SK281123B6 - Polynukleotid, antimediátorový polynukleotid, polypeptid, vektor obsahujúci polynukleotid, farmaceutická kompozícia obsahujúca polynukleotid alebo polypeptid a použitie polynukleotidu - Google Patents

Abstract

Opisuje sa gén označený ako Grb3-3, jeho varianty a ich použitie, predovšetkým pri protirakovinovej génovej terapii.ŕ

Description

Vynález sa týka nového génu, označeného symbolom Grb3-3, jeho variantov a ich použitia pri protirakovinovej génovej terapii.

Doterajší stav techniky

Pri regulácii bunkového delenia sa uplatňujú rôzne gény, ktoré sa nazývajú onkogény a supresorové gény. Z týchto génov je možné uviesť gény ras a ich produkty všeobecne označované ako proteíny p21, ktoré hrajú kľúčovú úlohu pri regulácii bunkovej proliferácie pri všetkých eukaryotických organizmoch, v ktorých sa skúmali. Predovšetkým sa dokázalo, že niektoré špecifické modifikácie týchto proteínov strácajú normálnu regulačnú schopnosť a stávajú sa onkogénnymi. Takto má veľký počet nádorov u ľudí súvislosť s výskytom modifikovaných génov ras. Rovnako tak môže nadmerná expresia týchto proteínov viesť k poruchám v bunkovej proliférácii. Pochopenie presnej úlohy týchto proteínov p21 v bunkách, mechanizmu ich funkcie a ich charakteristík teda predstavuje základné kamene na pochopenie kancerogenézy a na stanovenie farmaceutického prístupu k liečeniu rakoviny.

V rámci ras-dependentnej signálnej dráhy boli identifikované rôzne faktory. Medzi týmito faktormi figuruje gén Grb2, ktorý kóduje proteín s veľkosťou 23-25 kDa, ktorý má štruktúru SH3-SH2-SH3 (Lowenstein a kol., Celí 70, 431, (1992), Matouka a kol., PNAS 89, 9015, (1992)). Javí sa, že produkt génu Grb2 vstupuje do interakcie s tyrozín-fosfbrylovanými proteínmi svojou doménou SH2 a s výmenným faktorom GDP triedy SOS svojou doménou SH3 (Egan a kol., Náture 363,45, (1993)). Tento produkt by bol takto jednou zo zložiek transformačnej aktivity produktu génu ras. Vynález je výsledkom dokázania, klonovania a charakterizovania izoformy génu Grb2, označovanej ako Grb3-3 a majúcej deléciu v doméne SH2. Tento gén je exprimovaný v dospelých tkanivách, zodpovedajúca mRNA je prítomná v jedinom reťazci s dĺžkou 1,5 kb, a je transláciou konvertovaný na proteín s veľkosťou 19 kDa. Vzhľadom na jeho deléciu v doméne SH2 nie je už produkt génu schopný interakcie s tyrozín-fosforylovanými proteínmi (fosforylovaný receptor EGF), i keď si zachováva schopnosť interakcie s doménami bohatými na prolín proteínov SOS. Z dôvodov uvedenej delécic je produkt génu Grb3-3 takto schopný opozície proti bunkových účinkom génu Grb2. Prenos tohto génu in vivo alebo jeho variantov vrátane antimediátorových sekvencií teda umožňuje interferenciu s proliferačnými alebo diferenciačnými procesmi a/alebo procesmi smrti buniek.

Podstata vynálezu

Prvým predmetom vynálezu je teda nukleotidová sekvencia obsahujúca celý gén Grb3-3 alebo jeho časť (sekvencia SEQ ID NO: 1).

Ďalším predmetom vynálezu je nukleotidová sekvencia, ktorá je odvodená od sekvencie SEQ ID NO: 1 a ktorá je schopná inhibovať aspoň čiastočne expresiu proteínu Grb2 alebo Grb3-3. Vynález sa predovšetkým týka antimediátorových sekvencií, ktorých expresia v cieľovej bunke umožňuje regulovať prepis bunkových mRNA. Takéto sekvencie môžu byť napríklad prepísané v cieľovej bunke na komplementárnu RNA bunkových mRNA Grb2 alebo Grb3-3 a blokovať takto ich transláciu na proteín technikou opísanou v európskom patente EP 140 308. Takéto sekvencie môžu obsahovať celú nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO: 1 prepísanú v inverznej orientácii alebo jej časť.

Ako už bolo uvedené, je Grb2 najmenej bifunkčným proteínom viažucim sa svojou doménou SH2 k špecifickým sekvenciám fosforylovaným na tyrozíne a svojimi dvoma doménami SH3 k výmenným faktorom skupiny SOS. Grb3-3, ktorý už stratil svoju schopnosť viazať sa na proteíny fosforylované na tyrozíne, môže teda výlučne tvoriť komplex s proteínmi SOS. Grb3-3 môže teda oponovať tvorbe komplexu Grb2-SOS receptormi autofosforylovaných rastových faktorov alebo pridruženými proteínmi taktiež fosfofylovanými na tyrozíne, akými sú SHC alebo IRS1. Grb3-3, ktorý je schopný blokovať túto tvorbu, je schopný blokovať mitogénne cesty a spôsobiť smrť buniek. Prihlasovateľ skutočne preukázal, že proteín Grb3-3 sa exprimuje počas niektorých fyziologických procesov, akým je napríklad maturácia týmusu u krysy. Prihlasovateľ taktiež preukázal, že Grb3-3 je schopný privodiť smrť buniek apoptózou rôznych bunkových typov. Tieto napospol výhodné vlastnosti sa dali dokázať i) injekciou rekombinantného proteínu do fibroplastov 3T3 a ii) prenosom sekvencie kódujúcej Grb3-3 v bunkách 3T3 (príklad 4). Grb3-3 je teda schopný indukovať smrť živých buniek, akými sú napríklad imortalizované, rakovinové alebo embryonálne bunky. Ako je to dokázané v príkladoch, je Grb2 schopný oponovať účinkom Grb3-3.

Výskum expresie Grb3 uskutočnený počas infekcie lymfocytových buniek vírusom HIV umožnil dokázať, že masívna vírusová produkcia pozorovaná 7 dní po infekcii je korelovaná nadmernou expresiou mRNA Grb3-3 infikovanými bunkami (príklad 5). Tento experiment taktiež dokázal, že eliminácia alebo opozícia bunkových účinkov Grb3-3 môže taktiež umožniť zachovanie infikovaných buniek nažive, a to infikovaných predovšetkým vírusom HIV, a takto umožniť lymťocytom T4 pokračovať v ich úlohe pri imunitnej obrane. V tomto ohľade sa vynález taktiež týka použitia zlúčenín schopných eliminovať alebo aspoň čiastočne redukovať účinky Grb3-3 na prípravu farmaceutického prostriedku určeného na liečenie AIDS. Predovšetkým použitými zlúčeninami môžu byť:

- genetické antimediátorové sekvencie, ako sú už definované,

- špecifické oligonukleotidy Grb3-3, nemodifikované alebo modifikované na účely lepšej stability alebo biologickej dostupnosti (fosforotioáty, interkalačné činidlá atď.). Výhodne môže ísť o oligonukletidy pokrývajúce kódujúcu sekvenciu lokalizovanú medzi N-terminálnou doménou SH3 a reziduálnou doménou SH2,

- ľubovoľná sekvencia, ktorej prenos do infikovaných buniek indukuje nadmernú expresiu Grb2.

Nukleotidová sekvencie podľa vynálezu sa môžu použiť samotné, napríklad na injekciu pre človeka alebo zviera s cieľom indukovať ochranu proti rakovine alebo s cieľom liečiť rakoviny. Tieto sekvencie sa môžu predovšetkým injikovať vo forme samotnej DNA technikou opísanou v prihláške WO 90/11092. Tieto sekvencie sa môžu tiež podať vo forme komplexu, napríklad komplexu s DEAE-dextránom (Pagano a kol., J. Virol. 1, 891, (1967)), s jadrovými proteínmi (Kaneda a kol., Science 243, 375, (1989)), s lipidmi (Felgner a kol., PNAS 84, 7413, (1987)), vo forme lipozómov (Fraley a kol., J. Biol. Chem. 255, 10431, (1980)) atď.

Výhodne tvoria nukleotidová sekvencie podľa vynálezu súčasť vektora. Použitie takéhoto vektora v skutočnosti umožňuje zlepšiť podanie nukleovej kyseliny do buniek, ktoré sa majú liečiť, a taktiež zlepšiť jej stabilitu v uvede2 ných bunkách, čo umožňuje dosiahnuť trvalý terapeutický účinok. Okrem toho je možné zaviesť do jedného a toho istého vektora niekoľko sekvencií nukleovej kyseliny, čo taktiež zvyšuje účinnosť liečenia.

Použitý vektor môže mať rozličný pôvod, ak je schopný transformovať živočíšne bunky, výhodne ľudské nádorové bunky. V rámci výhodného uskutočnenia spôsobu podľa vynálezu sa používa vírusový vektor, ktorý sa môže zvoliť z množiny zahrnujúcej adenovírusy, retrovírusy, pridružené adenovírusy (AAV), vírus herpes, cytomegalovírus (CMV), vírus kravských kiahní atď. Vektory odvodené od adenovírusov, retrovírusov alebo pridružených adenovírusov s inkorporovanými sekvenciami heterológnych nukleových kyselín boli opísané v početnej odbornej literatúre (Akli a kol., Náture Genetics 3, 224, (1993), Straford-Perricaudet a kol., Human Gene Therapy 1, 241, (1990), EP 185 573, Levrero a kol., Gene 101.195, (1991), Le Gal la Šalie a kol., Science 259. 988, (1993), Roemer a Friedmann, Eur. J. Biochem. 208, 211, (1992), Dobson a kol., Neurón 5, 353, (1990), Chiocca a kol., New Biol. 2, 739, (1990), Miyanohara a kol., New Biol. 4, 238, (1992, WO 91/18088.

Vynález sa taktiež týka ľubovoľného rekombinantného vírusu, ktorý obsahuje vo svojom genóme vloženú definovanú nukleovú sekvenciu.

Výhodne je rekombinantným vírusom podľa vynálezu defektný vírus. Výraz „defektný vírus“ tu označuje vírus, ktorý je neschopný replikácie v cieľovej bunke. Vo všeobecnosti je genóm defektného vírusu použitého v rámci vynálezu zbavený aspoň sekvencií, ktoré sú nevyhnutné na replikáciu uvedeného vírusu v cieľovej bunke. Tieto oblasti sa môžu alebo eliminovať (celkom alebo čiastočne), alebo sa môžu urobiť nefunkčnými, alebo sa môžu nahradiť inými sekvenciami a predovšetkým nukleovou kyselinou podľa vynálezu. Výhodne si defektný vírus napriek tomu zachováva sekvencie svojho genómu, ktoré sú nevyhnutné na enkapsidáciu vírusových častíc.

Je predovšetkým výhodné použiť nukleotidové sekvencie podľa vynálezu vo forme pridruženej k defektnému adenovírusu, pridruženému adenovírusu (AAV) alebo rekombinantnému retrovírusu.

Pokiaľ ide o adenovírusy, existujú rôzne sérotypy adenovírusov, ktorých štruktúra a vlastnosti sa trochu menia, pričom tieto sérotypy nie sú pre človeka patogénne a predovšetkým nie sú patogénne pre subjekt s nedeprimovanou imunitnou reakciou. Tieto vírusy sa napokon neintegrujú do genômu buniek, ktoré infikujú a môžu inkorporovať dôležité fragmenty oxogénnej DNA. Z týchto rozličných sérotypov sa prednostne v rámci vynálezu používajú adenovírusy typu 2 alebo 5 (Ad 2 alebo Ad 5). V prípade adenovírusov Ad 5 sú oblasťami nevyhnutnými na replikáciu E1A a E1B.

Defektné rekombinantné vírusy podľa vynálezu sa môžu pripraviť homológnou rekombináciou medzi defektným vírusom a plazmidom nesúcim okrem iného definovanú nukleotidovú sekvenciu (Levrero a kol., Gene 101. 195 (1991), Graham EMBO J. 3, (12) 2917, (1984)). K tejto homológnej rekombinácii príde po kontranfekcii uvedených vírusov a plazmidu v príslušnom bunkovom rade. Použitý bunkový rad musí byť výhodne transformovateľný uvedenými prvkami a musí obsahovať sekvencie schopné komplementovať časť genómu defektného vírusu, výhodne v integrovanej forme, aby sa zabránilo rizikám rekombinácie. Ako príklad použiteľného bunkového radu na prípravu defektných rekombinantných adenovírusov možno uviesť bunkový rad 293 z obličky ľudského zárodku (Graham a kol., J. Gen. Virol. 36, 59, (1977)), ktorá obsahuje integrovane vo svojom genóme ľavú časť genómu adenovírusu Ad 5 (12 %). Ako príklad bunkového radu použiteľného na prípravu defektných rekombinantných retrovírusov je možné uviesť rad CRIP (Danos a Mulligan, PNAS 85, 6460, (1988).

Multiplikované vírusy sa potom izolujú a prečistia klasickými technikami molekulárnej biológie.

Predmetom vynálezu je taktiež farmaceutický prípravok obsahujúci najmenej jeden rekombinantný vírus alebo nukleotidovú sekvenciu, ktoré už boli definované.

Farmaceutické prostriedky podľa vynálezu sa môžu formulovať do vhodnej galenickej formy na topické, perorálne, parenterálne, intranazálne, intravenózne, intramuskuláme, subkutánne, intraokuláme a iné podanie.

Výhodne tieto farmaceutické prostriedky obsahujú farmaceutický prijateľné nosiče pre injikovateľnú formuláciu, prípadne aplikovanú priamo do liečeného nádoru. Predovšetkým môže ísť o soľné roztoky (hydrogenfosforečnan sodný, dihydrofosforečnan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý alebo chlorid horečnatý atď. alebo zmesi týchto solí) v sterilnom izotonickom stave alebo o suché, predovšetkým lyofílizované prostriedky, ktoré po pridaní sterilizovanej vody alebo fyziologického roztoku umožňujú vytvorenie injikovateľných roztokov.

Dávky nukleových kyselín (sekvencia alebo vektor) použité na podanie môžu závisieť od rozličných faktorov, medzi ktoré patrí predovšetkým spôsob podania, liečený patologický stav, nukleová kyselina, ktorá sa má exprimovať, alebo tiež požadovaný čas liečenia. Všeobecne, pokiaľ ide o rekombinantné vírusy podľa vynálezu, tieto vírusy sa formulujú a podávajú vo forme dávok obsahujúcich 10⁴ až 10¹⁴ pfii/ml, výhodne medzi 10⁶ a 10¹⁰ pfú/ml. Výraz pfo („plaque forming unit“) zodpovedá injekčnej potencii vírusového roztoku a stanoví sa infekciou príslušnej bunkovej kultúry a určením, zvyčajne po 48 hodinách, počtu kolónií infikovaných buniek. Technika stanovenia hodnoty pfu daného vírusového roztoku je veľmi dobre zdokumentovaná,v literatúre.

Uvedené prostriedky sa môžu použiť v humánnej medicíne na liečenie a/alebo prevenciu rakovín. Prípravky podľa vynálezu sú predovšetkým schopné modulovať aktivitu proteínov ras, umožňujú intervenciu do procesov rozvoja rakovín a predovšetkým môžu inhibovať aktivitu onkogénov, ktorých transformačná aktivita je sprostredkovaná funkčnou interakciou p21-GAP. V skutočnosti sa zistilo, že početné rakoviny sú v súvislosti s prítomnosťou onkogénnych proteínov ras. Z týchto rakovín zahrnujúcich najčastejšie mutagénne gény ras možno uviesť predovšetkým adenokarcinómy pankreasu, z ktorých 90 % má mutantný onkogén Ki-ras na dvanástom kodóne (Almoguera a kol., Celí 53, 549 (1988)), adenokarcinómy tračníka a rakoviny štítnej žľazy (50 %) alebo karcinómy pľúc a myeloidnej leukémie (30 %, Bos, J. L. Cancer Res. 49, 4682, (1989)). Všeobecnejšie sa môžu prostriedky podľa vynálezu použiť na liečenie všetkých typov patologických stavov, pri ktorých sa pozoruje bunková proliferácia indukciou apoptózy, ako aj všetkých patologických stavov charakterizovaných smrťou buniek následkom apoptózy (AIDS, Huntingtonova chorea, Parkinsonova choroba) pomocou zlúčenín blokujúcich účinky Grb3-3 (predovšetkým antimediátorové).

V nasledujúcej časti opisu bude vynález bližšie objasnený pomocou konkrétnych príkladov jeho uskutočnenia a odkazov na pripojené výkresy.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 znázorňuje schematické zobrazenie štruktúrnych domén Grb2 a Grb3-3, obr. 2 znázorňuje štúdium väzby Grb3-3 k receptoru pre EGF (obr. 2a) a k peptidom bohatým na prolín (obr. 2b), obr. 3 znázorňuje účinok Grb3-3 na transaktiváciu pri použití ras RRE odvodeného od enhancera polyomného vírusu, obr. 4 znázorňuje demonštráciu smrti buniek indukovanej pôsobením Grb3-3 na fibroplastoch 3T3 a obr. 5 znázorňuje demonštráciu expresie Grb3-3 v bunkách infikovaných vírusom IIIV.

Všeobecné techniky molekulárnej biológie

Klasicky používané techniky molekulárnej biológie, akými sú preparatívne extrakcie plazmidovej DNA, odstreďovanie plazmidovej DNA v gradiente chloridu cézneho, elektroforéza na agarózovom alebo akrylamidovom géli, purifikácia fragmentov DNA elektroelúciou, extrakcia proteínov fenolom alebo zmesou fenolu a chloroformu, zrážanie DNA v soľnom prostredí etanolom alebo izopropanolom, transformácia v Escherichia coli atď. sú veľmi dobre známe a hojne opísané v príslušnej odbornej literatúre (Maniatis T. a kol., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual“ Cold Spring Harbor, N. Y., 1982, Ausubel F. M. a kol., (edit.), „Current Protocols in Molecular Biology“, John Wiley and Sons, New York, (1987).

Plazmidy typu pBR322, pUC a fágy radu Ml 3 sú komerčne dostupné (Bethesda Research Laboratories).

Na účely ligácie sa môžu fragmenty DNA separovať podľa veľkosti elektroforézou na agarózovom alebo akrylamidovom géli, extrahovať fenolom alebo zmesou fenolu a chloroformu, zrážať etanolom a potom inkubovať v prítomnosti DNA-ligázy fúgu T4 (Biolabs) podľa odporúčania dodávateľa.

Zarovnanie proeminentných koncov 5' sa môže uskutočniť Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I Escherichia coli (Biolabs) podľa pokynov dodávateľa. Deštrukcia proeminentných koncov 3' sa uskutočňuje v prítomnosti DNA polymerázy fágu T4 (Biolabs) použitej podľa odporúčania výrobcu. Deštrukcia proeminentných koncov 5' sa uskutočňuje šetrným pôsobením nukleázy S l.

Riadená mutagenéza in vitro syntetickými oligodeoxynukleotidmi sa môže uskutočňovať metódou vyvinutou Taylorom a kol., (Nucleic Acids Res. 13, 8749-8764, (1985)) pri použití súpravy distribuovanej firmou Amersham.

Enzymatická amplifikácia fragmentov DNA technikou nazvanou PCR (Polymerase-catalyzes Chain Reaction, Saiki, R. K. a kol., Science230,1350-1354, (1985), Mullis, K. B. aFaloona, F. A., Meth. Enzým. 155, 335-350, (1987)) sa môže uskutočniť s použitím DNA-termálneho cyklera („DNA Thermal cycler“) (Perkin Elmer Cetus) podľa pokynov výrobcu.

Overenie nukleotidových sekvencií sa môže uskutočniť metódou, ktorú vyvinuli Sanger a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467, (1977)) použitím súpravy distribuovanej firmou Amersham.

V nasledujúcej časti opisu bude vynález bližšie objasnený pomocou konkrétnych príkladov jeho uskutočnenia, ktoré majú iba ilustračný charakter a v ničom neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne definovaný formuláciou patentových nárokov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Izolácia génu Grb3-3

Gén Grb3-3 sa izoloval triedením ľudskej banky DNA pomocou sondy odvodenej od sekvencie génu Grb2.

Pomocou sondy odvodenej od sekvencie génu Grb2 sa vytriedilo 500 000 rekombinantných fágov Lambda gtll nesúcich fragmenty DNA pôvodom z banky ľudskej placenty (Clontech). Použitá sonda zodpovedá ôsmim prvým aminokyselinám proteínu Grb2 a zahrnuje nasledujúcu sekvenciu:

ATGGAAGCCATCGCCAAATATGAC (SEQ Π) NO: 2)

Takto sa identifikovalo desať pozitívnych klonov. Inzert týchto desiatich klonov sa izoloval vo forme fragmentov EcoRI, klonoval v plazmide M13mpl8 a sekvenoval. Z týchto desiatich klonov deväť nieslo inzerty identické so sekvcnciou Grb2. Iba jediný z týchto klonov niesol inzert, ktorého veľkosť bola menšia ako veľkosť génu Grb2 z dôvodu delécie v doméne SH2 (obr. 1). Analýza zostávajúcej sekvencie mala dokonalú identitu so zodpovedajúcimi oblasťami Gbr2 vrátane nekódujúcich oblasti 5' a 3'. Fáza otvoreného čítania tohto kionu kóduje proteín so 177 aminokyselinami (SEQ ID NO: 1) obsahujúci dve domény SH3 ohraničujúce neúplnú doménu SH2 (obr. 1). Vypustené (delécia) aminokyseliny v doméne SH2 (zvyšky 60 až 100 proteínu Grb2) zodpovedajú zvyškom implikovaným vo väzbe Grb2 k peptidom obsahujúcim fosforylované tyrozíny.

Príklad 2

Aktivita väzby proteínu Grb3-3

Ako už bolo uvedené, je Grb2 mediátor interakcie medzi receptormi fosforylovaných rastových faktorov a faktormi SOS. Tento príklad demonštruje skutočnosť, že proteín Grb3-3 je neschopný interakcie s fosforylovaným EGF (s fosforylovaným rastovým faktorom), ale že si i naďalej zachováva svoju schopnosť interakcie s peptidom bohatým na prolín odvodeným zo sekvencie ľudského faktora SOS L

Kapacita väzby Grb3-3 sa študovala použitím biotinylovaných fúznych proteínov ku glutatión-S-transferáze (GST). Tento typ fúzie umožňuje rýchlu a účinnú purifikáciu rekombinantných produktov. Na tieto účely sa sekvencie podľa vynálezu exprimovali v kmeni Escherichia coli TG1 vo forme íúznych proteínov s GST podľa techniky opísanej Smithom a Johnosonom (Gene 67, 31, (1988)). Stručne špecifikované, gény Grb2 a Grb3-3 sa najskôr modifikovali zavedením na oboch stranách kodónu štart a stop miesta BamHl. Na tento účel sa otvorené fázy čítania týchto génov amplifikovali technikou PCR pri použití nasledujúcich oligonukleotidov:

Oligonukleotid I (5')(SEQ ID NO: 3)

GAATTCGGATTCATGGAAGCCATCGCCAAATATGACTTC oligonukleotid II (3') (SEQ ID NO: 4):

Podčiarknutá časť uvedených oligonukleotidov zodpovedá vytvorenému miestu BamHl nasledovanému alebo predchádzanému kodónmi štart a stop.

Takto amplifikované gény sa potom klonujú vo forme fragmentov BamHl vo vektore pGEX 2T (Pharmacia) line4

SK 281123 Β6 arizovanému rovnakým enzýmom v 3' a vo fáze cDNA kódujúcej GST. Takto získané vektory sa potom použijú na transformáciu kmeňa Escherichia coli TG1. Takto transformované bunky sa potom predkultivujú cez noc pri teplote 37 “C, zriedia 1 : 10 v prostredí LB, zmiešajú s IPTG na indukciu expresie (2 hodiny, 25 °C) a potom kultivujú počas 21 hodín pri teplote 25 °C. Tieto bunky sa potom podrobia lýze a produkované fúzne proteíny sa prečistia na základe ich afinity na stĺpci produktu agaróza-GSH. Na tento účel sa bakteriálny lyzát inkubuje v prítomnosti gélu (pripravený a uvedený do rovnovážneho stavu s pufrom lýzy) počas 15 minút pri teplote 4 °C. Po 3 hodinách premývania tampónom Tris-HCl (pH 7,4) sa proteíny eluujú v prítomnosti pufra Tris-HCl (pH 7,7) obsahujúceho prebytok GST. Supernatant sa oddelí a odstredí.

Rovnaká metodika sa použije na prípravu mutanta Grb2, v ktorom je glycín 203 nahradený arginínom (Grb2G203R), a mutanta Grb3-3, v ktorom je glycín 162 nahradený arginínom (Grb3-3G162R). Mutant Grb2G203R bol opísaný ako mutant, ktorý nemá účinnosť pri teste reiniciácie syntézy DNA (Lowenstein a kol.). Mutant Grb3-3G162R nesie rovnakú mutáciu v rovnakej polohe a mal by teda byť taktiež neúčinný.

Tieto mutanty sa pripravili mutagenéznou technikou PCR na génoch Grb2 a Grb3-3 použitím 5' oligonukleotidu I opísaného a 3' nasledujúceho oligonukleotidu 111, v ktorom je mutovaný kodón podčiarknutý:

oligonukleotid III (3') (SEQID NO: 5):

GACGTTCCGGTTCACGGGCGTGACATAATTGCGGCGAAACATGCfifiC.TC

Takto amplifikované fragmenty sa potom eluujú, reamplifikujú technikou PCR pomocou oligonukleotidov I a II a potom klonujú vo vektore pGEX 2T. Potom sa uvedenými postupmi pripravia zodpovedajúce mutanty.

Fúzne proteíny s GST (GST-Grb2, GST-Grb3-3, GST-Grb3-3G162R a GST) sa potom biotinylujú klasickými známymi technikami (pozri všeobecné techniky molekulárnej biológie a Mayer a kol., PNAS 88, 627 (1991)) a použijú sa ako sondy na stanovenie väzby k receptoru pre imobilizovaný fosforylovaný EGF (2.1) a potom k peptidu odvodenému od hSOSl (2.2).

1. Väzba k receptoru pre fosforylovaný EGF

Metodika:

Receptor pre EGF sa purifikoval z buniek A431 imobilizáciou na WGA-sepharose uskutočnenou technikou opísanou Duchesneom a kol. (Science 259, 525 (1993)). 2 pg tohto receptora sa najskôr stimuluje 1 μΜ EGF počas 10 minút pri teplote 22 °C a potom sa inkubuje v prítomnosti alebo neprítomnosti chladného ATP (10 μΜ) a v prítomnosti 2,5 mM NaCl, 0,1 % Triton, 10 % glycerol, pH = 7,5, pri teplote 4 °C počas 2 minút. Fosforylácia receptora sa potom ukončí pridaním degradačného pufra. Vzorky sa nanesú na 4 - 20 % gél SDS-PAGE a potom sa prevedú na polyvinylidéndifluoridové membrány (PVDF). Získané bloty sa potom inkubujú v prítomnosti rôznych biotinylovaných fúzií GST (2 pg/ml) a potom vyvolajú pomocou streptavidínu kopulovaného s alkalickou fosfatázou (Promega). Receptory RGf sa taktiež podrobili imunoblotu v prítomnosti antifosfotyrozínových protilátok (anti-PY), na účely preverenia toho, že receptory boli skutočne fosforylované.

Výsledky:

Získané výsledky sú zobrazené na obr. 2. Tieto výsledky ukazujú podľa očakávania, že proteín Grb2 vstupuje do interakcie s receptorom EGF iba v prípade, keď je tento receptor fosforylovaný. Tieto výsledky ďalej ukazujú, že proteín Grb3-3 sa neviaže k receptoru EGF, a to bez ohľadu na jeho stupeň fosforylácie.

2. Väzba k peptidu odvodenému od hSOSl

Metodika:

Syntetizovali sa nasledujúce dva peptidy bohaté na prolín:

- peptid hSOSl: GTPEVPVPPPVPPRRRPESA: tento peptid zodpovedá zvyškom 1143 až 1162 proteínu hSOSl (Li a kol., Náture 363. 83, (1993)) zodpovedného za interakciu medzi Grb2 ahSOSl (SEQ ID NO: 6),

- peptid 3BP1: tento peptid je odvodený od derivátu proteínu 3BP1, o ktorom je známe, že viaže účinne doménu SH3 Abl a Src (Cicchetti a kol., Science 257, 803, (1992)) (SEQ ID NO: 7).

Každý z týchto peptidov bol imobilizovaný na nitrocelulózovej membráne. Tieto membrány sa potom inkubovali v blokačnom pufri (Tris 20 mM, pH = 7,6, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween, 3 % albumín hovädzieho dobytka). Membrány sa potom inkubujú cez noc pri teplote 4 °C v prítomnosti rôznych biotinylovaných fúzií GST (4 pg/ml) a potom sa vyvolávajú pomocou streptavidínu kopulovaného s alkalickou fosfatázou (Promega).

Výsledky:

Získané výsledky sú uvedené na obr. 2. Tieto výsledky ukazujú, že Grb3-3 je rovnako ako Grb2 schopný viazať peptid hSOSl. Tieto výsledky ďalej ukazujú, že táto interakcia je špecifická, pretože sa nepozorovala žiadna väzba s peptidom 3BP1. Okrem toho výsledky tiež ukazujú, že mutant Grb3-3G162R už nie je schopný viazať peptid hSOSl, čo potvrdzuje dôležitosť tohto zvyšku a funkčnú úlohu uvedenej interakcie.

Príklad 3

Aktivita proteínu Grb3-3

Tento príklad demonštruje, že napriek delécii v doméne SH2 má proteín Grb3-3 funkčný účinok.

Aktivita proteínu Grb3-3 bola študovaná stanovením jeho schopnosti kooperovať s ras v rámci transaktivácie promótora majúceho prvky reakcie proti ras (RRE) a riadiaceho expresiu reportérového génu.

Použitú metodiku opísali napríklad Schweighoff a kol. v Science 256, 825 (1992). Stručne špecifikované je použitým promótorom syntetický promótor tvorený murinným promótorom génu tymidínkinázy a 4 repetitívnych prvkov PEA1 odvodených od polyómneho enhancera (Wasylyk a kol., EMBO J 7, 2475 (1988)): promótor Py-TK. Tento promótor riadi expresiu reportérového génu, v prípade bakteriálneho génu chloramfenikolacetyltransfcrázy (CAT): vektor Py-TK-CAT. Testované vektory expresie génov boli konštruované inzerciou uvedených génov vo forme fragmentov BamHI do miesta BglII plazmidu pSV2. Toto miesto umožňuje vložiť gény pod kontrolu raného promótora SV40.

Bunky ER22 so 40 % konfluenciou sa transfekovali použitím 0,5 pg vektora Py-TK-CAT samotného (Py) alebo v prítomnosti expresného vektora nesúceho pod kontrolou raného promótora SV40 gén: Grb2, 2 gg, Gbr3-3, 2 gg Grb2(G203R), 2 gg, Grb3-3(G162R), 2 gg alebo Grb3-3, 2 gg ľ Grb2, 2 gg. V každom prípade je celkové množstvo DNA nastavené na 5 gg expresným vektorom bez inzertu. Transfekcia sa uskutočnila v prítomnosti lipospermínu (Transfectam, IBF-Sepracor). Bunky sa udržiavali počas 48 hodín v prostredí DMEM doplnenom 0,5 % fetálnym teľacím sérom. Aktivita CAT (transaktivácia RRE) sa potom stanovila spôsobom opísaným Wasylykom a kol. (PNAS 85.7952,(1988)).

Získané výsledky sú uvedené na obr. 3. Tieto výsledky jasne ukazujú, že expresia proteínu Grb3-3 oponuje účinkom aktivácie receptora pre rastový faktor. Tieto výsledky taktiež ukazujú, že Grb2 v prebytku oponuje účinkom Grb3-3 v odpovedi na rastový faktor.

Príklad 4

Grb3-3 indukuje bunkovú apoptózu

Tento príklad demonštruje priamu implikáciu Grb3-3 v bunkovej apoptóze. Táto vlastnosť ponúka predovšetkým výhodné použitie v rámci liečenia patologických stavov vyplývajúcich z bunkovej proliferácie (rakoviny, restenóza atd’.).

Indukcia bunkovej apoptózy účinkom Grb3-3 bola demonštrovaná i) injekciou rekombinantného proteínu do fibroplastov 3T3 a ii) prenosom sekvencie kódujúceho Grb3-3 do buniek 3T3.

i) Injekcia rekombinantného proteínu

Rekombinantný proteín Grb3-3 sa pripravil vo forme fúzovaného proteínu s GST podľa metodiky opísanej v príklade 2. Fúzovaný proteín sa potom spracoval trombínom (0,25 %, Sigma) s cieľom oddeliť časti GST a potom sa purifikoval ionexovou chromatografiou na stĺpci monoQ. Frakcie obsahujúce rekombinantný proteín sa potom zahustili pomocou mikrokoncentrátu Microsep (Filtron) v 20 mM fosfátového pu&a (pH = 7) obsahujúcom 100 mM chloridu sodného. Takto získaný purifikovaný proteín sa injikoval (1 až 3 mg/ml) do kultúry buniek 3TS pomocou automatického mikroinjektora Eppendorf. Tieto bunky sa potom inkubujú pri teplote 34 °C a v pravidelných intervaíoch fotografujú na účely sledovania morfologických transformácií. Získané výsledky ukazujú, že 5 hodín po injikácii Grb3-3 je väčšina buniek mŕtvych, zatiaľ čo injekcia Grb2 alebo mutanta Grb3-3(G162R) nemá žiadny účinok na životnosť buniek.

ii) Prenos sekvencie kódujúcej rekombinantný proteín

Skonštruoval sa plazmid obsahujúci sekvenciu SEQ ID NO: 1 kódujúci proteín Grb3-3 pod kontrolou raného promótora vírusu SV40.

Fibroplasty 3T3 so 40 % konfluenciou boli transfekované v prítomnosti lipospermínu (Transfectam, IBF-Sepracor) pomocou 0,5 alebo 2 gg tohto expresného plazmidu. 48 hodín po transfekcii sa 50 % buniek suspendovalo v prostredí, zatiaľ čo zostávajúce bunky priľnuté na stene mali významné morfologické zmeny (obr. 4). Analýza uskutočnená elektroforézou na agarózovom géíi ukázala, že tieto bunky mali charakteristickú oligo-nukleozomálnu štruktúru fragmentácie DNA mŕtvych buniek (obr. 4). Naopak bunky transfekované za rovnakých podmienok expresným plazmidom Grb2, Grb3-3(G162R) alebo Grb2(G203R) si zachovali normálnu morfológiu, sú stále živé a nemajú žiadnu fragmentáciu DNA. Ako je to zrejmé z obr. 4 umožňuje koexpresia Grb2 opozíciu proti účinkom Grb3-3.

Tieto výsledky ukazujú teda jednoznačne, že Grb3-3 je smrtiacim génom schopným indukovať bunkovú apoptózu. Ako už bolo uvedené, ponúka táto vlastnosť predovšetkým výhodné aplikácie v rámci liečenia patologických stavov rezultujúcich z bunkovej proliferácie, akými sú predovšetkým rakoviny, restenóza atd’.

Príklad 5

Demonštrovanie expresie Grb3-3 v lymfocytoch infikovaných vírusom HIV

Tento príklad ukazuje, že v priebehu infekčného cyklu lymfocytov T vírusom HIV je podiel mRNA Grb2 a Grb3-3 modifikovaný a že v okamihu masívnej vírusovej tvorby a smrti buniek sa nadmerne exprimuje mediátor Grb3-3.

Lymfocyty periférnej krvi sa infikovali vírusom HIV-1 v dvoch zriedeniach (1/10 a 1/100) počas 1, 4 alebo 7 dní. mRNA buniek sa potom analyzovali reverznou technikou PCR pomocou špecifických oligonukleotidov Grb2 a Grb3-3 s cieľom stanoviť relatívny podiel mediátora Grb2 a Grb3-3. Použitými špecifickými oligonukleotidmi Grb3-3 sú nasledujúce oligonukleotidy:

oligonukletid IV (3’):

ATCGTTTCCAAACGGATGTGGTTT (SEQ ID NO: 8) oligonukleotid IV (5'):

ATAGAAATGAAACCACATCCGTTT (SEQ ID NO: 9).

Získané výsledky sú uvedené na obr. 5. Tieto výsledky ukazujú jednoznačne, že 7 dní po infekcii vírusom HIV dochádza k nadmernej expresii mRNA Grb3-3. Ako je zrejmé zo stanovenia proteínu p24 a inverznej transkriptázy vírusu, zodpovedá 7 dní tiež perióde, v ktorej sa pozoruje masívna vírusová produkcia.

Zoznam sekvencií

SEQIDNO: 1:

i) charakteristiky sekvencie:

A) dĺžka: 933 párov báz

B) typ: nukleová kyselina

C) počet reťazcov: dvojitý

D) konfigurácia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický: nie iii) antimediátorový: nie vi) pôvod:

A) organizmus: Homo sapiens ix) dodatočné charakteristiky:

A) meno/kľúč: CD S

B) umiestnenie: 37..567

C) ďalšie informácie: produkt = „Grb3-3“ xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 1:

GAATŤCGGCG

CTGCTGAGCA CTGAGCACGG CT'

CAGA

ATG

GAA

GCC

ATC

GCC

AAA

5«

Mat 1

Glu

Ala

11«

Ala 5

Lys

TA*

GAC

TTC

AAA

GCT

ACT

GCA

GAC

GAC

GAC

CTG

AGC

TTC

AAA

AGG

GGG

102

Tyr

Asp

Phe

Lya

Ala

Thr

Ala

Asp

Asp

Asp

Leu

Ser

Pha

Lys

Arg

Gly

10

15

20

GAC

ATC

CTC

AAG

GTT

TTG

AAC

GAA

GAA

TGT

GAT

CAG

AAC

TGG

TAC

AAG

150

Asp

Zla

Leu 25

Lys

Val

Lau

Asn

Glu 30

Glu

Cys

Asp

Gin

Asn 35

Trp

Tyr

Lys

GCA

GAG

CTC

AAT

GGA

ΑΛΑ

GAC

GGC

TTC

ATT

CCC

AAG

AAC

TAC

ATA

GAA

198

Ala

Glu

Leu

Asn

Gly

Lys

Asp

Gly

Phe

11*

Pro

Lys

Asn

Tyr

Ila

Glu

40

4$

50

ATG

AAA

CCA

CAT

CCG

TTT

GGA

AAC

GAT

GTG

CAG

CAC

TTC

AAG

GTG

CTC

246

Met 55

Lys

Pro

His

Pro

Pha ÍO

Gly

Asn

Asp

V*1

Gin 65

Kis

Phe

Lys

Val

Leu 70

CSA

GA*

GGA

GCC

GGG

AAG

TAC

TTC

CTC

TGG

GTG

GTG

AAG

TTC

AAT

TCT

294

Ary

Asp

Gly

Ala

Gly

Lys

Tyr

Phe

Leu

Trp

Val

val

Lys

Pha

Asn

Ser

75

60

85

TTG

AAT

GAG

CTG

GTG

GAT

TAT

CAC

AGA

TCT

ACA

TCT

GTC

TCC

AGA

AAC

342

Lsu

Asn

Glu

Lau 90'

val

ASP

Tyr

Kls

Arg 95

Ser

TJir

ser

val

Ser 100

Arg

Asn

CAG

CAG

KTA

TTC

CTG

CGG

GAC

ΑΤλ

GAA

CAC

GTG

CCA

CAG

CAG

CCG

ACA

390

Gin

Gin

Ila 105

Pha

Lau

Arg

Asp

Xla no

Glu

Gin

val

Pro

Gin 11S

Gin

Pro

Thr

TAC

GTC

CAG

GCC

CTC

TPC

GAC

TTT

GAT

CCC

CAG

GAG

GAT

GGA

GAG

CTG

Tyr

val no

Gin

Ala

Lau

PM

Asp US

Ph·

*»P

Pro

Gin

Glu 130

Asp

Gly

Glu

Leu

GGC

TTC

CGC

CGG

GGA

GAT

TTT

ATC

CAT

GTC

ATG

GAT

AAC

TCA

GAC

CCC

486

Gly 135

Ph·

Arg

Arg

Gly

Asp 140

Ph·

n·

His

Val

Het KS

Aap

Asn

Ser

Asp

Pro 150

AAC

TGG

TGG

ΑΛΑ

GGA

GCT

TGC

CAC

GGG

CAG

ACC

GGC

ATG

TTT

CCC

CCC

S34

Asfl

Trp

Trp

Lys

Gly 155

Ala

Cys

Kis

Gly

Gin 160

Thr

Gly

Mat

Phe

Pre 165

Arg

AAT

TAT

GTC

kCC

CCC

GTG

AAC

CGG

AAC

GTC

TAAGAGTCAA GAAGCAATT

Ά

684

Ksn

Tyr

Val

Thr

Pro

Val

Asn

Arg

xsn

val

170

175

TAAATTAAGA AGAGTTTTTK WACAAATT? TCACTGCTCC TCCTCTTTCC CCTCCTTTGT ctttttťtsč τκαηνη ctcttctgtc catcagtgca tgacgtttaa ggccacgtat

AGTCCTAGCT QACGCCAASA AAAAACAAGA AACCAAAAAA CCCGAATTC

624

684

933

SEQ ID NO: 2:

i) charakteristiky sekvencie:

A) dĺžka: 24 párov báz

B) typ: nukleová kyselina

C) počet reťazcov: jednoduchý

D) konfigurácia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA vi) pôvod:

A) organizmus: oligonukleotid xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 2:

ATGGAAGCCA TCGCCAAATA TGAC 24

SEQIDNO: 3:

i) charakteristiky sekvencie:

A) dĺžka: 39 párov báz

B) typ: nukleová kyselina

C) počet reťazcov: jednoduchý

D) konfigurácia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA vi) pôvod:

A) organizmus: oligonukleotid I xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 3:

GAATTCGGAT CCATGGAAGC CATCGCCAAA

TATGACTTC 39

SEQIDNO: 4:

i) charakteristiky sekvencie:

A) dĺžka: 39 párov báz

B) typ: nukleová kyselina

C) počet reťazcov: jednoduchý

D) konfigurácia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA vi) pôvod:

A) organizmus: oligonukleotid II xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 4:

GAATTCGGAT CCTTAGACGT TCCGGTTCAC GGGGGTGAC 39

SEQ ID NO: 5:

i) charakteristiky sekvencie:

A) dĺžka: 49 párov báz

B) typ: nukleová kyselina

C) počet reťazcov: jednoduchý

D) konfigurácia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA vi) pôvod:

A) organizmus: oligonukleotid III xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 5:

GACGTTCCGG TTCACGGGGG TGACATAATT GCGGGGAAAC ATGCGGGGTC 49

SEQIDNO: 6:

i) charakteristiky sekvencie:

A) dĺžka: 20 aminokyselín

B) typ: aminokyselina

D) konfigurácia: lineárna ii) typ molekuly: proteín vi) pôvod:

A) organizmus: peptid hOSOl (zvyšky 1143 až 1162) xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 6:

Gly Thr Pro Glu Val Pro Val Pro Pro Pro Val Pro Pro Arg Arg

I 5 10 15

Arg Pro Glu Ser Ala

SEQ ID NO: 7:

i) charakteristiky sekvencie:

A) dĺžka: 8 aminokyselín

B) typ: aminokyselina

D) konfigurácia: lineárna ii) typ molekuly: proteín vi) pôvod:

A) organizmus: peptid 3BP1 xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 7:

Pro Pro Pro Leu Pro Pro Leu Val

5

SEQIDNO: 8:

i) charakteristiky sekvencie:

A) dĺžka: 24 párov báz

B) typ: nukleová kyselina

C) počet reťazcov: jednoduchý

D) konfigurácia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA vi) pôvod:

A) organizmus: oligonukleotid IV xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 8:

ATCGTTTCCA AACGGATGTG GTTT 24

SEQIDNO: 9:

i) charakteristiky sekvencie:

A) dĺžka: 24 párov báz

B) typ: nukleová kyselina

C) počet reťazcov: jednoduchý

D) konfigurácia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA vi) pôvod:

A) organizmus: oligonukleotid V xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 9:

Claims (12)

1. Polynukleotid kódujúci polypeptid Grb3-3 majúci aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v sekvencii SEQ ID NO: 1, pričom uvedený polypeptid je izomorfný k polypeptidu Grb-2, ktoiý má delcciu v doméne SH2.

2. Polynukleotid podľa nároku 1 obsahujúci nukleotidy 37-564 sekvencie SEQ ID NO: 1.

3. Antimediátorový polynukleotid obsahujúci celý poylnukleotid alebo časť polynukleotidu podľa nároku 1, pričom uvedený antimediátorový polynukleotid je schopný inhibovať expresiu Grb2.

4. Antimediátorový polynukleotid obsahujúci celý polynukleotid alebo časť polynukleotidu podľa nároku 1, pričom uvedený antimediátorový polynukleotid je schopný inhibovať expresiu Grb3-3.

5. Polypeptid Grb3-3 majúci aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v sekvencii SEQ ID NO: 1, ktorý je schopný opozície proti bunkovým účinkom polypeptidu Grb2.

6. Vektor obsahujúci polynukleotid podľa nároku 1 až 4.

7. Vektor podľa nároku 6, vyznačujúci sa t ý m , že ide o vírusový vektor.

8. Vektor podľa nároku 7, vyznačujúci sa t ý m , že ide o vektor odvodený z adenovírusov, retrovírusov, pridružených adenovírusov, vírusu herpes, cytomegalovírusu alebo vírusu kravských kiahní.

9. Vektor podľa nároku 7 alebo 8, vyznačujúci sa t ý m , že ide o vírus defektný na replikáciu.

10. Farmaceutická kompozícia obsahujúca polynukleotid podľa nárokov 1 až 4 alebo polypeptid podľa nároku 5.

11. Použitie polynukleotidu podľa nároku 1 alebo 3 alebo vektora obsahujúceho uvedený polynukleotid na prípravu farmaceutickej kompozície na liečenie rakovín.

12. Použitie polynukleotidu podľa nároku 4 na prípravu farmaceutickej kompozície určenej na liečenie AIDS.