UA127428U - Спосіб отримання культури експлантів аорти лабораторних тварин - Google Patents

Abstract

Спосіб отримання культури експлантів аорти лабораторних тварин включає культивування in vitro методом експлантів фрагментів тканини аорти. Попередньо з аорти за допомогою мікроінструментів видаляють адвентицію.

Description

Корисна модель належить до експериментальної медицини, зокрема до галузі клітинних та тканинних технологій, і може використовуватись для отримання культури експлантів аорти лабораторних тварин з метою дослідження регенеративного потенціалу стовбурових клітин та подальшої розробки нових методів лікування захворювань серцево-судинної системи у людини.

Застосування тканино-специфічних прогеніторів з магістральних судин вважають перспективним підходом для прискорення регенерації ішемічних пошкоджень тканин, що супроводжуються ендотеліаальною дисфункцією. Отримання за короткий проміжок часу чистої популяції клітин з необхідними морфологічними та функціональними характеристиками для досягнення максимального терапевтичного ефекту при патології серцево-судинної системи є актуальним завданням сучасної біотехнології та регенеративної медицини.

За останні роки в Україні та світі активно впроваджуються нові методи культивування тканино-специфічних стовбурових та прогеніторних клітин з різних джерел, в тому числі і з магістральних судин. Для отримання культур клітин з стінки судин в експерименті та клініці застосовують кілька підходів.

Зокрема, відомий спосіб отримання культури гладком'язових клітин з аорти (Пат. 2529947

Російська Федерація МПК СтТ2М 5/071, С12М 55/02, С12М 5/077, опубл. 10.10.2014. пЕрулимлмі ліре.гу|. Метод полягає в тому, що вирізають фрагмент судини, подрібнюють його на шматочки до розмірів не більше 2 мм, інкубують в 0,1 95 розчині колагенази протягом 30 хв. та культивують в культуральному флаконі з попередньо нанесеними на дно флакона подряпинами.

Однак, цей спосіб стосується отримання культур, насамперед, гладком'язових клітин і лише у людини, оскільки передбачає виділення висхідного фрагмента грудної аорти під час операції аортокоронарного шунтування.

Відомий також метод культивування іп міо ендотеліальних клітин з аорти щурів (Пат. 104673744А СМ, МПК Ст2М 5/071; заявник та власник патенту Мапа дипії (СМ); опубл. 03.06.2015 пОрз/Лмопаміде. езрасепеї.соті|. За даним методом на етапі інкубації в колагеназі вирізану аорту попередньо наповнюють поживним середовищем, що містить гепарин.

Стерильною голкою та ниткою зшивають кінці судини та інкубують у СО?» інкубаторі.

Однак, використання даного підходу потребує освоєння методики накладання судинного

Зо шва та забезпечення його герметичності і стерильності на час інкубації та при щоденній заміні середовища. Також, дана методика не може бути використана у лабораторних мишей через значно менші розміри аорти, в порівнянні з відповідними судинами у щура.

З літературних джерел також відомий метод виділення ендотеліальних клітин з аорти миші

ІА бітріє Меїноадй ої Ізоїайіпд Моизе Аопіс Епдоїпеїїа! СеїІв / М. Кобрауавні, К. Іпошйе, Е. УМагабі, єї а. // доштаї ої ашегозсіеговів апа (пготрброзвів. - 2005. - Мої. 12, Ме 3. - Р. 138-42). За матеріалами публікації, даний метод включає заповнення аорти через канюлю розчином колагенази типу ЇЇ на 45 хв. з подальшим вимиванням виділених клітин поживним середовищем. Отриману суспензію відмивають та культивують в середовищі для ендотеліальних клітин, а аорту нарізають на фрагменти зі стороною 2-3 мм та культивують методом експлантів для виділення гладком'язових клітин.

Проте, даний метод потребує додаткових етапів зав'язування дистального кінця аорти, промивання її поживним середовищем та використання спеціального покриття флаконів для культивування, що збільшує часові та фінансові затрати на його виконання.

За прототип авторами взятий спосіб отримання та культивування ендотеліальних клітин з грудної аорти миші (Пат. 106591217А СМ, МПК С12М 5/071; заявник та власник патенту Опім

Зіспцап (СМ); опубл. 26.04.2017. пИр/Амопаміде.езрасепеї.соті|, який передбачає попереднє нарізання аорти на кільця та культивування їх методом експлантів на матриксі Майїде! в спеціальному середовищі для ендотеліальних клітин.

Проте, даний метод не запобігає контамінації культури фібробластами із зовнішньої оболонки аорти та потребує значних фінансових затрат на ростові фактори та покриття для культурального посуду.

В основу даної корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб отримання культури експлантів аорти лабораторних тварин, який би був надійний і ефективний та дозволив отримувати з внутрішніх оболонок аорти чисту культуру гладком'язових або ендотеліальних клітин, яка не контамінована стромальними клітинами із зовнішньої сполучнотканинної оболонки, що додатково зменшить час та витрати на культивування необхідної популяції клітин.

Поставлена задача вирішується тим, що в способі, який включає культивування іп мйго методом експлантів фрагментів тканини аорти, згідно з даною корисною моделлю, з аорти попередньо за допомогою мікроінструментів видаляють адвентицію.

Технічний результат, який досягається при застосуванні даного способу, полягає в тому, що завдяки попередньому видаленню адвентиції в культурі іп міго з експлантів аорти мігрують клітини лише з внутрішніх її оболонок. Відсутність адвентиції та парааортальної жирової тканини в експлантах фрагментів аорти дозволяє запобігти контамінації культури фібробластами та мультипотентними стромальними клітинами, які швидко проліферують та зменшують ефективність міграції цільової популяції клітин з внутрішніх оболонок. При даному способі зменшуються час та витрати поживних середовищ і матеріалів на культивування необхідної популяції клітин. Даний спосіб не потребує значних затрат часу та використання дорогого високотехнологічного обладнання.

Спосіб здійснюють наступним чином.

Тварини підлягають евтаназії методом цервікальної дислокації після інтраперитонеального введення 2,5 95 розчину авертину в дозі 400 мг/кг. В стерильних умовах відпрепаровують аорти та переносять їх в чашки Петрі з середовищем АРМІ-1640, яке містить 1 95 суміші антибіотиків

Репеігтер. Під стереомікроскопом промивають порожнину аорти стерильним середовищем

АРМІ-1640, видаляють фрагменти парааортальної жирової тканини та препарують зовнішню оболонку аорти (Шпіса ехієгта, адвентиція) від середньої (Шпіса тедіа) та внутрішньої (Шпіса іпіїта). Виділені внутрішні оболонки промивають в середовищі АРМІ-1640, подрібнюють на фрагменти розмірами біля 1 мм: та інкубують в 0,1 95 розчині колагенази І типу протягом 40 хвилин при температурі 437 "С, після чого промивають середовищем АРМІ-1640 з 1 95 суміші антибіотиків Репоігер. Подрібнені елементи внутрішньої оболонки аорти переносять в чашки

Петрі діаметром 35 мм з повним живильним середовищем МЕМ АОтеєаіа з додаванням 10 95 фетальної сироватки корів.

Культивування усіх зразків клітин проводять за стандартних умов в СОг-інкубаторі при температурі 37 "С та зволоженій атмосфері з концентрацією СО» 595. Першу заміну середовища проводять через 10 діб після початку культивування. Подальшу заміну поживного середовища проводять через кожні три доби. Субкультивування проводять при досягненні 80 95 конфлуентності моношару за допомогою 0,25 95 розчину трипсину.

Приклад.

Джерелом клітин-попередників з магістральних судин була аорта самців мишей лінії ЕВМ

Зо віком 5 міс. Порівнювали культури клітин, отриманих з адвентиції та внутрішніх оболонок аорти, виділених за запропонованим способом.

Прикріплені експланти з адвентиції зберігали адгезію до пластику протягом усього часу культивування до першого пасажу. Міграція клітин з експлантів адвентиції аорти мишей розпочиналась з 7-10 доби культивування. На ранніх пасажах культура була гетерогенною за морфологічними характеристиками: клітини мали переважно видовжену веретеноподібну форму з чіткою візуалізацією округлого або овального ядра та ядерець. Деякі з клітин набували полігональної форми та утворювали довгі відростки, які контактували з сусідніми клітинами, утворюючи кластери конфлюентного моношару. У частини клітин було виявлено вакуолізацію цитоплазми, за короткий час вони набували округлої форми та відкріплювались від поверхні культурального посуду, що свідчить про їх апоптоз.

Культура клітин з внутрішніх оболонок аорти мишей за морфологічними характеристиками була представлена однорідною популяцією полігональних клітин, які щільно контактували між собою та утворювали характерні острівці моношару по типу "бруківки". В динаміці культивування острівці зливались між собою, утворюючи конфлюентний моношар. Цитоплазма клітин при цьому була світлою, гомогенною, без ознак вакуолізації. Ядра та ядерця зберігали правильну округлу форму та розміщувались по центру клітин. На ранніх етапах культивування були присутні поодинокі гігантські розпластані клітини, навколо них концентрично розміщувались клітини веретеноподібної форми, які при подальшому пасажуванні не виявлялись.

В результаті з експлантів аорти мишей, з якої було видалено адвентицію, отримано однорідну культуру клітин, яка за морфологічними характеристиками подібна до ендотеліальних, без збереження стромальних елементів.

Таким чином, даний спосіб доступний, не потребує високовартісних реактивів та обладнання, забезпечує отримання чистої культури клітин, не контамінованої фібробластами та стромальними клітинами, і може використовуватись в експериментальній медицині.

Claims (1)

1. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ

   Спосіб отримання культури експлантів аорти лабораторних тварин, який включає культивування іп міго методом експлантів фрагментів тканини аорти, який відрізняється тим,

   що попередньо з аорти за допомогою мікроінструментів видаляють адвентицію.