UA126108C2 - Спосіб синтезу полінуклеотиду та динуклеотидна тіофосфорамідатна сполука - Google Patents

Спосіб синтезу полінуклеотиду та динуклеотидна тіофосфорамідатна сполука Download PDF

Info

Publication number
UA126108C2
UA126108C2 UAA201610381A UAA201610381A UA126108C2 UA 126108 C2 UA126108 C2 UA 126108C2 UA A201610381 A UAA201610381 A UA A201610381A UA A201610381 A UAA201610381 A UA A201610381A UA 126108 C2 UA126108 C2 UA 126108C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
protected
substituted
bond
group
differs
Prior art date
Application number
UAA201610381A
Other languages
English (en)
Inventor
Премчандран Х. Рамія
Премчандран Х. Рамия
Original Assignee
Джерон Корпорейшн
Джерон Корпорэйшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Джерон Корпорейшн, Джерон Корпорэйшн filed Critical Джерон Корпорейшн
Publication of UA126108C2 publication Critical patent/UA126108C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/314—Phosphoramidates
    • C12N2310/3145—Phosphoramidates with the nitrogen in 3' or 5'-position
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Винахід стосується способу синтезу полінуклеотиду, що має принаймні дві нуклеозидні субодиниці, з'єднані N3'(P5' оксофосфорамідатним або N3'(P5' тіофосфорамідатним міжсубодиничним зв'язком, який включає стадію зняття захисту із захищеної 3'-аміногрупи кінцевого нуклеозиду, приєднаного до твердофазної основи, причому вказане зняття захисту приводить до утворення вільної 3'-аміногрупи; стадію приведення в контакт вільної 3'-аміногрупи з димером 3'-захищеного амінодинуклеотид-фосфорамідат-5'-фосфорамідиту в присутності нуклеофільного каталізатора з утворенням міжнуклеозидного N3'(P5' фосфорамідитного зв’язку і стадію окиснення вказаного зв'язку для одержання N3'(P5' оксофосфорамідатного або N3'(P5' тіофосфорамідатного міжсубодиничного зв’язку. Винахід також стосується динуклеотидної тіофосфорамідатної сполуки або її солі.

Description

(57) Реферат:
Винахід стосується способу синтезу полінуклеотиду, що має принаймні дві нуклеозидні субодиниці, з'єднані М3-»РБ5 оксофосфорамідатним або М3-»РБ5 тіофосфорамідатним міжсубодиничним зв'язком, який включає стадію зняття захисту із захищеної 3'-аміногрупи кінцевого нуклеозиду, приєднаного до твердофазної основи, причому вказане зняття захисту приводить до утворення вільної 3'-аміногрупи; стадію приведення в контакт вільної 3'- аміногрупи з димером 3'-захищеного амінодинуклеотид-фосфорамідат-5'і-фосфорамідиту в присутності нуклеофільного каталізатора з утворенням міжнуклеозидного /М3'-»РБ' фосфорамідитного зв'язку і стадію окиснення вказаного зв'язку для одержання М3'-»Р5 оксофосфорамідатного або М3'-»Р5' тіофосфорамідатного міжсубодиничного зв'язку. Винахід також стосується динуклеотидної тіофосфорамідатної сполуки або її солі.
ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ
ЇО0ОО1| Згідно із 35 Ш.5.С. 5 119(є6), ця заявка заявляє пріоритет за датами подання попередньої заявки на патент США із серійним номером 61/987396, поданої 1 травня 2014 року, і попередньої заявки на патент США із серійним номером 61/151909, поданої 23 квітня 2015 року (номер справи патентного повіреного 185/002Х), опис яких включено в цей документ за допомогою посилання.
ВВЕДЕННЯ
00021 Хімія полімерів нуклеїнових кислот відіграє важливу роль у багатьох технологіях, що розвиваються, в галузі фармацевтики, діагностики й аналітики й, більш конкретно, у підгалузях антисмислових і антигенних терапевтичних засобів, комбінаторної хімії, посилення сигналів на основі розгалуженої ДНК і діагностики й аналізів на основі матриці ДНК. Частина вказаної хімії полімерів спрямована на поліпшення міцності зв'язування, специфічності й стійкості до дії нуклеаз природних полімерів нуклеїнових кислот, таких як ДНК. Пептидні нуклеїнові кислоти (РМА), тіофосфатні, метилфосфонатні й фосфорамідатні міжнуклеозидні зв'язки представляють собою приклади деяких хімічних особливостей полімерів, які використовують у відношенні олігонуклеотидів для одержання однієї або більше бажаних властивостей, таких як стійкість до дії нуклеаз, клітинне поглинання й розчинність.
ІО0ОЗІ Олігонуклеотидні М3'-РБ" фосфорамідати можуть утворювати стабільні дуплекси з комплементарними ДНК і РНК ланцюгами, а також стабільні триплекси із ДНК дуплексами, і є стійкими до дії нуклеаз. Олігонуклеотидні М3'-Р5' тіофосфорамідати знаходять застосування як ефективні антисмислові агенти іп мійго та іп мімо. Наприклад, сполуки, що містять олігонуклеотиди, які інгібують активність теломерази, можуть бути використані для лікування розладів, опосередкованих теломеразою, таких як рак, оскільки ракові клітини проявляють активність теломерази, а нормальні соматичні клітини людини не мають активність теломерази на біологічно значимому рівні. Таким чином, важливі способи одержання й виділення вказаних олігонуклеотидів.
СУТЬ ВИНАХОДУ
Ї0004| У цьому описі представлений твердофазний спосіб одержання олігонуклеотидів за допомогою послідовних циклів зв'язування, що включають принаймні одне зв'язування
Зо динуклеотидної димерної субодиниці з вільною 3'-кінцевою групою (наприклад, 3'-гідроксильною або 3-аміногрупою) ланцюга, що росте. Розглянуті способи включають одержання олігонуклеотидів, у яких принаймні дві нуклеозидні субодиниці з'єднані М3--Р' фосфорамідатним міжсубодиничним зв'язком. Вказаний спосіб може включати стадії (а) зняття захисту із захищеної 3'-аміногрупи кінцевого нуклеозиду, приєднаного до твердофазної основи, вказане зняття захисту приводить до утворення вільної 3'-аміногрупи; (Б) приведення в контакт вільної 3З3'-аміногрупи з димером 3-захищеного амінодинуклеотид-5-фосфорамідиту у присутності нуклеофільного каталізатора з одержанням міжнуклеозидного М3--РБ' фосфорамідитного зв'язку; і (с) окиснення вказаного зв'язку. У деяких випадках окиснення зв'язку включає сульфування з одержанням міжнуклеозидного М3'-РБ' тіофосфорамідатного зв'язку. 0005) Аспекти цього опису включають олігонуклеотидні композиції, отримані розглянутими способами, які містять знижену кількість одного або більше (М-х) олігонуклеотидних продуктів. У деяких випадках знижена кількість становить менше (1,9 х М) частин на 100 частин за масою одного або більше (М-х) продуктів відносно М продукту. Олігонуклеотиди, отримані відповідно до розглянутих способів, включають олігонуклеотид, що має послідовність М-нуклеозидних субодиниць, комплементарну РНК компоненту людської теломерази, де принаймні дві нуклеозидні субодиниці з'єднані М3--РБ5 тіофосфорамідатним міжсубодиничним зв'язком.
Представлені також фармацевтичні композиції, що містять розглянуті олігонуклеотидні композиції.
КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ
ІО0ОбЇ На фіг. 1А і 18 представлена ВЕРХ хроматограма (А) і Р ЯМР спектри (В) для ТА димерного тіофосфорамідату (сполука 7е, схема 1). 0007 На фіг. 2А і 28 представлена ВЕРХ хроматограма (А) і "Р ЯМР спектри (В) для АА димерного тіофосфорамідату (сполука 7а, схема 1).
ІО0О8І На фіг. ЗА і ЗВ представлена ВЕРХ хроматограма (А) і У'Р ЯМР спектри (В) для СО димерного тіофосфорамідату (сполука 7с, схема 1).
ІО009І На фіг. 4А і 48 представлена ВЕРХ хроматограма (А) і "Р ЯМР спектри (В) для СТ димерного тіофосфорамідату (сполука 74, схема 1). 00101 На фіг. 5А і 58 представлена ВЕРХ хроматограма (А) і У'Р ЯМР спектри (В) для СА бо димерного тіофосфорамідату (сполука 7р, схема 1).
0011) На фіг. 6бА і 6В представлені РХМС сліди димерних амідатів ТА, АА, СА, СТ і 60.
І0012|На фіг. 7 представлена ВЕРХ хроматограма продукту синтезу іметельстату в масштабі 140 мкмоль із застосуванням стратегії зв'язування мономерів.
І0013|На фіг. 8 представлена ВЕРХ хроматограма продукту синтезу іметельстату в масштабі 140 мкмоль із застосуванням стратегії зв'язування димерного блоку.
ВИЗНАЧЕННЯ
0014) Наступні терміни мають наступні значення, якщо не вказане інше. Будь-які невизначені терміни мають значення, прийняте в цій галузі техніки.
ЇОО15|У цьому контексті терміни «полінуклеотид» і «олігонуклеотид» використані взаємозамінно. Якщо олігонуклеотид представлений послідовністю або буквами, наприклад «АТОЦССТО», слід розуміти, що вказані нуклеотиди розташовано в порядку 5-3 зліва направо, і що «А» означає дезоксіаденозин, «С» означає дезоксицитидин, «б» означає дезоксигуанозин, «Т» означає тимідин, і «О» означає дезоксиуридин, якщо не вказане інше. 0016) У цьому контексті «нуклеозид» включає природні нуклеозиди, включаючи 2'-дезокси й 2г'-гідроксильні форми, наприклад, описані в Когпрегд апа ВаКег, ОМА Керіїсайоп, 2-е вид. (Егеетап, Сан-Франциско, 1992). «Аналоги» у відношенні нуклеозидів включають синтетичні аналоги, що мають фрагменти модифікованих основ та/або фрагменти модифікованих цукрів, наприклад, описані, у цілому, автором Бспеїї, Мисіеоїіде Апаіодв (допп Уміеу, Нью-Йорк, 1980).
Такі аналоги включають синтетичні нуклеозиди, призначені для посилення зв'язувальних властивостей, наприклад, стабільності, специфічності або т.п., такі як описані авторами
Опітапп і Реутап (Спетіса! Кемієму5, 90:543-584, 1990). У деяких варіантах реалізації нуклеозид або аналоги нуклеозиду містить 3'-гідроксильну групу або 3'-аміногрупу.
ЇО017| Терміни «основа» і «азотиста основа» використані в цьому контексті взаємозамінно й включають (ї) звичайні основи ДНК і РНК (урацил, тимін, аденін, гуанін і цитозин) і (Ії) модифіковані основи або аналоги основ (наприклад, 5-метилцитозин, 5-бромурацил або інозин).
Аналог основи являє собою хімічну сполуку, молекулярна структура якої імітує структуру звичайної основи ДНК або РНК. 0018) У цьому контексті «піримідин» означає піримідини, що зустрічаються в природних нуклеозидах, включаючи цитозин, тимін і урацил, і їх поширені аналоги, такі як аналоги, що містять окси, метил, пропініл, метокси, гідрокси, аміно, тіо, галоген і т.п. замісники. Вказаний термін у цьому контексті додатково включає піримідини із приєднаними звичайними захисними групами, такі як М" -бензоїлцитозин. Додаткові звичайні захисні групи піримідину описані авторами Веацсаде і Іуег, Теігапеагоп 48: 2223-2311 (1992).
ЇОО19|У цьому контексті «пурин» означає пурини, що зустрічаються в природних нуклеозидах, включаючи аденін, гуанін і гіпоксантин, і їх поширені аналоги, такі як аналоги, що містять окси, метил, пропініл, метокси, гідрокси, аміно, тіо, галоген і т.п. замісники. Вказаний термін у цьому контексті додатково включає пурини із приєднаними звичайними захисними групами, такі як Ме-бензоїлгуанин, Ме-ізобутирилгуанин, МУ-бензоїладенін і т.п. Додаткові звичайні захисні групи пурину описані авторами Веаисаде і Іуег, Тейгапедгоп 48: 2223-2311 (1992). У цьому контексті термін «захищений» як частина хімічної назви стосується відомих у цій галузі техніки захисних груп для конкретного фрагмента сполуки, наприклад, «5'-захищений гідроксил» у відношенні нуклеозиду включає трифенілметил ( тобто тритил), п- анізилдифенілметил ( тобто монометокситритил або ММТ), ди-п-анізилфенілметил ( тобто диметокситритил або ОМТ) і т.п.; і захищена азотиста основа у відношенні азотистої основи, що містить гетероатом, захищений групою, такий як диметиламіноформамідин (ОМЕ), бензоїл (В2), ізобутирил і т.п. Відомі в цій галузі техніки захисні групи включають групи, описані в наступних посиланнях: Заїї, ед., Оіїдописіеоїіде Зупіпевів: А Ргасіїса! Арргоасі! (ІКГ. Рге55, Оксфорд, 1984);
Ататаїйй і Вгоот, Спетіса! Кемієм/5, 77:183-217, 1977; Роп сеї а!., Віотесппіднев, 6:768-775, 1988;
Опізика еї аї, Місієїс Асід5 Незеєагсп, 10:6553-6570, 1982; ЕскКвієїп, ей., Оіїдописіеоїіде5. апа
АпаІодшиевз: А Ргасіїса! Арргоасії (ІК Ргез5, Оксфорд, 1991), Огееєепе і Ууці5, Ргоїесіїме сгоишмрз іп
Огдапіс Зупіпезі5, друге видання, (опп УмМіеу 5 5оп5, Мем/ ХогК, 1991), Магапо, ред, Зупіпевів апа Арріїсайоп5 ої ОМА апа КМА (Асадетіс Ргез5, Мем/ ХогК, 1987), Веаисаде і Іуег, Теїгапедгоп 48: 2223-2311 (1992), і подібних посиланнях.
І0020| У цьому контексті «олігонуклеотидний М3--РБ5 фосфорамідат» означає олігомер, звичайно лінійний, з нуклеозидних субодиниць, зв'язаних принаймні одним М3--Р5' фосфорамідатним зв'язком. У загальних термінах, нуклеозидні субодиниці містять нуклеозиди або аналоги нуклеозидів, але також можуть містити більш загальні фрагменти, що мають порівнянну хімічну структуру, такі як позбавлені азотистої основи цукри й інші вуглеводневі фрагменти, такі як описані в наступних посиланнях: Меулоп еї аї., Мисівїс Асід5 Кезеагсі, 21: 60 1155-1162 (1993); Стійіп еї а), У. Ат. Сет. Бос., 114: 7976-7982 (1992); УЧавсиКе еї аї,
Теїганеагоп І еЦегв, 34: 301-304 (1992); Ма єї аІ., Міжнародна заявка РСТ/СА9У2/00423; 20оп еї аї.,
Міжнародна заявка РСТ/О590/06630; Юигапа еї аї., Мисівїс Асід5 Кезеагсй, 18: 6353-6359 (1990); заішпКне єї аї., ). Ат. Спет. 5бос., 114: 8768-8772 (1992); і т.п. У деяких випадках вказаний термін означає олігонуклеотид, у якому усі міжнуклеозидні зв'язки замінені М3--РБ' фосфорамідатними зв'язками, тобто термін включає частково й повністю «амідовані» олігомери. У деяких випадках він означає олігонуклеотид, у якому усі міжнуклеозидні зв'язки замінені М3-РБ5 фосфорамідатними зв'язками, і в якому нуклеозидні субодиниці представляють собою природні нуклеозиди або їх аналоги. Розглянутий олігонуклеотидний
М3-РБУ" фосфорамідат, у якому кожний зв'язок являє собою М3'-Р5' фосфорамідатний зв'язок («повністю амідований») може бути вбудований або приєднаний до інших олігонуклеотидів або полінуклеотидів з утворенням більшого олігомеру, який є «частково амідованим». Розглянутий олігонуклеотидний М3'-Р5" фосфорамідат може містити будь-які підходящі 3' та/або 5' кінцеві групи. У деяких варіантах реалізації олігонуклеотидний М3--»РБ5 фосфорамідат містить 3'- кінцеву гідроксигрупу або 3'-кінцеву аміногрупу.
ІО021| У цьому контексті терміни «фосфат» і «фосфатна група» включають тіофосфатну групу й оксофосфатну групу.
І0022| У цьому контексті термін «фосфорамідитна аміногрупа» стосується аміногрупи, --
МАВ», приєднаної до атома фосфору фосфорамідитної групи, а термін «фосфорамідитний азот» стосується атома азоту фосфорамідитної аміногрупи. (0023) «Алкіл» стосується одновалентних насичених аліфатичних вуглеводневих груп, що містять від 1 до 10 атомів вуглецю, наприклад, від 1 до 6 атомів вуглецю (наприклад, «алкіл, що містить від 1 до 6 атомів вуглецю») або від 1 до 5 (наприклад, «алкіл, що містить від 1 до 5 атомів вуглецю»), або від 1 до 4 (наприклад, «алкіл, що містить від 1 до 4 атомів вуглецю»), або від 1 до З атомів вуглецю (наприклад, «алкіл, що містить від 1 до З атомів вуглецю»). Вказаний термін включає, наприклад, лінійні й розгалужені вуглеводневі групи, такі як метил (СНз-), етил (СНіСНе-), н-пропіл (СНзСНесСнН»г-), ізопропіл. ((СНз)2СН-), н-бутил (СНазСнН».СНеСснН»-), ізобутил (СНзснене-), втор-бутил («Снз(СНазсСнег)сн.-), трет-бутил (СнНз)зо-), н-пентил (СНнеснН.нснНесн»е-) і неопентил ((СНз)зССНе-). (00241 Термін «заміщений алкіл» стосується алкільної групи, визначеної в цьому документі, у
Зо якій один або більше атомів вуглецю в алкільному ланцюзі необов'язково замінені гетероатомом, таким як -О-, -М-, -5-, -2(О)- (де п дорівнює від 0 до 2), -МВ- (де К являє собою водень або алкіл), що й має від 1 до 5 замісників, вибраних із групи, яка складається з алкокси, заміщеного алкокси, циклоалкілу, заміщеного циклоалкілу, циклоалкенілу, заміщеного циклоалкенілу, ацилу, ациламіно, ацилокси, аміно, аміноацилу, аміноацилокси, оксіаміноацилу, азидо, ціано, галогену, гідроксилу, оксо, тіокето, карбоксилу, карбоксіалкілу, тіоарилокси, тіогетероарилокси, тіогетероциклоокси, тіолу, тіоалкокси, заміщеного тіоалкокси, арилу, арилокси, гетероарилу, гетероарилокси, гетероциклілу, гетероциклоокси, гідроксіаміно, алкоксіаміно, нітро, -5О-алкілу, -5О0-арилу, -50-гетероарилу, -5О2-алкілу, -5О2-арилу, -505- гетероарилу й -МА2ВЄ, де Ка і Б? можуть бути однаковими або різними й вибрані з водню, необов'язково заміщеного алкілу, циклоалкілу, алкенілу, циклоалкенілу, алкінілу, арилу, гетероарилу й гетероциклічної групи. У деяких випадках «заміщений алкіл» стосується алкільної групи, визначеної в цьому документі, що має від 1 до 5 замісників, вибраних із групи, яка складається з алкокси, циклоалкілу, циклоалкенілу, ацилу, ациламіно, ацилокси, аміно, аміноацилу, аміноацилокси, азидо, ціано, галогену, гідроксилу, карбоксилу, карбоксіалкілу, тіолу, тіоалкокси, арилу, арилокси, гетероарилу, гетероарилокси, гетероциклілу, гетероциклоокси, сульфонамідо й -МАВеНЄ, де Ка і КЕ? можуть бути однаковими або різними й вибрані з водню, алкілу, циклоалкілу, алкенілу, циклоалкенілу, алкінілу, арилу, гетероарилу й гетероциклічної групи. (0025 «Алкілен» стосується двовалентних аліфатичних вуглеводневих груп, що переважно
БО мають від 1 до 6 і більше, переважно від 1 до З атомів вуглецю, які є або нерозгалуженими, або розгалуженими, і які необов'язково перервано однією або більше групами, вибраними з -О-, -
МАо-, -МАОС(0)-, -С(О)МНАО- ії т.п. Вказаний термін включає, наприклад, метилен (-СНе-), етилен (-СН»аСнН»-), н-пропілен (-СНСНоСН»-), ізопропілен (-СНСН(СнНз)-), (-С(СНз)2СНоСНе-), (-
С(СНз)25СНегС(О)-), (-С(СНз)25СНгС(О)МН-), (-'СН(СНз)СнНе-) і т.п. 0026) «Заміщений алкілен» стосується алкіленової групи, що має від 1 до З атомів водню, із замісниками, описаними для атомів вуглецю у визначенні «заміщений», представленому нижче.
І0027| Термін «алкан» стосується алкільної групи й алкіленової групи, визначеної у цьому документі. 0028) Термін «алкіламіноалкіл», «алкіламіноалкеніл» і «алкіламіноалкініл» стосується груп 60 АМНА-, де К являє собою алкільну групу, визначену в цьому документі, а К являє собою алкіленову, алкеніленову або алкініленову групу, визначену в цьому документі.
І0029| Термін «алкарил» або «аралкіл» стосується груп -алкілен-арил і -заміщений алкілен- арил, де алкілен, заміщений алкілен і арил є такими, як визначено в цьому документі.
ЇООЗОЇ «Алкокси» стосується групи -О-алкіл, де алкіл є таким, як визначено в цьому документі. Алкокси включає, наприклад, метокси, етокси, н-пропокси, ізопропокси, н-бутокси, трет-бутокси, втор-бутокси, н-пентокси й т.п. Термін «алкокси» стосується також груп алкеніл-О- ; циклоалкіл-О-, циклоалкеніл-О- і алкініл-О-, де алкеніл, циклоалкіл, циклоалкеніл і алкініл є такими, як визначено в цьому документі. 00311 Термін «заміщений алкокси» стосується груп заміщений алкіл-О-, заміщений алкеніл-
Сб-, заміщений циклоалкіл-О-, заміщений циклоалкеніл-О- і заміщений алкініл-О-, де заміщений алкіл, заміщений алкеніл, заміщений циклоалкіл, заміщений циклоалкеніл і заміщений алкініл є такими, як визначено в цьому документі.
І0ОЗ2| Термін «алкоксіаміно» стосується групи -МН-алкокси, де алкокси є таким, як визначено в цьому документі.
Ї0ООЗЗ| Термін «галогеналкокси» стосується груп алкіл-О-, де один або більше атомів водню алкільної групи заміщені групою галогену, і включає, наприклад, такі групи як трифторметокси, і т.п. 00341 Термін «галогеналкіл» стосується заміщеної алкільної групи, описаної вище, у якій один або більше атомів водню алкільної групи заміщені групою галогену. Приклади таких груп включають, без обмеження, фторалкільні групи, такі як трифторметил, дифторметил, трифторетил і т.п. 0035 Термін «алкілалкокси» стосується груп -алкілен-О-алкіл, алкілен-О-заміщений алкіл, заміщений алкілен-О-алкіл і заміщений алкілен-О-заміщений алкіл, де алкіл, заміщений алкіл, алкілен і заміщений алкілен є такими, як визначено в цьому документі.
І0ООЗ6| Термін «алкілтіоалкоси» стосується груп -алкілен-5-алкіл, алкілен-5-заміщений алкіл, заміщений алкілен-5-алкіл і заміщений алкілен-5-заміщений алкіл, де алкіл, заміщений алкіл, алкілен і заміщений алкілен є такими, як визначено в цьому документі.
Ї00ОЗ37| «Алкеніл» стосується нерозгалужених або розгалужених вуглеводневих груп, які мають від 2 до 6 атомів вуглецю й переважно від 2 до 4 атомів вуглецю, й що мають принаймні 1 ї переважно від 1 до 2 центрів ненасиченості, що представляють собою подвійний зв'язок.
Вказаний термін включає, наприклад, бівініл, аліл і бут-3-ен-1-іл. У цей термін входять цис- і транс-ізомери або суміші вказаних ізомерів.
ІЇ0ООЗ8)| Термін «заміщений алкеніл» стосується алкенільної групи, визначеної в цьому документі, що має від 1 до 5 замісників або від 1 до З замісників, вибраних з алкокси, заміщеного алкокси, циклоалкілу, заміщеного циклоалкілу, циклоалкенілу, заміщеного циклоалкенілу, ацилу, ациламіно, ацилокси, аміно, заміщеного аміно, аміноацилу, аміноацилокси, оксіаміноацилу, азидо, ціано, галогену, гідроксилу, оксо, тіокето, карбоксилу, карбоксіалкілу, тіоарилокси, тіогетероарилокси, тіогетероциклоокси, тіолу, тіоалкокси, заміщеного тіоалкокси, арилу, арилокси, гетероарилу, гетероарилокси, гетероциклілу, гетероциклоокси, гідроксіаміно, алкоксіаміно, нітро, -5О-алкілу, -50-заміщеного алкілу, -50- арилу, -5О-гетероарилу, -5О2-алкілу, -502-заміщеного алкілу, -5О2-арилу й -502-гетероарилу.
Ї0ООЗ9| «Алкініл» стосується нерозгалужених або розгалужених одновалентних вуглеводневих груп, що мають від 2 до б атомів вуглецю й переважно від 2 до З атомів вуглецю й мають принаймні 1 і переважно від 1 до 2 центрів ненасиченості, що представляють собою потрійний зв'язок. Приклади таких алкінільних груп включають ацетиленіл (-СЕСН) і пропаргіл (-
СНеСЕСН).
Ї0040| Термін «заміщений алкініл» стосується алкінільної групи, визначеної в цьому документі, що має від 1 до 5 замісників або від 1 до З замісників, вибраних з алкокси, заміщеного алкокси, циклоалкілу, заміщеного циклоалкілу, циклоалкенілу, заміщеного циклоалкенілу, ацилу, ациламіно, ацилокси, аміно, заміщеного аміно, аміноацилу, аміноацилокси, оксіаміноацилу, азидо, ціано, галогену, гідроксилу, оксо, тіокето, карбоксилу, карбоксіалкілу, тіоарилокси, тіогетероарилокси, тіогетероциклоокси, тіолу, тіоалкокси, заміщеного тіоалкокси, арилу, арилокси, гетероарилу, гетероарилокси, гетероциклілу, гетероциклоокси, гідроксіаміно, алкоксіаміно, нітро, -5О-алкілу, -50-заміщеного алкілу, -50- арилу, -50-гетероарилу, -5О2-алкілу, -502-заміщеного алкілу, -5О2-арилу й -502-гетероарилу. 00411 «Алкінілокси» стосується групи -О-алкініл, де алкініл є таким, як визначено в цьому документі. Алкінілокси включає, наприклад, етинілокси, пропінілокси й т.п. (0042) «Ацил» стосується груп Н-С(О0)-, алкіл-С(0)-, заміщений алкіл-С(0)-, алкеніл-С(О)-, заміщений алкеніл-С(О)-, алкініл-С(О0)-, заміщений алкініл-С(0)-, циклоалкіл-С(О)-, заміщений (510) циклоалкіл-С(О)-, циклоалкеніл-С(О)-, заміщений циклоалкеніл-С(0)-, арил-С(0)-, заміщений арил-С(0)-, гетероарил-С(О0)-, заміщений гетероарил-С(0)-, гетероцикліл-С(О)- і заміщений гетероцикліл-С(0О)-, де алкіл, заміщений алкіл, алкеніл, заміщений алкеніл, алкініл, заміщений алкініл, циклоалкіл, заміщений циклоалкіл, циклоалкеніл, заміщений циклоалкеніл, арил, заміщений арил, гетероарил, заміщений гетероарил, гетероциклічна група із заміщена гетероциклічна група є такими, як визначено в цьому документі. Наприклад, ацил включає «ацетильну» групу СНзС(О)- 0043) «Ациламіно» стосується груп -МНАОС(О)алкіл, -МА?ОС(О)заміщений алкіл, М
ВА?РоС(О)циклоалкіл, -МА?ОС(О)заміщений циклоалкіл, -МА2оС(О)циклоалкеніл, -
МАгОС(О)заміщений циклоалкеніл, -МА2ОС(О)алкеніл, -МНА2ОС(О)заміщений алкеніл, -
МА?оС(О)алкініл, -МА?ОС(О)заміщений алкініл, -МАгоС(О)арил, -МА?ОС(О)заміщений арил, -
МАгОоС(О)гетероарил, -МА2ОС(О)заміщений гетероарил, -МАгоС(О)гетероциклічна група й -
МАгОоС(О)заміщена гетероциклічна група, де Ко являє собою водень або алкіл, і де алкіл, заміщений алкіл, алкеніл, заміщений алкеніл, алкініл, заміщений алкініл, циклоалкіл, заміщений циклоалкіл, циклоалкеніл, заміщений циклоалкеніл, арил, заміщений арил, гетероарил, заміщений гетероарил, гетероциклічна група й заміщена гетероциклічна група є такими, як визначено в цьому документі. (0044) «Амінокарбоніл» або термін «аміноацил» стосується групи -С(О)МА2 В, де В?! і Кг незалежно вибрані із групи, яка складається з водню, алкілу, заміщеного алкілу, алкенілу, заміщеного алкенілу, алкінілу, заміщеного алкінілу, арилу, заміщеного арилу, циклоалкілу, заміщеного циклоалкілу, циклоалкенілу, заміщеного циклоалкенілу, гетероарилу, заміщеного гетероарилу, гетероциклічної групи й заміщеної гетероциклічної групи, і де КК? і Кк необов'язково з'єднані один з одним разом з атомом азоту, зв'язаним з ними, з утворенням гетероциклічної або заміщеної гетероциклічної групи, і де алкіл, заміщений алкіл, алкеніл, заміщений алкеніл, алкініл, заміщений алкініл, циклоалкіл, заміщений циклоалкіл, циклоалкеніл, заміщений циклоалкеніл, арил, заміщений арил, гетероарил, заміщений гетероарил, гетероциклічна група й заміщена гетероциклічна група є такими, як визначено в цьому документі. 0045) «Амінокарбоніламіно» стосується групи -МА2С(О)МА2А2, де КК", ІД22 ії ВЗ незалежно вибрані з водню, алкілу, арилу або циклоалкілу, або де дві групи К з'єднані з утворенням
Зо гетероциклільної групи. 0046) Термін «алкоксикарбоніламіно» стосується групи -МКС(О)ОК, де кожний К незалежно являє собою водень, алкіл, заміщений алкіл, арил, гетероарил або гетероцикліл, де алкіл, заміщений алкіл, арил, гетероарил і гетероцикліл є такими, як визначено в цьому документі.
Ї0047| Термін «ацилокси» стосується груп алкіл-С(0)О-, заміщений алкіл-С(О)О-, циклоалкіл-С(0)О-, заміщений циклоалкіл-С(0)О-, арил-С(0)О-, гетероарил-С(О)0О- (|і гетероцикліл-С(О)О-, де алкіл, заміщений алкіл, циклоалкіл, заміщений циклоалкіл, арил, гетероарил і гетероцикліл є такими, як визначено в цьому документі. 0048) «Аміносульфоніл» стосується групи -502М82'В?2, де К? і К22 незалежно вибрані із групи, яка складається з водню, алкілу, заміщеного алкілу, алкенілу, заміщеного алкенілу, алкінілу, заміщеного алкінілу, арилу, заміщеного арилу, циклоалкілу, заміщеного циклоалкілу, циклоалкенілу, заміщеного циклоалкенілу, гетероарилу, заміщеного гетероарилу, гетероциклічної групи, заміщеної гетероциклічної групи, і де БК" ї 222 необов'язково з'єднані один з одним разом з атомом азоту, зв'язаним з ними, з утворенням гетероциклічної або заміщеної гетероциклічної групи, і алкіл, заміщений алкіл, алкеніл, заміщений алкеніл, алкініл, заміщений алкініл, циклоалкіл, заміщений циклоалкіл, циклоалкеніл, заміщений циклоалкеніл, арил, заміщений арил, гетероарил, заміщений гетероарил, гетероциклічна група й заміщена гетероциклічна група є такими, як визначено в цьому документі.
Ї0049| «Сульфоніламіно» стосується групи -МА2 5052822, де КК?! і 2 незалежно вибрані із групи, яка складається з водню, алкілу, заміщеного алкілу, алкенілу, заміщеного алкенілу, алкінілу, заміщеного алкінілу, арилу, заміщеного арилу, циклоалкілу, заміщеного циклоалкілу, циклоалкенілу, заміщеного циклоалкенілу, гетероарилу, заміщеного гетероарилу, гетероциклічної групи й заміщеної гетероциклічної групи, і де К"' ії 222 необов'язково з'єднані один з одним у місці з атомами, зв'язаними з ними, з утворенням гетероциклічної або заміщеної гетероциклічної групи, і де алкіл, заміщений алкіл, алкеніл, заміщений алкеніл, алкініл, заміщений алкініл, циклоалкіл, заміщений циклоалкіл, циклоалкеніл, заміщений циклоалкеніл, арил, заміщений арил, гетероарил, заміщений гетероарил, гетероциклічна група й заміщена гетероциклічна група є такими, як визначено в цьому документі.
Ї0ОО50ОЇ «Арил» або «Аг» стосується одновалентної ароматичної карбоциклічної групи, що складається з 6-18 атомів вуглецю, що має одне кільце (таке, як у фенільній групі) або кільцеву бо систему, що має декілька конденсованих кілець (приклади таких ароматичних кільцевих систем включають нафтил, антрил і інданіл), і вказані конденсовані кільця можуть бути або не бути ароматичними, за умови, що точка приєднання знаходиться біля атома ароматичного кільця.
Вказаний термін включає, наприклад, феніл і нафтил. Якщо інше не обмежене визначенням арильного замісника, такі арильні групи можуть бути необов'язково заміщеними 1-5 замісниками або 1-3 замісниками, вибраними з ацилокси, гідрокси, тіолу, ацилу, алкілу, алкокси, алкенілу, алкінілу, циклоалкілу, циклоалкенілу, заміщеного алкілу, заміщеного алкокси, заміщеного алкенілу, заміщеного алкінілу, заміщеного циклоалкілу, заміщеного циклоалкенілу, аміно, заміщеного аміно, аміноацилу, ациламіно, алкарилу, арилу, арилокси, азидо, карбоксилу, карбоксіалкілу, ціано, галогену, нітро, гетероарилу, гетероарилокси, гетероциклілу, гетероциклоокси, аміноацилокси, оксіациламіно, тіоалкокси, заміщеного тіоалкокси, тіоарилокси, тіогетероарилокси, -5О0-алкілу, -50-заміщеного алкілу, -5О-арилу, -5О0-гетероарилу, -505- алкілу, -5О2-заміщеного алкілу, -5О2-арилу, -5О2-гетероарилу й тригалогенметилу. У таких випадках арильна група, яка заміщена 1-5 замісниками (наприклад, як описано в цьому документі), згадана як «заміщений арил».
Ї0051| «Арилокси» стосується групи -О-арил, де арил є таким, як визначено в цьому документі, включаючи, наприклад, фенокси, нафтокси й т.п., включаючи необов'язково заміщені арильні групи, також описані в цьому документі. (00521 «Аміно» стосується групи -МН».
Ї0ОО53З| Термін «заміщений аміно» стосується групи -МЕКК, де кожний К незалежно вибраний із групи, яка складається з водню, алкілу, заміщеного алкілу, циклоалкілу, заміщеного циклоалкілу, алкенілу, заміщеного алкенілу, циклоалкенілу, заміщеного циклоалкенілу, алкінілу, заміщеного алкінілу, арилу, гетероарилу й гетероциклілу, за умови, що принаймні один К не являє собою водень. 00541 Термін «азидо» стосується групи -Мв3з. 0055) «Карбоксил», «карбокси» або «карбоксилат» стосується -СО»Н або його солей.
Ї0056| «Карбоксильний ефір» або «карбоксіефір», або терміни «карбоксіалкіл», або «карбоксилалкіл» стосуються груп -С(0)О-алкіл, -С(0)О-заміщений алкіл, -С(0)О-алкеніл, -
С(О)О-заміщений алкеніл, -С(0)О-алкініл, -С(О0)О-заміщений алкініл, -С(О)О-арил, -С(О0)О- заміщений арил, -С(0)О-циклоалкіл, -С(0)О-заміщений циклоалкіл, -С(О0)О-циклоалкеніл, -
С(0О)О-заміщений циклоалкеніл, -С(0)О-гетероарил, -С(0)О-заміщений гетероарил, -С(0)0О- гетероциклічна група й -С(0)О-заміщена гетероциклічна група, де алкіл, заміщений алкіл, алкеніл, заміщений алкеніл, алкініл, заміщений алкініл, циклоалкіл, заміщений циклоалкіл, циклоалкеніл, заміщений циклоалкеніл, арил, заміщений арил, гетероарил, заміщений гетероарил, гетероциклічна група й заміщена гетероциклічна група є такими, як визначено в цьому документі.
Ї0057| «Карбоксильний ефір)окси» або «карбонат» стосується груп -0-С(0)О-алкіл, -О-
С(О)О-заміщений алкіл, -0О-С(0)О-алкеніл, -0-С(О0)О-заміщений алкеніл, -0-С(0)О-алкініл,. -О-
С(О)О-заміщений алкініл, -0-С(О0)О-арил, -0-С(0)О-заміщений арил, -0О-С(О)О-циклоалкіл, -О-
С(О)О-заміщений циклоалкіл, -0О-С(О)О-циклоалкеніл,. -0-С(0)О-заміщений циклоалкеніл, -О-
С(О)О-гетероарил, -0О-С(0)О-заміщений гетероарил, -0О-С(0)О-гетероциклічна група й -0-
С(О)О-заміщена гетероциклічна група, де алкіл, заміщений алкіл, алкеніл, заміщений алкеніл, алкініл, заміщений алкініл, циклоалкіл, заміщений циклоалкіл, циклоалкеніл, заміщений циклоалкеніл, арил, заміщений арил, гетероарил, заміщений гетероарил, гетероциклічна група й заміщена гетероциклічна група є такими, як визначено в цьому документі. 0058) «Ціано» або «нітрил» стосується групи -СМ.
Ї0059| «Циклоалкіл» стосується циклічних алкільних груп, що складаються із 3-10 атомів вуглецю, що мають одне або декілька циклічних кілець, включаючи конденсовані, місточкові й спірокільцеві системи. Приклади підходящих циклоалкільних груп включають, наприклад, адамантил, циклопропіл, циклобутил, циклопентил, циклооктил і т.п. Такі циклоалкільні групи включають, наприклад, однокільцеві структури, такі як циклопропіл, циклобутил, циклопентил, циклооктил і т.п., або багатокільцеві структури, такі як адамантаніл і т.п.
І0ОО6ОІ Термін «заміщений циклоалкіл» стосується циклоалкільних груп, що мають від 1 до 5 замісників або від 1 до З замісників, вибраних з алкілу, заміщеного алкілу, алкокси, заміщеного алкокси, циклоалкілу, заміщеного циклоалкілу, циклоалкенілу, заміщеного циклоалкенілу, ацилу, ациламіно, ацилокси, аміно, заміщеного аміно, аміноацилу, аміноацилокси, оксіаміноацилу, азидо, ціано, галогену, гідроксилу, оксо, тіокето, карбоксилу, карбоксіалкілу, тіоарилокси, тіогетероарилокси, тіогетероциклоокси, тіолу, тіосалкокси, заміщеного тіоалкокси, арилу, арилокси, гетероарилу, гетероарилокси, гетероциклілу, гетероциклоокси, гідроксіаміно, алкоксіаміно, нітро, -5О-алкілу, -50-заміщеного алкілу, -5О-арилу, -5О0-гетероарилу, -505- 60 алкілу, -5О2-заміщеного алкілу, -5О2-арилу й -5О2-гетероарилу.
0061) «Циклоалкеніл» стосується неароматичних циклічних алкільних груп, що складаються із 3-10 атомів вуглецю, що мають одне або декілька кілець, й що мають принаймні один подвійний зв'язок і переважно від 1 до 2 подвійних зв'язків. 00621 Термін «заміщений циклоалкеніл» стосується циклоалкінільних груп, що мають від 1 до 5 замісників або від 1 до З замісників, вибраних з алкокси, заміщеного алкокси, циклоалкілу, заміщеного циклоалкілу, циклоалкенілу, заміщеного циклоалкенілу, ацилу, ациламіно, ацилокси, аміно, заміщеного аміно, аміноацилу, аміноацилокси, оксіаміноацилу, азидо, ціано, галогену, гідроксилу, кето, тіокето, карбоксилу, карбоксіалкілу, тіоарилокси, тіогетероарилокси, тіогетероциклоокси, тіолу, тіоалкокси, заміщеного тіоалкокси, арилу, арилокси, гетероарилу, гетероарилокси, гетероциклілу, гетероциклоокси, гідроксіаміно, алкоксіаміно, нітро, -50-алкілу, -
ЗО-заміщеного алкілу, -5О0-арилу, -50-гетероарилу, -5О2-алкілу, -502-заміщеного алкілу, -502- арилу й -5О2-гетероарилу. 0063) «Циклоалкініл» стосується неароматичних циклоалкільних груп, що складаються із 5- 10 атомів вуглецю, що мають одне або декілька кілець, й що мають принаймні один потрійний зв'язок. 00641 «Циклоалкокси» стосується -О-циклоалкілу. 0065) «Циклоалкенілокси» стосується -О-циклоалкенілу. 0066) «Гало» або «галоген» стосується фтору, хлору, брому і йоду. 0067 «Гідрокси» або «гідроксил» стосується групи -ОН. 0068) «Гетероарил» стосується ароматичної групи, яка складається з 1-15 атомів вуглецю, наприклад, 1-10 атомів вуглецю, і 1-10 гетероатомів, вибраних із групи, яка складається з кисню, азоту й сірки, що перебувають у кільці. Такі гетероарильні групи можуть мати одне кільце (наприклад, піридиніл, імідазоліл або фурил) або декілька конденсованих кілець у кільцевій системі (наприклад, у таких групах як індолізиніл, хінолініл, бензофуран, бензімідазоліл або бензотієніл), де принаймні одне кільце в кільцевій системі є ароматичним, і принаймні одне кільце в кільцевій системі є ароматичним, за умови, що точка приєднання знаходиться біля атома ароматичного кільця. У деяких варіантах реалізації кільцевий атом(-и) азоту та/або сірки гетероарильної групи необов'язково окиснений з утворенням М-оксиду (М--0), сульфінільних або сульфонільних фрагментів. Вказаний термін включає, наприклад, піридиніл, піроліл,
Зо індоліл, тіофеніл і фураніл. Якщо інше не обмежене визначенням гетероарильного замісника, такі гетероарильні групи можуть бути необов'язково заміщеними 1-5 замісниками або 1-3 замісниками, вибраними з ацилокси, гідрокси, тіолу, ацилу, алкілу, алкокси, алкенілу, алкінілу, циклоалкілу, циклоалкенілу, заміщеного алкілу, заміщеного алкокси, заміщеного алкенілу, заміщеного алкінілу, заміщеного циклоалкілу, заміщеного циклоалкенілу, аміно, заміщеного аміно, аміноацилу, ациламіно, алкарилу, арилу, арилокси, азидо, карбоксилу, карбоксіалкілу, ціано, галогену, нітро, гетероарилу, гетероарилокси, гетероциклілу, гетероциклоокси, аміноацилокси, оксіациламіно, тіоалкокси, заміщеного тіоалкокси, тіоарилокси, тіогетероарилокси, -5О0-алкілу, -50-заміщеного алкілу, -5О-арилу, -5О0-гетероарилу, -505- алкілу, -502-заміщеного алкілу, -5О2-арилу й -502-гетероарилу, і тригалогенметилу. У таких випадках гетероарильна група, яка заміщена 1-5 замісниками (наприклад, як описано в цьому документі), згадана як «заміщений гетероарил». 0069 Термін «гетероаралкіл» стосується груп -алкілен-гетероарил, де алкілен і гетероарил є такими, як визначено в цьому документі. Вказаний термін включає, наприклад, піридилметил, піридилетил, індолілметил і т.п. 0070 «Гетероарилокси» стосується -О-гетероарилу. 0071) «Гетероцикл», «гетероциклічний», «гетероциклоалкіл» і «гетероцикліл» стосуються насиченої або ненасиченої групи, що має одне кільце або декілька конденсованих кілець, включаючи конденсовані, місточкові й спірокільцеві системи, і що має від З до 20 кільцевих атомів, включаючи від 1 до 10 гетероатомів. Вказані кільцеві атоми вибрані із групи, яка складається з азоту, сірки або кисню, при цьому в конденсованих кільцевих системах одне або більше кілець можуть представляти собою циклоалкіл, арил або гетероарил, за умови, що точка приєднання знаходиться в неароматичному кільці. У деяких варіантах реалізації атом(-и) азоту та/або сірки гетероциклічної групи необов'язково окиснені з утворенням М-оксиду, -5(0)- або -
ЗОг2-фрагментів.
І0072| Приклади гетероциклів і гетероарилів включають, але не обмежуються ними, азетидин, пірол, імідазол, піразол, піридин, піразин, піримідин, піридазин, індолізин, ізоїндол, індол, дигідроіндол, індазол, пурин, хінолізин, ізохінолін, хінолін, фталазин, нафтилпіридин, хіноксалін, хіназолін, цинолін, птеридин, карбазол, карболін, фенантридин, акридин, фенантролін, ізотіазол, феназин, ізоксазол, феноксазин, фенотіазін, імідазолідин, імідазолін, 60 піперидин, піперазин, індолін, фталімід, 1,2,3,4-тетрагідроізохінолін, 4,5,6,7-
тетрагідробензої|б|гіофен, тіазол, тіазолідин, тіофен, бензо|бІгіофен, морфолініл, тіоморфолініл (також називається тіаморфолінілом), 1,1-діоксотіоморфолініл, піперидиніл, піролідин, тетрагідрофураніл і т.п.
Ї0073| Якщо інше не обмежене визначенням гетероциклічного замісника, такі гетероциклічні групи можуть бути необов'язково заміщені 1-5 або 1-3 замісниками, вибраними з алкокси, заміщеного алкокси, циклоалкілу, заміщеного циклоалкілу, циклоалкенілу, заміщеного циклоалкенілу, ацилу, ациламіно, ацилокси, аміно, заміщеного аміно, аміноацилу, аміноацилокси, оксіаміноацилу, азидо, ціано, галогену, гідроксилу, оксо, тіокето, карбоксилу, карбоксіалкілу, тіоарилокси, тіогетероарилокси, тіогетероциклоокси, тіолу, тіоалкокси, заміщеного тіоалкокси, арилу, арилокси, гетероарилу, гетероарилокси, гетероциклілу, гетероциклоокси, гідроксіаміно, алкоксіаміно, нітро, -5О-алкілу, -50-заміщеного алкілу, -50- арилу, -50-гетероарилу, -5О2-алкілу, -502-заміщеного алкілу, -5О2-арилу, -50О2-гетероарилу й конденсованого гетероциклу. 00741 «Гетероциклілокси» стосується групи -О-гетероцикліл. 0075 Термін «гетероциклілтіо» стосується групи гетероцикліл-5-. 0076) Термін «гетероциклен» стосується бірадикальної групи, утвореної з гетероциклу, визначеного в цьому документі. 0077 Термін «гідроксіаміно» стосується групи -МНОН. 0078) «Нітро» стосується групи -МО».
Ї0079| «Оксо» стосується атома (-0).
І0080| «Сульфоніл» стосується групи 5Ог2-алкіл, 5О2-заміщений алкіл, 5Ог-алкеніл, 5О2- заміщений алкеніл, 5О2-циклоалкіл, 5О2-заміщений циклоалкіл, 5О»2-циклоалкеніл, 5О»2- заміщений циклоалкеніл, 5Ог-арил, 5Ог-заміщений арил, 5О2-гетероарил, 50О2-заміщений гетероарил, 5Ог-гетероциклічна група й 5О2-заміщена гетероциклічна група, де адлькіл, заміщений алкіл, алкеніл, заміщений алкеніл, алкініл, заміщений алкініл, циклоалкіл, заміщений циклоалкіл, циклоалкеніл, заміщений циклоалкеніл, арил, заміщений арил, гетероарил, заміщений гетероарил, гетероциклічна група й заміщена гетероциклічна група є такими, як визначено в цьому документі. Сульфоніл включає, наприклад, метил-5О2-, феніл-5О2- і 4- метилфеніл-5О2-.
Коо) І0081| «Сульфонілокси» стосується групи -0502-алкіл, О5О2-заміщений алкіл, О5052- алкеніл, О5О»2-заміщений алкеніл, О5О»2-циклоалкіл, О5О2-заміщений циклоалкіл, О505- циклоалкеніл, О5О2-заміщений циклоалкеніл, О5О2-арил, О5О»2-заміщений арил, О505- гетероарил, О5О2-заміщений гетероарил, О5О2-гетероциклічна група й 05052 заміщена гетероциклічна група, де алкіл, заміщений алкіл, алкеніл, заміщений алкеніл, алкініл, заміщений алкініл, циклоалкіл, заміщений циклоалкіл, циклоалкеніл, заміщений циклоалкеніл, арил, заміщений арил, гетероарил, заміщений гетероарил, гетероциклічна група й заміщена гетероциклічна група є такими, як визначено в цьому документі. 00821 Термін «амінокарбонілокси» стосується групи -ОС(О)МКК, де кожний К незалежно являє собою водень, алкіл, заміщений алкіл, арил, гетероарил або гетероциклічну групу, де алкіл, заміщений алкіл, арил, гетероарил і гетероциклічна група є такими, як визначено в цьому документі. 00831 «Тіол» стосується групи -5Н. 00841 «Тіоксо» або термін «тіокето» стосується атома (-5). 0085 «Алкілтіо» або термін «тіоалкокси» стосується групи -5-алкіл, де алкіл є таким, як визначено в цьому документі. У деяких варіантах реалізації сірка може бути окиснена до -5(0)-.
Сульфоксид може існувати у вигляді одного або більше стереоізомерів. 0086) Термін «заміщений тіоалкокси» стосується групи -5-заміщений алкіл.
І0О87| Термін «тіоарилокси» стосується групи арил-5-, де арильна група є такою, як визначено в цьому документі, включаючи необов'язково заміщені арильні групи, також визначені в цьому документі. 0088) Термін «тіогетероарилокси» стосується групи гетероарил-5-, де гетероарильна група є такою, як визначено в цьому документі, включаючи необов'язково заміщені арильні групи, також визначені в цьому документі. 0089 Термін «тіогетероциклоокси» стосується групи гетероцикліл-5-, де гетероциклільна група є такою, як визначено в цьому документі, включаючи необов'язково заміщені гетероциклільні групи, також визначені в цьому документі.
Ї0090О| Крім опису, представленого в цьому документі, термін «заміщений», використовуваний для модифікації визначеної групи або радикала, також може означати, що один або більше атомів водню визначеної групи або радикала, кожний незалежно від інших, бо замінені однаковими або різними групами замісників, як описано нижче.
Ї0О091| Крім груп, описаних відносно окремих термінів, групи замісників для заміщення одного або більше атомів водню (будь-які два атоми водню біля одного атома вуглецю можуть бути замінені на 50, МАК, -М-ОВ, -М2 або -5) біля насичених атомів вуглецю у визначеній групі або радикалі, представляють собою, якщо не вказане інше, -Н92, галоген, 0, -ЮОВ8, -БН, -МА8одво, тригалогенметил, -СМ, -ОСМ, -5СМ, -МО, -МО», -Ме», -Мз, -5021872, -5020-М", -5020Н82, -0502879, -05020-Ме, - 05020879, -Р(О-)2(МУ)2, -Р(ІФОВЗО-МУ, -Р(ІХХОВ У) 2, -ФО)В, -
С(5)А, -С(МА)А, -Б(00-МУ, -С(00ОН, -б(5)О", -С(О)МАВод -С(МА МАО - осо), -об(5)А8, -оОб() М, -ОС(0)Н, -О6(5)0ОН, -МАС(О)Н", -МА"О(5)А, -
МАО МУ, -МАбО2вН, 0 -МАОб(Б)ОН 0 -МАЛС(О)МАдю -МАОСМАА її -
МАТС(МА 9)МАЗОВЯо, де Кб? вибраний із групи, яка складається з необов'язково заміщеного алкілу, циклоалкілу, гетероалкілу, гетероциклоалкілалкілу, циклоалкілалкілу, арилу, арилалкілу, гетероарилу й гетероарилалкілу, кожний КК"? незалежно являє собою водень або Ко: кожний Ко незалежно являє собою КК або, в альтернативному варіанті, два К89, разом з атомом азоту, з яким вони зв'язані, утворюють 5-, 6- або 7-членний гетероциклоалкіл, який може необов'язково містити від 1 до 4 однакових або різних додаткових гетероатомів, вибраних із групи, яка складається з 0, М і 5, з яких М може мати -Н або С:-Сз алкільне заміщення; і кожний М" являє собою протиїон з нетто-одиничним позитивним зарядом. Кожний М' незалежно може представляти собою, наприклад, іон лужного металу, такий як К", Ма», І іх; іон амонію, такий як "М(Вео);; або іон лужноземельного металу, такий як ІСагчю5, (Маю, або |Ва2чю0»5 (нижній індекс 0,5 означає, що один із протиіїонів для кожного двовалентного іона лужноземельного металу може бути іонізованою формою сполуки згідно із цим винаходом, а інший протиіон може представляти собою, наприклад, хлорид; або дві іонізовані сполуки, описані у цьому документі, можуть служити як протиіїони для таких двовалентних іонів лужноземельних металів; або двічі іонізована сполука згідно із цим винаходом може служити як протиіїон для таких двовалентних іонів лужноземельних металів). Як конкретні приклади, -МА8ОВВо включає -МН», -МН-алкіл, М- піролідиніл, М-піперазиніл, 4М-метилпіперазин-1-іл і М-морфолініл. 0092) Крім опису, представленого в цьому документі, групи замісників для атомів водню або ненасичених атомів вуглецю в «заміщених» алкенових, алкінових, арильних і гетероарильних групах, якщо не вказане інше, представляють собою -НЄ2, галоген, -ОМ", -ОВ 7,
Зо -5І3879, -5-М", -М89ВВо, тригалогенметил, -СЕз, -СМ, -ОСМ, -5СМ, -МО, -МО», -Мз, -502879, -503-
Ме, -50з31879, -«0502872, -«05057М", -050Оз38 9, -РОЗ(МУ)2, -Р(ІФОДОВ"О-МУ, -Р(ІОХОВ)», -Ф(О)В, -б(5)879, -«С(МА )8о, -5025-МУ, -60287, -Б(5)087о, -С(О)МАВодВо, «(МА )МАВодВо, -ОС(О)В, -
Оос(5)8", -06бО5Ме, -0бО2н" -об(5)Ов -МАлС(О)ВН, -МАлС(5)А, -МАОбОМ», -
МАО», -МАО(5)ОА, -МАС(О)МАВодВо «МА С(МАА ї -МА"С(МА)МАВОВВО, де КО,
ВО, ДВО | М" є такими, як визначено вище, за умови, що у випадку заміщеного алкену або алкіну замісники не представляють собою -О-МУ, -0О82, -58379 або -5-М". 0093) Крім груп, описаних у цьому документі відносно окремих термінів, групи замісників для атомів водню біля атома азоту в «заміщених» гетероалкільних і циклогетероалкільних групах представляють собою, якщо не вказане інше, -Нб0, -0МУ, -ОВ8, -5418879, -5 МУ, -МА8ВОДВО, тригалогенметил, -СЕз, -СМ, -МО, -МО», -(0)2879, -(Ф2О Ме, -60)2082, -05(0)2879, -05(0)20:- ме, -05(0)2ОН8,. -Р(ІФОЗ2(МУ2, -Р(ІОХОВ ЗО МУ, -Р(ІХОВ"(ОВ) -Б(О0)8, -(5)8, -
С(МмА)А8?, -Щ0)ОН, -6(5)0Н7, -С(О)МАодВо (МАМА, -О0(0)8", -ОС(5)8, - ос), -об(5)0Нл -МАС(О)Н, -МАлб(БувА, -МА!АООС()ОВ, -МАОб(5)А, -
МАС (О)МАВодНо, -МАЛС(МА А її -МА"С(МА МАО, де ро В, ДВО Її М'є такими, як визначено раніше. 00941) Крім представленого опису, у деяких варіантах реалізації заміщена група має 1, 2, З або 4 замісники, 1, 2 або З замісники, 1 або 2 замісники, або 1 замісник. 0095) Слід розуміти, що у всіх заміщених групах, визначених вище, полімери, що виникають при утворенні замісників з додатковими замісниками їх самих (наприклад, заміщений арил, що має заміщену арильну групу як замісник, яка сама заміщена заміщеною арильною групою, яка додатково заміщена заміщеною арильною групою, і т.д.), не входять у цей опис. У таких випадках максимальна кількість вказаних заміщень дорівнює трьом. Наприклад, серійні заміщення заміщених арильних груп, спеціально які мається на увазі в цьому контексті, обмежені групою заміщений арил-(заміщений арил)-заміщений арил.
ІЇ0096)| Якщо не вказане інше, то номенклатура замісників, що не мають явного визначення в цьому описі, визначена назвою кінцевої частини функціональної групи, потім сусідньої функціональності в напрямку точки приєднання. Наприклад, замісник «арилалкілоксикарбоніл» стосується групи (арил)-(алкіл)-0О-С(0О)-.
Ї0097| Відносно будь-яких груп, описаних у цьому документі, які містять один або більше бо замісників, слід розуміти, звичайно, що такі групи не містять якої-небудь заміни або заміщуючих структур, які є просторово неможливими та/або нездійсненними з точки зору синтезу. Крім того, розглянуті сполуки включають усі стереохімічні ізомери, що виникають при заміщенні вказаних сполук. 0098) Термін «фармацевтично прийнятна сіль» означає сіль, яка прийнятна для введення пацієнтові, такому як ссавець (солі із протиїонами, що мають прийнятну безпеку для ссавців у цьому режимі дозування). Такі солі можуть бути отримані з фармацевтично прийнятних неорганічних або органічних основ і з фармацевтично прийнятних неорганічних або органічних кислот. «Фармацевтично прийнятна сіль» стосується фармацевтично прийнятний солей сполук, які отримані з різних органічних і неорганічних протиіонів, загальновідомих у цій галузі техніки, і включають, наприклад, натрій і т.п.; і якщо молекула містить основну функціональну групу, солі органічних або неорганічних кислот, такі як гідрохлорид, і т.п. Розглянуті фармацевтично прийнятні солі включають, але не обмежуються ними, солі алюмінію, амонію, аргініну, барію, бензатину, кальцію, холінату, етилендіаміну, лізину, літію, магнію, меглуміну, прокаїну, калію, натрію, трометаміну, М-метилглюкаміну, М,М'-дибензилетилендіаміну, хлорпрокаїну, діетаноламіну, етаноламіну, піперазину, цинку, діїзопропіламіну, діїзопропілетиламіну, триєетиламіну й триетаноламіну.
І0099| Термін «її сіль» означає сполуку, утворену при заміні протону кислоти катіоном, таким як катіон металу або органічний катіон, і т.п. Якщо це доречно, сіль являє собою фармацевтично прийнятну сіль, хоча це не є необхідним для солей проміжних сполук, які не призначені для введення пацієнтові. Наприклад, солі сполук згідно із цим винаходом включають солі, у яких сполука є протонованою неорганічною або органічною кислотою з утворенням катіона, зі спряженою основою неорганічної або органічної кислоти як аніонного компонента вказаної солі. Розглянуті солі включають, але не обмежуються ними, солі алюмінію, амонію, аргініну, барію, бензатину, кальцію, цезію, холінату, етилендіаміну, літію, магнію, меглуміну, прокаїну, М-метилглюкаміну, піперазину, калію, натрію, трометаміну, цинку, М,М'- дибензилетилендіаміну, хлорпрокаїну, дієтаноламіну, етаноламіну, піперазину, діізопропіламіну, діізопропілетиламіну, триетиламіну й триетаноламіну. Слід розуміти, що для будь-яких олігонуклеотидних структур, зображених у цьому документі, які містять кістяк міжнуклеозидних зв'язків, такі олігонуклеотиди також можуть включати будь-які підходящі
Зо сольові форми. У деяких варіантах реалізації для простоти зображені кислотні форми міжнуклеозидних зв'язків. У деяких випадках сіль розглянутої сполуки являє собою сіль одновалентного катіона. У деяких варіантах реалізації сіль розглянутої сполуки являє собою сіль двовалентного катіона. У деяких випадках сіль розглянутої сполуки являє собою сіль тривалентного катіона. «Сольват» стосується комплексу, утвореного комбінацією молекул розчинника з молекулами або іонами розчиненої речовини. Розчинник може представляти собою органічну сполуку, неорганічну сполуку або їх суміш. Деякі приклади розчинників включають, але не обмежуються ними, метанол, М,М-диметилформамід, тетрагідрофуран, диметилсульфоксид і воду. Якщо розчинник являє собою воду, утворений сольват являє собою гідрат.
Ї00100| «Стереоїзомер» і «стереоізомери» стосуються сполук, які мають однакову послідовність з'єднання атомів, але різне розташування атомів у просторі. Стереоізомери включають цис-транс ізомери, Е і 2 ізомери, енантіомери й діастереомери. 00101) «Таутомер» стосується альтернативних форм молекули, які відрізняються тільки електронним зв'язуванням атомів та/або положення протона, таким як кето-енольні й імін- єнамінні таутомери, -МН-Р(-5)МОН)-О- ії -МН-Р(-О0)(ЗН)-О-, або таутомерні форми гетероарильних груп, що містять кільцеве розташування атомів -М-С(Н)-МН-, таких як піразоли, імідазоли, бензімідазоли, триазоли й тетразоли. Фахівцям у цій галузі техніки зрозуміло, що можливі й інші таутомерні розташування груп, описаних у цьому документі. Наприклад, слід розуміти, що олігонуклеотид, описаний наступною структурою:
МК о-і ов о зн отв () А
Сх
М отрвН
О-19 р пр прі пре пре пре пре пров пре пре А пр опр преопре опр опрео пре опр про | о...
МН включає також наступну структуру, що демонструє одне можливе альтернативне таутомерне розташування зв'язувальних груп:
Ко о о сн з'вен () А
Сх й з-р г
О-19 р пр прі пре пре пре пре пров пре пре А пр опр преопре опр опрео пре опр про | о.
МН де «про» являє собою тіофосфорамідатний зв'язок (-МН--Р(« -ОХ5ЗН) -0-- або --МН-
РІ-5БХОН) -50--), що зв'язує 3-атом вуглецю одного нуклеозиду з 5'-атомом вуглецю сусіднього нуклеозиду. Слід розуміти, що всі таутомерні форми розглянутої сполуки входять у структуру, у якій описано лише одне можливе таутомерне розташування груп сполуки, навіть якщо вони спеціально не вказані. При описі сполук може бути використане будь-яке підходяще таутомерне розташування груп розглянутих сполук. 001021 Слід розуміти, що термін «або її сіль, або сольват, або стереоіїзомер» включає всі перестановки солей, сольватів і стереоізомерів, такі як сольват фармацевтично прийнятної солі стереоїзомера розглянутої сполуки. Слід розуміти, що термін «або її сіль» включає всі перестановки солей. Слід розуміти, що термін «або її фармацевтично прийнятна сіль» включає всі перестановки солей. Слід розуміти, що термін «або її сольват» включає всі перестановки сольватів. Слід розуміти, що термін «або її стереоїзомер» включає всі перестановки стереоізомерів. Слід розуміти, що термін «або її таутомер» включає всі перестановки таутомерів. Таким чином, наприклад, виходить, що включений сольват фармацевтично прийнятної солі таутомера стереоізомера розглянутої сполуки.
Ї00103| «Фармацевтично ефективна кількість» і «терапевтично ефективна кількість» стосуються кількості сполуки, достатньої для лікування конкретного розладу або захворювання,
або одного або більше його симптомів, та/або для запобігання виникнення захворювання або розладу. У відношенні оонкогенних проліферативних розладів, фармацевтично або терапевтично ефективна кількість включає кількість, достатню, серед іншого, для ініціації скорочення пухлини або зниження швидкості росту пухлини. 00104) «Пацієнт» стосується людини й суб'єктів, що не є людиною, особливо ссавців суб'єктів.
ЇО0О10О5)| Термін «лікувати» або «лікування» у цьому контексті означає лікування захворювання або медичного стану в пацієнта, такого як ссавець ( зокрема, людей), який включає: (а) запобігання виникнення захворювання або медичного стану, таке як профілактичне лікування суб'єкта; (5) полегшення захворювання або медичного стану, таке як виключення або ініціація регресії захворювання або медичного стану в пацієнта; (с) пригнічення захворювання або медичного стану, наприклад, за допомогою уповільнення або зупинки розвитку захворювання або медичного стану в пацієнта; або (4) полегшення симптому захворювання або медичного стану в пацієнта. 00106) У цьому контексті термін «виділений» описує розглянуту сполуку, яка знаходиться в середовищі, відмінному від середовища, у якому первинно знаходиться сполука. «Виділена» включає сполуку, які знаходиться у зразках, що містять суттєво більш високу кількість розглянутої сполуки, та/або в яких розглянута сполука є частково або по суті очищеною.
ЇО0О107|У цьому контексті « по суті очищена» стосується сполуки, яка вилучена з її природнього середовища і є очищена принаймні на 60 9о, очищена принаймні на 75 95, очищена принаймні на 80 95, очищена принаймні на 85 956, очищена принаймні на 90 95, очищена принаймні на 95 95, очищена принаймні на 98 95 або очищена більше ніж на 98 95 від інших компонентів, з якими вона була зв'язана природно. 00108) Термін «фізіологічні умови» включає умови, сумісні з живими клітинами, наприклад, переважно водні умови з температурою, рн, солоністю і т.д., які сумісні з живими клітинами.
Ї00109| Перед докладним описом цього винаходу слід розуміти, що цей винахід не обмежений конкретними описаними варіантами реалізації, оскільки вони, звичайно, можуть змінюватися. Також слід розуміти, що вживана в цьому документі термінологія призначена для опису тільки конкретних варіантів реалізації винаходу й не повинна вважатися обмежуючою,
Зо тому що обсяг цього винаходу обмежений тільки доданою формулою винаходу.
Ї00110| Якщо представлений діапазон величин, слід розуміти, що кожне проміжне значення, до десятої частини одиниці нижньої границі діапазону, якщо з контексту явно не випливає інше, між верхньою й нижньою границею цього інтервалу й будь-яке інше задане або проміжне значення в цьому заданому інтервалі, знаходяться у рамках винаходу. Верхня і нижня границі цих менших інтервалів можуть незалежно бути включені в менші інтервали й також знаходяться у рамках винаходу, крім будь-якої спеціально виключеної границі в заданому інтервалі. Якщо заданий інтервал включає одну або обидві границі, то інтервали без однієї або обох границь також включені у винахід.
Ї00111| Зрозуміло, що деякі ознаки цього винаходу, які для ясності описані в контексті окремих варіантів реалізації, можуть бути представлені в комбінації в межах одного варіанта реалізації. З іншого боку, різні ознаки винаходу, які для стислості описано в контексті одного варіанта реалізації, також можуть бути представлені окремо або в будь-якій підходящій субкомбінації. Усі комбінації варіантів реалізації, що стосуються цього винаходу, спеціально включені в цей винахід і описані у цьому документі, як якби всі й кожна комбінація була описана окремо й у явному вигляді, у тому ступені, у якому такі комбінації охоплюють розглянутий предмет, який являє собою, наприклад, сполуки, що представляють собою стабільні сполуки ( тобто сполуки, які можуть бути отримані, виділені, охарактеризовані й випробувані на біологічну активність). Крім того, усі субкомбінації різних варіантів реалізації і їх елементів (наприклад, елементів хімічних груп, перерахованих у варіантах реалізації, що описують такі змінні) також спеціально включені в цей винахід і описані у цьому документі, як якби всі й кожна така субкомбінація була окремо й у явному вигляді описана в цьому документі.
ІЇ0О0112| Якщо не вказане інше, усі технічні й наукові терміни, використовувані в цьому документі, мають те ж значення, що звичайно розуміється фахівцем у цій галузі техніки, до якої належить цей винахід. Хоча при практичному здійсненні або випробуванні цього винаходу можуть бути використані будь-які способи й матеріали, аналогічні або еквівалентні до тих, які описані в цьому описі, далі будуть описані ілюстративні способи й матеріали. Усі публікації, згадані в цьому документі, включені в нього за допомогою посилання для розкриття й опису способів та/або матеріалів, у зв'язку з якими цитуються вказані публікації. 00113) Слід зазначити, що при використанні в цьому документі й доданій формулі винаходу 60 форми однини включають посилання на множину, якщо з контексту очевидно не випливає інше.
Додатково слід зазначити, що може бути складений план формули винаходу, щоб виключити будь-який необов'язковий елемент. У зв'язку із цим передбачається, що дане твердження служить як попередня основа для таких термінів, що виключають, як «винятково», «тільки» і тому подібних у зв'язку з перерахуванням елементів формули винаходу, або для використання «негативних» обмежень. 00114) Зрозуміло, що деякі ознаки цього винаходу, які для ясності описані в контексті окремих варіантів реалізації, можуть бути представлені в комбінації в межах одного варіанта реалізації. З іншого боку, різні ознаки винаходу, які для стислості описано в контексті одного варіанта реалізації також можуть бути представлені окремо або в будь-який підходящій субкомбінації. 00115) Публікації, розглянуті в цьому документі, представлені лише у відношенні їх опису до дати подачі цієї заявки. Інформацію в цьому документі не слід тлумачити як визнання того, що цей винахід не має права датувати таку публікацію більш раннім числом через дію більш раннього винаходу. Більше того, дані представлених публікацій можуть відрізнятися від фактично опублікованих даних, що може потребувати незалежного підтвердження.
ДОКЛАДНИЙ ОПИС СУТІ ВИНАХОДУ
ЇО0116| Як коротко описане вище, у цьому описі представлений твердофазний спосіб одержання олігонуклеотидів за допомогою послідовних циклів зв'язування, що включають зв'язування динуклеотидного димеру з вільною 3'-кінцевою групою (наприклад, З3'-гідроксильною або 3-аміногрупою) ланцюга, що росте. У цілому, синтез проводять від 5'-кінця до 3'-кінця цільової олігонуклеотидної послідовності, і синтез включає принаймні одне зв'язування динуклеотидного димера. Димер може бути зв'язаний з вільною 3'-кінцневою групою зростаючого ланцюга за допомогою будь-якого підходящого хімічного механізму. У деяких випадках димер являє собою 3'-захищений динуклеотид-5'і-фосфорамідитний димер, де динуклеотид може містити будь-який підходящий міжнуклеозидний зв'язок. Олігонуклеотид може містити один або більше фосфорамідатних міжсубодиничних зв'язків (наприклад, оксофосфорамідатний або тіофосфорамідатний зв'язок).
ІЇО0117| У деяких варіантах реалізації олігонуклеотид містить послідовність нуклеозидних субодиниць, що містить принаймні одну субодиницю, визначену формулою:
Зо : В
Ще,
НМ. ВЗ
Бе Ж р ко 0-3 де В являє собою пурин, захищений пурин, піримідин або захищений піримідин, або їх аналог; Х являє собою О або 5; К вибраний із групи, яка складається з водню, алкілу, заміщеного алкілу, арилу, заміщеного арилу, захисної групи фосфату; і КЗ вибраний із групи, яка складається з водню, О-Н2 і галогену, де К: являє собою Н, алкіл, заміщений алкіл (наприклад, -(СНг)пУМ(СНг)тН, де п дорівнює від 1 до 10, т дорівнює від 0 до 10, і М/ являє собою 0, 5 або МН) або захисної групи гідроксилу. Слід розуміти, що деякі олігонуклеотиди, що містять субодиницю, описану представленою вище формулою, також можуть існувати в сольовій формі. Такі форми, за умови можливості їх існування, включені в обсяг цього опису. 00118) Розглянуті способи забезпечують зменшену кількість циклів зв'язування в порівнянні зі способами, що включають зв'язування тільки нуклеозидних мономерних субодиниць, і забезпечують зменшену кількість нецільових олігонуклеотидних продуктів синтезу.
Ретросинтетична стратегія, використовувана для одержання цільової олігонуклеотидної послідовності, може бути вибрана залежно від багатьох факторів, таких як довжина й послідовність цільового олігонуклеотиду, для мінімізації кількості конкретних нецільових олігонуклеотидних продуктів синтезу.
ЇО0119|У деяких варіантах реалізації розглянуті способи забезпечують одержання композицій, які містять знижену кількість одного або більше (М-х) продуктів у порівнянні із цільовим розглянутим олігонуклеотидом.
Ї0О0120| У деяких варіантах реалізації будь-які композиції, описані в цьому документі, що містять знижену кількість одного або більше (М-х) продуктів у порівнянні із цільовим розглянутим олігонуклеотидом, є неочищеними. 00121) У цьому контексті термін «(М-х) продукт» (де х являє собою ціле число від 1 до М-1, і
М являє собою кількість нуклеозидних залишків у цільовому олігонуклеотиді) стосується нецільового олігонуклеотиду, отриманому за допомогою розглянутих способів одержання, у якому не вистачає х нуклеозидних залишків, у порівнянні з послідовністю цільового олігонуклеотиду, що має М залишків у довжину. Цільовий олігонуклеотид являє собою продукт, на одержання якого орієнтований розглянутий спосіб одержання. Таким чином, (М-1) продукт являє собою нецільовий олігонуклеотид, у якому не вистачає будь-якого одного нуклеозидного залишку в послідовності цільового олігонуклеотиду. Отже, у деяких випадках термін «(М-1) продукт» стосується різних нецільових олігонуклеотидних продуктів, у кожному з яких не вистачає одного нуклеозидного залишку в порівнянні з послідовністю цільового олігонуклеотиду. У такий же спосіб, термін «(М-х) продукт» стосується багатьох нецільових олігонуклеотидних продуктів, у кожному з яких не вистачає х нуклеозидних залишків у порівнянні з послідовністю цільового олігонуклеотиду. Наприклад, (М-2) продукт являє собою нецільовий олігонуклеотид, у якому не вистачає будь-яких двох нуклеозидних залишків у послідовності цільового олігонуклеотиду. У деяких випадках х залишків є, що прилягають один до одного в порівнянні із цільовою олігонуклеотидною послідовністю. В інших випадках х залишків розташовані окремо один від одного відносно цільової олігонуклеотидної послідовності. Х нуклеозидних залишків може не вистачати в будь-якому положенні цільової послідовності, і вони можуть бути утворені з непрореагованих 3'-кінцевих груп під час циклу зв'язування. (М-х) продукти розглянутих способів можуть містити одну або більше додаткових модифікацій, що виникають у результаті розглянутих способів синтезу, наприклад, модифікація часткового зняття захисту, втрата азотистої основи (наприклад, депуринізація), кепування кінцевої групи, дериватизація синтетичним реагентом (наприклад, фенілацетилування
Зо сульфуючим реагентом) і т.п. Можливі багато модифіковані олігонуклеотиди, залежно від хімічного способу синтезу олігонуклеотиду й використовуваних реагентів. Якщо не вказане інше, усі такі модифікації входять у визначення терміну «(М-х) продукт». 00122) У деяких варіантах реалізації розглянуті способи приводять до зменшення одного або більше нецільових продуктів синтезу олігонуклеотиду, вибраних із частково захищеного продукту або частково захищеного (М-х) продукту, наприклад, олігонуклеотидного продукту, що містить одну або більше захисних груп азотистої основи. У розглянутих олігонуклеотидних композиціях цільова олігонуклеотидна послідовність може бути легше виділена або очищена від інших продуктів, що містять олігонуклеотиди, вказаного способу, наприклад, (М-х) продуктів і продуктів, що не мають азотистої основи. 001231) Варіанти реалізації розглянутих способів і композицій більш докладно описані в представлені нижче розділах.
СПОСОБИ ОДЕРЖАННЯ ОЛІГОНУКЛЕОТИДІВ
00124) У цьому описі представлений спосіб одержання олігонуклеотиду. Розглянуті способи можуть включати принаймні одне зв'язування динуклеотидного димеру з вільною 3'-кінцевою групою зростаючого олігонуклеотидного ланцюга. У розглянутих способах одержання можуть бути використані будь-які підходящі способи й хімічні прийоми синтезу олігонуклеотидів. Хімічні прийоми й розглянуті способи синтезу олігонуклеотидів, які можуть бути адаптовані для застосування в розглянутих способах, включають, але не обмежуються ними, фосфорамідит, Н- фосфонат, фосфодіефір, фосфотриефір, фосфіт-триефір і ті, які описані авторами Ееагоп еї аї. у патенті США 5824793, повний опис якого включено в цей документ за допомогою посилання.
Олігонуклеотидні компоненти сполук згідно із цим винаходом можуть бути синтезовані за допомогою адаптації звичайних протоколів до вибраного хімічного типу. Розглянуті способи синтезу олігонуклеотидів, що мають М3-РБ' фосфорамідатний хімічний склад, включають, але не обмежуються ними, способи, описані в публікації МеСигау еї аї., (1997) Теїганеадгоп І еНегв, 38:207-210 і Ропдгас: 8. сгуагпом, (1999) Теїгапеагоп ГІ ецегз, 49:7661-7664. 00125) Розглянутий олігонуклеотид може бути отриманий із застосуванням розглянутих способів за допомогою послідовного зв'язування, починаючи з 5'-кінця й продовжуючи до 3'- кінця цільової олігонуклеотидної послідовності. 5'-Кінцева нуклеозидна субодиниця може бути приєднана до будь-якої підходящої твердої основи за допомогою необов'язкової зв'язувальної бо групи або 5'-кінцевої групи. Потім зв'язування субодиниці зі зростаючим олігонуклеотидним ланцюгом може бути досягнуте із застосуванням або димерних фосфорамідитів, або мономерних фосфорамідитів. В альтернативному варіанті 5'-кінцева динуклеотидна субодиниця може бути приєднана до будь-якої підходящої твердої основи за допомогою необов'язково зв'язувальної групи або 5'-кінцевої групи. Після приєднання першої субодиниці (наприклад, мономерної або димерної субодиниці) до твердої основи із вказаної субодиниці може бути знятий захист із одержанням вільної, іммобілізованої3З'-кінцевої групи. У деяких випадках вказаний спосіб включає зв'язування основи, зв'язаної з 3'-кінцевою групою, з димером 3'- захищеного динуклеотид-5'--фосфорамідиту. У деяких варіантах реалізації З3'-кінцева група являє собою 3'-гідроксильну групу. У деяких варіантах реалізації 3'-кінцева група являє собою 3'-аміногрупу. 00126) У деяких випадках вказаний спосіб включає стадії: (а) зняття захисту із захищеної 3'- аміногрупи кінцевого нуклеозиду, приєднаного до твердофазної основи, вказане зняття захисту приводить до утворення вільної З3'-аміногрупи; (Б) приведення в контакт вільної 3'-аміногрупи з димером 3-захищеного амінодинуклеотид-тіофосфорамідату або фосфорамідит-5'- фосфорамідиту у присутності нуклеофільного каталізатора з утворенням міжнуклеозидного
М3'-РЕ" фосфорамідитного зв'язку; і (с) окиснення вказаної зв'язки.
І00127| Цільова олігонуклеотидна послідовність може бути синтезована за допомогою ретросинтетичної стратегії, яка включає послідовне зв'язування обох димерних і мономерних субодиниць із 3'-кінцевою групою зростаючого олігонуклеотидного ланцюга. Таким чином, у деяких варіантах реалізації вказаний спосіб додатково включає стадії: (а) зняття захисту із захищеної 3'-аміногрупи кінцевого нуклеозиду, приєднаного до твердофазної основи, вказане зняття захисту приводить до утворення вільної 3'-аміногрупи; (Б) приведення в контакт вільної
З'-аміногрупи з мономером 3'-захищеного амінонуклеозид-5і-фосфорамідиту у присутності нуклеофільного каталізатора з утворенням міжнуклеозидного М3--РБ5 фосфорамідитного зв'язку; і (с) окиснення вказаного зв'язку з одержанням М3'-Рб' фосфорамідатного зв'язку. 00128) У цьому контексті термін «М3'-РБ5' фосфорамідитний зв'язок» стосується проміжної сполуки фосфору (ПІ) фосфорамідатного зв'язку М3-Ре". У цілому, фосфорамідатний зв'язок
М3-РБ" утворюється за допомогою окиснення фосфорамідитного зв'язку МУ3-Ре' до продукту фосфору (М) (наприклад, фосфорамідатний зв'язок М3'-Ро", яка може містити оксо (Р-О) або
Зо тіо (Р-5) групу). У деяких випадках стадія окиснення може бути описана як сульфування фосфорамідитного зв'язку М3'-Р5' з одержанням тіофосфорамідатного зв'язку М3'- Р".
ЇО0О129|У цьому контексті «М3--РБ5 фосфорамідат», «Р5-»М3У фосфорамідат» ( «фосфорамідат» стосуються міжнуклеозидного субодиничного зв'язку, описаного формулою: 3-МН-Р(-ХХОН)-О-5' або її таутомеру, де 3'ї 5 стосуються атомів вуглецю цукрових фрагментів послідовних нуклеозидів, які зв'язані вказаним зв'язком, і де К являє собою водень, алкіл, заміщений алкіл, арил, заміщений арил або захисну групу фосфату, і Х являє собою халькоген, такий як кисень або сірка. Слід розуміти, що якщо К являє собою водень, алкіл, заміщений алкіл, арил, заміщений арил або захисну групу фосфату, то деякі міжнуклеозидні субодиничні зв'язки, описані представленою вище формулою, можуть також існувати в сольовій формі. Такі форми, за умови можливості їх існування, включені в обсяг цього опису. У деяких випадках, якщо Х являє собою сірку, фосфорамідат може бути згаданий як тіофосфорамідат. У деяких випадках, якщо Х являє собою кисень, «фосфорамідат» може бути згаданий як «оксофосфорамідат». У деяких випадках, якщо К являє собою захисну групу фосфату, він може представляти собою алкіл, алкеніл, арил, аралкіл, циклоалкіл або їх заміщені версії. У деяких випадках К являє собою захисну групу фосфату, що містить 10 або менше атомів вуглецю. У деяких випадках, якщо К являє собою захисну групу фосфату, він являє собою алкіл, що має від 1 до 6 атомів вуглецю; електроноакцепторний Д-заміщений етил (наприклад, рД-тригалогенметил-, рВ-ціано-, Вр- сульфо- або В-нітрозаміщений етил); електроноакцепторний заміщений феніл (наприклад, галоген-, сульфо-, ціано або нітрозаміщений феніл); або електроноакцепторний заміщений фенілетил. У деяких варіантах реалізації якщо К являє собою захисну групу фосфату, він являє собою метил, В-ціаноетил або 4-нітрофенілетил. У деяких варіантах реалізації К являє собою водень, метил або р-ціаноетил. Електроноакцепторні замісники, що представляють інтерес, включають, але не обмежуються ними, галоген, ціано, нітро, сульфо або моно-, ди- або тригалогенметил, і т.п. Замісники, що представляють собою атом галогену, звичайно представляють собою фтор, хлор, бром або йод; і в деяких випадках вони представляють собою фтор або хлор. «Електроноакцепторний» означає схильність замісника притягати валентні електрони молекули, частиною якої він є, тобто він є електронегативним, див., наприклад, Магсп, Адмапсей Огдапіс Спетівігу, стор. 16-18 (Чопп УМієу, Мем МоїКк, 1985). 60 Посібник з вибору захисної групи фосфату презентовано в публікації Веаисаде і Іуег,
Темганедоп 48: 2223-2311 (1992). Для зручності, нуклеотидні фосфорамідати іноді позначені в цьому документі нижнім індексом «пр» або «рп» для М3--»РБ5 фосфорамідатів і РУ3--М5' фосфорамідатів, відповідно. Так, «ОпрО» являє собою динуклеотид, у якому 3'-аміноуридин і уридин зв'язані М3--Р5 фосфорамідатним зв'язком. Якщо зв'язок являє собою оксофосфорамідат, то нуклеотидний оксофосфорамідат іноді позначений у цьому контексті нижнім індексом «про» або «орп» для М3-Р5 фосфорамідатів і РУ--М5' фосфорамідатів, відповідно. Аналогічно, нуклеотидні тіофосфорамідати іноді позначені в цьому контексті нижнім індексом «про» або «б5рп» для М3--Р5 тіофосфорамідатів і РЗ--М5' тіофосфорамідатів, відповідно. Аналогічно, 2'--фторзамісники позначені верхнім індексом «Її». Так, «ШепрО» являє собою динуклеотид, у якому 5'-крайній 3'-аміно-2'-фторуридин зв'язаний з уридином М3-Р5' фосфорамідатним зв'язком. Єдиний початковий нижній індекс «р» означає 5'-ємонофосфат, а єдиний замикаючий нижній індекс «п» означає 3'-аміногрупу. 001301 У деяких випадках міжнуклеозидний субодиничний зв'язок описаний формулою: 3-МН-Р(-ХХОМК)-О-5' або являє собою її таутомер, де 3' їі 5' стосуються атомів вуглецю цукрових фрагментів послідовних нуклеозидів, які зв'язані вказаним зв'язком, і де К являє собою водень, і Х являє собою кисень або сірку. Слід розуміти, що для будь-яких олігонуклеотидів, описаних у цьому документі, які містять такий міжнуклеозидний зв'язок, вказані олігонуклеотиди також можуть включати будь-які підходящі сольові форми вказаного зв'язку. Таким чином, вказаний міжнуклеозидний зв'язок може бути в сольовій формі, що містить будь-який підходящий протиїіон.
ЇО0О131| У розглянутих способах можуть бути використані будь-які підходящі стратегії застосування захисних груп для захисту основ, фосфорамідиту, фосфорамідату, 5", 2 та/або 3! груп. Захисні групи, яка представляють інтерес, включають, але не обмежуються ними, захисні групи, описані в публікації ОйКибо еї аї., Ога. Ген, 2010, 12 (11), стор. 2496-2499; і Веаисаде і
Іуег, Темапеагоп 48: 2223-2311 (1992). 00132) У цьому контексті термін «фосфатна захисна група» стосується захисної групи, яка може бути приєднана до фосфорвмісного міжсубодиничного зв'язку олігонуклеотиду. При її наявності, фосфатна захисна група може перешкоджати ( тобто блокувати) взаємодії
Зо фосфорвмісного зв'язку в тому положенні, у якому приєднана фосфатна захисна група.
Розглянутими захисними групами фосфату можуть бути захищені будь-які підходящі фосфорвмісні міжсубодиничні зв'язки (наприклад, зв'язки Р (ІІ) ії Р (М)), включаючи, але не обмежуючись ними, фосфорамідитні, оксофосфорамідатні, тіофосфорамідатні, фосфатні складноефірні, тіофосфатні складноефірні, фосфодіефірні зв'язки й т.п. Захисна група фосфату може бути приєднана до доступного атома кисню фосфорвмісним міжсубодиничним зв'язком.
Як захисна група фосфатну можуть бути використані будь-які підходящі захисні групи. Захисні групи фосфату, яка представляють собою інтерес, включають, але не обмежуються ними, алкіл, алкеніл, арил, аралкіл, циклоалкіл або їх заміщені версії, наприклад, алкіл, що має від 1 до 6 атомів вуглецю, такий як електроноакцепторний В-заміщений етил (наприклад, В- тригалогенметил-, ДВ-ціано-, В-сульфо- або В-нітрозаміщений етил; електроноакцепторний заміщений феніл (наприклад, галоген-, сульфо-, ціано- або нітрозаміщений феніл); або електроноакцепторний заміщений фенілетил, метил, В-ціаноетил або 4-нітрофенілетил. У деяких варіантах реалізації фосфатна захисна група являє собою метил або р-ціаноетил.
Електроноакцепторні замісники, що представляють інтерес, включають, але не обмежуються ними, галоген (наприклад, хлор або фтор), ціано, нітро, сульфо або моно-, ди- або тригалогенметил, і т.п.
І00133| Зі-кінцева група зростаючого олігонуклеотидного ланцюгу може включати 3'- гідроксил, 3З'-аміногрупу або їх захищені версії. Під час синтезу олігонуклеотиду в 3'-кінцевій групі можуть бути використані будь-які підходящі гідроксильні та/або амінозахисні групи. У деяких варіантах реалізації 3'-кінцева група являє собою захищену 3'-аміногрупу, і вказаний спосіб включає зняття захисту або видалення захисної групи з одержанням вільної 3'- аміногрупи. 00134) У цьому контексті термін «вільна аміногрупа» відносно мономерів і димерів означає аміногрупу, здатну взаємодіяти з фосфорамідитною групою мономеру або димеру, що надходить. У деяких варіантах реалізації вільна аміногрупа являє собою первинний амін. Після стадії зняття захисту (наприклад, детритилування) аміногрупа може бути у формі солі (наприклад, солі спряженої основи кислоти, використаної для детритилування). Вказана сіль може бути необов'язково нейтралізована основним розчином, таким як 2 95 триетиламін або піридин в ацетонітрилі, після стадії детритилування. бо 00135) У деяких варіантах реалізації 3'-кінцева група являє собою захищену 3'-гідроксильну групу, і вказаний спосіб включає зняття захисту або видалення захисної групи з одержанням вільної 3-гідроксильної групи. У деяких варіантах реалізації 3З'-кінцева група являє собою захищену 3'-аміногрупу, і вказаний спосіб включає зняття захисту або видалення захисної групи з одержанням вільної 3'-аміногрупи. Захищена 3'-аміно або 3'-гідроксильна група може бути захищена тритильною захисною групою. У деяких варіантах реалізації тритильна захисна група являє собою трифенілметил (Ттг, РизС-). У деяких варіантах реалізації тритильна захисна група являє собою 4,4-диметокситритил (ОМТ). 00136) Зняття захисту з 3'-кінцевої аміно або гідроксильної групи може бути здійснене за допомогою будь-яких підходящих способів. Способи, що представляють собою інтерес, включають, але не обмежуються ними, способи, описані в публікації Веаисаде і Іуег, Теїігапедгоп 48: 2223-2311 (1992). У деяких випадках зняття захисту із захищеної 3'-аміногрупи кінцевого нуклеозиду включає детритилування з одержанням вільної З3'-кінцевої групи, наприклад, каталізоване кислотою детритилування.
Ї00137| У цілому, димерні або мономерні субодиничні фосфорамідити містять захищену 3'- гідроксильну або З3'-аміногрупу, яка є такою ж, як 3'-кінцева група кінцевого нуклеозиду, приєднаного до твердої основи. 3'-захист субодиничних фосфорамідитів, що надходять, перешкоджає небажаній полімеризації ланцюга.
ЇО0138)| У розглянутих способах можуть бути використані будь-які підходящі твердофазні основи. Розглянуті тверді основи включають, але не обмежуються ними, мікрочастинки, отримані зі скла з контрольованим розміром пор (СРО), полістиролу з високим ступенем поперечної зшивки (наприклад, Міорпазе НІ. 400 або СЕ Р'гітег 350), акрилових співполімерів, целюлози, нейлону, декстрану, латексу, поліакролеїну й т.п., такі як описані в наступних ілюстративних посиланнях: Мей. Епгутої!., Зесійоп А, стор. 11-147, тому 44 (Асадетіс Ргев5,
Мем ок, 1976); патенти США Мо 4678814; 4413070; і 4046720; і Роп, гл. 19, у книзі Адгамаї, ед.,
Меїпод3з іп Моїесшіаг Віоіоду, том 20, (Нитапа Ргез5, Тотова, штат Нью-Джерсі, 1993). Додаткові основи, що представляють собою інтерес, включають полістирольні гранули; полістирол, щеплений поліетиленгліколем (наприклад, Тепіаде! М, Карр Роїутеге, Тюбинген, Німеччина); і т.п. Вибір характеристик основи, таких як матеріал, пористість, розмір пор, форма й т.п., і типу використовуваного зв'язувального фрагмента залежить від багатьох факторів, таких як
Зо використовувані захисні групи, довжина кінцевого продукту, кількість кінцевого продукту й т.п.
Ілюстративні зв'язувальні фрагменти описані в Роп еї аї, Віоїесппідиез, 6:768-775 (1988); УМерб, патенті США Мо 4659774; Вагапу еї аї, у міжнародній патентній заявці РСТ/О591/06103; Вгом/п еї аі, У. Спет. бос. боттип., 1989: 891-893; Батна еї аї, Мисівіс Асідє Везеєагсі, 18: 3813- 3821(1990); Веаціє еї аї, Сіїіпіса! Спетівігу, 39: 719-722 (1993); Мазкоз і Бош пет, Мисіевїс Асіа5
Везеєагси, 20: 1679-1684 (1992); і т.п.
ЇО0139| У деяких варіантах реалізації тверді основи, які знаходять застосування в розглянутих способах, включають СРО і полістирол, який щеплений полієтиленгліколем і який має кінцеву аміногрупу (наприклад, ТепіадеІ-пй» "М, Карр Роїутеге, Тюбинген, Німеччина).
Амінопропільна група може бути використана як вставка між СРО і нуклеозидним зв'язком. У деяких випадках зв'язок з 5'і-гідроксилом першого нуклеозиду являє собою сукцинільну групу, яка забезпечує рухливий в основних умовах складноефірний зв'язок, який може бути розщеплений після синтезу за допомогою водного аміаку. 00140) Після зняття захисту зв'язаний з основою нуклеозид може взаємодіяти з димерним або мономерним субодиничним фосфорамідитом з утворенням міжнуклеозидного зв'язку. Слід розуміти, що зв'язаний з основою нуклеозид може стосуватися одного залишку, приєднаного до твердої основи, або може стосуватися кінцевого залишку олігонуклеотидногого ланцюга, приєднаного до основи. 001411) У розглянутих способах можуть бути використані будь-які підходящі хімічні прийоми зв'язування, зв'язувальні реагенти й способи. Докладний посібник з вибору умов зв'язування, захисних груп, твердофазних основ, зв'язувальних груп, реагентів для зняття захисту, реагентів для відщеплення продуктів від твердофазних основ, очищення продукту й т.п., у контексті розглянутих способів, презентовано в літературі, наприклад, саї, ейд., Оіїдописіеоїіде Зупіпебів:
А Ргасіїса! Арргоасії (ІКГІ. Ргез55, Оксфорд, 1984); Атагпаїйй і Вгоот, Спетіса! Кеміем5, том 77, стор. 183-217 (1977); Роп еї аї, Віотесппіднев5, том 6, стор. 768-775 (1988); ОпізикКа вї аї, Мисівїс
Асід5 Кезеагсі, том 10, стор. 6553-6570 (1982); ЕскКвівіп, єд., Оіїдописієоїідев5. апа Апаіодиев: А
Ргасіїсаї Арргоасі! (ІВІ Ргевз5, Охога, 1991), Сгеєпе і Умуцші5 "Ргоїесіїме Сгоцпр5 іп Огдапіс зупіпевів", Зп Еайоп., Уліеу, Мем ХогкК 1999, Магапо, ред, Зупіпезі5 апа Арріїсайопз5 ої ОМА апа
ЕМА (Асадетіс Ргез55, Мем/ МогКк, 1987), Веаисаде і Іуег, Тейгапедгоп 48: 2223-2311 (1992), їі подібних посиланнях. бо 00142) Стадія зв'язування розглянутих способів може бути здійснена в температурному діапазоні від -20 до 200 "С. У деяких випадках реакцію проводять при температурі навколишнього середовища ( близько 15-30 "С). Реакція може бути здійснена додаванням розчину фосфорамідитного димеру або мономеру й розчину активатора (або розчину, що містить фосфорамідитний димер або мономер і активатор) у реакційну посудину, що містить вільну аміногрупу (оліго)нуклеотиду, ковалентно приєднаного до твердої основи. У цілому, розглянуті активатори включають нуклеофільні каталізатори, які заміщають більш стабільну фосфорамідитну аміногрупу з утворенням дуже реакційноздатної (і менш стабільної) проміжної сполуки, яка, у свою чергу, взаємодіє з вільною 3'-аміногрупою зв'язаного із твердою основою олігонуклеотидного М3"-РБ5' фосфорамідату. Потім суміш перемішують такими способами як механічне струшування, продування інертного газу і т.д. В альтернативному варіанті розчин(-и) димеру або мономеру й активатора може бути отриманий і спрямований у вигляді потоку через реакційну посудину (або колону), що містить зв'язаний із твердою основою (оліго)нуклеотид з вільною 3'-кінцевої групою. Мономер і активатор можуть бути змішані заздалегідь, змішані в клапанному блоці підходящого синтезатор, змішані в ємності попередньої активації й при необхідності попередньо врівноважені, або вони можуть бути додані в реакційну посудину окремо. 00143) Активатори, що представляють інтерес, які можуть бути використані в розглянутих способах, включають, але не обмежуються ними, тетразол, 5-(етилтіо)тетразол, 5-(4- нітрофеніл)тетразол, 5-(2-тіофен)тетразол, триазол, хлорид піридинію й т.п., наприклад, активуючі агенти, описані в публікації Веаисаде і Іуег, Теїгапедгоп 48: 2223-2311 (1992); Вете"г еї аї, Мисівїс Асід5 Везвєагсі, 17: 853-864 (1989); Вепзоп, Спет. Веу. 41: 1-61 (1947). У цьому контексті термін «тетразольний активатор» стосується активаторів, які представляють собою тетразол або похідні тетразолу. У деяких варіантах реалізації активатор являє собою тетразол.
Підходящі розчинники включають, але не обмежуються ними, ацетонітрил, тетрагідрофуран, метиленхлорид і т.п. Слід дотримуватися обережності при використанні сухого ( що не містить води) димеру або мономеру, активатора й розчинника на стадії зв'язування, а також відносно розчинника, використовуваного для промивання твердої основи безпосередньо перед стадією зв'язування. 00144) Після зв'язування непрореаговані 3'-аміногрупи зв'язаного з основою зростаючого
Зо ланцюга олігонуклеотиду можуть бути необов'язково кеповані підходящим кепуючим агентом до проведення наступної стадії зняття захисту (наприклад, стадії детритилування) для забезпечення їх інертності на наступних стадіях зв'язування. Вказана стадія кепування може поліпшувати ВЕРХ профіль такого одержання для полегшення очищення, а також може поліпшувати загальний вихід продукту. Кепуючі реагенти, що є придатними для розглянутих способів, включають електрофільні реагенти, такі як оцтовий ангідрид і ізомасляний ангідрид, хлорангідриди кислот, такі як адамантилкарбонілхлорид, півалоїлхлорид і т.п., ізотіоціанати, хлорформіати і т.д. Також є придатними фосфорамідити в комбінації з активатором і з наступним окисненням, а також Н-фосфонатні солі, такі як ізопропіл-Н-фосфонат триетиламонію, використовувані в комбінації із хлорангідридом кислоти, таким як півалоїлхлорид або адамантилкарбонілхлорид. 00145) У деяких варіантах реалізації вказаний спосіб включає окиснення міжнуклеозидного
М3-РБЕ фосфорамідитного зв'язку. У цьому контексті терміни «окиснити», «окиснення», «окисний» і т.п. у відношенні фосфорвмісного міжнуклеозидного зв'язку означають процес або обробку для перетворення атома фосфору, що знаходиться у вказаному зв'язку, з форми фосфору (ІП) у форму фосфору (М). Окиснення міжнуклеозидних зв'язків може бути здійснене в будь-який підходящий момент синтезу, із застосуванням будь-яких підходящих способів. У деяких варіантах реалізації окиснення проводять поетапно, наприклад, під час кожного циклу зв'язування. В інших варіантах реалізації окиснення декількох міжнуклеозидних зв'язків проводять наприкінці синтезу. У деяких випадках окиснення М3'-Р5" фосфорамідитного зв'язку (наприклад, із застосуванням окисного агента на основі йоду/вод) приводить до одержання оксофосфорамідатного зв'язку. В інших випадках окиснення М3'-РБ5' фосфорамідитного зв'язку включає сульфування з одержанням тіофосфорамідатного зв'язку. Сульфування може бути здійснене будь-якими підходящими способами. Розглянуті способи сульфування включають способи, описані в публікації сгуа7опом еї аїІ., ММО2001018015, повний опис якої включено в цей документ за допомогою посилання. Сульфуючі агенти для застосування згідно із цим винаходом включають елементарну сірку, тіурамдисульфіди, такі як тетраетилтіурамдисульфід, ацилдисульфіди, такі як фенацилдисульфід, фосфінотіоїлдисульфіди, такі як 5-Геїга М, ії 1,1- діоксо-ЗН-1,2-бензодитіол-З3-он. У деяких варіантах реалізації сульфування може бути проведене із застосуванням елементарної сірки (58). У деяких варіантах реалізації бо сульфування може бути проведене із застосуванням реагенту Бокажа, за способах, описаних
Іуег єї а!., У. Огдапіс Спетівігу 55:4693-4699, 1990.
Ї00146| Окисні агенти, підходящі у вказаному способі, включають йод, хлор, бром, перкислоти, такі як м-хлорбензойна кислота, гідропероксиди, такі як трет-бутилгідропероксид, етилгідропероксид, метилгідропероксид і т.п., озон, змішані ацилсульфінові ангідриди, такі як
ЗН-2,1-бензоксатіолан-3-он-1-оксид, солі персульфатів, такі як персульфат натрію, амонію й тетрабутиламонію, і т.п., монопероксисульфати, такі як Охопе "М, гіпохлорит натрію та/або інші гіпохлорити, пероксиди, такі як діетилпероксид або біс(триметилсиліл)/упероксид, або пероксид водню, або неводні еквіваленти пероксиду водню, такі як пероксидний комплекс сечовини/водню, і т.д. Інші підходящі окисні агенти, які можуть бути використані для перетворення фосфору (ІІ) у фосфор (У), описані в публікації Веаисаде і Іуег, Теїгапедгоп 48: 2223-2311 (1992).
Ї00147| У деяких випадках окисний або сульфуючий агент може бути схильний до участі в небажаній побічній реакції Арбузова, що протікає паралельно до необхідного окиснення (Веаисаде і Іуег, посилання вище). Побічна реакція Арбузова може приводити до зняття захисту з фосфорамідату, який нестабільний у кислотних умовах на наступних стадіях детритилування, що приводить до фрагментації олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації як окисний агент використовують пероксид водню для мінімізації побічної реакції Арбузова. У деяких варіантах реалізації окиснення включає приведення в контакт олігонуклеотиду з розчином 1,5 905 пероксиду водню, 3,5 95 води, 20 95 піридину й 75 905 ТГФ. 00148) У деяких варіантах реалізації вказаний спосіб включає стадії: (а) зняття захисту із захищеної З3'-аміногрупи кінцевого нуклеозиду, приєднаного до твердофазної основи, вказане зняття захисту приводить до утворення вільної 3'-аміногрупи; (р) взаємодії вільної 3'-аміногрупи з: () димером 3'-захищеного амінодинуклеотид-фосфорамідат-5'-фосфорамідиту; або (ії) мономером 3'-захищеного амінонуклеозид-5'-фосфорамідиту; у присутності нуклеофільного каталізатора з одержанням міжнуклеозидного М3'--Ре' фосфорамідитного зв'язку; (с) окиснення вказаного зв'язку; і (а) повторення стадій (а)-(с) до синтезу полінуклеотиду, де повторення стадій (а)-(с) включає
Зо здійснення стадії (Б)(ї) принаймні один раз.
Ї00149| У деяких варіантах реалізації повторення стадій (а)-(с) включає здійснення стадії (Б) два рази або більше. У деяких варіантах реалізації повторення стадій (а)-(с) включає здійснення стадії (Б)(ї) З рази або більше, наприклад, 4 рази або більше, 5 разів або більше, 6 разів або більше, 7 разів або більше, 8 разів або більше, 9 разів або більше, 10 разів або більше, 15 разів або більше, 20 разів або більше, або навіть 30 разів або більше. У деяких варіантах реалізації повторення стадій (а)-(с) включає здійснення стадії (Б)(ї) на кожній стадії зв'язування. У деяких варіантах реалізації повторення стадій (а)-(с) включає здійснення стадії (Б) на кожній стадії зв'язування, за винятком однієї. У деяких варіантах реалізації повторення стадій (а)-(с) включає здійснення стадії (Б)(ї) один і тільки один раз. У деяких варіантах реалізації повторення стадій (а)-(с) включає здійснення стадії (Б)(ії) два й тільки два рази. 00150) Як описано в цьому документі, слід розуміти, що термін «фосфорамідатний зв'язок» включає оксофосфорамідатні й тіофосфорамідатні зв'язки (наприклад, як показано у Формулі І).
У деяких варіантах реалізації вказаного способу окиснення міжнуклеозидного М3'-Р5' фосфорамідитного зв'язку приводить до утворення оксофосфорамідатного зв'язку. У деяких варіантах реалізації вказаного способу окиснення М3'-Р5" фосфорамідитного зв'язку включає сульфування з одержанням тіофосфорамідатного зв'язку. 00151) У деяких варіантах реалізації вказаного способу олігонуклеотид описаний Формулою (І):
-пр- в 7 І йо нм в х и во о оз и во в
Формула (І) де: кожний В незалежно являє собою пурин, захищений пурин, піримідин або захищений піримідин, або їх аналог; кожний Х незалежно являє собою кисень або сірку; кожний ЕКЗ являє собою водень, фтор, гідроксил, алкокси, заміщений алкокси або захищений гідроксил;
Ве являє собою аміно, гідроксил, захищений аміно, захищений гідрокси, -О-І -2 або -МН-Ї -7; кожний ГІ. незалежно являє собою необов'язковий лінкер; кожний 2 незалежно являє собою Н, ліпід, основу, носій, олігонуклеотид, полімер, поліпептид, мітку, що виявляється, або маркер;
Е являє собою водень, алкіл, заміщений алкіл, арил, заміщений арил або захисну групу фосфату; і п являє собою ціле число від 1 до 1000. Якщо К являє собою водень, алкіл, заміщений алкіл, арил, заміщений арил або захисну групу фосфату, слід розуміти, що деякі олігонуклеотиди Формули (І) також можуть існувати в сольовій формі. Такі форми, за умови можливості їх існування, включені в обсяг цього опису. 001521 У деяких варіантах реалізації Формули (І) кожний КЗ являє собою водень. У деяких варіантах реалізації Формули (І) кожний КЗ являє собою фтор. У деяких варіантах реалізації
Формули (І) кожний ЕКЗ являє собою гідроксил. 00153) У деяких варіантах реалізації Формули (І) Е5 являє собою аміно. У деяких варіантах реалізації Формули (І) 5 являє собою гідроксил.
ЇО0154| У деяких варіантах реалізації Формули (І) кожний К являє собою водень. Слід розуміти, що якщо К являє собою водень, то фосфатний зв'язок може мати заряд у водних умовах, таких як фізіологічні умови. Таким чином, слід розуміти, що олігонуклеотиди Формули (І) також можуть включати будь-які підходящі сольові форми вказаного зв'язку. Отже, міжнуклеозидний зв'язок Формули (І) може бути в сольовій формі, що містить будь-який
Зо підходящий протиїіон. У деяких варіантах реалізації Формули (І) кожний К являє собою алкіл або заміщений алкіл. У деяких варіантах реалізації Формули (І) кожний КЕ являє собою арил або заміщений арил. У деяких варіантах реалізації Формули (І) кожний К являє собою захисну групу фосфату.
ЇО0155)| У деяких варіантах реалізації Формули (І) 2 являє собою Н. У деяких варіантах реалізації Формули (І) 2 являє собою ліпід (наприклад, як описано в цьому документі). У деяких випадках ліпід являє собою жирну кислоту (наприклад, як описано в цьому документі). У деяких варіантах реалізації Формули (І) 7 являє собою основу. У деяких варіантах реалізації Формули () 7 являє собою носій. У деяких варіантах реалізації Формули (І) 7 являє собою олігонуклеотид. У деяких варіантах реалізації Формули (І) 7 являє собою полімер. У деяких випадках полімер являє собою ПЕГ. У деяких варіантах реалізації Формули (І) 7 являє собою поліпептид. У деяких варіантах реалізації Формули (І) 7 являє собою мітку, що виявляється. У деяких варіантах реалізації Формули (І) 2 являє собою маркер. 00156) У деяких варіантах реалізації Формули (І) Г. відсутній.
Ї00157| У деяких варіантах реалізації кожний В незалежно вибраний з А, С, б, Т і О або їх захищеної версії.
00158) У деяких варіантах реалізації Формули (І) п являє собою ціле число від 1 до 500, наприклад, від 1 до 100, від 1 до 75, від 1 до 50, від 1 до 40, від 1 до 30, від 1 до 20, від 1 до 15, від 1 до 10 або від 4 до 10. У деяких варіантах реалізації п являє собою ціле число від 1 до 100, наприклад, від 5 до 50, від 10 до 50, від 10 до 40, від 10 до З0, від 10 до 25, від 10 до 20, від 12 до 18 або від 12 до 16. У деяких варіантах реалізації п дорівнює 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24 або 25.
ЇО0159|У деяких варіантах реалізації вказаного способу олігонуклеотид містить послідовність нуклеозидних субодиниць, комплементарну РНК компоненту людської теломерази, і при цьому принаймні дві нуклеозидні субодиниці з'єднані М3--Р5' фосфорамідатним міжсубодиничним зв'язком.
ЇОО160|У деяких варіантах реалізації вказаного способу олігонуклеотид містить послідовність із 3-50 нуклеозидних послідовних субодиниць, комплементарну РНК компоненту людської теломерази, наприклад, від 5 до 40, від 10 до 40, від 10 до З0, від 10 до 25, від 10 до 20, від 12 до 18 або від 12 до 16 нуклеозидних субодиниць. У деяких варіантах реалізації олігонуклеотид містить послідовність із 10 або більше послідовних нуклеозидних субодиниць, комплементарну РНК компоненту людської теломерази. У деяких варіантах реалізації олігонуклеотид містить послідовність із 7 або більше послідовних нуклеозидних субодиниць, наприклад, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 або 17 послідовних нуклеозидних субодиниць. У деяких варіантах реалізації олігонуклеотид містить послідовність із 11-18, наприклад, 11-16 послідовних нуклеозидних субодиниць, комплементарну РНК компоненту людської теломерази.
ЇОО161|У деяких випадках вказаного способу М3-зР5 тіофосфорамідатний міжсубодиничний зв'язок описаний наступною структурою: 3-МН-Р(ІЗХОК)-О-5' де К вибраний із групи, яка складається з водню, алкілу, заміщеного алкілу, арилу, заміщеного арилу й захисної групи фосфату. Слід розуміти, що якщо ЕК вибраний із групи, яка складається з водню, алкілу, заміщеного алкілу, арилу, заміщеного арилу й захисної групи фосфату, то деякі міжнуклеозидні зв'язки, описані представленою вище формулою, також можуть існувати в сольовій формі. Такі форми, за умови можливості їх існування, включені в обсяг цього опису.
Зо ЇО0О162|У деяких випадках вказаного способу М3-зРБ5 /тіофосфорамідатний міжсубодиничний зв'язок описаний наступною структурою: 3-МН-Р(ІЗХОК)-О-5' де К являє собою водень. Слід розуміти, що для будь-яких олігонуклеотидів, описаних у цьому документі, які містять такий міжсубодиничний зв'язок, вказані олігонуклеотиди також можуть включати будь-які підходящі сольові форми вказаного зв'язку. Таким чином, вказаний міжсубодиничний зв'язок може бути в сольовій формі, що містить будь-який підходящий протиїіон.
ЇО0О163|У деяких варіантах реалізації вказаного способу олігонуклеотид містить послідовність ТАСОСТТАСАСАА (5БЕО ІО МО:3) У деяких варіантах реалізації всі міжнуклеотидні міжсубодиничні зв'язки послідовності ТАСОСТТАСАСАА (5ЕО ІО МОЗ) представляють собою М3'- Р5" фосфорамідатні міжсубодиничні зв'язки. У деяких випадках усі
М3- РБ" фосфорамідатні міжсубодиничні зв'язки вказаної послідовності представляють собою
М3"- РО" тіофосфорамідатні міжсубодиничні зв'язки (наприклад, зв'язки пр5). У деяких випадках усі М3-- РБ фосфорамідатні міжсубодиничні зв'язки вказаної послідовності представляють собою М3'-- РО" оксофосфорамідатні міжсубодиничні зв'язки (наприклад, зв'язки пр). 00164) У деяких варіантах реалізації вказаного способу полінуклеотид містить кінцеву 3'- аміно або 3'-гідроксигрупу. У деяких варіантах реалізації вказаного способу полінуклеотид містить кінцеву 3'-аміногрупу. У деяких варіантах реалізації вказаного способу полінуклеотид містить кінцеву 3'"-гідроксильну групу.
ЇО0О165|У деяких варіантах реалізації вказаного способу олігонуклеотид описаний структурою:
но он о т
М -р.-.-
КАК о--о о о 5н т
Овен (в) А т о-в-5Н плбееебвобіеттев пролебаво евеСельі о А
МН» де «про» являє собою тіофосфорамідатний зв'язок (наприклад, --МН-А-Р(-ОХЗН)-О-- або її таутомер), що з'єднує 3-атом вуглецю одного нуклеозиду з 5'-атомів вуглецю сусіднього 5 нуклеозиду. 00166) Слід розуміти, що всі варіанти реалізації, що стосуються олігонуклеотиду, також застосовні до сольових форм вказаного олігонуклеотиду.
ЇО0167|У деяких варіантах реалізації вказаного способу олігонуклеотид описаний структурою:
Нн он ГІ т
МАК ло-в-о о о 5н
Ц от вн (в) А
Сх
Щй о-во5н о-(СОіпрвЯпреіпре Паре ГпреАпрепреАпреСпреАпреї | о А
МН» або його сіль; де «про» являє собою тіофосфорамідатний зв'язок (наприклад, --МН-А-Р(-ОХЗН)-О-- або її таутомер, або її сіль), що з'єднує 3'-атом вуглецю одного нуклеозиду з 5'-атомів вуглецю сусіднього нуклеозиду. У деяких варіантах реалізації композиція містить фармацевтично прийнятну сіль сполуки. У деяких випадках композиція містить натрієву сіль сполуки. У деяких варіантах реалізації композиція містить сіль двовалентного катіона й вказаної сполуки, таку як магнієва сіль сполуки. У деяких варіантах реалізації композиція містить сіль тривалентного катіона й вказаної сполуки, таку як алюмінієва сіль сполуки.
ЇО0О168| У деяких варіантах реалізації вказаного способу олігонуклеотид описаний наступною структурою, де кожний М незалежно являє собою водень або будь-який підходящий протиіон солі, кожний х незалежно дорівнює 1, 2 або 3, і п являє собою ціле число від 5 до 13, наприклад, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 або 13, наприклад, п дорівнює 13:
(о)
МН
Ши: 8-в-0- осо о Дав, Мне
Ми
Усик, 5-5-0 Ге) М М
МН се у т (о! о М МН
НІМ СД
8-Р-0-- о ММ сМн, ав; 9
Ми МН ні зх 85-Р-0-ї о ММ сМн, ав; 9
Ми МН ну зр 8-Р-0-ї о ММ Мн, 5-й о
МН нм зе ра 8-Р-0- осо
У у о
МН нм зе ре 8Р-О- осо о - мно
МН Й Я; ! а 8-8-0- ом о "нав,
МА МН
НМ щу 8-8-0- о М М'сМн, о: х 7 МН о, -р-0 ММ о Ге! Мн зм с 8-Р-О ом ав) мно
МН м -р А 8-Р-0-- ом о: є 7 Мне
МН ге і А 8-в-0- ом М "ав,
Х
Мне (М п
У деяких випадках кожний х дорівнює 1. У деяких випадках кожний х незалежно дорівнює 1 або 2. У деяких випадках кожний х незалежно дорівнює 1 або 3. У деяких випадках М'єЄ являє 5 собою водень. 00169) У деяких варіантах реалізації вказаного способу олігонуклеотид описаний наступною структурою й може містити будь-які підходящі катіонні протиіїони солі:
ЇО0170|У деяких варіантах реалізації вказаного способу олігонуклеотид описаний структурою:
в)
Ма" МН о А 8-в-0- ом о о ав, Мн
М Б
ОН пн «1 8-8Р-0- ом
МН о- га 7 в) ів) я
Шев 8-Р-0-і о ММ сМн, ав, 9 ня чно М 8-8Р-0-1 о ММ сМН, ав, 9 я
Ма нм Тер 8-Р-0- о М сМсМн, ка» Ду; я я СО з--0 ол Ше) о ав, 9)
Ма" не 8-в-0- оМо о; я МН»
Ма
З-в-0 Ге! М м о о- рев, гя М мен М(лв 8-8-0-- о ММ Мн, ав, Мо ня 8-Р-0-4 ом с га 7 МН» чн С 8-р-о ом о: х у, Мне
Ма" -
Ко, 5-иР-0 о М М ав, Мне ня
Ма Мн т 8-8-0- ом ав; -
Ма МН»
ЇО0171|У деяких варіантах реалізації вказаного способу С11 нуклеотидний залишок послідовності ТАСОСТТАСАСАА (5БО ІЮО МО:3) отримано з мономеру 3'-захищеного амінонуклеозид-5'-фосфорамідиту. Під терміном «отриманий 3» розуміють, що розглянутий залишок вбудований під час синтезу за допомогою певної субодиниці. У деяких випадках залишки Т1-А10, А12-А13 послідовності ТАСОСТТАСАСАА (5ЕО ІЮ МО:3) отримані з димерів 3'--захищеного амінодинуклеотид-тіофосфорамідат-5'-фосфорамідиту.
Ї00172| У деяких випадках вказаний спосіб включає послідовне зв'язування наступних димерів 3'-захищеного амінодинуклеотид-тіофосфорамідат-5'-фосфорамідиту і мономеру 3- захищеного амінонуклеозид-5'-фосфорамідиту з кінцевою групою твердофазної основи: ТА, 0,
СТ, ТА, СА, С і АА. Слід розуміти, що для простоти захищена фосфорамідитна субодиниця, яка знаходить застосування в реакціях зв'язування розглянутих способів, може бути зображена символами Х' або Х'Х?, де Х' і Х? незалежно представляють собою будь-які підходящі нуклеозиди, зв'язані будь-яким підходящим міжнуклеозидним зв'язком (наприклад, як описано в цьому документі). У розглянутих способах можуть бути використані будь-які підходящі стратегії синтезу. Деякі стратегії що представляють собою інтерес, представлені нижче для демонстрації того, як спосіб одержання цільової олігонуклеотидної послідовності може бути пристосований до конкретних димерних та/або мономерних субодиниць.
Ї00173| Ілюстративні ретросинтетичні стратегії представлені наступними переліками послідовних димерних та/або мономерних субодиниць, представлені для ілюстративної цільової олігонуклеотидної послідовності ТАСОСТТАСАСАА (ЗЕО ІЮ МО:3). Слід розуміти, що вказаний перелік стратегій не є вичерпним, і може бути адаптований для застосування відносно синтезу будь-якого підходящого цільового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації вказаний спосіб включає послідовне зв'язування однією з наступних серій димерів 3'- захищеного амінодинуклеотид-тіофосфорамідат-5-фосфорамідиту та/або мономерів 3- захищеного амінонуклеозид-5'-фосфорамідиту з кінцевою групою твердофазної основи: 001741! ТА, с, с, с, ГТ, ГТ А, С, А, С, А А 00175, Ас, с, с, ГТ, ГТ А, С, А, С, А А 00176 ГТ, А, сс, с, ГТ, ГТ А, С, А, С, А А (00177 ГТ, А, с, а, т, ГА, С, А, С, А А 00178 ГТ, А, с, с, ЕТ, ГТ А, С, А, С, А А 001791, А, с, с, с, ГТ, А, С, А, С, А А
ІОО180| ГТ, А, с, с, С, Т, ТА, С, А, С, А А
ІО0181| ГТ, А, с, с, с, т, ГТ АС, А, С, А А 001821 ГТ, А, с, с, С, Т, Т.А, СА, С, А А
І00183| Т, А, с, с, с, т, ТА, с, АС, А, А 001841, А, с, с, С, Т, Т.А, с, А, СА, А 001851 ГТ, А, с, с, С, Т, ТА, с, А, С, АА 00186) ТА, сс, с, ГТ, Т.А, С, А, С, А, А
І00187| ТА, с, са, Т, Т.А, С, А, С, А, А
Коо) І00188| ТА, с, с, СТ, ГТ, А, С, А, С, А, А
І00189| ТА, с, с, с, ТТ, А, С, А, С, А, А
ІО0190| ТА, с, с, С, Т, ТА, С, А, С, А, А
ІОО191| ТА, с, с, С, т, ГТ, АС, А, С, А, А
І00192| ТА, с, с, с, Т, ГТ. А, ВА, С, А, А
І00193| ТА, с, с, С, т, ГТ. А, С, АС, А, А
І001947ТА, с, с, С, Т, ГТ, А, С, А, СА, А
І00195| ТА, с, с, С, Т, ГТ, А, С, А, С, АА (00196) Т, АС, са, Т, Т.А, С, А, С, А, А (00197 ГТ, АС, с, СТ, Т, А, С, А, С, А, А (001981 ГТ, АС, с, С, ТТ, А, С, А, С, А, А (001991, АС, с, С, Т, ТА, С, А, С, А, А (002001, Ас, с, с, т, ГТ АС, А, С, А, А
І0о2о11Т, Ас, с, с, Т, ГТ. А, ВА, С, А, А (002021, Ас, с, с, т, ГТ А, с, АС, А, А (00203 т, Ас, с, С, Т, ГТ, А, С, А, СА, А (002041, Ас, с, с, Т, ГТ, А, С, А, С, АА 002051 ГТ, А, сс, СТ, Т.А, С, А, С, А, А
І002о6| Т, А, сс, с, ТТ, А, С, А, С, А, А 00207 ГТ, А, сс, с, Т, ТА, с, А, С, А, А (002081, А, сс, с, т, ГТ АС, А, С, А, А (002091, А, сс, с, т, ГТ. А, ВА, С, А, А 002101 ГТ, А, сс, с, т, ГТ А, С, АС, А, А 002111 ГТ, А, сс, с, Т, Т.А, С, А, СА, А (002121, А, са, с, т, ГТ А, С, А, С, АА (00213| Т., А, с, а, ТТ, А, С, А, С, А, А 002141, А, с, а, Т, ТА, С, А, С, А, А (002151, А, с, па, т, ГТ АС, А, С, А, А (00216 Т, А, с, а, т, ГТ. А, ВА, С, А, А 00217 ГТ, А, с, а, т, ГТ А, С, АС, А, А (510) (0021817, А, с, а, Т, Т.А, С, А, СА, А
(002191 Т, А, С, СО, Т, Т, А, С, А, С, АА (002201 Т, А, С, С, СТ, ТА, С, А, С, А, А (0022117, А, С, С, СТ, Т, АС, А, С, А, А (002221Т, А, С, С, СТ, Т, А, СА, С, А, А (00223|Т, А, С, С, СТ, Т, А, С, АС, А, А (002241|Т, А, С, С, СТ, Т, А, С, А, СА, А (002251 Т, А, С, С, СТ, Т, А, С, А, С, АА (002261Т, А, С, С, С, ТТ, АС, А, С, А, А (00227|Т, А, С, С, С, ТТ, А, СА, С, А, А (0022817, А, С, С, С, ТТ, А, С, АС, А, А (002291|Т, А, С, С, С, ТТ, А, С, А, СА, А (002301 Т, А, С, С, С, ТТ, А, С, А, С, АА (002311 Т, А, С, С, С, Т, ТА, СА, С, А, А (002321 Т, А, С, С, С, Т, ТА, С, АС, А, А (002331 Т, А, С, С, С, Т, ТА, С, А, СА, А (002341 Т, А, С, С, С, Т, ТА, С, А, С, АА (0023517, А, С, С, С, Т, Т, АС, АС, А, А (002361 Т, А, С, С, С, Т, Т, АС, А, СА, А (002371 Т, А, С, С, С, Т, Т, АС, А, С, АА (002381 Т, А, С, С, С, Т, Т, А, СА, СА, А (002391 Т, А, С, С, С, Т, Т, А, СА, С, АА (002401 ТА, СС, СТ, Т, А, С, А, С, А, А (002411 ТА, СС, С, ТТ, А, С, А, С, А, А (002421 ТА, СС, С, Т, ТА, С, А, С, А, А (002431 ТА, СС, С, Т, Т, АС, А, С, А, А (002441 ТА, СС, С, Т, Т, А, СА, С. А, А (002451 ТА, СС, С, Т, Т, А, С, АС, А, А (002461 ТА, СС, С, Т, Т, А, С, А, СА, А (002471 ТА, СС, С, Т, Т, А, С, А, С, АА
Зо (002481 ТА, С, СС, ТТ, А, С, А, С, А, А (002491 ТА, С, СС, Т, ТА, С, А, С, А, А (002501 ТА, С, СС, Т, Т, АС, А, С, А, А (002511 ТА, С, СС, Т, Т, А, СА, С, А, А (002521 ТА, С, СС, Т, Т, А, С, АС, А, А
ЗБ (002531 ТА, С, СС, Т, Т, А, С, А, СА, А (002541 ТА, С, СС, Т, Т, А, С, А, С, АА, і т.д. (002551 ТА, СО, СТ, ТА, С, А, С, А, А (00256) ТА, СС, СТ, Т, АС, А, С, А, А (002571 ТА, СС, СТ, Т, А, СА, С, А, А (002581 ТА, СС, СТ, Т, А, С, АС, А, А (002591 ТА, СС, СТ, Т, А, С, А, СА, А (00260) ТА, СС, СТ, Т, А, С, А, С, АА, і т.д. (002611 ТА, СС, СТ, ТА, СА, С, А, А (002621 ТА, СС, СТ, ТА, С, АС, А, А (002631 ТА, СС, СТ, ТА, С, А, СА, А (002641 ТА, СС, СТ, ТА, С, А, С, АА, і т.д. (002651 ТА, С, СО, ТТ, ЛО, АС, А, А (002661 ТА, С, СС, ТТ, АС, А, СА, А (002671 ТА, С, СС, ТТ, АС, А, С, АА
БО (002681 ТА, С, С, СТ, ТА, СА, СА, А (002691 ТА, С, С, СТ, ТА, СА, С, АА (002701 ТА, С, С, СТ, ТА, СА, СА, А (002711 ТА, С, С, С, ТТ, АС, АС, ДА (002721 ТА, С, СС, Т, ТА, СА, СА, А
ББ (002731 ТА, С, СС, Т, ТА, СА, С, АА (002741 ТА, С, СС, Т, ТА, С, АС, АА, і т.д. (002751 Т, А, С, СО, ТТ, АС, АС, ДА (002761 Т, А, СС, С, ТТ, АС, АС, ДА (002771 Т, АС, С, С, ТТ, АС, АС, ДА во (002781 ТА, С, С, С, ТТ, АС, АС, ДА
(002791 Т, АС, о, СТ, Т, АС, АС, АА, і т.д. (002801 Т, АС, ОО, Т, Т, АС, АС, АА, і т.д. (00281) Т, АС, ОО, ТТ, А, б, АС, АА, і т.д. (00282) Т, АС, ОО, ТТ, АС, А, С, АА, і т.д. (00283) Т, Ас, са, ТТ, АС, АС, А, А (00284) Т, Ас, са, ТТ, АС, АС, АА (00285) ТА, с, са, ТТ, АС, АС, АА (00286) ТА, са, с, ТТ, АС, АС, АА (00287) ТА, са, ст, Т, АС, АС, АА (00288) ТА, са, СТ, ТА, с, АС, АА 002891 ТА, 5, СТ, ТА, БА, С, АА або (002901 ТА, са, СТ, ТА, СА, СА, А. 002911 У деяких варіантах реалізації вказаний спосіб включає послідовне зв'язування серій димерів 3'і-захищеного амінодинуклеотид-тіофосфорамідату-5'-фосфорамідит та/або мономерів 3'-захищеного амінонуклеозид-5'-фосфорамідиту з кінцевою групою твердофазної основи, де принаймні останнє зв'язування синтезу являє собою димерне зв'язування. У деяких варіантах реалізації друге від кінця зв'язування й останнє зв'язування представляють собою димерні зв'язування. У деяких випадках, якщо М являє собою парне число, вказаний спосіб включає М/2 димерних зв'язувань. У деяких випадках, якщо М являє собою парне число, вказаний спосіб включає М/2-1 димерних зв'язувань. У деяких випадках, якщо М являє собою парне число, вказаний спосіб включає М/2-2 димерних зв'язувань. У деяких випадках, якщо М являє собою парне число, вказаний спосіб включає М/2-3 димерних зв'язувань. У деяких випадках, якщо М являє собою парне число, вказаний спосіб включає М/2-4 димерних зв'язувань. У деяких випадках, якщо М являє собою парне число, вказаний спосіб включає М/2-5 димерних зв'язувань. У деяких випадках, якщо М являє собою непарне число, вказаний спосіб включає
М/2-1 димерних зв'язувань У деяких випадках, якщо М являє собою непарне число, вказаний спосіб включає М/2-2 димерних зв'язувань. У деяких випадках, якщо М являє собою непарне число, вказаний спосіб включає М/2-3 димерних зв'язувань. У деяких випадках, якщо М являє собою непарне число, вказаний спосіб включає М/2-4 димерних зв'язувань. У деяких випадках,
Зо якщо М являє собою непарне число, вказаний спосіб включає М/2-5 димерних зв'язувань. У деяких випадках, якщо М являє собою непарне число, вказаний спосіб включає М/2-6 димерних зв'язувань. Наприклад, послідовне зв'язування наступних серій димерів 3'-захищеного амінодинуклеотид тіофосфорамідату-5-фосфорамідит та/або мономерів 3'-захищеного амінонуклеозид-5'і-фосфорамідиту з кінцевою групою твердофазної основи: 002921, А, с, а, с, ТТ, ТА, с, А, С, АА (00293| Т, А, с, с, С, Т, Т, А, с, АС, АА 00294, А, с, с, С, Т, Т, А, СА, С, АА 00295 ГТ, А, с, с, с, Т, Т, АС, А, С, АА (00296 Т, А, с, с, С, Т, ТА, С, А, С, АА 00297 ГТ, А, с, с, с, ГТ, А, С, А, С, АА (00298 Т, А, с, с, СТ, ТА, С, А, С, АА (00299| Т, А, с, а, Т, ГТ, А, С, А, С, АА
І0ООЗО0І Т, А, ас, с, Т, ГТ, А, С, А, С, АА
ІООЗО11Т, Ас, с, с, Т, ГТ, А, С, А, С, АА
І0ОЗО2 ТА, С, с, С, Т, Т, А, 6, А, С, АА, і т.д.
І0О3ОЗ| Т, А, с, с, С, Т, Т, АС, АС, АА
ІООЗО41Т, А, с, с, с, ТТ, АС, АС, АА
І0ОЗО5І Т, А, с, с, ТТ, АС, АС, АА
ІООЗОбІ| Т, Ас, са, ТТ, АС, АС, АА 003071 ТА, с, сс, ТТ, АС, АС, АА
І0ООЗО8І ТА, са, с, ТТ, АС, АС, АА
І0ОЗО9| ТА, са, СТ, Т, АС, АС, АА 003101 ТА, са, СТ, ТА, С, АС, АА 00311) ТА, са, СТ, ТА, СА, С, АА.
ЇООЗ312| У деяких варіантах реалізації вказаного способу димер 3'-захищеного амінодинуклеотид-тіофосфорамідат-5'-фосфорамідиту описаний формулою Х'Х?, де Хі хх? незалежно вибрані із захищеного аденіну, захищеного цитозину, захищеного гуаніну, тиміну й урацилу.
Модифіковані ліпідом олігонуклеотиди бо 00313) Для сполучення ліпідного фрагмента І з олігонуклеотидом можуть бути використані різні синтетичні підходи, залежно від природи вибраного зв'язку, включаючи підходи, описані в публікаціях Міга еї аї!., (1995) Віоспетіса єї Віорпузіса Асіа, 1264:229-237, ЗНеа еї аї., (1990)
Мисівїс Асіа5 Нев. 18:3777-3783, і Китр еї а!., (1998) Віосоп). Спет. 9:341-349. Синтез сполук, у яких ліпідний фрагмент спряжений на 5' або 3' кінці олігонуклеотиду, може бути здійснений за допомогою підходящих функціональних груп на відповідному кінці у деяких випадках аміногрупи, які можуть взаємодіяти з карбоновими кислотами, хлорангідридами кислот, ангідридами й активними складними ефірами. Як функціональні групи також можуть бути використані тіольні групи (див. Кирійаг еї аї., (2001) Віоогдапіс апа Меадісіпа! Спетівігу 9:1241- 1247). Аміно- і тіол-модифікатори різної довжини ланцюга для синтезу олігонуклеотидів є в продажі. Олігонуклеотиди, що мають М3--Р5 фосфорамідатні (наприклад, М3--Р5' тіофосфорамідатні) зв'язки, містять 3'-аміногрупи (а не 3'-гідрокси, що зустрічаються в більшості звичайних хімічних структур олігонуклеотидів) і, отже, вказані олігонуклеотиди забезпечують унікальну можливість сполучення ліпідних груп з 3'-кінцем олігонуклеотиду. 00314) Можуть бути використані різні підходи для приєднання ліпідних груп до кінців олігонуклеотидів з М3--РБ5 фосфорамідатною (наприклад, М3--Р5 тіофосфорамідатною) хімічною структурою (див., наприклад, З-пальмітоїламідо-1-0-(4,4'-диметокситритил)-2-О- сукциніллропандіоловий лінкер у таблиці 2). Для приєднання до 3'-кінця спряжені сполуки можуть бути синтезовані за допомогою взаємодії вільної 3'-аміногрупи повністю захищеного олігонуклеотиду, зв'язаного із твердою основою, з відповідним ангідридом кислоти з наступним зняттям захисту за допомогою аміаку й очищенням. В альтернативному варіанті для сполучення ліпідних груп може бути використане зв'язування карбонових кислот ліпідів з вільною 3'-аміногрупою олігонуклеотиду, зв'язаного із твердою основою, із застосуванням зв'язувальних агентів, таких як карбодііміди, НВТ або йодид 2-хлор-1-метилпіридинію. Вказані два способи приводять до одержання амідного зв'язку між ліпідом і олігонуклеотидом. Ліпіди також можуть бути приєднані до олігонуклеотидного ланцюгу із застосуванням фосфорамідитного похідного ліпіду, зв'язаного з олігонуклеотидами під час подовження ланцюгу. Вказаний підхід приводить до одержання фосфорамідатного (наприклад, тіофосфорамідатного) зв'язку, що з'єднує ліпід і олігонуклеотид (наприклад, пропіл- пальмітоїлові й 2-гідроксипропіл-пальмітоїлові сполуки). Інший підхід включає взаємодію вільної
Зо 3З-аміногрупи повністю захищеного олігонуклеотиду, зв'язаного із твердою основою, з підходящим альдегідом ліпіду, з наступним відновленням ціаноборогідридом натрію з одержанням амінного зв'язку.
ЇООЗ315| Для приєднання до 5-кінця олігонуклеотид може бути синтезований (із застосуванням модифікованої, ліпідвмісної твердої основи, 3 наступним синтезом олігонуклеотиду в напрямку від 5 до 3, як описано в публікації Ропдгас; і сгуагпом (1999).
Приклад модифікованої основи представлений нижче. Якщо п-14, жирна кислота являє собою пальмітинову кислоту: взаємодія З-аміно-1,2-пропандіолу з пальмітоїлхлоридом, з наступним диметокситритилуванням і сукцинілуванням приводить до одержання проміжної сполуки, використовуваної для зв'язування із твердою основою. ЕК може представляти собою довголанцюговий алкіламін на склі з контрольованим розміром пор.
АХ
Спо рі
ПКУ ст
Ост х о
Кия сі СВ, Сх дсп Ми торму ол
ДИМЕРИ, ЩО Є ПРИДАТНИМИ ДЛЯ ОДЕРЖАННЯ ОЛІГОНУКЛЕОТИДІВ
Ї0О0ОЗ316) У деяких варіантах реалізації способу одержання олігонуклеотиду вказаний спосіб включає приведення в контакт зв'язаної з основою вільної 3'-кінцевої групи (наприклад, 3'- гідроксильною або 3'-аміногрупи) з динуклеотидної димерної субодиницею з одержанням міжсубодиничного зв'язку. У цілому, динуклеотидний димер є 3'-захищеним і містить 5'-групу,
здатну до зв'язування з 3'-кінцевою групою. У деяких варіантах реалізації динуклеотидний димер містить 5'і-фосфорамідит. Динуклеотидний димер може містити 3'-захищену аміногрупу або 3-захищену гідроксильну групу. У деяких варіантах реалізації динуклеотид описаний формулою Х'Х?, де Х' і Х? незалежно представляють собою будь-які підходящі нуклеозиди (наприклад, А, С, б, Т або І, або їх захищені версії), зв'язані будь-якою підходящим міжнуклеозидним зв'язком (наприклад, як описано в цьому документі). Динуклеотид може містити будь-яку підходящу міжнуклеозидний зв'язок між двома нуклеозидами. Розглянуті міжнуклеозидні зв'язки, які знаходять застосування в динуклеотидних димерах, включають, але не обмежуються ними, фосфодіефірний, фосфотриефірний, метилфосфонатний, фосфорамідатний (наприклад, тіофосфорамідатний) і тіофосфатний зв'язок.
ЇОО317| У деяких випадках динуклеотидний димер являє собою димер 3'-захищеного динуклеотид-5'і-фосфорамідиту або його синтетичний попередник, де динуклеотид описаний формулою Х'Х, де Х! і Х2 незалежно вибрані з А, С, 0, Т і О або їх захищеної версії, іде Х' і хг зв'язані фосфодіефірним, фосфотриефірним, метилфосфонатним, фосфорамідатним (наприклад, тіофосфорамідатним) або тіофосфатним зв'язком, або їх захищеними версіями. 00318) У деяких варіантах реалізації способу одержання олігонуклеотиду вказаний спосіб включає приведення в контакт зв'язаної з основою вільної 3'-аміногрупи з димером 3- захищеного амінодинуклеотид-фосфорамідат-5'і-фосфорамідиту З утворенням міжнуклеозидного М3'-Рб5 фосфорамідатного зв'язку. У розглянутих способах може бути використаний будь-який підходящий димер 3'-захищеного амінодинуклеотид-фосфорамідат-5'- фосфорамідиту або його синтетичні попередники. У деяких випадках димер може бути представлено однією з наступних послідовностей: АА, АС, АС, АТ, АМ, СА, СС, СО, СТ або СИ,
СА, ОС, 00, ОТ або Б), ТА або ША, ТС або ОС, ТО або С і ТТ або ШИ. У деяких випадках димер містить захищені 2'"-гідроксильні групи.
Ї0О0ОЗ319| У деяких варіантах реалізації динуклеотидний димер являє собою динуклеотидну тіофосфорамідатну сполуку, яка описується Формулою (ІІ): в!!! х в' (,; в)
Н н н н "і н
Оо- -вР - -5 / | 2
ВЗ в (о; в)
Н н н Н
Ї" н в'2
Зо Формула (Ії) де В' і В, кожний незалежно, представляють собою пурин, захищений пурин, піримідин або захищений піримідин, або їх аналог; К' являє собою водень, захисну групу або фосфорамідитну групу; В'? являє собою водень або захисну групу; і Е"З являє собою водень, алкіл, заміщений алкіл, арил, заміщений арил або захисну групу. У деяких випадках В' та/або В2 містить захисну групу азотистої основи. Слід розуміти, що якщо КЗ являє собою водень, алкіл, заміщений алкіл, арил, заміщений арил або захисну групу, то деякі динуклеотидні димери, описані Формулою (Ії), можуть також існувати в сольовій формі. Такі форми, за умови можливості їх існування, включені в обсяг цього опису.
ІЇ0ОЗ20| У деяких варіантах реалізації Формули (І) К' являє собою водень. У деяких варіантах реалізації Формули (ІЇ) К" являє собою захисну групу. У розглянутих димерах
Формули (Ії) можуть бути використані будь-які підходящі захисні групи. У деяких варіантах реалізації Формули (І) В"! являє собою захисну групу на основі левулінату. У деяких варіантах реалізації Формули (ІІ) В! являє собою левулінатну захисну групу ( тобто -СОСНа.СНСОСН»). У деяких варіантах реалізації Формули (І) В" являє собою 5'-фосфорамідитну групу.
Ї00321| У деяких варіантах реалізації Формули (Ії) В? являє собою водень. У деяких варіантах реалізації Формули (Ії) КЕ"? являє собою захисну групу. У деяких варіантах реалізації
В"? являє собою тритильну групу (наприклад, трифенілметил (ТТ), монометокситритил (ММТ) або диметокситритил (ОМТ)). У деяких варіантах реалізації Формули (Ії) Кг являє собою захисну групу Ті.
Ї0ОЗ322| У деяких варіант реалізації Формул (І) К' представляти собою захисну фторрозщеплювану захисну групу. При одержанні розглянутих динуклеотидних димерів й їх синтетичних попередників можуть бути використані будь-як підходящі захисні групи. В деяких варіантах реалізації Формули (ІІ) "2 являє собою заміщену піксильну захисну групу, таку як нітро-, фтор-, метил-, трифторметил- та/або метоксизаміщена піксильна захисна група. У деяких варіантах реалізації Формули (ІІ) "2 являє собою піксильну захисну групу ( тобто 9-(9- феніл)ксантеніл).
ІЇ0ОЗ23| У деяких варіантах реалізації Формули (І) КК" являє собою левунілову захисну групу, і В"? являє собою тритильну захисну групу.
Ї00324| У деяких варіантах реалізації Формули (ІЇ) БК'З являє собою водень. У деяких варіантах реалізації Формули (ІІ) К"З являє собою захисну групу. У деяких варіантах реалізації
В'З являє собою 2-ціаноетильну групу.
ЇООЗ25|У деяких варіантах реалізації димер 3-захищеного амінодинуклеотид- фосфорамідат-5'-фосфорамідиту описаний формулою (І): т о-- 6
Ме в! (о)
Мо Н ід) н н 7 Нн
Оо- Р -- -5 рай і в
Ме о
Н Н
Н Н
Мн Н --ї-я
РИ
Формула (ПІ) де В' і В, кожний незалежно, представляють собою пурин, захищений пурин, піримідин або
Зо захищений піримідин, або їх аналог. У деяких випадках В' та/або В? містить захисну групу азотистої основи.
І00326б|У деяких варіантах реалізації димер 3-захищеного амінодинуклеотид- фосфорамідат-5-фосфорамідиту описаний формулою (І):
Зо
- / о--Р
Х в! о (в)
МС ід! ід) н і!
Щі і! о-Р-83 у- ц в:
Те | тк н ід)
Н н
МН Нн
Ї
Формула (ІМ) де В' і В, кожний незалежно, представляють собою пурин, захищений пурин, піримідин або захищений піримідин, або їх аналог; і Б"? являє собою тритильну захисну групу (таку як Ті, ОМТ або ММТ) або піксильну захисну групу.
І0ООЗ27| У деяких варіантах реалізації Формул (ІІ) або (ІІ) В' ії В, кожний незалежно, вибрані із захищеного аденіну, захищеного цитозину, захищеного гуаніну, тиміну й урацилу. У деяких варіантах реалізації Формул (ІІ) або (І) В'ї В, кожний незалежно, вибрані з А(В7), А(ЮМЕ),
С(В7), с(ізобутирил), Т і 3. У деяких варіантах реалізації Формул (ІІ) або (ІП) В' являє собою
А(В2). У деяких варіантах реалізації Формул (ІІ) або (І) В' являє собою А(МЕ). У деяких варіантах реалізації Формул (ІІ) або (ІІ) В' являє собою С(В2). У деяких варіантах реалізації
Формул (Ії) або (ІІ) В' являє собою С(ізобутирил). У деяких варіантах реалізації Формул (ІЇ) або (І) В' являє собою Т або |. У деяких варіантах реалізації Формул (Ії) або (ІІІ) В? являє собою
А(В7) або А(ОМРЕ). У деяких варіантах реалізації Формул (Ії) або (І) В? являє собою С(В2). У деяких варіантах реалізації Формул (І) або (І) В? являє собою (з(ізобутирил). У деяких варіантах реалізації Формул (ІІ) або (ПІ) В? являє собою Т або и.
ІООЗ28) У деяких варіантах реалізації Формул (ІЇ) або (ІІ) В' являє собою А(В27) або А(ОМЕ), і Вг являє собою А(В7) або А(ОМЕ). У деяких варіантах реалізації Формул (ІІ) або (ІІ) В' являє собою А(В2) або А(ОМЕ), і В? являє собою С(В2). У деяких варіантах реалізації Формул (ІІ) або (І) В' являє собою А(В7) або А(МЕ), і В? являє собою С(ізобутирил). У деяких варіантах реалізації Формул (ІЇ) або (ІІ) В' являє собою А(В2) або А(ОМЕ), і Ве? являє собою Т або |). 00329) У деяких варіантах реалізації Формул (Ії) або (І) В' являє собою С(В2), і В? являє собою А(В7) або А(ОМЕ). У деяких варіантах реалізації Формул (І) або (І) В' являє собою С(В7), і В? являє собою С(В2). У деяких варіантах реалізації Формул (Ії) або (ІІ) В' являє собою
С(В2), і В являє собою (Ф(ізобутирил). У деяких варіантах реалізації Формул (І) або (ПІ) В' являє собою С(В2), і В? являє собою Т або |.
ЇООЗЗ0І У деяких варіантах реалізації Формул (ІЇ) або (ІІ) В' являє собою С(ізобутирил), і В? являє собою А(В7) або А(МРЕ). У деяких варіантах реалізації Формул (ІІ) або (ІП) В' являє
Зо собою С(ізобутирил), і В? являє собою С(В2). У деяких варіантах реалізації Формул (Ії) або (І)
В' являє собою (Фс(ізобутирил), і Вг являє собою Фс(ізобутирил). У деяких варіантах реалізації
Формул (ІЇ) або (ІІІ) В' являє собою Сс(ізобутирил), і В2 являє собою Т або |.
Ї0ООЗ3З1) У деяких варіантах реалізації Формул (ІІ) або (ІІІ) В' являє собою Т або у, і В? являє собою А(В7) або А(ОМРЕ). У деяких варіантах реалізації Формул (ІІ) або (ІІ) В' являє собою Т або М, ії В? являє собою С(В2). У деяких варіантах реалізації Формул (ІІ) або (ІІІ) В' являє собою
Т або Ц, і В? являє собою С(ізобутирил). У деяких варіантах реалізації Формул (ІІ) або (І) В' являє собою Т або |, і В? являє собою Т або М. Слід розуміти, що кожної з варіантів реалізації
Формул (Ії) або (ІІ), описаний у цьому документі, також може бути застосований відносно
Формули (ІМ).
00332) Будь-які димери, описані в цьому документі, можуть бути адаптовані для застосування в розглянутих способах. Розглянуті димери можуть бути отримані відповідно до будь-яких підходящих способів з будь-яких підходящих нуклеозидних мономерів. Нуклеозидні мономери, що представляють собою інтерес, які знаходять застосування при одержанні розглянутих нуклеозидних димерів, включають, але не обмежуються ними, мономери 16, 17, 12 і 13, які зображені на схемах синтезу, описаних у цьому документі. Розглянуті динуклеотидні димери включають нефосфітиловані димери, які знаходять застосування при одержанні розглянутих фосфітилованих динуклеотидних димерів, такі як димери 18 і 19, які знаходять застосування при одержанні фосфітилованих динуклеотидних димерів, таких як 20, або димер 14, який знаходить застосування при одержанні фосфітилованих динуклеотидних димерів, таких як 15.
ЇООЗ333| У деяких варіантах реалізації димери Формул (ІІ) і (ІМ) одержують способом, представленим на наступній схемі: 16 о. В! вх о. В!
Ї --- КЗ
Нм НМ й 16 в'я 1
Ме о. в
СМ
С у
А тот Ні
СМ
Ж й. в-во
НМ. дит (в) 17 (Ф) в2 - - 6 ж - - - 18 и
Зв'язування нуклеозидного амідиту 8 Х
Сульфування ні "в ол
Ов! у
З ну /- ни няття захисту СМ
РО р ди см ---тше-- : 5-5-0
Ге! Фосфітилування о. в о
Нм, 5 в' НМ 7 15 і: де В' і В, кожний незалежно, представляють собою пурин, захищений пурин, піримідин або захищений піримідин, або їх аналог; К"» являє собою водень або захисну групу аміну; К'" являє собою захисну групу аміну; і К'5 являє собою захисну групу гідроксилу. У деяких варіантах реалізації КК!» являє собою водень. У деяких варіантах реалізації мономеру 16 К'5 являє собою силіл. У деяких варіантах реалізації мономеру 16 КЗ являє собою ТВОМ5 (трет- бутилдиметилсиліл). У деяких варіантах реалізації мономеру 17 К'"" являє собою тритил (ТО). У деяких варіантах реалізації мономеру 17 КЕ!" являє собою монометокситритил (ММТ).
Ї00О334| У деяких варіантах реалізації мономеру 17 К'' являє собою диметокситритил
(ОМТ). У деяких варіантах реалізації мономеру 17 К'"" являє собою піксил. У деяких варіантах реалізації димерів 18-20 ВЩВ'" являє собою тритил (Ті). У деяких варіантах реалізації димерів 18- 20 В'" являє собою монометокситритил (ММТ). У деяких варіантах реалізації димерів 18-20 В"" являє собою диметокситритил (ОМТ). У деяких варіантах реалізації димерів 18-20 В" являє собою піксил.
У деяких варіантах реалізації димери Формул (ІП) ії (ІМ) одержують за способом, представленим на наступній схемі, де мономер 13 одержують із 11 через мономер 12 і зв'язують із нуклеозидним амідитом з одержанням димерів 14, які перетворюють у димер 15: о. в! О. в: но Захист МН» не Левулінатний захист
ЧУ - 5 :4.3- У - А "ИРБА:-"ти СВТВТ-ії Й -И3З на НМ лм віз 0072 (в)
Ов!
Ов! Ге) й (в) ' - о Зняття захисту в 3-МН» ніх с - - 5 / вн М
Н Зв'язування нуклеозидного амідиту 8-в-077 "в Сульфування б 13 (Ф) в2
НМ. д'ї о ем
Д в. о в'
Зняття захисту в У-ОН М иа - 65 -2- 6 «| - ---м» Ж КУ
Щі
Фосфі ання СМ фітилув в-во в)
НМ. и і: де В' і В, кожний незалежно, представляють собою пурин, захищений пурин, піримідин або захищений піримідин, або їх аналог; і КЗ ї В"", кожний незалежно, представляють собою захисну групу. У деяких варіантах реалізації мономерів 12 і 13 К"З являє собою тритил. У деяких варіантах реалізації мономерів 12 і 13 К"З являє собою піксил. У деяких варіантах реалізації димерів 14 і 15 КК"? являє собою тритил. У деяких варіантах реалізації димерів 14 і 15 КК" представляє соой диметокситритил. У деяких варіантах реалізації димерів 14 і 15 К"" являє собою монометокситритил. У деяких варіантах реалізації димерів 14 і 15 КК" являє собою піксил.
Мономери, що представляють собою інтерес, які знаходять застосування при одержанні розглянутих динуклеотидних димерів згідно зі способами, описаними в цьому документі, включають, але не обмежуються ними:
СМ о ри: У: ою
ХУ їі
Р. о. В
Ом я с
Мео с
ОМе
СМ а о) в
НМ Ф о
Ов
СХ стру ване о Нам
Ге! (в) о) в р тони зртеи о З в) -
НК в нм Ф кисе (С
Кк 2 в (6) (в) в є в) ї-
НМ У
ОМе де В являє собою пурин, захищений пурин, піримідин або захищений піримідин, або їх аналог, і К являє собою водень або алкіл (наприклад, метил) або галоген (наприклад, бром). У деяких випадках В вибраний з А(В2), С(ІВи), Т, А(ОМЕ), С(В2) або |.
КОМПОЗИЦІЇ ОЛІГОНУКЛЕОТИДІВ
Ї0ООЗЗ5І| Крім цільового олігонуклеотиду, під час синтезу олігонуклеотиду можуть бути отримані різні нецільові продукти синтезу олігонуклеотиду. Побічні продукти, які можуть бути присутні у препаратах олігонуклеотиду, включають, але не обмежуються ними, продукти делеції (наприклад, продукти, що не мають одного або більше нуклеозидних залишків), продукти, які містять одну або більше захисних груп, терміновані продукти (наприклад, продукти, які містять кеповану олігонуклеотидну ланцюг), продукти, які не мають одного або більше азотистих основ, продукти, які містять частково окиснені фосфорамідитні зв'язки, і продукти, які містять частково сульфовані зв'язки. У цьому контексті цільовий олігонуклеотид стосується олігонуклеотидної послідовності, що представляє інтерес, яка являє собою цільовий продукт описаного способу одержання. У цьому контексті терміни «нецільовий продукт» і «побічний продукт» використані взаємозамінно й стосуються будь-якого продукту, що містить олігонуклеотид, який не є цільовим продуктом і який може утворюватися під час або після циклів синтезу цільового олігонуклеотиду. 00336) Розглянуті способи забезпечують одержання композицій з поліпшеною чистотою цільового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації композиція містить 50 95 або більше за масою цільового олігонуклеотиду, наприклад, близько 55 95 або більше, близько 60 95 або більше, близько 65 95 або більше, близько 70 95 або більше, близько 75 95 або більше, близько 80 95 або більше, близько 85 95 або більше, близько 90 95 або більше або навіть близько 95 95 або більше за масою цільового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації композиція містить 50 95 або більше за масою цільового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації композиція містить 55 95 або більше за масою цільового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації композиція містить 60 95 або більше за масою цільового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації композиція містить 65 95 або більше за масою цільового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації композиція містить 70 95 або більше за масою цільового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації композиція містить 75 96 або більше за масою цільового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації композиція містить 80 95 або більше за масою цільового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації композиція містить 85 95 або більше за масою цільового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації композиція містить 90 до або більше за масою цільового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації композиція містить 95 95 або більше за масою цільового олігонуклеотиду.
ЇОО337| У деяких варіантах реалізації розглянуті способи забезпечують ефективність зв'язування 95 95 або більше, наприклад, 96 95 або більше, 97 95 або більше, 98 95 або більше, або навіть 98 95 або більше.
ЇООЗ38| У деяких варіантах реалізації розглянуті способи забезпечують середню ефективність зв'язування, яка на 0,5 95 або більше, наприклад, на 0,75 95 або більше, на 1,0 95 або більше, на 1,25 95 або більше, на 1,5 95 або більше, на 1,75 95 або більше, на 2,0 95 або більше, на 2,5 96 або більше або навіть на З 95 або більше вище середньої ефективності зв'язування в контрольному синтезі, проведеному із застосуванням тільки мономерних субодиниць. У деяких варіантах реалізації розглянуті способи забезпечують ефективність зв'язування 96 95 або більше. У деяких варіантах реалізації розглянуті способи забезпечують
Зо ефективність зв'язування, яка на 2 95 або більше вище, чим ефективність зв'язування в контрольному синтезі, проведеному із застосуванням тільки мономерних субодиниць. 003391 Після синтезу розглянуті композиції можуть бути піддано одній або більше стадіям очищення (наприклад, ВЕРХ хроматографія, афінна хроматографія, іонообмінна хроматографія, гель-фільтрація і т.д.), наприклад, для видалення одного або більше побічних продуктів із цільового олігонуклеотиду. Слід розуміти, що в розглянутих композиціях знижені кількості побічних продуктів та/або збільшена кількість цільового нуклеотиду, забезпечувані розглянутими способами одержання, можуть стосуватися таких кількостей і до такої чистоти, які отримані безпосередньо після синтезу й до проведення будь-якої додаткової стадії очищення або розділення (наприклад, ВЕРХ хроматографії). Таким чином, у деяких випадках розглянуті композиції можуть бути згадані як препарати синтезу, наприклад, неочищені препарати синтезу. Під «неочищеною» розуміють, що відносно композиції не було виконано ніяких стадій хроматографічного очищення. Хроматографічне очищення стосується будь-якого підходящого способу очищення, який включає абсорбцію цільового полінуклеотиду на хроматографічній основи з наступним елююванням цільового полінуклеотиду. У деяких випадках хроматографічне очищення стосується хроматографічного очищення із оберненою фазою.
Ї00340)| Розглянуті способи забезпечують одержання композицій, що містять знижену кількість одного або більше побічних продуктів. Під зниженою кількістю розуміють, що кількість за масою побічного продукту в композиції відносно цільового олігонуклеотиду знижена в порівнянні з контрольним синтезом, наприклад, синтезом, у якому олігонуклеотид одержують із застосуванням тільки мономерного зв'язування. У деяких варіантах реалізації знижена кількість побічного продукту становить близько 20 95 або менше відносно кількості за масою цільового олігонуклеотиду, наприклад, близько 15 95 або менше, близько 10 95 або менше, або близько 5 до або менше відносно кількості за масою цільового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації знижена кількість побічного продукту становить 20 95 або менше відносно кількості за масою цільового олігонуклеотиду, наприклад, 15 95 або менше, 10 95 або менше, 9 95 або менше, 8 95 або менше, 7 95 або менше, 6 95 або менше, 5 95 або менше, 45 або менше, З 95 або менше, 2 95 або менше, або навіть 1 95 або менше відносно кількості за масою цільового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації побічний продукт являє собою (М-х) продукт. бо Ї00341| Розглянуті способи одержання можуть забезпечувати одержання композицій, що мають знижену кількість одного або більше (М-х) продуктів відносно цільового олігонуклеотиду, що представляє інтерес, де х являє собою ціле число від 1 до М-1, і М являє собою кількість нуклеозидних залишків у цільовому олігонуклеотиді. Отже, (М-1) продукт може стосуватися будь-якого й усіх олігонуклеотидних продуктів, у яких не вистачає одного нуклеотидного залишку в порівнянні із цільовим олігонуклеотидом (наприклад, М продуктом). Отже, (М-2) продукт стосується будь-якого й усіх олігонуклеотидних продуктів, у яких не вистачає двох нуклеотидних продуктів у порівнянні із цільовим олігонуклеотидом (наприклад, М-продуктом). У деяких варіантах реалізації побічний продукт являє собою (М-1) продукт. У деяких варіантах реалізації побічний продукт являє собою (М-2) продукт. У деяких варіантах реалізації побічний продукт являє собою (М-3) продукт. У деяких варіантах реалізації побічний продукт являє собою (М-4) продукт. У деяких варіантах реалізації побічний продукт являє собою (М-5) продукт. У деяких варіантах реалізації побічний продукт являє собою (М-б6) продукт. У деяких варіантах реалізації побічний продукт являє собою (М-7) продукт. 00342) У деяких варіантах реалізації будь-які композиції, описані в цьому документі, що містять знижену кількість одного або більше (М-х) продуктів у порівнянні із цільовим розглянутим олігонуклеотидом, є неочищеними. 00343) У деяких варіантах реалізації розглянуті композиції містять низьке співвідношення (М-1) продукту до цільового олігонуклеотидного продукту. У деяких випадках низьке співвідношення становить менше (2,0 х М) частин на 100 частин за масою (М-1) продукту відносно цільового олігонуклеотиду, де М стосується кількості нуклеотидних залишків у цільовій олігонуклеотидної послідовності. У деяких варіантах реалізації вказане співвідношення становить менше (1,9 х М) частин на 100 частин за масою (М-1) продукту відносно цільового олігонуклеотиду, наприклад, менше (1,8 х М) частин на 100 частин, менше (1,7 х М) частин на 100 частин, менше (1,6 х М) частин на 100 частин, менше (1,5 х М) частин на 100 частин, менше (1,4 х М) частин на 100 частин, менше (1,3 х М) частин на 100 частин, менше (1,2 х М) частин на 100 частин, менше (1,1 х М) частин на 100 частин, менше (1,0 х М) частин на 100 частин, менше (0,9 х М) частин на 100 частин, менше (0,8 х М) частин на 100 частин, менше (0,7 х М) частин на 100 частин, менше (0,6 х М) частин на 100 частин, менше (0,5 х М) частин на 100 частин, менше (0,4 х М) частин на 100 частин, менше (0,3 х М) частин на 100 частин, менше (0,2 х М) частин на
Зо 100 частин або навіть менше (0,1 х М) частин на 100 частин за масою (М-1) продукту відносно цільового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації розглянуті композиції мають низьке співвідношення, що становить менше (1,5 х М) частин на 100 частин за масою (М-1) продукту відносно цільового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації розглянуті композиції мають низьке співвідношення, що становить менше (1,2 х М) частин на 100 частин за масою (М-1) продукту відносно цільового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації розглянуті композиції мають низьке співвідношення, що становить менше (1,0 х М) частин на 100 частин за масою (М-1) продукту відносно цільового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації розглянуті композиції мають низьке співвідношення, що становить менше (0,5 х М) частин на 100 частин за масою (М-1) продукту відносно цільового олігонуклеотиду. 00344) У деяких варіантах реалізації розглянуті композиції містять низьке співвідношення (М-2) продукту до цільового олігонуклеотидного продукту. У деяких випадках низьке співвідношення становить менше (2,0 х М) частин на 100 частин за масою (М-2) продукту відносно цільового олігонуклеотиду, де М стосується кількості нуклеотидних залишків у цільовій олігонуклеотидній послідовності У деяких варіантах реалізації вказане співвідношення становить менше (1,9 х М) частин на 100 частин за масою (М-2) продукту відносно цільового олігонуклеотиду, наприклад, менше (1,8 х М) частин на 100 частин, менше (1,7 х М) частин на 100 частин, менше (1,6 х М) частин на 100 частин, менше (1,5 х М) частин на 100 частин, менше (1,4 х М) частин на 100 частин, менше (1,3 х М) частин на 100 частин, менше (1,2 х М) частин на 100 частин, менше (1,1 х М) частин на 100 частин, менше (1,0 х М) частин на 100 частин, менше (0,9 х М) частин на 100 частин, менше (0,8 х М) частин на 100 частин, менше (0,7 х М) частин на 100 частин, менше (0,6 х М) частин на 100 частин, менше (0,5 х М) частин на 100 частин, менше (0,4 х М) частин на 100 частин, менше (0,3 х М) частин на 100 частин, менше (0,2 х М) частин на 100 частин або навіть менше (0,1 х М) частин на 100 частин за масою (М-2) продукту відносно цільового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації розглянуті композиції мають низьке співвідношення, що становить менше (1,5 х М) частин на 100 частин за масою (М-2) продукту відносно цільового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації розглянуті композиції мають низьке співвідношення, що становить менше (1,2 х М) частин на 100 частин за масою (М-2) продукту відносно цільового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації розглянуті композиції мають низьке співвідношення, що становить менше (1,0 х М) частин на 100 частин за бо масою (М-1) продукту відносно цільового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації розглянуті композиції мають низьке співвідношення, що становить менше (0,5 х М) частин на 100 частин за масою (М-2) продукту відносно цільового олігонуклеотиду. 00345) У деяких варіантах реалізації композиції містять (М-1) продукт у кількості 20 95 або менше відносно загального вмісту нецільових олігонуклеотидів у композиції, наприклад, 15 90 або менше, 10 95 або менше, або навіть 5 95 або менше відносно загального вмісту нецільових олігонуклеотидів. 00346) За допомогою способів, описаних у цьому документі, може бути отримана будь-яка із численних композицій олігонуклеотидів. Багато класів і типи олігонуклеотидів представляють собою інтерес для одержання із застосуванням розглянутих способів (наприклад, описаних у цьому документі). Олігонуклеотиди, що є придатними для одержання згідно з розглянутими способами, включають, але не обмежуються ними, антисмислові олігонуклеотиди, РНК олігонуклеотиди, міРНК олігонуклеотиди, РНКІ олігонуклеотиди, ДНК аптамери, мікроРНК і т.п.
Олігонуклеотиди, комплементарні РНК компоненту теломерази
І00347| Аспекти цього опису включають сполуки й композиції, що містять олігонуклеотиди, комплементарні РНК компоненту людської теломерази, а також способи їх одержання. Вказані сполуки можуть інгібувати активність теломерази в клітинах з високою ефективністю, і мають характеристики клітинного поглинання. 00348) Як коротко описано вище, розглянуті способи забезпечують можливість зниження кількості нецільових олігонуклеотидних продуктів синтезу. У деяких випадках розглянуті способи забезпечують одержання збільшених кількостей цільового олігонуклеотидного продукту синтезу. У деяких варіантах реалізації розглянуті способи забезпечують одержання композицій, які містять знижену кількість одного або більше (М-х) продуктів у порівнянні із цільовим розглянутим олігонуклеотидом. У таблиці 1 представлені кількості деяких нецільових олігонуклеотидних продуктів, що представляють інтерес.
Ї00О349| У деяких варіантах реалізації будь-які композиції, описані в цьому документі, що містять знижену кількість одного або більше (М-х) продуктів у порівнянні із цільовим розглянутим олігонуклеотидом, є неочищеними. 003501 Таблиця 1. Вміст олігонуклеотидних продуктів у розглянутих композиціях. Розглянуті композиції можуть містити один або більше наступних компонентів у кількостях, вказаних у таблиці 1.
Таблиця 1 . . Діапазон . . |Діапазон відносно й
Граничні кількості ільовВогО відносно
Фо у композиції |відносно цільового ці цільового
Продукт продукту ( за (за масою) продукту масою) продукту ( за (за масою) й масою)
Олігонуклеотиди й іметельстат 95 або більше, 95 або більше, 60 95 або більше, 65 95 або більше, ільовий продукт 70 95 або більше, й роду 75 95 або більше, 80 95 або більше, 85 95 або більше, 90 95 або більше, 95 95 або більше менше 11 95 менше (1,9 х М) від близько (0,1 х | від близько 1 до (М-1) продукти менше 10 95 частин на 100, М) до близько (0,5 близько 20
Уукт менше 9 95 менше (1,8 х М) х М) частин на частин на 100, (включаючи їх о : й ніш . менше 8 95 частин на 100, 100, від близько |від близько 1 до похідні, такі як о фенілацетильні й менше 7 95 менше (1,7 х М) (0,1 х М) до близько 10 й т, менше 6 95 частин на 100, близько (0,4 х М) | частин на 100, іВи похідні) о менше 5 95 менше (1,6 х М) частин на 100, віді від близько 1 до (наприклад, (М-1) о менше 4 95 частин на 100, близько (0,2 х М) | близько 8 частин продукт хвостового о : ' менше 3 95 менше (1,5 х М) до близько (0,3 х | на 100, від піка 1) о менше 2 95 частин на 100, М) частин на 100, | близько 1 до менше 1 95 менше (1,4 х М) близько (0,1 х М) | близько 6 частин
Таблиця 1 г г. . |Діапазон відносно Діапазон раничні кількості - відносно п Фо у композиції |відносно цільового ЦільОВОГО цільового родукт продукту ( за (за масою) продукту масою) продукту ( за (за масою) Опі масою) лігонуклеотиди й іметельстат менше 0,5 95 частин на 100, частин на 100, на 100, від менше (1,3 х М) близько (0,2 х М) | близько 1 до частин на 100, частин на 100, близько 5 частин менше (1,2 х М) близько (0,3 х М) | на 100, від частин на 100, частин на 100, близько 2 до менше (1,1 х М) близько (0,4 х М) | близько 4 частин частин на 100, частин на 100, на 100, менше (0,9 х М) близько (0,5 х М) | близько 1 частин частин на 100, частин на 100, на 100, близько менше (0,8 х М) 2 частин на 100, частин на 100, близько З частин менше (0,7 х М) на 100, близько частин на 100, 4 частин на 100, менше (0,6 х М) близько 5 частин частин на 100, на 100 менше (0,5 х М) менше 1 частини частин на 100, на 4, менше 1 менше (0,4 х М) частини на 5, частин на 100, менше 1 частини менше (0,3 х М) на 6, менше 1 частин на 100, частини на 7, менше (0,2 х М) менше 1 частини частин на 100, на 8, менше 1 менше (0,1 х М) частини на 9, частин на 100 менше 1 частини на 10, менше 1 частини на 20, менше 1 частини на 25, менше 1 частини на 100 принаймні (1,0 х М)| від близько (1,0 х | від близько 5 до частин на 100, М) до близько (5,0 близько 50 4 ую або більше |принаймні (1,5 х М)| х М) частин на частин на 100, б 95 або більше |частин на 100, 100, від близько |від близько 10 8 95 або більше |принаймні (2,0 х М)| (2,0 х М) до до близько 50 (М-2) ії (М-3) 10 95 або більше |частин на 100, близько (5,0 х М) | частин на 100, продукти окремо 12 95 або більше |принаймні (2,5 х М)| частин на 100, віді від близько 20 або в сукупності 14 95 або більше |частин на 100, близько (2,5 х М) | до близько 50 (включаючи їх 16 95 або більше |принаймні (3,0 х М)| до близько (4,0 х | частин на 100, похідні, такі як 18 95 або більше |частин на 100, М) частин на 100, | від близько 30 фенілацетильні й 20 95 або більше |принаймні (3,3 х М)| від близько (3,0 х | до близько 50 іВи похідні) 25 95 або більше |частин на 100 М) до близько (4,0| частин на 100, (наприклад, менше 25 95 менше (3,3 х М) х М) частин на від близько 5 до хвостові піки 2-34 менше 20 95 частин на 100, 100, від близько |близько 40 або хвостові піки менше 18 90 менше (3,0 х М) (3,0 х М) до частин на 100, 3-4, або хвостові менше 16 95 частин на 100, близько (3,5 х М) | від близько 5 до піки 2, З або 4) менше 14 95 менше (2,5 х М) частин на 100 близько 30 менше 12 905 частин на 100, близько (1,0 х М) | частин на 100, менше 10 95 менше (2,0 х М) частин на 100, від близько 5 до частин на 100, близько (1,5 х М) | близько 20 менше (1,5 х М) частин на 100, частин на 100, частин на 100, близько (2,0 х М) | від близько 10
Таблиця 1 г г. . |Діапазон відносно Діапазон раничні кількості - відносно п Фо у композиції |відносно цільового ЦільОВОГО цільового родукт (за масою) продукту продукту ( за продукту ( за масою) (за масою) Опі масою) лігонуклеотиди й іметельстат менше (1,0 х М) частин на 100, до близько 20 частин на 100 близько (2,5 х М) | частин на 100 частин на 100, близько 10 близько (3,0 х М) | частин на 100, частин на 100, близько 15 близько (3,3 х М) | частин на 100, частин на 100, близько 20 близько (3,5 х М) | частин на 100, частин на 100 близько 25 частин на 100, близько 30 частин на 100, близько 35 частин на 100, близько 40 частин на 100, близько 45 частин на 100, близько 50 частин на 100 принаймні 5 частин на 100, принаймні 10 частин на 100, принаймні 12 частин на 100, принаймні 14 частин на 100, принаймні 15 частин на 100, принаймні 20 частин на 100, принаймні 30 частин на 100, принаймні 40 частин на 100 менше (8,5 х М) від близько (0,4 х | від близько 5 до частин на 100, М) до близько (5,0 близько 50 менше (8,0 х М) х М) частин на частин на 100, частин на 100, 100, від близько |від близько 10 менше (7,5 х М) (08 х М) до до близько 50 45 95 або менше, |/|частин на 100, близько (4,0 х М) | частин на 100,
Загальний вміст 40 95 або менше, | менше (7,0 х М) частин на 100, віді від близько 20 нецільових 35 95 або менше, |частин на 100, близько (1,6 х М) | до близько 50 олігонуклеотидів 30 95 або менше, | менше (6,5 х М) до близько (4,0 х | частин на 100, 25 9у5 або менше, |/|частин на 100, М) частин на 100, | від близько 20
У5 або менше | менше (6,0 х М) від близько (1,6 х | до близько 40 частин на 100, М) до близько (2,5| частин на 100, менше (5,5 х М) х М) частин на від близько 20 частин на 100, 100 до близько 30 менше (5,0 х М) близько (1,9 х М) | частин на 100, частин на 100, частин на 100 близько 25
Таблиця 1 . . Діапазон
Граничні кількості Діапазон ВІДНОСНО відносно п Фо у композиції |відносно цільового ЦільОВОГО цільового родукт продукту ( за (за масою) продукту масою) продукту ( за (за масою) Опі масою) лігонуклеотиди . іметельстат менше (4,5 х М) принаймні (1,0 х |частин на 100 частин на 100, М) частин на 100, | принаймні 10 менше (4,0 х М) принаймні (1,5 х |частин на 100, частин на 100, М) частин на 100, | принаймні 15 менше (3,5 х М) принаймні (2,0 х |частин на 100, частин на 100, М) частин на 100 | принаймні 20 менше (3,0 х М) частин на 100, частин на 100, принаймні 25 менше (2,5 х М) частин на 100, частин на 100, менше 40 частин менше (2,0 х М) на 100, менше частин на 100, 30 частин на менше (1,5 х М) 100, менше 25 частин на 100, частин на 100, менше (1,0 х М) менше 20 частин частин на 100 на 100, менше 15 частин на 100
Ї0О0351| У деяких варіантах реалізації композиція містить менше (2,0 х М) частин на 100 частин за масою (М-1) продукту відносно сполуки, де сполука містить полінуклеотид, що має послідовність із М нуклеозидних субодиниць, комплементарну РНК компоненту людської теломерази, при цьому принаймні дві нуклеозидні субодиниці з'єднані М3--Р5' тіофосфорамідатним міжсубодиничним зв'язком. У деяких варіантах реалізації вказане співвідношення становить менше (1,9 х М) частин на 100 частин за масою (М-1) продукту відносно М продукту, наприклад, менше (1,8 х М) частин на 100, менше (1,7 х М) частин на 100, менше (1,6 х М) частин на 100, менше (1,5 х М) частин на 100, менше (1,4 х М) частин на 100, менше (1,3 х М) частин на 100, менше (1,2 х М) частин на 100, менше (1,1 х М) частин на 100, менше (1,0 х М) частин на 100, менше (0,9 х М) частин на 100, менше (0,8 х М) частин на 100, менше (0,7 х М) частин на 100, менше (0,6 х М) частин на 100, менше (0,5 х М) частин на 100, менше (0,4 х М) частин на 100, менше (0,3 х М) частин на 100, менше (0,2 х М) частин на 100 або навіть менше (0,1 х М) частин на 100 частин за масою (М-1) продукту відносно М продукту. 00352) У деяких варіантах реалізації містить менше 1 частини на 4 частини за масою (М-1) продукту відносно сполуки (наприклад, менше 1 частини на 5, менше 1 частини на 6, менше 1 частини на 7, менше 1 частини на 8, менше 1 частини на 9, менше 1 частини на 10, менше 1 частини на 15, менше 1 частини на 20, менше 1 частини на 25, менше 1 частини на 50, менше 1 частини на 100 частин за масою (М-1) продукту відносно сполуки), де вказана сполука містить полінуклеотид, що має послідовність із 10 або більше нуклеозидних субодиниць, комплементарну РНК компоненту людської теломерази, при цьому принаймні дві нуклеозидні субодиниці з'єднані М3"-Р5' тіофосфорамідатним або оксофосфорамідатним міжсубодиничним зв'язком. У деяких варіантах реалізації полінуклеотид має послідовність із 10 або більше нуклеозидних субодиниць, комплементарну РНК компоненту людської теломерази, наприклад, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 або більше нуклеозидних субодиниць.
Ї0О0ОЗ353) У деяких варіантах реалізації полінуклеотид містить послідовність із 13 або більше нуклеозидних субодиниць, комплементарну РНК компоненту людської теломерази, наприклад, 15 або більше, 20 або більше, 30 або більше, 50 або більше нуклеозидних субодиниць, комплементарних РНК компоненту людської теломерази.
Зо 00354) У деяких варіантах реалізації полінуклеотид містить послідовність із 7 або більше нуклеозидних субодиниць, комплементарну РНК компоненту людської теломерази, наприклад, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 або 17 нуклеозидних субодиниць, комплементарних РНК компоненту людської теломерази. У деяких варіантах реалізації полінуклеотид містить послідовність нуклеозидних субодиниць, комплементарну РНК компоненту людської теломерази, що містить від 11 до 18, наприклад, від 11 до 16 послідовних нуклеозидних субодиниць, комплементарних РНК компоненту людської теломерази.
ЇО0355| У деяких варіантах реалізації полінуклеотид містить від З до 50 послідовних нуклеозидних субодиниць, комплементарних РНК компоненту людської теломерази, наприклад, від 5 до 40, від 10 до 40, від 10 до З0, від 10 до 25, від 10 до 20 або від 12 до 15 нуклеозидних субодиниць. У деяких варіантах реалізації олігонуклеотид містить послідовність із 10 або більше послідовних нуклеозидних субодиниць, комплементарну РНК компоненту людської теломерази.
У деяких варіантах реалізації композиція містить менше 1 частини на 10 частин за масою (М-1) продукту відносно вказаної сполуки. У деяких варіантах реалізації композиція містить менше 1 частини на 20 частин за масою (М-1) продукту відносно вказаної сполуки. У деяких варіантах реалізації композиція містить менше 1 частини на 25 частин за масою (М-1) продукту відносно вказаної сполуки. У деяких варіантах реалізації композиція містить менше 1 частини на 30 частин за масою (М-1) продукту відносно вказаної сполуки. У деяких варіантах реалізації композиція містить менше 1 частини на 50 частин за масою (М-1) продукту відносно вказаної сполуки. 00356) У деяких варіантах реалізації композиція містить менше 1 частини на 4 частини за масою будь-якого (М-х) продукту відносно сполуки, наприклад, менше 1 частини на 5, менше 1 частини на 6, менше 1 частини на 7, менше 1 частини на 8, менше 1 частини на 9, менше 1 частини на 10, менше 1 частини на 20, менше 1 частини на 25, менше 1 частини на 30 або навіть менше 1 частини на 50 частин за масою будь-якого (М-х) продукту відносно сполуки.
Ї00357| У деяких варіантах реалізації композиція містить менше 40 частин на 100 частин за масою сукупних (М-х) полінуклеотид-вмісних продуктів відносно сполуки, наприклад, менше 35 частин на 100, менше 30 частин на 100, менше 25 частин на 100, менше 20 частин на 100 або навіть менше 15 частин на 100 за масою (М-х) полінуклеотид-вмісних продуктів відносно сполуки. 00358) У деяких варіантах реалізації композиція містить принаймні 5 частин на 100 частин за масою (М-2) і (М-3) продуктів відносно сполуки, наприклад, принаймні 10 частин на 100 частин за масою, принаймні 12 частин на 100 частин за масою, принаймні 14 частин на 100 частин за масою, принаймні 15 частин на 100 частин за масою, принаймні 20 частин на 100 частин за масою, принаймні 30 частин на 100 частин за масою або принаймні 40 частин на 100
Зо частин за масою (М-2) і (М-3) продуктів відносно сполуки.
ЇООЗ359|У деяких варіантах реалізації композиція має наступний профіль (М-х) полінуклеотид-вмісних продуктів: менше 1 частини на 4 частини за масою (М-1) продукту відносно М продукту; і принаймні 10 частин на 100 частин за масою (М-2) і (М-3) продуктів відносно М продукту.
Ї00З36О| У деяких варіантах реалізації олігонуклеотидний М продукт містить 3'-кінцеву нуклеозидну субодиницю, яка відсутній в (М-1) продукті.
І0ОЗ61| Олігонуклеотидна сполука може бути описана формулою:
О-(х-І п де О являє собою олігонуклеотид, що містить послідовність нуклеозидних субодиниць, комплементарну РНК компоненту людської теломерази, х являє собою необов'язкову лінкерну групу, Ї являє собою ліпідний фрагмент, і п являє собою ціле число від 1 до 5.
І00362| Отже, для конструювання сполук необхідно вибрати два елементи, О і І", а також визначити структурний зв'язок(-и) між вказаними елементами, які можуть включати необов'язкову лінкерну групу х.
ЇООЗ363| У деяких варіантах реалізації олігонуклеотидна сполука може бути описана формулою:
О-(х-І п де О являє собою олігонуклеотид, що містить послідовність нуклеозидних субодиниць, комплементарну РНК компоненту людської теломерази, х являє собою необов'язкову лінкерну групу, Ї являє собою ліпідний фрагмент, і п дорівнює 1, наприклад, олігонуклеотид Формули (1), або її сіль, при цьому у Формулі () 7 являє собою ліпідний фрагмент, Ї являє собою необов'язковий лінкер, і групи В відповідають послідовності нуклеозидних субодиниць, комплементарної РНК компоненту людської теломерази.
І00364| Олігонуклеотидний компонент О може розглядатися як «ефекторний» компонент сполуки в тому відношенні, що він являє собою компонент, який впливає на інгібування ферменту теломерази за допомогою зв'язування із РНК компонентом теломерази. Таким чином, послідовність О вибрана так, що вона містить ділянку, комплементарну послідовності РНК теломерази, представленої в ЗЕО ІЮ МО:1. На ділянку, яка комплементарна РНК компоненту теломерази, теоретично може бути націлена будь-яка частина РНК теломерази, але певні бо ділянки РНК теломерази переважно націлені на інгібуючі олігонуклеотиди. Одна краща ділянка-
мішень являє собою ділянку, що охоплює нуклеотиди 30-67 в 5ЕБО І МО 1, що містить «матричну ділянку», ділянку із 11 нуклеотидів послідовності 5-СОААСССПААС-3 (5ЕО ІЮ МО: 2), яка охоплює нуклеотиди 46-56 5ЕБО ІЮО МО: 1. Матрична ділянка діє для визначення послідовності теломерних повторів, які теломераза приєднує до кінців хромосоми, і є необхідною для активності ферменту теломерази (див. Спеп еї аї., СеїЇ 100:503-514, 2000; Кіт еї аї., Ргос. Маї). Асад. 5сі., ОБА 98(14):7982-7987, 2001). Таким чином, особливо кращі сполуки згідно із цим винаходом, які містять олігонуклеотидний фрагмент, що містить послідовність, комплементарну всієї або частини матричної ділянки. Інша краща ділянка-мішень являє собою ділянку, що охоплює нуклеотиди 137-179 в ПТК (див. Рги7ап еї аї, Мисі. Асіа5 Кезеагсі, 30:559- 588, 2002). У вказаній ділянці послідовність, що охоплює 141-153, є кращою мішенню. У публікації РСТ УМО 98/28442 описане застосування олігонуклеотидів, що мають принаймні 7 нуклеотидів у довжину, для інгібування теломерази, де вказані олігонуклеотиди сконструйовані так, щоб бути комплементарними до доступних ділянок послідовності НТЕ за межами матричної ділянки, включаючи нуклеотиди 137-196, 290-319 і 350-380 в ПТ. 00365) Ділянка О, на яку націлена послідовність ПТК, переважно точно комплементарна відповідної послідовності ПТК. Незважаючи на те, що в деяких випадках припустимі деякі невідповідності, вони приблизно знижують специфічність і активність отриманого олігонуклеотидного кон югата. Таким чином, у конкретних варіантах реалізації послідовність основ олігонуклеотиду О вибрана так, щоб вона містила послідовність із принаймні 5 нуклеотидів, точно комплементарну РНК теломерази, і посилене інгібування теломерази може бути досягнуте при використанні більшої довжини комплементарної послідовності, наприклад, принаймні 8, принаймні 10, принаймні 12, принаймні 13 або принаймні 15 нуклеотидів точно комплементарні РНК теломерази. В інших варіантах реалізації послідовність олігонуклеотиду містить послідовність, що складається із принаймні від 5 до 20, принаймні від 8 до 20, принаймні від 10 до 20 або принаймні 10 до 15 нуклеотидів, точно комплементарних послідовності РНК теломерази. Оптимальна активність інгібування теломерази може бути досягнута в тому випадку, якщо повна довжина олігонуклеотиду О вибрана так, що вона комплементарна РНК теломерази. Однак необов'язково, щоб повна довжина олігонуклеотидного компонента була точно комплементарна цільової послідовності, і олігонуклеотидна послідовність може містити ділянки, які некомплементарні цільової послідовності. Такі ділянки можуть бути додані, наприклад, для забезпечення інших властивостей сполуки, наприклад, послідовності, що полегшують очищення. Якщо олігонуклеотидний компонент ОО містить ділянки, які некомплементарні цільової послідовності, такі ділянки можуть бути розташовано на одному або обох кінцях 5' або 3. У випадках, якщо вказана ділянка точної комплементарності націлена на матричну ділянку, ефективне інгібування теломерази може бути досягнуте за допомогою короткої ділянки (5-8 нуклеотидів) точної комплементарності, з якою теломеразоподобна (з високим вмістом с) послідовність зв'язана на 5'-кінці. 00366) Ілюстративні послідовності, які комплементарні РНК людської теломерази і які можуть бути включені як частина олігонуклеотидного компонента О, або які можуть бути використані як цілий олігонуклеотидний компонент О, включають наступні:
І00367| послідовності, комплементарні ПТК (ділянки олігонуклеотидної послідовності БЕО ІЮ
МО:1, описаної в публікації США 2012329858) (роз68! асссовааА сааосааоСОо саесасаасаа асасСАООО ОООпОСОААС
ССОААСОвпАс АдсааСацАа сссасса;асиу оророасисосс сссасасвО оррососСсасура АсСОсАаасСса саСааААААдса ссСсааоСОа ссассООССА ССОИООСАЦОС
ОАдадасСАААС ААДАААОВиС дабопосОвас сбпообасоо собсбссацвА ссОсСовсаСас сосассусвос САвоооССаА Ассссасса сгаассасСсас освассСаса ессососСаа аспСАСССАС рассАсСсасСа ААСИАСОЦІО0ССЯС сосро,Срсдас сасасасОс оссавасасаА смавасадасйци САСОаССООС АдаассасАсцоа
ААСАССААСО сласадасс ссасабаСбса сасаАдссс ралдаСсссти сАсарасСАСо сСааспсАСОСбасСОСАСАСАЦ С (5ЕО ІЮ МО: 1) (00369| аСТСТАСААТаААСОССТасААЛС,аСОсаСАСца 137-166 (5ЕО І МО: 6) 00379, атаавдАлаассасСАса 137-151 (5ЕО ІЮО МО: 7)
Т00371| асААдсасСцвасСАса 137-149 (5ЕО ІЮ МО: 8) 00372, атапАдаасо(асСА 139-151 (ЗЕО І МО: 9) 00373) атапвААлс(асос 141-151 (5ЕО ІЮО МО: 10) т00374, СастасАдАсасоса 141-153 (5ЕО ІЮ МО: 11) т00375| АССОСТасвАДОааСс 142-154 (5ЕО ІЮ МО: 12)
Т00376| ААСССтТасСАДОааСИсо 143-155 (ЗЕО ІЮО МО: 13) 60 І00377| АТаАдАСОССТасААЛСОИаСос 144-158 (5ЕО І МО: 14)
І00378| АСАТТТТТТатттастотАа 160-179 (5ЕО І МО: 15)
І00379| ТАаСИаТТАСАСАА 42-54 (5ЕО ІЮО МО: 3) (0озво| аттАсасттАа 46-56 (5ЕО ІЮО МО: 4) (0оза1| а ТтТАсаатТТАСАС 44-56 (5ЕО І МО: 16) (00382)! аттАсСсатТТАСАСАА 42-56 (5ЕО І МО: 17) (0оз83| ассваТтТАсцАС 44-52 (00384| САаттТАсасє 50-58
І00385| СССТТСТСАСТТ 54-65 (5ЕО ІЮ МО: 18) (ооз86І! Сасссттстода 56-67 (5ЕО ІО МО: 19)
І00387| У деяких варіантах реалізації полінуклеотид містить послідовність, вибрану із групи, яка складається з: СТТАОООСТТАс (5БО ІЮ МО:4); ТАСОСТТАСАСАА (5ЕБО ІЮ МО:3); і сАааттАаа,астТтТАс (ЗЕО ІО МО:5).
І0ОЗ88) Вибір типу міжнуклеозидних зв'язків, використовуваних для синтезу компонента 0, може бути зроблений на основі будь-яких доступних хімічних структур олігонуклеотидів, включаючи, але не обмежуючись ними, фосфодіефірні, фосфотриефірні, метилфосфонатні,
РЗУ--»М5" фосфорамідатні, М3'-РБ5' фосфорамідатні, М3-РБ' тіофосфорамідатні й тіофосфатні зв'язки. 00389) У деяких варіантах реалізації олігонуклеотидний компонент О має принаймні одну
М3-РБ" фосфорамідатну (наприклад, М3--РО"' тіофосфорамідатну) зв'язок. У деяких варіантах реалізації всі нуклеозидні субодиниці, комплементарні РНК компоненту людської теломерази, зв'язані М3А-Р5" фосфорамідатними міжсубодиничними зв'язками. У деяких випадках М3--Р5' фосфорамідатні міжсубодиничні зв'язки представляють собою М3--Р5' тіофосфорамідатні міжсубодиничні зв'язки. У деяких випадках М3'-РБ5 фосфорамідатні міжсубодиничні зв'язки представляють собою М3'--Р5' оксофосфорамідатні міжсубодиничні зв'язки.
ЇООЗ90О| У деяких випадках М3--РБ5' тіофосфорамідатний міжсубодиничний зв'язок має наступну структуру: 3-МН-Р(ІЗХОК)-О-5' де К вибраний із групи, яка складається з водню, алкілу, заміщеного алкілу, арилу, заміщеного арилу й захисної групи фосфату. Слід розуміти, що деякі олігонуклеотидні
Зо компоненти О, що містять міжсубодиничний зв'язок, описаний представленою вище формулою, де К вибраний із групи, яка складається з водню, алкілу, заміщеного алкілу, арилу, заміщеного арилу й захисної групи фосфату, також можуть існувати в сольовій формі. Такі форми, за умови можливості їх існування, включені в обсяг цього опису. 00391) У деяких випадках М3-Ре5' тіофосфорамідатний міжсубодиничний зв'язок описаний наступною структурою: 3-МН-Р(ІЗХОК)-О-5' де К являє собою водень. Слід розуміти, що для будь-яких олігонуклеотидних компонентів
О, описаних у цьому документі, які містять вказаний міжсубодиничний зв'язок, такі олігонуклеотидні компоненти О також можуть включати будь-які підходящі сольові форми вказаного зв'язку. Таким чином, вказаний міжсубодиничний зв'язок може бути в сольовій формі, що містить будь-який підходящий протиїіон. 00392) Сполуки згідно із цим винаходом більш ефективні для інгібування теломерази в клітинах, ніж відповідні олігонуклеотиди, не спряжені з ліпідними компонентами. Функція ліпідного компонента І приблизно полягає в посиленні клітинного поглинання сполуки, зокрема, у полегшенні проходження через клітинну мембрану. Незважаючи на те, що механізм, за яким це відбувається, дотепер не до кінця вивчений, одна з можливостей полягає в тому, що ліпідний компонент може полегшувати зв'язування сполуки із клітинною мембраною у вигляді однієї молекули або в агрегованій (міцелярній) формі, з наступною інтерналізацією. Однак розуміння точного механізму не є необхідним для застосування цього винаходу.
БО 003931) Ліпідний компонент може представляти собою будь-який ліпід або ліпідне похідне, яке забезпечує посилене клітинне поглинання в порівнянні 3 немодифікованим олігонуклеотидом. Кращі ліпіди представляють собою вуглеводи, жири (наприклад, гліцериди, жирні кислоти й похідні жирних кислот, такі як аміди жирних кислот) і стерини. Якщо ліпідний компонент являє собою вуглеводень, то компонент ЇЇ може бути заміщеним або незаміщеним циклічним вуглеводнем, або аліфатичним нерозгалуженим або розгалуженим вуглеводнем, який може бути насиченим або ненасиченим. Кращі приклади представляють собою лінійні нерозгалужені вуглеводні, які є повністю насиченими або поліненасиченими. Довжина вуглеводневого ланцюгу може змінюватися від С2 до С30, але оптимальне інгібування теломерази може бути досягнуте із застосуванням вуглецевих ланцюгів С8-С22. Кращі бо приклади насичених вуглеводнів (алканів) перераховані нижче:
Ї00394| Систематична назва / вуглецевий ланцюг
Ї00395| Тетрадекан Сі«Нзо
Ї00396| Пентадекан Сі5Нзг
Ї00397| Гексадекан СівНза 00398) Гептадекан С17Нзв
Ї00399| Октадекан СівНзв
Ї00400| Нонадекан С:і9Нао
Ї00401| Ейкозан СгоНаг 00402) Також можуть бути вибрані моно- і поліненасичені форми (алкени й полієни, такі як алкадієни й алкатриєни) вуглеводнів, при цьому кращі сполуки, що мають від одного до трьох подвійних зв'язків, хоча можуть бути використані сполуки, що мають більше подвійних зв'язків.
Також можуть бути використані алкіни (що містять одну або більше потрійних зв'язків) і алкеніни (потрійний зв'язок(-и) і подвійний зв'язок(-и)).
ЇО0403| У сполуках згідно із цим винаходом можуть бути використані заміщені форми вуглеводнів, при цьому кращі групи замісників, які є інертними іп мімо і іп міго. Особливо кращий замісник являє собою фтор. Ілюстративні узагальнені структури поліфторованих вуглеводнів включають: СЕз(СЕг)н-(СНг)т-, де т дорівнює принаймні 1, переважно принаймні 2, і п-1-30, наприклад, фтортридекан: СЕз(СЕг)(СНг)з; і СНаз(СНег)а(СЕг)в(СНг)с-, де а, Б ії с незалежно дорівнюють 1-30. 00404 Інші підходящі ліпідні компоненти включають прості жирні кислоти й похідні жирних кислот, тригліцериди й більш складні ліпіди, такі як стерини, наприклад, холестерин. Жирні кислоти і їх похідні можуть бути повністю насиченими або моно-, або поліненасиченими.
Довжина вуглецевого ланцюга може змінюватися від С2 до С30, але оптимальне інгібування теломерази може бути досягнуте із застосуванням вуглецевих ланцюгів С8-С22. Кращі приклади насичених жирних кислот перераховані нижче:
Ї00405| Систематична назва / тривіальна назва / вуглецевий ланцюг
Ї00406| Тетрадеканова міристинова 14:0
Ї00407| Гексадеканова пальмітинова 16:0
Ї00408| Октадеканова стеаринова 18:0
Коо) Ї00409| Ейкозанова арахінова 20:0 00410) Також можуть бути використані моно- і поліненасичені форми жирних кислот, при цьому кращі сполуки, що мають від однієго до трьох подвійних зв'язків, хоча можуть бути використані сполуки, що мають більше подвійних зв'язків. Приклади розповсюджених моно- і поліненасичених жирних кислот, які можуть бути використані, включають:
І00411| Систематична назва / тривіальна назва / вуглецевий ланцюг 00412) Цис-9-гексадеканова пальмітинолеїнова 16:1 (п- 7) 00413) Цис-6-октадеканова петроселінова 18:1 (п-12) 00414) Цис-9-октадеканова олеїнова 18:1 (п-9) 00415) 9,12-октадекадієнова лінолева 18:2 (п-б) 00416) 6,9,12-октадекатриєнова гамма-линолева 18:3 (п-б) (00417) 9,12,15-октадекатриєнова альфа-линолева 18:3 (п-3) 00418) 5,8,11,14-ейкозатетраєнова арахидонова 20:4 (п-6) 00419) У сполуках згідно із цим винаходом також можуть бути використані жирні кислоти з одним або більше потрійними зв'язками у вуглецевому ланцюзі, а також розгалужені жирні кислоти. У сполуках згідно із цим винаходом можуть бути використані заміщені форми жирних кислот. Як і у випадку вуглеводневих груп, кращі групи замісників, які є інертними іп мімо і їп міїго, при цьому особливо кращий фтор. Ілюстративні узагальнені структури поліфторованих похідних жирних кислот, що є придатними для застосування згідно із цим винаходом, представляють собою: СЕзЗ(СЕг)н-- (СНг)тСО--, де т дорівнює принаймні 1, переважно принаймні 2, і п-1-30, і 0 СНз(СНаг)а(СЕг)(СНег)сСо--, де а, Б і с незалежно дорівнюють 1-30. 00420) У деяких випадках від одного до п'яти компонентів ЇЇ (п-1-5) ковалентно зв'язані з компонентом 0, необов'язково через лінкер. Більш часто використовують 1 або два компоненти
ЇЇ (п-1 або 2). Якщо з компонентом О зв'язано більше одного компонента І, то кожний компонент І вибраний незалежно.
І00421| Слід розуміти, що сполуки згідно із цим винаходом, описані, як такі, що мають визначений вуглеводень як фрагмент І ", і сполуки, описані, які такі, що мають визначену жирну кислоту (з такою ж кількістю атомів вуглецю, як у вказаному вуглеводні), є близькоспорідненими й відрізняються за структурою тільки природою зв'язку що з'єднує фрагмент | з олігонуклеотидом, який, у свою чергу, є результатом процедури синтезу, використаної для 60 одержання сполуки. Наприклад, як більш докладно описане нижче, якщо синтезовані сполуки,
що мають фрагмент І", спряжений з 3'-амінокінцом олігонуклеотиду (що має фосфорамідатні або тіофосфорамідатні міжнуклеозидні зв'язки), то застосування альдегідної форми жирної кислоти (жирного альдегіду) як вихідного матеріалу приводить до утворення амінного зв'язку між ліпідним ланцюгом і олігонуклеотидом, так що ліпідна група виступає як вуглеводень.
Навпаки, застосування карбонової кислоти, ангідриду кислоти або хлорангідридної форми тієї ж жирної кислоти приводить до утворення амідного зв'язку, так що ліпідна група виступає як похідне жирної кислоти, зокрема, у цьому випадку як жирний амід ( як відзначено в представленому вище розділі «Визначення», для простоти термін «жирна кислота» при описі спряженої групи ЇЇ використаний у цьому контексті в широкому розумінні й включає похідні жирних кислот, у тому числі жирні аміди). Це показано на наступних схематичних ілюстраціях, які демонструють 3'-амінокінець фосфорамідатного олігонуклеотиду, з'єднаний з С14 ліпідним компонентом. На схематичному зображенні А | являє собою тетрадеканову кислоту (міристинову кислоту), у якій зв'язок між групами Її О являє собою амід. На схематичнім зображенні В І являє собою тетрадекан, і зв'язок між групами І і О являє собою амін.
Схематичне зображення А . Схематичне зображення Б х ин й А м І ча ми ні Ян й , і і п а УА й Кк р АК . в а и а о с о й ані
І00422| Зв'язок між компонентами О і! може бути прямим зв'язком або може бути реалізований через необов'язковий лінкерний фрагмент, наприклад, х або необов'язковий лінкер Г Формули (І). Лінкерна група може служити для полегшення хімічного синтезу сполук.
Незалежно від того, чи використана лінкерна група для опосередкування спряження компонентів О і ЇЇ чи ні, в олігонуклеотидном компоненту О існує декілька сайтів, 3 якими компонент(-и) Її можуть бути легко сполучені. Підходящі точки зв'язування включають 5' |і 3 кінці одне або більше цукрових кілець, міжнуклеозидний кістяк і азотисті основи олігонуклеотиду. У деяких випадках фрагмент І приєднаний до 3' або 5' кінця олігонуклеотиду. 00423) Якщо компонент | повинен бути приєднаний до 3' кінця, то приєднання може бути здійснене безпосередньо до 3'-замісника, який у випадку кращих фосфорамідатних і тіофосфорамідатних олігонуклеотидів являє собою 3'-аміногрупу, і в інших випадках, таких як звичайні фосфодіефірні олігонуклеотиди, являє собою 3-гідроксигрупу. В альтернативному
Зо варіанті фрагмент | може бути зв'язаний через 3'-зв'язану фосфатну групу, у якій гексадекановий вуглеводень зв'язаний з 3'-фосфатом тіофосфорамідатного олігонуклеотиду за допомогою О-алкільного лінкера. Якщо фрагмент І повинен бути зв'язаний з 5' кінцем, він може бути приєднаний через 5'-зв'язану фосфатну групу. Приєднання до основи фрагмента О може бути здійснене через будь-який підходящий атом, наприклад, до М2 аміногрупи гуанозину. Якщо п»1, так що до компонента О повинно бути приєднано багато ліпідних компонентів, то окремо вибрані компоненти І можуть бути приєднані в будь-якому підходящому місці(-ах). Наприклад, одна група І може бути приєднана до кожного з кінців, різні групи Ї" можуть бути приєднані до вказаних основ, або дві або більше груп І" можуть бути приєднані до одному кінцю. 00424) Необов'язковий лінкерний компонент х може бути використаний для зв'язування компонентів О і ЇЇ сполук. Слід розуміти, що необов'язковий лінкер (наприклад, х або Ї у
Формулі (І)) може бути приєднаний до полінуклеотиду (наприклад, 0) через кінцеву фосфатну групу, наприклад, 3'-зв'язану або 5'-зв'язану фосфатну групу. При необхідності використання лінкера його вводять у процедуру синтезу так, як описано в цьому документі. Приклади підходящих лінкерних груп включають лінкери типу аміногліцерину й О-алкілгліцерину, які, відповідно, можуть бути зображені загальними структурами: тор
Е в
І00425)| де К-Н, ОН, МН»е ог 5Н; ї-0О, 5 або МЕ; К-Н, алкіл або заміщений алкіл; іпі т незалежно представляють собою цілі числа від 1 до 18.
00426) Конкретні приклади підходящих лінкерів представляють собою аміногліцериновий лінкер, у якому К-ОН, У--О, і кожний т і п дорівнює 1: -у ра мае рай й от»
Он
І00427| біс-аміногліцериновий лінкер, у якому Е-ОН, Х--МН, і кожний т і п дорівнює 1: б не
НІ Й ап 004281) і О-алкілгліцериновий лінкер, у якому К-Н: отут
С
І00429| Ілюстративні модифіковані ліпідом олігонуклеотиди, які можуть бути отримані відповідно до розглянутих способів, включаючи сполуки, описаний на фіг. 1 (наприклад, фіг. 1А- 100) у заявці на патент США 0520120329858, ОСгуагпом еї а! "Модіїей оїЇїдописіеоїіде5 ог
Іеіотегавзе іппірйіоп", повний опис якої включено в цей документ за допомогою посилання. 00430) У деяких варіантах реалізації композиція містить сполуку, описану структурою: нон І т
МАК ло-р-о Ге)
Ге) 5н їй от вн (в) А
Сх т о-вовН о-(СпреСОпреОаре П пр ГпреАпрепреАпреСпреАпрві | о А
МН» де «про» являє собою тіофосфорамідатний зв'язок (наприклад, --МН-Р(-О0О)Х(ЗН)-0--), що зв'язує 3'-атом вуглецю нуклеозиду з 5'-атомом вуглецю сусіднього нуклеозиду.
Ї00431| Слід розуміти, що всі варіанти реалізації, що стосуються сполуки, також застосовні до сольових форм вказаної сполуки. 00432) У деяких варіантах реалізації композиція містить сполуку, описану структурою:
і)
Н (о) | ІЇ т
М -р--
ЯК о--0- о о 5н й оту 7Вн (в) А - т о-р-5Н о-(ОпреОпреСіпре І пре І преАпреСпреАпреСпреАпрві | о А
МН» або її сіль; де «про» являє собою тіофосфорамідатний зв'язок (наприклад, --МН-А-Р(-ОХЗН)-О-- або її таутомер, або її сіль), що з'єднує 3'-атом вуглецю одного нуклеозиду з 5'-атомом вуглецю сусіднього нуклеозиду. У деяких варіантах реалізації композиція містить фармацевтично прийнятну сіль сполуки. У деяких випадках композиція містить натрієву сіль сполуки. У деяких варіантах реалізації композиція містить сіль двовалентного катіона й вказаної сполуки, таку як магнієва сіль сполуки. У деяких варіантах реалізації композиція містить сіль тривалентного катіона й вказаної сполуки, таку як алюмінієва сіль сполуки.
ЇО0433| У деяких варіантах реалізації композиція містить олігонуклеотид, описаний наступною структурою, де кожний Ме незалежно являє собою водень або будь-який підходящий протиіон солі, кожний х незалежно дорівнює 1, 2 або 3, і п являє собою ціле число від 5 до 13, наприклад, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 або 13, наприклад, п дорівнює 13:
(е)
Зв 8-Р-0-ї осо о ре; Мн» ка
ОН МН «1 88Р-0-1 ом
МН е- у4 В, (о) о М МН
Нм щу 8-Р-0-ї о МТМ Мн. ав, в
МА МмН щі вх 8-Р-0-- о ММ сМмн, ав, 9
М
МН ор 85-Р-0- о М'Мм'сМмн, о 2, о
МН нм зе " 8-в-0- осо о - о
МН нм зе ре 8-в-0- осМо о дев, Мн» о р
З-в-0 Ге) М м о в /4 7
М Мн
Нм щу 5-8-0- о. М М'МНн о Де, М жо гр -р- М 4 о о Мн
М ст 8-рР-О оо о Де, мно о Тр 8-8Р-0- ом "ав, Мн
Ор 8-Р-0- ом о- це; хя
Мнь (МУ)
У деяких випадках кожний х дорівнює 1. У деяких випадках кожний х незалежно дорівнює 1 або 2. У деяких випадках кожний х незалежно дорівнює 1 або 3. У деяких випадках М'єЄ являє 5 собою водень.
Ї00434|У деяких варіантах реалізації композиція містить олігонуклеотид, описаний наступною структурою, і може містити будь-які підходящі катіонні протиіони солі:
(в) ва 8-8-0-- сом о о й Мне
Ми
ОН ДН «1 8-Р-0-ї о.
МН се га В Ге; о ММ
Нім С 8-8-0- о ММ "Ммн, о: Дав, в;
М
МН ніх ох 8-Р-0-і- о ММ Мн, о: Дав; в;
М МН ніх р 5-6-0-- о. ММ Мн. 7 о
МН нм з 5-Р-0- осо о: ; 7 (в)
МН ото
З-Р-0О- осо о: д- Мн»
МН т ! 4 5-Р-о0 Го! Мт о о: раз,
МА сМмн
Нм щи 8-8-0-- од. .М' "М мн, (од Дав, Мне се, ср 2 5-Р-0 о. ММ о" іє і, Мне зм нс 5-Р-О о М в) о: х р, МН» о ор 8-Р-0- ом о це»; МН
У, 8-в-0- ом о рев,
Мне 00435) У деяких варіантах реалізації композиція містить сполуку, описану структурою:
(е)
Ма" МН о А 8-Р-0- о7М7о о я МН
М Б он МН «А 8-Р-0-і ом
МН о гє В, в) о я
М Шев 8-Р-0- о. ММ сМмн,
Дав, 9 ня нка. 8-Р-0-ї о МОМ сМн, ав, о
Н
Шев 8-в-0-- о МОМ сМмн, козу; ня чорт 8-Р-0о-ї осМо 5-й о
Ма" в 8-Р-0- ОосМ7о о: я МН»
Ма" М. їн «ТУ 8--0- 0. М о о: ра»,
Ех М чн 8-5-0-- о ММ "мн, ав, М»
М о
Шев, 8-Р-О ММ у й Мн» ня МУ
Ма Мн С
З-в-0 Ге) М ге) ав, мн»
Ма" з о, 8-Р-0-і ом о: є 7 МН» -
Ма Мн ге 8-Р-0-1 00 ав; -
Ма мн, 00436) Представлені також композиції складного активного фармацевтичного інгредієнта, що містять сполуку, що містить олігонуклеотид. У цьому контексті активний фармацевтичний інгредієнт стосується композиції, яка отримана із застосуванням розглянутих способів одержання, при цьому вказана композиція може бути необов'язково піддана одній або більше додатковим стадіям очищення після синтезу. У цілому, активний фармацевтично інгредієнт являє собою композицію, що підходить для переворення у фармацевтичну композицію. У деяких випадках композицію складного активного фармацевтичного інгредієнта не очищають після синтезу, так що компоненти композиції, що містять олігонуклеотид, представляють собою продукти, отримані під час синтезу олігонуклеотиду.
Ї00437| У деяких варіантах реалізації складний активний фармацевтичний інгредієнт містить менше 9 96 за масою (М-1) продукту, де вказана сполука містить полінуклеотид, що має послідовність із 10 або більше нуклеозидних субодиниць, комплементарну РНК компоненту людської теломерази, при цьому принаймні дві нуклеозидні субодиниці з'єднані М3--Р5' тіофосфорамідатним або оксофосфорамідатним міжсубодиничним зв'язком (наприклад, описаним в цьому документі). 00438) У деяких варіантах реалізації складний активний фармацевтичний інгредієнт містить менше 9 95 за масою (М-1) продукту, де вказана сполука або її фармацевтично прийнятна сіль містить полінуклеотид, що має послідовність із 10 або більше нуклеозидних субодиниць, комплементарну РНК компоненту людської теломерази, при цьому принаймні дві нуклеозидні субодиниці з'єднані М3"-Р5' тіофосфорамідатним або оксофосфорамідатним міжсубодиничним зв'язком (наприклад, описаним в цьому документі). 00439) У деяких варіантах реалізації складного активного фармацевтичного інгредієнта всі нуклеозидні субодиниці, комплементарні РНК компоненту людської теломерази, з'єднані
М3"-РО тіофосфорамідатними міжсубодиничними зв'язками.
ІЇ00440| У деяких варіантах реалізації складного активного фармацевтичного інгредієнта
М3"-РО тіофосфорамідатний міжсубодиничний зв'язок має наступну структуру: 3-МН-Р(ІЗХОК)-О-5' де К вибраний із групи, яка складається з водню, алкілу, заміщеного алкілу, арилу, заміщеного арилу й захисної групи фосфату. Якщо К вибраний із групи, яка складається з водню, алкілу, заміщеного алкілу, арилу, заміщеного арилу й захисної групи фосфату, слід розуміти, що деякі міжсубодиничні зв'язки, описані представленою вище формулою, також можуть існувати в сольовій формі. Такі форми, за умови можливості їх існування, включені в обсяг цього опису.
ІЇ00441| У деяких варіантах реалізації складного активного фармацевтичного інгредієнта
М3"-РО тіофосфорамідатний міжсубодиничний зв'язок має наступну структуру: 3-МН-Р(ІЗХОК)-О-5' де К являє собою водень. Слід розуміти, що для будь-якого із складних активних фармацевтичних інгредієнтів, описаних у цьому документі, які містять такий міжсубодиничний зв'язок, вказаний складний активний фармацевтичний інгредієнт також може містити будь-які
Зо підходящі фармацевтично прийнятні сольові форми вказаного зв'язку. Таким чином, міжсубодинична зв'язок може бути у формі фармацевтично прийнятної солі, що містить будь- який підходящий протиїіон вказаної солі.
І00442| У деяких варіантах реалізації складного активного фармацевтичного інгредієнта полінуклеотид містить від 10 до 50 послідовних нуклеозидних субодиниць, комплементарних
РНК компоненту людської теломерази (наприклад, як описано в цьому документі).
Ї00443| У деяких варіантах реалізації складного активного фармацевтичного інгредієнта полінуклеотид містить послідовність, вибрану із групи, яка складається з: ЗТТАСОСТТАС (5ЕО
ІО МО:4); ТАСОСТТАСАСАА (5ЕО ІО МО:3); ії САСТТАОСОТТАС (5ЕО ІЮ МО:5). (00444) У деяких варіантах реалізації складного активного фармацевтичного інгредієнта полінуклеотид містить кінцеву 3'-аміно або 3'-гідроксильну групу. У деяких варіантах реалізації складного активного фармацевтичного інгредієнта полінуклеотид містить кінцеву 3'-аміногрупу.
У деяких варіантах реалізації складного активного фармацевтичного інгредієнта полінуклеотид містить кінцеву 3'"-гідроксильну групу.
ІЇ00445| У деяких варіантах реалізації складного активного фармацевтичного інгредієнта вказана сполука має структуру:
Н он ІЇ т
М -р-- «Ко в о Ге) о 5н ц о-и-ВН (в) А
Ка, т
О-р-8Н о--ІОпреСіпреСіпре П пре ГпреАпре пре АпреС преАпре | о А
МН» де «про» являє собою тіофосфорамідатний зв'язок --МН--Р(-0)(ЗН)-0--, що зв'язує 3- атом вуглецю одного нуклеозиду з 5'-атомом вуглецю сусіднього нуклеозиду.
І00446| Слід розуміти, що всі варіанти реалізації що стосуються складного активного фармацевтичного інгредієнта, також застосовні до сольових форм вказаного складного активного фармацевтичного інгредієнта.
ІЇ00447| У деяких варіантах реалізації складного активного фармацевтичного інгредієнта вказана сполука має структуру: нон І т ми ло-Р-о о о 5н
Ц о-е-вн (в) А сх т о-Р-5Н о-їІСіпреСіпреСіпре Ї пр ГпреАпреЯпреАпреС пре Апрві | о А
МН» або її фармацевтично прийнятна сіль; де «про» являє собою тіофосфорамідатний зв'язок --МН-А-Р(І-О)(5Н)-О-- (або її таутомер, або її фармацевтично прийнятну сіль, як описано в цьому документі), що зв'язує 3'-атом вуглецю одного нуклеозиду з 5'--атомом вуглецю сусіднього нуклеозиду. У деяких варіантах реалізації складного активного фармацевтичного інгредієнта композиція містить натрієву сіль вказаної сполуки. У деяких варіантах реалізації композиція містить сіль двовалентного катіона й вказаної сполуки, таку як магнієва сіль сполуки. У деяких варіантах реалізації композиція містить сіль тривалентного катіона й вказаної сполуки, таку як алюмінієва сіль сполуки. 00448) У деяких варіантах реалізації складного активного фармацевтичного інгредієнта сполука описана наступною структурою, де кожний М незалежно являє собою водень або будь-який підходящий протиіон солі, кожний х незалежно дорівнює 1, 2 або 3, і п являє собою ціле число від 5 до 13, наприклад, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 або 13, наприклад, п дорівнює 13:
(о) в 8-Р-0-- осо о -- Мн
ММ он Мн «Її - а 8-Р-0- о.0МсМ
МН у ує В; Ге! о МА МН
Нм С 8-8-0-- о ММ Мн, ев, в
М Мн нм тр 8-Р-О-ї о ММ Мн, бу з,
М
МН ор 8-Р-0-ї о ММ мн, о 2, о
МН нм зе т 8-Р-О-- ОоСМОо о я- о
МН
Нм зе ї 8-Р-0О- осо о де, МН» оо 8-Р-0- оо (в) є 7
М МН
НМ щу 8-Р-0- о ММ МН, о Де, М отр 8-Р-О ММ
Ф- --й МНь зм - С 8-Р-О Ге! мо о ав) МН» ке 8-Р-О-ї ом "ав; но
С
8-Р-0-1 ом "нав, ха
Мне (М ІЙ
У деяких випадках кожний х дорівнює 1. У деяких випадках кожний х незалежно дорівнює 1 або 2. У деяких випадках кожний х незалежно дорівнює 1 або 3. У деяких випадках Ме являє собою водень.
Ї00449| У деяких варіантах реалізації складного активного фармацевтичного інгредієнта сполука описана наступною структурою, і може містити будь-які підходящі катіонні протиїони солі:
(в) ща 8-Р-0-ї ОМ о о - Мн»
ММ он Мн 2 -ї 4 5-6-0 ГФ) М М
МН о га 7 (е) о М МН
Нм ще 5-8-0- о ММ Мн, ав, 9
М МН ни р 8-8-0-- о ММ мн, ав, 9
МА МН ні с в 8-Р-0-ї о ММ Мн, а» Ду
МН нм зе ре 8-Р-0- осо о я о
МН нм з ї 8-в-0- ом о о я МН ке, ко о! ММ є)
МА сМмн нм «АЖ 8-Р-0-- о ММ мн, ав; М» 8-р-0 мм су --у Мн» зм їн сх 8-рР-0 І) "ав, мн» р 88Р-О-1 ом "ав; Мн» р 8-Р-0- ом о а»,
МН»
Ї00450| У деяких варіантах реалізації складного активного фармацевтичного інгредієнта вказана сполука описана структурою:
(о) ма" МН о щи 5-в-0- оо о -- Мн мим он кН «ТУ 8-Р-0-- ом
Мн це»; о (в; я нон р 8-Р-О- ом МН
Дав, 9 . мив в-в-0- о. М сМ'сМн, о: я г; я
МК ев 8-Р-0- о ММ Мн, азу; ня ян ТО 8-Р-0-- ОО с - о
Ма"
ТС
8-8-0- ОМ О о - МН»
Ма" М с
МН 2 М 2
З-в-0 Ге! Мт Те) о й»;
Ех М
МН
Ма нм г и. 8-8-0--о ММ МмНн, ав; Мо
Ма" с б тр 8-рР-о ММ су -ї МН» я У чен С 8-р-О ом о: я Мн»
Ма" сч оо 8-Р-0- ом о: є 7 МН» я
Ма Мн те 8-Р-0-ї ом ав, ня
Ма МН»
Ї00451| У деяких варіантах реалізації складний активний фармацевтичний інгредієнт містить менше 9 95 за масою (М-1) продукту, наприклад, менше 8 956 за масою, менше 7 95 за масою, менше 6 95 за масою, менше 5 95 за масою, менше 4 95 за масою, менше 3 95 за масою, менше 2 У за масою або навіть менше 1 95 за масою (М-1) продукту. У деяких варіантах реалізації складний активний фармацевтичний інгредієнт містить менше 5 95 за масою (М-1) продукту. У деяких варіантах реалізації складний активний фармацевтичний інгредієнт містить менше 2 95 за масою (М-1) продукту. 00452) У деяких варіантах реалізації активний фармацевтичний інгредієнт містить менше 9
Фо будь-якого (М-х) продукту, наприклад, менше 8 95 за масою, менше 7 95 за масою, менше 6 95 за масою, менше 5 95 за масою, менше 4 95 за масою, менше З 95 за масою, менше 2 95 за масою або навіть менше 1 95 за масою будь-якого (М-х) продукту. 00453) У деяких варіантах реалізації складний активний фармацевтичний інгредієнт містить менше 9 95 за масою сумарних (М-х) полінуклеотид-вмісних продуктів, наприклад, менше 8 95 за масою, менше 7 95 за масою, менше 6 95 за масою, менше 5 95 за масою, менше 4 95 за масою, менше 3 95 за масою, менше 2 95 за масою або навіть менше 1 95 за масою сумарних (М-х) полінуклеотид-вмісних продуктів. 00454) У деяких варіантах реалізації складний активний фармацевтичний інгредієнт має наступний профіль (М-х) полінуклеотид-вмісних продуктів: менше 1 частини на 4 частини за масою (М-1) продукту відносно М продукту; і принаймні 10 частин на 100 частин за масою (М-2) і (М-3) продуктів відносно М продукту.
ЛІКАРСЬКІ ФОРМИ
00455) Представлені також фармацевтичні композиції, які містять олігонуклеотидну композицію (наприклад, описану в цьому документі). Олігонуклеотидні композиції (наприклад, описані в цьому документі) також можуть бути складені у фармацевтичну композицію для інгібування транскрипції або трансляції в клітині при хворобливому стані, зв'язаному із понадекспресією гена-мішені.
Ї00456|У деяких варіантах реалізації фармацевтична композиція містить композицію олігонуклеотиду (наприклад, описану в цьому документі), складену у фармацевтично прийнятній допоміжній речовині. У деяких варіантах реалізації композиція олігонуклеотиду являє собою складний активний фармацевтичний інгредієнт, що має менше 9 95 за масою (М-1) продукту, де вказана сполука містить полінуклеотид, що має послідовність із 10 або більше нуклеозидних субодиниць, комплементарну РНК компоненту людської теломерази, при цьому принаймні дві нуклеозидні субодиниці з'єднані М3-Р5' тіофосфорамідатним міжсубодиничним зв'язком.
Ї00457|У цьому винаході представлені сполуки, які можуть специфічно й ефективно інгібувати активність теломерази, і які, отже, можуть бути використані для інгібування проліферації теломераза-позитивних клітин, таких як пухлинні клітини. Показано, теломераза- позитивними є багато ракових клітин, включаючи клітини раку шкіри, сполучної тканині, жировій тканині, молочної залози, легень, стравоходу, підшлункової залози, яєчників, шийки матки,
Зо матки, нирок, сечового міхура, товстої кишки, передміхурової залози, центральної нервової системи (ЦНС), сітківки й гематологічних пухлин (таких як мієлома, лейкоз і лімфома). Типи раку, що представляють інтерес, включають, але не обмежуються ними, мієлофиброз, тромбоцитемію, мієлодиспластичний синдром і мієлогенний лейкоз.
Ї00458)| Розглянуті сполуки можуть бути використані для лікування гематологічних злоякісних утворень і мієлопроліферативних розладів, включаючи, але не обмежуючись ними, есенційну тромбоцитемію (ЕТ), поліцитемію віра (РМ), хронічний мієлогенний лейкоз (СМ), мієлофіброз (МЕ), хронічний нейтрофільний лейкоз, хронічний еозинофільний лейкоз і гострий мієлогенний лейкоз (АМІ). Розглянуті сполуки можуть бути використані для лікування мієлодиспластичних синдромів, які включають такі захворювання як рефрактерна анемія, рефрактерна анемія з надлишком бластів, рефрактерна цитопенія з мультилінійною дисплазією, рефрактерна цитопенія з однолінійної дисплазіюєй і хронічний мієломоноцитарний лейкоз (СММІ). Розглянуті сполуки можуть бути використані для лікування гематологічних захворювань, таких як описані в заявці на патент РСТ Мо РСТ/О513/070437, поданої 15 листопада 2013 року, повний опис якої включено в цей документ за допомогою посилання. 004591) Відповідно, сполуки, представлені в цьому документі, є придатними для лікування широкого ряду злоякісних утворень. Більш важливо, що сполуки згідно із цим винаходом можуть бути ефективними для лікування, що забезпечує високе диференціювання між злоякісними й нормальними клітинами, дозволяючи уникнути багатьох шкідливих побічних ефектів, що виникають при використанні більшості сучасних хіміотерапевтичних режимів, заснованих на агентах, які неселективно нищать клітини, що діляться. Крім того, сполуки згідно із цим винаходом більш ефективним, чому еквівалентні незв'язані олігонуклеотиди, що означає, що вони можуть бути введені в більш низьких дозах, забезпечуючи підвищену безпеку й істотне зниження вартості лікування. Таким чином, один з аспектів цього винаходу являє собою спосіб лікування рака у пацієнта, що включає ведення пацієнтові терапевтично ефективної дози сполуки згідно із цим винаходом. Інгібітори теломерази, включаючи сполуки згідно із цим винаходом, можуть бути використані в комбінації з іншими засобами лікування рака, включаючи хірургічне видалення первинних пухлин, хіміотерапевтичні агенти й радіаційне лікування. Отже, цей винахід стосується сполук і композицій, представлених у цьому документі, для застосування як лікарського засобу. Даний винахід стосується також сполук і композицій, бо представлених у цьому документі, для застосування при лікуванні або попередженні одного зі злоякісних захворювань, згаданих вище.
І00460| Для терапевтичного застосування сполуки згідно із цим винаходом готують у терапевтично ефективній кількості з фармацевтично прийнятним носієм. У будь-яку дану лікарську форму може бути введена одна або більше сполук згідно із цим винаходом (наприклад різні компоненти, що мають, Ї або 0). Фармацевтичний носій може бути твердим або рідким. Рідкі носії можуть бути використані при одержанні розчинів, емульсій, суспензій і композицій під тиском. Сполуки розчиняють або суспендують у фармацевтично прийнятній рідкій допоміжній речовині. Підходящі приклади рідких носіїв для парентерального введення препаратів олігонуклеотидів включають воду (яка може містити добавки, наприклад, похідні целюлози, переважно розчин карбоксиметилцелюлози натрію), фосфатно-сольовий буферний розчин (РВ5), спирти (включаючи одноатомні спирти й багатоатомні спирти, наприклад, гліколі) і їх похідні, а також олії (наприклад, фракціонована кокосова олія й арахісова олія). Рідкий носій може містити інші підходящі фармацевтичні добавки, включаючи, але не обмежуючись ними, такі: солюбілізатори, суспендуючі агенти, емульгатори, буфери, загусники, барвники, регулятори в'язкості, консерванти, стабілізатори й регулятори осмолярності.
Ї00461| Для парентерального введення сполук носій також може представляти собою маслянистий складний ефір, такий як етилолеат і ізопропілміристат. Для застосування в стерильних рідких формах композицій для парентерального введення є придатними стерильні носії.
І00462| Стерильні рідкі фармацевтичні композиції, розчини або суспензії, можуть бути використані, наприклад, за допомогою внутрішньоочеревинної ін'єкції, підшкірної ін'єкції, внутрішньовенно або локально. Олігонуклеотиди також можуть бути введені внутрішньом'язово або через судинний стент. 004631) Рідкий носій для композицій під тиском може представляти собою галогенований вуглеводень або інший фармацевтично прийнятний агент-витісник. Такі композиції під тиском також можуть бути інкапсуловані в ліпіді для доставки за допомогою інгаляції. Для введення інтраназальною або інтрабронхіальною інгаляцією або інсуфляцією олігонуклеотиди можуть бути приготовлені в композицію у вигляді водного або частково водного розчину, який може бути потім використаний у формі аерозолю.
Зо 00464) Сполуки можуть бути введені локально у вигляді розчину, крему або лосьйону, за допомогою лікарської форми з фармацевтично прийнятними носіями, що містить активну сполуку. 00465) Фармацевтичні композиції згідно із цим винаходом можуть бути перорально введені в будь-якій прийнятній лікарській формі, включаючи, але не обмежуючись ними, лікарські форми в капсулах, таблетках, порошках або гранулах, а також у вигляді суспензій або розчинів у водному або неводному середовищі. Фармацевтичні композиції та/або лікарські форми, що містять олігонуклеотиди згідно із цим винаходом, можуть містити носії, змащувальні речовини, розріджувачі, загусники, ароматизатори, емульгатори, диспергуючі добавки або зв'язувальні речовини. У випадку таблеток для перорального застосування традиційно використовувані носії включають лактозу й кукурудзяний крохмаль. Також можуть бути додані змащувальні агенти, такі як стеарат магнію. Для перорального введення у формі капсули придатні розріджувачі включають лактозу й висушений кукурудзяний крохмаль. Якщо потрібні водні суспензії для перорального застосування, активний інгредієнт об'єднуть із емульгуючими й суспендуючими агентами. При необхідності також можуть бути додані деякі підсолоджувачі, ароматизатори або барвники. (00466) Незважаючи на те, що сполуки згідно із цим винаходом мають чудові характеристики проникнення в клітини й тканини, вони можуть бути приготовлені для забезпечення ще більшої переваги, наприклад, у ліпосомних носіях. Застосування ліпосом для полегшення клітинного поглинання описане, наприклад, у патенті США Мо 4897355 і в патенті США Мо 4394448.
Складання й одержання ліпосом описане в численних публікаціях. Сполуки також можуть бути приготовлені в композицію за допомогою змішування з додатковими підсилювачами проникнення, такими як незв'язані форми ліпідних фрагментів, описаних вище, включаючи жирні кислоти і їх похідні. Приклади включають олеїнову кислоту, лауринову кислоту, капринову кислоту, міристинову кислоту, пальмітинову кислоту, стеаринову кислоту, лінолеву кислоту, ліноленову кислоту, дикапрат, трикапрат, рецинолеат, моноолеїн (також відомий як 1- моноолеїл-рац-гліцерин), дилаурин, каприлову кислоту, арахідонову кислоту, гліцерил-1- монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнітини, ацилхоліни, моно- і дигліцериди і їх фармацевтично прийнятні солі ( тобто олеат, лаурат, капрат, міристат, пальмітат, стеарат, лінолеат і т.д.). 60 Ї00467| Можуть бути використані складні лікарські форми, що містять один або більше агентів посилення проникнення. Наприклад, жовчні солі можуть бути використані в комбінації з жирними кислотами для одержання складних лікарських форм. Ілюстративні комбінації включають хенодезоксихолеву кислоту (СОСА), звичайно використовувану в концентраціях від близько 0,5 до 2 95, комбіновану з капратом натрію або лауратом натрію, звичайно використовуваним у концентраціях від близько 0,5 до 5 95. 00468) Фармацевтичні композиції та/або лікарські форми, що містять олігонуклеотиди згідно із цим винаходом, також можуть містити хелатоутворюючі агенти, поверхнево-активні речовини й поверхнево-неактивні речовини. Хелатоутворюючі агенти включають, але не обмежуються ними, етилендіамінтетраацетат динатрію (ЕДТА), лимонну кислоту, саліцилати (наприклад, саліцилат натрію, 5-метоксисаліцилат і гомованілат), М-ацильні похідні колагену, лаурет-9 і М- аміноацильні похідні бета-дикетонів (єнамінів). Поверхнево-активні речовини включають, наприклад, лаурилсульфат натрію, поліоксіетгилен-З-лауриловий ефір і поліоксіетилен-20- цетиловий ефір; і емульсії перфторованих сполуку, такі як ЕС-43. Поверхнево-неактивні речовини включають, наприклад, ненасичені циклічні сечовини, 1-алкіл- і 1- алкенілазациклоалканонові похідні а також нестероїдні протизапальні агенти, такі як диклофенак натрію, індометацин і фенілбутазон.
Ї00469| Таким чином, в іншому аспекті цього винаходу представлений спосіб складання фармацевтичної композиції, що включає забезпечення сполуки, описаної в цьому документі, і комбінування вказаної сполуки з фармацевтично прийнятною допоміжною речовиною.
Переважно, представлена сполука має фармацевтичну чистоту, як описано нижче. Вказаний спосіб може додатково включати додавання до сполуки, до або після додавання допоміжної речовини, агента для посилення проникнення.
І00470| Фармацевтична композиція може відповідати стандартам фармацевтичної чистоти.
У деяких випадках, для застосування як активного інгредієнта у фармацевтичному препараті, розглянута сполука очищена від реакційноздатних або потенційно імуногенних компонентів, що присутні у суміші, у якій вона було отримана.
Ї00471| Може бути взята аліквота фармацевтичної композиції й упакована у вигляді однієї дози або багатодозових одиниць. Вимоги до дози для лікування олігонуклеотидною сполукою варіюються залежно від конкретних використовуваних композицій, способу введення, тяжкості
Зо присутніх симптомів, форми сполуки й конкретного суб'єкта, що підлягає лікуванню. 00472) Фармацевтичні композиції згідно із цим винаходом можуть бути введені суб'єктові в лікарській формі й у кількості, ефективних для досягнення клінічно бажаного результату. Для лікування раку бажані результати включають зменшення маси пухлини (обумовленою пальпацією або візуалізацією; наприклад, радіографією, радіонуклідним скануванням, КАТ скануванням або МРТ), зменшення швидкості росту пухлини, зменшення швидкості утворення метастазів (що визначається, наприклад, гістохімічним аналізом біопсійних зразків), зменшення біохімічних маркерів (включаючи загальні маркери, такі як СУК, і пухлиноспецифічні маркери, такі як РЗА у сироватці) і поліпшення якості життя (обумовлене клінічною оцінкою, наприклад, за шкалою Карновського), збільшення часу до прогресування, виживаності без ознак захворювання й загальної виживаності. 00473) Кількість сполуки на одну дозу й кількість доз, необхідних для досягнення вказаних ефектів, варіюється залежно від багатьох факторів, включаючи показання для лікування захворювання, характеристики пацієнта, що підлягає лікуванню, і спосіб введення. У деяких випадках лікарська форма й спосіб введення забезпечують локальну концентрацію у вогнищі захворювання від 1 мкм до 1 нм сполуки. 004741) У цілому, сполуку вводять у концентрації, яка забезпечує ефективні результати, не викликаючи шкідливих або згубних побічних ефектів. Вказана концентрація може бути досягнута за допомогою введення однієї одиничної дози або за допомогою введення дози, розділеної на зручні субодиниці, з підходящими інтервалами протягом доби.
КОРИСНІСТЬ
Ї00475| Способи й композиції згідно із цим винаходом, наприклад, описані вище, знаходять застосування в різних галузях використання. Галузі застосування, що представляють інтерес, включають, але не обмежуються ними: терапевтичні застосування, діагностичні застосування, дослідницькі застосування й застосування для скрінингу, як докладніше описане нижче. 00476) Розглянуті сполуки знаходять застосування в багатьох терапевтичних галузях. У деяких варіантах реалізації способи одержання олігонуклеотидів застосовують для одержання олігонуклеотидів, які забезпечують терапевтичний ефект. Типи захворювань, які можна лікувати із застосуванням композицій згідно із цим винаходом, безмежні. Наприклад, вказані композиції можуть бути використані для лікування ряду генетичних захворювань. У деяких варіантах бо реалізації розглянуті способи й композиції мають антисмислове застосування. У деяких варіантах реалізації розглянуті способи й композиції мають антигенне застосування. У деяких варіантах реалізації розглянуті способи й композиції мають застосування для інгібування теломерази, як описано в патенті США 6835826 і в публікації США 20120329858, повний опис яких включено в цей документ за допомогою посилання.
Розглянуті сполуки й способи знаходять застосування в різних діагностичних областях, включаючи, але не обмежуючись ними, розробку клінічної діагностики, наприклад, іп міо діагностики або агентів для візуалізації пухлини іп мімо. Такі застосування є придатними для діагностики або підтвердження діагнозу хворобливого стану або схильності до нього. Вказані способи також є придатними для моніторингу прогресування захворювання та/або реакції на лікування в пацієнтів, у яких раніше діагностовано захворювання.
ПРИКЛАДИ
Ї00477| Наступні приклади представлені для забезпечення фахівцям у цій галузі техніки повного розкриття й опису способів здійснення й застосування цього винаходу, і вони не призначені для обмеження обсягу, який автори винаходу вважають своїм винаходом, а також вони не призначені для того, щоб показати, що представлені нижче експерименти є всіма або єдиними проведеними експериментами. Були початі зусилля для забезпечення точності відносно використовуваних чисел (наприклад, кількості, температури і т.д), але слід ураховувати деякі експериментальні помилки й відхилення. Якщо не вказане інше, частини є масовими частинами, молекулярна маса є середньоваговою молекулярною масою, температура вказана в градусах Цельсію, а тиск дорівнює або близько до атмосферного. Під «середнім» мається на увазі середнє арифметичне. Можуть бути використані стандартні скорочення, наприклад, п.о., пара(-и) основ; тис.о., тисяча(-и) основ; пл, піколітр(-и); с або сек., секунда(-и); хв., хвилина(-и); год або г., година(-и); а.к., амінокислота(-и); тис.о., тисяча(-и) основ; п.о., пара(-и) основ; нт, нуклеотид(-и), іт., внутрішньом'язово (-ий); |і.р., внутрішньоочеревинно (-ий); 5.с., підшкірно(-ий); і т.п.
Загальні способи синтезу 00478) Доступні багато загальних посилань, що забезпечують, загальновідомі схеми і умови хімічного синтезу, що є придатними для синтезу описаних сполук (див., наприклад, Зтійй і
Магси; Магсй, Адмапсей Огдапіс Спетівігу: Неасіїоп5, Меспапізт»5, апа бігисіиге, п'яте вид.,
УМіеу-іпіегосіепсе, 2001; або Модеї, А Техібоок ої Ргасіїса! Огдапіс Спетівігу, Іпсіваїпуд Очаїнакме
Огодапіс Апаїузів, Ай Едйоп., Мем МогКк: Гопдтап, 1978).
Ї00479| Сполуки, описані в цьому документі, можуть бути очищені будь-яким способом очищення, відомим у цій галузі техніки, включаючи хроматографію, таку як ВЕРХ, препаративна тонкошарова хроматографія, колонкова флеш-хроматографія й іонообмінна хроматографія.
Може бути використана будь-яка підходяща нерухома фаза, включаючи нормальні й обернені фази, а також іонні смоли. У деяких варіантах реалізації описані сполуки очищають хроматографією на силікагелі та/або оксиді алюмінію. Див., наприклад, Іпігодисіоп То Модегп
Пацій Сптотайюдгарну, 2па Еайоп, єд. І. В. Зпуадег і у). у. КігкКІапа, дУопп Уміеу апа Зопв5, 1979; і
Тпіп Гауег Спготаїодгарну, єд. Е. гай, Зргіпдег-мепад, Мем/ Могк, 1969.
Ї00480| Під час будь-яких способів одержання розглянутих сполук може бути необхідно та/або бажано захистити чутливі або реакційноздатні групи будь-яких розглянутих молекул. Це може бути здійснене за допомогою підходящих захисних груп, описаних у відомих працях, таких як У. Е. МУ. Мсотіє, "Ргоїесіїме сгоимрз іп Огдапіс Спетівзігу", Ріепит Ргез5, Гопдоп апа Мем/ мок, 1973, в Т. МУ. Сгеепе і Р. б. М. М/шв5, "Ргоїесіїме Сгошмрз іп Огдапіс Зупіпевів", Тпіга еайіоп., М/Пеу,
Мем ХоїКк 1999, в "Те Рерііде5"; Моїште З (ей.: Е. Сго55 і). Меіепрогег), Асадетіс Ргез5, І опдоп апа Мем/ Моїк, 1981, в "Мешодеп адег огдапізспеп Спетіє", Ноибеп-М/еуї, 4 єд., Моїште 15/,
Сеогд Тпіете Мепад, зішідагі 1974, в Н.-О0. ЧаКкибКе апа Н. уезспеїй, "Атіпозацйгеп, Рерійае,
Ргоївіпе", Мепад Спетіє, М/еіпнєїт, ЮОєепіїй Веєасі, апа Вавзеєї! 1982, та/або в щдоспеп Гептапп, "Спетіє дег Копіеппуагаге: Мопозассвагіде апа Оегімаїе", беогд Тнієте Мепад, зішшдапй, 1974.
Захисні групи можуть бути вилучені на підходящій наступній стадії за допомогою способів, відомих у цій галузі техніки.
Ї00481| Розглянуті сполуки можуть бути синтезовані різними способами синтезу із застосуванням наявних у продажі вихідних матеріалів та/або вихідних матеріалів, отриманих звичайними способами синтезу. Численні приклади способів синтезу, які можуть бути використані для синтезу сполук, описаних у цьому документі, описані на представлені нижче схемах.
ПРИКЛАД 1
І00482| Синтез іметельстату натрію із застосуванням димерних фосфорамідитів.
Ї00483| Іметельстат натрію синтезували за допомогою твердої основи (основа зі скла з бо контрольованим розміром пор або полімерна тверда основа) і мономерних фосфорамідитів,
таких як АВ: або Аеті, С, (Ви | Т амідити, у наступній послідовності: 5Бк-ТАаасатТтТАСАСАА-МН»-3" (5ЕО ІО МО:3), де К - ліпідна лінкерна група (004841
Таблиця 2
Структура амідитів і твердої основи
М и М Му 1 . ГФ) -/ 3-Тритиламіно-Ме- Р-О М диметилформамідино-2",3'- ря о
Амідит Доті дидезоксіаденозин-5'-(2- АЖ ціаноетил)-М,М-діїзопропіл- НМ фосфорамідит ла
СМ М
1 | А 3- «В о) М М
Монометокситритиламіно- М є
Амідит Доті Ме-диметилформамідино- А і (ММ) 2,3-дидезоксіаденозин-5'- НМ (2-ціаноетил)-М,М- с діззопропіл-фосфорамідит Фе
ОМе чт
СМ М
3-(Диметил-заміщений | А піксил)аміно-Мв- мо О. ам М
Амідит Доті диметилформамідино-27,3"- (піксил) дидезоксіаденозин-5'-(2- А нк ціаноетил)-М,М-діїзопропіл- Ф фосфорамідит ФІ, а
Мт
СМ М
! ! | А 3'і-Диметокситритиламіно- Р Ге! М М , Ме-диметилформамідино- М ль дті (М 2",3'-дидезоксіаденозин-5'- А 3 (2-ціаноетил)-М,М- НИ діззопропіл-фосфорамідит (и ОоМе
Мео | с бо
Таблиця 2
Структура амідитів і твердої основи
Структура и дл МН сх о ме! . р-О 3-Тритиламіно-Ме-бензоїл- ря о) й 2,3-дидезоксіаденозин-5'- в2
Амідит А (2-ціаноетил)-М,М- рак діззопропіл-фосфорамідит НМ о
МУ "с ос 3- Тритиламіно-М-бензоїл- ре 9) мо . 2,3'-дидезоксицитидин-5'- М-Р-о діззопропіл-фосфорамідит чих (6)
М о су 3-Тритиламіно-М2- уд МОМ тм ізобутирил-2", 3'- Р-О о но
Амідит (Ви) дидезоксигуанозин-5'-(2- 6) ціаноетил)-М,М-діїзопропіл- т МН фосфорамідит М
М
К о зе о, мо 3-Тритиламіно-3'- ра РУ
Амідит Т дезокситимідин-5'-(2- м о о д ціаноетил)-М,М-діізопропіл- А фосфорамідит МН
Таблиця 2
Структура амідитів і твердої основи
Структура 1 нМ-тверда ясновБаА же ве
Кей ш-4З -532Ої З н
Є А ро и ва и и и дя З-пальмітоїламідо-1-О-(4,4-| - ММ
Пальмітоїл- вет а : і диметокситритил)-2-0- : Ї аміногліцерин- й . щИ. сукцинілпропандіол, скляна че твердая основа ! основа з контрольованим ? або розміром пор 41 Я Полімерня тверда всновя . би
Мікорпазепі З-пальмітоїламідо-1-0-(4,4- А Щ пальмітоїл 400 иметокситритил)-2-0- | | Е полімерна д ситр ; ей онно сукцинілпропандіол, я о в тверда основа 1 гій Хушн шин Н ч. тя тк, вол ння рань мя ит К полімерна тверда основа | | ан и в с о о
ЩІ та їеї о
ІЇ00485| Іметельстат має скелет МРБ5, аналогічний до вихідного фосфорамідиту, і тому ефективність зв'язування становить приблизно 92 95. Використання димерних фосфорамідитів забезпечує можливість використання меншої кількості стадій зв'язування, що може приводити до більш високого виходу й чистоті на проміжній стадії після синтезу. За способом, описаним на схемі синтезу 1, одержували наступні димерні фосфорамідити, представлені нижче:
ТА, АА, СА, ОО і СТ. 00486) Для синтезу димерних фосфорамідитів потрібні були три мономерних амідати (4а- 4с, схема 1) і три 5-ТВОМ5-3' амінонуклеозидних проміжних сполук (За-3с, схема 1) для нуклеозидів А, б і Т. ТВОМ5 являє собою трет-бутилдиметилсиліл. Проміжні сполуки (За-Зс, схема 1) одержували із двох типів вихідних матеріалів, 5'-ОН-3-МН-ТВ-2'-дезокси-М- бензоїладенозин (Та), 5-ОН-3-МН-ТВ-2'-дезокси-М-ізобутирилгуанозин (15) і 5-0ОН-3- амінотимідин (2). Тг або Ті стосується тритилу.
І00487| 5-гідроксильні групи в Та і 15 захищали групами ТВОМ5, використовуючи трет- бутилдиметилсилілхлорид і імідазол у ДМФА (М,М-диметилформамід), а потім тритильні групи в 3З'-аміноположеннях видаляли обробкою оцтовою кислотою у воді. Отримані проміжні сполуки,
За-3с, зв'язували з відповідними амідатами, 4а-4с, використовуючи бензилмеркаптотетразол (ВМТ) як активатор в диметилформаміді, а наступне сульфування (Р ІІ до Р М) проводили із застосуванням гідриду ксантану й піридину (схема 1). У цілому, реакція сульфування була завершена легко. Результат реакцій зв'язування змінювався залежно від вмісту вологи, часу реакції й еквівалентності амідатів. Бажаними були безводні умови із застосуванням газоподібного азоту або аргону, а також швидке проведення реакції зв'язування, оскільки більш тривалий час реакції приводив до більшої кількості побічних продуктів, таких як продукти окиснення Р (М). Проміжні сполуки димеру Р (ІІІ) мали різну стабільність. Проміжний продукт ТА був досить стабільним для контролювання завершення реакції за ТШХ і ВЕРХ. Інші проміжні продукти Р (І) були недостатньо стабільними для контролювання реакції зв'язування, і завершення реакції перевіряли після завершення сульфування (схема 1). Сполуки Р(М) більш стабільні для димерів АА, СА, об і СТ. Для димеру ТА (5є) використовували 1,3 еквівалента амідату (4с) для зв'язування, а для інших чотирьох димерів (5ач5а) треба було приблизно З
Зо еквіваленти амідатів (4а і 45) (схема 1). Амідатні мономери 4а-4с одержували адаптацією способів, описаних у патенті США 5859233. 00488) Схема 1. Схема синтезу димерних амідатів
(Р-реагент являє собою ціаноетокси-біс(М,М-діззопропіламіно)фосфін) як
Урннннннюй й жор ах ще и такі х ХМ сн м ел ВАШ. Во х А 7 ї в Зк: Виседеня ча вед С твомер-я бен ге сок Унню яю й лм
Звонбу І ї У каші: шк і Я щй прпарид незнтану, придия шен щи і За. віє х й томі мідазол, ДЕК ДЕ ная ще | ЗБЕ
Зк ї
Гана паче я у як щ аю оо нори яр, сон фу щ сне ще не в в-в-8 . Не-тридиян І 2п-в-в Е П-певтент, ВМТ. ЕЕ д-в-в як
КО ГЗ3и ----Нтт я й ЕЙ мн ш-К в ща Ас жа кн я оз Ка | Та ра і чі Ге ї ! ту : ій пашкя яТУ Їхї ша ех й Я сяк я й: най " пай й ее щ и да влид вбхдея и ся та ве д'вде пров дреди Бе в'єде де ТВ. ВИ, деедих
Бе. во ди к У. Вірю ех Дік дія ве. вах вт ваним во ТВ вчех. дет
Ба Вт дя Ва ет вн Ко, ВК В нд
Ї00489| Захисну групу ТВОМ5 біля 5'-гідроксильної групи видаляли з використанням
НЕ"піридину в ацетонітрилі а остаточне фосфітилування проводили за допомогою фосфітилуючого агента в присутності ВМТ ії М-метилімідазолу (ММІ) з одержанням димерних тіофосфорамідатів 7а-7е (схема 1). Кінцеві продукти (7) і три проміжні сполуки (3, 5, 6) очищали колонковою хроматографією. Вихід вказаної стадії й загальні виходи реакцій з кількостями отриманих готових амідатів представлено в таблиці 3. Узагальнення результатів аналізів для п'яти димерних амідатів презентовано в таблиці 4. 00490)
Таблиця З
Виходи синтезу димерів
Димер 5-ТВОМ5-3- Б-ТВОМ5-3-МН- 5-ОН-3-МН-Ті- Димерний Загальний (кількість) | амінонуклеозид Ти-димер димер амідат вихід ( 90)
ТА
58 до 91 96 71 96 51 96 19,1 96 (2,9 г)
АА о о о о о 17 58 до 82 о 70 до 47 95 15,6 96
А о о о о о 58 до 77 о б6О о 55 96 14,7 96 (3,4 у) со о о о о о 58 до 67 до 57 9о 38 95 8,4 до (1,9 3) ат о о о о о 58 до 99 96 42 9 38 95 9,2 до (1,8 у 00491
Таблиця 4
Узагальнення аналізу димерів ее ГІ 00000твяко 00000 екю клен о 148,281(с), 148,193(с), 73,811(с), 73,723(с), 11694
Товт те бас) о 148,156(м), 74,244(с), 73,993(с), 72,912(с), 1268,5 (Ма) о 148,159(м), 73,993(с), 73,811(с), 73,295(с), 11514 о 148,168(м), 148,011(с), 74,175(с), 73,942(с), 12645 тВИто о, тео, 00492) Спосіб синтезу димерних тіофосфорамідатів
Ї00493| 1) Одержання 5-ТВОМ5-3-амінонуклеозиду ( для аденозину й гуанозину).
І00494|а) Розчиняли 5-ОН-3-МН-ТІ-2'і--дезоксинуклеозид (1,0 екв.) і імідазол (5,0 екв.) у
ДМФА й нагрівали до 60 ес.
І00495| Б)Додавали ТВОМ5ЗСЇІ (1,2 екв.) до розчину, що нагрівається, потім перемішували протягом 1 години при 60260.
Ї00496)| с)Додавали насичений водний розчин МАНСОз до реакційної суміші, потім екстрагували етилацетатом.
І00497| ФОрганічний шар промивали насиченим водним розчином МАНСО»з і насиченим сольовим розчином. 00498) е)Додавали безводний Маг5О»х до відділеного органічного шару для висушування, потім фільтрували. 00499) )Фільтрат концентрували.
І00500| 9)Додавали 80 96 водний розчин оцтової кислоти до концентрованої реакційної суміші, потім перемішували протягом 1 години при температурі навколишнього середовища.
Ї00501| п)Видаляли твердий продукт фільтруванням, потім додавали насичений водний розчин МАНСО»з фільтрату, потім чотири рази екстрагували етилацетатом.
І00502| Органічний шар висушували над безводним Ма»5О»:, потім видаляли тверду речовину фільтруванням. 00503) ))Фільтрат концентрували, потім очищали колонковою хроматографією (елюент: етилацетат: метанол-:-9:1 -» 5:11). 00504) Ю)5-ТВОМ5-3'-аміно-2і-дезоксинуклеозид одержували у вигляді білої твердої речовини. 00505) 2) Одержання 5-ТВОМ5-3-амінонуклеозиду ( для тимідину) 00506) а)їРозчиняли 5-ОН-3'-аміно-2'і-дезоксинуклеозид (1,0 екв.) і імідазол (5,0 екв.) у
ДМФА й нагрівали до 60260.
І00507| О)Додавали ТВОМ5ЗСЇІ (1,2 екв.) до розчину, що нагрівається, потім перемішували
Зо протягом 1 години при 6090. 00508) с)Додавали насичений водний розчин МАНСО»з до реакційної суміші, потім чотири рази екстрагували етилацетатом.
Ї00509| 4)Додавали безводний Маг5О»х до органічного шару для висушування й фільтрували. 005101 е)Фільтрат концентрували.
Ї00511| ОКонцентровану неочищену суміш очищали колонковою хроматографією (елюент: етилацетат: метанол--15:1 -2 5:1). 005121 4)5- ТВОМ5-3-амінотимідин одержували у вигляді білої твердої речовини. 005131) 3) Одержання димеру 5- ТВОМ5-3'-МН-Ту
І00514а)Для видалення вологи 5-ЇТВОМ5-3-амінонуклеозид (1,0 екв) і ВМТ (бензилмеркаптотетразол, 1,0-5,0 екв.) піддавали азеотропній перегонці з ацетонітрилом три рази, потім розчиняли в ДМФА при температурі навколишнього середовища в атмосфері М».
Ї00515| Б)По краплях додавали мономерний амідат (3,0 екв.) у ДМФА (використовуючи мінімальну кількість для розчинення мономерного амідату) до реакційного розчину, потім перемішували протягом 1 години при температурі навколишнього середовища в атмосфері азоту. Мономерний амідат одержували відповідно до способів, описаних в патенті США 5859233. 00516) с)Додавали гідрид ксантану (2,0 екв.) і піридин (4,0 екв.) до реакційного розчину, потім перемішували протягом 1 години при температурі навколишнього середовища в атмосфері азоту.
ІЇ00517|4)Додавали насичений водний розчин МАНСОз до реакційної суміші, потім екстрагували етилацетатом. 00518) е)Водний шар екстрагували етилацетатом.
І00519| ОВідділені органічні шари поєднували, а потім промивали насиченим водним розчином МАНСО:з і насиченим сольовим розчином.
І00520| 9)Додавали безводний Маг50Ох до органічного шару для висушування й фільтрували, потім концентрували фільтрат.
І00521| пП)Концентровану неочищену суміш очищали колонковою хроматографією (елюент: етилацетат: метанол--1.5:1 -» тільки ЕА). (00522) Димер 5-ТВОМ5-3-МН-Тт одержували у вигляді блідо-жовтої твердої речовини. 00523) 4) Одержання димеру 5-ОН-3-МН-Ттг (00524) а)Розчиняли димер 5-ТВОМ5-3-МН-Ттг (1,0 екв.) в АСМ (20 мл) в атмосфері азоту, а потім додавали розчин НЕ-піридину при перемішуванні при температурі навколишнього середовища протягом 1,5 годин.
І00525| Б)УДодавали насичений водний розчин МАНСОз до реакційної суміші, потім екстрагували етилацетатом. 00526) с)Відділений органічний шар промивали насиченим водним розчином МАНСсО:з і насиченим сольовим розчином.
І00527| 4)Додавали безводний Маг50О» до органічного шару для висушування й фільтрували, потім фільтрат концентрували.
І00528| е)Концентровану неочищену суміш очищали колонковою хроматографією (елюент: етилацетат, метанол, спільний розчинник метиленхлорид)
І00529| ПОодержували димер 5-ОН-3-МН-Тт у вигляді білої твердої речовини. 005301 5) Одержання димерного тіофосфорамідату (димерного амідату)
Зо Ї00531| А)Для видалення вологи димер 5'-гідрокси-3-МН-Тг піддавали азеотропній перегонці з ацетонітрилом три рази, потім розчиняли в АСМ при температурі навколишнього середовища в атмосфері азоту. 00532) Ю)Додавали ВМТ (1,3 екв.), ММІ (М-метилімідазол, 0,3 екв.) ії фосфітилуючий реагент (2,0 екв.) до реакційного розчину, потім перемішували протягом 1 години при температурі навколишнього середовища.
Ї00533| с)Додавали насичений водний розчин МАНСОз до реакційної суміші, потім екстрагували етилацетатом.
І00534| 4)Відділений органічний шар промивали насиченим сольовим розчином. 00535) е)Додавали безводний Маг50О» до органічного шару для висушування й фільтрували, потім концентрували фільтрат.
ІЇ00536| ОРозчиняли концентровану реакційну суміш у метиленхлориді (10 мл), потім додавали гексан для осадження твердої речовини.
І00537| 9)Декантували верхній шар розчину для видалення надлишку фосфітилуючого реагенту. (Повторювали процес декантації 5 раз). 00538) п) Тверду речовину, що залишилася, очищали колонковою хроматографією (елюент: етилацетат, ацетон, спільний розчинник метиленхлорид) 00539) ДОдержували димер у вигляді білої твердої речовини. 00540) Синтез іметельстату із застосуванням димерних амідатів
І00541| П'ять димерних амідатів використовували замість мономерних амідатів як будівельні блоки для синтезу іметельстату, і результати порівнювали з результатами, отриманими для амідатів мономеру. Для зв'язування нуклеозиду С в іметельстат вибрали мономерний будівельний блок, представлений у наступній послідовності. Синтез проводили в масштабі 140 мкмоль, використовуючи АКіа Оїідоріїої 100. (00542) 5'К-ТА сі СТ ТА ВА С АД-МН» 3 (5ЕО ІЮ МО: 3) 00543) Димерні амідати використовували як будівельні блоки для одержання іметельстату.
Використовуючи реагенти й параметри синтезу, перераховані в таблицях 5А і 5В, п'ять димерних амідатів (АА, ТА, 0, ЗА і СТ) і один мономерний амідат (С), представлений вище, зв'язували з одержанням послідовності іметельстату на СРО з низьким завантаженням (РА! М 0051, 64,6 мкмоль/г-). Час зв'язування становив 500 з, і використовували еквівалентність бо амідитів 10. Після твердофазного синтезу основу обробляли етанольним розчином аміаку
(МНАОН:ЕЮН-З:1 ( об./06.)) при 659С протягом 15 годин. Неочищений продукт виділяли випаровуванням розчинників і аналізували за допомогою УФ спектроскопії й ВЕРХ. 00544) Таблиця 5. Ілюстративні параметри синтезу (А) і склад реагентів (В) для синтезу олігонуклеотидів. АСМ являє собою ацетонітрил. ОСА являє собою дихлороцтову кислоту.
РАО5 являє собою фенілацетилдисульфід. ЕТТ являє собою 5-етилтіо-1 Н-тетразол. 5 Промив 120350 о5МЕТТВ АСК й затнв. ЗД то 22МРАВЗВАСМИТВ-КІ й давня 2035 ММіІвАСМ
З Пахзд ЗО - -- - -
Ів Заг ІВСАТІТІАЄМ- 8
МО оАвктво 1300150 із Пауза ЗАНО 13 Промнв. 30 ЗО із Оксенн. то л5о 15 Пауза 300.0 16 Оксин. ій0б 350 17 Пвуза ко 15 Промнв. б 350 19 КепаА 3 200 2 КепВ 1.4 15 1 Пауза 1,5 ра КепА Зх іхо 24 КепВ т 150 24 Мвузя 1,5
ТЕ Промня. 5.0 З5О 00545) Використовуючи АКіа Оіїдорії 100, проводили синтез у масштабі 140 мкмоль із застосуванням мономерного блокового способу й димерного блокового способу. Умови синтезу були аналогічними до умов, вказаних у таблицях 5А-В. (00546)
Таблиця 6
Параметри синтезу в масштабі 140 мкмоль (АКТА Оіідоріої 100)
Синтез іметельстатуІСинтез іметельстату
Параметри із застосуванням із застосуванням мономерів димерів
СТ (хв.) З хв. (2-ий 6 хв.)
Розділення блоків (5 95 ОСА У толуолі) 11,2 СУ
Лінійний потік (см./год) 450 см./год 0,1 М, 2,5 екв.
Амідат 0,1 М,2,5екВ. | (останнійдА: 3,0 (останні 2:3,0 екв.) екв.) ' 0,5 М ЕТТ (амідат:активатор, 46)
Зв'язування ; ти :
СТ пропускання потоку 18 хв. (хв.) "
СТ рециклу (хв.) 1,8 хв. (Тий: 4 хв.)
Тіолування СТ (хв.) (01 М РАОЗ 3,5 СМ в АМ:СТО-9:1) Лінійний потік (см./год) 80 см./год
Кепування СТ (хв.) 1 хв. ий: 2 хв.) (Кеп А: 20 95 ММІ в АМ, 1 СМ (ий: 2 СМ)
Кеп В: ІВОА:СТО:АМ -1:1:8)) Лінійний потік (см./год) 120 см./год
Таблиця 6
Параметри синтезу в масштабі 140 мкмоль (АКТА Оіідоріої 100)
Синтез іметельстатуІСинтез іметельстату
Параметри із застосуванням із застосуванням мономерів димерів оса двдвяю М лав
Й Лінійний потік (см./год) 52 см./год
І00547| Аналіз олігонуклеотидів за допомогою ВЕРХ-МС показав, що чистота РІ Р (продукту повної довжини) була суттєво поліпшена при використанні для синтезу п'яти димерних блоків, з одержанням чистоти 72 95 за ВЕРХ, як показано в таблицях 7 і 8. Неочищений олігонуклеотид, отриманий із застосуванням мономерних блоків, продемонстрував чистоту лише 45 95 РІ Р. Крім того, загальна 00 (оптична густина) збільшилася більш ніж у два рази, з 5,299 до 11,623, що дає неочищений вихід 3,34 г/ммоль. Вміст (М-1) продукту й РО знизилося до 2,4 95 з 11,2 95 ї до 595 з 20 95, відповідно. 00548) Перевага застосування димерних блоків включає той факт, що час одержання скорочений, а кількість розчинників, використовуваних під час твердофазного синтезу, знижена. 00549)
Таблиця 7
Результати аналізу для синтезу в масштабі 140 мкмоль
Синтез іметельстату із Синтез іметельстату із
Показники застосуванням застосуванням димерного мономерного амідату амідату за АзЬ 74.0 Зь
ВЕРХ Хвостовий пік 1 о о
Загальна оптична
УФ густина (ТОЮ) 5299 11623 70,3 9 71,9 95 16,4 96 ме 19,9 96
Ї00550)| Синтез п'яти димерних амідатів був успішно завершено з виходом 9 95-19 95 з 5'- гідрокси-3'-амінонуклеозиду або 5'-гідрокси-3'-тритиламінонуклеозиду з одержанням 1,7-3,4 г.
Оптимізація умов реакції для кожної стадії не була ретельно вивчена. Синтез іметельстату з димерних блоків проводили в масштабі 140 мкмоль, і результати були порівнянні з даними, отриманими для синтезу із застосуванням мономерних амідатів. Димерна блокова стратегія одержання іметельстату продемонструвала істотне поліпшення, оскільки була значно поліпшена чистота й вихід, наприклад, у масштабі 140 мкмоль (чистота за ВЕРХ: димер 74,0 905 (фіг. 8), мономер 44,4 95 (фіг. 7), неочищений вихід по ТОЮ (загальної оптичної густини): димер 468 мг, мономер 213 мг). Крім того, була отримана більш низька кількість зв'язків про, оскільки мала місце менша кількість стадій зв'язування при синтезі із застосуванням димерів. 00551) Ефективність зв'язування димеру (синтез у масштабі 140 мколь ) продемонструвала, що димерний синтез має ефективність зв'язування 9б 90, тоді як мономерний синтез має ефективність зв'язування 94 95. Оскільки для димеру було проведено тільки сім зв'язувань, то вміст РР для димеру становив 71,6 9565, що близько до теоретично розрахованого значення продукту повної довжини 72 95, а для мономеру з 13 зв'язуваннями вміст РІ Р становив 45,6 95 у порівнянні з теоретичними розрахунками 44 95.
Зо І0Оо552І
Таблиця 8
Аналіз результатів для синтезу в масштабі 140 мкмоль -
Час до площі для Час 5 площі
Продукти мономерного Продукти димерного для утримання |мономерного утримання синтезу синтезу димерного (хв.) синтезу (хв.) синтез
Хвостовий пік 1 Хвостовий пік 1
Хвостовий пік 2 Хвостовий пік 2
М-2хіВи, М-2, 12 6,3 М-2-іВи, М-2, 41,3 3,9
М-сСжфенілацетил М-сжфенілацетил
Хвостовий пік З Хвостовий пік З
М-2фенілацетил, 42,3 М-2фенілацетил, 42,4 51
М-3 (М-А-А-Є М-3 (М-А-А-Є
Хвостовий пік 4 447 Хвостовий пік 4 445 16
М-З-фенілацетил " М-З-фенілацетил " "
Загальний вмісті Загальний вміст нецільових 39,8 - 54,7 49,5 нецільових 39,7 - 53,1 19,8 олігонуклеотидів олігонуклеотидів «Фенілацетил» означає продукт, отриманий у результаті реакції з окисним реагентом
ЇО0553| Синтез іметельстату із застосуванням меншої кількості стадій зв'язування забезпечує суттєво більш високу чистоту й вихід продукту повної довжини. Виділення домішок 5 забезпечує більш просте очищення іметельстату з меншою кількістю побічних продуктів, що виходять поблизу основного піка ВЕРХ, з одержанням композицій, що мають більш високу чистоту іметельстату. Таке поліпшення є бажаним для зниження вартості продуктів виробництва іметельстату натрію, наприклад, вартість продуктів може бути знижено на 30-40 95 при реалізації у виробничому масштабі. 00554) Схема 2. Схема синтезу димерного амідату СА и кл я Ге н що поля ви ої У-А У Я а зе ов пиши о дО чт деспе тваваї та й в ви тро пи я м Я Як " ше о щі. ва Би -в- т. ша к- вм й їз ва н ру Х У о-в-ї Ве щ Гл що о 0 н ох У х. Ох і г тнасаг СО т щі З дРада 0055585 г ТВАС одержували з 300 г АРО2 відповідно до способів, описаних в цьому документі, за стадіями, представленими на схемі 2. 00556) Схема 3. Схема синтезу димерного амідату АА і Їх ТІ
МН; чн; 1 нич
Ге гр и Ї ет 8 є а и ас А сл ак «р с о жав. твомо- о. | о тя й з зон - і -- с - у: -- -- ТЕН сю -- юо« : -Ю че я з їй ит З її ту -В8- МН у таБиИБО су од і г Я: 'че о 5 З я з ти І
Зк
АвАй ЯТВАРА1 ТВАРАй ТВА о о о не А. ще ях ше ст ни З
ТТ 1 си ок.
Ки Ті ро Би т от з т в "7 роми
Ж в фе -вя бу фе ще т й 1 твОМБО оо шк Ов. ве 9 г я н в ї зу н й ї ем ве й- ї м ! В ять, ві Е м я зі ; Зн- - - вив ч рен рив мета -е-еБ3 о ЯЖБ-Ж а « ее.) в (-2 А ГТ пр-о -) й У и ще ж й й Я х-й і й -й дк шу і-- е ц ік
І ЩІ ЩІ
ТВААА БААХ АЕДАВ
Ї00557| 430 г ТВАРА1 одержували з 800 г неочищеного АРАТ (чистота: 46 95) відповідно до способів, описаних в цьому документі, за стадіями, представленими на схемі 3. 00558) Схема 4. Синтез димерного амідату ТА о. в о. в не Захист МН» не Левуніловий захист - - 4: л з» с ------
НОМ НМ
Піксил 1,в-тТ 2:в-т (в) чути Зняття захисту біля 3-МН» О ні о) : - - їйївн )йїйчя | см - -р. гул
НМ, Звязування з амідитом А(ОМЕ) 5 о
Піксил Сульфування (гідрид ксантану) Ге)
З и даті нм
Тг 4 оо
Д «ВУ о; т
Зняття захисту біля У-ОН М Я -62626262626ИЙИЙИЙИИШИШИШИШИШОШОШОШО0х А ї
Щі
Фосфітилування СМ в)
НМ.
Те
Ї00559| Димерний амідат ТА (5) одержували відповідно до способів, описаних в цьому документі, за стадіями, представленими на схемі 4, у масштабі синтезу від 100 мг до 1 г. 00560) Схема 5. Зв'язування й сульфування під час синтезу димерного амідату о т
З ца в дув нд и ЕТТАСМ 7тто | т»
ГФ) на що т НМ
Те (в) це (о) о. 27 о и
Ж -М
Ге) НМ, 5 є) /г М ; ие в. ак
Ммс-/то "М МО. х Ма КА
НМ
Те 005611
Таблиця 9
Зв'язування й сульфування під час синтезу димерного амідату
Кількість Типі -, |Розр. мас. й . ни Час реакції/ : .
Введення | вихідного |Мол. екв. реагентів кількість вихід Аналіз - температура матеріалу розчинника
ЕТТ (1,0 екв.), . гідрид ксантану ацетонітрил кімн. гра 300 мг 1 100 мг я протягом 3-2 РХМО (2,0 екв.), піридин |(5,0 мл) (неочищ.) год. (1,5 мл) 0,4 М ЕТ (2,0 мл), . гідрид ксантану м Кмн. тра 350 мг 2 100 мг : нерозведений | протягом 3-2 РХМО (1,2 екв.), піридин го (неочищ.) (2,0 мл) А. 00562 Відповідно до способів, описаних в цьому документі, одержували різні нуклеозидні мономери, які знаходять застосування при одержанні димерних сполук.
І00563)| Схема 6: Синтез левулінат-захищених мономерів ї пещинне А ом їв ї ск (У В -к Ка р ща чи Що |; М Зннутя захисту них яв ше Пірввонн М ра ТО Пезунілова група нь ! КЕ, Мод. з вах ть За ре її і те ! і зе двора ТМ жах МЕ ' Захист основи прі вану вання | див
Бо
00564) Схема 7: Синтез амідиту А біс-ДМФА
МН» ли
А че М А че М (в) іє | 2 МФА - ОМА (в) іє | 2 3 ДМФА / нок 8690 М, / -х
Х аа
Реагент ол ем М М фосфітилування Ї щЧ | А осі м и
ОХМ / ДМФА / 6390 ра Мі
Ки ех у
І00565)| Схема 8: Схема синтезу ММТ, ОМТ і піксильних мономерів (амідитів А):
МН» МН
М - М ах
М М
СНО ше пз
Ге) М М Захист 3-МНо Ге) М М ДМФА - ОМА 3 Піридин А ДМФА
Ной НМ
РО
РО: ММТ, ОМТ, піксил мн пса
Ми СМ М о М Ми фосфітилування ре | о) М 4 - ресіІ /
НМ дхмМ ра ні и М
Ро РО
РО: ММТ, ОМТ, піксил РО: ММТ, ОМТ, піксил мит
СМ М
Х ь о М м 3-Монометокситритиламіно- М ль й Ме-диметилформамідино- аті .-
Амідит А 2",3'і-дидезоксіаденозин-5'-(2- Ж г (ММТ) : й . НМ ціаноетил)-М,М-діїзопропіл- фосфорамідит Ф
ОМе м
СМ М
3-(Диметил-заміщений ре | о М А піксил)аміно-Мв- мо М
Амідит доті диметилформамідино-2",3'- А (піксил) дидезоксіаденозин-5'-(2- нк ціаноетил)-М,М-діїзопропіл- Ф фосфорамідит ФІ, о
Мт
СМ М
О7- 2 т 3-Диметокситритиламіно-Мев- Д Ц о. ОМ -
Амідит дети диметилформамідино-2",3"- М и (Мт) дидезоксіаденозин-5'-(2- А З ціаноетил)-М,М-діїзопропіл- НМ фосфорамідит (и ОоМе
Мео | с
Ї00566| Незважаючи на те, що цей винахід описаний з посиланням на конкретні варіанти його реалізації, фахівцям у цій галузі техніки слід розуміти, що у відношенні їх можуть бути зроблені різні зміни, і вони можуть бути замінені еквівалентами без відхилення від принципової ідеї й обсягу цього винаходу. Крім того, можуть бути зроблено багато модифікацій для адаптації конкретної ситуації, матеріалу, складу речовини, способу, стадії або стадій способу відносно завдання, загального ідеї й обсягу цього винаходу. Усі такі модифікації вважаються такими, що підпадають під обсяг доданої формули винаходу.
ВАРІАНТИ РЕАЛІЗАЦІЇ ВИНАХОДУ
Ї00567| У цьому описі представлена композиція, що містить менше 1 частини на 4 частини за масою (М-1) продукту відносно сполуки або її солі, де вказана сполука містить полінуклеотид, що має послідовність із 10 або більше нуклеозидних субодиниць, і принаймні дві нуклеозидні субодиниці з'єднані М3--РБ5' фосфорамідатним міжсубодиничним зв'язком. У деяких варіантах реалізації вказаної композиції М3-Р5' фосфорамідатний міжсубодиничний зв'язок являє собою
М3-РБ" тіофосфорамідатний міжсубодиничний зв'язок, що має структуру: 3А-МНА-Р(ІЗХОВ)-
О--5, де К вибраний із групи, яка складається з водню, алкілу, заміщеного алкілу, арилу, заміщеного арилу й фосфатним захистом групи, або її сіль. 00568) У деяких варіантах реалізації композиції сполука містить полінуклеотид, що має послідовність із 10 або більше нуклеозидних субодиниць, комплементарну РНК компоненту людської теломерази. У деяких варіантах реалізації композиції полінуклеотид містить послідовність, що містить 13 або більше нуклеозидних субодиниць, комплементарну РНК компоненту людської теломерази. У деяких варіантах реалізації композиції полінуклеотид містить від З до 50 послідовних нуклеозидних субодиниць, комплементарних РНК компоненту людської теломерази. У деяких варіантах реалізації композиції всі нуклеозидні субодиниці, комплементарні РНК компоненту людської теломерази, зв'язані М3--РБ5' фосфорамідатними міжсубодиничними зв'язками. У деяких варіантах реалізації композиції полінуклеотид містить послідовність, вибрану із групи, яка складається з: СТТАСОоСсТТАс (5БО І МО:4),
ТАСОСТТАСАСАА (ЗЕО ІЮ МО:3) і САСТТАСОСТТАЄс (ЗЕБО ІЮ МО:5). У деяких варіантах реалізації композиції полінуклеотид містить кінцеву 3'-аміно або 3'-гідроксильну групу. 00569) У деяких варіантах реалізації композиції сполука має структуру:
Нн он ГІ т
МАК ло-в-о о о 5н
Ц от вн (в) А
Сх
Щй о-в-8Н о-(СОіпреЯпреіпре Паре ГпреАпрепреАпреСпреАпреї | о А
Мне або її сіль; де «про» являє собою тіофосфорамідатний зв'язок --МН--Р(-О0)(ЗН)-0--, що зв'язує 3'-атом вуглецю одного нуклеозиду з 5'-атомів вуглецю сусіднього нуклеозиду. У деяких варіантах реалізації композиції сіль являє собою фармацевтично прийнятну сіль. 00570) У деяких варіантах реалізації композиції сполука має структуру:
(о) щи 5-в-0- осо о ав, МН»
М из
У он ор 5-8Р-0 Ге) М М
МН ее у т Ге) о М МН
Нм СД 8-Р-0-- о ММ сМн, о я, 9
МА МН
«Ве в. 8-Р-0О-ї о ММ Мн, о ре, 9
М МН нм о 8-в-0- о ММ Мн, о БУ о
МН нм зе ра 8-в-0- оо в о
МН нм зе ре 8-Р-0о- осо о -- мно
МН м що 2 8-8Р-0- ом о "нав,
МА МН
НМ щу 8-в-0- о М М'сМн, о Да, МН о, -р- М 2 5 У Ге! Мн
М
С
8-Р-О ом о -- Мн»
МН м ці 2 8-8Р-0- о0ММм о є 7 МН»
МН ге -р 4 8-в-0- ом "ав,
ХА
МН» (М п де кожний М незалежно являє собою водень або протиіїон солі, кожний х незалежно дорівнює 1, 2 або 3, і п являє собою ціле число від 5 до 13. У деяких випадках Ме являє собою 5 водень. 00571) У деяких варіантах реалізації композиції сполука має структуру:
(е)
Ма" МН о ЩІ Ч 8--0- оо 9) я Мне
М Б он МН «А 8-Р-0-і ом
МН о гє В, в) о я
М Шев 8-Р-0- о. ММ сМмн,
Дав, 9 ня нка. 8-Р-0-ї о МОМ сМн, ав, о
Н
Шев 8-в-0-- о МОМ сМмн, козу; ня чорт 8-Р-0о-ї осМо 5-й о
Ма" вч 8--0- о Мо о: я МН»
Ма" М. їн «ТУ 8--0- 0. М о о: ра»,
Ех М нов 8-5-0-- о ММ "мн, ав, М»
М о ше, 5З-Р-0 М щ у й Мн ня МУ чо С
З-в-0 Ге) М ге) ав, мн»
Ма" з о, 8-Р-0-і ом о: є 7 МН» -
Ма Мн ге 8-Р-0-1 00 ав; -
Ма мн, 00572) У деяких варіантах реалізації композиція містить менше 1 частини на 6 частин за масою (М-1) продукту відносно вказаної сполуки. У деяких варіантах реалізації композиція містить менше 1 частини на 10 частин за масою (М-1) продукту відносно вказаної сполуки. У деяких варіантах реалізації композиція містить менше 1 частини на 20 частин за масою (М-1) продукту відносно вказаної сполуки. У деяких варіантах реалізації композиція містить менше 1 частини на 4 частини за масою будь-якого (М-х) продукту відносно вказаної сполуки. У деяких варіантах реалізації композиція містить менше 40 частин на 100 частин за масою сукупних (М-х) полінуклеотид-вмісних продуктів відносно вказаної сполуки. У деяких варіантах реалізації композиція має наступний профіль (М-х) полінуклеотид-вмісних продуктів: менше 1 частини на 4 частини за масою (М-1) продукту відносно вказаної сполуки; принаймні 10 частин на 100 частин за масою (М-2) ї (М-3) продуктів відносно вказаної сполуки.
Ї00573| У цьому описі представлений складний активний фармацевтичний інгредієнт, що має менше 11 95 за масою (М-1) продукту, де вказана сполука або її фармацевтично прийнятна сіль містить полінуклеотид, що має послідовність із 10 або більше нуклеозидних субодиниць, комплементарну РНК компоненту людської теломерази, при цьому принаймні дві нуклеозидні субодиниці з'єднані М3"-Р5" фосфорамідатним міжсубодиничним зв'язком. 00574) У деяких варіантах реалізації складного активного фармацевтичного інгредієнта всі нуклеозидні субодиниці, комплементарні РНК компоненту людської теломерази, з'єднані
М3-РБ тіофосфорамідатними міжсубодиничними зв'язками. У деяких варіантах реалізації складного активного фармацевтичного інгредієнта М3-Р5' фосфорамідатний міжсубодиничний зв'язок являє собою М3'-Р5' тіофосфорамідатний міжсубодиничний зв'язок, що має структуру: 3-А-МНА -Р(ІЗХОН)-О--5, де ЕК вибраний із групи, яка складається з водню, алкілу, заміщеного алкілу, арилу, заміщеного арилу й захисної групи фосфату, або її фармацевтично прийнятну сіль.
Ї00575| У деяких варіантах реалізації складного активного фармацевтичного інгредієнта полінуклеотид містить від 10 до 50 послідовних нуклеозидних субодиниць, комплементарних
РНК компоненту людської теломерази. У деяких варіантах реалізації складного активного фармацевтичного інгредієнта полінуклеотид містить послідовність, вибрану із групи, яка складається з: СТТАСОСТТАС (5БО І МО:4) ТАСОСТТАСАСАА (5ЕБО ІЮО МО:3); і САатТТАСпОастТТАС (5БО 10 МО:5) У деяких варіантах реалізації складного активного фармацевтичного інгредієнта полінуклеотид містить кінцеву 3'-аміно або 3'-гідроксильну групу.
Ї00576| У деяких варіантах реалізації складного активного фармацевтичного інгредієнта вказана сполука має структуру:
Н он ї т
МАК ло--о (в) о 5н їй ост вн (в) А 5-х
Щй о-в-ВН о-ІСОіпреСіпреСпре Пар ПпреАпрепреАпреСтпреАпреі | о А
МН» або її фармацевтично прийнятна сіль; де «про» являє собою тіофосфорамідатний зв'язок --
МНА-Р(І-ОФ3Х(5Н)--0--, що зв'язує 3--атом вуглецю одного нуклеозиду з 5'-атомом вуглецю сусіднього нуклеозиду.
Зо Ї00577| У деяких варіантах реалізації складного активного фармацевтичного інгредієнта вказана сполука має структуру:
(о)
МН
Щи 8-в-0- осо о Дав, Мне
Ми
Усик, 5-в-0 Ге) М М
МН се у т (о! о М МН
НІМ СД
8-Р-0-- о ММ сМн, ав; 9
Ми МН ні « и 85-Р-0-ї о ММ сМн, ав; 9
Ми МН ну « п 8-Р-0-ї о ММ Мн, 5-й о
МН нм зе ра 8-в-0- осо
У у о
МН нм зе ре 8-Р-о- осо о - мно
МН Й Я; ! а 8-Р-0- ом оо "нав,
МА МН
НМ щу 8-8-0- о М М'сМн, я», Мо о, -р-0 ММ о Ге! Мн зм нс 8-Р-О ом ав) мн»
МН м -р А 8-Р-0-- ом о: є 7 Мне
МН ге і А 8-в-0- ом М "ав,
Х
Мне (М п де кожний МУ незалежно являє собою водень або протиїбон фармацевтично прийнятної солі, кожний х незалежно дорівнює 1, 2 або 3, і п являє собою ціле число від 5 до 13. У деяких 5 випадках Ме являє собою водень.
Ї00578| У деяких варіантах реалізації складного активного фармацевтичного інгредієнта вказана сполука має структуру:
Ма" ді а МН о ще 5-Р-0 ом о я мн»
М БУ он Мн а -ї 2 5-8-0 Ге) М М
МН о: (о) в) я - нов 8-Р-О-ї о ММ сМНн, о: Де, о я нон СВ 8-Р-0-ї о. ММ сМн, о: Да», о я
Шев
В-Р-О-ї о МОМ сМно ко» Ду; ! 5-в-0 Ге! мо оз ду;
Ма"
ТО
5-в-0 оті Ше) о; я МН»
Ма оо зЗ-в-0 Ге) М М Ге! о ее, к М
МН нє вх 8-8-0- о ММ Мн, ав, Мі
Ма" Же тя бр 8-р-0 ММ с --- М Но я
Ма Мн С 8-р-о ом ав, мно
Ма" о 8-Р-0- ом о х 7 Мне я 8-в-0- ом ав; ня
Ма мн, 00579) У деяких варіантах реалізації складний активний фармацевтичний інгредієнт містить менше 9 95 за масою (М-1) продукту. У деяких варіантах реалізації складний активний фармацевтичний інгредієнт містить менше 5 906 за масою (М-1) продукту. У деяких варіантах реалізації складний активний фармацевтичний інгредієнт містить менше 11 95 будь-якого (М-х) продукту. У деяких варіантах реалізації складний активний фармацевтичний інгредієнт містить менше 45 95 за масою сумарних (М-х) полінуклеотид-вмісних продуктів. У деяких варіантах реалізації складний активний фармацевтичний інгредієнт має наступний профіль (М-х) полінуклеотид-вмісних продуктів: менше 5 9о за масою (М-1) продукту; і принаймні 10 9о за масою (М-2) і (М-3) продуктів.
00580) Представлена також фармацевтична композиція, що містить композицію (наприклад, відповідно до кожного з варіантів реалізації, описаних у цьому документі), складену у фармацевтично прийнятній допоміжній речовині Представлена також фармацевтична композиція, що містить складний активний фармацевтичний інгредієнт (наприклад, відповідно до кожного з варіантів реалізації, описаних у цьому документі), складений у фармацевтично прийнятному допоміжному речовин.
Ї00581| У цьому описі представлений спосіб синтезу полінуклеотиду. У деяких варіантах реалізації вказаний спосіб включає стадії: (а) зняття захисту із захищеної 3'-аміногрупи кінцевого нуклеозиду, приєднаного до твердофазної основи, вказане зняття захисту приводить до утворення вільної 3'-аміногрупи; (Б) приведення в контакт вільної 3'-аміногрупи з димером 3'- захищеного амінодинуклеотид-фосфорамідату-5'і-фосфорамідит у присутності нуклеофільного каталізатора з утворенням міжнуклеозидного М3--РБ фосфорамідитного зв'язку; і (с) окиснення вказаного зв'язку. 00582) У деяких варіантах реалізації вказаний спосіб додатково включає: (а) зняття захисту із захищеної 3'-аміногрупи кінцевого нуклеозиду, приєднаного до твердофазної основи, вказане зняття захисту приводить до утворення вільної 3'-аміногрупи; (Б) приведення в контакт вільної
З'-аміногрупи з мономером 3'-захищеного амінонуклеозид-5і-фосфорамідиту у присутності нуклеофільного каталізатора з утворенням міжнуклеозидного М3--РБ5 фосфорамідитного зв'язку; і (с) окиснення вказаного зв'язку. У деяких варіантах реалізації вказаного способу окиснення вказаному зв'язку включає сульфування з одержанням тіофосфорамідатного зв'язку.
У деяких варіантах реалізації вказаного способу окиснення вказаному зв'язку приводить до одержання оксофосфорамідатного зв'язку.
Ї00583| У деяких варіантах реалізації вказаного способу димер 3'-захищеного амінодинуклеотид-фосфорамідат-5'-фосфорамідиту має формулу: т о--Р х в' (Ф) (в)
Мо ді! ід)
Н Н
7 Н
Оо-Р--Х
У-т | в2 (в) (в)
Мо ід! Н
Нн Нн
МН Нн е-ї-»
Ри де Х являє собою О або 5, і В'ї В, кожний незалежно, представляють собою пурин, захищений пурин, піримідин або захищений піримідин, або їх аналог. У деяких варіантах
Зо реалізації вказаного способу В'6ї В, кожний незалежно, вибрані із захищеного аденіну, захищеного цитозину, захищеного гуаніну, тиміну й урацилу. У деяких варіантах реалізації вказаного способу В' і Ве, кожний незалежно, вибрані з А(В7), А(ОМЕ), С(В2), С(ізобутирил), т і
М. У деяких варіантах реалізації вказаного способу Х являє собою 5. 00584) У деяких варіантах реалізації вказаного способу полінуклеотид має формулу:
- ри. в 7 І йо
З
Кк ко во о; о в п о ві де: кожний В незалежно являє собою пурин, захищений пурин, піримідин або захищений піримідин, або їх аналог; кожний Х незалежно являє собою кисень або сірку; кожний КЗ являє собою водень, фтор або гідроксил, алкокси, заміщений алкокси або захищений гідроксил; Ї. являє собою необов'язковий лінкер; 2 являє собою Н, ліпід, основу, носій, олігонуклеотид, ПЕГ, поліпептид, мітку, що виявляється, або маркер: НЯ являє собою аміно, гідроксил, захищений аміно, захищений гідроксил, -О-І -7 або -МН-І -7; К являє собою водень, алкіл, заміщений алкіл, арил, заміщений арил або захисну групу фосфату; і п являє собою ціле число від 1 до 1000; або його сіль; і вказаний спосіб включає стадії: (а) зняття захисту із захищеної 3'-аміногрупи кінцевого нуклеозиду, приєднаного до твердофазної основи, вказане зняття захисту приводить до утворення вільної З3'-аміногрупи; (Б) взаємодії вільної 3З'-аміногрупи з: () димером 3'- захищеного амінодинуклеотид-фосфорамідат-5'-фосфорамідиту; або (і) мономером 3-захищеного амінонуклеозид-5-фосфорамідиту; у присутності нуклеофільного каталізатора з утворенням міжнуклеозидного М3--РБ5 фосфорамідитного зв'язку; (с) окиснення вказаного зв'язку; і (4) повторення стадій (а)-(с) до синтезу полінуклеотиду, де повторення стадій (а)-(с) включає здійснення стадії (Б)(ї) принаймні один раз.
Ї00585| У деяких варіантах реалізації вказаного способу окиснення вказаному зв'язку включає сульфування з одержанням тіофосфорамідатного зв'язку. У деяких варіантах реалізації вказаного способу окиснення вказаному зв'язку приводить до одержання оксофосфорамідатного зв'язку. У деяких варіантах реалізації вказаного способу полінуклеотид містить послідовність нуклеозидних субодиниць, комплементарну РНК компоненту людської теломерази, і при цьому принаймні дві нуклеозидні субодиниці з'єднані М3--Р5' фосфорамідатним міжсубодиничним зв'язком. У деяких варіантах реалізації вказаного способу
М3"-РБУ" фосфорамідатний міжсубодиничний зв'язок являє собою М3'--Р5' тіофосфорамідатний міжсубодиничний зв'язок, що має структуру: 3--МНА-Р(ІЗХОН)-О--5, де ЕК вибраний із групи, яка складається з водню, алкілу, заміщеного алкілу, арилу, заміщеного арилу й фосфатним захистом групи, або її сіль.
Зо 00586) У деяких варіантах реалізації вказаного способу полінуклеотид містить послідовність
ТАСОСТТАСАСАА. У деяких варіантах реалізації вказаного способу всі міжнуклеотидні міжсубодиничні зв'язки послідовності ТАССОСТТАСАСАА представляють собою М3-- Ре фосфорамідатні міжсубодиничні зв'язки. У деяких варіантах реалізації вказаного способу полінуклеотид має структуру:
нон І т
МАК ло-в-о (е) о нн їй о-в-вн (в) А -
Ми о-вовН о-(СОпреО пре пр» ТП пре ГП преАпреУпреАпреСтпреАпрві | о А
МН» або його сіль; де «про» являє собою тіофосфорамідатний зв'язок --МН--Р(-О0)(5Н)-О--, що зв'язує 3'-атом вуглецю одного нуклеозиду з 5'-атомів вуглецю сусіднього нуклеозиду.
І00587| У деяких варіантах реалізації вказаного способу полінуклеотид має структуру:
(в)
С
8-Р-0-- осо о я Мн» мм он МН «1 5-Р-0О- ом
Мне за т (о) о М МН нм щу 8-Р-О-ї о ММ МН, о 2, о;
М
МН о лох 5-Р-0- о ММ сМмНн, ав, 9
М
МН се. 8-Р-0-ї о ММ МН,
Я о
МН нм зе т 8-Р-0- осо оз ду;
Мн
Нм зе ї 8-Р-0- осо о де, МН» ор в--о Ге! М М о (в) у 7
А-к МН
НМ СД
8-Р-0-ї о ММ Мн ав, : ж тр -р- М 4 вхо о міч» зм - С 8-Р-О Ге! мо а»; мно
Яке, 8-Р-0- ом "нав, нь в, 8-80 ом "ав, хі
МН» (М п де кожний МУ незалежно являє собою водень або протиїбон фармацевтично прийнятної солі, кожний х незалежно дорівнює 1, 2 або 3, і п являє собою ціле число від 5 до 13. У деяких 5 випадках Ме являє собою водень. 00588) У деяких варіантах реалізації вказаного способу полінуклеотид має структуру:
о
Ма" МН о ще 5-6-0 оті ке; о ща, МН»
М Б он Мн а -і 2 5----0 о. ММ
МН е- га 7 в) 0) я
М ШК ев 8-в-0- о.МсМ'сМн, ав, о я
ВК аа 8-8-0-ї о ММ сМн, о ра», о я
М ев 8-Р-0-ї о. МОМ сМНо ко» Ду; й о в 5-в-0 ом о оз;
Ма" нов 5-в-0 ом о о Да, МН» ма" Мі
Мн «ТУ о Ге) М М о и МА МН ж ОХ 8-8-0- о ММ "Мн, ав, Мі»
Ма" хе б тр 8-рР-О ММ о -й М мно й чт С
З-Р-о0 Ге! М ів) о - МН»
Ма" хх ор 8-8Р-0- ом ав; мно й
Ма Мн ге 8-Р-0- ом ав, й
Ма Мн»
Ї00589| У деяких варіантах реалізації вказаного способу С11 нуклеотидний залишок послідовності ТАСООСТТАСАСАА отримано з мономеру 3'-захищеного амінонуклеозид-5'- фосфорамідиту. У деяких варіантах реалізації вказаний спосіб включає послідовне зв'язування наступних димерів 3'-захищеного амінодинуклеотид-тіофосфорамідат-5'-фосфорамідиту, ТА, об, СТ, ТА, БА ії АА, і мономеру 3'-захищеного амінонуклеозид-5-фосфорамідиту, С, із твердофазною основою. У деяких варіантах реалізації вказаного способу димер 3'-захищеного амінодинуклеотид-фосфорамідит-5'-фосфорамідиту описаний формулою Х'Х?, де Х' і хх? незалежно вибрані із захищеного аденіну, захищеного цитозину, захищеного гуаніну, тиміну й урацилу. У деяких варіантах реалізації вказаного способу димер 3'-захищеного амінонуклеозид-
Б-фосфорамідиту вибраний із захищеного аденіну, захищеного цитозину, захищеного гуаніну, тиміну й урацилу.
Ї00590| У цьому описі представлена динуклеотидна тіофосфорамідатна сполука, описана
Формулою (ІІ): в!! х в' о |)
Н н н н
Щі Н / Ї З ; в'з в о іо) н н н Н
МН Н
Ця
Формула (ІІ) де: В' їі В, кожний незалежно, представляють собою пурин, захищений пурин, піримідин або захищений піримідин, або їх аналог; К'' являє собою водень, захисну групу або фосфорамідитну групу; і В: ї ВЗ, кожний незалежно, представляють собою водень або захисну групу; або її сіль. 005911 У деяких варіантах реалізації вказаної сполуки В' і В, кожний незалежно, вибрані із захищеного аденіну, захищеного цитозину, захищеного гуаніну, тиміну й урацилу. У деяких варіантах реалізації вказаної сполуки В' і В, кожний незалежно, вибрані з А(В7), А(ОМЕ), С(В2),
С(ізобутирил), Т і Ш. У деяких варіантах реалізації вказаної сполуки К" являє собою 5'- фосфорамідит; КК"? являє собою захисну групу, і КЗ являє собою захисну групу. У деяких варіантах реалізації вказаної сполуки В' являє собою А(В7) або А(ОМЕ), і В2 являє собою А(В2) або А(ОМЕРЕ). У деяких варіантах реалізації вказаної сполуки В' являє собою А(В27) або А(ОМЕ), і
В? являє собою С(В2). У деяких варіантах реалізації вказаної сполуки В' являє собою А(В2) або
А(ОМРЕ), і В являє собою С(ізобутирил). У деяких варіантах реалізації вказаної сполуки В' являє собою А(В7) або А(ОМЕРЕ), і В? являє собою Т. У деяких варіантах реалізації вказаної сполуки В' являє собою А(В7) або А(ОМЕ), і Вг являє собою І. У деяких варіантах реалізації вказаної сполуки В' являє собою С(В2), і В? являє собою А(В7) або А(ОМЕ). У деяких варіантах реалізації вказаної сполуки В' являє собою С(В2), і В являє собою С(В7). У деяких варіантах реалізації вказаної сполуки В' являє собою С(В2), і В? являє собою ((ізобутирил). У деяких варіантах реалізації вказаної сполуки В' являє собою С(В7), і Вг являє собою Т. У деяких варіантах реалізації вказаної сполуки В' являє собою С(В7), і Вг являє собою ШО. У деяких варіантах реалізації вказаної сполуки В' являє собою С(ізобутирил), і В2 являє собою А(В2) або А(ОМЕ). У деяких варіантах реалізації вказаної сполуки В' являє собою С(ізобутирил), і В? являє собою С(В7). У деяких варіантах реалізації вказаної сполуки В' являє собою с(ізобутирил), і В2г являє собою Сс(ізобутирил). У деяких варіантах реалізації вказаної сполуки
В' являє собою С(ізобутирил), і В? являє собою Т. У деяких варіантах реалізації вказаної сполуки В' являє собою С(ізобутирил), і В? являє собою ШО. У деяких варіантах реалізації вказаної сполуки В' являє собою Т або І, і В2 являє собою А(В7) або А(МРЕ). У деяких варіантах реалізації вказаної сполуки В' являє собою Т або , і В? являє собою С(В2). У деяких варіантах реалізації вказаної сполуки В' являє собою Т або |, і В? являє собою с(ізобутирил). У деяких варіантах реалізації вказаної сполуки В' являє собою Т або , і В2 являє собою Т. У деяких варіантах реалізації вказаної сполуки В' являє собою Т або |, і Ве являє собою |). 00592) Усі можливі комбінації вказаних вище варіантів реалізації вважаються такими, що підпадають під обсяг цього винаходу.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1195 Ватітуа, РгештевВавахавз Н. «їз КОМПОЗИЦІЇ ОЛІГОНУКЛЕОТИДІВ ТА СПОСОБИ ЇХ ОДЕРЖАННЯ «130» СЕКВ-185йО «15» п5 с1/987395 «151» 2014-05-01 «1502» 05 62/151905 «151» 2015-04-23 «ібо» 15 «170» БазЕБ5БЕО для ЖЗпаСеив версії 4.0 «10» 1 «211: 451 чхійш» НЕ «2137 Ношо зарієпеа чик «вг3» Синтетичний полінуклесотид «400» 1 чаш сада зозподоассо заЗзазоозоаоа иассацим дииуууєцаавс сспаасоцаю 60 заччусучоай дсассдпваси чизасцессс дсдсдситні попссуєцоа астшісадєсз 120 ччссоузазавау сепсоаосає содссзисса ссузисашис засацсавас азазавцврс 180 адспоасиддс седоасяссс сисосодчача ссичеуусяд досуєсвЯсєс садсссседа ХО ассессассоа зазассосоз зсудсссуду дспосиосодд здасасссає здссвосуса 200 зазацичазчеа спопорсвус сзсопаисис мсоозчасза зусозаани сасдссимис 360 задссосауоу заваазовасз чзаздсоацисс ссзепспево сосзавнебе заоазсоооозу ч2о чЧасоззоасасс сазчзсисчш сисасасаув Є 51 «вій» й «Бі1їх 13 «719 РНК «213» Штучна послідсвність «вах «Ева» Синтетичний полінУкЛлеЄєти й «ОО» сівасссовапа с 13 кі 5 «вії 13 «вії» ДИКЕ «гії Штучна послідсвність «рей» «йих3» Синтетичний полінуУклевотид «400х 3 тазацітїаза сай 13 «Рід» Я «ші 11 «212» ДНК «13» ШтУчна послідовність сей?
«аз Синтетичний попінчклестид «4Ойз 4 чзЕкзЯчестяа о 11 «Ід в «2112 13 «2122 ДНК «2132 Штучна послідовність «й: «29532» Синтетичний полінУуклеотидй «002 5 сазстачаяаї са ї5 «2105 б «211» 120 к2і2» ДНК «2513» Штучна послідовність «Ех «223 Синтетичний попінуклеотид «апа 6 чесссзазаї даасдасвюа апддсчЗсачо Зо «10 7 «2117 15 «ій» ДВК «813з Штучна послідовність
«их «га» пинтетичний полівуклесотид «4005 7 чЕчсазачаса пово 5 «М» В «2112 13 «212» ДНК «-81їх Штучна послідовність сет «гі» Синтетичний полінуклеотид «40щаз Я зучавоазсчдс аа 13 «хіх з «215 13 «212з ДОК «213» Штучна послідовність сих «ге3» Синтетичний лолівуклестид «400» З чесдчазаюрвоа са 13 «210 18 «ії» 11 «212» ЛНЕ «8135 Штучна послідовність
«ий «ге?» Синтетичний полінуУуклеотий «ай» 10 чсодавччся З 11 «71» 11 ««В1іїх 13 «122 ДНК «Тт13з Штучна послідовність «»2йз «їз» Синтетичний полінуклеотид «400» 113 «чсззавая с99 15 «вій 19 ««і1з 13 «вій ДНК «13» Штучна послідовність «во «ві» Синтетичний полінуклеотид «49002 153 асзчубсодазо Ччез 13 «-8107 13 «ії 16 «12 ДВК
«8135 Штучна йпеслідовність «ак х «ве3?» синтетичний полінуклеотид «00» 13 ззсачсодза досаае 16 «8102 14 «2115 18 «1і1їз ДНЕ к2і3» Штучна лпослідсовністек «айИх сег3» Синтетичний полінуклеотид «Ох 18 засдаасачід зчазддесда 18 «Вій» 15 «2112 20 «вії: ДНК «гї8з Штучна послідовність сив» «Рез» Савнтетичний полінуклестид «4005» 15 асаєттктта сетостогсад 28 «10» 16 «2117 13
«вік» дик «135 Вркучна послідовність «ге «киаУ Сивтетизний полінуклеотни «Ох 16 чЧчесвпсаста дає 33 «21ї0х 17 «2115 15 «ім ДНЕ «ві» Штучма послідовність «ей» «ва Синтетичний полінУукле)тид хай» ії? чебазазсєа засаз ЕВ. «19» ІВ «11 12 «гій ДЕК егі1й» Штучна послідовність ких «3» Синтетичний полінуклестид «ВО» 15 шксткстсад їх 15 «10» 18
«киії» 15
«еї2з ДНК
«х«к1їі3з Штучна послідовність
«22йах
«кииЗ» Синтетичний полінуклеотид
«оо» 19 пцссстсстс да 12

Claims (45)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб синтезу полінуклеотиду, що має принаймні дві нуклеозидні субодиниці, з'єднані М3'-РБ' оксофосфорамідатним або М3'-»Р5' тіофосфорамідатним міжсубодиничним зв'язком, який включає стадії: (а) зняття захисту із захищеної 3'-аміногрупи кінцевого нуклеозиду, приєднаного до твердофазної основи, причому вказане зняття захисту приводить до утворення вільної 3'- аміногрупи; (Б) приведення в контакт вільної З-аміногрупи з димером 3'і-захищеного амінодинуклеотидфосфорамідат-5'-фосфорамідиту в присутності нуклеофільного каталізатора з утворенням міжнуклеозидного М3'-»Р5" фосфорамідитного зв'язку; і (с) окиснення вказаного зв'язку для одержання М3'-»Р5' оксофосфорамідатного або М3-»РБ тіофосфорамідатного міжсубодиничного зв'язку.
2. Спосіб за п. 1, який додатково включає: (а) зняття захисту із захищеної 3'-аміногрупи кінцевого нуклеозиду, приєднаного до твердофазної основи, причому вказане зняття захисту приводить до утворення вільної 3'- аміногрупи; (Б) приведення в контакт вільної 3'-аміногрупи з мономером 3'-захищеного амінонуклеозид-5'- фосфорамідиту в присутності нуклеофільного каталізатора з утворенням міжнуклеозидного М3'- РЕ" фосфорамідитного зв'язку; і (с) окиснення вказаного зв'язку.
З. Спосіб за будь-яким із пп. 1 і 2, який відрізняється тим, що окиснення зв'язку включає сульфування з одержанням тіофосфорамідатного зв'язку.
4. Спосіб за будь-яким із пп. 1 і 2, який відрізняється тим, що окиснення зв'язку приводить до утворення оксофосфорамідатного зв'язку.
5. Спосіб за будь-яким із пп. 1-4, який відрізняється тим, що згаданий димер 3'-захищеного амінодинуклеотидфосфорамідат-5'-фосфорамідиту має формулу:
/З о- 58 Ме в! (в) Мо ід! ід) Нн Н Щі н Оо-- 365:-5-хкх УН-Т і в? Мо о Н ід) н і! МН Нн я-- Рі , де Х являє собою О або 5, і В' ї Вг кожний незалежно являє собою пурин, захищений пурин, піримідин або захищений піримідин або їх аналог.
6. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що В' і В2 кожний незалежно вибраний із захищеного аденіну, захищеного цитозину, захищеного гуаніну, тиміну й урацилу.
7. Спосіб за п. б, який відрізняється тим, що В'ї В? кожний незалежно вибраний з А(В2), А(ОМЕ), С(В2), с(ізобутирилу), Ті.
8. Спосіб за будь-яким із пп. 5-7, який відрізняється тим, що Х являє собою 5.
9. Спосіб за будь-яким із пп. 1-8, який відрізняється тим, що полінуклеотид має формулу: -р- в 7 І що З Ше х й ух ко (в) о) в и бо, де: кожний В незалежно являє собою пурин, захищений пурин, піримідин або захищений піримідин або їх аналог; кожний Х незалежно являє собою кисень або сірку; кожний КЗ являє собою водень, фтор або гідроксил, алкокси, заміщений алкокси або захищений гідроксил; Ї являє собою необов'язковий лінкер; 7 являє собою Н, ліпід, основу, носій, олігонуклеотид, ПЕГ, поліпептид, мітку, що виявляється, або маркер; Ве являє собою аміно, гідроксил, захищену аміно, захищену гідрокси, -О-І -72 або -МН-І -7;
К являє собою водень, алкіл, заміщений алкіл, арил, заміщений арил або захисну групу фосфату; і п дорівнює цілому числу від 1 до 1000; або його сіль; а вказаний спосіб включає стадії: (а) зняття захисту із захищеної 3'-аміногрупи кінцевого нуклеозиду, приєднаного до твердофазної основи, причому вказане зняття захисту приводить до утворення вільної 3'- аміногрупи; (р) приведення в контакт вільної 3'-аміногрупи з: () димером 3'-захищеного амінодинуклеотидфосфорамідат-5'-фосфорамідиту; або (ії) мономером 3'-захищеного амінонуклеозид-5'-фосфорамідиту; у присутності нуклеофільного каталізатора з одержанням міжнуклеозидного М3'-»РБ' фосфорамідитного зв'язку; (с) окиснення вказаного зв'язку; і (84) повторення стадій (а)-(с) доки не буде синтезовано полінуклеотид, при цьому повторення стадій (а)-(с) включає здійснення стадії (Б)(ї) принаймні один раз.
10. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що окиснення вказаного зв'язку включає сульфування з одержанням тіофосфорамідатного зв'язку.
11. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що окиснення вказаного зв'язку приводить до утворення оксофосфорамідатного зв'язку.
12. Спосіб за будь-яким із пп. 8-11, який відрізняється тим, що полінуклеотид містить послідовність нуклеозидних субодиниць, комплементарну РНК-компоненту людської теломерази, і при цьому принаймні дві нуклеозидні субодиниці з'єднані М3'-»Р5' оксофосфорамідатним або М3'-»Ре' тіофосфорамідатним міжсубодиничним зв'язком.
13. Спосіб за п. 12, який відрізняється тим, що М3'-»Р5' оксофосфорамідатний або М3-зР тіофосфорамідатний міжсубодиничний зв'язок являє собою М3-»РБ5 тіофосфорамідатний міжсубодиничний зв'язок, що має структуру: 3А-МНА-Р(ІБМОН)-АО0О--5, де К вибраний із групи, яка складається з водню, алкілу, заміщеного алкілу, арилу, заміщеного арилу й захисної групи фосфат або її солі.
14. Спосіб за будь-яким із пп. 9-12, який відрізняється тим, що полінуклеотид містить послідовність ТАСОСТТАСАСАА.
15. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що всі міжнуклеотидні міжсубодиничні зв'язки послідовності ТАЄССТТАСАСАА являють собою М3'-»Р5' тіофосфорамідатні міжсубодиничні зв'язки.
16. Спосіб за будь-яким із пп. 9-15, який відрізняється тим, що полінуклеотид має структуру: но он г МК ло-в-о | ? І о 5Н їй остсвн (в) А щ- МН о--вн о--(О пре преЯарв пр Ї преАпреЯ пре Апре Спр Апрві | о А МН» або його сіль; де "про" являє собою тіофосфорамідатний зв'язок --МН НА -Р(-О0)(5Н)-0--, що зв'язує 3-атом вуглецю одного нуклеозиду з 5'-атомом вуглецю сусіднього нуклеозиду.
17. Спосіб за будь-яким із пп. 9-16, який відрізняється тим, що полінуклеотид має структуру:
(о) ФОТО 8-в-0- о7Мо о я МН» МК он Мн «І 8-8-0- ом Мне ує 7 (в) о М МН Нм ще 8-Р-0-ї ом М смнь ав, 9 М Мн ні зр 8-8-0- о. ММ "Мне ев, 9 М Мн оо 8-8-0- о. ММ "МН, Я о МН нм зе те 8-в-0- осМо сі Де, о Мн нм зе ре 8-Р-0-- осо о - Мне Мн Тр 8-8Р-0- ом м о "ав, М сМмНн НМ «ДЖ 8-Р-0- о МТМ Мн, (ей 5 7 МН о, 5-Р-О ММ су -У мно М т С І 8-р-0 о мо о: щ- Мне ка, 8-Р-0-і ом "ав; мно МН зе і А 8-Р-0- ом "нав, ха МН (М п де кожний Ме незалежно являє собою водень або протиїон фармацевтично прийнятної солі, кожний х незалежно дорівнює 1, 2 або 3, а п дорівнює цілому числу від 5 до 13.
18. Спосіб за п. 17, який відрізняється тим, що полінуклеотид має структуру:
ма" МН о СД 8-8-0- о7М7о о я МН ММ он МН «а -і 4 5-8Р-0 о. ММ МН ее га 7 (о) і) ж нон тр 8-в-0- о ММ Мн, ав, 9 - у ой 8-8-0- о. ММ Мн, ав, 9 ня Ма що Тер 8-Р-0-3 о ММ сМн, козу; ня нон ТО 8-Р-0-ї о-М7о о я о Ма" но в 8-в-0-6о/Мо о: Дав, МН» ма" Мо і чо, 5-Р-о О.М м о с ав Ди . чн о 8-8-0- о. М" "М' "Мн, ав, Мн - Ма нм т 8-Р-О ММ о ав, Моно ня ч чо С З-Р-о Ге) М 1Ф) (од я МН» Ма" сх оо 8-8-0- ом ав; мно й ма Мн тя 8-Р-0- ом о це»; ня Ма мн,
19. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що С11 нуклеотидний залишок послідовності ТАСОСТТАСАСАА отримано з мономера 3'-захищеного амінонуклеозид-5'-фосфорамідиту.
20. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що вказаний спосіб включає послідовне зв'язування наступних димерів 3-захищеного амінодинуклеотидтіофосфорамідат-5'- фосфорамідиту, ТА, Об, СТ, ТА, СА і АА, і мономера 3'-захищеного амінонуклеозид-5'- фосфорамідиту, С, із твердофазною основою.
21. Спосіб за будь-яким із пп. 1-5, який відрізняється тим, що димер 3'-захищеного амінодинуклеотид-фосфорамідит-5'-фосфорамідиту описаний формулою Х'Х?, де Х' і хх? кожний незалежно вибраний із захищеного аденіну, захищеного цитозину, захищеного гуаніну, тиміну й урацилу.
22. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що димер 3'-захищеного амінонуклеозид-5'- фосфорамідиту вибраний із захищеного аденіну, захищеного цитозину, захищеного гуаніну, тиміну й урацилу.
23. Динуклеотидна тіофосфорамідатна сполука, описана Формулою (І): в!!! У в' і) ід! н Н н Щі н Оо- Р Р-5 я | во й о (о) Н ід) і! і! МН і! Ця Формула (ІІ) де: В'Її В? кожний незалежно являє собою пурин, захищений пурин, піримідин або захищений піримідин або їх аналог; А" являє собою фосфорамідитну групу; і В": ії ВЗ кожний незалежно являє собою захисну групу; або її сіль.
24. Сполука за п. 23, яка відрізняється тим, що В'ї В" кожний незалежно вибраний із захищеного аденіну, захищеного цитозину, захищеного гуаніну, тиміну й урацилу.
25. Сполука за п. 24, яка відрізняється тим, що В' ї В? кожний незалежно вибраний з А(В2), А(ОМЕ), С(В2), с(ізобутирил) Ті Ш.
26. Сполука за п. 25, яка відрізняється тим, що В' являє собою А(В27) або А(ОМЕ), а В? являє собою А(В2) або А(ОМРЕ).
27. Сполука за п. 25, яка відрізняється тим, що В' являє собою А(В7) або А(ОМЕ), а В2 являє собою С(В?2).
28. Сполука за п. 25, яка відрізняється тим, що В' являє собою А(В27) або А(ОМЕ), а В? являє собою с(ізобутирил).
29. Сполука за п. 25, яка відрізняється тим, що В' являє собою А(В7) або А(ОМРЕ), а В? являє собою Т.
30. Сполука за п. 25, яка відрізняється тим, що В' являє собою А(В7) або А(ОМРЕ), а В? являє собою М.
31. Сполука за п. 25, яка відрізняється тим, що В' являє собою С(В2), а В? являє собою А(В2) або А(ОМРЕ).
32. Сполука за п. 25, яка відрізняється тим, що В' являє собою С(В2), а В? являє собою С(В2). Зо
33. Сполука за п. 25, яка відрізняється тим, що В' являє собою С(В7), а В? являє собою с(ізобутирил).
34. Сполука за п. 25, яка відрізняється тим, що В' являє собою С(В27), а В? являє собою Т.
35. Сполука за п. 25, яка відрізняється тим, що В' являє собою С(В27), а В? являє собою |.
36. Сполука за п. 25, яка відрізняється тим, що В' являє собою С(ізобутирил), а В? являє собою А(В2) або А(ОМРЕ).
37. Сполука за п. 25, яка відрізняється тим, що В' являє собою С(ізобутирил), а В? являє собою С(В2).
38. Сполука за п. 25, яка відрізняється тим, що В' являє собою С(ізобутирил), а В? являє собою Сс(ізобутирил).
39. Сполука за п. 25, яка відрізняється тим, що В' являє собою Ф(ізобутирил), а В? являє собою Т.
40. Сполука за п. 25, яка відрізняється тим, що В' являє собою Ф(ізобутирил), а В? являє собою М.
41. Сполука за п. 25, яка відрізняється тим, що В' являє собою Т або у, а В? являє собою А(В2) або А(ОМРЕ).
42. Сполука за п. 25, яка відрізняється тим, що В' являє собою Т або |, а В? являє собою С(В2).
43. Сполука за п. 25, яка відрізняється тим, що В' являє собою Т або |, а В? являє собою с(ізобутирил).
44. Сполука за п. 25, яка відрізняється тим, що В' являє собою Т або у, а В являє собою Т.
45. Сполука за п. 25, яка відрізняється тим, що В' являє собою Т або у, а Ве являє собою |. ІАК! ву чн Тех да йон Коляка СВУ АКТА «канал Я Й М ж «З : от ХЕ Н ше: 7 зда» ! г Ж ВУ її п і й За ш жо- В ши -20 а ня х М аа Ж зачеї ух п дкопеотсесссссссс око моооооссосссосоооссоосоасссссссссссссскккнндцянн кн ення знан ЗЕ ЕК в Я за ІВ рей Час хв.) Таблиця результатів без розрахунків - холонка ОБІЗ АРТА - канал ПО Пе ПО ПО ПО рр
Пеориуювнеть вяпумесівВ: зе хх Ж -- щ сук че пе - В рес зОБе їх в а ща | і : 3 : і і я ї і : і 1 ; і ї лина у па о аваа ВВ ВВ ВО НННЧИВ, чо обме зЮш чб о8б. 80 що зо В « рот я Ї» жа «юю ВЕ Фк ІВ ід сл ГИ екс панноя йсек К кн на Ко Ей ке З ! А нн ВКА ЗУНКНЕ. явне Щ : ! І : сон я ї 1 і ї ї; дерен ре у тт ник ит тих вин нин як що УУтмиминн ик и тт тити п 4 | е Мо ле.Ї ї І і ї у х ЩО, | М НИ: : : І : : КК, І : г нн тик пс С ВН НН ВИ СК М по С НН М : : ї Н Н Я ї ї й Мінні нні нні інки Зк ні інн нні інн нні ннінніннінн: Зіни ин ї й й Я 4 чЕ о БУ р М І ха їх вдо Тзблиця результатів (без резрахуннків- АВАА 13 НЮХ - канал 1) ш Час утримання хв. ПлошеЇ мА. Висота Гм и М
Янг. 2А
КН ОХ АРАД послідовність пульсі «ОЇ хв ск В сито ва ве Ул дя щі ї- ща ох. КЗ а вищо МІ ТУ т: У о гу х ІС ВВ и чих те в з вх я хх те мевЕкике хо кі | ше Кк шо Бе ! зи Й СУ З НЕ 0 ШО ЗО ще 8. 50 50 Ж ч Й -йИ Бе Бе Кс че. 2В
ІАГЗ : : т т тт ї Н : по й бул кв . ; : і : : В : : | щш ші : іі і : ОК р ! : і : В : 5 т ! Я і : Е і в і Н Н : 1 Ода ох і | і Я : І : Г. Ї : р В се І : З ї : ї РІЗ ! : Ех : : ОгЯВ Ко нина имени мими не х А нн о і : : В : в В 6 15 З рр Мас Таблиня результатів: без розрахунків - РОС 13 ОВ тек - канал 1! Ол т п ві п й 7
Фіг. ЗА
ВОВНИ АЕН ПаогедОовНість пепульсів: ери ще ж т ж т я за ще ве щодух т Бо вн я кг ЕМ -
ЖЖ. їж хо 0 КВ п : 5: ї ЩЕ ща ше» ШУ х ! Її ! Ї В " їх ї Е ї ; ї : Її ! ї ! С ; «уч КУ КУ у с фач о кт Є УФ ке КУ ек де уче ру ек у уч руч У у чу у рочок укус у уч рою усу уже усу у БВ а 0-3 180 кю Зб Я З и 5 Ж Вр т З Ка ія зр т. ЗВ
НК : : : Те : і ; ; -Ва ї і : ж щ-о вин ни п В В ОБО д Ко Е і : : 5 Ж свя : Я: : : гЗ : | ! ох ї і : ке В Ї і і яв пен нани кос кино роюнннон нн нн Не - т я : а ще Таблиця результатів (без розрахунків - АРОТ З НВ канал ОО Час утримання хв. Площа мН.сі Висота |хВ| Плоша | ові
«Фг.ЯА
ЗОБІ АРОТ Постпловність імуно вари сег кі був; віт сх ож джу УК ТО ча кн ж ефе Ба же Б і ЗЕ: 2 а ня ї ї : ШИ теЕКреккуфткуУссууУсскустотусуссртскусккісстурскуУтсруутстсркостусккорсусстуетскуусскусскуусикоткесукостуски треку єтуєскуєтсюку єть 18 зщк о що а що а що ЯКЕ БО) й ше з зе зр ж чи а ж
Фі. В
UAA201610381A 2014-05-01 2015-04-29 Спосіб синтезу полінуклеотиду та динуклеотидна тіофосфорамідатна сполука UA126108C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461987396P 2014-05-01 2014-05-01
US201562151909P 2015-04-23 2015-04-23
PCT/US2015/028327 WO2015168310A1 (en) 2014-05-01 2015-04-29 Oligonucleotide compositions and methods of making the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA126108C2 true UA126108C2 (uk) 2022-08-17

Family

ID=54359301

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201610381A UA126108C2 (uk) 2014-05-01 2015-04-29 Спосіб синтезу полінуклеотиду та динуклеотидна тіофосфорамідатна сполука

Country Status (32)

Country Link
US (5) US9796747B2 (uk)
EP (2) EP4286519A3 (uk)
JP (6) JP7040892B2 (uk)
KR (3) KR20210130822A (uk)
CN (3) CN117357548A (uk)
AP (1) AP2016009489A0 (uk)
AU (3) AU2015253158B2 (uk)
BR (1) BR112016025196B1 (uk)
CA (1) CA2943888A1 (uk)
CL (4) CL2016002749A1 (uk)
DK (1) DK3137479T3 (uk)
EA (1) EA034882B9 (uk)
ES (1) ES2963740T3 (uk)
FI (1) FI3137479T3 (uk)
HR (1) HRP20231505T1 (uk)
HU (1) HUE064289T2 (uk)
IL (2) IL248044B (uk)
JO (2) JOP20200257A1 (uk)
LT (1) LT3137479T (uk)
MX (2) MX2016014178A (uk)
MY (2) MY196927A (uk)
PE (1) PE20170147A1 (uk)
PH (1) PH12016502080A1 (uk)
PL (1) PL3137479T3 (uk)
PT (1) PT3137479T (uk)
RS (1) RS64860B1 (uk)
SG (2) SG11201608226YA (uk)
SI (1) SI3137479T1 (uk)
TW (2) TWI709406B (uk)
UA (1) UA126108C2 (uk)
WO (1) WO2015168310A1 (uk)
ZA (2) ZA201606624B (uk)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7485717B2 (en) 2004-07-02 2009-02-03 Geron Corporation Synthesis of protected 3′-amino nucleoside monomers
JOP20200257A1 (ar) 2014-05-01 2017-06-16 Geron Corp تركيبات أوليجو نوكليوتيد وطرق لتحضيرها
SG11201707893RA (en) 2015-04-23 2017-11-29 Geron Corp Methods of polynucleotide preparation using multivalent cation salt compositions
UA125185C2 (uk) * 2017-07-10 2022-01-26 Джерон Корпорейшн Покращений спосіб одержання іметелстату
IL292328A (en) * 2019-10-28 2022-06-01 Geron Corp Succinylate-converted 3-(fatty amido)-2-hydroxy-1-(hydroxy-protected)-propane salts amorphous solids and methods for their preparation
WO2021086754A1 (en) 2019-10-28 2021-05-06 Geron Corporation Crystalline solids of 3-palmitoyl-amido-1,2-propanediol and 3-palmitoyl-amido-2-hydroxy-1-dimethoxytriphenylmethylether-propane and methods of making and using the same
KR20220123300A (ko) 2020-01-08 2022-09-06 닛토덴코 가부시키가이샤 분절-타입 아미디트(segment-type amidite)를 사용한 핵산 합성 방법

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4046720A (en) 1974-01-17 1977-09-06 California Institute Of Technology Crosslinked, porous, polyacrylate beads
US4394448A (en) 1978-02-24 1983-07-19 Szoka Jr Francis C Method of inserting DNA into living cells
US4678814A (en) 1981-03-30 1987-07-07 California Institute Of Technology Polyacrolein microspheres
US4413070A (en) 1981-03-30 1983-11-01 California Institute Of Technology Polyacrolein microspheres
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US6448392B1 (en) 1985-03-06 2002-09-10 Chimerix, Inc. Lipid derivatives of antiviral nucleosides: liposomal incorporation and method of use
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US4757141A (en) 1985-08-26 1988-07-12 Applied Biosystems, Incorporated Amino-derivatized phosphite and phosphate linking agents, phosphoramidite precursors, and useful conjugates thereof
US4659774A (en) 1985-11-01 1987-04-21 American Hoechst Corporation Support for solid-phase oligonucleotide synthesis
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
ES2055907T3 (es) 1989-03-07 1994-09-01 Genentech Inc Conjugados covalentes de lipidos y oligonucleotidos.
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5411947A (en) 1989-06-28 1995-05-02 Vestar, Inc. Method of converting a drug to an orally available form by covalently bonding a lipid to the drug
US6395492B1 (en) 1990-01-11 2002-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US6153737A (en) 1990-01-11 2000-11-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US6114513A (en) 1990-01-11 2000-09-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized oligonucleotides
WO1991014696A1 (en) 1990-03-29 1991-10-03 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide-transport agent disulfide conjugates
US5420330A (en) 1990-09-07 1995-05-30 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Lipo-phosphoramidites
US5419966A (en) 1991-06-10 1995-05-30 Microprobe Corporation Solid support for synthesis of 3'-tailed oligonucleotides
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5837453A (en) 1992-05-13 1998-11-17 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5629154A (en) 1993-11-12 1997-05-13 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5489508A (en) 1992-05-13 1996-02-06 University Of Texas System Board Of Regents Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
US6235886B1 (en) 1993-09-03 2001-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of synthesis and use
US5523389A (en) 1992-09-29 1996-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of human immunodeficiency virus
US7067497B2 (en) 1992-09-29 2006-06-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of telomere length by oligonucleotides having a G-core sequence
US6087491A (en) 1993-01-08 2000-07-11 Hybridon, Inc. Extremely high purity oligonucleotides and methods of synthesizing them using dimer blocks
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
US6350853B1 (en) 1993-04-26 2002-02-26 Peter E. Nielsen Conjugated peptide nucleic acids having enhanced cellular uptake
DE4331670A1 (de) 1993-09-17 1995-03-23 Hoechst Ag Neue Antisense-Oligonucleotide gegen HSV-1 sowie deren Herstellung
CA2174425A1 (en) 1993-10-18 1995-04-27 Graham Leslie Barrett A method for enhancing neurone survival and agents useful for same
US5863726A (en) 1993-11-12 1999-01-26 Geron Corporation Telomerase activity assays
CA2184375C (en) 1994-03-18 2006-05-02 Sergei M. Gryaznov Oligonucleotide n3'-p5' phosphoramidates: synthesis and compounds; hybridization and nuclease resistance properties
US5726297A (en) 1994-03-18 1998-03-10 Lynx Therapeutics, Inc. Oligodeoxyribonucleotide N3' P5' phosphoramidates
US5599922A (en) 1994-03-18 1997-02-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties
GB9413035D0 (en) 1994-06-29 1994-08-17 Scras Antisense oligonucleeotides
US5958680A (en) 1994-07-07 1999-09-28 Geron Corporation Mammalian telomerase
US5583016A (en) 1994-07-07 1996-12-10 Geron Corporation Mammalian telomerase
EP1293565A3 (en) 1994-07-07 2004-05-12 Geron Corporation Mammalian telomerase RNA component
EP0790965A1 (en) 1994-11-07 1997-08-27 HYBRIDON, Inc. Synthesis of ?35 s-labeled oligonucleotides with 3h-1,2-benzodithiol-3-1,1-dioxide
US5760062A (en) 1995-04-18 1998-06-02 Geron Corporation Telomerase inhibitors
US5863936A (en) 1995-04-18 1999-01-26 Geron Corporation Telomerase inhibitors
US5656638A (en) 1995-04-18 1997-08-12 Geron Corporation Telomerase inhibitors
US5840490A (en) 1995-06-07 1998-11-24 Mcmaster University Telomerase activity associated with hematological and colorectal malignancies
US5770613A (en) 1995-09-29 1998-06-23 Geron Corporation Telomerase inhibitors
US5767278A (en) 1995-10-06 1998-06-16 Geron Corporation Telomerase inhibitors
US5684143A (en) 1996-02-21 1997-11-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligo-2'-fluoronucleotide N3'->P5' phosphoramidates
US5859233A (en) 1996-02-21 1999-01-12 Lynx Therapeutics, Inc. Synthons for synthesis of oligonucleotide N3-P5 phosphoramidates
GB9606158D0 (en) 1996-03-23 1996-05-29 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
US6015710A (en) 1996-04-09 2000-01-18 The University Of Texas System Modulation of mammalian telomerase by peptide nucleic acids
AU2445997A (en) 1996-04-10 1997-10-29 Lynx Therapeutics, Inc. Telomerase inhibitors
US6111085A (en) 1996-09-13 2000-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbamate-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US6261836B1 (en) 1996-10-01 2001-07-17 Geron Corporation Telomerase
US6444650B1 (en) 1996-10-01 2002-09-03 Geron Corporation Antisense compositions for detecting and inhibiting telomerase reverse transcriptase
US6001991A (en) 1996-10-04 1999-12-14 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense oligonucleotide modulation of MDR P-glycoprotein gene expression
US5846723A (en) 1996-12-20 1998-12-08 Geron Corporation Methods for detecting the RNA component of telomerase
EP0951568A1 (en) 1996-12-20 1999-10-27 Geron Corporation Methods for detecting and inhibiting the rna component of telomerase
US5877309A (en) 1997-08-13 1999-03-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides against JNK
US5998604A (en) 1997-09-15 1999-12-07 The Perkin-Elmer Corporation Polynucleotide purification method
JP3722630B2 (ja) 1998-10-28 2005-11-30 パイオニア株式会社 記録再生装置
US6656730B1 (en) 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
ATE391134T1 (de) 1999-09-10 2008-04-15 Geron Corp Oligonukleotid n3'-p5' thiophosphoramidate: ihre synthese und verwendung
GB9927674D0 (en) * 1999-11-23 2000-01-19 Aegis Eng Ltd Protective material
US6331399B1 (en) 2000-05-16 2001-12-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of tert expression
US7563618B2 (en) 2001-03-23 2009-07-21 Geron Corporation Oligonucleotide conjugates
AU2002245717A1 (en) 2001-03-23 2002-10-08 Geron Corporation Oligonucleotide conjugates
BRPI0414222B8 (pt) 2003-09-09 2021-05-25 Geron Corp compostos oligonucleotídeos modificados para inibição da telomerase, métodos, composição farmacêutica e usos relacionados
US20120329858A1 (en) 2010-08-04 2012-12-27 Geron Corporation Modified oligonucleotides for telomerase inhibition
US7485717B2 (en) 2004-07-02 2009-02-03 Geron Corporation Synthesis of protected 3′-amino nucleoside monomers
WO2006023880A2 (en) * 2004-08-23 2006-03-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for the characterization of oligonucleotides
CA2584984A1 (en) * 2004-10-18 2006-04-27 Codon Devices, Inc. Methods for assembly of high fidelity synthetic polynucleotides
ATE553198T1 (de) 2005-04-15 2012-04-15 Geron Corp Behandlung von krebs durch die kombinierte hemmung der proteasom- und telomeraseaktivitäten
US8153604B2 (en) * 2006-04-24 2012-04-10 Geron Corporation CNS-tumor treatment method and composition
ES2696828T3 (es) 2006-10-30 2019-01-18 Geron Corp Inhibidor de telomerasa y gemcitabina combinados para el tratamiento del cáncer
WO2008094640A2 (en) 2007-01-30 2008-08-07 Geron Corporation Compounds having anti-adhesive effects on cancer cells
US9106103B2 (en) 2011-09-23 2015-08-11 Eaton Corporation Unintteruptible power supply systems and methods employing on-demand energy storage
US9006630B2 (en) 2012-01-13 2015-04-14 Altasens, Inc. Quality of optically black reference pixels in CMOS iSoCs
US9375485B2 (en) 2012-12-07 2016-06-28 Geron Corporation Use of telomerase inhibitors for the treatment of myeloproliferative disorders and myeloproliferative neoplasms
US20150342982A1 (en) 2012-12-07 2015-12-03 Geron Corporation Use of Telomerase Inhibitors for the Treatment of Myeloproliferative Disorders and Myeloproliferative Neoplasms
JOP20200257A1 (ar) 2014-05-01 2017-06-16 Geron Corp تركيبات أوليجو نوكليوتيد وطرق لتحضيرها

Also Published As

Publication number Publication date
AP2016009489A0 (en) 2016-10-31
JP2018131453A (ja) 2018-08-23
LT3137479T (lt) 2023-10-10
FI3137479T3 (fi) 2023-11-28
PH12016502080A1 (en) 2017-01-09
IL248044A0 (en) 2016-11-30
ZA201606624B (en) 2020-12-23
PE20170147A1 (es) 2017-04-12
AU2022203273A1 (en) 2022-06-02
MX2016014178A (es) 2017-05-04
CL2022000202A1 (es) 2023-02-10
AU2015253158B2 (en) 2019-12-12
KR20230088509A (ko) 2023-06-19
CN111228288A (zh) 2020-06-05
SG11201608226YA (en) 2016-10-28
HRP20231505T1 (hr) 2024-03-01
EA201691786A1 (ru) 2017-04-28
JP2023073510A (ja) 2023-05-25
EP4286519A2 (en) 2023-12-06
CN117357548A (zh) 2024-01-09
CL2018001212A1 (es) 2018-08-03
CN106459134B (zh) 2020-02-18
JOP20200257A1 (ar) 2017-06-16
CA2943888A1 (en) 2015-11-05
WO2015168310A1 (en) 2015-11-05
HUE064289T2 (hu) 2024-02-28
JP2021182946A (ja) 2021-12-02
KR102316282B1 (ko) 2021-10-25
JP7308309B2 (ja) 2023-07-13
US10392418B2 (en) 2019-08-27
SI3137479T1 (sl) 2023-11-30
AU2020201707B2 (en) 2022-02-17
AU2020201707A1 (en) 2020-03-26
JO3767B1 (ar) 2021-01-31
EA034882B1 (ru) 2020-04-01
SG10201911086XA (en) 2020-01-30
PT3137479T (pt) 2023-11-30
EP3137479B1 (en) 2023-08-30
NZ724764A (en) 2021-02-26
JP2017514479A (ja) 2017-06-08
IL248044B (en) 2019-08-29
ES2963740T3 (es) 2024-04-01
JP2020050670A (ja) 2020-04-02
TW201622732A (zh) 2016-07-01
US11739114B2 (en) 2023-08-29
US20150337314A1 (en) 2015-11-26
MY196927A (en) 2023-05-11
ZA202005857B (en) 2024-01-31
MX2021004932A (es) 2021-08-16
DK3137479T3 (da) 2023-11-20
US11299511B2 (en) 2022-04-12
US9796747B2 (en) 2017-10-24
JP2022044679A (ja) 2022-03-17
IL268570A (en) 2019-09-26
US20180016293A1 (en) 2018-01-18
EP3137479A4 (en) 2018-02-07
KR20160147768A (ko) 2016-12-23
TWI712413B (zh) 2020-12-11
RS64860B1 (sr) 2023-12-29
EP3137479A1 (en) 2017-03-08
JP7040892B2 (ja) 2022-03-23
TW202017574A (zh) 2020-05-16
BR112016025196B1 (pt) 2022-08-02
TWI709406B (zh) 2020-11-11
EA034882B9 (ru) 2020-07-13
KR20210130822A (ko) 2021-11-01
IL268570B (en) 2021-10-31
EP4286519A3 (en) 2024-02-28
CN106459134A (zh) 2017-02-22
US20180016294A1 (en) 2018-01-18
CL2016002749A1 (es) 2017-04-28
US20220306676A1 (en) 2022-09-29
NZ763996A (en) 2021-03-26
US20240150391A1 (en) 2024-05-09
PL3137479T3 (pl) 2024-02-26
CL2018001213A1 (es) 2018-08-03
BR112016025196A2 (pt) 2017-12-12
AU2015253158A1 (en) 2016-10-20
CN111228288B (zh) 2023-10-20
MY178617A (en) 2020-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA126108C2 (uk) Спосіб синтезу полінуклеотиду та динуклеотидна тіофосфорамідатна сполука
EA044343B1 (ru) Неочищенная композиция полинуклеотидного соединения
OA18106A (en) Oligonucleotide compositions and methods of making the same
OA19860A (en) Oligonucleotide compositions and methods of making the same.
NZ724764B2 (en) Oligonucleotide compositions and methods of making the same
NZ763996B2 (en) Oligonucleotide compositions and methods of making the same