CN113264801B

CN113264801B - 一种生物有机肥的制备方法

Info

Publication number: CN113264801B
Application number: CN202110689492.XA
Authority: CN
Inventors: 袁野
Original assignee: Jiangsu Fushoukang Agricultural Biotechnology Co ltd
Current assignee: Jiangsu Fushoukang Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2021-06-22
Filing date: 2021-06-22
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2041-06-22
Also published as: CN113264801A

Abstract

本发明涉及一种生物有机肥的制备方法，通过对初步扩增和二次扩增原料的前处理，减少原料中本身含有的微生物对本发明使用特定菌种生长的影响，通过选用特定的哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌和放线菌组合以及发酵环境制备有机肥，实现有效控制成品生物有机肥中的微生物含量及种类，在施肥后能够抑制土壤中有害微生物生长，减少植物患病概率。

Description

一种生物有机肥的制备方法

技术领域

本发明涉及肥料领域，具体涉及一种生物有机肥及其制备方法。

背景技术

有机肥料是农业生产的重要肥源，在培肥地力、改良土壤、提高作物产量和改善农产品品质方面具有重要作用。大力发展商品有机肥，实现有机肥生产的工厂化及其产品的商品化，增加有机肥的施用量，不断提高食品安全性、营养性，已成为推动无公害食品、绿色食品、有机食品生产发展的迫切需要。生物有机肥，即微生物肥料，能够通过微生物降解有机质，促进植物对养分的吸收，同时添加的活性功能微生物能够一定程度上抑制有害菌在土壤中的繁殖。

在全球的农业生产中，根结线虫的危害相当严重，特别是在热带和亚热带气候温和、雨水充足的地区，由根结线虫所造成的危害更加严重。植株在受根结线虫侵染后，初期地上部症状不明显，受害轻时常没有症状表现，严重时植株生长缓慢，下部叶片枯黄类似于缺水缺肥状。如若将发病严重植株连根拔起，会看到根系的侧根及须根己形成形状大小不等的根结。另外，根结线虫侵染根系时所造成的伤口容易受到细菌和真菌等病原物的侵染，常与青枯病、根腐病、枯萎病、黄萎病造成复合侵染而加重病情。

研究验证，哈茨木霉菌能与植株根系共生，抑制多种致病菌，比如：腐霉菌、立枯丝核菌、镰刀菌、黑根霉、柱孢霉、核盘菌、齐整小核菌等；放线菌能释放抗菌物质，可以抑制部分病原菌的生长定植，减轻病原菌的危害；枯草芽孢杆菌不但是一种重要的固氮菌，还能诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，对众多真菌和细菌病害具有拮抗作用，比如小麦纹枯病、枯萎病、白粉病、炭疽病、根腐病等。

但是目前在生物有机肥料的生产过程中，市面上可见的技术解决方案中没有对发酵使用的菌株进行选择和管理。由于采用自然发酵的方式，成品中的微生物种类难以保持一致，影响了成品施肥后的微生物分解有机质的能力，达不到应有的土壤改良效果。有些技术方案虽然采用固定的菌株，但是没有对原料中微生物进行管控，因此发酵过程中原料原有的菌株可能会成为优势菌种，抑制了添加的菌株的生长，最终也导致了成品有机肥中微生物种类的不稳定，影响产品质量。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物有机肥的制备方法，通过对初步扩增和二次扩增原料的前处理，减少原料中本身含有的微生物对本发明使用特定菌种生长的影响，通过选用特定的菌种和发酵环境制备有机肥，实现有效控制成品生物有机肥中的微生物含量及种类，在施肥后能够抑制土壤中有害微生物生长，减少植物患病概率。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一方面提供一种生物有机肥的制备方法，包括以下步骤：

(1)菌种复苏和初步扩增：分别将哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌和放线菌的菌粉用生理盐水稀释后，取适量涂布到各自固体培养基中培育；根据菌种的形态，选取单一菌落移植到液体培养基中培养；

(2)二次扩增原料及二次扩增混合物制备：将二次扩增原料豆渣粉、羽毛粉、氯化钠和水在高压湿热环境下处理，冷却后添加水并调节pH至7，搅匀至浆状；

将步骤(1)中初步扩增的哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌和放线菌菌液混合得到复合功能菌液；将上述处理后的二次扩增原料与复合功能菌液混合，搅拌后加入发酵罐中进行发酵得到二次扩增混合物；

(3)发酵：将二次扩增混合物与最终发酵原料进行混合，其中最终发酵原料由动物粪便、豆渣粉、菌棒碎渣、烟丝、羽毛粉和牡蛎粉组成；混合后加入水，静置发酵；

(4)后处理：发酵完成后将肥料烘干，造粒，包装。

优选的，所述生物有机肥的制备方法包括以下步骤：

(1)菌种复苏和初步扩增：采用无菌操作，分别将哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌和放线菌的菌粉用生理盐水稀释后，取适量涂布到各自固体培养基中，在培育箱中培育48小时；根据菌种的形态，选取单一菌落移植到液体培养基中，震荡培养48小时，温度不变；取初步扩增后的菌液，测定微生物数量，其微生物数量应达到10⁸-10⁹cfu/ml；

(2)二次扩增原料及二次扩增混合物制备：将二次扩增原料按重量百分比计豆渣粉20-30％、羽毛粉15-20％、氯化钠1-5％和50-60％水在120-125℃高压湿热环境下处理20-30分钟，使原料中原有微生物灭活并降解部分高分子有机物；然后冷却至室温，添加水并将水分控制在50％，调节pH至7，并且加入搅拌装置中进行混合，搅匀至浆状；

将步骤(1)中初步扩增的哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌和放线菌菌液，按照(1-3)：(1-3)：(1-3)的重量比混合，得到复合功能菌液；将上述处理后的二次扩增原料与复合功能菌液按照(5-15)：1的重量比混合，搅拌后加入发酵罐中进行发酵得到二次扩增混合物；取二次扩增混合物，测定微生物数量，其微生物数量应达到10⁶-10⁸cfu/g；

(3)发酵：将二次扩增混合物与最终发酵原料进行混合，其中最终发酵原料由按重量百分比计的动物粪便15％～25％，豆渣粉20％～30％，菌棒碎渣20％～30％，烟丝5％～10％，羽毛粉20％～30％和牡蛎粉10％～15％组成，二次扩增混合物按重量百分比计为最终发酵原料的5％～10％；混合后将水分调节至二次扩增混合物与最终发酵原料总重量的40％，进行静置发酵5-7天；上述静置发酵过程中，进行温度检测，当混合物温度达到55℃以上时，将混合物转入到发酵槽内进行发酵；用翻抛机每天翻抛1-2次，经发酵3周，当温度下降到40℃以下，不再升温后即完成发酵；

(4)后处理：发酵完成后将肥料烘干，将水分降到低于30％，造粒，包装。

优选的，所述步骤(1)中枯草芽孢杆菌和放线菌在34-38℃培育，哈茨木霉菌在24-28℃培育。

更优选的，所述步骤(1)中枯草芽孢杆菌和放线菌在36℃培育，哈茨木霉菌在26℃培育。

优选的，所述步骤(1)中哈茨木霉菌采用PDA固体培养基和PDB液体培养基，枯草芽孢杆菌采用LB液体培养基和LBA固体培养基，放线菌采用高氏一号固体培养基和液体培养基。

优选的，所述步骤(1)中哈茨木霉菌为哈茨木霉菌T-22或哈茨木霉菌G-41；放线菌为放线菌CICC 10520；枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌MBI600。

优选的，所述步骤(1)中液体和固体培养基制备完毕后均经过121℃，30分钟湿热灭菌；液体培养基倒入无菌的锥形瓶中密封降温待用，固体培养基倒入无菌的培养皿中待用。

优选的，所述步骤(2)中二次扩增原料为按重量百分比计的豆渣粉25％、羽毛粉20％、氯化钠5％和水50％。

优选的，所述步骤(2)中扩增原料高压加热温度为121℃，时间为30分钟。

优选的，所述步骤(2)中哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌和放线菌菌液按照2：2：1的重量比混合。

优选的，所述步骤(2)中二次扩增原料与复合功能菌液按照9：1的重量比混合。

优选的，所述步骤(2)中制备扩增混合物的发酵时间为24-48小时，发酵温度控制在24-34℃，期间保持通气并间断性搅拌。

更优选的，所述步骤(2)中制备扩增混合物的发酵时间为36小时，发酵温度控制在30℃。

优选的，所述步骤(2)中测定微生物数量，其微生物数量应达到10⁷-10⁸cfu/g。

优选的，所述步骤(3)中最终发酵原料由按重量百分比计的动物粪便15％，豆渣粉25％，菌棒碎渣25％，烟丝5％，羽毛粉20％和牡蛎粉10％组成。

优选的，所述步骤(3)中的动物粪便为猪粪、牛粪或鸡粪。

优选的，所述步骤(3)中二次扩增混合物按重量百分比计为最终发酵原料的10％。

优选的，所述步骤(3)中静置发酵的时间为6天。

优选的，所述步骤(3)中用翻抛机每天翻抛2次。

本发明的第二方面是提供上述任一制备方法得到的生物有机肥。

本发明的第三方面是提供上述生物有机肥在防治土壤病虫害中的应用。

优选的，所述应用为防治番茄根结线虫病。

本发明具有积极有益的效果：

(1)本发明具所述方案对原料中微生物的管控，减少原有微生物对发酵的菌种生长的影响。

(2)本发明采用的初次扩增，保证了发酵菌种在最终发酵时有着较高的活性和浓度。

(3)本发明采用固定的菌种进行发酵，保证了不同批次生产出的成品中菌种的类型稳定。

(4)本发明稳定的菌种类型及接种时的浓度，保证了发酵过程充分，能够降解更多有机质，有利于植物吸收。

(5)本发明成品有机肥中有较高的微生物活性，在施肥后能够抑制土壤中有害微生物生长，显著减少植物患病概率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作更进一步的说明，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1本发明生物有机肥F1的制备

(1)菌种复苏和初步扩增：采用无菌操作，分别将哈茨木霉菌T-22、枯草芽孢杆菌MBI600和放线菌CICC 10520的菌粉用生理盐水稀释后，取适量涂布到各自固体培养基中，在培育箱中培育48小时，其中枯草芽孢杆菌和放线菌在36℃培育，哈茨木霉菌在26℃培育；根据菌种的形态，选取单一菌落移植到液体培养基中，震荡培养48小时，温度不变；取初步扩增后的菌液，测定微生物数量，其微生物数量应达到10⁸-10⁹cfu/ml；

其中哈茨木霉菌采用PDA固体培养基和PDB液体培养基，枯草芽孢杆菌采用LB液体培养基和LBA固体培养基，放线菌采用高氏一号固体培养基和液体培养基；上述液体和固体培养基制备完毕后均经过121℃，30分钟湿热灭菌；液体培养基倒入无菌的锥形瓶中密封降温待用，固体培养基倒入无菌的培养皿中待用。

(2)二次扩增原料及二次扩增混合物制备：将二次扩增原料按重量百分比计豆渣粉25％、羽毛粉20％、氯化钠5％和50％水在121℃高压湿热环境下处理30分钟，使原料中原有微生物灭活并降解部分高分子有机物；然后冷却至室温，添加水，将水分控制在50％，调节pH至7，并且加入搅拌装置中进行混合，搅匀至浆状；

将步骤(1)中初步扩增的哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌和放线菌菌液，按照2：2：1的重量比混合，得到复合功能菌液；将上述处理后的二次扩增原料与复合功能菌液按照9：1的重量比混合，搅拌后加入发酵罐中进行发酵，发酵时间为24-48小时，发酵温度控制在24-34℃，期间保持通气并间断性搅拌；取二次扩增混合物，测定微生物数量，其微生物数量应达到10⁷-10⁸cfu/g；

(3)发酵：将二次扩增混合物与最终发酵原料进行混合，其中最终发酵原料由按重量百分比计的猪粪15％，豆渣粉25％，菌棒碎渣25％，烟丝5％，羽毛粉20％和牡蛎粉10％组成，二次扩增混合物按重量百分比计为最终发酵原料的10％；混合后将水分调节至二次扩增混合物与最终发酵原料总重量的40％，进行静置发酵6天；上述静置发酵过程中，进行温度检测，当混合物温度达到55℃以上时，将混合物转入到发酵槽内进行发酵；用翻抛机每天翻抛2次，经发酵3周，当温度下降到40℃以下，不再升温后即完成发酵；

(4)后处理：发酵完成后将肥料烘干，将水分降到低于30％，造粒，包装，得到生物有机肥F1。

实施例2本发明生物有机肥F2的制备

将步骤(2)中哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌和放线菌菌液的重量比由2：2：1调整为2：1：2，其余步骤与实施例1相同，得到生物有机肥F2。

实施例3本发明生物有机肥F3的制备

将步骤(2)中哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌和放线菌菌液的重量比由2：2：1调整为1：2：2，其余步骤与实施例1相同，得到生物有机肥F3。

对比例1作为对照的生物有机肥C1的制备

将步骤(2)中哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌和放线菌菌液替换成重量比为1:1的哈茨木霉菌和枯草芽孢杆菌菌液(即不加入放线菌菌液)，且加入的菌液总重量与实施例1保持一致，其余步骤与实施例1相同，得到生物有机肥C1。

对比例2作为对照的生物有机肥C2的制备

将步骤(2)中哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌和放线菌菌液由2：2：1调整为7：2：1，且加入的菌液总重量与实施例1保持一致，其余步骤与实施例1相同，得到生物有机肥C2。

对比例3作为对照的生物有机肥C3的制备

将步骤(2)中的枯草芽孢杆菌(MBI600)菌液替换为等重量的解淀粉芽孢杆菌(ACCC10388)菌液，且加入的菌液总重量与实施例1保持一致，其余步骤与实施例1相同，得到生物有机肥C3。

试验例1本发明生物有机肥防治番茄根结线虫病试验

1、试验方法

1.1、根结线虫扩繁

采用根结线虫适宜寄主番茄进行活体线虫繁殖，将番茄种子播入育苗基质中，待番茄苗长至3-4片真叶，移入带有根结线虫的病土中继续进行培育。

1.2、盆栽试验

首先将混匀的根结线虫病土装入直径35cm，高30cm的花盆中，将4叶龄番茄苗移栽其上(3株/盆)，移栽后10天，在植株周围进行各试验组有机肥施药。其中，试验组1-3分别采用实施例1-3制备的有机肥800kg/ha混土撒施，试验组4-6分别采用对比例1-3制备的有机肥800kg/ha混土撒施，空白对照组不施用有机肥。每个试验组重复5个盆栽，每盆施肥量按面积换算，每个处理盆栽番茄苗统一定量淋水保持土壤湿润。

施用各试验组有机肥后2个月，挖出番茄植株全部根系，调查植株根系受侵染程度。计算病情指数及防治效果，数据分析采用Duncan新复极差法。病害严重度分级标准和计算公式如下：根结分级标准参照Eisenback J D划分为0-5级，并作适当调整：0级，根系无根结；1级，0-10％根系有根结；2级，11％-30％根系有根结；3级，31％-50％根系有根结；4级，51％-75％根系有根结；5级，75％以上根系有根结。

病情指数＝Σ(各级植株数×级数)/(调查总株数×5)×100

防治效果(％)＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100

2、试验结果

本发明生物有机肥各试验组的病情指数和防治效果数据见下表1。

表1本发明生物有机肥对番茄根结线虫病的防治效果

试验组	病情指数	防效(％)
			试验组1(实施例1)	17.33	72.9％
试验组2(实施例2)	25.33	60.4％
			试验组3(实施例3)	28.00	56.2％
试验组4(对比例1)	38.67	39.6％
			试验组5(对比例2)	36.00	43.8％
试验组6(对比例3)	33.33	47.9％
			空白对照组	64.00	—

上表试验结果表明，试验组1-6的病情指数与空白对照相比均有明显的降低，表明试验组1-6对番茄根结线虫病均有一定的防治效果。与对比例1-3(试验组4-6)40-50％的防效相比，本申请实施例1-3(试验组1-3)的防效均在55％以上，证实本发明特定菌种选择及配比组合制备的有机肥具有优异的根结线虫病防治效果。

应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种生物有机肥的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）菌种复苏和初步扩增：采用无菌操作，分别将哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌和放线菌的菌粉用生理盐水稀释后，取适量涂布到各自固体培养基中，在培育箱中培育48小时；根据菌种的形态，选取单一菌落移植到液体培养基中，震荡培养48小时，温度不变；取初步扩增后的菌液，测定微生物数量，其微生物数量应达到10⁸-10⁹cfu/ml；

（2）二次扩增原料及二次扩增混合物制备：将二次扩增原料按重量百分比计豆渣粉20-30%、羽毛粉15-20%、氯化钠1-5%和50-60%水在120-125℃高压湿热环境下处理20-30分钟，使原料中原有微生物灭活并降解部分高分子有机物；然后冷却至室温，添加水并将水分控制在50%，调节pH至7，并且加入搅拌装置中进行混合，搅匀至浆状；

将步骤（1）中初步扩增的哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌和放线菌菌液，按照2：2：1的重量比混合，得到复合功能菌液；将上述处理后的二次扩增原料与复合功能菌液按照（5-15）：1的重量比混合，搅拌后加入发酵罐中进行发酵得到二次扩增混合物；取二次扩增混合物，测定微生物数量，其微生物数量应达到10⁶-10⁸ cfu/g；

（3）发酵：将二次扩增混合物与最终发酵原料进行混合，其中最终发酵原料由按重量百分比计的动物粪便15%~25%，豆渣粉20%~30%，菌棒碎渣20%~30%，烟丝5%~10%，羽毛粉20%~30%和牡蛎粉10%~15%组成，二次扩增混合物按重量百分比计为最终发酵原料的5%~10%；混合后将水分调节至二次扩增混合物与最终发酵原料总重量的40%，进行静置发酵5-7天；上述静置发酵过程中，进行温度检测，当混合物温度达到55℃以上时，将混合物转入到发酵槽内进行发酵；用翻抛机每天翻抛1-2次，经发酵3周，当温度下降到40℃以下，不再升温后即完成发酵；

（4）后处理：发酵完成后将肥料烘干，将水分降到低于30%，造粒，包装；

所述步骤(1)中哈茨木霉菌为哈茨木霉菌T-22；放线菌为放线菌CICC 10520；枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌MBI600。

2.根据权利要求1所述的生物有机肥的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中枯草芽孢杆菌和放线菌在34-38℃培育，哈茨木霉菌在24-28℃培育。

3.根据权利要求1所述的生物有机肥的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中二次扩增原料为按重量百分比计的豆渣粉25%、羽毛粉20%、氯化钠5%和水50%。

4.根据权利要求1所述的生物有机肥的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中二次扩增原料与复合功能菌液按照9：1的重量比混合。

5.根据权利要求1所述的生物有机肥的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中最终发酵原料由按重量百分比计的动物粪便15%，豆渣粉25%，菌棒碎渣25%，烟丝5%，羽毛粉20%和牡蛎粉10%组成。

6.根据权利要求1所述的生物有机肥的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中二次扩增混合物按重量百分比计为最终发酵原料的10%。

7.权利要求1-6任一项所述的制备方法得到的生物有机肥。

8.权利要求7所述的生物有机肥在防治土壤病虫害中的应用。