UA127471C2

UA127471C2 - Спосіб відбору гібридних рослин роду taraxacum

Info

Publication number: UA127471C2
Application number: UAA201803452A
Authority: UA
Inventors: Дейк Петер Йоханнес ван; Дэйк Петер Йоханнес ван; Анкер Пребен СЕРЕНСЕН
Original assignee: Ліон-Флекс Б.В.
Priority date: 2015-09-03
Filing date: 2016-09-02
Publication date: 2023-09-06
Also published as: US20180271043A1; EP3344033B1; EA201890636A1; EA037884B1; EP3344033A1; PL3344033T3; CA2996828A1; WO2017039449A1

Abstract

Винахід належить до способу відбору гібридних рослин роду Taraxacum, причому спосіб включає наступні етапи забезпечення гібридних рослин роду Taraxacum з розміром геному від 1000 до 1415 мегаба, відбір гібридних рослин роду Taraxacum за відсутності гена циспренілтрансферази (CPT ТO), відбір гібридних рослин роду Taraxacum за присутності принаймні трьох генів, що вибирають з групи, яка складається з циспренілтрансферази-2 T. koksaghyz (CPT2 TKS), циспренілтрансферази-3 T. koksaghyz (CPT3 TKS), активатора каучукової трансферази T. koksaghyz (RTA TKS), білка малих каучукових частинок P5 (SRPP5 TKS) і фактор подовження каучуку T. koksaghyz (REF TKS), d) відбір не більше 40 % гібридних рослин роду Taraxacum, що мають найбільший розмір рослини та відбір не більше 40 % гібридних рослин роду Taraxacum, що мають найбільший розмір геному, при цьому гібридні рослини роду Taraxacum являють собою гібрид Taraxacum officinale та Taraxacum koksaghyz. Винахід також належить до гібридної рослини роду Taraxacum, одержуваної заявленим способом та застосування цієї рослини роду Taraxacum для продукування та одержання каучуку.

Description

(57) Реферат:

Винахід належить до способу відбору гібридних рослин роду Тагахасит, причому спосіб включає наступні етапи забезпечення гібридних рослин роду Тагахасит з розміром геному від 1000 до 1415 мегаба, відбір гібридних рослин роду Тагахасит за відсутності гена циспренілтрансферази (СРТ ТО), відбір гібридних рослин роду Тагахасит за присутності принаймні трьох генів, що вибирають з групи, яка складається з циспренілтрансферази-2 Т.

Кокзадпуг (СРТ2 ТК5), циспренілтрансферази-3 7. Кокзадну7 (СРТЗ ТК5), активатора каучукової трансферази 7. Кокзадну (КТА ТК5), білка малих каучукових частинок Р5 (5БЕРР5

ТК) і фактор подовження каучуку 7. Кокзадну: (КЕР ТК), а) відбір не більше 40 95 гібридних рослин роду Тагахасит, що мають найбільший розмір рослини та відбір не більше 40 95 гібридних рослин роду Тагахасит, що мають найбільший розмір геному, при цьому гібридні рослини роду Тагахасит являють собою гібрид Тагахасит опНісіпає та Тагахасит Кокзадну?.

Винахід також належить до гібридної рослини роду Тагахасит, одержуваної заявленим способом та застосування цієї рослини роду Тагахасит для продукування та одержання каучуку.

Галузь техніки

Даний винахід належить до потужної і каучуконосної рослини роду Тагахасит і способу забезпечення такої рослини.

Передумови створення винаходу

Натуральний каучук, полімер ізопрену, є досить важливим поновлюваним матеріалом для більше 40000 продуктів, необхідних будівельній промисловості (клеїв, герметиків), фармацевтичній промисловості (рукавичок, трубок) і транспортній промисловості (килимків, шин). У багатьох застосуваннях натуральний каучук не може бути замінений синтетичними каучуками (штучні еластомери в основному синтезуються з побічних продуктів нафтопереробки).

У даний момент натуральний каучук збирають винятково на плантаціях каучуконосного дерева (Немеа Бгазйепві5), 290956 якого вирощують у Південно-Східній Азії. Однак прогнозується значне збільшення споживання натурального каучуку в усьому світі, у той час як виробничі майданчики перебувають у напруженому стані через працезатрати і переваги виробництва пальмового масла.

Казахстанська кульбаба |Тагахасит Кокзаойпу7, скорочено ТК5І| також продукує у своєму корінні натуральний каучук дуже високої якості, але це невелика рослина, що веде до низького врожаю. Напроти, звичайна кульбаба (Гагахасит ойПісіпае, скорочено ТОЇ) є потужною рослиною, але не продукує каучук.

Дотепер спроби відповідного об'єднання потужності і продукування каучуку в одній рослині роду Тагахасит були безуспішними (дивіться, наприклад, Воїапіса! Кемієм/, Мої. 11, Мо. 8, А

Кеміємж ої І йегаїште оп Тагахасит КоКк-задпу? Ной (Осі., 1945), рр. 417-461). Мета даного розкриття полягає в рішенні принаймні цієї проблеми у відомому рівні техніки.

Загальні визначення

У наступному описі і прикладах використовується ряд термінів. Для забезпечення ясного і послідовного розуміння специфікації та формули винаходу, включаючи об'єм, у якому повинні бути надані такі терміни, наводяться наступні визначення. Якщо не зазначено інше, усі використовувані технічні і наукові терміни мають таке ж значення, у якому вони звичайно розуміються фахівцем із середнім рівнем компетентності в галузі техніки, до якої належить цей винахід.

Використовуваний тут термін "рослина" або "рослинний матеріал" може належати до клітини рослини, тканини або органів рослини, протопласту рослини, культури клітинної тканини рослини, з якої може бути регенерована рослинаци), калюсів рослини, скупчення клітин рослини і клітин рослини, які є інтактними в рослинах, частин(и) рослин(и), таких як ембріони, пилку, насінних зачатків, фрукту (наприклад, зібраного фрукту), квітів, листя, насіння, коріння, кінчиків коренів і т.п. Корінь(ня) є органом рослини, який звичайно перебуває нижче поверхні грунту і може бути легко ідентифікований кваліфікованим фахівцем. Термін "рослина" також може належати до всієї рослини, наприклад, рослини роду Тагахасит або його коріння.

Використовуваний тут термін "каучук" належить до (натурального) каучуку, який включає полімери органічної сполуки ізопрену, зокрема, цис-1,4-поліїззопрену. Можуть бути присутніми домішки інших органічних сполук (такі як білки, жирні кислоти, смоли та неорганічні матеріали), а також вода, але переважно каучук включає принаймні 95 ваг. 9о полімерів ізопрену. У каучуку за даним винаходом (середня) молекулярна маса полімеру може становити від 100000 дальтон до 1000000 дальтон, переважно від 500000 дальтон до 1000000 дальтон, від 800000 до 1000000 дальтон або від 900000 до 1100000 дальтон, або навіть принаймні 1000000, 1100000, 1200000, 1300000, 1400000, 1500000 або принаймні 200000 дальтон. Форми поліїзопрену, які використовуються як натуральні каучуки, можуть бути віднесені до еластомерів. Натуральний каучук використовується багатьма виробничими компаніями для виробництва гумових виробів, наприклад (автомобільних або авіаційних) шин.

Використовуваний тут термін "Тагахасит" належить до роду квітучих рослин родини

Авіегасеаеє і складається з видів, широко відомих як кульбаба. Тагахасит ойісіпаіе (ТО), звичайна кульбаба, являє собою квітучу трав'янисту багаторічну рослину цієї родини.

Тагахасит Кокзадпу; (ТК5), звичайно називаний казахстанською кульбабою або російською кульбабою (або каучуконосною кульбабою), є видом кульбаби, властивим Казахстану, який відрізняється своїм продукуванням каучуку високої якості, але має невелику потужність. ТК5 можна знайти в природі в Казахстані або можна одержати з банку насіння ОБОА. ТО з подвійним числом хромосом можна, наприклад, знайти у Швейцарії, Нідерландах, а також можна одержати з банку насіння О5ОА. Звичайно, рослини роду Тагахасит відповідно до даного винаходу не обмежуються конкретним джерелом, з якого були отримані вихідні рослини.

Використовуваний тут термін "схрещування", "зворотне схрещення", "інтеркрос" і "відбір" належить до етапів селекції рослин. Селекція рослин являє собою вміння змінювати ознаки рослин з метою одержання бажаних характеристик. Інакше кажучи, це процес відбору індивідуумів у популяції, які будуть давати генетичний матеріал наступному поколінню (тобто Е1 є поколінням, отриманим у результаті схрещування першої сукупності батьків (тобто покоління

Р), а Е2/52, 03, 054, (05 і т.д. є наступними поколіннями). Зокрема, такий процес може грунтуватися як на природніх, так і на штучних явищах або етапах процедури. Критерії відбору можуть грунтуватися на фенотипічних або геномних характеристиках, наприклад, але без обмеження ними, присутності або ступені присутності генів, експресії генів, генетичних маркерів, комбінаціях генів, локусів кількісних ознак, ознаках або комбінаціях ознак. Зворотне схрещення являє собою схрещування рослин визначеного покоління з одним із його батьків (або предків) або індивідуумом, генетично схожим з його батьком, з метою одержання потомства з генетичною ідентичністю, яка ближча до такої батька або предка. Інтеркрос належить до схрещування двох індивідуумів, які мають загального/подібного предка один з одним. У даному винаході переважно, щоб схрещування і/або зворотне схрещування (і/або інтеркрос) виконувалися в оптимальних (парникових) умовах, наприклад, при 20-22 або 21 градусі Цельсія в денний час, при 17-19 або 18 градусах Цельсія в нічний час, нормальній вологості і етапи схрещування виконуються через 18-22 або 20 тижнів від сходів.

Використовуваний тут термін "маркер" належить до маркера (на основі ДНК), який може використовуватися в процесі, наприклад, для селекції рослин, у якому рослини піддають скринінгу на присутність і/або відсутність одного або більше генетичних і/або фенотипічних маркерів. Прикладами генетичних маркерів є специфічна ДНК-послідовність, АРІ Р (поліморфізм довжин ампліфікованого фрагмента), мікросателітний локус, КЕГР (поліморфізм довжин рестрикційного фрагмента), 515 (ДНК-маркірувальний сайт), 5зМР. (однонуклеотидний поліморфізм), ЗЕР (однофункціональний поліморфізм, дивіться Вогемії; еї, 2003, Сепоте

Везеєагсп 13: 513-523), БСАК (ампліфікована ділянка із визначеною послідовністю), маркери

САРБ5 (розщеплена ампліфікована поліморфна послідовність) і т.п. Аналіз КАБР може використовуватися для виявлення присутності або відсутності послідовності ДНК (маркера) і або для визначення, чи є рослина гетерозиготною або гомозиготною за маркером (дивіться також "ЗМР депоїуріпд: їйе КАБ5Р аззау, іп Стор Вгеєдіпа: Меїнодз апа Ргоїюосої5, Зргіпдег 2014,

Моїште 1145). До того ж, для скринінгу на присутність/відсутність визначеної послідовності ДНК (маркера) може використовуватися інший спосіб, наприклад, звичайні способи ПЛР. Звичайно, послідовність ДНК (маркер) також може бути виявлена за допомогою секвенування.

Використовуваний тут термін "секвенування" належить до визначення порядку нуклеотидів (послідовностей основ) у зразку нуклеїнової кислоти (зразку ДНК), наприклад, отриманому з рослини. Доступна множина методів, таких як секвенування за Сенгером і технології високопродуктивного секвенування (НТ). Секвенування за Сенгером може включати секвенування за допомогою детекції методом (капілярного) електрофорезу, у якому аж до 384 капілярів може бути проаналізовано відносно послідовності за один цикл. Високопродуктивне секвенування включає паралельне секвенування тисяч або мільйонів, або більше послідовностей відразу. НТ можна визначити як секвенування наступного покоління, тобто методи, основані на піросеквенуванні у твердій фазі, або як секвенування після наступного покоління на основі однонуклеотидного секвенування в режимі реального часу (5МКТ).

Технології НТ5 доступні, наприклад, пропонуються Коспе, ПШитіпа апа Арріїеа Віозуєтетв (І їе

Тесппоодіе5). Додаткові технології високопродуктивного секвенування описані і/або доступні від

Неїїсо5, Расіїс Віозсіепсе5, Сотрієїе Сепотіс5, оп Тоїпепі БЗувієтве, Охіога Мапороге

Тесппоіодіез, Мабрзув, 25 Сепеїйсв, С1пиВіо.

У цьому документі та у його формулі винаходу дієслово "включати (містити)" і його дієвідміни, як воно використовується в його необмежувальному значенні, означають, що наступні за словом елементи включені, але не згадані конкретно елементи не виключені. До того ж, посилання на елемент за допомогою невизначеного артикля "а" або "ап" не виключає можливості присутності більше одного елемента, якщо тільки контекст явно не вимагає присутності одного і тільки одного з елементів. Таким чином, невизначений артикль "а" або "ап" зазвичай означає "принаймні один". Крім того, зрозуміло, що при посиланні тут на "послідовності", як правило, посилаються на фактичні фізичні молекули з визначеною послідовністю субодиниць (наприклад, основ).

Способи здійснення звичайних методів, використовуваних у способах даного розкриття, будуть очевидні для кваліфікованого працівника і описані, наприклад, в бвєїЇесіп Меїнодз іп

Ріапі Вгеєдіпд (ед5. Ігак Воз, Реїег Саїїдагі; Зрііпдег Зсіеєпсе5-Вивзіпез55 Медіа 2008; Ргодгезв іп 60 Ріапі Вгеєдіпу (ей. сх. Е. Вивзеї; ВиЩепгмопій 4 Со, 2013); Ойцапійайме Сепеїйс5, Ссепотісв, апа

Ріапі Вгеєдіпд (еав. Мапіїї 5. Капо; КАВІ Рибіївпіпу 2002); і Ріапі Вгеєедіпд Меїйтосд3 (єд. МаНабаї!

Ват; РНІ І єатіпо Р'імаїє І ітієй, Мем Оеїпі, 2014).

Опис даного винаходу

Даний винахід належить до способу забезпечення рослини роду Тагахасит з - вмістом каучуку, що становить принаймні 0,5 г, переважно принаймні 0,75, 1,0, 1,5 або навіть 2,0 г сухої ваги, що може бути визначено переважно за допомогою прискореної екстракції розчинником.

Також передбачається рослина роду Тагахасит з - сухою вагою коріння, що становить принаймні 5 г, переважно принаймні 7, 10, 20, 30, 40 або навіть 50 г; - вмістом каучуку в корінні, що становить принаймні З ваг. 96, переважно принаймні 3,5, 4,0, 4,5 або навіть 5,0 ваг. 95 сухої ваги відносно загальної сухої ваги коріння, що може бути визначено, наприклад, за допомогою прискореної екстракції розчинником.

Конкретніше, даний винахід належить до способу забезпечення і відбору рослин роду

Тагахасит, причому спосіб включає наступні етапи: а) забезпечення рослин роду Тагахасит, що мають - розмір генома від 1000 до 1415 мегабаз і/або - 60-99 95 генів, що походять від Тагахасит Кокзадпу? (ТК), і 1-40 95 генів, що походять від

Тагахасит ойісіпа|е (ТО);

Б) відбір рослин роду Тагахасит за відсутністю гена СРТ ТЕ; с) відбір рослин роду Тагахасит за присутністю принаймні трьох генів з СРТ2 ТК5, СРТЗ

ТК, ВАТА ТК5, 5АРРБ ТКЗ5 і ВЕР ТК5; а) відбір не більше 40 95 рослин роду Тагахасит за розміром рослини; е) відбір не більше 40 95 рослин роду Тагахасит за розміром генома.

Цей метод дозволяє об'єднати потужність ТО із продукуванням каучуку в ТК5 в одній рослині роду Тараксакум. Це досягається шляхом інтрогресії пов'язаних з потужністю генетичних елементів ТО в генетичний ФОН ТК5, що забезпечує продукування каучуку, з метою одержання потужної і каучуконосної рослини роду Тагахасит.

Для цього перший етап а) належить до забезпечення рослин роду Тагахасит з розміром

Зо генома, що становить 1000-1415 мегабаз/1С (1С означає кількість у гаплоїдному ядрі або половину кількості в диплоїдному ядрі), і/або забезпечення рослин роду Тагахасит, що містять 60-99 95 генів, що походять від Тагахасит Кокзадпу; (ТК), і 1-40 95 генів, що походять від

Тагахасит ойісіпаіе (ТО). Відсотки генів, що походять від ТО/ТК5, зазвичай корелюють із (і можуть визначатися) розміром генома рослини роду Тагахасит. ТК5 має розмір генома -1420 мегабаз/1С (дивіться, наприклад, Кіг5сппег еї а!І., 2013 (Сепеї Кезошиг Стор Емої (2013) 60: 455- 471), тоді як ТО має розмір генома -835 мегабаза/1С (неопубліковані дані).

Хоча етапи селекції для одержання таких рослин роду Тагахасит можуть бути здійснені через аутсорсинг, також можна одержати рослини шляхом схрещування і/або зворотного схрещування (і/або інтеркросу) рослин роду Тагахасит, тобто рослин Тагахасит Кокзадпу (ТК) їі рослин Тагахасит ойПісіпаіе (ТО), переважно протягом принаймні двох поколінь. Отже, етапу а) може передувати забезпечення рослин Тагахасит Кокзаопу (ТК) і рослин Тагахасит ойісіпае (ТО), переважно з наступним схрещуванням і/або зворотним схрещуванням (і/або інтеркросом) ТКЗ і ТЕ. У випадку і ТК5, і ТО диплоїдні рослини можуть використовуватися для першого етапу схрещування. Після цього виконують переважно 1, 2, З або більше етапів зворотного схрещування з ТК5.

Кваліфікований фахівець може визначити розмір генома рослини роду Тагахасит за допомогою проточної цитометрії, як описано, наприклад, Таз і мап ріїк (1999, Негеайу 83: 707- 714) і більш переважно, як описано тут у прикладі. Кваліфікований фахівець також може легко визначити відсотки генів, що походять від ТО/ТК5, на основі правила, згідно з яким у потомства буде 50 95 генів першого батька та 50 95 генів другого батька. Це правило наочно презентовано на фіг. 1. На першому етапі схрещування на фіг. 1 ТО (зі 100 95 генів, що походять від ТЕ) схрещують із ТК5 (зі 100 9о генів, що походять від ТК5), що дає в результаті потомство з 50 95 генів, що походять від ТО, і 50 95, що походять від ТК5 генів. Потім ці ТОТК5» рослини схрещують із ТО рослинами, що дає в результаті ТОбо21002ТК56502-7075Т1К525, тобто рослину роду Тагахасит з 75 95 генів, що походять від ТО, і 25 95 генів, що походять від ТК5.

Оскільки відсотки генів, що походять від ТО/ТК5, як правило, корелюють із (і визначаються) розміром генома рослини роду Тагахасит, можливо, альтернативно, що відсотки генів, що походять від ТО/Г/К5, будуть грунтуватися на визначенні розміру генома рослини за допомогою проточної цитометрії. У такому випадку розмір генома -835 мегабаз означає 100 95 ТО, і кожні 60 додаткові 5,85 мегабаз зменшують відсоток генів, що походять від ТО, на 1 95 і збільшують відсоток генів, що походять від ТК, на 1 95. Так, якщо визначено, що розмір генома рослини дорівнює 846,7 мегабаз, рослину можна розглядати як ТОУЗТКО-. Відповідно, розмір генома, що становить -1420, має на увазі, що рослина являє собою 100 95 ТК5.

Як правило, у необов'язковій програмі селекції перший етап буде полягати в тому, щоб схрестити ТО" з ТК5700, що буде давати в результаті ТОРОТК5»ю, Другим етапом може бути зворотне схрещування з ТК5"0, що буде давати в результаті ТО2ТК5", яке вже перебуває в бажаному діапазоні, як того вимагає етап а). Однак, переважно виконувати множину етапів схрещування. Застосування більшої кількості етапів схрещування, зворотного схрещування і/або інтеркросу має ту перевагу, що буде відбуватися більша кількість подій рекомбінації, що призведе до більшої кількості варіацій у рослинах і більш різноманітної суміші сегментів, що походять від ТО і ТК5, у хромосомах рослин, забезпечених на етапі а).

Тому переважно, щоб схрещування і/або зворотне схрещування застосовували протягом принаймні 1, 2, 3, 4 або 5 поколінь, щоб прийти до рослини роду Тагахасит, як того вимагає етап а), перш, ніж перейти до етапу б).

Кваліфікованому фахівцеві буде ясно, що при застосуванні даного способу не потрібно виконувати етапи схрещування, зворотного схрещування і/або інтеркросу, які призводять до забезпечення рослин роду Тагахасит, що мають розмір генома, який становить 1000-1415 мегабаз, і/або таких, що містять 60-99 95 генів, що походять від Тагахасит Кокзадпу? (ТК), і 1- 40 95 генів, що походять від Тагахасит ойісіпаіе (ТО). Таким чином, ці етапи є необов'язковими і можуть бути здійснені шляхом аутсорсингу, так що спосіб може починатися із забезпечення зазначених рослин.

У переважному варіанті здійснення етап а) належить до забезпечення рослин роду

Тагахасит з розміром генома, що становить 1000-1415 мегабаз (/1С) або переважно з розміром генома, що становить принаймні 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1025, 1050, 1075, 1100, 1125, 1150, 1200, 1225, 1250, 1275, 1300, 1325, 1350, 1375, 1400 мегабаз (/1С) і/або не більше 1100, 1125, 1150, 1200, 1225, 1250, 1275, 1300, 1325, 1350, 1375, 1400 мегабаз (/1С).

В іншому переважному варіанті здійснення етап а) належить до забезпечення рослин роду

Тагахасит, що містять принаймні 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 95 і/або не більше 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 95 генів, що походять від Тагахасит Кокхаопу? (ТК), і відповідно не більше 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32,

З1, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20,19, 18, 17, 16, 15,14,13,12,11,10,9,8,7,6,5,4,3,2 або 1 95 і/або принаймні 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11,10,9,8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1 95 генів, що походять від Тагахасит ойісіпаіе (ТО). Альтернативно, етап а) належить до забезпечення рослин роду Тагахасит, що містять 60-99 95, 65-95 95 або 70-90 95 генів, що походять від

Тагахасит Кокзадпу; (ТК5), і 1-40 95, 5-35 або 10-30 95 генів, що походять від Тагахасит ойісіпаіе (ТО). Вищезгадані рослини роду Тагахасишт можуть розглядатися як гібриди Тагахасит

Кокзаоднпу? (ТК) і Тагахасит ойісіпа|е (ТО).

На етапі Б) здійснюють відбір рослин роду Тагахасит за відсутністю наступного гена

Тагахасит опПісіпа|е: - СРТ (СРТ ТО, цис-пренілтрансферази Тагахасит опйісіпа!е).

Кваліфікований фахівець може розпізнати СРТ ТО, оскільки він містить (і може бути виявлений за) маркер(ом) СРТ ТО, як описано в прикладі в аналізі КА5Р.

Переважно, щоб етап р) виконувався після або перед етапу(ом) а) забезпечення рослин роду Тагахасит, що мають розмір генома, що становить 1000-1415 мегабаз, і/або таких, що містять 60-99 95 генів, що походять від Тагахасит Кокзадпу? (ТК), і 1-40 95 генів, що походять від Тагахасит ойісіпаіе (ТО). Таким чином, можуть забезпечуватися рослини роду Тагахасит першого відбору.

На етапі с) здійснюють відбір рослин роду Тагахасит за присутністю принаймні одного, двох, трьох, чотирьох, переважно принаймні п'яти (або всіх) з наступних генів Тагахасит

Кокзадну?г: - СРТ2 (СРТ2 ТК, цис-пренілтрансферази 2), - СРТЗ (СРТЗ ТК, цис-пренілтрансферази 3), - КТА (КТА ТК, активатора каучук-трансферази), - ЗКРР5Б (ЗЕРР5Б ТК, білка Р5 на поверхні невеликих частинок каучуку) і/або - КЕЕ (КЕЕ ТК, фактора елонгації каучуку).

Кваліфікований фахівець може розпізнати ці гени на підставі того, що вони містять (і можуть бути виявлені за) відповідний маркер(ом), як описано в прикладі в аналізі КА5Р.

Таким чином, можуть бути забезпечені рослини роду Тагахасит другого відбору.

У переважному варіанті здійснення етапу с) відбір рослин здійснюють за гомозиготною присутністю принаймні одного, двох, трьох, чотирьох, переважно принаймні п'яти з перерахованих вище генів Тагахасит Кокзаоднпу?.

Переважно на етапі с) також здійснюють відбір рослин роду Тагахасит за (гомозиготною) присутністю всього кластера генів БКРР ТК5, тобто за ЗКРР1-5 ТК5: ЗЕРРІ (білком РІ на поверхні невеликих частинок каучуку), ЗКРР2 (білком Р2 на поверхні невеликих частинок каучуку), ЗКРРЗ (білком РЗ на поверхні невеликих частинок каучуку), ЗЕР РА (білком Р4 на поверхні невеликих частинок каучуку) і ЗЕРР5 (білююм РО на поверхні невеликих частинок каучуку).

Крім того, переважно, щоб додатково здійснювався відбір рослин роду Тагахасит за (гомозиготною) присутністю (гена, що містить) ЗЕБО ІО МО: 11, описаної тут у прикладі.

Переважно етап с) виконують після етапу р), що належить до відбору проти СРТ ОТ і після або до етапу а) забезпечення рослин роду Тагахасит, що мають розмір генома, що становить 1000- 1415 мегабаз (/1С), і/або таких, що містять принаймні 60 95 генів, що походять від Тагахасит

Ккокзадпу? (ТК) генів і принаймні 40 95 генів, що походять від Тагахасит ойісіпа|Іе (ТО).

Кваліфікований фахівець знає, як можна визначити присутність/відсутність вищезгаданих генів/послідовностей шляхом ідентифікації підходящих маркерів, які пов'язані із присутністю або відсутністю зазначених генів. Наприклад, підходящі праймери можуть бути розроблені для наступного виявлення за допомогою ПЛР або маркери ДНК-послідовності генів можуть бути виявлені шляхом секвенування. Аналіз КАЗР особливо корисний для виявлення (гомозиготної) присутності/відсутності маркерів ДНК-послідовностей зазначених генів.

На етапі 4) способу здійснюють відбір не більше 40 95 рослин роду Тагахасит за розміром рослин. Переважно на цьому етапі здійснюють відбір не більше 35 95, 30 95, 25 У, 20 9, 15 95, 10 95 рослин роду Тагахасит за розміром рослини (таким чином, відбираючи для забезпечення рослини більшого розміру). Розмір рослини можна визначити по-різному, наприклад, шляхом визначення площі поверхні самого довгого листка, кількості листків, загальної ваги рослини, висоти рослини (над землею) або ваги коріння. Переважно розмір рослини визначають на основі площі поверхні самого довгого листка або шляхом множення зазначеної площі поверхні на кількість листків. Етап 4) переважно виконують після етапу а) (до етапу Б), але більш

Зо переважно після обох етапів Б) і с). Таким чином, можуть бути забезпечені рослини роду

Тагахасит третього відбору.

На етапі (є) способу здійснюють відбір не більше 40 95 рослин роду Тагахасит за розміром їх генома. Переважно на цьому етапі здійснюють відбір не більше 35 95, 30 90, 25 95, 20 9о, 15 9, 10 95 рослин роду Тагахасит за розміром їх генома (таким чином, відбираючи для забезпечення рослини з більшими розмірами генома). Розмір генома, наприклад, у мегабазах, можна визначити за допомогою проточної цитометрії, добре відомої кваліфікованому фахівцеві і описаної Таз і мап рік (1999, Негейайу 83: 707-714), і більш переважно, як описано тут у прикладі. Етап е) переважно виконують після етапу а) (до етапу Б) і більш переважно після етапу а) відбору за розміром рослини. Таким чином, можуть бути забезпечені рослини роду

Тагахасит четвертого відбору.

Переважно етап а) способу забезпечує принаймні 10, 20, 50, 100, 100, 1500 або принаймні 2000 рослин. Етапи а)-е)у можуть виконуватися в іншому порядку, ніж прямо описано, хоча описаний порядок є переважним. Етап Б) може бути необов'язковим. Етап с) також може бути необов'язковим. До того ж, етап а) і/або етап е) можуть бути необов'язковими. Описаний вище спосіб (або його етап а) переважно не є по суті біологічним процесом для одержання рослин і/або переважно не включає схрещування і наступний відбір рослин. Крім того, переважно, щоб на етапах Б), с), а) і/або є) відібрані рослини фізично відбиралися з більшої популяції рослин, з якої починається відповідний етап. Одночасно або альтернативно, етапи б), с), 4) і/або є) можуть бути виконаними за допомогою комп'ютера етапами або виконаними іп б5іїйсо (віртуально). Останнє може бути об'єднане з етапом а), що є необов'язковим.

Також забезпечується рослина роду Тагахасит, яку можна отримати або отримано за допомогою способу згідно із даним винаходом. Переважно забезпечуються принаймні 2, 5, 10, 100, 500, 1000, 1500 або 2000 таких рослин. Повинно бути ясно, що також передбачений машиночитаний носій, що містить команди для виконання даного способу.

Даний винахід, крім того, належить до рослини роду Тагахасит з - вмістом каучуку, що становить принаймні 0,5 г, переважно принаймні 0,51, 0,52, 0,53, 0,54, 0,55, 0,56, 0,57, 0,58, 0,59, 0,6, 0,61, 0,62, 0,62, 0,63, 0,64,0,65,0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 або 1,0,11, 1,2, 1,25, 1,3, 1,4, 1,50, 1,6, 1,75, 1,8, 1,9, 2,00, 2,1, 2,2, 2,25, 2,50, 2,75 або 3,0 г сухої ваги, що може бути визначено переважно за допомогою прискореної екстракції розчинником. бо Також забезпечується рослина роду Тагахасит з

- сухою вагою коріння, що становить принаймні 5 г, переважно принаймні 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 9,0, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 25, 27, 28, 29, 30, 91, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 або 40, 41, 42, 43, 44, 45, Аб, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 або 60 г; і/або - вмістом каучуку в корінні, що становить принаймні З ваг. 9о, переважно принаймні 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9,4,0,4,1,4,2,4,3, 4,4, 4,5, 4,6,4,7,4,68,4,9,5,0,5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 або навіть 6,0 ваг. 95 сухої ваги відносно загальної сухої ваги коріння, що визначається, наприклад, за допомогою прискореної екстракції розчинником.

Переважно, щоб рослина додатково містила принаймні один, два, три, чотири, п'ять або всі з наступних генів/послідовностей: - СРТ2 ТК5 (переважно гомозиготний); - СРТЗ ТК5 (переважно гомозиготний); - КТА ТК5 (переважно гомозиготний); - ЗЕРРБ ТК5 (переважно 5КРР 1-5 і/або гомозиготний); і/або - КЕЕ ТК5 (переважно гомозиготний) і - необов'язково (ген, що містить) ЗЕО ІЮ МО:11 (переважно гомозиготну), описану в прикладі.

Як описано, рослина є переважно гомозиготною принаймні за однією, двома, трьома, чотирма, п'ятьма або шістьма (або всіма) із цих послідовностей генів/маркерів.

Крім того, рослина переважно має розмір генома, що становить принаймні 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 або переважно принаймні 1000, або навіть принаймні 1050, 1100 1150, або принаймні 1200, 1250, 1275, 1300, 1325, 1350, 1375, 1400, 1410 мегабаз, що може бути визначено за допомогою проточної цитометрії (як правило, при визначенні 1 пг означає 978 мегабаз). Переважно, щоб як (внутрішній) контроль використовувалася чиста ТК5 рослина (яка, як прийнято вважати, має розмір генома 1420 мегабаз/1С), але також може використовуватися інший (внутрішній) контроль із відомим розміром генома.

Альтернативно або додатково, рослина має розмір генома, що становить не більше 1200, 1250, 1275, 1300, 1325, 1350, 1375, 1400, 1410 мегабаз. Переважно, щоб рослина не містила

СРТ ТО.

Зо Вищевказані характеристики можуть бути визначені для конкретної рослини виду Тагахасит у будь-який час його циклу росту, але переважно вони визначаються після принаймні 10, 1, 12, 13, 14, 15, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100 тижнів росту в оптимальних (тепличних) умовах, починаючи зі сходів (наприклад, при 21 градусі Цельсія в денний час, 18 градусах у нічний час, необов'язково з контролюванням вологості).

Додатково або альтернативно, характеристики можуть бути визначені для популяції рослин (наприклад, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 або більше рослин) шляхом обчислення середнього значення для кожної їх характеристики. Сухий рослинний матеріал може бути отриманий, наприклад, шляхом сушіння в сушильній шафі при 70, 80, 90 або 100 градусах Цельсія протягом 1, 2 або З годин.

Рослину переважно одержують/можна одержати цим способом, і/або, наприклад, принаймні 2, 5,10, 100, 500, 1000, 1500 або 2000 таких рослин забезпечуються.

Вміст каучуку можна визначити за допомогою прискореної екстракції розчинником (АЗЕ), наприклад, описаної як "традиційна технологія" в О5 20060106183 А1. Наприклад, каучук може бути виділений з рослинного матеріалу (наприклад, коріння), використовуючи обварювання окропом, яке коагулює латекс у клітинах, з наступним етапом подрібнення в розчині їдкого лугу для виділення каучуку. У цьому випадку цей традиційний процес призводить до того, що подрібнена багаса осідає на дно ємності для обробки, і дозволяє смолі плавати на поверхні для збирання. Конкретніше, у цьому способі смоли з рослинних матеріалів одержують екстракцією полярними розчинниками, такими як спирти, кетони і складні ефіри. Зазвичай використовуваним розчинником є ацетон. Смолу виділяють із розчину шляхом випарювання розчинника. Каучук із куща, як правило, екстрагують із використанням вуглеводневих розчинників, таких як гексан, циклогексан або толуол.

Вміст каучуку можна визначити за допомогою АЗЕ наступним чином 1. обварювання окропом матеріалу рослини (коріння), або ліофілізація та розмелювання матеріалу рослини (коріння); 2. етап подрібнення в розчині їдкого лугу для виділення каучуку або піддавання матеріалу впливу розчинника (наприклад, н-гексану з 2,595 ЕН) (1 хв), потім нагрівання (до 802С) і стискання під тиском (1500 фунтів на квадратний дюйм) матеріалу (5 хв), 3. (екстрагування каучуку свіжим розчинником ї) визначення ваги каучуку відносно ваги бо вихідного матеріалу.

Більш переважно, коли спосіб АЗЕ виконують, як описано в прикладі.

Альтернативно, вміст каучуку можна визначити за допомогою прискореної екстракції розчинником з рекомендованими установками і параметрами, описаними в Реагзоп (Іпаивігіа!

Сторз5 апа Ргодисів 31 (2010) 469-475).

Переважно вміст каучуку визначають у корінні, беручи принаймні два, три, чотири, п'ять зразків з кореневих частин рослини, гомогенізуючи їх, а потім визначаючи вміст каучуку.

Альтернативно, вміст каучуку в кожному із принаймні двох, трьох, чотирьох або п'яти зразків можна визначити індивідуально, а потім вміст каучуку в них можна усереднити.

Рослина, яка може бути забезпечена згідно із даним винаходом, переважно є рослиною, що не стрілкується, тобто вона не виходить у стрілку перед холодовою індукцією. Вихід у стрілку являє собою (передчасне) утворення квітучого стебла (або стебел) на сільськогосподарських і садових культурах до збору врожаю. Перевага рослин, що не стрілкуються, полягає в тому, що вони будуть залишатися на вегетативній (зростаючої) стадії протягом більш тривалого часу, наприклад, поки не пройде зима. Кваліфікований фахівець знає, як він може відібрати рослини, які не стрілкуються. Крім того, переважно, щоб у рослини не проявлявся літній спокій. Літній спокій являє собою річний цикл, який може зустрічатися в рослин і який викликаний хімічними змінами усередині рослинних клітин. Він стимулюється умовами навколишнього середовища з більш високими температурами, відносною сухістю і більш довгими днями, пов'язаними з пізньою весною і влітку, що призводить до вповільнення метаболізму рослин. Кваліфікований фахівець також знає, як він може провести відбір за цією характеристикою.

У даному винаході також забезпечується насіння, клітина або культура тканин, або корінь (коріння), що походять з рослини згідно із даним винаходом, а також застосування рослини згідно їз даним винаходом для продукування каучуку. Для останнього каучук, як правило, екстрагують із коріння рослини.

Відповідно, у даному винаході також передбачається каучук, який можна одержати за допомогою, наприклад, екстракції з (коріння) рослини згідно із даним винаходом.

Каучук згідно із даним винаходом можна відрізнити від каучуку, отриманого способами відомого рівня техніки, за тим, що каучук має відмінні властивості.

Конкретніше, каучук може характеризуватися: - Мп, що складає принаймні 300000, 400000, 500000 дальтон, переважно принаймні 510000, 520000, 530000, 540000, 550000, 560000, 570000, 580000, 590000, 600000, 700000 або 800000, 900000 або навіть принаймні 1000000 дальтон; - Мму, що складає принаймні 700000, 800000, 900000, переважно принаймні 910000, 920000, 930000, 940000, 950000, 960000, 970000, 980000, 990000, 1000000, 1100000 або 1200000, 1300000 або навіть 1400000, або 1500000, або 1600000, або принаймні 1700000 дальтон - М7, що складає принаймні 1000000, 1100000 або 1200000, 1300000 або навіть принаймні 1400000 або 1500000, або 1600000, або 1700000 дальтон, 1800000, 1900000, або навіть принаймні 2000000, 2100000, 2200000, 2300000, 2400000, 2500000, 2600000, 2700000, 2800000, 2900000 або навіть 3000000, 3100000, 3200000, 3300000, 3400000, 3500000, 3600000, 3700000, 3800000, 3900000 або навіть 4000000 дальтон; і/або - полідисперсністю, що становить не більше 10,0, 9,0, 8,0, 7,0, 6,0, 5,0, 4,0, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,2, 3,1,3,0,2,9,2,8,2,7,2,6,2,5,2,4,2,3,2,2,2,1 або 2,0.

Мп означає середньочисельну молекулярну масу, Му/ являє собою средньовагову молекулярну масу, а М» являє собою 2-середню молекулярну масу. Полідисперсність являє собою відношення МуУ"/Мп.

Додатково або альтернативно, каучук може характеризуватися - Мп, що становить не більше 500000 дальтон, не більше 510000, 520000, 530000, 540000, 550000, 560000, 570000, 580000, 590000, 600000, 700000 або 800000, 900000 або навіть не більше 1000000, 1100000, 1200000, 1300000, 1400000, 1500000, 1600000, 1700000, 1800000,

БО 1900000 або не більше 2000000 дальтон; - Мму, що становить не більше 950000, 960000, 970000, 980000, 990000, 1000000, 1100000 або 1200000, 1300000 або навіть не більше 1400000, або 1500000, або 1600000, або 1700000, 1800000, 1900000, 2000000, або не більше 2500000 дальтон; - М7, що становить не більше 1000000, 1100000 або 1200000, 1300000 або навіть 1400000, або не більше 1500000, або 1600000, або 1700000 дальтон, 1800000, 1900000 або навіть не більше 2000000, 2100000, 2200000, 2300000, 2400000, 2500000, 2600000, 2700000, 2800000, 2900000 або навіть 3000000, 3100000, 3200000, 3300000, 3400000, 3500000, 3600000, 3700000, 3800000, 3900000 або навіть 4000000, 4100000, 4200000, 4300000, 4400000, 4500000, 4600000, 4700000, 4800000, 4900000, 5000000 дальтон; і/або

- полідисперсністю, що становить принаймні 10,0,9,0, 8,0, 7,0,6,0, 5,0, 4,0, 3,0, 2,7, 2,6, 2,5, 2,4,2,3,2,2,21, 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, 1,3, 1,2 або 1.1, або принаймні 1,0.

Мп може бути співвіднесена з колігативними властивостями полімеру, наприклад зниженням температури застигання. Му/ може бути співвіднесена з такими властивостями, як в'язкість розплаву. М: може бути співвіднесена з такими властивостями, як твердість. Полідисперсність характеризує форму розподілу: у міру зниження коефіцієнта розподілу міцність і твердість полімеру зазвичай зростають.

Подальше пояснення Мп, Мм/, М27, полідисперсності і те, як вони можуть бути виміряні, можна знайти, наприклад, у главі 17 ""ОГУМЕК МОГЕСШОГАК УУЕІСНТ МЕАЗОКЕМЕМТ",

Напабсок ої Роїутег Зупіпезів, СНагасієгігайоп, апа Ргосезвіпоу, Рігвї Едйоп. Едіей ру Епгідиє зЗаїдімаг-Спета апа Едиагао Мімаідо-Г іта. Є 2013 допп У/еєу 6 5опв5, Іпс. Риріїзнєейа 2013 Бу донп

МУйеу а опе, Іпс. Переважно, коли спосіб, описаний у прикладі, використовується для визначення якості каучуку і зазначених вище параметрів.

Також передбачений продукт, що містить каучук згідно із даним винаходом, причому переважним продуктом є шина, така як автомобільна шина. Таким чином, у даному винаході також передбачається автомобільна шина, що містить каучук згідно із даним винаходом.

У конкретному варіанті здійснення даним винаходом забезпечується спосіб одержання рослини виду Тагахасит, причому спосіб включає наступні етапи: а) схрещування рослин Тагахасит ойісіпаіе (ТО) з рослинами Тагахасит Кокзадпу? (ТК5) для забезпечення рослин покоління Е1; р) зворотне схрещування рослин покоління ЕТ з рослинами ТО для забезпечення рослин покоління Е2; с) інтеркрос рослин покоління Е2 для забезпечення рослин покоління 3; а) інтеркрос рослин покоління 3 для забезпечення рослин покоління 3"; е) зворотне схрещування рослин покоління (33" з рослинами ТК5 для забезпечення рослин покоління 4;

У) інтеркрос рослин покоління для забезпечення рослин покоління 4"; 9) зворотне схрещування рослин покоління (34" з рослинами ТК5 для забезпечення рослин покоління 5;

Зо МР) відбір рослин покоління 5 за відсутністю СРТ ТО для забезпечення відібраних рослин покоління 5; ї) необов'язково, інтеркрос відібраних рослин покоління (35 для забезпечення рослин покоління б-а і/або зворотне схрещування відібраних рослин покоління 55 з рослинами ТК5 для забезпечення рослин покоління (56-Б; )) відбір рослин покоління С6б-а і/або відбір рослин покоління (6-5 за присутністю СРТ2 ТК5,

СРТЗ ТК5, ЕТА ТК5, ЗКРР5Б (переважно 1-53 ТК5, КЕЕ ТКЗ5 і необов'язково ЗЕО ІЮ МО-11, описаної в прикладі, для забезпечення рослин покоління 36 першого відбору;

К) відбір не більше 4095 рослин покоління зб першого відбору за розміром рослини (наприклад, що визначається площею поверхні самого довгого листка, кількістю листків, загальною вагою рослини або висотою рослини над землею, або ваги коріння) для забезпечення рослин покоління 6 другого відбору;

І) відбір не більше 40 95 рослин роду Тагахасит покоління 6 другого відбору за розміром генома для забезпечення рослин покоління 6 третього відбору.

Вищезгаданий конкретний спосіб показаний на фіг. 1. Переважно, коли етапи а), Б), с), 4), є),

В, 9),Й),ї),)),юК і/або І) забезпечують принаймні 10, 20, 50, 100, 1000, 1500 або принаймні 2000 рослин. Процес селекції може, крім того, включати 1, 2, З і більше додаткових етапів зворотного схрещування з ТК5. Етап Б) може бути необов'язковим. Етап с) також може бути необов'язковим. До того ж, етап а) може бути необов'язковим. Кваліфікований фахівець може вибрати етапи, маючи на увазі, що метою способу є одержання рослини роду Тагахасит із зазначеними характеристиками. Аналогічно, етап е) може бути необов'язковим, і/або етап ї) може бути необов'язковим. У цьому відношенні етап 9) також може бути необов'язковим, у той час як альтернативно, або додатково етап й) може бути необов'язковим. Етап ї) також може бути необов'язковим і/або етап Ї) може бути необов'язковим. Нарешті, етап К) і/або етап І) можуть бути необов'язковими. У способах згідно із даним винаходом переважно ТК5 завжди використовується як донор пилку (запильника) на етапах схрещування.

На етапі ї) можуть забезпечуватися дві популяції рослин: (1) рослини покоління с6б-а і (2) рослини покоління 56-Б. Дві популяції можуть бути об'єднані або підтримуватися роздільно на подальших етапах способу згідно із даним винаходом. Альтернативно, забезпечуються або рослини покоління с6-а, і рослини покоління 6-0. бо Короткий опис креслень

Фіг. 1: Схема інтрогресії і відбору згідно із конкретним варіантом здійснення даного винаходу. Генотипи підкреслені. Верхній індекс вказує відсоток генів, що походять від ТКУ, і генів, що походять від ТО, за умови відсутності порушення сегрегації. У поколіннях 3, 4 їі 5 рослини зазнають зворотного схрещування з ТК5 і інтеркросу (гібридні групи). Інтеркрос збільшує рекомбінацію геномів ТКЗ5 і ТО, тоді як зворотне схрещування збільшує частку генома

ТК5. В 04 відбиралися тільки рослини без ТОСРТІ1. Тому в наступних поколінь також немає цього гена. У даному винаході інтрогресовані рослини можуть використовуватися як джерела насіння, а не як запильники, або інтрогресовні рослини можуть використовуватися як запильники, а не як джерела насіння.

Приклад 1

У наступній таблиці представлені характеристики двох рослин роду Тагахасит, отриманих шляхом застосування способу даного винаходу.

Таблиця дити НЯ са са проточної цитометрії, (мегабаз)

ВТА 11111111 ЇН1111111111111в1 (А-гомозиготне за похідним від ТК5 гену, В-гомозиготне за похідним від ТО гену,

Н-гетерозиготне)

Матеріал і методи

Визначення вмісту каучуку (СоїІйп5-51їма у, еї аІ., 2012, Рпуїоспетівігу, 79: 46-56)

Для екстракції натурального каучуку із тканини коріння із використанням гексану з 2,5 95

ЕН використовували пристрій для прискореної екстракції розчинником Оіопех (АБЕ) 200 моделі (Зиппумаїє, СА). Тканину коріння зважували. Ліофілізовану і подрібнену тканину коріння (приблизно 0,1 г) із зібраних рослин і контрольних рослин екстрагували три рази. Кожний зразок піддавали наступному способу: заповнення розчинником (н-гексаном з 2,5 95 ЕН) гнізда АБЕ (1 хв), нагрівання та підвищення тиску в гнізді до 8020 і 1500 фунтів на квадратний дюйм (5 хвилин), З цикли, кожний складається з 5-хвилинної статичної екстракції із промиванням струменем свіжого розчинника і кінцеву продувку М». Кінцеві отримані з використанням гексану екстракти сушили під М?» і зберігали при 2020. Вміст каучуку визначали гравіметрично.

Якість каучуку (СоПп5-51іЇма У, еї аї., 2012, Рпуїоспетівігу, 79: 46-56)

Для аналізу з використанням НРІС отримані з використанням гексану екстракти

Зо ресуспендували в 2 мл ТНЕ протягом ночі при кімнатній температурі. Екстракти з коріння потім аналізували за допомогою НРІ С-СРС. Пристрій, використовуваний для цих аналізів, складався з НР 1100 НР'ІС (Адііепі Тесппоїіодіє5, Раю АМо, СА), одної захисної колонки Рпеподеї! 50х7,80 мм і двох вузьких і довгих колонок Рпеподеї! 10 І (300х7,80 мм) (Рпепотепех, Тоітапсе, СА), з'єднаних послідовно, і випарного детектора за світлорозсіюванням 5едех моделі 75 (ЗЕОЕКЕ,

Франція). Зразки фракціонували з використанням ізократичного елюювання в толуолі при 7096 зі швидкістю потоку 1 мл/хв. Хроматограми знімали і аналізували з використанням програмного забезпечення Спетбіайоп для ІС Кему. А. 10.02 (1757) (Адіїепі Технології). Молекулярну масу полімеру каучуку розраховували за даними НРІ С-СРС, використовуючи модуль Спетвіайоп для аналізу даних Адііепі СРС (версію В.01.01). Калібрувальні криві для аналізів молекулярної маси були отримані виходячи з полістирольних стандартів (РоїЇутег І арогафогіе5, ОК) з Мр (піковими молекулярними масами) у діапазоні від 1480 до 3114000 дальтон. Каучук аналізували кількісно шляхом розрахунків маси каучуку залежно від площі піка з використанням стандартної кривої, отриманої виходячи із серійних розведень відомих кількостей синтетичного поліїзопрену (Кгаоп Роїутеге ІК-401, Ноивіоп, ТХ). Для кожного експерименту аналізували екстракти з коріння, стандарти молекулярної маси і стандарти для кількісного аналізу маси в тому самому циклі для зменшення варіабельності.

Протокол проточної цитометрії (Таз апа мап Обі)кК 1999, Негеайу 83: 707-714)

Розмір генома рослин визначали шляхом виміру кількості ядерної ДНК за допомогою УФ проточного цитометра (РАКТЕС Ріоіїду Апаїулег РАКТЕС СтрН, Мипегег, Німеччина), використовуючи модифікований протокол Шігіспй 4 Шігісп (1991 Ргоїоріазта 165, 212-215).

Свіжий листок (1 см) гібридної рослини і чистої ТК5 рослини (яка, як прийнято вважати, має розмір генома 1420 мегабаз/1С) був подрібнений разом гострим лезом бритви в 1 мл буферу для екстракції з ядер (0,1 М лимонної кислоти, що містить 0,5 95 Твін 20). Після фільтрації через фільтр 50 мкм (СейЙтгіс5, РАКТЕС) додавали 1 мл розчину флуоресцентного барвника САРІ (0,4

М динатрійфосфату, 0,2 М Масі ї 5 мг ли" ОАРІ (46б-діамідино-2-феніліндолу)), і зразки вимірювали безпосередньо.

Аналіз КА5Р

Присутність/відсутність СРТ ТО, СРТ2 ТК5, СРТЗ ТК5, КЕТА ТК5, 5КРРБ5 ТК5 і КЕЕ тТК5 визначали з використанням аналізу КА5БР з наступними послідовностями-маркерами (з виділенням ЗМР. (однонуклеотидного поліморфізму) жирним шрифтом). Аналіз КА5Р відомий кваліфікованому фахівцеві і, наприклад, описаний 5етадп і ін. (2013 МоїІесціаг Вгееаіпо, 33 (1): 1-14).

Я. Маркер для СРТ ТО (СРТІ 2 507Т, 5ЕБО ІЮ МО1) сласоссатАалдасАатастастадаАдааССАтТасААассСАССИасСтАААААТТСААССАСаИатА тотоСстСатАТата т ТасСТтТАСАСТТСТТОССАТОААДАТ

Я2. Маркер для СРТ2 ТК5(СРТ З 192Т, ЗЕО ІЮ МО:2)

ССМАТСССАСААСАСАТСИССТТСАТОСТОСАТаСАААССаАдАаса пт оастТАасАААТасАА

ССТСАСАЧдДАДааСсАСМаасССАСААААССвахутостАас (МУ означає А або Т, У означає С або Т, і М означає А або С)

Ж3. Маркер для СРТ2 ТК ісСРТЗ ТК5(СРТІ 2 507С, 5ЕО ІО МО:3) саласоссатАддасАатастастадаАддааССАТасАдассАССасСтТАААААСТСААССАСИТт зЗ30 АТСТОСТСатАТатТатТтасттТАСАСТТСТТОССАТОААдАТ (якщо відсутність СРТ2 ТК5 підтверджена маркером 2, цей маркер визначає специфічно

СРТЗ ТК5; або, якщо відсутність СРТЗ ТК5 підтверджена маркером 4, цей маркер визначає специфічно ТК5 СРТ2)

ЯНА. Маркер для СРТ ТО і СРТЗ ТК5(СРТ З 192С, 5ЕО ІЮ МО:4)

ССМАТСССАСААСАСАТСЯССТТСАТОСТоАТаайАААСсСадАаса т СасСсАааАААТасасчА

АССТСАСАпАаАвчаИасисмаассСАСААААССасУттостАас (якщо відсутність СРТ ТО підтверджена маркером 1, цей маркер визначає специфічно СРТЗ

ТК5, або, якщо відсутність СРТЗ ТК5 підтверджена маркером 3, цей маркер визначає специфічно СРТ ТО)

Я5. Маркер для КТА ТК5 (КТА-1А, 5ЕО ІО МО:5) ст"таттСаУвАвАТСТТАСИаТасААТТаАААВСТАТСТТАТААТАААТИОАААТТатаААААСА

ТАТОААСАТСТаААТТТАААСАСпСАаТаАААТАТСТТО

Я. Маркер для КТА ТО (КЕТА-16, ЗЕО ІЮ МО:6) ст"таттСаУвАвАТСТТАСИаТтасцсяААТТаАААВСТАТСТТАТААТАААТаСААТТатаААААСА

ТАТОААСАТСТаААТТТАААСАСпАаТаАААТАТСТТО

Ж. Маркер для ЗКРР5 ТК5 (ЗКРР5Б-20, кластер ЗЕРР, 5ЕО ІО МО:7)

ТтТатТАААТАДаИТтТАТОСАаСсаАТтТаТттасАТСТТАТаОАТМТТТТСсАТОАДаСаАСсТаИТатасАА

АТТТСАТОССААТААТСТАТаТтаААСсастоТТАСТТат яв. Маркер для КЕЕ ТК5 (КЕРЕ2С, 5ЕО І МО:8)

АТТАТИаСАСИаСтТААаСаатТоаАпААТасАТСТАСААААТСТАААТТИатТАпАССТТ ТТОаААСАдА

АТтттСсаСааТАТАТТтТасаСАТТАаТСАСвАсаУатТатт 9. Маркер для ЗКЕРР5 ТО (ЗЕРР5Б-2Т, кластер ЗЕРР, ЗЕО ІЮ МО:9) тТатТАААТАДаТтТАТаАааСаАТттаТтттасАТСТТАТОАТМІТТТТСАТаАТтТОоСАСТИАТатасАА

АТТТСАТОССААТААТСТАТаТтаААСсастоТТАСТТат 10. Маркер для КЕЕ ТО (КЕГЕ2б, 5ЕО ІЮО МО:10)

АТТАТИаСАСОИаСтТААаааТтоаАпААТасАТСТАСААААТСТАААТТаТаттТАаАасСтТТТТаААсСААА

АТтттСсаСааТАТАТТтТасаСАТТАаТСАСвАсаУатТатт 11. Додатковий маркер для ТК5 (5ЕО ІЮ МО:11)

СаАСТтТАТаСТОССОССТаАлСссатеососаСацвАаААавасцатааАааасСАСАастААаААСс 60 АСаААаАСТТАТСТ ТТаСсТатататааСсТАТАСКТСВТО

12. Додатковий маркер для ТО (ЗЕО ІОЮ МО:12)

СоАСТТТАТаСТОССОССТаАлСссаТесссаСацвАадАавасцатасАавассСАСсаастААаААС

АСаААаАСТТАТОТТ ТТОСсТОатТататааСаТтАТАСКТСВТО

Присутність маркера в зразку рослини вказує на присутність відповідного гена в рослині, з якої отриманий зразок. Крім того, аналіз КАБР дозволяє визначити, чи є рослина гетерозиготною або гомозиготною за відповідним геном, на основі виявленого сигналу, як добре відомо кваліфікованому фахівцеві. пПЕВЕЛІЮ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ «110» Жеудейе 8. Ух «1205 КАУЧУКОНОСНА РОСЛИНА РОДУ ТАВАХАСОМ «І30з рбовогорсх «150» Мб015396. : «їІ5Ііх 2015509-9 . «1605 3 | ' «їз басенств» уеквіов 4.5 «вій «вії» МІ «віт ДНК кій» тТахавасот «йо» 1 | а чаусссогає зчассЧетує бовувавуєс абдозазсса сеуствавааа Кеісвассаєо 80 какстссвса габусаоскЯє Безсасессе Бесссабдава Є 10 «ві «вріж 195 «Кі» ДНК кеії4з Такахасот «апа 2 ссеарсосау ваасасассус сткбабсоссо дасдозавсс дзацуєссую бадогавсоу 50 вассєсасай ааоппскстау ссасазааос дебусксесач є 101 каз З «йи1їх ї0ї «вій» ДНК «еіїх Татахасий «р» 3 чадесейсва заазсастос пуадееоосс збЗвавосса ссоссавава сссаассасо 50 басексстсо сабубуєєае ббасассксв всосатцава 1 «ій 4 «зії» 101 «215 ДЯК «із» Тахахаєсицй «20025 4 ссеаксссад аасасаєсус стесагреєо дабсопааасс чаадоєссос сасузаакач ко аасстсасач заосксвод ссасавайсс зоубссстая є то «гій» 5 «їх 91 «212 ДНК «213» Тагахаєсит «Фо» 5 ссккЧЕксЧу чївдавсстає абдравскоа затессассеє зсзасаваку зааккавава бо аасатаєсуаа чассбуваєс базасачачк чавебабссЕ 101 «81 6 «21ї» 101 «212 ДНК «213» Такакаєою «об» 5 стебосісЧу уачаїсьсас паса вакстеассеє асвзатавасєз дваскукуаа «0 васасаєсуаа забсодавеї Баласачачб Завабасссь о 10ї ких 7 «вік М «їз ДНК «2135 Тахахасиот «ж 7 «уїсалзасва чсхассвосу айтустекода Бісткавуат вессбсаєза чсуастовує о

Зсазатхссв сесавтавес сатоїцазев сесттвевко 5 ї83 «війж 8 хар ЦИ «212» ДНЕ «213» Тахахасим «400» В аїсатосвоч ссааоуєсяя чавкодатсо ведавасссяа еасеуєсаца ссксксоави й аааастсьсо сеапаєзкск досастадіс зсоадучеаї Є ав «2145 8 «211 181. егї12» ДНК жаху» тахакасав «4005 5 тЯгтаватав зссассадвч ассубкооза Ебсставуве шекексабув ссчастоавах во псагасттса бссватавто бабосдвасу сксебаську ї 01

«в10х 10

«ії» М

«212» НК хеі3»: Такахасив

«або». 10 :

зстакчезуу ссазудесов Чавсотассс всазаатств васкуєстада дссствувад ев зазаїкессу суцтасексє содсеставис асзадуасах Х 18

«ай» і :

«ії» І

«рих дик

«8132 тТатакасив

«абз 1 сасжестасу стссоЧчеосво Фосдосодея дасвадосоув сосадвссає зустаадває «о асодазцластс зсскстсоце зтатосадса хасаскесхв с т

«2103 12

«2112 70.

«гї12з ДНК.

«ії» такакасумв

«400» 13 .

сзаскссасо ссссоазідау чагоЧсодсо зЗазаацасув созадассає зоаставдває ва васазазчаєтт зкссЕссобЕ осакобдося сатаскескь с 151

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб відбору гібридних рослин роду Тагахасит, причому спосіб включає наступні етапи: а) забезпечення гібридних рослин роду Тагахасит з розміром геному від 1000 до 1415 мегабаз; Б) відбір гібридних рослин роду Тагахасит за відсутності гена циспренілтрансферази (СРТ ТО); с) відбір гібридних рослин роду Тагахасит за присутності принаймні трьох генів, що вибирають з групи, яка складається з циспренілтрансферази-2 7. Кокзаднул (СРТ2 ТК), циспренілтрансферази-3 7. Кокзаднпу7 (СРТЗ ТК5), активатора каучукової трансферази 7. Ккокзадну: (ВТА ТК), білка малих каучукових частинок Р5 (ЗКРР5 ТК) і фактора подовження каучуку 7. Кокзадну; (ВЕЕ ТК); а) відбір не більше 40 95 гібридних рослин роду Тагахасит, що мають найбільший розмір рослини; е) відбір не більше 40 95 гібридних рослин роду Тагахасит, що мають найбільший розмір геному, при цьому гібридні рослини роду Тагахасит являють собою гібрид Тагахасит онНісіпаІє та Тагахасит Кокзадну?.

2. Спосіб за п. 1, у якому етап а) не включає схрещування і наступний відбір рослин.

3. Спосіб за п. 1 або 2, у якому на етапі а) забезпечуються рослини роду Тагахасит, що мають розмір геному від 1000 до 1415 мегабаз, і/або такі, що містять 60-99 95 генів, що походять від Тагахасит Кокзадну (ТКЗ), і 1-40 95 генів, що походять від Тагахасит ойісіпа!е (ТО).

4. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, у якому на етапі с) здійснюється відбір за присутності принаймні чотирьох генів з СРТ2 ТК5, СРТЗ ТК5, КТА ТК5, ЗКРР5 ТКЗ5 і КЕЕ ТКЗ5.

5. Спосіб за п. 4, у якому на етапі с) здійснюється відбір за присутності принаймні п'яти генів з СРТ2 ТК5, СРТЗ ТК5, ЕТА ТК5, ЗКРРБ5 ТКЗ5 і КЕЕ ТКЗ5.

б. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, у якому на етапі с) здійснюється відбір за гомозиготної присутності СРТ2 ТК5, СРТЗ ТК5, КЕТА ТК5, ЗКРРБ5 ТКЗ і/або КЕЕ ТК5.

7. Машиночитаний носій, що містить команди, які при виконані комп'ютером забезпечують Зо комп'ютером виконання способу за будь-яким з попередніх пунктів.

8. Гібридна рослина роду Тагахасит, одержувана способом за будь-яким з пп. 1-6.

9. Рослина роду Тагахасит за п. 8, яка має вміст каучуку, що становить принаймні 0,5 г сухої ваги, що визначається за допомогою прискореної екстракції розчинником.

10. Рослина роду 7агахасит за п. 9, яка має вміст каучуку, що становить принаймні 0,75, 1,0, 1,25, 1,50, 1,75 або принаймні 2,00 г сухої ваги, що визначається за допомогою прискореної екстракції розчинником.

11. Рослина роду Тагахасит за будь-яким з пп. 8-10, яка має: - суху вагу коріння, що становить принаймні 5 г; - вміст каучуку в корінні, що становить принаймні З ваг. 95 сухої ваги відносно загальної сухої ваги коріння, що визначається за допомогою прискореної екстракції розчинником.

12. Рослина роду Тагахасит за п. 11, яка має: - суху вагу коріння, що становить принаймні 6, 7, 8, 9 або 10 г; - вміст каучуку в корінні, що становить принаймні 3,5, 4,0, 4,5 або 5,0 ваг. 95 сухої ваги відносно загальної сухої ваги коріння, що визначається за допомогою прискореної екстракції розчинником.

13. Рослина роду Тагахасит за будь-яким з пп. 8-12, що містить СРТ2 ТК5, СРТЗ ТК5, ЕТА ТК5, БЕРР5 ТКЗ5 і/або КЕЕ ТК.

14. Рослина роду Тагахасит за п. 13, причому рослина не містить СРТ ТО.

15. Рослина роду Тагахасит за будь-яким з пп. 8-14, що має розмір геному, що становить принаймні 1000 мегабаз.

16. Рослина роду Тагахасит за п. 15, що має розмір геному, що становить принаймні 1100 мегабаз.

17. Рослина роду Тагахасит за будь-яким з пп. 8-16, причому рослина є гомозиготною за СРТ2 ТК5, СРТЗ ТК5, ЕТА ТК5, ЗКРРБ5 ТКЗ5 і/або КЕР ТК5.

18. Рослина роду Тагахасит за будь-яким з пп. 8-17, причому рослина є рослиною, яка не стрілкується.

19. Застосування рослини роду Тагахасит за будь-яким з пп. 8-18 для продукування каучуку.

20. Спосіб одержання каучуку, що включає етап екстракції каучуку з рослини за будь-яким з пп. 8-18.

21. Спосіб за п. 20, в якому каучук характеризується наступним: - Мп, що складає принаймні 500000 г/моль; - Муу, що складає принаймні 1000000 г/моль; - М7, що складає принаймні 2500000 г/моль; і - полідисперсністю від 1,0 до 5,0. Р покоління тою х ткрию и ТЯ х точку» Е? ток ХО. са птОоКе Х тоетКес|Х ТКуме в4 (помткее х тобткбе) Х тку» льки негативні по СРТІ 5 током Х точ коє х ткумю Об; Відбір ток тоткею

Фіг. 1