HU221516B

HU221516B - Grb3-3 gén és variánsai, ezeket tartalmazó vektor és gyógyszerkészítmény és eljárások az előállításukra

Info

Publication number: HU221516B
Application number: HU9600668A
Authority: HU
Inventors: Fabien Schweighoffer; Bruno Tocque
Original assignee: Rhone-Poulenc Rorer S.A.
Priority date: 1993-09-15
Filing date: 1994-05-09
Publication date: 2002-11-28
Also published as: PL178402B1; EP0719328B1; ES2152313T3; ZA947059B; JP3794697B2; PL313445A1; CN1098930C; CZ75896A3; IL126756A; AU698819B2; RU2159815C2; DK0719328T3; CA2169938A1; USRE37952E1; FR2710074B1; NO960965D0; IL110942A0; FI961202A; JPH09502357A; KR100330477B1

Abstract

A találmány tárgyát a Grb3–3-nak nevezett új gén és ennek variánsaivagy ezeket magában foglaló vektor, valamint ezeknek többek között rákelleni génterápiában való felhasználása, továbbá a Grb3–3-at vagyvariánsait, vagy ezeket magában foglaló vektort tartalmazógyógyszerkészítmény képezi. Ugyancsak a találmány tárgyát képezi aGrb3– 3 gén izolálása és eljárás a vektor és gyógyszerkészítményelőállítására. ŕ

Description

A találmány a Grb3-3-nak nevezett új génre, ennek variánsaira, és ezeknek többek között rák elleni génterápiában való felhasználására vonatkozik.

A sejtosztódás szabályozásában különböző, onkogéneknek és szupresszor géneknek nevezett gének vesznek 5 részt. Ezek közül a ras gének és ezek termékei, mely utóbbiakat általában p21 proteineknek neveznek, minden olyan eukariótaoiganizmusnál kulcsszerepet játszanak a sejtosztódás szabályozásában, ahol vizsgálták azokat. Többek között rámutattak, hogy ezen fehérjék bizonyos 10 specifikus modifikációinak hatására a fehérjék elvesztik normális szabályozottságukat, és onkogénekké válnak, így igen sok humán tumort kapcsoltak megváltozott ras gének jelenlétéhez. Ugyanakkor ezen p21 fehérjék túlzott mértékű expressziója a sejtosztódás szabályozottságának 15 elvesztéséhez vezethet. Ezen p21 proteineknek a sejtben betöltött pontos szerepének, működésük módjának és jellemzőinek megismerése tehát lényeges kérdés a kancerogenezis megértésében és terápiás megközelítésében.

Különböző, a rasfuggő jelátviteli útvonalban szerep- 20 lő faktorokat azonosítottak. Ezek között található a Grb2 gén, amely egy SH3-SH2-SH3 szerkezettel rendelkező 23-25 kD-os fehéijét kódol [Lowenstein et al.,

Cell 70, 431 (1992); Matuoka et al., PNAS 89, 9015 (1992)]. A Grb2 gén terméke úgy tűnik, hogy a tiro- 25 zinon foszforilált proteinekkel lép kölcsönhatásba,

SH2 doménjén keresztül, valamint egy SOS-osztályba tartozó, a GDP-forgalomban szerepet játszó faktorral az SH3 doménjén keresztül [Egan et al., Natúré 363, 45 (1993)]. így ez a géntennék a ras gén termékét átalakí- 30 tó aktivitások egyik összetevője lehet. A találmány a Grb2 gén egy Grb3-3-nak nevezett izoformjának felfedezéséből, klónozásából és jellemzéséből származik, mely izoform az SH2 doménben egy deléciót tartalmaz. Ez a gén a kifejlett szövetekben fejeződik ki: a 35 megfelelő mRNS egy egyedi 1,5 kb sávként van jelen, és egy 19 kD fehérjévé fordítódik le. Az SH2 doménben jelen levő deléció miatt a Grb3-3 gén terméke nem képes a tirozinon foszforilált fehérjékkel (foszforilált EGF-receptor) kölcsönhatásba lépni, de megőrzi a 40 SOS-fehéijék prolinban gazdag régióival való kölcsönhatás képességét. Deléciója miatt a Grb3-3 gén terméke képes a Grb2 géntennék celluláris hatásait ellensúlyozni. E génnek vagy variánsainak, beleértve az antiszensz szekvenciákat is, in vivő transzferé lehetővé te- 45 szi tehát a proliferáció, a differenciálódás és/vagy a sejthalál folyamataiba történő beavatkozást.

A találmány első tárgya tehát a Grb3-3 gén egy részét vagy egészét tartalmazó nukleotidszekvenciára vonatkozik (1. számú szekvencia). 50

A találmány egy másik tárgya egy, az 1. számú szekvenciából származó, és a Grb2 vagy a Grb3-3 fehérjék expresszióját legalább részben gátolni képes nukleotidszekvenciára vonatkozik. Részletesebben a találmány olyan antiszensz szekvenciákra vonatkozik, ame- 55 lyek expressziója egy gazdasejtben lehetővé teszi a celluláris mRNS transzkripciójának szabályozását. A gazdasejtben az ilyen szekvenciákról például a Grb2 vagy a Grb3-3 celluláris mRNS-ével komplementer RNS íródhat át, amely így gátolni képes azok proteinné való 60 fordítását az EP 140 308 számú szabadalmi leírásban közölt eljárás szerint. Az ilyen szekvenciákat az ellentétes irányban átirt 1. számú szekvencia vagy annak ellentétes irányban átírt része alkothatja.

Amint azt korábban jeleztük, a Grb2 minimum két funkcióval rendelkező fehérje, amely SH2 doménjével jellegzetes, tirozinon foszforilált szekvenciákhoz, míg két SH3 doménjével az SOS-családba tartozó kicserélődési faktorokhoz kapcsolódik. A Grb3-3, mivel elvesztette a tirozinon foszforilált fehérjékhez való kapcsolódás képességét, kizárólag a SOS-fehéijékkel képes komplexet alkotni. így a Grb3-3 a Grb2-SOS-komplexnek az autofoszforilált növekedési faktorok receptorai vagy más, ugyancsak tirozinon foszforilált kapcsolódó fehérjék, mint például az SHC vagy az IRS1 által történő befogásával ellentétes hatást fejthet ki. Mivel a Grb3-3 képes ezt a befogást gátolni, képes a mitogén utak gátlására és a sejthalál indukálására is. A találmány valóban bemutatja, hogy a Grb3-3 fehérje kifejeződik bizonyos fiziológiai folyamatokban, mint például a tímusz érése során patkányban. A találmány bemutatja azt is, hogy a Grb3-3 képes a különböző sejttípusok apoptózisa által a sejthalált indukálni. Ezeket az igen előnyös tulajdonságokat (i) a rekombináns proteinnek 3T3 fibroblasztokba történő injektálásával és (ii) a Grb3-3-at kódoló szekvencia 3T3 sejtekbe történő átvitelével bizonyítottuk (4. pél- ? da). A Grb3-3 tehát képes az életképes sejtek, mint pél- t dául az immortalizált, rákos vagy embrionális sejtek halá- í lát kiváltani. Amint azt a példákban bemutatjukji a Grb2 képes a Grb3-3 hatását gátolni.

Másrészt a Grb3-3 expressziójának egy HlV-vírással fertőzött limfocita sejteken végzett vizsgálata azt mu- » tatta, hogy a 7 nappal az infekció után megfigyelt tömeges vírustennelődés korrelációban van a Grb3-3 mRNSének a fertőzött sejtek által történő nagymértékű exp- ressziójával (5. példa). Ez a kísérlet rámutat arra is, hogy a Grb3-3 sejtekre gyakorolt hatásának jelen esetben; a HÍV által való megszüntetése vagy ellensúlyozása lehetővé teszi a fertőzött sejtek életben tartását is, és így lehetővé teszi a T4-limfocitáknak, hogy betöltsék immunológiai védő szerepüket. Ebben a tekintetben a találmány egy a Grb3-3-nak a sejtekre gyakorolt hatását legalább részben megszüntetni vagy ellensúlyozni képes vegyület AIDS kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására való alkalmazására is vonatkozik. Részletesebben az alkalmazott vegyület lehet:

- a fentebb definiált antiszensz genetikai szekvencia;

- a jobb stabilitás vagy a jobb biológiai hozzáférhetőség érdekében módosított (foszforotioátok, köztes termékek stb.) vagy nem módosított, Grb3-3 specifikus oligonukleotid (előnyösen az N-terminális SH3 dómén és az SH2 dómén 1. gyöke közötti kódolószekvenciát átfogó oligonukleotidról lehet szó);

- minden olyan szekvencia, amelynek a fertőzött sejtbe történő bevitele a Grb2 nagymértékű expresszióját váltja ki.

A találmány szerinti nukleotidszekvenciákat bármilyen állapotban alkalmazhatjuk, például embernek vagy állatnak történő injektálás után, védelem indukálására vagy rák kezelésére. Részletesen, például tiszta

HU 221 516 Bl

DNS formájában injektálhatok a WO 90/11092 közzétételi iratban leírt eljárás szerint. Összetett formában is beadhatók, például DEAE-dextránnal [Pagano et al., J. Virol. 1, 891 (1967)], nukleáris proteinekkel [Kaneda et al., Science 243, 375 (1989)], lipidekkel [Felgner et al., 5 PNAS 84, 7413 (1987)], liposzómák alakjában [Fraley et al., J. Bioi. Chem. 255, 10431 (1980)] stb.

A találmány szerinti nukleotidszekvenciák előnyösen egy vektor részét képezik. Egy ilyen vektor használata lehetővé teszi a nukleinsavnak a kezelendő sejtbe 10 való bejuttatása elősegítését, és ezzel együtt stabilitásának megnövelését, ami meghosszabbitott terápiás hatás elérését teszi lehetővé. Ráadásul ugyanabba a vektorba több nukleinsavszekvenciát is bevezethetünk, ami szintén növeli a kezelés hatékonyságát. 15

Az alkalmazott vektor bármilyen eredetű lehet, amennyiben képes állati sejteket, előnyösen humán tumoros sejteket transzformálni. A találmány egy előnyös megvalósítási módjában virális vektort használunk, amit az adenovírusok, retrovírusok, adenoasszo- 20 ciált vírusok (AAV), herpeszvírusok, citomegalovirus (CMV), tehénhimlővírusok stb. közül választhatunk. Heterológ nukleinsavszekvenciákat tartalmazó, adenovírus, retrovírus vagy AAV-eredetű vektorokat az irodalomban már leírtak [Akii et al., Natúré Genetics 3, 224 25 (1993); Stradford-Perricaudet et al., Humán Gene Therapy 1, 241 (1990); EP 185 573, Levrero et al., Gene 101, 195 (1991); Le Gál la Salle et al., Science 259,

988 (1993); Roemer et Friedmann, Eur. J. Biochem.

208, 211 (1992); Dobson et al., Neuron 5, 353 (1990); 30 Chiocca et al., New Bioi 2, 739 (1990); Miyanohara et al., New Bioi. 4,238 (1992); WO 91/18088].

A találmány vonatkozik tehát minden olyan rekombináns vírusra is, amely genomjába inszertálva egy az előzőekben definiált nukleotidszekvenciát tartalmaz. 35

Előnyösen a találmány szerinti rekombináns vírus egy defektív vírus. A „defektiv vírus” kifejezés egy a célsejtben replikálódásra képtelen vírust jelöl. Általában a találmány keretein belül alkalmazott defektiv vírus genomjából legalább az említett vírusnak a fertőzött sejt- 40 ben való replikációjához szükséges szekvenciák hiányoznak Ezeket a régiókat vagy eltávolították (teljesen vagy részben), vagy működésképtelenné tették, vagy más szekvenciákkal helyettesítették többek között a találmány szerinti nukleotidszekvenciával. A defektiv vírus 45 előnyösen megőrzi genomjának azon részeit, amelyek a vírusrészecskék burokba pakolódásához szükségesek

Igen előnyös a találmány szerinti nukleotidszekvenciákat egy rekombináns defektiv adenovírusba, AAVbe vagy retrovirusba beépített formában alkalmazni. 50

Ami az adenovírusokat illeti, több olyan szerotípusuk létezik melyeknek szerkezete és tulajdonságai egy kissé eltérnek de amelyek nem patogének az emberre, különösen az olyan betegekre, akiknek immunrendszere nem gyengült le. Másrészt ezek a víru- 55 sok nem integrálódnak azoknak a sejteknek a genomjába, amelyeket megfertőztek és nagyobb exogén DNSíragmenseket be tudnak építeni. A különböző szerotípusok közül előnyben részesítjük a találmány keretem belül a 2 és 5 típusú adenovírusokat (Ad 2 vagy Ad 5). 60

Az Ad 5 adenovírusok esetében a replikációhoz szükséges szekvenciák az El A és E1B régiók.

A találmány szerinti defektív rekombináns vírusokat egy defektív vírus és egy többek között az előzőekben definiált nukleotidszekvenciát is hordozó plazmid közötti homológ rekombinációval állíthatjuk elő [Levrero et al., Gene 101, 195 (1991); Graham, EMBO J. 3 (12), 2917 (1984)]. A homológ rekombináció az említett vírus és plazmid egy megfelelő sejtvonalba történt kotranszfekciója után jön létre. Az alkalmazott sejtvonalnak előnyösen (i) az említett elemekkel transzformálhatónak kell lennie, és (ii) hordoznia kell a defektív vírus genomjának egy részét komplementálni képes szekvenciákat, a rekombináció veszélyének elkerülése végett előnyösen integrált formában. Példaként a rekombináns defektiv adenovírusok előállításához alkalmazható sejtvonalként megemlíthetjük a 293 humán embrionálisvese-sejtvonalat [Graham et al., J. Gén. Virol. 36, 59 (1977)], amely genomjába integrált módon tartalmazza többek között egy Ad5 adenovírus genomjának bal oldalát (12%). A rekombináns defektiv retrovírusok előállításához alkalmazható sejtvonalra példaként említhetjük a CRIP sejtvonalat [Dános et Mulligen, PNAS 85, 6460 (1988)].

Végül a felszaporodott vírusokat a molekuláris biológia klasszikus módszerei szerint összegyűjtjük és tisztítjuk.

A találmány tárgya egy gyógyszerkészítmény isi amely legalább egy fentebb definiált rekombináns vím. rust vagy nukleotidszekvenciát tartalmaz.

A találmány szerinti gyógyszerkészítményeket kül* sőleg, orális, parenterális, intranazális, intravénás, intrar muszkuláris, szubkután, intraokuláris stb. úton történő beadáshoz formulázhatjuk.

A gyógyszerkészítmény előnyösen egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozót tartalmaz, a közvetlenül a kezelendő tumorba való injektálható fonnulázáshoz. Különösen sóoldatokról (mononátrium-foszfát, dinátrium-foszfát, nátrium-, kálium-, kalcium- vagy magnézium-klorid stb. vagy ilyen sók keveréke), steril, izotóniás oldatokról vagy szárított készítményekről, többek között liofilezettekről lehet szó, amelyek az adott esettől függően steril víz vagy fiziológiás szérum hozzáadásával lehetővé teszik injektálható oldatok készítését.

Az alkalmazott nukleinsav (szekvencia vagy vektor) dózisát különböző paraméterek, többek között az alkalmazott beadási mód, az illető betegség, a kifejezni kívánt nukleinsav vagy az előirt kezelés időtartama figyelembevételével lehet beállítani. Általában a találmány szerinti rekombináns vírusokat 10⁴ és 10¹⁴ pfu/ml közötti, előnyösen 10⁶ és 10¹⁰ pfu/ml közötti dózisban formulázzák és adják be. A pfu („plaque forming unit”) kifejezés egy vírusoldat fertőzőképességét fejezi ki, és egy megfelelő sejtkultúra fertőzésével és a fertőzött sejteken keletkezett plakkok általában 48 óra elteltével történő megszámlálásával határozzák meg. Egy virális oldat pfu titere meghatározásának technikái az irodalomban jól dokumentáltak.

Az ilyen gyógyszerkészítmények az embernél rákok kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmazhatók.

HU 221 516 BI

Részletesebben, a találmány szerinti termékek - mivel képesek a ras proteinek aktivitásának modulálására lehetővé teszik, hogy a rákok kialakulásának folyamatába beavatkozzunk, többek között gátolni tudják az olyan onkogének aktivitását, melyek transzformáló akti- 5 vitása egy funkcionális p21-GAP interakció útján hat. Számos rákot kapcsolták valójában onkogén ras proteinek jelenlétéhez. Azon rákok közül, melyek leggvakrabban tartalmaznak mutált ras géneket, megemlíthetjük többek között a hasnyálmirigy-adenokarcinómákat, 10 melyeknek 90%-a rendelkezik egy a tizenkettedik kodonon mutált Ki-ras onkogénnel [Almoguera et el.:

Cell 53, 549 (1988)], a vastagbél-adenokarcinómákat és a pajzsmirigyrákokat (50%) vagy a tüdőrákokat és a mieloid leukémiákat [30%, Bős J. L.: Cancer Rés. 49, 15 4682 (1989)]. Általánosabban a találmány szerinti vegyületek minden olyan típusú betegség kezelésére alkalmazhatók, amelyekben abnormális sejtosztódást figyeltek meg, az apoptózis indukciója révén, és minden apoptózis általi sejthalállal jellemezhető betegségben 20 (AIDS, Huntington-kór, Parkinson-kór), a Grb3-3 hatását gátló (nevezetesen antiszensz) összetevők révén.

A találmány a Grb3-3 gén izolálást eljárására is vonatkozik, amely abban áll, hogy egy humán DNSbankot egy a Grb2 gén szekvenciájából származó szón- 25 dával átvizsgálunk, az igy kapott kiónokat azonosítjuk, és klónozás után szekvenáljuk. Az alkalmazott szonda az ATGGAAGCCA TCGCCAAATA TGAC szekvenciával rendelkezik. Az izolált Grb3-3 gén az 1. számú szekvenciavázlaton bemutatott nukleotidszekvenciával 30 rendelkezik.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás vektorok előállítására, melynek során egy alkalmas vektorba, előnyösen virális vektorba bevisszük a találmány szerinti izolált nukleotidszekvenciát vagy variánsait. 35 Vektorként előnyösen rekombináns vírusokat állítunk elő, még előnyösebben rekombináns replikádéban detektív adenovírusokat, melyek genomjába inszertáljuk a találmány szerinti nukleotidszekvenciákat.

A találmány még továbbá gyógyszerkészítmények 40 előállítására is vonatkozik, amely abban áll, hogy a találmány szerinti nukleotidszekvenciákat vagy vektorokat inért hordozóval összekeverve gyógyszerkészítményekké alakítjuk. Előnyösen rákok kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő. 45

Á találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti izolált nukleotidszekvencia által kódolt polipeptid előállítási eljárása, amely abban áll, hogy a találmány szerinti rekombináns vírussal sejteket fertőzünk, a felszaporodott rekombináns vírusokat összegyűjtjük és 50 tisztítjuk.

A találmányt részletesebben leírják az itt következő példák, amelyeket szemléltetőnek kell tekinteni, nem pedig az oltalmi kört korlátozóknak.

Az ábrák leírása 55

1. ábra: Grb2 és Grb3-3 szerkezeti doménjeinek sematikus bemutatása

2. ábra: Grb3-3 EGF-receptorhoz (2A. ábra) és prolingazdag peptidekhez (2B. ábra) való kötésének vizsgálata 60

3. ábra: Grb3-3 hatása egy poliomavírus enhanceréből származó RRE ras általi transzaktivációjára

4. ábra: Grb3-3 által kiváltott sejthalál bizonyítása 3T3 fibroblasztokon

5. ábra: Grb3-3 expressziójának bizonyítása HIVvírussal fertőzött sejtekben

A molekuláris biológia általános technikái

A molekuláris biológiában használt klasszikus eljárások, mint például a plazmid-DNS preparatív extrakciója, a plazmid-DNS cézium-klorid-gradiens centrifugálása, az akrilamid vagy agaróz gélelektroforézis, a DNS-fragmentumok elektroelúcióval való tisztítása, a proteinek fenolos vagy fenol-kloroformos extrakciója, a DNS etanolos vagy izopropil-alkoholos kicsapása, az Escherichia coli transzformálása stb. a szakemberek számára jól ismertek, és az irodalom részletesen tárgyalja azokat [Maniatis T. et al., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982; Ausubel F. M. et al. (eds), „Current Protocolls in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, New York, 1987].

A pBR322, pUC plazmidok és az M13 sorozat fágjai kereskedelmi eredetűek (Bethesda Research Laboratories).

A ligálásokhoz a DNS-fragmentumokat agaróz vagy? akrilamid gélelektroforézissel méretük szerint elválaszt* juk, fenollal vagy fenol-kloroform elegyével extraháljuk, etanollal kicsapjuk, majd a forgalmazó előírásai szerint T4 DNS-ligáz (Biolabs) jelenlétében inkubáljuk. >

A túllógó 5’ végek betöltését E. coli DNS-polime-rázának Klenow-fragmentumával (Biolabs) végezhet-? jük, a forgalmazó előírásai szerint A túllógó 3’ végek leemésztését T4 DNS-polimeráz jelenlétében végezzük, a gyártó előírásai szerint. A túllógó 5’ végek leemésztését Sl nukleázos kezeléssel végezzük.

A szintetikus oligonukleotidok által irányított in vitro mutagenezist a Taylor et al. [Nucleic Acids Rés. 13 (1985) 8749-8764] által kifejlesztett eljárással, az Amersham által forgalmazott kitet használva végezhetjük.

Az úgynevezett PCR-technikával [polimerázkatalizált láncreakció, Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R. K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K:B: et Falcona F:A., Meth. Enzym. 755 (1987) 335-350] történő enzimatikus DNS-ampliükációt egy „DNA thermal cycler”-t alkalmazva (Perkin Elmer Cetus) végezhetjük, a gyártó előírásai szerint.

A DNS-szekvenciák meghatározását a Sanger et al. által kifejlesztett módszer [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] szerint végezhetjük, az Amersham által forgalmazott kittel.

Példák

1. példa

A Grb3-3 gén izolálása

A GA3-3 gént egy humán DNS-banknak egy a Grb2 gén szekvenciájából származó szondával való átvizsgálásával izoláltuk.

HU 221 516 Bl

500 humán placentagénbankból (Clontech) származó DNS-fragmentumokat hordozó rekombináns lambda gtll fágot vizsgáltunk át egy a Grb2 gén szekvenciájából származó szondával. Az alkalmazott szonda a Grb2 protein első 8 aminosavának felel meg, és a következő szekvenciával rendelkezik:

ATGGAAGCCA TCGCCAAATA TGAC(2. számú szekvencia) pozitív kiónt azonosítottunk ezen a módon. Ennek a 10 kiónnak az inszertumát EcoRI fragmens formájában izoláltuk, M13mpl8 plazmidba klónoztuk, és szekvenáltuk. A 10 klón közül 9 a Grb2 szekvenciával azonos inszertumot hordozott. Közülük egy azonban a Grb2 gén méreténél kisebb méretű inszertumot hordozott egy, az SH2 doménban lévő deléció miatt (1. ábra). A fennmaradó szekvencia analízise a Gib2 megfelelő régióival való teljes egyezést mutatott, beleértve a nem kódoló 5’ és 3’ régiókat is. A klón nyílt leolvasási kerete egy 177 aminosavból álló proteint kódol (1. számú szekvencia), amely 2 SH3 domént tartalmaz, melyek egy hiányos SH2 domént szegélyeznek (1. ábra). Az SH2 doménből deletált aminosavak (a Grb2 protein 60-100 gyökei) a Grb2 foszforilált tirozint tartalmazó fehérjékhez való kötésében szerepet játszó gyököknek felelnek meg.

2. példa

A Grb3-3 protein kötési aktivitása

Amint azt fentebb jeleztük, a Grb2 a foszforilált növekedésifaktor-receptorok és az SOS-faktorok közötti kölcsönhatás mediátora. Ez a példa bemutatja, hogy a Grb3-3 protein nem képes a foszforilált EGF-receptorral kölcsönhatásba lépni, de megőrzi kölcsönhatási képességét egy a humán SOSl-faktor szekvenciájából származó prolingazdag pepiiddel.

A Grb3-3 kötési képességét biotinezett glutation-Stranszferázzal (GST) fuzionált proteineket alkalmazva vizsgáltuk. Az ilyen típusú fúzió a rekombináns termékek gyors és hatékony tisztítását teszi lehetővé. Ehhez a találmány szerinti szekvenciákat E. coli TG1 törzsben fejeztük ki GST-vel fuzionált proteinek formájában, a Smith és Johnson által leirt technikát alkalmazva [Gene 67, 31 (1988)]. Röviden a Grb2 és Grb3-3 géneket először mindkét oldalukon, a start- és stopkodonoknál egy BamHI-hely bevezetésével módosítottuk. Ehhez a gének nyílt leolvasási keretét PCR-rel amplifikáltuk a következő oligonukleotidok segítségével:

I. oligonukieotid (5’) (3. számú szekvencia): GAATTCGGAT CCATGGAAGC CATCGCCAAA TATGACTTC

II. oligonukieotid (3’) (4. számú szekvencia): GAATACGGAT CCTTAGACGT TCCGGTTCAC GGGGGTGAC

Az aláhúzott rész a kialakított BamHI-helynek felel meg, amelyet a start- vagy stopkodon követ vagy előz meg.

Az így amplifíkált géneket azután BamHI-fragmens formájában az ugyanazon enzimmel linearizált pGEX 2T vektorba (Pharmacia) klónoztuk a GST-t kódoló cDNS-től 3’ irányba, azzal fázisban. Az igy kapott vektorokat használtuk azután az E. coli TG1 törzs transzformálására. Az így transzformált sejteket egy éjszakán át előtenyésztettük 37 C°-on, LB tápközegben 1/10-re hígítottuk, IPTG-t adtunk hozzá az expresszió indukálására (2 óra, 25 C°), majd 21 órán át körülbelül 25 C°-on tenyésztettük. A sejteket azután lizáltuk, és a termelődött fúziós proteineket agaróz-GSH affinitásoszlopon tisztítottuk. Ehhez a baktériumlizátumot a (lízispufferrel elkészített és kiegyensúlyozott) gél jelenlétében inkubáltuk 15 percig 4 C°-on. Tris-HCl- (pH=7,4) pufferral végzett három mosás után a proteineket GST-felesleget tartalmazó Tris-HCl- (pH=7,7) puffer jelenlétében eluáltuk. A felülúszót összegyűjtöttük és centrifugáltuk.

Ugyanezt az eljárást alkalmaztuk egy olyan Grb2 mutáns előállítására, amelyben a 203 glicint egy arginin helyettesíti (GA2G203R), és egy olyan Grb3-3 mutáns előállítására, amelyben a 162 glicint egy arginin helyettesíti (Grb3-3G162R). A Grb2G203R mutánsról leírták, hogy egy DNS-szintézis reiniciációs tesztben nincs aktivitása (Lowenstein et al., idézve). A Grb3-3G162R ugyanazt a mutációt hordozza ugyanabban a pozícióban, így ugyanúgy inaktívnak kellene lennie.

Ezeket a mutánsokat a Grb2 és Grb3-3 gén PCRrel végzett mutagenezisével állítottuk elő, az 5’ végen a korábban leírt I. oligonukleotidot, a 3’ végen a következő oligonukleotidot alkalmazva, mely utóbbin a mutált kodon alá van húzva:

ΙΠ. oligonukieotid (3’) (5. számú szekvencia): GACGTTCCGG TTCACGGGGG TGACAT A ATI. GCGGGGAAAC ATGCGGGTC

Az így amplifíkált fragmenseket azután eluáltuk, újból amplifikáltuk PCR-ral, az I. és II. oligonukleotidok segítségével, majd a pGEX 2T vektorba klónoztuk; A mutánsokat azután a fentebb leírt módon termeltük.

A GST-vel fuzionált proteineket (GST-Grb2, GST-GA3-3, GSTGrb3-3G162R és a GST) azután biotineztük, a klasszikus, szakember számára ismert eljárásokkal [v. ö. a molekuláris biológia általános módszereivel, valamint Mayer et al., PNAS 88, 627 (1991)], és az immobilizált, foszforilált EGF-receptorhoz (2.1.), majd egy hSOSl-eredetű pepiidhez (2.2.) való kötés meghatározására szondaként alkalmaztuk.

2.1. példa

Foszforilált EGF-receptorhoz való kötés

Módszer: Az alkalmazott EGF-receptort A431 sejtekből tisztítottuk WGA-szefarózon való immobilizációval, a Duchesne és munkatársai által leírt technikával [Science 259, 525 (1993)]. Először 2 pg receptort 1 μΜ EGF-fel 10 percig 22 C°-on stimuláltunk, majd hideg ATP-vel (10 μΜ) vagy anélkül, 2,5 mM MnCl₂jelenlétében, HNTG-pufferban (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,1% Triton, 10% glicerin, pH=7,5) 4 C°-on 2 percig inkubáltuk. Ezután leállítottuk a receptor foszforilációját egy lebontópuffer hozzáadásával. A mintákat azután 4-20%-os SDS-PAGE-gélre vittük fel, majd átvittük poli(vinilidén-difluorid) (PVDF) membránra. A blotot azután különböző biotinált GSTfüziók jelenlétében (2 pg/ml) inkubáltuk, majd alkalikus foszfatázhoz kötött sztreptavidin (Promega) segítségével előhívtuk. Az EGF-receptorokat immunblotnak is alávetettük, anti-foszfotirozin-antitestek (anti-PY)

HU 221 516 BI jelenlétében, hogy igazoljuk, hogy a receptorok valóban foszforilálódtak.

Eredmények: A kapott eredményeket a 2a. ábrán mutatjuk be. Amint az várható volt, a Grb2 protein csak a foszforilált formában lévő EGF-receptorral lép köl- 5 csönhatásba. A Grb3-3 nem köt az EGF-receptorhoz, bármilyen annak foszforiláltsági foka.

2.2. példa

Egy hSOSl-eredetű pepiidhez való kötés

Módszer: A következő két, prolinban gazdag pép- 10 tidet szintetizáltuk:

hSOSl peptid: GTPEVPVPPPVPPRRRPESA: Ez a peptid a hSOSl fehéije 1143-1162 gyökeinek felel meg [Li et al., Natúré 363, 83 (1993)], amely rész a Grb2 és a hSOSl közötti kölcsönhatásért felelős (6. szá- 15 mú szekvencia).

3BP1 peptid: PPPLPPLV: Ez a peptid a 3BP1 fehérjéből származik, amely arról ismert, hogy hatásosan kapcsolódik az Abl és az Src SH3 doménjéhez [Cicchetti et al., Science 257, 803 (1992)] (7. számú 20 szekvencia).

A peptidek mindegyikét (1 pl, 10 mg/ml) nitrocellulóz membránon immobilizáltuk. A membránokat azután blokkolópuffeiban (Tris 20 mM, pH=7,6,150 mM NaCl, 0,1% Tween, 3% szarvasmarha-albumin) inkubál- 25 tűk. Ezután egy éjszakán át 4 C°-on, különböző biotinezett GST-fúziók jelenlétében inkubáltuk, majd alkalikus foszfatázzal (Promega) kapcsolt sztreptavidin segítségével előhívtuk.

Eredmények: A kapott eredményeket a 2B. ábra 30 mutatja be. A Grb3-3, ugyanúgy, mint a Grb2, képes a hSOSl pepiidhez kötni. Ezenfelül az eredmények rámutatnak, hogy ez a kölcsönhatás specifikus, mivel nem figyeltünk meg semmilyen kötést a 3BP1 peptiddel. Másrészt az eredmények azt is megmutatják, hogy a 35 Grb3-3G162R mutáns többé nem képes a hSOSl peptiddel kötést létesíteni, és ez alátámasztja ezen gyök fontosságát, és ennek a kölcsönhatásnak a funkcionális szerepét.

3. példa

A Grb3-3 protein aktivitása

A példa azt mutatja be, hogy az SH2 doménban lévő deléció ellenére a Grb3-3 protein rendelkezik funkcionális hatással. 45

A Grb3-3 protein aktivitását egy ras válaszelemekkel (RRE) rendelkező, és egy riportergén kifejeződését irányító promoter transzaktivációjában a rassal való együttműködési képességének meghatározásával vizsgáltuk. Az alkalmazott módszert például a Schweig- 50 hoffer és munkatársai, Science 256, 825 (1992) helyen írták le. Röviden az alkalmazott promoter egy az egér timidin-kináz-gén promoteréből és 4 ismétlődő, a polioma enhanceréből származó PEA1 elemből [Wasylyk et al., EMBO J. 7, 2475 (1988)] álló szintetikus promo- 55 tér: a promoter Py-TK. Ez a promoter irányítja a riportergén kifejeződését, jelen esetben a bakteriális kloramfeníkol-acetil-transzferáz (CAT)-génét: ez a Py-TK-CAT vektor. A tesztelt gének expressziós vektorait az említett géneknek a pSV2 plazmid BglII helyére 60

BamHI-fragmensként való inszertálásával állítottuk elő. Ez a hely lehetővé teszi, hogy a géneket az

SV40 korai promoterének irányítása alá helyezzük.

40%-os összefolyásig tenyésztett ER22 sejteket transzfektálunk 0,5 pg Py-TK-CAT vektorral (Py) egymagában vagy a Grb2 2 pg, Grb3-3 2 pg,

Grb2G203R 2 pg, Grb3-3G162R 2 pg vagy Grb3-3 2 pg+Grb2 2 pg géneket a korai SV40 promoter kontrollja alatt tartalmazó expressziós vektor jelenlétében. Minden esetben a DNS összmennyiségét inszertum nélküli expressziós vektorral 5 pg-ra állítottuk be. A transzfekciót lipospermin (Transfectam,

IBF-Sepracor) jelenlétében végeztük. A sejteket 48 órán át tenyésztettük 0,5% fötális boíjúszérummal kiegészített DMEM közegben. Azután a Cat aktivitását (a RRE transzaktivációját) a Wasylyk és munkatársai által leírt módszenei [PNAS 85, 7952 (1988)] határoztuk meg.

A kapott eredményeket a 3. ábra mutatja. Az eredmények egyértelműen azt mutatják, hogy a Grb3-3 protein expressziója ellensúlyozza a növekedési faktor receptorának aktivációs hatását. Rámutatnak arra is, hogy a Grb2 túlsúlya ellensúlyozza a Grb3-3 növekedési faktorokra történő válaszra gyakorolt hatását.

4. példa

A Grb3-3 által indukált sejtes apoptózis l

Ez a példa a Grb3-3 a sejtek apoptózisában játszott j közvetlen szerepére mutat rá. Ez a sajátosság különös J.

sen előnyös felhasználási lehetőségeket kínál a sejtosz- ? f tódás eredményeképpen kialakuló betegségek (rákok, resztenózis stb.) kezelésére. f

A sejtek Grb3-3 által kiváltott apoptózisát (i) a re* ] kombináns proteinnek 3T3 fibroblasztokba történő in- | jektálásával, és (ii) a Grb3-3-at kódoló szekvencia |

3T3 sejtekbe történő átvitelével mutatjuk be. | (i) A rekombináns protein injektálása iA rekombináns Grb3-3 proteint GST-vel való fúziós protein formájában állítottuk elő, a 2. példában leírt eljárás szerint. A fúziós fehérjét azután trombinnal (0,25%, Sigma) kezeltük, hogy eltávolítsuk a GSTrészt, majd ioncserélő kromatográfiával, monoQ oszlopon tisztítottuk. A rekombináns proteint tartalmazó frakciókat Microsep mikrokoncentrátorral (Filtron) mM (pH 7), 100 mM NaCl-t tartalmazó foszfátpufferban koncentráltuk. Az így kapott tisztított fehérjét tenyészetben lévő 3T3 sejtekbe injektáltuk (1-3 mg/ml) egy automata Eppendorf mikroinjektálóval. A sejteket azután 34 C°-on inkubáltuk, és szabályos időközökben lefényképeztük, hogy így kövessük a morfológiai változásokat. A kapott eredmények azt mutatják, hogy 5 órával a Grb3-3 injektálása után a sejtek nagy része halott, míg az ugyanolyan körülmények között injektált

Grb2-nek vagy mutáns Grb3-3G162R-nak nincs semmilyen hatása a sejtek életképességére.

(ii) A rekombináns proteint kódoló szekvencia átvitele |

Megalkottunk egy plazmidot, amely a Grb3-3 proteint kódoló 2. számú szekvenciát az SV40 vírus korai _r promotere kontrollja alatt tartalmazza.

HU 221 516 Bl

40%-os összefolyásig tenyésztett 3T3 sejteket transzferáltunk lipospennin (Transfectam, IBFSepracor) jelenlétében 0,5 vagy 2 pg fenti expressziós plazmiddal. A transzfekció után 48 órával a sejtek 50%-a szuszpenzióban volt a tápközegben, a fennma- 5 radó sejtek pedig, melyek az edény falára tapadtak, jelentős morfológiai változásokat mutattak (4. ábra).

Egy agaróz gélelektroforézises vizsgálat azt mutatta, hogy a sejtek az oligonukleoszomális DNS-nek olyan fragmentációs mintázatát mutatták, amely a halott sejtekre jellemző (4. ábra). Ezzel ellentétben, az ugyanilyen feltételek mellett Grb2, Grb3-3G162R vagy Grb2G203R expressziós plazmidokkal transzfektált sejtek megőrizték a normális morfológiát, továbbra is életképesek maradtak, és nem mutattak DNS-frag- 15 mentációt. Amint a 4. ábra mutatja, a Grb2 koexpressziója lehetővé teszi a Grb3-3 hatásának ellensúlyozását.

Ezek az eredmények egyértelműen azt mutatják, hogy a Grb3-3 gén egy ölő gén, amely képes a sejtek 20 apoptózisát indukálni. Amint az előzőekben jeleztük, ez a sajátosság különösen előnyös felhasználási lehetőségeket kittál a sejtosztódás eredményeképpen kialakuló betegségek, mint többek között a rákok, a resztenózis stb. kezelésére. 25

5. példa

A Grb3-3 HIV-vírussal fertőzött limfocitákban történő expressziójának igazolása

Ez a példa azt mutatja be, hogy a T-limfocitákban a HIV-vírus infekciós ciklusa során a Grb2 és Grb3-3 mRNS relatív aránya megváltozik, és hogy a Grb3-3 meszendzsere a tömeges vírustermelődés és a sejthalál pillanatában nagymértékben kifejeződik. Perifériásvér-limfocitákat HIV-l-vírussal fertőz10 tünk két hígításban (1/10 és 1/100) 1, 4 vagy 7 napig. A sejtek mRNS-ét reverz PCR-rel vizsgáltuk, Grb2 és Grb3-3 specifikus oligonukleotidok segítségével, hogy a Grb2 és a Grb3-3 meszendzserének relatív arányát meghatározzuk. A használt Grb3-3 specifikus oligonukleotidok a következők voltak:

IV. oligonukleotid (3’): ATCGTTTCCA AACGGATGTG GTTT (8. számú szekvencia)

V. oligonukleotid (5’): ATAGAAATGA AACCACATCC GITT (9. számú szekvencia)

A kapott eredményeket az 5. ábrán mutatjuk be. Az eredmények egyértelműen azt mutatják, hogy 7 nappal a HIV-vírussal való fertőzés után a Grb3-3 mRNS-e nagymértékben kifejeződik. Amint a p24 protein és a vírus reverz transzkriptázának aránya mutatja, a 7 nap annak a periódusnak felel meg, amikor a virális tömegtermelés figyelhető meg.

Szekvenciákjegyzéke l

1. számú szekvenciavázlat } (i) A szekvencia jellemzői: | (A) hosszúság: 933 bázispár ;

(B) típus: nukleinsav ₍ (C) szál típus: dupla t (D) topológia: lineáris I (ii) Molekulatípus: cDNS f (iü) Hipotetikus: nem · (iii) Antiszensz: nem (vi) Eredet: (A) Szervezet: Homo sapiens (ix) Jellemzés:

(A) név/kulcs: CDS (B) elhelyezkedés: 37...567 (D) Egyéb információk: /termék=„Grb3-3” (xi) A szekvencia leírása: 1. számú szekvencia

GAATTCGGGG CTGCTGAGCA CTGAGCAGGG CTCAGA ATG GAA GCC ATC GCC AAA 54

Met Glu Alá Ile Alá Lys

5

TAT

GAC

TTC

AAA

GCT

ACT

GCA

GAC

CTG

AGC

TTC

AAA

AGG

GGG

102

Tyr

Asp

Phe

Lys

Al a

Thr

Al a

Asp

Leu

Ser

Phe

Lys

Arg

Gly

10

15

20

GAC

ATC

CTC

AAG

GTT

TTG

AAC

GAA

TGT

GAT

CAG

AAC

TGG

TAC

AAG

150

Asp

Ile

Leu

Lys

Val

Leu

Asn

Glu

Cys

Asp

Gin

Asn

Trp

Tyr

Lys

25

30

35

GCA

GAG

CTT

AAT

GGA

AAA

GAC

GGC

TTC

ATT

CCC

AAG

AAC

TAC

ATA

GAA

198

Al a

Glu

Leu

Asn

Gly

Lys

Asp

Gly

Phe

Ile

Pro

Lys

Asn

Tyr

Ile

Glu

40

45

50

ATG

AAA

CCA

CAT

CCG

TTT

GGA

AAC

GAT

GTG

CAG

CAC

TTC

AAG

GTG

CTC

246

Me t

Lys

Pro

His

Pro

Phe

Gly

Asn

Asp

Val

Gin

His

Phe

Lys

Val

Leu

55

60

65

70

HU 221 516 Bl

CGA	GAT	GGA GCC	GGG AAG	TAC TTC	CTC TGG	GTG GTG AAG	TTC	AAT	TCT	294
Arg	Asp	Gly Ala	Gly Lys	Tyr Phe	Leu Trp	Val Val Lys	Phe	Asn	Ser
			75		80			85
TTG	AAT	GAG CTG	GTG GAT	TAT CAC	AGA TCT	ACA TCT GTC	TCC	AGA	AAC	342
Leu	Asn	Glu Leu	Val Asp	Tyr His	Arg Ser	Thr Ser Val	Ser	Arg	Asn
		90			95		100
CAG	CAG	ATA TTC	CTG CGG	GAC ATA	GAA CAG	GTG CCA CAG	CAG	CCG	ACA	390
Gin	Gin	Ile Phe	Leu Arg	Asp Ile	Glu Gin	Val Pro Gin	Gin	Pro	Thr
		105		110		115
TAC	GTC	CAG GCC	CTC TTT	GAC TTT	GAT CCC	CAG GAG GAT	GGA	GAG	CTG	438
Tyr	Val	Gin Ala	Leu Phe	Asp Phe	Asp Pro	Gin Glu Asp	Gly	Glu	Leu
	120			125		130
GGC	TTC	CGC CGG	GGA GAT	TTT ATC	CAT GTC	ATG GAT AAC	TCA	GAC	CCC	486
Gly	Phe	Arg Arg	Gly Asp	Phe Ile	His Val	Met Asp Asn	Ser	Asp	Pro
135			140			145			150
AAC	TGG	TGG AAA	GGA GCT	TGC CAC	GGG CAG	ACC GGC ATG	TTT	CCC	CGC	534
Asn	Trp	Trp Lys	Gly Ala	Cys His	Gly Gin	Thr Gly Met	Phe	Pro	Arg
			155		160			165
AAT	TAT	GTC ACC	CCC GTG	AAC CGG	AAC GTC	TAAGAGTCAA GAAGCAATTA	584
Asn	Tyr	Val Thr	Pro Val	Asn Arg	Asn Val
		170			175
TTTAAAGAAA GTGAAAAATG TAAAACACAT ACAAAAGAAT TAAACCCACA AGCTGCCTCT	644
GACAGCAGCC TGTGAGGGAG TGCAGAACAC CTGCCGGGTC ACCCTGTGAC CCTCTCACTT	704
TGGTTGGAAC TTTAGGGGGT GGGAGGGGGC GTTGGATTTA AAAATGCCAA AACTTACCTA	764
TAAATTAAGA AGAGTTTTTA TTACAAATTT TCACTGCTGC TCCTCTTTCC CCTCCTTTGT	824
CTTTTTTTTC TTCCTTTTTT CTCTTCTGTC CATCAGTGCA TGACGTTTAA GGCCACGTAT	884
AGTCCTAGCT GACGCCAATA AAAAACAAGA AACCAAAAAA CCCGAATTC			93 3

2. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) hosszúság: 24 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: cDNS (vi) Eredet:

(A) Szervezet: oligonukleotid (xi) A szekvencia leírása: 2. számú szekvencia

ATGGAAGCCA TCGCCAAATA TGAC 24

3. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) hosszúság: 39 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) Molekulatipus: cDNS (vi) Eredet:

(A) Szervezet: I. oligonukleotid (xi) A szekvencia leírása: 3. számú szekvencia

GAATTCGGAT CCATGGAAGC CATCGCCAAA TATGACTTC 39

4. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) hosszúság: 39 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: cDNS (vi) Eredet:

(A) Szervezet: U. oligonukleotid (xi) A szekvencia leírása: 4. számú szekvencia

GAATACGGAT CCTTAGACGT TCCGGTTCAC GGGGGTGAC 39

HU 221 516 Β1

5. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) hosszúság: 49bázispár (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: cDNS (vi) Eredet:

(A) Szervezet: ΙΠ. oligonukleotid (xi) A szekvencia leírása: 5. számú szekvencia

GACGTTCCGG TTCACGGGGG TGACATAATT GCGGGGAAAC ATGCGGGTC

6. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) hosszúság: 20aminosav (B) típus: aminosav (D) topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (vi) Eredet:

(A) Szervezet: hSOSl peptid (1143-1162 gyökök) (xi) A szekvencia leírása: 6. számú szekvencia

Gly Thr Pro Glu Val Pro Val Pro Pro Pro Val Pro Pro Arg Arg

5 10

Arg Pro Glu Ser Alá

20

7. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) hosszúság: 8 aminosav (B) típus: aminosav (D) topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (vi) Eredet:

(A) Szervezet: 3BP1 peptid (xi) A szekvencia leírása: 7. számú szekvencia Pro Pro Pro Leu Pro Pro Leu Val

5

8. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Szervezet: IV. oligonukleotid (xi) A szekvencia leírása: 8. számú szekvencia ATCGTTTCCA AACGGATGTG GTTT

9. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) hosszúság: 24 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) Molekulatipus: cDNS (vi) Eredet:

(A) Szervezet: V. oligonukleotid (xi) A szekvencia leírása: 9. számú szekvencia ATAGAAATGA AACCACATCC GTTT

Claims

1. Az 1. számú szekvenciavázlaton bemutatott nukleotidszekvencia.

2. Az 1. számú szekvenciavázlaton bemutatott nukleotidszekvencia egésze vagy része, amely képes legalább részben gátolni a Grb2 vagy Grb3-3 protein expresszióját.

3. Vektor, amely egy 1. vagy 2. igénypont szerinti nukleotidszekvenciát tartalmaz.

4. A 3. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy az egy virális vektor.

5. A 4. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, bőgj az egy adenovírus, retrovírus, AAV, HSV, CMV vagy tehénhimlővínjs.

6. A 4. vagy 5. igénypont szerinti vektor, azzaljellemezve, hogy az egy replikációjában defektív vírus.

7. Polipeptid, amelyet az 1. számú szekvenciavázlaton bemutatott nukleotidszekvencia kódol.

8. Gyógyszerkészítmény, amely egy vagy több, 3-6. igénypontok bármelyike szerinti vektort tartalmaz.

9. Gyógyszerkészítmény, amely egy vagy több, 1. vagy 2. igénypont szerinti nukleotidszekvenciát tartalmaz önmagában vagy DEAE-dextránnal, nukleáris proteinekkel vagy lipidekkel alkotott komplex formájában vagy liposzómákba épített formában.

10. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti nukleotidszekvencia vagy egy, 3-6. igénypont szerinti vektor alkalmazása rákok kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.

11. Eljárás az 1. számú nukleotidszekvenciával rendelkező Grb3-3 gén izolálásra, azzal jellemezve, hogy egy humán DNS-bankot egy, a Grb2 gén szekvenciájából származó szondával átvizsgálunk, és a Grb3-3 kiónokat azonosítjuk.

12. Az 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ATGGAAGCCA TCGCCAAATA TGAC szekvenciájú szondát alkalmazzuk.

13. Eljárás vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, 11. vagy 12. igénypont szerint előállított nukleotidszekvenciát alkalmas vektorba bevezetünk.

14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vektorként egy adenovírust, retrovírust, AAV-t, HSV-t, CMV-t, tehénhimlővírust vagy replikádéban defektív vírust használunk.

15. A 14. igénypont szerinti eljárás rekombináns vírus előállítására, azzal jellemezve, hogy a vírus genomjába inszertáljuk az említett nukleotidszekvenciát.

16. Eljárás polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, 13-15. igénypontok bármelyike szerinti vírusvektorral egy alkalmas sejtet megfertőzünk, a felszaporodott rekombináns vírusokat összegyűjtjük és a polipeptidet izoláljuk.

17. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy all. vagy 12. igénypont szerint izolált nukleotidszekvenciát, vagy egy, 13-15. igénypont szerint előállított vektort inért hordozóval összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk.

18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rákok kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.