UA127732C2 - Застосування штаму інактивованих бактерій виду delftia acidovorans рта-4249 або композиції, що містить вказаний штам, для поліпшення ровитку рослин та спосіб поліпшення розвитку рослин - Google Patents

Abstract

Винахід стосується застосування штаму інактивованих бактерій виду Delftіa acіdovorans, зареєстрованого в ATCC під номером PTA-4249, або композиції, що містить вказаний штам інактивованих бактерій, для поліпшення розвитку рослин, причому вказаний штам інактивованих бактерій відповідає бактеріям або бактеріальним препаратам, інактивованим фізичними, біохімічними, хімічними або фізико-хімічними процесами, та має життєздатність менше ніж 50 %, причому вказані інактивовані бактерії мають більшу біостимулюючу ефективність на розвиток рослин, ніж отримані з тим самим штамом живих бактерій. Винахід стосується також способу поліпшення розвитку рослин, що включає введення штаму інактивованих бактерій виду Delftіa acіdovorans, зареєстрованого в ATCC під номером PTA-4249, або композиції, що містить вказаний щонайменше один штам інактивованих бактерій.

Description

Даний винахід належить до нових композицій штамів інактивованих бактерій, способу їх одержання і їх застосування для поліпшення розвитку рослин.

Опис рівня техніки

Пошук нових стратегій, спрямованих на підтримку або підвищення продуктивності сільськогосподарських систем при одночасному скороченні використання хімічних речовин, продемонстрував вирішальне значення мікроорганізмів у біологічному функціонуванні агросистем. Ці дослідження призвели до появи концепції "біодобрив" і "біостимуляторів", які можуть бути визначені як продукти, що містять, наприклад, інактивовані живі мікроорганізми і/або екстракти мікроорганізмів, які при нанесенні на грунт або рослини заселяють ризосферу, і навіть колонізують тканини рослин, і стимулюють ріст рослин шляхом поліпшення, наприклад, засвоєння живильних речовин і вироблення фітогормонів.

У патенті США 5,589,381 описане виділення агента біологічного контролю, що містить штам

ВасШиз Іспепітогтів, який контролює фузаріоз, викликуваний присутністю Ризагішт у кукурудзі.

У патенті США 5,503,652 описане виділення штамів, які можуть сприяти подовженню корінь рослин.

У патенті США 5,935,839 описане застосування АйПгобасієг 5р. і Реендотопав Пиогезсепв5 для стимуляції росту сіянців хвойних рослин, при якому ризобактерії, що стимулюють ріст рослин (РОРК), вибирають за їх здатністю рости в кислому грунті і в умовах холоду, характерних для хвойних рослин.

В и 5,503,651 описане застосування штамів РОРК, які сприяють росту злаків, олійних культур і кукурудзи згідно зі здатністю до хемотаксису і завдяки штамам, що колонізують коріння.

У патенті США 5,496,547 описане виділення мутантів Рзепдотопав, які є ефективними біологічними агентами проти ВНі2осіюопіа 5о01апі.

У патенті США 4,849,008 описане нанесення Рзхейдотопах на коріння, рослини, насіння і фрагменти бульб або грунт для підвищення врожайності коренеплодів.

У патенті СІЛА 4,584,274 описані штами Рзхедотопав, стійкі до бактеріофагів, корисні для стимуляції росту коренеплодів.

У міжнародній заявці М/О2003057861 описане виділення і ідентифікація деякої кількості

Зо ризобактерій рослин, що сприяють росту (РОРЕ), які окиснюють сірку в сульфат, придатний для стимуляції росту рослин, таких як КАУ12, ідентифікований як Аспготорбасієг ріеснацайїй; ВАМ28, ідентифікований як Адгобрасієгійт іШштеїасіеп5, КАМ132, ідентифікований як біепоїгорпотопав5 тагГорпіїа; і КАУ209, ідентифікований як ОеЩіа асідомогапв.

У патенті СІЛА 6,194,193 описане застосування композиції для посилення росту рослин, яка містить суміш штамів Васійшз і Раєпірасіїйн5, що продукують фітогормони.

Іншим прикладом відомого гормонального ефекту є дія Аго5рійПшт 5рр (див., зокрема,

Кисеєу (1988), Ріапі агоулН-анегіпуд ейесів ої Агозріпшт Бгазієпзе апа Васйив С-1І-25 оп їмо м/пеаї сийімаг5. Чошгпаї ої Арріїєд Місторіоіоду, моїште 64, І55це З, раде5 187-196).

Деякі біодобрива складаються з живих організмів; тому їх необхідно виробляти, готувати з них склади і продавати, при цьому зберігаючи їх життєздатність і біологічну активність. Крім того, успішна інокуляція сільськогосподарських рослин мікроорганізмами в значній мірі залежить від кількості життєздатних клітин, внесених у грунт (Шидиеппе еї аї., 1999, РЕМ5

Місторіооду Есоіоду 29:331-339). Життєздатність інокулянту є важливим чинником успіху і адекватної колонізації ризосфери для одержання необхідного позитивного ефекту на ріст рослин. Основним недоліком використання біодобрив є те, що конкретні умови, такі як грунт, температура і вологість, можуть сильно змінюватися від однієї ділянки до іншої, і ці зміни можуть впливати на життєздатність мікроорганізмів і, отже, на врожайність і ріст рослин.

Отже, існує потреба в композиції, що стимулює розвиток рослин з поліпшеною ефективністю без недоліків, пов'язаних з підтримкою життєздатності такого типу біодобрива/біостимулятора.

Короткий опис винаходу

Даний винахід належить до способу підвищення біостимулювальної дії штаму живих бактерій або композиції, що містить його, який відрізняється тим, що він включає стадію інактивації штаму живих бактерій, причому зазначений штам інактивованих бактерій, отриманий таким чином, виявляє більш сильну біостимулювальну дію на розвиток рослин у порівнянні з дією такого ж штаму живих бактерій або композицією, що містить його.

Даний винахід також належить до штаму інактивованих бактерій для поліпшення розвитку рослин або до композиції, що містить його, який відрізняється тим, що зазначений штам інактивованих бактерій дозволяє поліпшити розвиток рослин у порівнянні з таким же штамом живих бактерій або композицією, що містить його.

Даний винахід також належить до штаму інактивованих бактерій для поліпшення росту рослин або до композиції, що містить його, який відрізняється тим, що зазначений штам інактивованих бактерій виявляє більш сильну біостимулювальну дію на розвиток рослин у порівнянні з дією такого ж штаму живих бактерій або композицією, що містить його.

Даний винахід також належить до способу застосування або застосування штаму інактивованих бактерій або композиції, що містить його, для поліпшення розвитку рослин, який відрізняється тим, що штам інактивованих бактерій дозволяє поліпшити розвиток рослин щодо того ж штаму живих бактерій або композиції, що містить його.

Даний винахід також належить до способу застосування або застосування штаму інактивованих бактерій або композиції, що містить його, для поліпшення розвитку рослин, який відрізняється тим, що штам інактивованих бактерій виявляє більш сильну біостимулювальну дію на розвиток рослин у порівнянні з таким же штамом живих бактерій або композицією, що містить його.

Переважно штам інактивованих бактерій або композиція, що містить його, отримані способом за даним винаходом, виявляють більш сильну біостимулювальну дію на розвиток рослин у порівнянні з таким же штамом живих бактерій або композицією, що містить його.

Переважно композиція і спосіб за даним винаходом дозволяють поліпшити розвиток рослин без необхідності враховувати життєздатність бактеріального інокуляту.

Короткий опис креслень

На фіг. 1 показана оцінка росту площі листя Агарідорвів ІНаЇапа, де: М означає культуральне середовище, відділене від ЮОеЩШіа асідомогапе КАМ209; Вода означає воду без активних або неактивних бактерій або культурального середовища; В-М означає ОеЩіа асідохотап5 КАУ209 у культуральному середовищі; Мр означає пастеризоване культуральне середовище, відділене від ОеЩШіа асідомогапе КАХУ209; 5 означає суспензію сірки; В-вода означає ЮОеЩщіа Асідомогапе

КАУ209 у воді; 17145 є позитивним контролем (Васіїйи5 атуїпоїїдиеїтасієпв 1745); (Внвода)р означає пастеризований розчин ОеєїЩіа асідомогап5 КАУ209 у воді, згідно з винаходом.

На фіг. 2 показані вбирні кореневі волоски рослин каноли (Вгазвзіса парив сийімаг 552501) через 36 днів після обробки стерильною водою.

На фіг. З показані вбирні кореневі волоски рослин каноли (Вгазвзіса парив сийімаг 552501)

Зо через 36 днів після обробки культуральним середовищем штаму ОеєїНіа асідохогап5 НАМУ209.

На фіг. 4 показані вбирні кореневі волоски рослин каноли (Вгазвзіса парив сийімаг 552501) через 36 днів після обробки штамом ОеєїЇйіа асідомогапе КАМ209, інактивованим обробкою

Френч-пресом (високий тиск із наступною швидкою декомпресією).

На фіг. 5 показані вбирні кореневі волоски рослин каноли (Вгазвзіса парив сийімаг 552501) через 36 днів після обробки штамом І асіорасійи5 "татпозив, інактивованим обробкою Френч- пресом (високий тиск із наступною швидкою декомпресією).

На фіг. 6 показані вбирні кореневі волоски рослин каноли (Вгазвзіса парив сийімаг 552501) через 36 днів після обробки штамом живих ОеЩіа асідохотапх ВАУ209.

На фіг. 7 показані вбирні кореневі волоски рослин каноли (Вгазвзіса парив сийімаг 552501) через 36 днів після обробки штамом живих І асіобасіїїш5 "татпозив.

На фіг. 8 показані вбирні кореневі волоски рослин каноли (Вгазвзіса парив сийімаг 552501) через 36 днів після обробки штамом ОеЩіа асідомогтап5 КАУ209, інактивованим пастеризацією.

На фіг. 9 показані вбирні кореневі волоски рослин каноли (Вгазвзіса парив сийімаг 552501) через 36 днів після обробки штамом І асіобасіїш5 "татпо5ив, інактивованим пастеризацією.

Докладний опис винаходу

Термін "живі бактерії" або "штами живих бактерій" означає бактерії або препарати бактерій з життєздатністю більше 70 95.

Термін "інактивовані бактерії" або "штами інактивованих бактерій" означає бактерії або препарати бактерій, вбитих фізичними, біохімічними, хімічними або фізико-хімічними процесами, і що мають життєздатність менше 50 95.

Термін "біомаса" означає весь органічний і мінеральний матеріал, що складає організм.

Термін "біостимулятор (біостимулювальний)" означає стимуляцію розвитку рослин.

Наприклад, розвиток рослин може включати один з наступних параметрів: укорінення, площа листя, цвітіння, плодоносіння, висоту рослини, біомасу, схожість і врожайність.

Термін "ризобактерії, що сприяють росту рослин" або "РОРЕК" означає ризосферні бактерії, що сприяють росту і здоров'ю рослин.

Термін "культуральне середовище" означає середовище, що містить елементи, необхідні для росту бактерій, що дозволяють культивувати бактерії за винаходом. Відповідно до одного з варіантів здійснення культуральне середовище може містити бактерії за винаходом під час їх бо росту або являти собою культуральне середовище, вільне від бактерій за даним винаходом,

якщо ці бактерії відділені від середовища в результаті процесу, зокрема, але не винятково, фільтрації або центрифугування. Відповідно до одного з варіантів здійснення культуральне середовище переважно являє собою рідке середовище. Усі ці середовища, а також звичайні процеси ферментації добре відомі фахівцеві в даній галузі техніки.

Термін "середовище для вирощування" означає сукупність продуктів, застосовуваних як середовище для вирощування певних рослин. їх застосування дозволяє одержати середовища з пористістю, зайнятою водою, і пористістю, зайнятою повітрям, які забезпечують як закріплення абсорбуючих органів рослин, так і контактування цих органів з розчинами, необхідними для росту рослин. Вони зазвичай складаються з органічних матеріалів і/або неорганічних матеріалів і зазвичай складаються з торфу, інших органічних матеріалів (зокрема, кокосових волокон, кори, деревних волокон, компостів) і неорганічних матеріалів (зокрема, грунту, піску, пуцолану, глин, мінеральної вати, перліту, вермикуліту).

Даний винахід належить до способу підвищення біостимулювальної дії штаму живих бактерій або композиції, що містить його, який відрізняється тим, що він включає етап інактивації штаму живих бактерій, причому зазначений штам інактивованих бактерій, отриманий таким чином, виявляє більш сильну біостимулювальну дію на розвиток рослин у порівнянні з дією такого ж штаму живих бактерій або композицією, що містить його. В одному із переважних варіантів здійснення етап інактивації, виконуваний у способі за винаходом, здійснюють за допомогою фізичних, біохімічних, хімічних або фізико-хімічних процесів. У більш переважному варіанті здійснення штам живих бактерій інактивують термічною обробкою або обробкою високим тиском. Переважно, штам живих бактерій інактивують пастеризацією. Більш переважно, штам живих бактерій інактивують без культурального середовища.

В одному з особливо переважних варіантів здійснення штам бактерій, використовуваний у способі за винаходом, належить до роду ОЮеЩіа, Аспготобрасієї, Аагорасієтшт або

Зіепоїторпотопаз. Переважно, штам бактерій належить до роду ОеШіа. Більш переважно штам бактерій являє собою ЮОеїНіа асідохогапе КАУ209, зареєстрований в АТСС 25 квітня 2002 року під номером РТА-4249, АсПготобасієг ріеспацаїй КАМ12, зареєстрований в Американській колекції типових культур (АТСС) 16 квітня 2002 року під номером РТА-4231, Адгобасієгт

Іштеїасіеєп5 КАУ28, зареєстрований в Американській колекції типових культур (АТСС) 16 квітня

Зо 2002 року під номером РТА-4232, або біепоїгорпотопав тайорпійа КАМ 132, зареєстрований в

Американській колекції типових культур (АТСС) 16 квітня 2002 року під номером РТА-4233. У ще більш переважному варіанті здійснення штам інактивованих бактерій являє собою штам ОеєїНіа асідомотап5 ВАУ209, зареєстрований в АТСС 25 квітня 2002 року під номером РТА-4249.

Даний винахід належить до штаму інактивованих бактерій або композиції для поліпшення розвитку рослин, яка відрізняється тим, що вона включає щонайменше один штам інактивованих бактерій. Переважно, даний винахід також належить до штаму інактивованих бактерій для поліпшення розвитку рослин, який відрізняється тим, що штам інактивованих бактерій забезпечує поліпшений розвиток рослин у порівнянні з тим же штамом живих бактерій.

Даний винахід належить до штаму інактивованих бактерій або композиції для поліпшення розвитку рослин, яка відрізняється тим, що вона включає щонайменше один штам інактивованих бактерій. Переважно, даний винахід належить до штаму інактивованих бактерій для поліпшення розвитку рослин, який відрізняється тим, що штам інактивованих бактерій виявляє більш сильну біостимулювальну дію на розвиток рослин у порівнянні з дією такого ж штаму живих бактерій або композицією, що містить його.

Штам бактерій, використовуваний відповідно до винаходу, може походити з будь-яких видів бактерій, зокрема, бактерій роду ОеєЩіа, АсНгтотобасієг, Аагорасієтішт і біепоїгорпотопазв.

Згідно з одним із переважних варіантів здійснення бактерії, використовувані за винаходом, можуть походити з видів ОеЩщіа асідомогап5, Аспготобасіег ріеспацаї, Адгобасієпит Шштеїасівнв5 і бїепоїгорпотопах таїюорпійа. Більш переважно вибирати використовуваний штам бактерій із групи, що складається зі штаму АсПгтотобрасієї ріеснацай КАМ12, зареєстрованого в

Американській колекції типових культур (АТСС) 16 квітня 2002 року під номером РТА-4231,

Адгорасієтйт іштеїасіепе КАУ28, зареєстрованого в Американській колекцію типових культур (АТСС) 16 квітня 2002 року під номером РТА-4232, 5іепоїторпотопаз тайПорнійа ВАМ 132, зареєстрованого в Американській колекції типових культур (АТСС) 16 квітня 2002 року під номером РТА-4233, і/або ОеЩіа асідомогап5 КАХУ209, зареєстрованого в Американській колекції типових культур (АТСС) 25 квітня 2002 року під номером РТА-4249, відповідно до

Будапештського договору про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів для цілей патентної процедури.

Згідно з одним з варіантів здійснення штам бактерій, використовуваний у даному винаході, 60 являє собою ризобактерії що сприяють росту рослин, або "РОРК". Відповідно іншому переважному варіанту здійснення штам інактивованих бактерій, використовуваний за винаходом, належить до роду Оещіа. Більш конкретно, штам бактерій, використовуваний за винаходом, являє собою штам ЮОеЩШіа асідомогап5 КАМ209, зареєстрований в Американській колекції типових культур (АТСС) 25 квітня 2002 року під номером РТА-424 9 відповідно до

Будапештського договору про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів для цілей патентної процедури.

Відповідно до одного із переважних варіантів здійснення бактерії за винаходом інактивують за допомогою фізичних, хімічних, біохімічних або фізико-хімічних процесів. Відповідно до одного з варіантів здійснення бактерії за даним винаходом інактивують обробкою високим тиском (наприклад, за допомогою Френч-преса або іншими способами, відомими в даній галузі техніки).

В іншому варіанті здійснення бактерії за даною заявкою інактивують термічною обробкою.

Більш переважно, бактерії за винаходом інактивують пастеризацією. Відповідно до одного з особливо переважних варіантів здійснення пастеризацію проводять шляхом нагрівання живих бактерій до температури від 60 "С до 90 "С, від 62 "С до 88 "С, від 65 "С до 85 "С, від 75 "С до 85"С або від 80 "С і 85"С. Згідно з іншим варіантом здійснення бактерії за винаходом пастеризують без культурального середовища. Згідно ще з одним варіантом здійснення бактерії за даним винаходом інактивують з культуральним середовищем. Згідно з іншим варіантом здійснення бактерії за даним винаходом інактивують без культурального середовища.

Згідно з одним з варіантів здійснення поліпшення розвитку і/або росту і продуктивності рослин і/або збільшення біостимулювальної дії на розвиток рослин, зокрема, але не винятково, включає поліпшення одного з наступних параметрів: укорінення, площа листа, розвиток кореня, цвітіння, плодоносіння, висота рослини, біомаса, схожість, урожайність, особливо в термінах кількості, якості або більш раннього дозрівання. Згідно з одним з варіантів здійснення посилення біостимулювальної дії на розвиток рослин включає площу листа, кількість вбирних кореневих волосків і/або висоту рослини.

Згідно з одним з варіантів здійснення даний винахід застосовний до всіх типів рослин, зокрема, без винятку, до зернових культур (пшениця, ячмінь, овес, жито, тритикале), коренеплодам (цукровий буряк, картопля, кукурудза), бобових (люцерна, конюшина, спаржа), кормових культур (райграс, костриця, садова трава, фестулоліум, люцерна, вика, рапс, кормова

Зо редька), олійних культур (соя, рапс, рапс, горох, квасоля, білий люпин, соняшник), овочів і городніх культур, плодових культур, виноградарства і декоративних культур (квітництво, газони, розсада розплідників).

Згідно з одним із переважних варіантів здійснення даний винахід належить до композиції для поліпшення розвитку рослин, яка відрізняється тим, що вона містить щонайменше один штам інактивованих бактерій, причому зазначений штам інактивованих бактерій виявляє більш сильну біостимулювальну дію на розвиток рослин у порівнянні із препаратом, отриманим з тим же штамом живих бактерій.

Відповідно до одного із переважних варіантів здійснення композиція за винаходом містить перед інактивацією від 107 КУО/мл до 1072 КУО/мл, від 105 КУО/мл до 10!7 КУО/мл, від 106

КУО/мл до 1072 КУО/мл, від 107 КУО/мл до 1072 КУО/мл, від 1096 КУО/мл до 10" КУО/мл, від 105

КУО/мл до 1019 КУО/мл, від 1056 КУО/мл до 107 КУО/мл або від 106 КУО/мл до 108 КУО/мл бактерій.

Відповідно до одного з варіантів здійснення композиція за винаходом містить щонайменше один штам бактерій інактивованих на 100 95, 99 95 (з 1 95 щонайменше одного штаму активних бактерій), 98 95 (з 2 96 щонайменше одного штаму активних бактерій), 97 95 (з З 975 щонайменше одного штаму активних бактерій), 96 95 (з 4 99 щонайменше одного штаму активних бактерій), 95 95 (з 5 У6 щонайменше одного штаму активних бактерій), 94 95 (з 6 96 щонайменше одного штаму активних бактерій), 93 95 (з 7 96 щонайменше одного штаму активних бактерій), 92 95 (3 895 щонайменше одного штаму активних бактерій) 9195 (з 995 принаймні одного штаму активних бактерій), 90 95-85 95 (з 10-15 95 щонайменше одного штаму активних бактерій), 85 95- 8095 (з 15-20 95 щонайменше одного штаму активних бактерій), 80 95-75595 (з 20-25 95 щонайменше одного штаму бактерій), 75 96-70 95 (з 25-30 95 щонайменше одного штаму бактерії), 70 95-65 95 (з 30-35 96 щонайменше одного штаму активних бактерій), 65 95-6095 (з 35 5-40 96 щонайменше одного штаму активних бактерій), 6095-55 95 (з 40-45 96 щонайменше від одного штаму активних бактерій) або 55 95-50 95 (з 45 55-50 96 щонайменше одного штаму активних бактерій).

Згідно з одним з особливо переважних варіантів здійснення композиція за винаходом містить щонайменше один штам інактивованих бактерій і носій, що підходить для застосування в сільському господарстві. Більш конкретно, підходящий для застосування в сільському бо господарстві носій підходить для введення інактивованих бактерій у рослину і/або грунт. Згідно з одним з варіантів здійснення носій перебуває у твердій і/або рідкій формі. Згідно з іншим варіантом здійснення носій є водою. Згідно з іншим варіантом здійснення носій являє собою водно-гербіцидну суміш. Відповідно до іншого варіанта здійснення носій являє собою суміш води і добрив. Згідно з іншим варіантом здійснення носій є культуральним середовищем.

Згідно з одним з особливо переважних варіантів здійснення композиція за винаходом містить штам інактивованих бактерій, відділений від культурального середовища.

Згідно з одним із переважних варіантів здійснення композиція, що містить щонайменше один штам інактивованих бактерій, може перебувати у формі порошку, гранул, мікрогранул, засобів для обробки насіння, рідких складів, капсульованих бактерій або рідких суспензій. Більш конкретно, композиція за винаходом перебуває в рідкій формі.

Згідно з одним із переважних варіантів здійснення композиція за винаходом перебуває в комбінації з підходящим складом, що містить порошки, зокрема, порошки, що змочуються, гранули, мікрогранули, засоби для обробки насіння, капсульовані бактерії, рідкі склади, включаючи, без обмеження, суспензії у воді, у розчиннику або культуральному середовищі.

Згідно з одним із переважних варіантів здійснення композиція за винаходом перебуває в підходящій формі для обробки грунту, обробки кореневої частини рослини, обробки листової частини рослини, обробки квітучої частини рослини, обробки плодоносної частини рослини і/або для обробки насіння. Згідно з іншим переважним варіантом здійснення композицію за винаходом вводять одночасно або послідовно, шляхом внесення в грунт, замочування корінь, обробки насіння або включення і/або покриття середовищем для росту, плівковим покриттям із продуктами для захисту рослин або добривами, або будь-яким іншим носієм, або будь-яким способом, що забезпечує безпосередній контакт або контакт у майбутньому композиції із призначеними для інокуляції насінням або рослинами. Більш конкретно, нанесення на грунт здійснюється, зокрема, але не винятково, шляхом розпилення, розкидання, поливу, обробки грунту, фертигації, краплинним шляхом у борозни з розсадою або на відкритий грунт.

Згідно з одним із переважних варіантів здійснення композиція за винаходом містить штам інактивованих бактерій у комбінації з іншими живими мікроорганізмами, інактивованими або в екстрактах, такими як бактерії, гриби і/або дріжджі. Більш конкретно, композиція за винаходом містить штам інактивованих бактерій у комбінації з іншими штамами інактивованих бактерій,

Зо причому зазначені бактерії сприяють розвитку рослин, живленню і захисту.

Згідно з одним із переважних варіантів здійснення композиція за винаходом також містить добрива, гербіциди, інсектициди, фунгіциди, бактерициди, мінеральні розчини і/або живильні середовища. Відповідно до іншого переважного варіанта здійснення композиція за винаходом також містить субстрат. Більш конкретно, субстрат містить органічний матеріал, зокрема, але не винятково, торф, неорганічні матеріали, зокрема, але не винятково, грунт і/або пісок, і/або глину, і/або інші компоненти грунту і/або синтетичні речовини. Більш конкретно, синтетична речовина може являти собою абсорбуючий матеріал, такий як, наприклад, гранулят.

Згідно з одним з варіантів здійснення композиція, що містить штам інактивованих бактерій, або штам інактивованих бактерій за даним винаходом забезпечує більш сильне поліпшення розвитку рослин у порівнянні з поліпшенням, забезпечуваним такою ж композицією, що містить такий же штам живих бактерій, або таким же штамом живих бактерій.

Згідно з іншим аспектом даний винахід належить до застосування штаму інактивованих бактерій або композиції, що містить його, для поліпшення розвитку рослин. Відповідно до одного з варіантів здійснення застосування композиції або штаму інактивованих бактерій за даним винаходом забезпечує більш сильне поліпшення розвитку рослин у порівнянні з поліпшенням, одержуваним при використанні такого ж штаму живих бактерій або такої ж композиції, що містить його.

Згідно з іншим аспектом даний винахід належить до способу поліпшення розвитку рослини, що включає введення композиції інактивованих бактерій за винаходом або штаму інактивованих бактерій за винаходом. Відповідно до одного з варіантів здійснення спосіб, що включає введення композиції штаму інактивованих бактерій або штаму інактивованих бактерій за винаходом, забезпечує більш сильне поліпшення розвитку рослин у порівнянні з поліпшенням, одержуваним при використанні такої ж композиції, що містить такий же штам живих бактерій, або такого ж штаму живих бактерій.

Відповідно до іншого аспекту даний винахід належить до рослини, отриманої шляхом використання композиції за винаходом або штаму інактивованих бактерій за винаходом для поліпшення розвитку рослини.

Відповідно до іншого аспекту даний винахід належить до рослини, отриманої шляхом використання способу поліпшення розвитку рослини, що включає введення композиції 60 інактивованих бактерій або штаму інактивованих бактерій за винаходом.

Приклади

Наведені нижче приклади дозволять ліпше зрозуміти даний винахід, які наведені для ілюстрації заявки, а не для обмеження її об'єму.

Були проведені випробування для перевірки впливу на розвиток модельної рослини деяких штамів, в основному живих або вбитих ОеїЇДЦіа асідомогап5, у комбінації або без культурального середовища.

Приклад 1 1-1. Одержання інокуляту бактеріального штаму: ЮеєїЇНіа асідомотапе

Необхідну бактеріальну концентрацію в кожному інокуляті оцінювали в еквіваленті 4-10"

КУО/м3 комерційного штаму Оєїйіа асідомогапо, відносно І РС8. Оскільки під час випробувань використовували ємності об'ємом 0,0003 м3, було визначено, що в кожну ємність необхідно вводити 1,2:108 КУО. 1-2. Метод підрахунку бактеріальних суспензій:

Штам бактерій ОеїЩіа асідомогтапе КАМ209 продається у вигляді рідкого складу, що містить суспензію бактерій у культуральному середовищі (ВіоВоо5і І ідиій або ВВІ). Щоб дізнатия концентрацію бактерій у продукті ВВІ, був виконаний їх підрахунок. З вихідної бактеріальної суспензії Вад-іп-Вох "М (ВВІ) відбирали 1 мл розчину, який поміщали в пробірку. У пробірку, що містить 1 мл бактеріальної суспензії, додавали лептонну воду (9 мл) для 107 розведення. 1 мл другого зразка цього розведення поміщали в пробірку і додавали 9 мл лептонної води для одержання 102 розведення. Потім цей процес повторювали доти, поки не були отримані 107 і 105 розведення. З кожного з 107 і 105 розведень відбирали по 100 мкл для інокуляції поверхні чашки Петрі (середовище Т5А: соєвий агар із триптоказеїном). У цілому для одного розведення інокулювали 6 чашок Петрі, які інкубували протягом 48 годин при 30 "С (АТСС, 2015; І агопег., 2015). Підраховували колонії на поверхні чашок і оцінювали концентрацію в ВВІ. (комерційному продукті) при 2:107 КУО/мл. 1-3. Метод підрахунку бактеріальних суспензій:

Штам бактерій ОеїЩіа асідомогтапе КАМ209 продається у вигляді рідкого складу, що містить суспензію бактерій у культуральному середовищі. Приготування бактеріального інокуляту в культуральному середовищі: "бактерії нсупернатант" (В-М):

Зо Для протоколу "бактеріїнсупернатант" (В-М) використовували бактеріальну суспензію ВВ. як таку. 1-4. Приготування інокуляту: "бактерії нвода": 1400 мл бактеріальної суспензії ВВІ центрифугували при 8500 об/хв (13000 9) протягом 15 хвилин. Бактеріальний осад розчиняли в 700 мл води і знову центрифугували. Цю стадію повторювали З рази, щоб вилучити культуральний супернатант, що залишився. Потім осад ресуспендували у водопровідній воді (приблизно 700 мл). Повторно вимірювали концентрацію бактерій у цьому розчині відповідно до протоколу, описаного в Прикладі 1-2. Після підрахунку колоній на поверхні чашок оцінювали концентрацію бактерій при 4-107 КУО/мл. Ця суспензія є протоколом "бактерії вода". 1-5. Підготовка протоколу "бактерії вода, пастеризовані" (Ввода) р):

Приблизно 200 мл суспензії "бактеріїнвода", описаної в Прикладі 1-2, нагрівали на водяній бані протягом 20 хвилин при 80 "С, щоб одержати суспензію "бактеріїнвода, пастеризовані" (В'вода) р). 1-6. Підготовка протоколу "культуральний супернатант" (М):

Бактеріальну суспензію ВВІ. центрифугували при 8500 об/хв (13000 4) протягом 15 хвилин, і відбирали приблизно 600 мл супернатанту для інокуляції рослин. Цей зразок є протоколом "культуральне середовище" (М). 1-7. Підготовка протоколу "пастеризований культуральний супернатант" (Мр):

Бактеріальну суспензію ВВІ центрифугували і після центрифугування вилучали 200 мл культурального супернатанту, який нагрівали на водяній бані протягом 20 хвилин при 80 с.

Отриманий розчин являє собою протокол "пастеризований культуральний супернатант" (Мр). 1-8. Підготовка протоколу "сірка" (5): 1 г сірки змішували з 100 мл води в контейнері для одержання протоколу "сірка" (5). 1-9. Підготовка протоколу для позитивного контролю Васійи5 аптпу/оїїднетасівеп5 1745 (1145):

Розпилений мікробний препарат Васійш5 аптуїоіїдоегасієпе 1745 у вигляді порошку, концентрований до 2:1019 КУО/г, ресуспендували у воді з одержанням цільової концентрації 4107 КУО/мл. б

Приклад 2 2-1. Підготовка рослин (Агарідорвів ІНаїапа)

Рослини вирощували на твердому середовищі в нестерильних умовах, наближених до природніх польових умов у наступних повторах:

Біологічний повтор-8 протоколівх3 повторухб ітерацій-144 рослини 2-2. Приготування розсади

Насіння зберігали при 4 "С для забезпечення правильного і синхронізованого проростання (АВКС, 2015). Приблизно 300-400 насінин висівали з низькою густиною в 3 чашках Петрі (діаметром 14 см) на папері для перевірки схожості насіння. Додавали еквівалентну кількість води, 5 мл, для просочення нею паперу для перевірки схожості насіння. Чашки Петрі поміщали в холодильник (4 "С) на З дня для стратифікації насіння. 2-3. Приготування мікро-теплиць і горщиків

Рослини вирощували в горщиках (бхбх7 см), поміщених в 6 мікро-теплиць (22х16х18 см).

Горщики заповнювали 150 г піщано-грунтової суміші для пророщення (2/3 живильний грунт і 1/3 піску, м/м).

Мікро-теплиці із внутрішньої сторони покривали іригаційною матою для підтримки вологого середовища для рослин.

Потім насіння вилучали із чашок Петрі і поміщали за допомогою щипців у горщики із грунтом (5-6 насінин на горщик). Після проростання насіння залишали один проросток на горщик. 2-4. Інокуляція і ріст рослин

Кожний сіянець інокулювали під час посіву розчинами/суспензіями, описаними в Прикладі 1, наступним чином. Розсаду вирощували із циклом день/ніч, при 23 "С протягом 16 денних годин, а потім при 18 "С протягом 8 нічних годин. Горщики поливали один або два рази на день у денний час. Вологість не регулювалася і становила приблизно 70-80 95. Кожний протокол інокулювали наступними дозами:

А) ОеїШіа асідомогапе КАМ209 у культуральному середовищі (В-М): б мл/горщик (18 горщиків)

В) "бактеріїнвода" (В-нвода): З мл/горщик (18 горщиків)

С) "(бактеріїнвода) пастеризовані" (В--вода)р: З мл/горщик (18 горщиків)

Зо р) "Пастеризований супернатант культури" (Мр): 6 мл/горщик (18 горщиків)

Е) вода: З мл/горщик (18 горщиків)

Е) "Супернатант культури" (М): 6 мл/горщик (18 горщиків)

С) Суспензія Васіїи5 ату/оїїдиегТасієпз 1745: 1 мл/горщик (18 горщиків)

Н) Сірка (5): 0,01 г/горщик (18 горщиків) (1 мл на рослину 1 95 (мас./об.) розчину).

Різні партії горщиків рандомізували таким чином, щоб був отриманий рівномірний розподіл тестованих зразків у використовуваній ділянці, що дозволяє усунути розкид змінних (температури, яскравості, аерації, вологості тощо), наявний у теплиці і приміщенні для культивування. У кімнаті для вирощування встановлювали З блоки з 8 періодично переміщуваних усередині блоку міні-теплиць. 2-5. Виміри та аналізи

Ріст рослин оцінювали за розвитком площі листя із часом. Рослини фотографували зверху кожні 2 дня і кожну фотографію аналізували за допомогою програмного забезпечення Фіджі для розрахунку площі листя кожної рослини протягом циклу.

Дані вимірів записували у файлі ЕхсеІ (площа листа, суха маса, свіжа маса), і ці дані аналізували за допомогою програмного забезпечення ХІ 5ТАТ. Для оцінки відмінностей між середніми значеннями протоколів використовували тест Тьюкі (апостеріорний тест множинного порівняння) (див. фіг. 1).

Таблиця 1

Середні значення площі листових пластин для кожного протоколу і за день

День? | День | Деньї! | Деньї4 | Деньї1б | Деньг0 | День24

Мр | 0,050с| 0и20рс | 0ибаар | 0,315арс| 0,859ар | 1,932а | 3,809а м | 0018с6| 0033с | бо50ь | 0,098с | беї8рь | 0бгяа | Та а Ь ї с - однорідні групи оброблених рослин, використані для проведення статистичного тесту Тьюкі.

Рг» Е: граничне значення для ступеня значимості

Відмінності, спостережувані у вимірах площі листа для кожного протоколу, є значимими (див. Таблицю 1). Значиму відмінність спостерігали між позитивним контролем (Васйив5 атупю!їїдиеїтасієп5 ІТ45) і негативним контролем (вода). Крім того, протокол (Ввода)р показав найкращі результати для площі листя рослин (перевищуючі дані для позитивного контролю) у порівнянні з іншими протоколами. Культуральний супернатант М показав найменший ріст листя.

Приклад З

Вивчення впливу інактивації штамів ОеЩШіа і І асіобасіїйи5 на параметри росту проростків каноли

Метою даного дослідження є визначення впливу обробки штамів ОєЩіа асідомогап5 і

І асюрасійн5 Патповзи5 пастеризацією на ріст сіянців каноли (Вгаззіса парив сийімаг 552501).

Більш конкретно, дане дослідження спрямоване на порівняння впливу пастеризованих і непастеризованих (тобто, живої бактеріальної культури) бактеріальних штамів на параметри росту проростків каноли. 3-1. Сорт каноли

Розсаду каноли Вгаз5віса пари5, що належить до сорту 5525СІ (Вгей Уошипо), дезінфікували відповідно до протоколу, описаного в Азади77атап еї аї. ("Мехароїотісв Ошйегепіайоп ої Сапоїа

Сепоїурев: Тожага ап Опаегеіапаіпу ої Сапоїа АПеіоспетіса!5". Егопіієгв іп Ріапі Зсієпсе, мої. 5, 2015.дої:10.3389/Лрі5.2014.00765). Після сушіння насіння залишали проростати в чашках Петрі, що містять агар (15 г/л). Пророслі насінини переносили в мішки для проростання (Меда

Іптегпайопа!) у кількості 2 насінини/мішок, що містять суміш живильний грунт, доповнений половиною дози Ноадіапа Мо 2 (Зідта, Н2г395). 3-2. Протоколи дослідження

Таблиця 2

Опис різних протоколів, вивчених у цьому прикладі. дистильованій воді) дистильованій воді), інактивована пастеризацією

Суспензія ОеїЙіа асідомогап5 КАМ 209 (клітини промивали в стерильній

З дистильованій воді), інактивована обробкою Френч-пресом (високий тиск із наступною швидкою декомпресією) дистильованій воді) дистильованій воді), інактивована пастеризацією

Суспензія І асіорасшШи5 гпатпозив5 КОО11 (клітини промивали в стерильній дистильованій воді), інактивована обробкою Френч-пресом (високий тиск із наступною швидкою декомпресією) 000108 000 |Стерильнадистильованавода.д//:///:/С/:(/)н.)84///:(64:К4НССС:(/3и/:З 3-3. Приготування непастеризованих інокулянтів

Штами бактерій, використовувані для інокуляції проростків каноли, являли собою ОЮеїКіа асідомогтап5 КАМ 209 (ВВІ) ї І асіюрасійи5 "патпобзих НОО11 (Інвійшї НовзеїІ-І аїетапа. Мопігеаї,

Ос, Сапада). Концентрації маточних розчинів бактерій становили відповідно 3,71Е08 КУО/мл і 2,21Е3-411 КУО/мл.

Маточні розчини (1 мл) центрифугували при 8500 об/хв протягом 15 хвилин. Осад ресуспендували в 1 мл стерильної дистильованої води. Цю стадію промивання бактеріальних клітин повторювали двічі. Після першого центрифугування вихідного розчину ОеЩШіа асідомогапв5

КАМ 209 супернатант зберігали для подальшої обробки проростків каноли (протокол 3).

Бактеріальні суспензії в стерильній дистильованій воді зберігали для інокуляції пророслої каноли (протоколи 1 і 4). 3-4. Приготування інактивованих інокулянтів

Оцінювали два методи інактивації: (1) пастеризацію або термічну обробку і (2) обробку на

Френч-пресі (високий тиск із наступною швидкою декомпресією). (1) Термічна обробка

Для кожного з 2 вивчених бактеріальних штамів 1 мл бактеріальної суспензії з концентрацією 3,71Е-08 КУО/мл у дистильованій воді переносили в пробірку типу Еппендорф (1,5 мл) і інкубували при 80 "С на водяній бані протягом 20 хвилин. Пастеризовані бактеріальні суспензії зберігали для інокуляції пророслих насінин каноли (протоколи 2 і 5). (2) Обробка на Френч-пресі (високий тиск із наступною швидкою декомпресією)

Для кожного з 2 вивчених бактеріальних штамів 5 мл бактеріальної суспензії з концентрацією 2,21Е-11 КУО/мл у стерильній дистильованій воді пропускали через Френч-прес (Атегісап Іпзігитепі СО Іпс.) під тиском 18000 фунтів на квадратний дюйм при 4 "С з наступною миттєвою розгерметизацією. Лізовані бактеріальні клітини збирали для інокуляції пророслого насіння каноли (протоколи З і 6). 3-5. Бактеріальна інокуляція розсади каноли

Проросле насіння каноли інокулювали за допомогою піпетки, і 10 мкл отриманих препаратів

Зо (див. протокол 8 у таблиці 2 опису протоколів) наносили на кожну насінину каноли. У таблиці З наведені концентрації бактерій, нанесених на насіння каноли.

Оброблене насіння витримували в контрольованій атмосфері в камері для вирощування при 22 7С протягом 16 світлових годин і при 18 "С у темряві протягом 8 годин.

Згідно зі схемою експерименту, кожний протокол мав по 10 повторів для 2 пророслих насінин/мішок для проростання. Таким чином, у цілому було оброблено 20 пророслих насінин на кожний протокол.

Таблиця З

Розрахунки бактеріальних концентрацій, застосовуваних для насіння каноли

Кіль-

Вне- . - |Кількість) кість

Кінцевий |. .

Концен- |Розведення . -І сена інокуляту| іноку- ; Необхідний| "7 титр -

Інокулянт трація маточного титр кіль- (КУО/на- в кінце- | ляту в маточного | розчину до кість/на| х вому кінце- (КУО/мл) : сінина (10 вд розчину /1|108 КУО/мл сінина мкл) об'ємі вому (мкл) (мкл) об'ємі (мкл)

ВАХУ2гО9 3-6. Обговорення результатів

Дані одержували через 8, 22 і 36 днів після інокуляції насіння каноли. Через 8 днів підраховували кількість бічного коренів. Через 22 дня інкубації збирали по 10 проростків на кожний протокол. По десять проростків на кожний протокол збирали через 36 днів інкубації.

Після збору проростків каноли вимірювали висоту пагонів від кореневої шийки до найвищого листа. Коріння відокремлювали від грунту і вимірювали. Рослинну біомасу і кореневу біомасу (пагони і коріння окремо) також вимірювали за допомогою точних ваг. Масу сухих пагонів і корінь визначали після сушіння при 35 "С протягом 48 годин.

Крім того, для кожного із протоколів під мікроскопом оцінювали наявність вбирних кореневих волосків на коріннях проростка каноли. Для цього для кожного із протоколів 1 см первинного кореня поміщали в чашку Петрі. Корінь занурювали у воду так, щоб вбирні кореневі волоски перебували у зваженому стані. Спостереження під мікроскопом проводили при збільшенні в 100 раз. Кореневі волоски підраховували на площі 0,75 мм?. На фіг. 2-9 показані зображення вбирних кореневих волосків відповідно до протоколу, спостережуваних під мікроскопом.

Виконували однобічний дисперсійний аналіз (АМОМА) і тест Бартлетта для порівняння дисперсій для визначення протоколів, які відрізнялися від інших за висотою пагонів (за допомогою програмного забезпечення КуРІіої). Результат аналізу висоти пагону представлено в таблиці 4.

Результати показують, що штам ОеЩіа асідомогап5 може стимулювати розвиток кореневої частини рослин за рахунок збільшення кількості вбирних кореневих волосків. Серед іншого, він також сприяє поліпшенню засвоєння живильних речовин рослинами.

Таблиця 4

Порівняння висоти пагонів каноли через 36 днів після обробки.

Гасіорасіїш5,інактивованіпідтиском.о 17777771 -111Ї11117ХсСс2щС у

Живігасюрасійяд 77777711 1Ї1111Хх с

Живібейа --/-//77771111111111111111111111Ї1111х1

Символи представляють значимість результатів порівняння видів обробки, зазначених у стовпці, з видами обробки, зазначеними в рядку (дисперсійний аналіз статистичної значимості

АМОМА).

Опис

Зо Символ/значення "«" значима позитивна відмінність відсутня "-" значима негативна відмінність відсутня

"" відмінності відсутні "як" значима позитивна відмінність при Р--0.1 "- значима негативна відмінність при Р--0,1 "ян"значима позитивна відмінність при Р-0,05 "-" значима негативна відмінність при Р-0,05

Хоча даний винахід був описаний з посиланням на конкретні варіанти здійснення, зрозуміло, що в зазначені варіанти здійснення можуть бути додані декілька варіантів і модифікацій, і дана заявка включає такі модифікації, застосування або адаптації даної заявки в цілому, принципи винаходу, включаючи будь-яку зміну даного опису, який стане відомим або загальноприйнятим в галузі техніки, до якої належить дана заявка, і який може бути застосований до суттєвих елементів, зазначених вище, відповідно до об'єму формули винаходу.

Claims (3)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Застосування штаму інактивованих бактерій виду Оеє/Ліа асідомогап5, зареєстрованого в АТСС під номером РТА-4249, або композиції, що містить вказаний штам інактивованих бактерій, для поліпшення розвитку рослин, причому вказаний штам інактивованих бактерій відповідає бактеріям або бактеріальним препаратам, інактивованим фізичними, біохімічними, хімічними або фізико-хімічними процесами, та має життєздатність менше ніж 50 95, причому вказані інактивовані бактерії мають більшу біостимулюючу ефективність на розвиток рослин, ніж отримані з тим самим штамом живих бактерій.

2. Застосування за п. 1, де штам живих бактерій інактивують термічною обробкою або обробкою високим тиском.

3. Застосування за будь-яким із пп. 1-2, де штам живих бактерій інактивують пастеризацією.

4. Застосування за будь-яким із пп. 1-3, де штам живих бактерій інактивують без його культурального середовища.

5. Застосування за будь-яким із пп. 1-4, де вказана композиція містить щонайменше один штам інактивованих бактерій і носій, що придатний для застосування в сільському господарстві.

6. Застосування за будь-яким із пп. 1-5, де вказана композиція містить штам інактивованих Зо бактерій, відділений від його культурального середовища.

7. Застосування за п. 6, де вказана композиція містить штам інактивованих бактерій у комбінації з іншими живими мікроорганізмами, інактивованими або в екстрактах, такими як бактерії, гриби і/або дріжджі.

8. Застосування за будь-яким із пп. 1-7, де вказана композиція також містить добриво, гербіциди, інсектициди, фунгіциди, мінеральні розчини і/або середовища для вирощування.

9. Застосування за будь-яким із пп. 1-8, де вказана композиція присутня в придатній формі для обробки грунту, обробки кореневої частини рослини, обробки листової частини рослини, обробки квітучої частини рослини, обробки плодоносної частини рослини і/або для обробки насіння.

10. Застосування за будь-яким із пп. 1-9, де вказана композиція присутня у формі порошку, гранул, мікрогранул, засобів для обробки насіння, рідких складів, капсульованих бактерій або рідких суспензій.

11. Спосіб поліпшення розвитку рослин, що включає введення штаму інактивованих бактерій виду Оеїйа асідомогап5, зареєстрованого в АТСС під номером РТА-4249, або композиції, що містить вказаний щонайменше один штам інактивованих бактерій, причому вказаний штам інактивованих бактерій відповідає бактеріям або бактеріальним препаратам, інактивованим фізичними, біохімічними, хімічними або фізико-хімічними процесами, та має життєздатність менше ніж 50 95, причому вказані інактивовані бактерії мають більшу біостимулюючу ефективність на розвиток рослин, ніж отримані з тим самим штамом живих бактерій.

12. Спосіб за п. 11, де штам живих бактерій інактивують термічною обробкою або обробкою високим тиском.

13. Спосіб за п. 12, де штам живих бактерій інактивують пастеризацією.

14. Спосіб за п. 11, де штам живих бактерій інактивують без його культурального середовища.

15. Спосіб за п. 11, де штам бактерій являє собою Рейа асідомогапе, зареєстрований в АТОС під номером РТА-4249.

16. Спосіб за будь-яким із пп. 11-15, де композиція містить щонайменше один штам інактивованих бактерій і носій, що придатний для застосування в сільському господарстві.

17. Спосіб за п. 11, де композиція містить штам інактивованих бактерій, відділений від його культурального середовища.

18. Спосіб за будь-яким із пп. 11-17, де композиція містить штам інактивованих бактерій у комбінації з іншими живими мікроорганізмами, інактивованими або в екстрактах, такими як бактерії, гриби і/або дріжджі.

19. Спосіб за будь-яким із пп. 11-18, де композиція містить штам інактивованих бактерій у комбінації з іншими штамами інактивованих бактерій.

20. Спосіб за будь-яким із пп. 11-19, де композиція також містить добриво, гербіциди, інсектициди, фунгіциди, мінеральні розчини і/або середовища для вирощування.

21. Спосіб за будь-яким із пп. 12-20, де композиція присутня в придатній формі для обробки грунту, обробки кореневої частини рослини, обробки листової частини рослини, обробки квітучої частини рослини, обробки плодоносної частини рослини і/або для обробки насіння.

22. Спосіб за будь-яким із пп. 12-21, де композиція присутня у формі порошку, гранул, мікрогранул, засобів для обробки насіння, рідких складів, капсульованих бактерій або рідких суспензій. ! Оцінка росту площі листя Агабіворвів Тванйепа згідно з різними протоколами : ТОЩО ВД, своя тет Кто ооо тв ВК окт одн кін КАВУ : Шо : ке ей ю У ! ї МО м М сн 2 Е ! о они вач : ії ї ак вних ще по й сесія: ВМДИД, і ї ТЕХ ян ВВ заеннн ОКОМ ни рннюнух нн ую кмину ї : і х - с. с. с Що Що пня ВА : : 7 а Її її їв в і ту : : Кількість Днів піспя посіву :

Фіг. 1

ПЕЕНЕТЕ Тр а А ШИшиий - ЕК, ШИПИ ЗК Е УНе а о ВН Пр ЕЕ ЕК тт з с КИ с З МИШКИ ПИПИДИЧОИПИЛ ППП пити, ит ших то ОО ЛШ . х ПЕК ПЕСНИ Я ПЕ с ов В В Я ПИ ПОП ОК ХУ ПК ШЕ НВ В ПЕТ я ЕЕ ОХ ОО ПЕКИ КПТ НК КЕ ХК М М М ПЛИТИ М К ОХ ХО У ОМ ДН ЕК ЕК ОКХ ОКХ МОВ о ПВ А ОК Й ЗЕ м В о ПЕ В ОКХ ОК СЕК: ОКО УК я за МК НА я ОК Ме МН ПК В, ДЕН ККУ С ПЕ и ОК ПІМИНМ МКК ОВК НЯ ОКХ ХУ НИКА ОК СК КК МКК КВК КК З КОЖНЕ ОК КУ ІНК КО ше ЕЕ ПИИН УМОВ ЗО ПМК БО МІЯ КЕ ОЗ СО ОКХ КК в х п ше. ХУ КК Х МН Дж КОХ ХЕ ОКА п Х ХАН ЗК у Б, ВВ МЕМ г КК о НН Ка Ї ОКХ УКВ КО Ка Я З КК КК ОКХ ЗХ ОО ОК В ОКО З х МОМ х ОККО ОКОМ шШнНн поч ее о ЕЕ и рн ВК З се пед п т. БК Енн ї : п МТ ПЛЕН : Я ЖЖ МКК ПЕК ил с Кто я, ЗМ я ШИПИЙИИИИИИИ ПТ ТИН, ПИТОТИ ПОП ПТ ИН я КО. ППП ПИ МИ ОК НУТИ ІПН ПИТИ ТИКИ ен ио СХ У ИН ІВ ОКХ ОКУ І ШИН ен нн ПО о З ПЕ ЕЕ ЕК ВХ о Мн ЕЕ ПОШИ КЕН х ДЕК и ОК п п ТК, В ОО ПИЛОК ЕЕ щ ОО ОДНО ВО перо нн нн Ір І І Ох Ма в 7 пе ах ПЕВ ОКХ нн ЕЕ в В КО КУ ОН о КЕ ДЕН ККОДИН Ин С а. КО ВЕ М у а ШЕ ПЕММИ КМ МКК ОО ЗО ПІНИ В ложок ю НИХ 0 В У У ЕВ МО КД и МН В сх ОК їх о КОВО еВ КК ПЕСИКА ОККО ОО : КОНЯ ОН ки ОО х 5 ОХ ОО ЕК о ЕХО В Ох ОК А ЩЕ ОККО КМ М ОК КК КК КОМ ОЗ ОМВК ОО ОКХ З ОКОМ КК : с ОККО х з ОО о Я : ОН З сх М ОКХ ОКО ХХ МОН М СУ о З ХХ КК ж Х ОМ М БОМБ КАК ММ е ХХ НК У ХМ БОНН ОХ ОК х З ОО х УК о. МОМ ХК о. х о ОХ МОХ З ХУ ОКУ ХХ Е еВ З ХХ ОК ЗНУ . . . о. ВКМ СО о КН ВО Х . З ОО с М п. У ОО ПИ НК Ди «КК ши п ЕЕ ж ЕЕ ПОЖХ Ми Кеш КІ й В пл о. Ен ДЕШЕВА КН КК ПКЕЕ НК ЕК АК ПКД ТК АКА Я ЕК КК КК ВЕ ШЕ а ХУ вн МЕ ОО о ОО о ДЕННІ ХК ОКО ОО ОК ОО хх ск Я Кд Я МК п с шими о М х ХХ ОККО я |і С ОХ пе З МКК ЗХ М ОКХ о. МОМ

ХХ . ОО ОХ З ЗОЗ о. З З ОКО с зі 2

Фіг.

кВ с и то ! 1: ше по. о. " . о. пубшмо и ОКОМ Ей Кн с : ЕЕ ох КК В НЯ . ОН : о п Нео с 1. 0 - ШОН с її с Ех с п ОХ ПОС КК Ко с . о о с п с й ва с . ооо.» 5 в. ЕК КК З З ХХ С ОК ОО . . ї : . : ОМ

0. З . І БЕ я КК ДНК КИ КК соня я 030 г х с Пав я с ПО В М МНИХ ОН п о. он : 0 о о 1. : 0 : ПІ с як : у щи . о. Я їх хх ОК ПЕ КЕ КО ОК ПЕН Нтх шт ЗО ОК КЕ ЕК о. . лине о. г о о. 1 0. о

ЕЕ. о. 5 . 3: с о і. З о. КО Не І па ї М ВЕ ОХ я СОС. о. . . З Ох Он ОІВ . : . с с . і. с о Х З їх М ж ОК В ХО КН НН и х ох но ПВА о ШИ Щі с ще у в с й о бас її. их : ООН сонних о ; У о. о Воя ОК КЕ о о що А МУК а с лов с Б о ВХ ОО о

Фіг. 3 ї г.

: УНК ипимти пити, М ЕК В. вка 7 оф ПННКИИНИИИШЕ Ух КК, МЕНЕ ВЕК МНК бу ДИКА ПЕ в о п а ПЕПКИМНИНИННИК ЕК КО ПЕН я ОХ хх шах СК ко ОО ООН ен ОО ДЕМО ох х ОКО ЗОВ ПИ С ОО ОК ЕК ЗХ ОХ : ів я М : ОО а х ЗЕ У ОК З Ох ОО ї п КК Х МОМ ОК МЕМ УК З С З Мо ВОМ и ОО ОК з Ох З Ух о КО ОН ПИПККНКН КН КОХ ХК НК з ХХ М М ОО ОК ВЕ Щ ООН Коня РОБ КЕ ОО ІМ ОО ВОВК ви до В Ж хоке о ОН ПЕК КЕНЕ МК по о я оо в ПЕ и ве ен ПЕН ПК и ОО ОО ЕХ ЕН ПК НК ОО ще ХХ ОК ОО МОК КК х З МО З ОКХ УЖ Я. З щ МЕ ОО ХХ З хх . Б ха ЩО ХХ щ ХХ З : ОК ВО ху пе в БО ПИПККЕНИ ЕК ЕН КЕ КВ В КК В ОВ ВВ ВО М ПЕ ВК вк ППЕЕКЕТ ЕХ ПН ЖК ва КК Ен 00 В ПО ОО КОХ ПЕД ИИИХ ПТПТШИНИИ ШИТИ ПТН Ки х хх с а ПЕ НВ ВО х ЗО КН ПКЕЕ ХЕ ДЕКО ово ІХ ОХ ОО ОХ перш 5. ОВ ОЕМ ОМС ЖЕ Ж ОО ОО Кі х ММ Ох С. 3. ї ща ря пе п я шо о КЕ ХО ОХ АК МОХ з ОК КК, ОО ОВ З х ОО КК. ОО ЕК о КК ПЛИНИ МО МНК, ОКХ Х в ШЕ КО В в ОККО ОВ рі іг. 4

ВЕК КВ диню ЕК і ГО Ур фхяа ак ЕХ МЕМ ОК х : ох З . с -

ше . Бе : о. 5 с ше шо . 5 : Е о. о. ОО І шо а в В . о. пд с 5535 ОМ о о. я КК ОКА ПКУ що КК КВ й о ОБУ . 0000 З ПЕ ХА ту х ЕН У і с С ОК а о. ОО с о. 0 с п . Я : о о КОМ М ДП ХА ХНИ Аня с ЗО о . ОО с с З с І нин В сх ОО ЗО с о о. З с ВІК КК ОК МКК ОХ с: о 5 ОНИ с 5: ОК с З : ОО ОО Ам Ко ни : КО ню У З КК КЕКВ ОО С ЗО дю ї ЗО КОКО КЕНЕ С : ПО ОК М уки : МОУ МЕ, ї о. . ЕХ п о п. Я зе г : ОК о ОКО ОО р : х п х 3. ОККО Еш п с о. о ОКО МК ОК СКК КВ КК З у о. ОО о М ОО п За п вані пи 0 пх Ов до п ХМ ит ТИ Ит ї о ши 1 - ПЕ Ер ев с ПИ КК КК КК КК я ОК 6

55 . МАМ ОК о. ЩІ ТК зд Ко ЗО В я М Ж ОК и ек : с : : 5 ї с КО КО

Фіг. 5 кЕВКК Кн В КЕКВ Ко Й БЕ КВ ПЕВ ФК ково ОМВК с шк КАВА БО КВ шо с г Кн Кн сон В ЕК о ши о. Кн х Є о. ХХ ЕВ пшнеВ . с пи я КОНИК ЕН вен СХ с шо 3 ШИН о ХО КУ. Ж кажи пеня ЗО о. й їЗ щ Де ех ПО я Зх ЗОМ Х ен В о оо. ОО С ос М ОК 0. х КО ЗО о. Ен ОМ МО ПЕКИ ЕК з ОО . ї По о. с ши с шою СО о. ДН З я ї ю 5 о. І п МОП ККИИИИИИКИ ХА ОК ИН КОХ ОО Х ОК пит ВК Ж уау ОВ ОО п ї В, Я я Мі НО шо с с шен а сс: Ме КК Б п ОО КК : Ве Хо: що о. ке хх У УМХ в ОО ВО п. СОУ М І КОКО ОО кове оз З Ох Ум ОХ ММ с и 0) ОК ОКА ОО В В ЗО, о Ю М В їх с ОК я ОК . с ОК КК на КК сс ООХУК п о М КН МОВО ОК аа КОВО пи ха ПК т п Ми шо в ЕН в МУ с З ШКО ее є ПЕХЕКИНКНЯ ОО ОХ КО ї я ПК ;

а. о о і ОАЕ ВВ о ПЕ ПО КМ ОХ її. В Ок ква о. Ох ЖЕ ТВ як ка ОХ З ОХ УК ; ОК ОН, о о ПК МНЕ ЗУ с о. о. : ОККО ОО о ОО ОК В ОМ МНК ОЗ п М В ЕХ МОХ М т

Фіг. 6 ек, ХЕ КН се я КМУ ОО ОН с ЗБЕ я Я о о. : сш: че Ме в о. о попкимкшх ОО с ї ї о о ОО, В о. ТО - КК я с . В с Б о. ОН : вс с ОО с У с о. ще с со п Я З ОО З КОХ З СХ ще г МХ п ОХ М я ТЕ . с КУ о о МНН ІК с ох со ХЕ МІ с о МАСОК Є ЕСЕ ККН З ОХ ОО п о пе ХХ соооССс ХЕ ШЕВУВ о 0 о. МО АК КН сх КК ОВ ОО о В с У ще М с ПЕНЕНННе ох КО хх В ї ВОК ОО З З СХ ОК с ТО їх о п. С с ОКХ ОО Ох с п. КУ СЯ о КОХ ВО ЇЇ - п о ПО З ох СОУ ШК . о. . ПО ХХ о КВ СХ ВЕК ХМК п с ДЕК хх оо ТЕ ПИШУ ОК с КК ХХ КЕ МЕ. ВЕ с о о п о. ше п. ОКХ КО ВЕ ЕХ ЗИ ТЯ ОМ М КО ОПЕК 0. . ТЕО С ї с ВАНН о п . Ов СОС КК МЕ Б п г. ДОК У о ОХ ЗК КН п. М КВ ХХ о СХ В СО 5 і с ОВУ ХХ Ж ОО З ; ВИК ПЕ ОО ох сх ХУ МИКМИМНИХ МВ ЗО МО сх З ї ОО ОК: ОО МО і ОВ ХК КОН с М В В З ї ПЕК ПОКОВ ХО СОКОКК С с с по ХХ ОК ХХ ще ПЕК я с о. о. що ж с ох 0. шо КУ с КХ МО М ПЕ ОХ С 0. ХК ОО ОО о. п ЕК МОХУ с ех Що х С о х с сени ша ХК ; Б. ЕРЯя сококов МОХ ох о. . МН сво пен ОО ПЕКЖИНЄУКУКО соус зе ве о М ВХ З У Х 7 ння МОУ ЗОМ ХУ ПИ ПКЕЕ ПЕЕИШННИННЯ С ХХ ВИМ ПИШЕ щИ КЕКВ СОУ КО ен З ШИМИ; КЕН СШШИИВ ХЕ ХКУУКУКХ ПЕН шк ТЕ МОХ КЕ вве СИПМИИИ о. ХЕККОКОХ со ПИ ПИ с зу : й го с ДЯ пе ЕЕ Тк ЩЕ ХО ОО о ПИЕШИТИНКИ ПИПНИИНЕ НМТ КН ЕІ ШИ ПК, КОХ ЕК х З ООН о ЕНН Кен кащх 0: 6. о о Е що ЯК с СЕМИ ПЕКТИ ЕС АКЕВ З А ЕЕ пили В, ще с ПЕН ПЕИШИННОК ПИ КУ п с с ОК я с ТЕКИ ПЕ ПИТИ КИ о с ПИ МЕ я . о о с у ЗОВ с с мг ОО с с Я виш З Зо Й ПЕК о с ХХ З й ї ЗБ ПООЕЕ с ВВ о їх що Е ОК ОЖИНИ ПОМ ї ОО енВВ МОХ их он КЕ ОВ - МВ о з КАХ с ВЕНАХ ХМ 15 Ух КУ А МЕНЕ ВЕН оо М я за ши і хх М пер ЗУ УКХ 0. о ВК МИМО хх хх По с З ЕНН ЗО ї зх с. шою ОХ с я що о. о с с ОХ М шо ОО с с ПЕК ОККО с ЛЕ ПЕК с ПАК ХО М с С СУ пек ЗО о. є ОО хх со х с сг ПЕК ОХ г с КОКККА ХО о - х ОА МКК КН ККня ПАК НЕ КЕНЕ КОХ В В с ЕК о ПИСК МО ОХ МК ПКЕЕ ТТ о с ВЕНА ХУ ОК КК Пе оо о о с . о є МИ є т ПЕ с М с ЕК с - ПЕ СШХ

Фіг. 7

ОО : ОКО У ПД жав ОО ПФК х КИЕВ Же ВАК ОКХ ПИНИНКаННМя АК М хо ОК щ . ши НН пе в Є ОО ЕК АК НИ і ОО пл А БО ще 0 КИ: о. БЕ ОО ОН 00 До о о ше вв х ее М с о о КЕ ОХ Осо пев : ПЕ ОХ КЕН ОЕННИКВ КК с. ПЕВ ЕОМ ХХ КК МЦИНИИ КИ ШИМИ МЕН У ПЕН нн ЗХ НЕВИННО ПЕН Ко пи о 0. ОККО В З 0. ДЕН ОХ М как те па ; с пи ан 3 КАН ннА ОО Ен хх Х ОО ЕД ЗВ ве ЖК В и о. зм ПЕН ОХ ЕНН х х : і ЩО ПЕПЕННН НН ни о МК З ХХ За Кк х ЕНН ОКХ о ще Ох ще . КОН ОКО я З З еВ х ПЕКИ ЗОВЕВОВ ОК пи М. . ПЕК ОХ о ШИК КВ о ! ШК УМХ М ПЕКИ КК З ПК ня В ! ПЕК КК ПО Я я ! ВУ ОО ЕК с х . ще ШК КО В ПО Ох ! БИ КК ою с . : ОХ ЕВ шин ОН . б З зе ви а о ШК дтнн т ЗХ М кана АК КЕ пІДКИиК пило виш нн То м І о Я КЕН ВВ В ВВ ПЛЕН ПЕК ши . дипиИпИе СПК М ОМ ВО п В с и ЗМО в в Б І и . ПИШИ ТТ ЗХ НЕ НЕ ВОК НК Ох ! 5: . 3 І о ОХ ПЕ МВт У КК ПЕВ Я МЕЖІ КЕ ХХ ОО ОКО о ОО МОШИТНИИЛИЦВ ЗХ МИ ПИШИ КОВКИ ОК ОК п ШИНИ КЕ ОКА ит ШЕ ОО ХК : ППП о М ЖЕ ПЛИТИ ЕК КК Не ОК ПИХОДЕЕЖ ХУ ПВ КВ ОО ОКО СЕК ОО ТВА 0 БВ КК М ; В ДК КК М Ж ПЕ х о : пив КМ Кв й КК с ШТ ПЕК КД в КК ОХ КК КВ ПЕ ОО НК Кв ВЕН ОЗ хх о ПТН ЗЕ ОН ПЕЛЕККЕ ВЕН КЕ Ве ТУ В Хр ПАХ ЗО ни Кн по їх 5 о ПО ОУ нн ВЕНАХ УС КО ОКХ КН МЕН ОО п що о. ЕН М я ОХ но в ЕК Ка Ох о шо ОКО НЕ МО п . ОО ОХ НЕ о о ВО пен МК ен С ее и Я ОХ МИ ОК щЩ о ЕН ЕХ ХМК КК: ПКЕЕ я ХХ и о ї о юкфсєсвгвммн п Шй 7 УМХ МІ ОО но. ко сх ПК ОК КК ОО ЗК аз З ох КК у х М КЕ З ПОВ і З о КВ СКК ОО ЗЕ ХХ М З п ї З ОКУ ОМ Зх хх що ОХ ж ЗУ ОО х Мо с п М За ХК ОХ М ХК ОКХ З ОО З КОХ ОО х У МКК ооо Ох МЕ х КК КІ с ОВ о. п. 5 ТЕЖ ДН нка Ох За с» с МЕМ КИ З З ї ЕМ ПИШИ ПИВ ОО ДЕМККЕ Ен с В ЕН НК ДЕД Ни ПЕВ п. ПЕ НЕ КН ОВК о З ПКД КК М ПЕ НЕ ПЕВ о. х НН ОВ ВХ ПЕШЕЕТМ ТК м ПОВ о. : ПИВО оон во с ПОКИ ЕК ХО ХК є -

Фіг. 8