RS64860B1 - Oligonukleotidne kompozicije i postupci za pripremu istih - Google Patents

Oligonukleotidne kompozicije i postupci za pripremu istih

Info

Publication number
RS64860B1
RS64860B1 RS20231110A RSP20231110A RS64860B1 RS 64860 B1 RS64860 B1 RS 64860B1 RS 20231110 A RS20231110 A RS 20231110A RS P20231110 A RSP20231110 A RS P20231110A RS 64860 B1 RS64860 B1 RS 64860B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
substituted
protected
group
bond
oligonucleotide
Prior art date
Application number
RS20231110A
Other languages
English (en)
Inventor
Premchandran H Ramiya
Original Assignee
Geron Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Geron Corp filed Critical Geron Corp
Publication of RS64860B1 publication Critical patent/RS64860B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/314—Phosphoramidates
    • C12N2310/3145—Phosphoramidates with the nitrogen in 3' or 5'-position
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
UVOD
[0001] Hemija polimera nukleinskih kiselina je igrala ulogu u mnogim razvojnim tehnologijama u farmaceutskim, dijagnostičkim i analitičkim poljima, a posebno u podoblastima antisens i antigenske terapije, kombinatorne hemije, pojačanja razgranatog DNK signala i DNK dijagnostike i analize zasnovane na nizu. Deo ove hemije polimera je usmeren na poboljšanje snage vezivanja, specifičnosti i otpornosti na nukleazu prirodnih polimera nukleinskih kiselina, kao što je DNK. Peptidna nukleinska kiselina (PNA), fosforotioatna, metilfosfonatna i fosforamidatna intemukleozidna veza su primeri nekih hemija polimera koje su primenjene na oligonukleotide da bi se obezbedilo jedno ili više poželjnih osobina kao što su otpornost na nukleaze i ćelijsko preuzimanje.
[0002] Fosforamidati oligonukleotida N3'→P5' mogu da formiraju stabilne duplekse sa komplementarnim DNK i RNK lancima, kao i stabilne triplekse sa DNK dupleksima, i otporni su na nukleaze. Oligonukleotidni N3'→P5' tiofosforamidati su našli primenu kao potentna antisens sredstva kako in vitro tako i in vivo. Na primer, jedinjenja koja sadrže oligonukleotide koja inhibiraju aktivnost telomeraze mogu se koristiti za lečenje poremećaja posredovanih telomerazom, kao što je kancer, pošto ćelije kancera eksprimiraju aktivnost telomeraze, a normalne humane somatske ćelije ne poseduju aktivnost telomeraze na biološki relevantnim nivoima. Kao takvi, postupci pripreme i izolovanja takvih oligonukleotida su od interesa.
[0003] WO 02/077184 A2 opisuje oligonukleotidne konjugate.
[0004] WO 97/37691 A1 opisuje inhibitore telomeraze.
[0005] Gryaznov et al., (2001) Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 20:401-410 opisuje i procenjuje različite oligonukleotidne N3'→P5' fosforamidate i N3'→P5' tiofosforamidate kao potencijalne inhibitore telomeraze.
[0006] Gryaznov et al., (2003) Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 22:577-581 opisuje i procenjuje oligonukleotidne N3'→P5' tiofosforamidate kao potencijalne antagoniste obrasca telomeraze.
KRATAK OPIS
[0007] Aspekti pronalaska za koje se traži zaštita su definisani u priloženim patentnim zahtevima. Ovo otkriće opisuje postupak čvrste faze pripreme oligonukleotida putem sekvencijalnih ciklusa kuplovanja uključujući najmanje jedno spajanje dinukleotidne dimer podjedinice sa slobodnom 3'-terminalnom grupom (npr., 3'-hidroksil ili 3'-amino grupom) rastućeg lanca. Predmetni postupci uključuju pripremu oligonukleotida gde su najmanje dve od nukleozidnih podjedinica spojene N3'→P5' fosforamidatnom vezom između podjedinica. Postupak može uključiti korake (a) uklanjanja zaštite sa zaštićene 3' amino grupe terminalnog nukleozida vezanog za nosač čvrste faze, pri čemu pomenuta deprotekcija formira slobodnu 3' amino grupu; (b) dovođenje u kontakt slobodne 3' amino grupe sa 3'-zaštićenim aminodinukleotid-5'-fosforamidit dimerom u prisustvu nukleofilnog katalizatora da bi se formirala internukleozidna N3'→P5' fosforamiditna veza; i (c) oksidacije veze. U nekim slučajevima, oksidacija veze uključuje sumporovanje da bi se proizvela internukleozidna N3'→P5' tiofosforamidatna veza.
[0008] Ovo otkriće opisuje oligonukleotidne kompozicije proizvedene predmetnim postupcima koji uključuju smanjenu količinu jednog ili više (N-x) oligonukleotidnih proizvoda. U nekim slučajevima, smanjena količina je manja od (1.9 x N) delova do 100 po težini jednog ili više (N-x) proizvoda u odnosu na N proizvod. Oligonukleotidi pripremljeni prema predmetnim postupcima uključuju oligonukleotid koji ima sekvencu N nukleozidnih podjedinica komplementarnih RNK komponenti humane telomeraze, pri čemu su najmanje dve nukleozidne podjedinice spojene N3'→P5' tiofosforamidatnom vezom među podjedinicama. Takođe su opisane farmaceutske kompozicije uključujući predmetne oligonukleotidne kompozicije.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0009]
Slike 1A i 1B prikazuju HPLC hromatogram (A) i<31>P NMR spektre (B) za TA dimer tiofosforamidat (jedinjenje 7e, šema 1).
Slike 2A i 2B prikazuju HPLC hromatogram (A) i<31>P NMR spektre (B) za AA dimer tiofosforamidat (jedinjenje 7a, šema 1).
Slike 3A i 3B prikazuju HPLC hromatogram (A) i<31>P NMR spektre (B) za GG dimer tiofosforamidat (jedinjenje 7c, šema 1).
Slike 4A i 4B prikazuju HPLC hromatogram (A) i<31>P NMR spektre (B) za GT dimer tiofosforamidat (jedinjenje 7d, šema 1).
Slike 5A i 5B prikazuju HPLC hromatogram (A) i<31>P NMR spektre (B) za GA dimer tiofosforamidat (jedinjenje 7b, šema 1).
Slike 6A i 6B prikazuju LCMS tragove za dimer amidate TA, AA, GA, GT i GG. Slika 7 prikazuje HPLC hromatogram proizvoda sinteze imetelstata na skali od 140 µmol korišćenjem strategije spajanja monomera.
Slika 8 prikazuje HPLC hromatogram proizvoda sinteze imetelstata na skali od 140 µmol koristeći strategiju spajanja dimer blokova.
DEFINICIJE
[0010] Sledeći termini imaju sledeća značenja osim ako nije drugačije naznačeno. Svi nedefinisani termini imaju svoja značenja priznata u stanju tehnike.
[0011] Kako se ovde koriste, termini polinukleotid i oligonukleotid se koriste naizmenično. Kad god je oligonukleotid predstavljen nizom slova, kao što je "ATGUCCTG", podrazumeva se da su nukleotidi u redosledu 5'→3' s leva na desno i da "A" označava deoksiadenozin, "C" označava deoksicitidin, " G" označava deoksiguanozin, "T" označava timidin i "U" označava deoksiuridin, osim ako nije drugačije naznačeno.
[0012] Kako se ovde koristi, "nukleozid" uključuje prirodne nukleozide, uključujući 2'-deoksi i 2'-hidroksil oblike, npr., kako je opisano u Kornberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992) "Analozi" u odnosu na nukleozide obuhvataju sintetičke nukleozide koji imaju modifikovane bazne delove i/ili modifikovane delove šećera, npr., opisane generalno od strane Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, New York, 1980). Takvi analozi uključuju sintetičke nukleozide dizajnirane da poboljšaju svojstva vezivanja, npr., stabilnost, specifičnost ili slično, kao što je otkriveno od strane Uhlmann and Peyman (Chemical Reviews, 90:543-584, 1990). U nekim primerima izvođenja, nukleozid ili analog nukleozida uključuje 3'-hidroksil grupu ili 3'-amino grupu.
[0013] Termini "baza" i "nukleobaza" se koriste naizmenično i ovde su definisani da uključuju (i) konvencionalne baze DNK i RNK (uracil, timin, adenin, guanin i citozin) i (ii) modifikovane baze ili analoge baze (npr., 5-metil-citozin, 5-bromuracil ili inozin). Analog baze je hemikalija čija molekularna struktura imitira onu konvencionalne DNK ili RNK baze.
[0014] Kako se ovde koristi, "pirimidin" označava pirimidine koji se nalaze u prirodnim nukleozidima, uključujući citozin, timin i uracil, i njihove uobičajene analoge, kao što su oni supstituenti koji sadrže oksi, metil, propinil, metoksi, hidroksil, amino, tio, halo i slično. Termin kako se ovde koristi dalje uključuje pirimidine sa zajedničkim vezanim zaštitnim grupama, kao što je N<4>- benzoilcitozin. Dalje uobičajene pirimidinske zaštitne grupe su otkrivene u Beaucage and Iyer Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992).
[0015] Kako se ovde koristi, "purin" označava purine koji se nalaze u prirodnim nukleozidima, uključujući adenin, guanin i hipoksantin, i njihove uobičajene analoge, kao što su oni supstituenti koji sadrže oksi, metil, propinil, metoksi, hidroksil, amino, tio, halo i slično. Termin kako se ovde koristi dalje uključuje purine sa zajedničkim vezanim zaštitnim grupama, kao što je N<2>-benzoilguanin, N<2>-izobutirilguanin, N<6>-benzoiladenin i slično. Dodatne uobičajene purinske zaštitne grupe su otkrivene od strane Beaucage and Iyer Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992). Kako se ovde koristi, termin "-zaštićen-" kao komponenta hemijskog imena odnosi se na zaštitne grupe koje su priznate u struci za određeni deo jedinjenja, npr., "5'-zaštićenihidroksil" u odnosu na nukleozid uključuje trifenilmetil (tj., tritil), p-anisildifenilmetil (tj., monometoksitritil ili MMT), di-p-anizilfenilmetil (tj., dimetoksitritil ili DMT) i slično i zaštićenu nukleobazu u odnosu na nukleobazu uključujući heteroatom zaštićen grupom kao što je dimetilaminoformamidin (DMF), benzoil (Bz), izobutiril i slično. Zaštitne grupe priznate u stanju tehnike uključuju one opisane u sledećim referencama: Gait, editor, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984); Amarnath and Broom, Chemical Reviews, 77:183-217, 1977; Pon et al., Biotechniques, 6:768-775, 1988; Ohtsuka et al, Nicleic Acids Research, 10:6553-6570, 1982; Eckstein, editor, Oligonucleotides. and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991), Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Second Edition, (John Wiley & Sons, New York, 1991), Narang, editor, Synthesis and Applications of DNA and RNA (Academic Press, New York, 1987), Beaucage and Iyer Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992), i sličnim referencama.
[0016] Kako se ovde koristi, "oligonukleotid N3'→P5' fosforamidat" označava oligomer, obično linearan, nukleozidnih podjedinica povezanih najmanje jednom N3'→P5' fosforamidatnom vezom. Uopšteno govoreći, nukleozidne podjedinice sadrže nukleozide ili analoge nukleozida, ali mogu takođe sadržati opštije delove koji imaju kompatibilnu hemiju, kao što su abazični šećeri i drugi ugljovodonični delovi, kao što je opisano u sledećim referencama: Newton et al., Nucleic Acids Research, 21: 1155-1162 (1993); Griffin et al, J. Am. Chem. Soc., 114: 7976-7982 (1992); Jaschke et al, Tetrahedron Letters, 34: 301-304 (1992); Ma et al., međunarodna prijava PCT/CA92/00423; Zon et al., međunarodna prijava PCT/US90/06630; Durand et al., Nucleic Acids Research, 18: 6353-6359 (1990); Salunkhe et al., J. Am. Chem. Soc., 114: 8768-8772 (1992); i slično. U nekim slučajevima, termin označava oligonukleotid u kome su sve internukleozidne veze zamenjene N3'→P5' fosforamidatnim vezama, tj., termin obuhvata delimično kao i potpuno "amidirane" oligomere. U nekim slučajevima, to znači oligonukleotid u kome su sve internukleozidne veze zamenjene N3'→P5' fosforamidatnim vezama i gde su nukleozidne podjedinice prirodni nukleozidi ili njihovi analozi. Predmetni oligonukleotid N3'->P5' fosforamidat u kojem je svaka veza N3'→P5' fosforamidatna veza ("potpuno amidirana") može biti ugrađena ili vezana za druge oligonukleotide ili polinukleotide da bi se formirao veći oligomer koji je „delimično amidovan". Predmetni oligonukleotid N3'→P5' fosforamidat može uključiti bilo koju pogodnu 3' i/ili 5' terminalnu grupu. U nekim primerima izvođenja, oligonukleotid N3'→P5' fosforamidat uključuje 3'-hidroksil terminalnu grupu ili 3'-amino terminalnu grupu.
[0017] Kako se ovde koristi, termini "fosfat" i "fosfatna grupa" obuhvataju tiofosfatnu i oksofosfatnu grupu.
[0018] Kako se ovde koristi, termin "fosforamiditna amino grupa" odnosi se na amino grupu, -NR<4>R<5>, vezanu za atom fosfora fosforamiditne grupe i termin "fosforamiditni azot" se odnosi na atom azota fosforamiditne amino grupe.
[0019] "Alkil" se odnosi na monovalentne zasićene alifatične hidrokarbil grupe koje imaju od 1 do 10 atoma ugljenika i kao što su 1 do 6 atoma ugljenika (npr. "alkil od 1 do 6 atoma ugljenika"), ili 1 do 5 (npr. "alkil od 1 do 5 atoma ugljenika"), ili 1 do 4 (npr. "alkil sa 1 do 4 atoma ugljenika"), ili 1 do 3 atoma ugljenika (npr. "alkil sa 1 do 3 atoma ugljenika"). Ovaj termin uključuje, na primer, linearne i razgranate hidrokarbilne grupe kao što je metil (CH3-), etil (CH3CH2-), n-propil (CH3CH2CH2-), izopropil ((CH3)2CH-), n-butil (CH3CH2CH2CH2-), izobutil ((CH3)2CHCH2-), sek-butil ((CH3)(CH3CH2)CH-), t-butil ((CH3)3C-), n-pentil (CH3CH2CH2CH2CH2-), i neopentil ((CH3)3CCH2-).
[0020] Termin "supstituisani alkil" se odnosi na alkil grupu kako je ovde definisana u kojoj su jedan ili više atoma ugljenika u alkil lancu izborno zamenjeni heteroatomom kao što je -O-, -N-, -S-, -S(O)n- (gde n je 0 do 2), -NR- (gde R je vodonik ili alkil) i ima od 1 do 5 supstituenata izabranih iz grupe koja se sastoji od sledećih: alkoksi, supstituisani alkoksi, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloalkenil, supstituisani cikloalkenil, acil, acilamino, aciloksi, amino, aminoacil, aminoaciloksi, oksiaminoacil, azido, cijano, halogen, hidroksil, okso, tioketo, karboksil, karboksialkil, tioariloksi, tioheteroariloksi, tioheterociklooksi, tiol, tioalkoksi, supstituisani tioalkoksi, aril, ariloksi, heteroaril, heteroariloksi, heterociklil, heterociklooksi, hidroksiamino, alkoksiamino, nitro, -SO-alkil, -SO-aril, -SO-heteroaril, -SO2-alkil, -SO2-aril, -SO2-heteroaril i -NR<a>R<b>, pri čemu R<a>i R<b>mogu biti isti ili različiti i izabrani su od vodonika, izborno supstituisanog alkila, cikloalkila, alkenila, cikloalkenila, alkinila, arila, heteroarila i heterociklusa. U nekim slučajevima, "supstituisani alkil" se odnosi na alkil grupu kako je ovde definisana koja ima od 1 do 5 supstituenata izabranih iz grupe koja se sastoji od alkoksi, cikloalkil, cikloalkenil, acil, acilamino, aciloksi, amino, aminoacil, aminoaciloksi, oksiaminoacil, azido, cijano, halogen, hidroksil, karboksil, karboksialkil, tiol, tioalkoksi, aril, ariloksi, heteroaril, heteroariloksi, heterociklil, heterociklooksi, sulfonamido i -NR<a>R<b>, pri čemu R<a>i R<b>mogu biti isti ili različiti i izabrani su od vodonika, alkila, cikloalkila, alkenila, cikloalkenila, alkinila, arila, heteroarila i heterocikla.
[0021] "Alkilen" se odnosi na dvovalentne alifatične hidrokarbil grupe koje poželjno imaju od 1 do 6 i još poželjnije 1 do 3 atoma ugljenika koji su ili pravolančani ili razgranati, i koji su izborno prekinuti sa jednom ili više grupa izabranih od -O-, -NR<10>-, -NR<10>C(O)-, -C(O)NR<10>- i slično. Ovaj termin uključuje, na primer, metilen (-CH2-), etilen (-CH2CH2-), n-propilen (-CH2CH2CH2-), izo-propilen (-CH2CH(CH3)-), (-C(CH3)2CH2CH2-), (-C(CH3)2CH2C(O)-), (-C(CH3)2CH2C(O)NH-), (-CH(CH3)CH2-), i slično.
[0022] "Supstituisani alkilen" se odnosi na alkilensku grupu koja ima od 1 do 3 vodonika zamenjene supstituentima kao što je opisano za ugljenike u definiciji "supstituisanog" u nastavku.
[0023] Termin "alkan" se odnosi na alkil grupu i alkilen grupu, kao što je ovde definisana.
[0024] Termin "alkilaminoalkil", "alkilaminoalkenil" i "alkilaminoalkinil" se odnosi na grupe R NHR - gde je R' alkil grupa kao što je ovde definisana, a R" je alkilen, alkenilen ili alkinilen grupa kao što je ovde definisano.
[0025] Termin "alkaril" ili "aralkil" se odnosi na grupe -alkilen-aril i -supstituisani alkilen-aril gde su alkilen, supstituisani alkilen i aril ovde definisani.
[0026] "Alkoksi" se odnosi na grupu -O-alkil, gde je alkil kao što je ovde definisan. Alkoksi uključuje, na primer, metoksi, etoksi, n-propoksi, izopropoksi, n-butoksi, t-butoksi, sekbutoksi, n-pentoksi i slično. Termin "alkoksi" se takođe odnosi na grupe alkenil-O-, cikloalkil-O-, cikloalkenil-O- i alkinil-O-, gde su alkenil, cikloalkil, cikloalkenil i alkinil kao što su ovde definisani.
[0027] Termin "supstituisani alkoksi" se odnosi na grupe supstituisane alkil-O-, supstituisane alkenil-O-, supstituisane cikloalkil-O-, supstituisane cikloalkenil-O- i supstituisane alkinil-O-gde su supstituisani alkil, supstituisani alkenil, supstituisani cikloalkil, supstituisani cikloalkenil i supstituisani alkinil su kao što su ovde definisani.
[0028] Termin "alkoksiamino" se odnosi na grupu -NH-alkoksi, gde je alkoksi ovde definisan.
[0029] Termin "haloalkoksi" se odnosi na grupe alkil-O- u kojima su jedan ili više atoma vodonika na alkil grupi supstituisani sa halo grupom i uključuju, kao primer, grupe kao što su trifluorometoksi i slično.
[0030] Termin "haloalkil" se odnosi na supstituisanu alkil grupu kao što je gore opisana, pri čemu su jedan ili više atoma vodonika na alkil grupi supstituisani sa halo grupom. Primeri takvih grupa uključuju, bez ograničenja, fluoroalkil grupe, kao što su trifluorometil, difluorometil, trifluoroetil i slično.
[0031] Termin "alkilalkoksi" se odnosi na grupe -alkilen-O-alkil, alkilen-O-supstituisani alkil, supstituisani alkilen-O-alkil i supstituisani alkilen-O-supstituisani alkil gde su alkil, supstituisani alkil, alkilen i supstituisani alkil kao što su definisani ovde.
[0032] Termin "alkiltioalkoksi" se odnosi na grupu -alkilen-S-alkil, alkilen-S-supstituisani alkil, supstituisani alkilen-S-alkil i supstituisani alkilen-S-supstituisani alkil gde su alkil, supstituisani alkil, alkilen i supstituisani kao što su definisani ovde.
[0033] "Alkenil" se odnosi na ravnolančane ili razgranate hidrokarbilne grupe koje imaju od 2 do 6 atoma ugljenika i poželjno 2 do 4 atoma ugljenika i imaju najmanje 1 i poželjno od 1 do 2 mesta nezasićenosti dvostruke veze. Ovaj termin uključuje, na primer, bi-vinil, alil i but-3-en-1-il. U ovaj termin uključeni su cis i trans izomeri ili smeše ovih izomera.
[0034] Termin "supstituisani alkenil" se odnosi na alkenil grupu kako je ovde definisana koja ima od 1 do 5 supstituenata, ili od 1 do 3 supstituenta, izabranih od sledećih: alkoksi, supstituisani alkoksi, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloalkenil, supstituisani cikloalkenil, acil, acilamino, aciloksi, amino, supstituisani amino, aminoacil, aminoaciloksi, oksiaminoacil, azido, cijano, halogen, hidroksil, okso, tioketo, karboksil, karboksialkil, tioariloksi, tioheteroariloksi, tioheterociklooksi, tiol, tioalkoksi, supstituisani tioalkoksi, aril, ariloksi, heteroaril, heteroariloksi, heterociklil, heterociklooksi, hidroksiamino, alkoksiamino, nitro, -SO-alkil, -SO-supstituisani alkil, -SO-aril, -SO-heteroaril, -SO2-alkil, -SO2-supstituisani alkil, -SO2-aril i - SO2-heteroaril.
[0035] "Alkinil" se odnosi na ravne ili razgranate monovalentne hidrokarbilne grupe koje imaju od 2 do 6 atoma ugljenika i poželjno 2 do 3 atoma ugljenika i imaju najmanje 1, a poželjno od 1 do 2 mesta nezasićenosti trostruke veze. Primeri takvih alkinil grupa uključuju acetilenil (-C=CH) i propargil (-CH2C≡CH).
[0036] Termin "supstituisani alkinil" se odnosi na alkinil grupu kako je ovde definisana koja ima od 1 do 5 supstituenata, ili od 1 do 3 supstituenta, izabranih od sledećih: alkoksi, supstituisani alkoksi, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloalkenil, supstituisani cikloalkenil, acil, acilamino, aciloksi, amino, supstituisani amino, aminoacil, aminoaciloksi, oksiaminoacil, azido, cijano, halogen, hidroksil, okso, tioketo, karboksil, karboksialkil, tioariloksi, tioheteroariloksi, tioheterociklooksi, tiol, tiokoaloksi, supstituisani tioalkoksi, aril, ariloksi, heteroaril, heteroariloksi, heterociklil, heterociklooksi, hidroksiamino, alkoksiamino, nitro, SO-alkil, -SO-supstituisani alkil, -SO-aril, -SO-heteroaril, -SO2-alkil, -SO2-supstituisani alkil, -SO2-aril i -SO2-heteroaril.
[0037] "Alkiniloksi" se odnosi na grupu -O-alkinil, gde je alkinil kao što je ovde definisan. Alkiniloksi uključuje, na primer, etiniloksi, propiniloksi i slično.
[0038] "Acil" se odnosi na grupe H-C(O)-, alkil-C(O)-, supstituisani alkil-C(O)-, alkenil-C(O)-, supstituisani alkenil-C(O)-, alkinil-C(O)-, supstituisani alkinil-C(O)-, cikloalkil-C(O)-, supstituisani cikloalkil-C(O)-, cikloalkenil-C(O)-, supstituisani cikloalkenil-C(O)-, aril- C(O)-, supstituisani aril-C(O)-, heteroaril-C(O)-, supstituisani heteroaril-C(O)-, heterociklil-C(O)- i supstituisani heterociklil-C(O)-, pri čemu su alkil, supstituisani alkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloalkenil, supstituisani cikloalkenil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, heterociklus, supstituisani heterociklus, ovde definisani. Na primer, acil uključuje "acetil" grupu CH3C(O)-[0039] "Acilamino" se odnosi na grupe -NR<20>C(O)alkil, -NR<20>C(O) supstituisani alkil, NR<20>C(O)cikloalkil, -NR<20>C(O) supstituisani cikloalkil, -NR<20>C(O)cikloalkenil, -NR<20>C(O) supstituisani cikloalkenil, -NR<20>C(O)alkenil, -NR<20>C(O) supstituisani alkenil, -NR<20>C(O)alkinil, -NR<20>C(O) supstituisani alkinil, -NR<20>C(O)aril, -NR<20>C(O) supstituisani aril, -NR<20>C(O)heteroaril, -NR<20>C(O) supstituisani heteroaril, -NR<20>C(O)heterociklus i -NR<20>C(O) supstituisan heterociklus, gde R<20>je vodonik ili alkil i pri čemu su alkil, supstituisani alkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloalkenil, supstituisani cikloalkenil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, heterociklus i supstituisani heterociklus kao što su ovde definisani.
[0040] "Aminokarbonil" ili termin "aminoacil" se odnosi na grupu -C(O)NR<21>R<22>, pri čemu R<21>i R<22>nezavisno su izabrani iz grupe koja se sastoji od sledećih: vodonik, alkil, supstituisani alkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, aril, supstituisani aril, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloalkenil, supstituisani cikloalkenil, heteroaril, supstituisani heteroaril, heterociklus i supstituisani heterociklus i gde R<21>i R<22>su izborno spojeni zajedno azotnom vezom tako da se formira heterociklična ili supstituisana heterociklična grupa, i gde alkil, supstituisani alkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloalkenil, supstituisani cikloalkenil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, heterociklus i supstituisani heterociklus su kao što su ovde definisani.
[0041] "Aminokarbonilamino" se odnosi na grupu -NR<21>C(O)NR<22>R<23>gde R<21>, R<22>i R<23>su nezavisno izabrani od vodonika, alkila, arila ili cikloalkila, ili gde su dve R grupe spojene da formiraju heterociklil grupu.
[0042] Termin "alkoksikarbonilamino" se odnosi na grupu -NRC(O)OR gde je svaki R nezavisno vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, heteroaril ili heterociklil gde su alkil, supstituisani alkil, aril, heteroaril i heterociklil kao što su ovde definisani.
[0043] Termin "aciloksi" se odnosi na grupe alkil-C(O)O-, supstituisani alkil-C(O)O-, cikloalkil-C(O)O-, supstituisani cikloalkil-C(O)O-, aril-C(O)O-, heteroaril-C(O)O- i heterociklil-C(O)O- pri čemu su alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, aril, heteroaril i heterociklil kao što je ovde definisano.
[0044] "Aminosulfonil" se odnosi na grupu -SO2NR<21>R<22>, pri čemu su R<21>i R<22>nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od sledećih: vodonik, alkil, supstituisani alkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, aril, supstituisani aril, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloalkenil, supstituisani cikloalkenil, heteroaril, supstituisani heteroaril, heterociklus, supstituisani heterociklus i gde su R<21>i R<22>izborno spojeni zajedno sa azotnom vezom tako da se formira heterociklična ili supstituisana heterociklična grupa i alkil, supstituisani alkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloalkenil, supstituisani cikloalkenil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, heterociklus i supstituisani heterociklus su kao što su ovde definisani.
[0045] "Sulfonilamino" se odnosi na grupu -NR<21>SO2R<22>, pri čemu R<21>i R<22>nezavisno su izabrani iz grupe koja se sastoji od sledećih: vodonik, alkil, supstituisani alkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, aril, supstituisani aril, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloalkenil, supstituisani cikloalkenil, heteroaril, supstituisani heteroaril, heterociklus i supstituisani heterociklus i gde su R<21>i R<22>izborno spojeni zajedno sa atomima vezanim za njih tako da formiraju heterocikličnu ili supstituisanu heterocikličnu grupu, i pri čemu alkil, supstituisani alkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloalkenil, supstituisani cikloalkenil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, heterociklus i supstituisani heterociklus su kao što su ovde definisani.
[0046] "Aril" ili "Ar" se odnosi na monovalentnu aromatičnu karbocikličnu grupu od 6 do 18 atoma ugljenika koja ima jedan prsten (kao što je prisutan u fenil grupi) ili sistem prstena koji ima više kondenzovanih prstenova (primeri takvih sistema aromatičnih prstenova uključuju naftil, antril i indanil) čiji kondenzovani prstenovi mogu ili ne moraju biti aromatični, pod uslovom da je tačka vezivanja preko atoma aromatičnog prstena. Ovaj termin uključuje, na primer, fenil i naftil. Osim ako nije drugačije ograničeno definicijom za aril supstituent, takve aril grupe mogu izborno biti supstituisane sa od 1 do 5 supstituenata, ili od 1 do 3 supstituenta, izabranih od sledećih: aciloksi, hidroksi, tiol, acil, alkil, alkoksi, alkenil, alkinil, cikloalkil,
1
cikloalkenil, supstituisani alkil, supstituisani alkoksi, supstituisani alkenil, supstituisani alkinil, supstituisani cikloalkil, supstituisani cikloalkenil, amino, supstituisani amino, aminoacil, acilamino, alkaril, aril, ariloksi, azido, karboksil, karboksialkil, cijano, halogen, nitro, heteroaril, heteroariloksi, heterociklil, heterociklooksi, aminoaciloksi, oksiacilamino, tioalkoksi, supstituisani tioalkoksi, tioariloksi, tioheteroariloksi, -SO-alkil, -SO-supstituisani alkil, -SO-aril, -SO-heteroaril, -SO2-alkil, -SO2-supstituisani alkil, -SO2-aril, -SO2-heteroaril i trihalometil. U takvim slučajevima, aril grupa koja je supstituisana sa 1 do 5 supstituenata (npr., kao što su ovde opisani) naziva se "supstituisani aril".
[0047] "Ariloksi" se odnosi na grupu -O-aril, gde je aril kao što je ovde definisan, uključujući, na primer, fenoksi, naftoksi i slično, uključujući izborno supstituisane aril grupe kao što su takođe ovde definisane.
[0048] "Amino" se odnosi na grupu -NH2.
[0049] Termin "supstituisani amino" se odnosi na grupu -NRR gde je svaki R nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od sledećih: vodonik, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, alkenil, supstituisani alkenil, cikloalkenil, supstituisani cikloalkenil, alkinil, supstituisani alkinil, aril, heteroaril i heterociklil pod uslovom da najmanje jedan R nije vodonik.
[0050] Termin "azido" se odnosi na grupu -N3.
[0051] "Karboksil", "karboksi" ili "karboksilat" se odnosi na -CO2H ili njegove soli.
[0052] "Karboksi estar" ili "karboksi estar" ili termini "karboksialkil" ili "karboksialkil" se odnose na grupe -C(O)O-alkil, -C(O)O-supstituisani
alkil, -C(O)O-alkenil, -C(O)O-supstituisani alkenil, -C(O)O-alkinil, -C(O)O-supstituisani alkinil, -C(O)O-aril, -C(O)O-supstituisani aril, -C(O)O-cikloalkil, -C(O)O-supstituisani cikloalkil, -C(O)O-cikloalkenil, -C(O)O-supstituisani cikloalkenil, -C(O)O-heteroaril, -C(O)O-supstituisani heteroaril, -C(O)O-heterociklični i -C(O)O-supstituisani heterociklus, pri čemu alkil, supstituisani alkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloalkenil, supstituisani cikloalkenil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, heterociklus i supstituisani heterociklus su kao što su ovde definisani.
[0053] "(Karboksil estar)oksi" ili "karbonat" se odnosi na grupe -O-C(O)O-alkil, -O-C(O)O-supstituisani alkil, -O-C(O)O-alkenil, -O-C(O)O-supstituisani alkenil, -O-C(O)O-alkinil, -O-C(O)O-supstituisani alkinil, -O-C(O)O-aril, -O-C(O)O-supstituisani aril, -O-C(O)O-cikloalkil, -O-C(O)O-supstituisani cikloalkil, -O-C(O)O-cikloalkenil, -O-C(O)O-supstituisani cikloalkenil, -O-C(O)O-heteroaril, -O-C(O)O-supstituisani heteroaril, -O-C (O)O-heterociklus i -O-C(O)O-supstituisani heterociklus, pri čemu alkil, supstituisani alkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloalkenil, supstituisani cikloalkenil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, heterociklus i supstituisani heterociklus su kao što su ovde definisani.
[0054] "Cijano" ili "nitril" se odnosi na grupu -CN.
[0055] "Cikloalkil" se odnosi na ciklične alkil grupe od 3 do 10 atoma ugljenika koji imaju jedan ili više cikličnih prstenova uključujući fuzionisane, premošćene i spiro prstenaste sisteme. Primeri pogodnih cikloalkil grupa uključuju, na primer, adamantil, ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, ciklooktil i slično. Takve cikloalkil grupe uključuju, na primer, strukture sa jednim prstenom kao što su ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, ciklooktil i slično, ili višestruke strukture prstena kao što je adamantanil i slično.
[0056] Termin "supstituisani cikloalkil" se odnosi na cikloalkil grupe koje imaju od 1 do 5 supstituenata, ili od 1 do 3 supstituenta, izabranih od sledećih: alkil, supstituisani alkil, alkoksi, supstituisani alkoksi, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloalkenil, supstituisani cikloalkenil, acil, acilamino, aciloksi, amino, supstituisani amino, aminoacil, aminoaciloksi, oksiaminoacil, azido, cijano, halogen, hidroksil, okso, tioketo, karboksil, karboksialkil, tioariloksi, tioheteroariloksi, tioheterociklooksi, tiol, tioalkoksi, supstituisani tioalkoksi, aril, ariloksi, heteroaril, heteroariloksi, heterociklil, heterociklooksi, hidroksiamino, alkoksiamino, nitro, -SO-alkil, -SO-supstituisani alkil, -SO-aril, -SO-heteroaril, -SO2-alkil, -SO2-supstituisani alkil, -SO2-aril i -SO2-heteroaril.
[0057] "Cikloalkenil" se odnosi na nearomatične ciklične alkil grupe od 3 do 10 atoma ugljenika koji imaju pojedinačne ili višestruke prstenove i imaju najmanje jednu dvostruku vezu i poželjno od 1 do 2 dvostruke veze.
[0058] Termin "supstituisani cikloalkenil" se odnosi na cikloalkenil grupe koje imaju od 1 do 5 supstituenata, ili od 1 do 3 supstituenta, izabrane od sledećih: alkoksi, supstituisani alkoksi, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloalkenil, supstituisani cikloalkenil, amino, supstituisani amino, aciloksi amino, aminoacil, aminoaciloksi, oksiaminoacil, azido, cijano, halogen, hidroksil, keto, tioketo, karboksil, karboksilalkil, tioariloksi, tioheteroariloksi, tioheterociklooksi, tiol, tioalkoksi, supstitutisani tioalkoksi, aril, ariloksi, heteroaril, heteroariloksi, heterociklil, heterociklooksi, hidroksiamino, alkoksiamino, nitro, -SO-alkil, -SO-supstituisani alkil, -SO-aril, - SO-heteroaril, -SO2-alkil, -SO2-supstituisani alkil, -SO2-aril i -SO2-heteroaril.
[0059] "Cikloalkinil" se odnosi na nearomatične cikloalkil grupe od 5 do 10 atoma ugljenika koje imaju jedan ili više prstenova i imaju najmanje jednu trostruku vezu.
[0060] "Cikloalkoksi" se odnosi na -O-cikloalkil.
[0061] "Cikloalkeniloksi" se odnosi na -O-cikloalkenil.
[0062] "Halo" ili "halogen" se odnosi na fluoro, hloro, bromo i jodo.
[0063] "Hidroksi" ili "hidroksil" se odnosi na grupu -OH.
[0064] "Heteroaril" se odnosi na aromatičnu grupu od 1 do 15 atoma ugljenika, kao što je od 1 do 10 atoma ugljenika i 1 do 10 heteroatoma izabranih iz grupe koja se sastoji od sledećih: kiseonik, azot i sumpor unutar prstena. Takve heteroaril grupe mogu imati jedan prsten (kao što je piridinil, imidazolil ili furil) ili više kondenzovanih prstenova u sistemu prstenova (na primer u grupama kao što su, indolizinil, hinolinil, benzofuran, benzimidazolil ili benzotienil), pri čemu je najmanje jedan prsten unutar sistema prstenova aromatičan i najmanje jedan prsten unutar sistema prstenova je aromatičan, pod uslovom da je tačka vezivanja preko atoma aromatičnog prstena. U određenim primerima izvođenja, atom(i) azota i/ili sumpora u prstenu heteroaril grupe su izborno oksidovani da bi se obezbedili N-oksid (N→O), sulfinil ili sulfonil ostaci. Ovaj termin uključuje, na primer, piridinil, pirolil, indolil, tiofenil i furanil. Osim ako nije drugačije ograničeno definicijom za heteroaril supstituent, takve heteroaril grupe mogu biti izborno supstituisane sa 1 do 5 supstituenata, ili od 1 do 3 supstituenta, izabrane od sledećih: aciloksi, hidroksi, tiol, acil, alkil, alkoksi, alkenil, alkinil, cikloalkil, cikloalkenil, supstituisani alkil, supstituisani alkoksi, supstituisani alkenil, supstituisani alkinil, supstituisani cikloalkil, supstituisani cikloalkenil, amino, supstituisani amino, aminoacil, acilamino, alkaril, aril, ariloksi, azido, haloksi, karboksil, karboksialkil, cijano, halogen, nitro, heteroaril, heteroariloksi, heterociklil, heterociklooksi, aminoaciloksi, oksiacilamino, tioalkoksi, supstituisani tioalkoksi, tioariloksi, tioheteroariloksi, -SO-alkil, -SO-supstituisani alkil, -SO-aril, -SO-heteroaril, -SO2-alkil, -SO2-supstituisani alkil, -SO2-aril i -SO2-heteroaril i trihalometil. U takvim slučajevima, heteroaril grupa koja je supstituisana sa od 1 do 5 supstituenata (npr., kao što je ovde opisano) se naziva "supstituisani heteroaril".
[0065] Termin "heteroaralkil" se odnosi na grupe -alkilen-heteroaril gde su alkilen i heteroaril ovde definisani. Ovaj termin uključuje, na primer, piridilmetil, piridiletil, indolilmetil i slično.
[0066] "Heteroariloksi" se odnosi na -O-heteroaril.
[0067] „Heterociklus“, „heterociklični“, „heterocikloalkil“ i „heterociklil“ se odnose na zasićenu ili nezasićenu grupu koja ima jedan prsten ili više kondenzovanih prstenova, uključujući fuzionisane premošćene i spiro prstenaste sisteme, i koja ima od 3 do 20 atoma u prstenu, uključujući 1 do 10 heteroatoma. Ovi atomi u prstenu su izabrani iz grupe koja se
1
sastoji od sledećih: azot, sumpor ili kiseonik, pri čemu, u fuzionisanim sistemima prstenova, jedan ili više prstenova može biti cikloalkil, aril ili heteroaril, pod uslovom da je tačka vezivanja preko ne-aromatičnog prstena. U određenim primerima izvođenja, atom(i) azota i/ili sumpora heterociklične grupe su izborno oksidovani da bi se obezbedio N-oksid, -S(O)- ili -SO2- delovi.
[0068] Primeri heterociklusa i heteroarila obuhvataju, ali nisu ograničeni na, azetidin, pirol, imidazol, pirazol, piridin, pirazin, pirimidin, piridazin, indolizin, izoindol, indol, dihidroindol, indazol, purin, hinazolin, izohinolin, hinolin, ftalazin, naftilpiridin, hinoksalin, hinazolin, cinoline, pteridin, karbazol, karbolin, fenantridin, akridin, fenantrolin, izotiazol, fenazin, izoksazol, fenoksazin, fenotiazin, imidazolidin, imidazolin, piperidin, piperazin, indolin, ftalimid, 1,2,3,4-tetrahidroizohinolin, 4,5,6,7-tetrahidrobenzo[b]tiofen, tiazol, tiazolidin, tiofen, benzo[b]tiofen, morfolinil, tiomorfolinil (takođe označen kao tiamorfolinil), 1,1-dioksotiomorfolinil, piperidinil, pirolidin, tetrahidrofuranil i slično.
[0069] Osim ako nije drugačije ograničeno definicijom za heterociklični supstituent, takve heterociklične grupe mogu biti izborno supstituisane sa 1 do 5, ili od 1 do 3 supstituenta, odabranih od sledećih: alkoksi, supstituisani alkoksi, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloalkenil, supstituisani cikloaciloalkenil, acil, acilamino, aciloksi, amino, supstituisani amino, aminoacil, aminoaciloksi, oksiaminoacil, azido, cijano, halogen, hidroksil, okso, tioketo, karboksil, karboksialkil, tioariloksi, tioheteroariloksi, tioheterociklooksi, tiol, tioalkoksi, supstituisani tioalkoksi, aril, ariloksi, heteroaril, heteroariloksi, heterociklil, heterociklooksi, hidroksiamino, alkoksiamino, nitro, -SO-alkil, -SO-supstituisani alkil, -SO-aril, -SO-heteroaril, -SO2-alkil, - SO2-supstituisani alkil, -SO2-aril, -SO2-heteroaril i fuzionisani heterociklus.
[0070] "Heterocikliloksi" se odnosi na grupu -O-heterociklil.
[0071] Termin "heterocikliltio" se odnosi na grupu heterociklus-S-.
[0072] Termin "heterociklen" se odnosi na diradikalnu grupu formiranu od heterociklusa, kako je ovde definisan.
[0073] Termin "hidroksiamino" se odnosi na grupu -NHOH.
[0074] "Nitro" se odnosi na grupu -NO2.
[0075] "Okso" se odnosi na atom (=O).
[0076] "Sulfonil" se odnosi na grupu SO2-alkil, SO2-supstituisani alkil, SO2-alkenil, SO2-supstituisani alkenil, SO2-cikloalkil, SO2-supstituisani cikloalkil, SO2-cikloalkenil, SO2-supstituisani cikloalkenil, SO2-aril, SO2-supstituisani aril, SO2-heteroaril, SO2-supstituisani heteroaril, SO2-heterociklus i SO2-supstituisani heterociklus, pri čemu su alkil, supstituisani alkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloalkenil, supstituisani cikloalkenil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, heterociklus i supstituisani heterociklus su kao što su ovde definisani. Sulfonil uključuje, na primer, metil-SO2-, fenil-SO2-, i 4-metilfenil-SO2-.
[0077] "Sulfoniloksi" se odnosi na grupu -OSO2-alkil, OSO2-supstituisani alkil, OSO2-alkenil, OSO2-supstituisani alkenil, OSO2-cikloalkil, OSO2-supstituisani cikloalkil, OSO2-cikloalkenil, OSO2-supstituisani cikloalkenil, OSO2-aril, OSO2-supstituisani aril, OSO2-heteroaril, OSO2-supstituisani heteroaril, OSO2-heterociklus i OSO2supstituisani heterociklus, pri čemu su alkil, supstituisani alkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloalkenil, supstituisani cikloalkenil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, heterociklus i supstituisani hetrociklus kao što su ovde definisani.
[0078] Termin "aminokarboniloksi" se odnosi na grupu -OC(O)NRR gde je svaki R nezavisno vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, heteroaril ili heterocikl, gde su alkil, supstituisani alkil, aril, heteroaril i heterociklus kao što su ovde definisani.
[0079] "Tiol" se odnosi na grupu -SH.
[0080] "Tiokso" ili termin "tioketo" se odnosi na atom (=S).
[0081] "Alkiltio" ili termin "tioalkoksi" se odnosi na grupu -S-alkil, gde je alkil kao što je ovde definisan. U određenim primerima izvođenja, sumpor može biti oksidovan u -S(O)-. Sulfoksid može postojati kao jedan ili više stereoizomera.
[0082] Termin "supstituisani tioalkoksi" se odnosi na grupu -S-supstituisani alkil.
[0083] Termin "tioariloksi" se odnosi na grupu aril-S- gde je aril grupa kao što je ovde definisana uključujući izborno supstituisane aril grupe takođe ovde definisane.
[0084] Termin "tioheteroariloksi" se odnosi na grupu heteroaril-S- u kojoj je heteroaril grupa kao što je ovde definisana uključujući izborno supstituisane aril grupe kao što su takođe ovde definisane.
[0085] Termin "tioheterociklooksi" se odnosi na grupu heterociklil-S- u kojoj je heterociklil grupa kao što je ovde definisana uključujući izborno supstituisane heterociklil grupe kao što su takođe ovde definisane.
[0086] Pored ovog otkrića, termin "supstituisan", kada se koristi za modifikovanje određene grupe ili radikala, takođe može značiti da su jedan ili više atoma vodonika određene grupe ili radikala, nezavisno jedan od drugog, zamenjeni istim ili različitim supstituentskim grupama kao što su definisane u nastavku.
[0087] Pored grupa otkrivenih u vezi sa pojedinačnim terminima ovde, supstituentske grupe za supstituciju za jedan ili više vodonika (bilo koja dva vodonika na jednom ugljeniku mogu biti zamenjena sa =O, =NR<70>, =N-OR<70>, =N2ili =S) na zasićenim atomima ugljenika u navedenoj
1
grupi ili radikalu su, osim ako nije drugačije naznačeno, -R<60>, halo, =O, -OR<70>, -SR<70>, -NR<80>R<80>, trihalometil, -CN, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, =N2, -N3, -SO2R<70>, -SO2O-M<+>, -SO2OR<70>, -OSO2R<70>, -OSO2O-M<+>, -OSO2OR<70>, -P(O)(O-)2(M<+>)2, -P(O)(OR<70>)O-M<+>, -P(O)(OR<70>)2, -C(O)R<70>, -C(S)R<70>, -C(NR<70>)R<70>, -C(O)O-M<+>, -C(O)OR<70>, -C(S)OR<70>, -C(O)NR<80>R<80>, -C(NR<70>)NR<80>R<80>, -OC(O)R<70>, -OC(S)R<70>, -OC(O)O -M<+>, -OC(O)OR<70>, -OC(S)OR<70>, -NR<70>C(O)R<70>, -NR<70>C(S)R<70>, -NR<70>CO2-M<+>, -NR<70>CO2R<70>, -NR<70>C(S)OR<70>, -NR<70>C(O)NR<80>R<80>, -NR<70>C(NR<70>)R<70>i -NR<70>C(NR<70>)NR<80>R<80>, gde je R<60>izabran iz grupe koja se sastoji od sledećih: izborno supstituisani alkil, cikloalkil, heteroalkil, heterocikloalkilalkil, cikloalkilalkil, aril, arilalkil, heteroaril i heteroarilalkil, svaki R<70>je nezavisno vodonik ili R<60>; svaki R<80>je nezavisno R<70>ili alternativno, dva R<80>, uzeti zajedno sa atomom azota za koji su vezani, formiraju 5-, 6- ili 7-člani heterocikloalkil koji izborno može uključivati od 1 do 4 istih ili različitih dodatnih heteroatoma izabranih iz grupe koja se sastoji od O, N i S, od kojih N može imati -H ili C1-C3alkil supstituciju; i svaki M<+>je protivjon sa neto jednim pozitivnim naelektrisanjem. Svaki M<+>može nezavisno biti, na primer, alkalni jon, kao što je K<+>, Na<+>, Li<+>; amonijum jon, kao npr<+>N(R<60>)4; ili zemnoalkalni jon, kao što je [Ca<2+>]0.5, [Mg<2+>]0.5, ili [Ba<2+>]0.5(„subskript 0.5 znači da jedan od protivjona za takve dvovalentne zemnoalkalne jone može biti jonizovani oblik jedinjenja kao što je ovde opisan, a drugi protivjon kao što je hlorid, ili dva jonizovana jedinjenja koja su ovde otkrivena mogu poslužiti kao protivjoni za takve dvovalentne zemnoalkalne jone, ili dvostruko jonizovano jedinjenje kao što je ovde opisano, može poslužiti kao protivjon za takve dvovalentne zemnoalkalne jone). Kao specifični primeri, -NR<80>R<80>znači da uključuje -NH2, -NH-alkil, N-pirolidinil, N-piperazinil, 4N-metil-piperazin-1-il i N-morfolinil.
[0088] Pored ovog otkrića, supstituentske grupe za vodonike na nezasićenim atomima ugljenika u "supstituisanim" alken, alkin, aril i heteroaril grupama su, osim ako nije drugačije naznačeno, R<60>, halo, -O-M<+>, -OR<70>, -SR<70>, -S-M<+>, -NR<80>R<80>, trihalometil, -CF3, -CN, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, -N3, -SO2R<70>, -SO3-M<+>, -SO3R<70>, -OSO2R<70>, -OSO3-M<+>, -OSO3R<70>, -PO3<-2>(M<+>)2, -P(O)(OR<70>)O-M<+>, -P(O)(OR<70>)2, -C(O)R<70>, -C(S)R<70>, -C(NR<70>)R<70>, -CO2-M<+>, -CO2R<70>, -C(S)OR<70>, -C(O)NR<80>R<80>, -C(NR<70>)NR<80>R<80>, -OC(O)R<70>, -OC(S)R<70>, -OCO2-M<+>, -OCO2R<70>, -OC(S)OR<70>, -NR<70>C(O)R<70>, -NR<70>C(S)R<70>, -NR<70>CO2-M<+>, -NR<70>CO2R<70>, -NR<70>C(S)OR<70>, -NR<70>C(O)NR<80>R<80>, -NR<70>C(NR<70>)R<70>i -NR<70>C(NR<70>)NR<80>R<80>, gde R<60>, R<70>, R<80>i M<+>su kao što je prethodno definisano, pod uslovom da u slučaju supstituisanog alkena ili alkina, supstituenti nisu -O-M<+>, -OR<70>, -SR<70>, ili -S-M<+>.
1
[0089] Pored grupa otkrivenih u vezi sa pojedinačnim terminima ovde, supstituentske grupe za vodonike na atomima azota u "supstituisanim" heteroalkil i cikloheteroalkil grupama su, osim ako nije drugačije
navedeno -R<60>, -O-M<+>, -OR<70>, -SR<70>, -S-M<+>, -NR<80>R<80>,
trihalometil, -CF3, -CN, -NO, -NO2, -S(O)2R<70>, -S(O)2O-M<+>, -S(O)2OR<70>, -OS(O)2R<70>, -OS(O)2O-M<+>, -OS(O)2OR<70>, -P(O)(O-)2(M<+>)2, -P(O)(OR<70>)O-M<+>, -P(O)(OR<70>)(OR<70>), -C(O)R<70>, -C(S)R<70>, -C(NR<70>)R<70>, -C(O)OR<70>, -C(S)OR<70>, -C(O)NR<80>R<80>, -C(NR<70>)NR<80>R<80>, -OC(O)R<70>, -OC(S)R<70>, -OC(O)OR<70>, -OC(S)OR<70>, -NR<70>C(O)R<70>, -NR<70>C(S)R<70>, -NR<70>C(O)OR<70>, -NR<70>C(S)OR<70>, -NR<70>C(O)NR<80>R<80>, -NR<70>C(NR<70>)R<70>i -NR<70>C(NR<70>)NR<80>R<80>, gde su R<60>, R<70>, R<80>i M<+>kao što su prethodno definisani.
[0090] Pored ovog otkrića, u određenom aspektu, grupa koja je supstituisana ima 1, 2, 3 ili 4 supstituenta, 1, 2 ili 3 supstituenta, 1 ili 2 supstituenta ili 1 supstituent.
[0091] Podrazumeva se da su u svim supstituisanim grupama definisanim gore, do polimera došlo definisanjem supstituenata sa daljim supstituentima za sebe (npr., supstituisani aril koji ima supstituisanu aril grupu kao supstituent koji je sam supstituisan sa supstituisanom aril grupom, koja je dalje supstituisana sa supstituisanom aril grupom, itd.) nisu namenjeni za uključivanje ovde. U takvim slučajevima, maksimalan broj takvih zamena je tri. Na primer, serijske supstitucije supstituisanih aril grupa koje su ovde posebno razmatrane su ograničene na supstituisani aril-(supstituisani aril)-supstituisani aril.
[0092] Osim ako nije drugačije naznačeno, do nomenklature supstituenata koji ovde nisu eksplicitno definisani dolazi se imenovanjem terminalnog dela funkcionalne grupe praćenog susednom funkcionalnom grupom prema tački vezivanja. Na primer, supstituent "arilalkiloksikarbonil" se odnosi na grupu (aril)-(alkil)-O-C(O)-.
[0093] Što se tiče bilo koje od ovde otkrivenih grupa koje sadrže jedan ili više supstituenata, podrazumeva se, naravno, da takve grupe ne sadrže nikakvu supstituciju ili supstitucijske obrasce koji su sterički nepraktični i/ili sintetički neizvodljivi. Pored toga, predmetna jedinjenja obuhvataju sve stereohemijske izomere koji nastaju supstitucijom ovih jedinjenja.
[0094] Termin "farmaceutski prihvatljiva so" označava so koja je prihvatljiva za primenu na pacijenta, kao što je sisar (soli sa protivjonima koje imaju prihvatljivu bezbednost za sisare za dati režim doziranja). Takve soli mogu biti izvedene iz farmaceutski prihvatljivih neorganskih ili organskih baza i iz farmaceutski prihvatljivih neorganskih ili organskih kiselina.
1
"Farmaceutski prihvatljiva so" se odnosi na farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja, koje soli su izvedene iz raznih organskih i neorganskih protivjona dobro poznatih u tehnici i uključuju, samo kao primer, natrijum i slično; i kada molekul sadrži baznu funkcionalnu grupu, soli organskih ili neorganskih kiselina, kao što je hidrohlorid i slično. Farmaceutski prihvatljive soli od interesa uključuju, ali nisu ograničene na, aluminijum, amonijum, arginin, barijum, benzatin, kalcijum, holinat, etilendiamin, lizin, litijum, magnezijum, meglumin, prokain, kalijum, natrijum, trometamin, N-metilglukamin, N,N'-dibenziletilen-diamin, hloroprokain, dietanolamin, etanolamin, piperazin, cink, diizopropilamin, diizopropiletilamin, trietilamin i trietanolamin soli.
[0095] Termin "njegova so" označava jedinjenje koje se formira kada je proton kiseline zamenjen katjonom, kao što je katjon metala ili organski katjon i slično. Tamo gde je primenjivo, so je farmaceutski prihvatljiva so, iako to nije potrebno za soli intermedijarnih jedinjenja koja nisu namenjena za primenu na pacijenta. Kao primer, soli ovih jedinjenja uključuju one u kojima je jedinjenje protonovano neorganskom ili organskom kiselinom da bi se formirao katjon, sa konjugatnom bazom neorganske ili organske kiseline kao anjonskom komponentom soli. Soli od interesa uključuju, ali nisu ograničene na, aluminijum, amonijum, arginin, barijum, benzatin, kalcijum, cezijum, holinat, etilendiamin, litijum, magnezijum, meglumin, prokain, N-metilglukamin, piperazin, kalijum, natrijum, trometamin, cink, N,N'-dibenziletilen-diamin, hloroprokain, dietanolamin, etanolamin, piperazin, diizopropilamin, diizopropiletilamin, trietilamin i trietanolamin soli. Podrazumeva se da za bilo koju od ovde prikazanih oligonukleotidnih struktura koje uključuju osnovnu intemukleozidnih veza, takvi oligonukleotidi mogu takođe uključiti bilo koje pogodne oblike soli. U nekim primerima izvođenja, kiseli oblici intemukleozidnih veza su prikazani radi jednostavnosti. U nekim slučajevima, so predmetnog jedinjenja je monovalentna so katjona. U određenim slučajevima, so predmetnog jedinjenja je dvovalentna so katjona. U nekim slučajevima, so predmetnog jedinjenja je trovalentna so katjona. "Solvat" se odnosi na kompleks formiran kombinacijom molekula rastvarača sa molekulima ili jonima rastvorene supstance. Rastvarač može biti organsko jedinjenje, neorgansko jedinjenje ili smeša oba. Neki primeri rastvarača uključuju, ali nisu ograničeni na, metanol, N,N-dimetilformamid, tetrahidrofuran, dimetilsulfoksid i voda. Kada je rastvarač voda, formirani solvat je hidrat.
[0096] "Stereoizomer" i "stereoizomeri" se odnose na jedinjenja koja imaju istu atomsku povezanost, ali različit atomski raspored u prostoru. Stereoizomeri uključuju cis-trans izomere, E i Z izomere, enantiomere i dijastereomere.
1
[0097] „Tautomer“ se odnosi na alternativne oblike molekula koji se razlikuju samo po elektronskom vezivanju atoma i/ili u položaju protona, kao što su enol-keto i imin-enamin tautomeri, -NH-P(=S)(OH)-O- i -NH-P(=O)(SH)-O-, ili tautomerni oblici heteroaril grupa koje sadrže -N=C(H)-NH- atomski raspored atoma u prstenu, kao što su pirazoli, imidazoli, benzimidazoli, triazoli i tetrazoli. Osoba sa uobičajenim iskustvom u ovoj oblasti tehnike bi prepoznala da su mogući i drugi tautomerni rasporedi ovde opisanih grupa. Na primer, podrazumeva se da je oligonukleotid opisan sledećom strukturom:
takođe obuhvata sledeću strukturu koja pokazuje jedan mogući alternativni tautomerni raspored vezujućih grupa:
gde "nps" predstavlja tiofosforamidatnu vezu (-NH-P(=O)(SH)-O- ili -NH-P(=S)(OH)-O-) koja povezuje 3'-ugljenik jednog nukleozida sa 5'-ugljenikom susednog nukleozida. Podrazumeva se da su svi tautomerni oblici predmetnog jedinjenja obuhvaćeni strukturom u kojoj je opisan jedan mogući tautomerni raspored grupa jedinjenja, čak i ako nije posebno naznačeno. Bilo koji pogodan tautomerni raspored grupa predmetnih jedinjenja može se koristiti za opisivanje jedinjenja.
1
[0098] Biće jasno da termin "ili njihova so ili solvat ili stereoizomer" treba da obuhvati sve permutacije soli, solvata i stereoizomera, kao što je solvat farmaceutski prihvatljive soli stereoizomera predmetnog jedinjenja. Podrazumeva se da termin "ili njegova so" treba da obuhvati sve permutacije soli. Podrazumeva se da termin "ili njegova farmaceutski prihvatljiva so" treba da obuhvati sve permutacije soli. Podrazumeva se da termin "ili njegov solvat" treba da uključi sve permutacije solvata. Podrazumeva se da termin "ili njegov stereoizomer" treba da obuhvati sve permutacije stereoizomera. Podrazumeva se da termin "ili njegov tautomer" treba da obuhvati sve permutacije tautomera. Tako, na primer, sledi da je namera da se uključi solvat farmaceutski prihvatljive soli tautomera stereoizomera predmetnog jedinjenja.
[0099] "Farmaceutski efikasna količina" i "terapeutski efikasna količina" odnose se na količinu jedinjenja dovoljnu za lečenje određenog poremećaja ili bolesti ili jednog ili više njegovih simptoma i/ili za sprečavanje pojave bolesti ili poremećaja. U odnosu na tumorogene proliferativne poremećaje, farmaceutski ili terapeutski efikasna količina obuhvata količinu dovoljnu da, između ostalog, izazove smanjenje tumora ili smanjenje brzine rasta tumora.
[0100] „Pacijent“ se odnosi na ljude i nehumane subjekte, posebno na subjekte sisare.
[0101] Termin "lečenje" ili "tretman" kako se ovde koristi označava lečenje ili tretman bolesti ili medicinskog stanja kod pacijenta, kao što je sisar (posebno čovek) koji uključuje: (a) sprečavanje pojave bolesti ili zdravstvenog stanja, kao što je profilaktički tretman subjekta; (b) poboljšanje bolesti ili zdravstvenog stanja, kao što je eliminisanje ili izazivanje regresije bolesti ili zdravstvenog stanja kod pacijenta; (c) suzbijanje bolesti ili zdravstvenog stanja, na primer usporavanjem ili zaustavljanjem razvoja bolesti ili zdravstvenog stanja kod pacijenta; ili (d) ublažavanje simptoma bolesti ili zdravstvenog stanja kod pacijenta.
[0102] Kako se ovde koristi, termin "izolovan" treba da opiše jedinjenje od interesa koje se nalazi u okruženju različitom od onog u kome se jedinjenje prirodno javlja. „Izolovano“ podrazumeva jedinjenja koja se nalaze u uzorcima koji su značajno obogaćeni jedinjenjem od interesa i/ili u kojima je jedinjenje od interesa delimično ili suštinski prečišćeno.
[0103] Kako se ovde koristi, termin "značajno prečišćen" odnosi se na jedinjenje koje je uklonjeno iz svog prirodnog okruženja i koje je najmanje 60% slobodno, najmanje 75% slobodno, najmanje 80% slobodno, najmanje 85% slobodno, najmanje 90% slobodno, najmanje 95% slobodno, najmanje 98% slobodno ili više od 98% slobodno od drugih komponenti sa kojima je prirodno povezan.
[0104] Termin "fiziološka stanja" treba da obuhvati one uslove kompatibilne sa živim ćelijama, npr., pretežno vodeni uslovi temperature, pH, saliniteta, itd. koji su kompatibilni sa živim ćelijama.
2
[0105] Pre nego što se ovaj pronalazak dalje opisuje, treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na određene opisane primere izvođenja, jer takvi mogu, naravno, da variraju. Takođe treba razumeti da je terminologija korišćena ovde samo u svrhu opisivanja određenih primera izvođenja, i nije namera da bude ograničavajuća, pošto će obim ovog pronalaska biti ograničen samo priloženim zahtevima.
[0106] Kada je naveden raspon vrednosti, podrazumeva se da svaka vrednost između, do desetine jedinice donje granice, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije, između gornje i donje granice tog opsega i bilo koje druge navedene ili vrednosti između u tom navedenom opsegu je obuhvaćena pronalaskom. Gornje i donje granice ovih manjih opsega mogu nezavisno biti uključene u manje opsege, a takođe su obuhvaćene pronalaskom, podložno bilo kojoj posebno isključenoj granici u navedenom opsegu. Tamo gde navedeni opseg uključuje jednu ili obe granice, opsezi koji isključuju jedno ili obe uključene granice takođe su uključeni u pronalazak.
[0107] Smatra se da određene karakteristike pronalaska, koje su, radi jasnoće, opisane u kontekstu odvojenih primera izvođenja, takođe mogu biti obezbeđene u kombinaciji u jednoj varijanti. Nasuprot tome, različite karakteristike pronalaska, koje su, radi kratkoće, opisane u kontekstu jednog primera izvođenja, takođe mogu biti obezbeđene odvojeno ili u bilo kojoj pogodnoj podkombinaciji. Sve kombinacije primera izvođenja koje se odnose na pronalazak su posebno obuhvaćene ovim pronalaskom i ovde su otkrivene baš kao da je svaka kombinacija pojedinačno i eksplicitno otkrivena, u meri u kojoj takve kombinacije obuhvataju predmet koji su, na primer, jedinjenja koja su stabilna jedinjenja (tj. jedinjenja koja se mogu napraviti, izolovati, okarakterisati i testirati na biološku aktivnost). Pored toga, sve podkombinacije različitih izvođenja i njihovih elemenata (npr., elementi hemijskih grupa navedenih u primerima izvođenja koje opisuju takve promenljive) su takođe posebno obuhvaćene ovim pronalaskom i ovde su otkrivene kao da svaka takva podkombinacija je pojedinačno i eksplicitno otkrivena ovde.
[0108] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju isto značenje koje obično razume stručnjak u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Iako se bilo koji postupak i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani takođe mogu koristiti u praksi ili testiranju ovog pronalaska, sada su opisani postupci i materijali od interesa.
[0109] Mora se primetiti da kako se ovde koristi i u priloženim zahtevima, oblici jednine "a", "an" i "the" uključuju množinu, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Dalje se napominje da patentni zahtevi mogu biti sastavljeni tako da isključe bilo koji izborni element. Kao takva, ova izjava treba da posluži kao prethodna osnova za upotrebu takve ekskluzivne terminologije kao što su „isključivo“, „samo“ i slično u vezi sa navođenjem elemenata patentnih zahteva ili upotrebom „negativnog“ ograničenja.
[0110] Smatra se da određene karakteristike pronalaska, koje su, radi jasnoće, opisane u kontekstu odvojenih primera izvođenja, takođe mogu biti obezbeđene u kombinaciji u jednoj varijanti. Nasuprot tome, različite karakteristike pronalaska, koje su, radi kratkoće, opisane u kontekstu jednog primera izvođenja, takođe mogu biti obezbeđene odvojeno ili u bilo kojoj pogodnoj podkombinaciji.
[0111] Publikacije o kojima se ovde govori su obezbeđene isključivo radi njihovog otkrivanja pre datuma podnošenja ove prijave. Ništa ovde se ne može tumačiti kao priznanje da ovaj pronalazak nema pravo da prethodi takvom objavljivanju na osnovu prethodnog pronalaska. Dalje, dati datumi objavljivanja mogu se razlikovati od stvarnih datuma objavljivanja koji će možda morati da budu nezavisno potvrđeni.
DETALJAN OPIS
[0112] Kao što je gore sumirano, aspekti pronalaska za koje se traži zaštita su definisani u priloženim zahtevima. Ovo otkriće opisuje postupak čvrste faze za pripremu oligonukleotida putem sekvencijalnih ciklusa kuplovanja uključujući kuplovanje dinukleotidnog dimera na slobodnu 3'-terminalnu grupu (npr., 3'-hidroksil ili 3'-amino grupu) rastućeg lanca. Uopšteno govoreći, sinteza se odvija od 5'-terminusa do 3'-terminusa ciljne oligonukleotidne sekvence i uključuje najmanje jedno kuplovanje dinukleotidnog dimera. Dimer može biti spojen na slobodnu 3' terminalnu grupu rastućeg lanca bilo kojom pogodnom hemijom. U nekim slučajevima, dimer je 3'-zaštićeni-dinukleotid-5'-fosforamidit dimer, pri čemu dinukleotid može uključivati bilo koju pogodnu međunukleozidnu vezu. Oligonukleotid može uključivati jednu ili više fosforamidatnih veza između podjedinica (npr. okso-fosforamidatna ili tiofosforamidatna veza).
[0113] U skladu sa prvim aspektom pronalaska, obezbeđen je postupak sinteze polinukleotida koji ima najmanje dve nukleozidne podjedinice spojene N3'→P5' oksofosforamidatom ili N3'→P5' tiofosforamidatnom međupodjediničnom vezom, postupak koji sadrži korake:
(a) uklanjanje zaštite sa zaštićene 3' amino grupe terminalnog nukleozida vezanog za nosač čvrste faze, pri čemu pomenuta deprotekcija formira slobodnu 3' amino grupu; (b) dovođenja u kontakt slobodne 3' amino grupe sa 3'-zaštićenim amino-dinukleotid fosforamidat-5'-fosforamidit dimerom u prisustvu nukleofilnog katalizatora da bi se formirala internukleozidna N3'→P5' fosforamiditna veza; i
(c) oksidacije veze da bi se proizvela N3'→P5' oksofosforamidatna ili N3'→P5' tiofosforamidatna veza između podjedinica.
[0114] Prema drugom aspektu pronalaska, obezbeđeno je jedinjenje dinukleotida tiofosforamidata opisano Formulom (II):
gde:
B<1>i B<2>su svaki nezavisno purin, zaštićeni purin, pirimidin ili zaštićeni pirimidin, ili njihov analog;
R<11>je fosforamiditna grupa; i
R<12>i R<13>su svaki nezavisno zaštitna grupa; ili njegova so.
[0115] U nekim primerima izvođenja, oligonukleotid uključuje niz nukleozidnih podjedinica koje sadrže najmanje jednu podjedinicu definisanu formulom:
2
gde je B purin, zaštićeni purin, pirimidin ili zaštićeni pirimidin, ili njihov analog; X je O ili S; R je izabran iz grupe koja se sastoji od sledećih: vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril, fosfatna zaštitna grupa; i R<3>je izabran iz grupe koja se sastoji od sledećih: vodonik, O-R<2>i halogen, pri čemu R<2>je H, alkil, supstituisani alkil (npr. -(CH2)nW(CH2)mH, gde je n između 1-10, m je između 0-10 i W je O, S ili NH) ili zaštitna grupa za hidroksil. Podrazumeva se da neki od oligonukleotida uključujući podjedinicu opisanu gornjom formulom mogu takođe postojati u obliku soli. Takvi oblici, u meri u kojoj mogu da postoje, treba da budu uključeni u obim ovog otkrića.
[0116] Predmetni postupci obezbeđuju smanjen broj ciklusa kuplovanja u odnosu na postupke koji uključuju samo spajanje podjedinica nukleozidnih monomera i obezbeđuju smanjene količine neciljnih oligonukleotidnih proizvoda sinteze. Retrosintetička strategija koja se koristi za pripremu ciljne oligonukleotidne sekvence može se izabrati u zavisnosti od niza faktora, kao što su dužina i sekvenca ciljnog oligonukleotida, tako da se minimiziraju količine određenih neciljnih oligonukleotidnih proizvoda sinteze.
[0117] U nekim primerima izvođenja, predmetni postupci obezbeđuju pripremu kompozicija koje imaju smanjenu količinu jednog ili više (N-x) proizvoda u odnosu na ciljni oligonukleotid od interesa.
[0118] U određenim primerima izvođenja, bilo koja od ovde opisanih kompozicija koja ima smanjenu količinu jednog ili više (N-x) proizvoda u odnosu na ciljni oligonukleotid od interesa nije prečišćena.
[0119] Kako se ovde koristi, termin "(N-x) proizvod" (gde je x ceo broj od 1 do N-1 i N je broj nukleozidnih ostataka u ciljnom oligonukleotidu), odnosi se na neciljani oligonukleotid proizveden tokom predmetnih postupaka pripreme koji nema x nukleozidnih ostataka u poređenju sa sekvencom ciljnog oligonukleotida dužine N ostataka. Ciljni oligonukleotid je proizvod za koji je dizajniran predmetni postupak pripreme. Kao takav, (N-1) proizvod je neciljani oligonukleotid kome nedostaje bilo koji nukleozidni ostatak iz sekvence ciljnog oligonukleotida. Kao takav, u nekim slučajevima, termin "(N-1) proizvod" se odnosi na razne neciljne oligonukleotidne proizvode, od kojih svakom nedostaje jedan nukleozidni ostatak u poređenju sa sekvencom ciljnog oligonukleotida. Slično, termin "(N-x) proizvod" se odnosi na niz neciljanih oligonukleotidnih proizvoda, od kojih svakom nedostaje x nukleozidnih ostataka u poređenju sa sekvencom ciljnog oligonukleotida. Na primer, (N-2) proizvod je neciljani oligonukleotid kome nedostaju bilo koja dva nukleozidna ostatka izvan sekvence ciljnog oligonukleotida. U nekim slučajevima, x ostaci su susedni jedan drugom u odnosu na ciljnu oligonukleotidnu sekvencu. U drugim slučajevima, x ostaci su međusobno odvojeni u odnosu na ciljnu oligonukleotidnu sekvencu. Ostaci x nukleozida mogu nedostajati na bilo kojoj lokaciji ciljne sekvence i mogu se proizvesti iz neizreagovanih 3'-terminalnih grupa tokom ciklusa kuplovanja. (N-x) proizvodi predmetnih postupaka mogu uključivati jednu ili više dodatnih modifikacija koje proizilaze iz predmetnih postupaka sinteze, npr., delimična modifikacija deprotekcije, gubitak nukleobaze (npr. depurinacija), zatvaranje terminalne grupe, derivatizacija putem reagensa za sintezu (npr., fenilacetilacija reagensom za sumporovanje), i slično. Mogući su različiti modifikovani oligonukleotidi u zavisnosti od hemije sinteze oligonukleotida i korišćenog reagensa. Osim ako nije drugačije naznačeno, sve takve modifikacije treba da budu obuhvaćene terminom (N-x) proizvod.
[0120] U nekim primerima izvođenja, predmetni postupci rezultiraju redukcijom jednog ili više neciljanih proizvoda sinteze oligonukleotida izabranih između delimično zaštićenog proizvoda ili delimično zaštićenog (N-x) proizvoda, npr., oligonukleotidnog proizvoda koji uključuje jednu ili više zaštitnih grupa nukleobaze. U predmetnim oligonukleotidnim kompozicijama, ciljna oligonukleotidna sekvenca može biti lakše izolovana ili prečišćena od drugih proizvoda koji sadrže oligonukleotide ovog postupka, npr., (N-x) proizvoda i proizvoda kojima nedostaje nukleobaza.
[0121] Primeri izvođenja predmetnih postupaka i kompozicija su detaljnije opisani u odeljcima ispod.
POSTUPCI PRIPREME OLIGONUKLEOTIDA
[0122] Ovo otkriće obezbeđuje postupak za pripremu oligonukleotida. Predmetni postupci mogu uključiti najmanje jedno spajanje dinukleotidnog dimera za slobodnu 3' terminalnu grupu rastućeg oligonukleotidnog lanca. Bilo koji pogodni postupci i hemije sinteze oligonukleotida mogu se koristiti u predmetnim postupcima pripreme. Hemije sinteze oligonukleotida i postupci od interesa koje se mogu prilagoditi za upotrebu u predmetnim postupcima uključuju, ali nisu ograničeni na, fosforamidit, H-fosfonat, fosfodiestar, fosfotriestar, fosfit triestar i one koje opisuje Fearon et al. U U.S.5,824,793. Oligonukleotidne komponente ovde opisanih jedinjenja mogu se sintetisati prilagođavanjem konvencionalnih protokola za tip izabrane hemije. Postupci od interesa za sintezu oligonukleotida koji imaju N3'→P5' fosforamidatne hemije uključuju, ali nisu ograničeni na, one postupke opisane u McCurdy et al., (1997) Tetrahedron Letters, 38:207-210 i Pongracz & Gryaznov, (1999) Tetrahedron Letters, 49:7661-7664.
[0123] Oligonukleotid od interesa može se pripremiti korišćenjem predmetnih postupaka putem sekvencijalnog spajanja počevši od 5'-terminusa i nastavljajući do 3'-terminusa ciljne
2
oligonukleotidne sekvence. 5'-terminalna nukleozidna podjedinica može biti vezana za bilo koju pogodnu čvrstu podlogu preko izborne vezujuće grupe ili 5'-terminalne grupe. Zatim, spajanje podjedinica za rastući oligonukleotidni lanac može se postići korišćenjem ili dimer fosforamidita ili monomer fosforamidita. Alternativno, 5'-terminalna dinukleotidna podjedinica može biti vezana za bilo koji pogodan čvrsti nosač preko izborne vezujuće grupe ili 5'-terminalne grupe. Jednom kada je prva podjedinica (npr., monomerna ili dimerna podjedinica) vezana za čvrsti nosač, podjedinica može biti deprotektovana da bi se proizvela slobodna, imobilizovana 3'-terminalna grupa. U nekim slučajevima, postupak uključuje kuplovanje 3'-terminalne grupe vezane za podlogu sa 3'-zaštićenim dinukleotid-5'-fosforamidit dimerom. U određenim primerima izvođenja, 3'-terminalna grupa je 3'-hidroksilna grupa. U određenim primerima izvođenja, 3'-terminalna grupa je 3'-amino grupa.
[0124] U nekim slučajevima, postupak uključuje korake: (a) uklanjanja zaštite sa zaštićene 3' amino grupe terminalnog nukleozida vezanog za nosač čvrste faze, pri čemu navedeno uklanjanje zaštite formira slobodnu 3' amino grupu; (b) dovođenje u kontakt slobodne 3' amino grupe sa 3'-zaštićenim amino-dinukleotidnim tiofosforamidatom ili fosforamidit-5'-fosforamidit dimerom u prisustvu nukleofilnog katalizatora da bi se formirala internukleozidna N3'→P5' veza fosfora i (c) oksidaciju veze.
[0125] Ciljna oligonukleotidna sekvenca može da se sintetiše korišćenjem retrosintetičke strategije koja uključuje sekvencijalno spajanje i dimernih i monomernih podjedinica na 3'-terminalnu grupu rastućeg oligonukleotidnog lanca. Kao takav, u nekim primerima izvođenja, postupak dalje uključuje korake: (a) uklanjanja zaštite zaštićene 3' amino grupe terminalnog nukleozida vezanog za nosač čvrste faze, pri čemu pomenuta deprotekcija formira slobodnu 3' amino grupu; (b) dovođenje u kontakt slobodne 3' amino grupe sa 3'-zaštićenim aminonukleozid-5'-fosforamidit monomerom u prisustvu nukleofilnog katalizatora da bi se formirala internukleozidna N3'->P5' fosforamiditna veza; i (c) oksidaciju veze da bi se proizvela N3'→P5' fosforamidatna veza.
[0126] Kako se ovde koristi, termin "N3'→P5' fosforamiditna veza" odnosi se na fosfor (III) intermedijer N3'→P5' fosforamidatne veze. Uopšteno govoreći, N3'→P5' fosforamidatna veza se formira oksidacijom N3'→P5' fosforamiditne veze u fosfor (V) proizvod (npr., N3'→P5' fosforamidatna veza koja može uključivati okso (P=O) ili tio (P=S) grupa). U nekim slučajevima, korak oksidacije se može opisati kao sumporovanje N3'→P5' fosforamiditne veze da bi se proizvela N3'→P5' tiofosforamidatna veza.
[0127] Kako se ovde koristi, "N3'→P5' fosforamidat", "P5'→N3' fosforamidat" i "fosforamidat" se odnose na međunukleozidnu vezu podjedinica opisanu formulom:
2
ili njegov tautomer, pri čemu se 3' i 5' odnose na atome ugljenika ostataka šećera uzastopnih nukleozida koji su povezani putem veze, i gde je R vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril, ili fosfatna zaštitna grupa i X je halkogen, kao što je kiseonik ili sumpor. Podrazumeva se da, kada je R vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril ili fosfatna zaštitna grupa, neke od internukleozidnih podjediničnih veza opisanih gornjom formulom mogu takođe postojati u obliku soli. Takvi oblici, u meri u kojoj mogu da postoje, treba da budu uključeni u obim ovog otkrića. U nekim slučajevima, kada je X sumpor, fosforamidat se može nazvati tiofosforamidatom. U nekim slučajevima, kada je X kiseonik, "fosforamidat" se može nazvati "oksofosforamidat". U nekim slučajevima, kada je R fosfatna zaštitna grupa, to može biti alkil, alkenil, aril, aralkil, cikloalkil ili njihova supstituisana verzija. U nekim slučajevima, R je fosfatna zaštitna grupa koja sadrži 10 ili manje atoma ugljenika. U određenim slučajevima, kada je R fosfatna zaštitna grupa, to je alkil koji ima od 1 do 6 atoma ugljenika; β-supstituisani etil koji povlači elektrone (npr. β-trihalometil-, β-cijano-, β-sulfo- ili β-nitro-supstituisani etil); supstituisani fenil koji povlači elektrone (npr. halo-, sulfo-, cijano- ili nitro-, supstituisani fenil); ili feniletil supstituisan sa povlačenjem elektrona. U nekim primerima izvođenja, kada je R fosfatna zaštitna grupa, to je metil, β-cijanoetil ili 4-nitrofeniletil. U određenim primerima izvođenja, R je vodonik, metil ili β-cijanoetil. Supstituenti koji povlače elektrone od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, halo, cijano, nitro, sulfo, ili mono-, di- ili trihalometil i slično. Supstituenti atoma halogena su obično fluoro, hloro, bromo ili jodo; a u nekim slučajevima su fluoro ili hloro. „Povlačenje elektrona“ označava sklonost supstituenta da privuče valentne elektrone molekula čiji je deo, odnosno da je elektronegativan, npr., March, Advanced Organic Chemistry, pgs.16-18 (John Wiley, New York, 1985). Smernice za izbor fosfatne zaštitne grupe su date u Beaucage and Iyer, Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992). Radi praktičnosti, nukleotidni fosforamidati su ovde ponekad označeni "np" ili "pn" za N3'→P5' fosforamidate i P3'→N5' fosforamidate, respektivno. Dakle, „UnpU" je dinukleotid u kome su 3'-aminouridin i uridin povezani N3'→P5' fosforamidatnom vezom. Kada je veza okso-fosforamidat, nukleotid okso-fosforamidat se ponekad ovde označava sa "npo" " ili "opn" za N3'→P5' fosforamidate i P3'→N5' fosforamidate, respektivno. Slično, nukleotidni tiofosforamidati su ovde ponekad označeni sa "nps" ili "spn" za N3'→P5' tiofosfosforamide i →N5' tiofosforamidate, respektivno. Slično, 2'-fluoro supstituenti su označeni superskriptom "f". Dakle, "Uf.npU" je dinukleotid u kome je 5'-
2
najviše 3'-amino-2'-fluoruridin vezan za uridin preko N3'→P5' fosforamidatne veze. Jedno vodeći "p" u subskriptu označava 5' monofosfat, i jedan završni indeks sa "n" označava 3'-amino grupu.
[0128] U nekim slučajevima, veza internukleozidne podjedinice je opisana formulom:
ili njegov tautomer, pri čemu se 3' i 5' odnose na atome ugljenika u delovima šećera uzastopnih nukleozida koji su povezani putem veze, i gde je R vodonik i X je kiseonik ili sumpor. Podrazumeva se da za bilo koji od ovde opisanih oligonukleotida koji uključuju takvu internukleozidnu vezu, takvi oligonukleotidi mogu takođe uključiti bilo koje pogodne oblike soli veze. Kao takva, internukleozidna veza može biti u obliku soli koja uključuje bilo koji pogodan protivjon.
[0129] Bilo koje pogodne strategije zaštitne grupe mogu se koristiti u predmetnim postupcima za zaštitu baza, fosforamidita, fosforamidata, 5', 2' i/ili 3' grupa. Zaštitne grupe od interesa uključuju, ali nisu ograničene na, one zaštitne grupe opisane u Ohkubo et al., Org. Lett., 2010, 12 (11), pp 2496-2499; i Beaucage and Iyer, Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992).
[0130] Kako se ovde koristi, termin "fosfatna zaštitna grupa" odnosi se na zaštitnu grupu koja može biti vezana za vezu između podjedinica oligonukleotida koja sadrži fosfor. Kada je prisutna, fosfatna zaštitna grupa može sprečiti (tj. blokirati) reakciju veze koja sadrži fosfor na mestu gde je vezana fosfatna zaštitna grupa. Bilo koje prikladne veze između podjedinica koje sadrže fosfor (npr. veze P(III) i P(V)) mogu biti zaštićene predmetnim fosfatnim zaštitnim grupama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, fosforamidit, oksofosforamidat, tiofosforamidat, fosfatni estar, tiofosfat estar, fosfodiestarske veze i slično. Fosfatna zaštitna grupa može biti vezana za dostupni atom kiseonika veze među podjedinicama koja sadrži fosfor. Bilo koja pogodna zaštitna grupa može se koristiti kao fosfatna zaštitna grupa. Fosfatne zaštitne grupe od interesa uključuju, ali nisu ograničene na, alkil, alkenil, aril, aralkil, cikloalkil, ili njihovu supstituisanu verziju, kao što je alkil koji ima od 1 do 6 atoma ugljenika, kao što je β-supstituisani etil koji povlači elektron (npr. β-trihalometil-, β-cijano-, β-sulfo- ili β-nitrosupstituisani etil); supstituisani fenil koji povlači elektrone (npr. halo-, sulfo-, cijano- ili nitro-, supstituisani fenil); ili supstituisani feniletil, metil, β-cijanoetil ili 4-nitrofeniletil koji povlači elektrone. U određenim primerima izvođenja, fosfatna zaštitna grupa je metil ili β-cijanoetil. Supstituenti koji povlače elektrone od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, halo (npr. hloro ili fluoro), cijano, nitro, sulfo, ili mono-, di- ili trihalometil i slično.
2
[0131] 3'-terminalna grupa rastućeg oligonukleotidnog lanca može uključivati 3'-hidroksil, 3'-amino grupu ili njihovu zaštićenu verziju. Bilo koja pogodna hidroksil i/ili amino zaštitna grupa može se koristiti na 3'-terminalnoj grupi tokom sinteze oligonukleotida. U nekim primerima izvođenja, 3'terminalna grupa je zaštićena 3'-amino grupa i postupak uključuje uklanjanje zaštite ili uklanjanje zaštitne grupe da bi se proizvela slobodna 3'amino grupa.
[0132] Kako se ovde koristi, termin "slobodna amino grupa" u odnosu na monomere i dimere označava amino grupu koja je dostupna za reagovanje sa fosforamiditnom grupom ulaznog monomera ili dimera. U nekim primerima izvođenja, slobodna amino grupa je primarni amin. Posle koraka uklanjanja zaštite (npr., detritilacije), amino grupa može biti u obliku soli (npr., so konjugatne baze kiseline koja se koristi za detritilaciju). Ova so izborno može da se neutrališe sa baznim rastvorom kao što je 2% trietilamin ili piridin u acetonitrilu posle koraka detritilacije.
[0133] U nekim primerima izvođenja, 3'-terminalna grupa je zaštićena 3'-hidroksil grupa i postupak uključuje uklanjanje zaštite ili uklanjanje zaštitne grupe da bi se proizvela slobodna 3'-hidroksilna grupa. U nekim primerima izvođenja, 3'-terminalna grupa je zaštićena 3'-amino grupa i postupak uključuje uklanjanje zaštite ili uklanjanje zaštitne grupe da bi se proizvela slobodna 3'-amino grupa. Zaštićena 3'-amino ili 3'-hidroksil grupa može biti zaštićena tritil zaštitnom grupom. U određenim primerima izvođenja, tritil zaštitna grupa je trifenilmetil (Tr, Ph3C-). U određenim primerima izvođenja, tritil zaštitna grupa je 4,4'-dimetoksitritil (DMT).
[0134] Uklanjanje zaštite sa 3'-terminalne amino ili hidroksilne grupe može se postići korišćenjem bilo kog pogodnog postupka. Postupci od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, one postupke opisane u Beaucage and Iyer, Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992). U nekim slučajevima, deprotekcija zaštićene 3' amino grupe terminalnog nukleozida uključuje detritilaciju da bi se proizvela slobodna 3' terminalna grupa, na primer, kiselinom katalizovanu detritilaciju.
[0135] Generalno, fosforamiditi dimera ili monomerne podjedinice uključuju zaštićenu 3'-hidroksil ili 3'-amino grupu koja je ista kao 3'-terminalna grupa terminalnog nukleozida vezanog za čvrsti nosač. 3'-Zaštita dolazećih podjedinica fosforamidita sprečava neželjenu polimerizaciju lanca.
[0136] Bilo koji pogodan nosač čvrste faze se može koristiti u predmetnim postupcima. Čvrste podloge od interesa uključuju, ali nisu ograničene na, mikročestice napravljene od stakla sa kontrolisanim porama (CPG), visoko unakrsno vezanog polistirena (npr., NittoPhase HL 400 ili GE Primer 350), akrilnih kopolimera, celuloze, najlona, dekstrana, lateksa, poliakroleina i slično, kao što su oni otkriveni u sledećim primerima referenci: Meth. Enzymol., Section A, pages11-147, vol.44 (Academic Press, New York, 1976); U.S. Pat. br.4,678,814; 4,413,070; i
2
4,046;720; i Pon, Chapter 19, in Agrawal, editor, Methods in Molecular Biology, Vol.20, (Humana Press, Totowa, N.J., 1993). Dodatni nosači od interesa uključuju perle od polistirena; polistiren nakalemljen polietilen glikolom (npr., TentaGel<™>, Rapp Polymere, Tubingen Germany); i slično. Izbor karakteristika potpore, kao što su materijal, poroznost, veličina, oblik i slično, kao i vrsta korišćenog veznog dela zavisi od niza faktora, kao što su upotrebljene zaštitne grupe, dužina finalnog proizvoda, količina finalnog proizvoda, i slično. Primeri vezanih delova su otkriveni u Pon et al, Biotechniques, 6:768-775 (1988); Webb , U.S. Pat. br.
4,659,774; Barany et al, International patent application PCT/US91/06103; Brown et al, J. Chem. Soc. Commun., 1989: 891-893; Damha et al, Nucleic Acids Research, 18: 3813-3821(1990); Beattie et al, Clinical Chemistry, 39: 719-722 (1993); Maskos and Southern, Nucleic Acids Research, 20: 1679-1684 (1992); i slično.
[0137] U nekim primerima izvođenja, čvrsti nosači koji se koriste u predmetnim postupcima uključuju CPG i polistiren nakalemljen polietilen glikolom i koji poseduje terminalnu amino grupu (npr., TentaGel-NH2<™>, Rapp Polymere, Tubingen Germany). Aminopropil grupa se može koristiti kao razmak između CPG i nukleozidne veze. U nekim slučajevima, veza za 5'-hidroksil prvog nukleozida je sukcinil grupa koja obezbeđuje bazno-labilnu estarsku vezu koja može da se odcepi nakon sinteze sa vodenim rastvorom amonijaka.
[0138] Nakon uklanjanja zaštite, nukleozid vezan za podršku je sposoban da reaguje sa dimerom ili monomernom podjedinicom fosforamiditom da bi se formirala internukleozidna veza. Podrazumeva se da se nukleozid vezan za podršku može odnositi na jedan ostatak vezan za čvrsti nosač ili se može odnositi na terminalni ostatak oligonukleotidnog lanca koji je vezan za nosač.
[0139] Bilo koja pogodna hemija kuplovanja, reagensi za kuplovanje i postupci mogu se koristiti u predmetnim postupcima. Značajna uputstva za izbor uslova kuplovanja, zaštitnih grupa, podloga čvrste faze, vezujućih grupa, reagenasa za uklanjanje zaštite, reagenasa za odvajanje proizvoda od podloge čvrste faze, prečišćavanja proizvoda i slično, u kontekstu predmetnih postupaka mogu se naći u literaturi, npr., Gait, editor, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984); Amarnath and Broom, Chemical Reviews, Vol. 77, pgs. 183-217 (1977); Pon et al, Biotechniques, Vol.6, pgs. 768-775 (1988); Ohtsuka et al, Nucleic Acids Research, Vol. 10, pgs. 6553-6570 (1982); Eckstein, editor Oligonucleotides. and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991), Greene and Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis", Third edition, Wiley, New York 1999, Narang, editor, Synthesis and Applications of DNA and RNA (Academic Press, New York, 1987), Beaucage and Iyer, Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992), i sličnim referencama.
[0140] Korak spajanja predmetnih postupaka može se izvesti u temperaturnom opsegu od -20 do 200 stepeni Celzijusa. U nekim slučajevima, reakcija se izvodi na temperaturi okoline (oko 15-30 stepeni Celzijusa). Reakcija se može izvesti dodavanjem rastvora fosforamiditnog dimera ili monomera i rastvora aktivatora (ili rastvora koji sadrži fosforamiditni dimer ili monomer i aktivator) u reakcioni sud koji sadrži slobodnu amino grupu (oligo)nukleotida kovalentno vezanu za čvrstu podlogu. Generalno, aktivatori od interesa uključuju nukleofilne katalizatore koji istiskuju stabilniju fosforamiditnu amino grupu da bi formirali visoko reaktivan (i manje stabilan) intermedijer koji, zauzvrat, reaguje sa slobodnom 3' amino grupom čvrstog oligonukleotida N3'->P5 ' fosforamidata. Smeša se zatim meša postupcima kao što su mehaničko vorteksovanje, prskanje inertnim gasom, itd. Alternativno, rastvor(i) dimera ili monomera i aktivatora mogu da prođu kroz reakcioni sud (ili kolonu) koji sadrži čvrstu podlogu (oligo)nukleotida sa slobodnom 3'-terminalnom grupom. Monomer i aktivator mogu biti prethodno pomešani, pomešani u bloku ventila odgovarajućeg sintisajzera, pomešani u posudi za pre-aktivaciju i prethodno ekvilibrisani ako se želi, ili se mogu dodati odvojeno u reakcioni sud.
[0141] Aktivatori od interesa koji se mogu koristiti u predmetnim postupcima uključuju, ali nisu ograničeni na, tetrazol, 5-(etiltio)tetrazol, 5-(4-nitrofenil)tetrazol, 5-(2-tiofen) tetrazol, triazol, piridinijum hlorid i slično, npr., aktivaciona sredstva kako su opisali Beaucage and Iyer Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992.); Berner et al, Nucleic Acids Research, 17: 853-864 (1989); Benson, Chem. Rev. 41: 1-61 (1947). Kako se ovde koristi, termin "aktivator tetrazola" se odnosi na aktivatore koji su tetrazol ili derivati tetrazola. U nekim primerima izvođenja, aktivator je tetrazol. Pogodni rastvarači uključuju, ali nisu ograničeni na, acetonitril, tetrahidrofuran, metilen hlorid i slično. Može se voditi računa o upotrebi suvog (bez vode) dimera ili monomera, aktivatora i rastvarača za korak kuplovanja i za rastvarač koji se koristi za pranje čvrste podloge neposredno pre koraka spajanja.
[0142] Nakon kuplovanja, neodreagovane 3'-amino grupe rastućeg lanca oligonukleotida vezanog za podlogu mogu izborno da budu zatvorene pogodnim sredstvom za zatvaranje pre sledećeg koraka uklanjanja zaštite (npr., korak detritilacije) da bi se učinile inertnim za naredne korake kuplovanja. Ovaj korak zatvaranja može poboljšati HPLC profil preparata kako bi prečišćavanje bilo lakše, a takođe može poboljšati ukupan prinos proizvoda. Reagensi za zatvaranje korisni u predmetnim postupcima uključuju elektrofilne reagense kao što su anhidrid sirćetne kiseline i anhidrid izobuterne kiseline, hloridi kiseline kao što su adamantil karbonil hlorid, pivaoil hlorid i slično, izotiocijanati, hloroformati, itd. Takođe su korisni fosforamiditi zajedno sa aktivatorom i nakon čega sledi oksidacija, i H-fosfonatnim solima kao što je
1
trietilamonijum izopropil-H-fosfonat koji se koristi u zajedno sa kiselim hloridom kao što je pivaoil hlorid ili adamantil karbonil hlorid.
[0143] U nekim primerima izvođenja, postupak uključuje oksidaciju internukleozidne N3'→P5' fosforamiditne veze. Kako se ovde koristi, termini "oksiduju", "oksidacija", "oksidovati" i slično, u odnosu na internukleozidnu vezu koja sadrži fosfor, označava postupak ili tretman za pretvaranje atoma fosfora veze od oblika fosfora (III) u oblik fosfora (V). Oksidacija internukleotidnih veza može se izvesti u bilo kojoj pogodnoj tački u sintezi korišćenjem bilo kog pogodnog postupka. U nekim primerima izvođenja, oksidacija se izvodi postepeno, na primer, tokom svakog ciklusa kuplovanja. U drugim primerima izvođenja, oksidacija višestrukih internukleotidnih veza se izvodi na kraju sinteze. U nekim slučajevima, oksidacija N3'→P5' fosforamiditne veze (npr., korišćenjem oksidacionog sredstva na bazi joda/vode) proizvodi okso-fosforamidatnu vezu. U drugim slučajevima, oksidacija N3'→P5' fosforamiditne veze uključuje sumporizaciju da bi se dobila tiofosforamidatna veza. Sumporizacija se može izvesti bilo kojim pogodnim postupcima. Postupci sumporizacije od interesa uključuju one opisane od strane Gryazonov et al., WO2001018015. Sredstva za sumporisanje za upotrebu u pronalasku uključuju elementarni sumpor, tiuram disulfide kao što je tetraetil tiuram disulfid, acil disulfide kao što je fenacildisulfid, fosfinotioil disulfide kao što je S-Tetra<™>i 1,1-diokso-3H-1,2-benzoditiol-3-on. U nekim primerima izvođenja, sumporizacija se može izvršiti korišćenjem elementarnog sumpora (S8). U određenim primerima izvođenja, sumporizacija se može izvesti korišćenjem Beaucage reagensa, korišćenjem postupaka opisanih u Iyer et al., J. Organic Chemistry 55:4693-4699, 1990.
[0144] Oksidaciona sredstva koja su korisna u ovom postupku uključuju jod, hlor, brom, perkiseline kao što je m-hlorobenzojeva kiselina, hidroperokside kao što je tbutilhidroperoksid, etil hidroperoksid, metil hidroperoksid i slično, ozon, mešane anhidride acil-sulfina kao što je 3H-2,1-benzoksatiolan-3-on-1-oksid, soli persulfata kao što su natrijum, amonijum i tetrabutilamonijum persulfat i slično, monoperoksisulfate kao što je oxon<™>, natrijum i/ili drugi hipohlorit, perokside kao što je dietil peroksid ili bis(trimetilsilil)peroksid, ili vodonik peroksid ili ekvivalenti vodonik peroksida bez vode, kao što je kompleks uree/vodonik peroksida, itd. Druga korisna oksidaciona sredstva koja se mogu koristiti za pretvaranje fosfora (III) u fosfor (V) opisani su u Beaucage and Iyer Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992).
[0145] U nekim slučajevima, oksidaciono ili sumporno sredstvo može imati tendenciju da se podvrgne neželjenoj Arbuzov-ljevoj sporednoj reakciji paralelno sa željenom oksidacijom (Beaucage and Iyer, citirani gore). Arbuzov-a sporedna reakcija može dovesti do
2
deprotektiranog fosforamidata koji je nestabilan u kiselim uslovima narednih koraka detritilacije, i rezultirati fragmentacijom oligonukleotida. U određenim primerima izvođenja, vodonik-peroksid se koristi kao oksidaciono sredstvo da bi se minimizirala sporedna reakcija Arbuzov-a. U određenim primerima izvođenja, oksidacija uključuje dovođenje u kontakt oligonukleotida sa rastvorom od 1.5% vodonik peroksida, 3.5% vode, 20% piridina i 75% THF.
[0146] U nekim otkrivenim primerima izvođenja, postupak uključuje korake
(a) uklanjanja zaštite sa zaštićene 3' amino grupe terminalnog nukleozida vezanog za podlogu čvrste faze, pri čemu navedeno uklanjanje zaštite formira slobodnu 3' amino grupu;
(b) reagovanje slobodne 3' amino grupe sa:
(i) 3'-zaštićenim amino-dinukleotidnim fosforamidat-5'-fosforamidit dimerom; ili
(ii) 3'-zaštićenim aminonukleozid-5'-fosforamidit monomerom;
u prisustvu nukleofilnog katalizatora da se formira internukleozidna N3'→P5' fosforamiditna veza;
(c) oksidaciju veze; i
(d) ponavljanje koraka (a) do (c) dok se polinukleotid ne sintetiše, pri čemu ponavljajući koraci (a) do (c) sadrže izvođenje koraka (b)(i) najmanje jednom.
[0147] U nekim primerima izvođenja, koraci koji se ponavljaju (a) do (c) sadrže izvođenje koraka (b)(i) dva ili više puta. U određenim primerima izvođenja, koraci koji se ponavljaju (a) do (c) sadrže izvođenje koraka (b)(i) 3 puta ili više, kao što su 4 puta ili više, 5 puta ili više, 6 puta ili više, 7 puta ili više, 8 puta ili više, 9 puta ili više, 10 puta ili više, 15 puta ili više, 20 puta ili više, ili čak 30 puta ili više. U određenim primerima izvođenja, koraci koji se ponavljaju (a) do (c) sadrže izvođenje koraka (b)(i) u svakom koraku spajanja. U određenim primerima izvođenja, koraci koji se ponavljaju (a) do (c) sadrže izvođenje koraka (b)(i) u svakom koraku spajanja osim u jednom. U određenim primerima izvođenja, ponavljanje koraka (a) do (c) sadrže izvođenje koraka (b)(ii) jednom i samo jednom. U određenim primerima izvođenja, ponavljanje koraka (a) do (c) sadrže izvođenje koraka (b)(ii) dva puta i samo dva puta.
[0148] Kao što je ovde opisano, podrazumeva se da termin fosforamidatna veza obuhvata i okso-fosforamidatne i tiofosforamidatne veze (npr., kao što je prikazano u Formuli I). U određenim primerima izvođenja postupka, oksidacija internukleozidne N3'→P5' fosforamidne veze proizvodi okso-fosforamidatnu vezu. U nekim primerima izvođenja postupka, oksidacija internukleozidne N3'→P5' fosforamiditne veze uključuje sumporizaciju da bi se dobila tiofosforamidatna veza.
[0149] U nekim primerima izvođenja postupka, oligonukleotid je opisan Formulom (I):
gde:
svaki B je nezavisno purin, zaštićeni purin, pirimidin ili zaštićeni pirimidin, ili njihov analog;
svaki X je nezavisno kiseonik ili sumpor;
svaki R<3>je vodonik, fluoro, hidroksil, alkoksi, supstituisani alkoksi ili zaštićeni hidroksil;
R<6>je amino, hidroksil, zaštićeni amino, zaštićeni hidroksi, -O-L-Z ili -NH-L-Z; svaki L je nezavisno izborni linker;
svaki Z je nezavisno H, lipid, nosač, nosač, oligonukleotid, polimer, polipeptid, obeleživač koji se može detektovati ili oznaka;
R je vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril ili fosfat zaštitna grupa; i n je ceo broj od 1 do 1000. Kada je R vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril ili fosfat zaštitna grupa, podrazumeva se da neki od oligonukleotida Formule (I) takođe mogu postojati u obliku soli. Takvi oblici, u meri u kojoj mogu da postoje, treba da budu uključeni u obim ovog otkrića.
[0150] U nekim primerima izvođenja Formule (I), svaki R<3>je vodonik. U nekim primerima izvođenja Formule (I), svaki R<3>je fluoro. U nekim primerima izvođenja Formule (I), svaki R<3>je hidroksil.
4
[0151] U nekim primerima izvođenja Formule (I), R<6>je amino. U određenim primerima izvođenja Formule (I), R<6>je hidroksil.
[0152] U nekim primerima izvođenja Formule (I), svaki R je vodonik. Podrazumeva se da kada je R vodonik, fosfatna veza može biti naelektrisana pod vodenim uslovima, kao što su fiziološki uslovi. Kao takvi, podrazumeva se da oligonukleotidi Formule (I) mogu takođe uključiti bilo koje pogodne oblike soli veze. Kao takva, internukleozidna veza Formule (I) može biti u obliku soli koja uključuje bilo koji pogodan protivjon. U nekim primerima izvođenja Formule (I), svaki R je alkil ili supstituisani alkil. U nekim primerima izvođenja Formule (I), svaki R je aril ili supstituisani aril. U nekim primerima izvođenja Formule (I), svaki R je fosfatna zaštitna grupa.
[0153] U nekim primerima izvođenja Formule (I), Z je H. U nekim primerima izvođenja Formule (I), Z je lipid (npr., kao što je ovde opisan). U određenim slučajevima, lipid je masna kiselina (npr., kako je ovde opisano). U nekim primerima izvođenja Formule (I), Z je podloga. U nekim primerima izvođenja Formule (I), Z je nosač. U nekim primerima izvođenja Formule (I), Z je oligonukleotid. U nekim primerima izvođenja Formule (I), Z je polimer. U određenim slučajevima, polimer je PEG. U nekim primerima izvođenja Formule (I), Z je polipeptid. U nekim primerima izvođenja Formule (I), Z je obeleživač koji se može detektovati. U nekim primerima izvođenja Formule (I), Z je oznaka.
[0154] U nekim primerima izvođenja Formule (I), L je odsutan.
[0155] U nekim primerima izvođenja, svaki B je nezavisno izabran od A, C, G, T i U ili njihove zaštićene verzije.
[0156] U određenim primerima izvođenja Formule (I), n je ceo broj između 1 i 500, kao što je između 1 i 100, između 1 i 75, između 1 i 50, između 1 i 40, između 1 i 30, između 1 i 20 , između 1 i 15, između 1 i 10, ili između 4 i 10. U određenim rešenjima, n je ceo broj između 1 i 100, kao što je između 5 i 50, između 10 i 50, između 10 i 40, između 10 i 30, između 10 i 25, između 10 i 20, između 12 i 18, ili između 12 i 16. U određenim rešenjima, n je 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25.
[0157] U određenim primerima izvođenja postupka, oligonukleotid sadrži sekvencu nukleozidnih podjedinica komplementarnih RNK komponenti humane telomeraze, i pri čemu su najmanje dve nukleozidne podjedinice spojene N3'→P5' fosforamidatnom vezom među podjedinicama.
[0158] U nekim primerima izvođenja postupka, oligonukleotid uključuje sekvencu od između 3 i 50 nukleozidnih susednih podjedinica komplementarnih sa RNK komponentom humane telomeraze, kao što je između 5 i 40, između 10 i 40, između 10 i 30, između 10 i 25, između 10 i 20, između 12 i 18, ili između 12 i 16 nukleozidnih podjedinica. U određenim primerima izvođenja, oligonukleotid uključuje sekvencu od 10 ili više susednih nukleozidnih podjedinica komplementarnih RNK komponenti humane telomeraze. U određenim primerima izvođenja, oligonukleotid uključuje sekvencu od 7 ili više susednih nukleozidnih podjedinica, kao što su 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ili 17 susednih nukleozidnih podjedinica. U određenim primerima izvođenja, oligonukleotid uključuje sekvencu između 11 i 18, kao što je između 11 i 16 susednih nukleozidnih podjedinica komplementarnih RNK komponenti humane telomeraze.
[0159] U nekim slučajevima ovog postupka, N3'→P5' tiofosforamidatna veza među podjedinicama je opisana sledećom strukturom:
3'-NH-P(S)(OR)-O-5'
gde je R izabran iz grupe koja se sastoji od sledećih: vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril i fosfatna zaštitna grupa. Podrazumeva se da, kada je R izabran iz grupe koja se sastoji od sledećih: vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril i fosfat zaštitna grupa, neke od internukleozidnih veza podjedinica opisanih gornjom formulom mogu takođe postojati u obliku soli. Takvi oblici, u meri u kojoj mogu da postoje, treba da budu uključeni u obim ovog otkrića.
[0160] U nekim slučajevima ovog postupka, N3'→P5' tiofosforamidatna veza među podjedinicama je opisana sledećom strukturom:
3'-NH-P(S)(OR)-O-5'
gde je R vodonik. Podrazumeva se da za bilo koji od ovde opisanih oligonukleotida koji uključuje takvu vezu između podjedinica, takvi oligonukleotidi mogu takođe uključiti bilo koje pogodne oblike soli veze. Kao takva, veza između podjedinica može biti u obliku soli koja uključuje bilo koji pogodan protivjon.
[0161] U nekim primerima izvođenja postupka, oligonukleotid uključuje sekvencu TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3). U određenim primerima izvođenja, sve internukleotidne veze između podjedinica sekvence TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3) su N3'→P5' fosforamidatne veze među podjedinicama. U određenim slučajevima, sve N3'→P5' fosforamidatne veze između podjedinica sekvence su N3'-> P5' tiofosforamidatne veze između podjedinica (npr., nps veze). U određenim slučajevima, sve N3'→P5' fosforamidatne veze između podjedinica sekvence su N3'→P5' okso-fosforamidatne veze između podjedinica (npr., np veze).
[0162] U nekim primerima izvođenja postupka, polinukleotid uključuje 3'-amino ili 3'-hidroksi terminalnu grupu. U određenim primerima izvođenja postupka, polinukleotid uključuje 3'-amino terminalnu grupu. U određenim primerima izvođenja postupka, polinukleotid uključuje 3'-hidroksil terminalnu grupu.
[0163] U nekim primerima izvođenja postupka, oligonukleotid je opisan strukturom:
gde "nps" predstavlja tiofosforamidatnu vezu (npr. -NH-P(=O)(SH)-O- ili njegov tautomer), povezujući 3'-ugljenik jednog nukleozida sa 5'-ugljenikom susednog nukleozida.
[0164] Podrazumeva se da su svi primeri izvođenja koji se odnose na oligonukleotid takođe primenljivi na oblike soli navedenog oligonukleotida.
[0165] U nekim primerima izvođenja postupka, oligonukleotid je opisan strukturom:
ili njihova so;
gde "nps" predstavlja tiofosforamidatnu vezu (npr., -NH-P(=O)(SH)-O- ili njegov tautomer, ili njegovu so), povezujući 3'-ugljenik jednog nukleozida sa 5'- ugljenikom susednog nukleozida.
U određenim primerima izvođenja, kompozicija uključuje farmaceutski prihvatljivu so jedinjenja. U određenim slučajevima, kompozicija uključuje natrijumovu so jedinjenja. U određenim primerima izvođenja, kompozicija uključuje dvovalentnu katjonsku so jedinjenja, kao što je magnezijumova so jedinjenja. U određenim primerima izvođenja, kompozicija uključuje trovalentnu katjonsku so jedinjenja, kao što je aluminijumska so jedinjenja.
[0166] U određenim primerima izvođenja postupka, oligonukleotid je opisan sledećom strukturom, gde svaki M<x+>je nezavisno vodonik ili bilo koji pogodan protivjon soli, svaki x je nezavisno 1, 2 ili 3 i n je ceo broj od 5 do 13, kao što je 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ili 13, kao što je n jednako 13:
U određenim slučajevima, svako x je 1. U određenim slučajevima, svako x je nezavisno 1 ili 2. U određenim slučajevima, svako x je nezavisno 1 ili 3. U određenim slučajevima, M<x+>je vodonik.
[0167] U određenim primerima izvođenja postupka, oligonukleotid je opisan sledećom strukturom i može uključivati bilo koje pogodne katjonske protivjone soli:
[0168] U određenim primerima izvođenja postupka, oligonukleotid je opisan strukturom:
[0169] U određenim primerima izvođenja postupka, C11 nukleotidni ostatak sekvence TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3) potiče od 3'-zaštićenog aminonukleozid-5'-fosforamiditnog monomera. Pod "potiče od" se podrazumeva da se ostatak od interesa uvodi tokom sinteze preko određene podjedinice. U određenim slučajevima, T1 do A10, A12 i A13 ostaci sekvence TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3) potiču od 3'-zaštićenih aminodinukleotid tiofosforamidat-5'-fosforamiditnih dimera.
[0170] U nekim slučajevima, postupak uključuje sekvencijalno spajanje sledećih 3'-zaštićenih amino-dinukleotid tiofosforamidat-5'-fosforamidit dimera i 3'-zaštićenog aminonukleozid-5'-fosforamidita monomera na terminalnu grupu podloge čvrste faze: TA, GG, GT, TA, GA, C i AA. Podrazumeva se da zbog jednostavnosti, zaštićena fosforamiditna podjedinica koja se koristi u spajanju predmetnih postupaka može biti prikazana simbolima X<1>ili X<1>X<2>, gde X<1>i X<2>su nezavisno bilo koji pogodni nukleozidi povezani preko bilo koje pogodne internukleozidne veze (npr., kao što je ovde opisano). Bilo koje pogodne sintetičke strategije mogu se koristiti u predmetnim postupcima. Neke strategije od interesa su prikazane u nastavku da pokažu kako se priprema ciljna oligonukleotidna sekvenca može dodeliti određenim dimernim i/ili monomernim podjedinicama.
[0171] Primeri retrosintetičkih strategija predstavljene sledećim listama sekvencijalnih dimernih i/ili monomernih podjedinica su obezbeđene za primer ciljne oligonukleotidne sekvence TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3). Podrazumeva se da ova lista strategija nije iscrpna i da se može prilagoditi za primenu na bilo koju pogodnu sintezu ciljnog oligonukleotida. U nekim primerima izvođenja, postupak uključuje sekvencijalno spajanje jedne od sledećih serija 3'-zaštićenih amino-dinukleotid tiofosforamidat-5'-fosforamidit dimera i/ili 3'-zaštićenih aminonukleozid-5'-fosforamidit monomera na terminalnu grupu podloge čvrste faze:
TA, G, G, G, T, T, A, G, A, C, A, A
T, AG, G, G, T, T, A, G, A, C, A, A
T, A, GG, G, T, T, A, G, A, C, A, A
T, A, G, GG, T, T, A, G, A, C, A, A
T, A, G, G, GT, T, A, G, A, C, A, A
T, A, G, G, G, TT, A, G, A, C, A, A
T, A, G, G, G, T, TA, G, A, C, A, A
T, A, G, G, G, T, T, AG, A, C, A, A
T, A, G, G, G, T, T, A, GA, C, A, A
T, A, G, G, G, T, T, A, G, AC, A, A
T, A, G, G, G, T, T, A, G, A, CA, A
T, A, G, G, G, T, T, A, G, A, C, AA
TA, GG, G, T, T, A, G, A, C, A, A
4
TA, G, GG, T, T, A, G, A, C, A, A TA, G, G, GT, T, A, G, A, C, A, A TA, G, G, G, TT, A, G, A, C, A, A TA, G, G, G, T, TA, G, A, C, A, A TA, G, G, G, T, T, AG, A, C, A, A TA, G, G, G, T, T, A, GA, C, A, A TA, G, G, G, T, T, A, G, AC, A, A TA, G, G, G, T, T, A, G, A, CA, A TA, G, G, G, T, T, A, G, A, C, AA T, AG, GG, T, T, A, G, A, C, A, A T, AG, G, GT, T, A, G, A, C, A, A T, AG, G, G, TT, A, G, A, C, A, A T, AG, G, G, T, TA, G, A, C, A, A T, AG, G, G, T, T, AG, A, C, A, A T, AG, G, G, T, T, A, GA, C, A, A T, AG, G, G, T, T, A, G, AC, A, A T, AG, G, G, T, T, A, G, A, CA, A T, AG, G, G, T, T, A, G, A, C, AA T, A, GG, GT, T, A, G, A, C, A, A T, A, GG, G, TT, A, G, A, C, A, A T, A, GG, G, T, TA, G, A, C, A, A T, A, GG, G, T, T, AG, A, C, A, A T, A, GG, G, T, T, A, GA, C, A, A T, A, GG, G, T, T, A, G, AC, A, A T, A, GG, G, T, T, A, G, A, CA, A T, A, GG, G, T, T, A, G, A, C, AA T, A, G, GG, TT, A, G, A, C, A, A T, A, G, GG, T, TA, G, A, C, A, A T, A, G, GG, T, T, AG, A, C, A, A T, A, G, GG, T, T, A, GA, C, A, A T, A, G, GG, T, T, A, G, AC, A, A T, A, G, GG, T, T, A, G, A, CA, A T, A, G, GG, T, T, A, G, A, C, AA T, A, G, G, GT, TA, G, A, C, A, A T, A, G, G, GT, T, AG, A, C, A, A T, A, G, G, GT, T, A, GA, C, A, A T, A, G, G, GT, T, A, G, AC, A, A T, A, G, G, GT, T, A, G, A, CA, A T, A, G, G, GT, T, A, G, A, C, AA T, A, G, G, G, TT, AG, A, C, A, A T, A, G, G, G, TT, A, GA, C, A, A T, A, G, G, G, TT, A, G, AC, A, A T, A, G, G, G, TT, A, G, A, CA, A T, A, G, G, G, TT, A, G, A, C, AA T, A, G, G, G, T, TA, GA, C, A, A T, A, G, G, G, T, TA, G, AC, A, A T, A, G, G, G, T, TA, G, A, CA, A T, A, G, G, G, T, TA, G, A, C, AA T, A, G, G, G, T, T, AG, AC, A, A T, A, G, G, G, T, T, AG, A, CA, A T, A, G, G, G, T, T, AG, A, C, AA T, A, G, G, G, T, T, A, GA, CA, A T, A, G, G, G, T, T, A, GA, C, AA TA, GG, GT, T, A, G, A, C, A, A TA, GG, G, TT, A, G, A, C, A, A TA, GG, G, T, TA, G, A, C, A, A TA, GG, G, T, T, AG, A, C, A, A TA, GG, G, T, T, A, GA, C, A, A TA, GG, G, T, T, A, G, AC, A, A TA, GG, G, T, T, A, G, A, CA, A TA, GG, G, T, T, A, G, A, C, AA TA, G, GG, TT, A, G, A, C, A, A TA, G, GG, T, TA, G, A, C, A, A TA, G, GG, T, T, AG, A, C, A, A TA, G, GG, T, T, A, GA, C, A, A TA, G, GG, T, T, A, G, AC, A, A TA, G, GG, T, T, A, G, A, CA, A TA, G, GG, T, T, A, G, A, C, AA itd.
TA, GG, GT, TA, G, A, C, A, A TA, GG, GT, T, AG, A, C, A, A TA, GG, GT, T, A, GA, C, A, A TA, GG, GT, T, A, G, AC, A, A TA, GG, GT, T, A, G, A, CA, A TA, GG, GT, T, A, G, A, C, AA, itd. TA, GG, GT, TA, GA, C, A, A TA, GG, GT, TA, G, AC, A, A TA, GG, GT, TA, G, A, CA, A TA, GG, GT, TA, G, A, C, AA, itd. TA, G, GG, TT, AG, AC, A, A TA, G, GG, TT, AG, A, CA, A TA, G, GG, TT, AG, A, C, AA TA, G, G, GT, TA, GA, CA, A TA, G, G, GT, TA, GA, C, AA TA, G, G, GT, TA, GA, CA, A TA, G, G, G, TT, AG, AC, AA TA, G, GG, T, TA, GA, CA, A TA, G, GG, T, TA, GA, C, AA TA, G, GG, T, TA, G, AC, AA itd. T, A, G, GG, TT, AG, AC, AA
T, A, GG, G, TT, AG, AC, AA
T, AG, G, G, TT, AG, AC, AA TA, G, G, G, TT, AG, AC, AA
T, AG, G, GT, T, AG, AC, AA, itd. T, AG, GG, T, T, AG, AC, AA, itd. T, AG, GG, TT, A, G, AC, AA, itd. T, AG, GG, TT, AG, A, C, AA, itd. T, AG, GG, TT, AG, AC, A, A
T, AG, GG, TT, AG, AC, AA
TA, G, GG, TT, AG, AC, AA
TA, GG, G, TT, AG, AC, AA
TA, GG, GT, T, AG, AC, AA
TA, GG, GT, TA, G, AC, AA
4 TA, GG, GT, TA, GA, C, AA ili
TA, GG, GT, TA, GA, CA, A.
[0172] U nekim otkrivenim primerima izvođenja, postupak uključuje sekvencijalno spajanje serije 3'-zaštićenih amino-dinukleotid tiofosforamidat-5'-fosforamidit dimera i/ili 3'-zaštićenih aminonukleozid-5'-fosforamidita monomera na terminalnu grupu podloge u čvrstoj fazi, pri čemu je barem konačno spajanje sinteze dimerno spajanje. U određenim primerima izvođenja, pretposlednje spajanje i konačno spajanje su dimer sprege. U određenim slučajevima, kada je N paran, postupak uključuje N/2 dimer sprege. U određenim slučajevima, kada je N paran, postupak uključuje N/2-1 dimer sprege. U određenim slučajevima, kada je N paran, postupak uključuje N/2-2 dimer kuplovanja. U određenim slučajevima, kada je N paran, postupak uključuje N/2-3 dimer kuplovanja. U određenim slučajevima, kada je N paran, postupak uključuje N/2-4 dimer kuplovanja. U određenim slučajevima, kada je N paran, postupak uključuje N/2-5 dimer kuplovanja. U određenim slučajevima, kada je N neparan, postupak uključuje N/2-1 dimer sprege. U određenim slučajevima, kada je N neparan, postupak uključuje N/2-2 dimer kuplovanja. U određenim slučajevima, kada je N neparan, postupak uključuje N/2-3 dimer kuplovanja. U određenim slučajevima, kada je N neparan, postupak uključuje N/2-4 dimer kuplovanja. U određenim slučajevima, kada je N neparan, postupak uključuje N/2-5 dimer kuplovanja. U određenim slučajevima, kada je N neparan, postupak uključuje N/2-6 dimer kuplovanja. Na primer, sekvencijalno spajanje sledeće serije 3'-zaštićenih aminodinukleotid tiofosforamidat-5'-fosforamidit dimera i/ili 3'-zaštićenih aminonukleozid-5'-fosforamidit monomera na terminalnu grupu podloge čvrste faze:
T, A, G, G, G, T, T, A, G, A, C, AA
T, A, G, G, G, T, T, A, G, AC, AA
T, A, G, G, G, T, T, A, GA, C, AA
T, A, G, G, G, T, T, AG, A, C, AA
T, A, G, G, G, T, TA, G, A, C, AA
T, A, G, G, G, TT, A, G, A, C, AA
T, A, G, G, GT, T, A, G, A, C, AA
T, A, G, GG, T, T, A, G, A, C, AA
T, A, GG, G, T, T, A, G, A, C, AA
T, AG, G, G, T, T, A, G, A, C, AA
TA, G, G, G, T, T, A, G, A, C, AA, itd.
T, A, G, G, G, T, T, AG, AC, AA
T, A, G, G, G, TT, AG, AC, AA
T, A, G, GG, TT, AG, AC, AA
T, AG, GG, TT, AG, AC, AA
TA, G, GG, TT, AG, AC, AA
TA, GG, G, TT, AG, AC, AA
TA, GG, GT, T, AG, AC, AA
TA, GG, GT, TA, G, AC, AA
TA, GG, GT, TA, GA, C, AA.
[0173] U nekim primerima izvođenja postupka, 3'-zaštićeni amino-dinukleotid tiofosforamidat-5'-fosforamidit dimer je opisan formulom X<1>X<2>, gde X<1>i X<2>su nezavisno izabrani od zaštićenog adenina, zaštićenog citozina, zaštićenog gvanina, timina i uracila.
Oligonukleotidi modifikovani lipidom
[0174] Različiti sintetički pristupi se mogu koristiti za konjugaciju lipidnog dela L' sa oligonukleotidom, u zavisnosti od prirode izabrane veze, uključujući pristupe opisane u Mishra et al., (1995) Biochemica et Biophysica Acta, 1264:229-237, Shea et al., (1990) Nucleic Acids Res. 18:3777-3783, i Rump et al., (1998) Bioconj. Chem. 9:341-349. Sinteza jedinjenja u kojima je lipidni deo konjugovan na 5' ili 3' terminusu oligonukleotida može se postići upotrebom odgovarajućih funkcionalnih grupa na odgovarajućem terminusu, u nekim slučajevima amino grupe, koja može da reaguje sa karboksilnim kiselinama, hloridima kiselina, anhidridima i aktivnim estrima. Tiol grupe se takođe mogu koristiti kao funkcionalne grupe (videti Kupihar et al., (2001) Bioorganic and Medicinal Chemistry 9:1241-1247). Kako aminotako i tiol-modifikatori različite dužine lanca su komercijalno dostupni za sintezu oligonukleotida. Oligonukleotidi koji imaju N3'→P5' fosforamidatne veze (npr., N3'→P5' tiofosforamidatne) veze sadrže 3'-amino grupe (umesto 3'-hidroksi koji se nalazi u većini konvencionalnih hemija oligonukleotida), i stoga ove oligonukleotidne hemije pružaju jedinstvenu priliku za povezivanje oligonukleotida lipidne grupe za 3'-kraj oligonukleotida.
[0175] Mogu se koristiti različiti pristupi za vezivanje lipidnih grupa na krajeve oligonukleotida pomoću N3'→P5' fosforamidat (npr., N3'→P5' tiofosforamidat) hemije (videti npr., 3-palmitoilamido-1-O-(4,4'-dimetoksitritil)-2-O-sukcinil propandiol linker iz tabele 2). Za vezivanje za 3' terminus, konjugovana jedinjenja se mogu sintetisati reakcijom slobodne 3'-
4
amino grupe potpuno zaštićenog oligonukleotida vezanog za čvrsti nosač sa odgovarajućim anhidridom kiseline, nakon čega sledi uklanjanje zaštite amonijakom i prečišćavanje. Alternativno, kuplovanje karboksilnih kiselina lipida za slobodnu 3'-amino grupu oligonukleotida vezanog za nosač korišćenjem sredstava za kuplovanje kao što su karbodiimidi, HBTU ili 2-hloro-1-metilpiridinijum jodid se može koristiti za konjugaciju lipidnih grupa. Ova dva postupka formiraju amidnu vezu između lipida i oligonukleotida. Lipidi se takođe mogu vezati za oligonukleotidni lanac korišćenjem fosforamiditnog derivata lipida spojenog na oligonukleotide tokom elongacije lanca. Ovaj pristup daje fosforamidatnu (npr., tiofosforamidatnu) vezu koja povezuje lipid i oligonukleotid (primer jedinjenja propil-palmitoil i 2-hidroksi-propil-palmitoil). Još jedan pristup uključuje reakciju slobodne 3'-amino grupe potpuno zaštićenog oligonukleotida vezanog za podlogu sa odgovarajućim lipidnim aldehidom, nakon čega sledi redukcija sa natrijum cijanoborohidridom, koji proizvodi aminsku vezu.
[0176] Za vezivanje za 5' kraj, oligonukleotid se može sintetisati korišćenjem modifikovane čvrste podloge koja sadrži lipide, nakon čega sledi sinteza oligonukleotida u pravcu 5' do 3' kao što je opisano u Pongracz & Gryaznov (1999). Primer izmenjene podloge je dat u nastavku. U slučaju kada je n=14, masna kiselina je palmitinska kiselina: reakcija 3-amino-1,2-propandiola sa palmitoil hloridom, praćena dimetoksitritilacijom i sukcinilacijom, dala je intermedijer koji se koristi za spajanje sa čvrstim nosačem. R može biti dugolančano alkil amin staklo sa kontrolisanim porama.
DIMERI KORISNI ZA PRIPREMU OLIGONUKLEOTIDA
[0177] U nekim primerima izvođenja postupka pripreme oligonukleotida, postupak uključuje dovođenje u kontakt slobodne 3'-terminalne grupe vezane za podlogu (npr., 3'-hidroksil ili 3'-amino grupe) sa dinukleotidnom dimer podjedinicom da bi se formirala veza između podjedinica. Generalno, dinukleotidni dimer je 3'-zaštićen i uključuje 5'-grupu sposobnu za kuplovanje sa 3'-terminalnom grupom. U nekim primerima izvođenja, dinukleotidni dimer uključuje 5'-fosforamidit. Dinukleotidni dimer može uključivati 3'-zaštićenu amino grupu ili 3'-
4
zaštićenu hidroksilnu grupu. U nekim primerima izvođenja, dinukleotid je opisan formulom X<1>X<2>, gde X<1>i X<2>su nezavisno bilo koji pogodni nukleozidi (npr., A, C, G, T ili U ili njihova zaštićena verzija) povezani preko bilo koje pogodne internukleozidne veze (npr., kao što je ovde opisana). Dinukleotid može uključiti bilo koju pogodnu internukleozidnu vezu između dva nukleozida. Internukleozidne veze od interesa koje pronalaze primenu u dinukleotidnim dimerima uključuju, ali nisu ograničene na, fosfodiestar, fosfotriestar, metilfosfonat, fosforamidat (npr. tiofosforamidat) i fosforotioatnu vezu.
[0178] U nekim slučajevima, dinukleotidni dimer je 3'-zaštićeni-dinukleotid-5'-fosforamidit dimer, ili njegov sintetički prekursor, gde je dinukleotid opisan formulom X<1>X<2>, gde je X<1>i X<2>su nezavisno izabrani od A, C, G, T i U ili njihove zaštićene verzije, i pri čemu X<1>i X<2>su povezani preko fosfodiestra, fosfotriestra, metilfosfonata, fosforamidata (npr., tiofosforamidata) ili fosforotioatne veze, ili njihove zaštićene verzije.
[0179] U nekim primerima izvođenja postupka za pripremu oligonukleotida, postupak uključuje kontaktiranje slobodne 3'-amino grupe vezane za podršku sa 3'-zaštićenim aminodinukleotid fosforamidat-5'-fosforamidit dimerom da bi se formirao internukleozid N3'→P5' fosforamiditna veza. Bilo koji pogodan 3'-zaštićeni amino-dinukleotid fosforamidat-5'-fosforamidit dimer, ili njegovi sintetički prekursori, mogu naći primenu u predmetnim postupcima. U nekim slučajevima, dimer može biti predstavljen jednom od sledećih sekvenci: AA, AC, AG, AT, AU, CA, CC, CG, CT ili CU, GA, GC, GG, GT ili GU, TA ili UA, TC ili UC, TG ili UG i TT ili UU. U nekim slučajevima, dimer uključuje zaštićene 2'-hidroksilne grupe.
[0180] U određenim primerima izvođenja, dinukleotidni dimer je jedinjenje dinukleotida tiofosforamida opisano Formulom (II):
4
pri čemu B<1>i B<2>su svaki nezavisno purin, zaštićeni purin, pirimidin ili zaštićeni pirimidin, ili njihov analog; R<11>je vodonik, zaštitna grupa ili fosforamiditna grupa; R<12>je vodonik ili zaštitna grupa; i R<13>je vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril ili zaštitna grupa. U nekim slučajevima, B<1>i/ili B<2>uključuju zaštitnu grupu nukleobaze. Podrazumeva se da, kada je R<13>je vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril ili zaštitna grupa, neki od dinukleotidnih dimera opisanih Formulom (II) mogu takođe postojati u obliku soli. Takvi oblici, u meri u kojoj mogu da postoje, treba da budu uključeni u obim ovog otkrića.
[0181] U nekim primerima izvođenja Formule (II), R<11>je vodonik. U nekim primerima izvođenja Formule (II), R<11>je zaštitna grupa. Bilo koja pogodna zaštitna grupa može naći upotrebu u predmetnim dimerima formule (II). U nekim primerima izvođenja Formule (II), R<11>je zaštitna grupa na bazi levulinata. U nekim primerima izvođenja Formule (II), R<11>je levulinatna zaštitna grupa (tj., -COCH2CH2COCH3). U nekim primerima izvođenja Formule (II), R<11>je 5'-fosforamiditna grupa.
[0182] U nekim primerima izvođenja Formule (II), R<12>je vodonik. U nekim primerima izvođenja Formule (II), R<12>je zaštitna grupa. U određenim primerima izvođenja, R<12>je tritil grupa (npr., trifenilmetil (Trt), monometoksitritil (MMT) ili dimetoksitritil (DMT)). U nekim primerima izvođenja Formule (II), R<12>je Trt zaštitna grupa.
[0183] U nekim primerima izvođenja Formule (II), R<12>je fotocepabilna zaštitna grupa. Bilo koja pogodna zaštitna grupa koja se cepa na svetlosti može naći upotrebu u pripremi predmetnih dinukleotidnih dimera i njihovih sintetičkih prekursora. U nekim primerima izvođenja Formule (II), R<12>je supstituisana piksil zaštitna grupa, kao što je nitro, fluoro, metil, trifluorometil, i/ili
4
metoksi-supstituisana piksil zaštitna grupa. U nekim primerima izvođenja Formule (II), R<12>je piksilna zaštitna grupa (tj.9-(9-fenil)ksantenil).
[0184] U nekim primerima izvođenja Formule (II), R<11>je levunil zaštitna grupa i R<12>je tritil zaštitna grupa.
[0185] U nekim primerima izvođenja Formule (II), R<13>je vodonik. U nekim primerima izvođenja Formule (II), R<13>je zaštitna grupa. U određenim primerima izvođenja, R<13>je 2-cijano-etil grupa.
[0186] U određenim primerima izvođenja, 3'-zaštićeni amino-dinukleotid fosforamidat-5'-fosforamidit dimer je opisan Formulom (III):
pri čemu B<1>i B<2>su svaki nezavisno purin, zaštićeni purin, pirimidin ili zaštićeni pirimidin, ili njihov analog. U nekim slučajevima, B<1>i/ili B<2>uključuju zaštitnu grupu nukleobaze.
[0187] U određenim primerima izvođenja, 3'-zaštićeni amino-dinukleotid fosforamidat-5'-fosforamidit dimer je opisan Formulom (III):
4
pri čemu B<1>i B<2>su svaki nezavisno purin, zaštićeni purin, pirimidin ili zaštićeni pirimidin, ili njihov analog; i R<18>je tritil zaštitna grupa (kao što je Trt, DMT ili MMT) ili piksil zaštitna grupa.
[0188] U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<1>i B<2>su svaki nezavisno izabrani između zaštićenog adenina, zaštićenog citozina, zaštićenog gvanina, timina i uracila. U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<1>i B<2>su svaki nezavisno izabrani od A(Bz), A(DMF), C(Bz), G(izobutiril), T i U. U nekim primerima izvođenja formula (II) ili (III), B<1>je A(Bz). U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<1>je A(DMF). U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<1>je C(Bz). U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<1>je G(izobutiril). U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<1>je T ili U. U nekim primerima izvođenja Formule (II) ili (III), B<2>je A(Bz) ili A(DMF). U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<2>je C(Bz). U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<2>je G(izobutiril). U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<2>je T ili U.
[0189] U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<1>je A(Bz) ili A(DMF) i B<2>je A(Bz) ili A(DMF). U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<1>je A(Bz) ili A(DMF) i B<2>je C(Bz). U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<1>je A(Bz) ili A(DMF) i B<2>je G(izobutiril). U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<1>je A(Bz) ili A(DMF) i B<2>je T ili U.
[0190] U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<1>je C(Bz) i B<2>je A(Bz) ili A(DMF). U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<1>je C(Bz) i B<2>je C(Bz). U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<1>je C(Bz) i B<2>je G(izobutiril). U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<1>je C(Bz) i B<2>je T ili U.
[0191] U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<1>je G(izobutiril) i B<2>je A(Bz) ili A(DMF). U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<1>je G(izobutiril) i B<2>je C(Bz). U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<1>je G(izobutiril) i B<2>je G(izobutiril). U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<1>je G(izobutiril) i B<2>je T ili U.
[0192] U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<1>je T ili U i B<2>je A(Bz) ili A(DMF). U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<1>je T ili U i B<2>je C(Bz). U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<1>je T ili U i B<2>je G(izobutiril). U nekim primerima izvođenja Formula (II) ili (III), B<1>je T ili U i B<2>je T ili U. Podrazumeva se da se bilo koji od primera izvođenja Formula (II) ili (III) opisanih ovde, takođe može primeniti na Formulu (IV).
[0193] Bilo koji od ovde opisanih dimera može biti prilagođen za upotrebu u predmetnim postupcima. Predmetni dimeri mogu biti pripremljeni prema bilo kom pogodnom postupku od bilo kog pogodnog nukleozidnog monomera. Nukleozidni monomeri od interesa koji nalaze primenu u pripremi predmetnih nukleozidnih dimera uključuju, ali nisu ograničeni na, monomere 16, 17, 12 i 13 koji su prikazani u sintetičkim šemama koje su ovde otkrivene. Dinukleotidni dimeri od interesa uključuju nefosfitilirane dimere koji nalaze primenu u pripremanju predmetnih fosfilizovanih dinukleotidnih dimera, kao što su dimeri 18 i 19 koji nalaze primenu u pripremi fosfitiliranih dinukleotidnih dimera kao što je 20, ili dimer 14 koji se koristi u priprema fosfilovanih dinukleotidnih dimera kao što je 15.
[0194] U nekim primerima izvođenja, dimeri formula (III) i (IV) se pripremaju postupkom prikazanim na sledećoj šemi:
1
gde B<1>i B<2>su svaki nezavisno purin, zaštićeni purin, pirimidin ili zaštićeni pirimidin, ili njihov analog; R<15>je vodonik ili amino zaštitna grupa; R<17>je amino zaštitna grupa; i R<16>je hidroksil zaštitna grupa. U određenim primerima izvođenja, R<15>je vodonik. U određenim primerima izvođenja monomera 16, R<16>je silil. U određenim primerima izvođenja monomera 16, R<16>je TBDMS (terc-butildimetilsilil). U određenim primerima izvođenja monomera 17, R<17>je tritil (Trt). U određenim primerima izvođenja monomera 17, R<17>je monometoksitritil (MMT).
2
[0195] U određenim primerima izvođenja monomera 17, R<17>je dimetoksitritil (DMT). U određenim primerima izvođenja monomera 17, R<17>je piksil. U određenim primerima izvođenja dimera 18-20, R<17>je tritil (Trt). U određenim primerima izvođenja dimera 18-20, R<17>je monometoksitritil (MMT). U određenim primerima izvođenja dimera 18-20, R<17>je dimetoksitritil (DMT). U određenim primerima izvođenja dimera 18-20, R<17>je piksil.
[0196] U nekim primerima izvođenja, dimeri Formule (III) i (IV) se pripremaju postupkom prikazanim na sledećoj šemi, gde je monomer 13 pripremljen od 11 preko monomera 12 i spojen sa nukleozidnim amiditom da bi se proizveli dimeri 14 koji se konvertuju do dimera 15:
gde B<1>i B<2>su svaki nezavisno purin, zaštićeni purin, pirimidin ili zaštićeni pirimidin, ili njihov analog; i R<13>i R<14>su svaki nezavisno zaštitna grupa. U određenim primerima izvođenja monomera 12 i 13, R<13>je tritil. U određenim primerima izvođenja monomera 12 i 13, R<13>je piksil. U određenim primerima izvođenja dimera 14 i 15, R<14>je tritil. U određenim primerima izvođenja dimera 14 i 15, R<14>je dimetoksitritil. U određenim primerima izvođenja dimera 14 i 15, R<14>je monometoksitritil. U određenim primerima izvođenja dimera 14 i 15, R<14>je piksil. Monomeri od interesa koji se koriste u pripremi predmetnih dinukleotidnih dimera prema postupcima opisanim ovde uključuju, ali nisu ograničeni na:
gde je B purin, zaštićeni purin, pirimidin ili zaštićeni pirimidin, ili njihov analog i R je vodonik ili alkil (npr., metil) ili halogen (npr., bromo). U određenim slučajevima, B je izabran od A(Bz), G(iBu), T, A(DMF), C(Bz) ili U.
4
OLIGONUKLEOTIDNE KOMPOZICIJE
[0197] Pored ciljnog oligonukleotida, tokom sinteze oligonukleotida mogu se proizvesti različiti neciljni proizvodi sinteze oligonukleotida. Manji proizvodi koji mogu biti prisutni u preparatima oligonukleotida uključuju, ali nisu ograničeni na, proizvode za deleciju (npr., proizvode koji nemaju jedan ili više nukleozidnih ostataka), proizvode koji uključuju jednu ili više zaštitnih grupa, proizvode sa terminusom (npr., oligonukleotidni lanac), proizvode kojima nedostaje jedna ili više nukleobaza, proizvode koji uključuju delimično oksidovane fosforamiditne veze i proizvode koji uključuju delimično sumporisane veze. Kako se ovde koristi, ciljni oligonukleotid se odnosi na oligonukleotidnu sekvencu od interesa, koja je ciljni proizvod postupka pripreme. Kako se ovde koriste, termini „proizvod koji nije cilj“ i „manji proizvod“ se koriste naizmenično i odnose se na bilo koji proizvod koji sadrži oligonukleotid koji nije ciljni proizvod, i koji se može javiti tokom i posle ciklusa sinteze ciljnog oligonukleotida.
[0198] Predmetni postupci obezbeđuju kompozicije koje uključuju poboljšanu čistoću ciljnog oligonukleotida. U nekim primerima izvođenja, kompozicija uključuje 50% ili više po težini ciljnog oligonukleotida, kao što je oko 55% ili više, oko 60% ili više, oko 65% ili više, oko 70% ili više, oko 75% ili više, oko 80% ili više, oko 85% ili više, oko 90% ili više, ili čak oko 95% ili više po težini ciljnog oligonukleotida. U određenim primerima izvođenja, kompozicija uključuje 50% ili više po težini ciljnog oligonukleotida. U određenim primerima izvođenja, kompozicija uključuje 55% ili više po težini ciljnog oligonukleotida. U određenim primerima izvođenja, kompozicija uključuje 60% ili više po težini ciljnog oligonukleotida. U određenim primerima izvođenja, kompozicija uključuje 65% ili više po težini ciljnog oligonukleotida. U određenim primerima izvođenja, kompozicija uključuje 70% ili više po težini ciljnog oligonukleotida. U određenim primerima izvođenja, kompozicija uključuje 75% ili više po težini ciljnog oligonukleotida. U određenim primerima izvođenja, kompozicija uključuje 80% ili više po težini ciljnog oligonukleotida. U određenim primerima izvođenja, kompozicija uključuje 85% ili više po težini ciljnog oligonukleotida. U određenim primerima izvođenja, kompozicija uključuje 90% ili više po težini ciljnog oligonukleotida. U određenim primerima izvođenja, kompozicija uključuje 95% ili više po težini ciljnog oligonukleotida.
[0199] U nekim primerima izvođenja, predmetni postupci obezbeđuju efikasnost spajanja od 95% ili više, kao što je 96% ili više, 97% ili više, 98% ili više, ili čak 98% ili više.
[0200] U nekim primerima izvođenja, predmetne metode obezbeđuju srednju efikasnost spajanja koja je 0.5% ili više, kao što je 0.75% ili više, 1.0% ili više, 1.25% ili više, 1.5% ili više, 1.75% ili više, 2.0% ili više, 2.5% ili više, ili čak 3.0% ili više, od srednje efikasnosti kuplovanja kontrolne sinteze izvedene korišćenjem samo monomernih podjedinica. U određenim primerima izvođenja, predmetni postupci su obezbedili efikasnost spajanja od 96% ili veću. U određenim primerima izvođenja, predmetni postupci obezbeđuju efikasnost kuplovanja koja je 2% ili veća od efikasnosti kuplovanja kontrolne sinteze izvedene korišćenjem samo monomernih podjedinica.
[0201] Posle sinteze, predmetne kompozicije mogu da prođu jedan ili više koraka prečišćavanja (npr., HPLC hromatografija, afinitetna hromatografija, hromatografija izmene jona, gel filtracija, itd.), na primer, da se ukloni jedan ili više sporednih proizvoda iz ciljnog oligonukleotida. Podrazumeva se da se, u predmetnim kompozicijama, smanjene količine manjih proizvoda i/ili povećana količina ciljnog oligonukleotida obezbeđene predmetnim postupcima pripreme mogu odnositi na takve količine i čistoće dobijene neposredno posle sinteze i pre bilo kakvih daljih koraka prečišćavanja ili razdvajanja. (npr., HPLC hromatografija). Kao takvi, u nekim slučajevima, predmetne kompozicije se mogu nazvati preparatima za sintezu, npr., neprečišćeni preparati za sintezu. Pod neprečišćenim se podrazumeva da na kompoziciji nisu izvedeni koraci prečišćavanja hromatografijom. Prečišćavanje hromatografijom se odnosi na bilo koju pogodan postupak prečišćavanja koji uključuje apsorpciju ciljnog polinukleotida na nosač za hromatografiju i naknadno eluiranje ciljnog polinukleotida. U nekim slučajevima, hromatografsko prečišćavanje se odnosi na prečišćavanje hromatografijom reverzne faze.
[0202] Predmetni postupci obezbeđuju kompozicije koje uključuju smanjenu količinu jednog ili više sporednih proizvoda. Pod smanjenom količinom se podrazumeva da je količina po težini manjeg proizvoda u kompoziciji u odnosu na ciljni oligonukleotid smanjena u odnosu na kontrolnu sintezu, na primer, sintezu gde se oligonukleotid priprema korišćenjem samo monomernih spojeva. U nekim primerima izvođenja, smanjena količina manjeg proizvoda je oko 20% ili manje masene količine ciljnog oligonukleotida, kao što je oko 15% ili manje, oko 10% ili manje, ili oko 5% ili manje količine od težina ciljnog oligonukleotida. U određenim primerima izvođenja, smanjena količina manjeg proizvoda je 20% ili manje težinske količine ciljnog oligonukleotida, kao što je 15% ili manje, 10% ili manje, 9% ili manje, 8% ili manje, 7% ili manje, 6% ili manje, 5% ili manje, 4% ili manje, 3% ili manje, 2% ili manje, ili čak 1% ili manje težinske količine ciljnog oligonukleotida. U određenim primerima izvođenja, sporedni proizvod je (N-x) proizvod.
[0203] Predmetni postupci pripreme mogu da obezbede kompozicije koje imaju smanjenu količinu jednog ili više (N-x) proizvoda u odnosu na ciljni oligonukleotid od interesa, gde je x ceo broj od 1 do N-1 i N je broj nukleozidnih ostataka u ciljnom oligonukleotidu. Kao takav, (N-1) proizvod se može odnositi na bilo koji ili sve oligonukleotidne proizvode kojima nedostaje bilo koji nukleotidni ostatak u poređenju sa ciljnim oligonukleotidom (npr., N proizvod). Kao takav, (N-2) proizvod se odnosi na bilo koji ili sve oligonukleotidne proizvode kojima nedostaju bilo koja dva nukleotidna ostatka u poređenju sa ciljnim oligonukleotidom (npr., N proizvod). U određenim primerima izvođenja, sporedni proizvod je (N-1) proizvod. U određenim primerima izvođenja, sporedni proizvod je (N-2) proizvod. U određenim primerima izvođenja, sporedni proizvod je (N-3) proizvod. U određenim primerima izvođenja, sporedni proizvod je (N-4) proizvod. U određenim primerima izvođenja, sporedni proizvod je (N-5) proizvod. U određenim primerima izvođenja, sporedni proizvod je (N-6) proizvod. U određenim primerima izvođenja, sporedni proizvod je (N-7) proizvod.
[0204] U određenim primerima izvođenja, bilo koja od ovde opisanih kompozicija koja ima smanjenu količinu jednog ili više (N-x) proizvoda u odnosu na ciljni oligonukleotid od interesa nije prečišćena.
[0205] U nekim primerima izvođenja, predmetne kompozicije uključuju nizak odnos (N-1) proizvoda prema ciljnom oligonukleotidnom proizvodu. U nekim slučajevima, nizak odnos je manji od (2.0 × N) delova prema 100 težinskih delova (N-1) proizvoda u odnosu na ciljni oligonukleotid, gde se N odnosi na broj nukleotidnih ostataka u ciljnoj oligonukleotidnoj sekvenci. U određenim primerima izvođenja, odnos je manji od (1.9 × N) delova prema 100 težinskih delova (N-1) proizvoda u odnosu na ciljni oligonukleotid, kao što je manje od (1.8 × N) delova prema 100, manje od (1.7 × N) delova prema 100, manje od (1.6 × N) delova prema 100, manje od (1.5 × N) delova prema 100, manje od (1.4 × N) delova prema 100, manje od (1.3 × N) delova prema 100, manje od (1.2 × N) delova prema 100, manje od (1.1 × N) delova prema 100, manje od (1.0 × N) delova prema 100, manje od (0.9 × N) delova prema 100, manje od (0.8 × N) delova prema 100, manje od (0.7 × N) delova prema 100, manje od (0.6 × N) delova prema 100, manje od (0.5 × N) delova prema 100, manje od (0.4 × N) delova prema 100, manje od (0.3 × N) delova prema 100, manje od (0.2 × N) delova prema 100, ili čak manje od (0.1 × N) delova prema 100 težinskih delova (N-1) proizvoda u odnosu na ciljni oligonukleotid. U određenim primerima izvođenja, predmetne kompozicije uključuju nizak odnos manje od (1.5 × N) delova prema 100 težinskih delova (N-1) proizvoda u odnosu na ciljni oligonukleotid. U određenim primerima izvođenja, predmetne kompozicije uključuju nizak odnos od manje od (1.2 × N) delova prema 100 težinskih delova (N-1) proizvoda u odnosu na ciljni oligonukleotid. U određenim primerima izvođenja, predmetne kompozicije uključuju nizak odnos od manje od (1.0 × N) delova prema 100 težinskih delova (N-1) proizvoda u odnosu na ciljni oligonukleotid. U određenim primerima izvođenja, predmetne kompozicije uključuju nizak odnos od manje od (0.5 × N) delova prema 100 težinskih delova (N-1) proizvoda u odnosu na ciljni oligonukleotid.
[0206] U nekim primerima izvođenja, predmetne kompozicije uključuju nizak odnos (N-2) proizvoda prema ciljnom oligonukleotidnom proizvodu. U nekim slučajevima, nizak odnos je manji od (2.0 × N) delova prema 100 težinskih delova (N-2) proizvoda u odnosu na ciljni oligonukleotid, gde se N odnosi na broj nukleotidnih ostataka u ciljnoj sekvenci oligonukleotida. U određenim primerima izvođenja, odnos je manji od (1.9 × N) delova prema 100 težinskih delova (N-2) proizvoda u odnosu na ciljni oligonukleotid, kao što je manje od (1.8 × N) delova prema 100, manji od (1.7 × N) delova prema 100, manje od (1.6 × N) delova prema 100, manje od (1.5 × N) delova prema 100, manje od (1.4 × N) delova prema 100, manje od (1.3 × N) delova prema 100, manje od (1.2 × N) delova prema 100, manje od (1.1 × N) delova prema 100, manje od (1.0 × N) delova prema 100, manje od (0.9 × N) delova prema 100, manje od (0.8 × N) delova prema 100, manje od (0.7 × N) delova prema 100, manje od (0.6 × N) delova prema 100, manje od (0.5 × N) delova prema 100, manje od (0.4 × N) delova prema 100, manje od (0.3 × N) delova prema 100, manje od (0.2 × N) delova prema 100, ili čak manje od (0.1 × N) delova prema 100 težinskih delova (N-2) proizvoda u odnosu na ciljni oligonukleotid. U određenim primerima izvođenja, predmetne kompozicije uključuju nizak odnos od manje od (1.5 × N) delova prema 100 težinskih delova (N-2) proizvoda u odnosu na ciljni oligonukleotid. U određenim primerima izvođenja, predmetne kompozicije uključuju nizak odnos od manje od (1.2 × N) delova prema 100 težinskih delova (N-2) proizvoda u odnosu na ciljni oligonukleotid. U određenim primerima izvođenja, predmetne kompozicije uključuju nizak odnos od manje od (1.0 × N) delova prema 100 težinskih delova (N-1) proizvoda u odnosu na ciljni oligonukleotid. U određenim primerima izvođenja, predmetne kompozicije uključuju nizak odnos od manje od (0.5 × N) delova prema 100 težinskih delova (N-2) proizvoda u odnosu na ciljni oligonukleotid.
[0207] U nekim primerima izvođenja, predmetne kompozicije uključuju (N-1) proizvod u količini od 20% ili manje od ukupnih neciljnih oligonukleotida u kompoziciji, kao što je 15% ili manje, 10% ili manje ili čak 5% ili manje od ukupnih neciljnih oligonukleotida.
[0208] Bilo koja od širokog spektra oligonukleotidnih kompozicija može se pripremiti korišćenjem postupaka opisanih ovde. Različite klase i tipovi oligonukleotida su od interesa za pripremu korišćenjem predmetnih postupaka (npr., kako su ovde opisani). Oligonukleotidi pogodni za pripremu prema predmetnim postupcima uključuju, ali nisu ograničeni na, anti-sens oligonukleotide, RNK oligonukleotide, siRNA oligonukleotide, RNAi oligonukleotide, DNK aptamere, mikro RNK i slično.
Oligonukleotidi komplementarni RNK komponenti telomeraze
[0209] Aspekti otkrića obuhvataju jedinjenja i kompozicije uključujući oligonukleotide komplementarne RNK komponenti humane telomeraze, i postupke za pripremu istih. Jedinjenja mogu da inhibiraju aktivnost telomeraze u ćelijama sa visokom potencijom i imaju karakteristike unosa u ćeliju.
[0210] Kao što je gore sumirano, predmetni postupci obezbeđuju smanjene količine neciljnih oligonukleotidnih proizvoda sinteze. U određenim slučajevima, predmetni postupci obezbeđuju povećanje količine ciljnog oligonukleotidnog proizvoda sinteze. U nekim primerima izvođenja, predmetni postupci obezbeđuju pripremu kompozicija koje imaju smanjenu količinu jednog ili više (N-x) proizvoda u odnosu na ciljni oligonukleotid od interesa. Tabela 1 prikazuje iznose od interesa nekih neciljnih oligonukleotidnih proizvoda.
[0211] U određenim primerima izvođenja, bilo koja od ovde opisanih kompozicija koja ima smanjenu količinu jednog ili više (N-x) proizvoda u odnosu na ciljni oligonukleotid od interesa nije prečišćena.
Tabela 1. Nivoi oligonukleotidnih proizvoda u kompozicijama od interesa. Predmetne kompozicije mogu uključivati jednu ili više od sledećih komponenti na jednom od nivoa navedenih u Tabeli 1.
1
2
4
[0212] U određenim primerima izvođenja, kompozicija ima manje od (2.0 × N) delova prema 100 težinskih delova (N-1) proizvoda u odnosu na jedinjenje, pri čemu jedinjenje uključuje polinukleotid koji ima sekvencu od N nukleozidnih podjedinica komplementarnih komponenti RNK humane telomeraze, pri čemu su najmanje dve od nukleozidnih podjedinica spojene N3'→P5' tiofosforamidatnom vezom između podjedinica. U određenim primerima izvođenja, odnos je manji od (1.9 × N) delova prema 100 težinskih delova (N-1) proizvoda u odnosu na N proizvoda, kao što je manje od (1.8 × N) delova prema 100, manje od (1.7 × N) delova prema 100, manje od (1.6 × N) delova prema 100, manje od (1.5 × N) delova prema 100, manje od (1.4 × N) delova prema 100, manje od (1.3 × N) delova prema 100, manje od (1.2 × N) delova prema 100, manje od (1.1 × N) delova prema 100, manje od (1.0 × N) delova prema 100, manje od (0.9 × N) delova prema 100, manje od (0.8 × N) delova prema 100, manje od (0.7 × N) delova prema 100, manje od (0.6 × N) delova prema 100, manje od (0.5 × N) delova prema 100, manje od (0.4 × N) delova prema 100, manje od (0.3 × N) delova prema 100, manje od (0.2 × N) delova prema 100, ili čak manje od (0.1 × N) delova prema 100 težinskih delova (N-1) proizvoda u odnosu na N proizvod.
[0213] U nekim primerima izvođenja, kompozicija ima manje od 1 dela u 4 težinska dela (N-1) proizvoda u odnosu na jedinjenje (kao što je manje od 1 dela u 5, manje od 1 dela u 6, manje od 1 dela u 7, manje od 1 dela u 8, manje od 1 dela u 9, manje od 1 dela u 10, manje od 1 dela u 15, manje od 1 dela u 20, manje od 1 dela u 25, manje od 1 dela u 50, manje od 1 dela u 100 težinska dela (N-1) proizvoda u odnosu na jedinjenje), pri čemu jedinjenje sadrži polinukleotid koji ima sekvencu od 10 ili više nukleozidnih podjedinica komplementarnih sa RNK komponentom humane telomeraze, pri čemu najmanje dve od nukleozidnih podjedinica su spojene N3'→P5' tiofosforamidatnom ili oksofosforamidatnom vezom između podjedinica. U određenim primerima izvođenja, polinukleotid ima sekvencu od 10 ili više nukleozidnih podjedinica komplementarnih sa RNK komponentom humane telomeraze, kao što je 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više nukleozidnih podjedinica.
[0214] U određenim slučajevima, polinukleotid uključuje sekvencu od 13 ili više nukleozidnih podjedinica komplementarnih RNK komponenti humane telomeraze, kao što je 15 ili više, 20 ili više, 30 ili više, 50 ili više nukleozidnih podjedinica komplementarnih sa RNK komponentom humane telomeraze.
[0215] U određenim primerima izvođenja, polinukleotid uključuje sekvencu od 7 ili više nukleozidnih podjedinica komplementarnih RNK komponenti humane telomeraze, kao što je 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ili 17 komplementarnih nukleozidnih podjedinica na RNK komponentu humane telomeraze. U određenim primerima izvođenja, polinukleotid uključuje sekvencu nukleozidnih podjedinica komplementarnih RNK komponenti humane telomeraze od između 11 i 18, kao što je između 11 i 16 susednih nukleozidnih podjedinica komplementarnih RNK komponenti humane telomeraze.
[0216] U nekim primerima izvođenja, polinukleotid uključuje između 3 i 50 susednih nukleozidnih podjedinica komplementarnih sa RNK komponentom humane telomeraze, kao što je između 5 i 40, između 10 i 40, između 10 i 30, između 10 i 25, između 10 i 20, ili između 12 i 15 nukleozidnih podjedinica. U određenim primerima izvođenja, oligonukleotid uključuje sekvencu od 10 ili više susednih nukleozidnih podjedinica komplementarnih RNK komponenti humane telomeraze. U određenim primerima izvođenja, kompozicija ima manje od 1 u 10 težinskog dela (N-1) proizvoda u odnosu na jedinjenje. U određenim primerima izvođenja, kompozicija ima manje od 1 u 20 težinskog dela (N-1) proizvoda u odnosu na jedinjenje. U određenim primerima izvođenja, kompozicija ima manje od 1 u 25 težinskog dela (N-1) proizvoda u odnosu na jedinjenje. U određenim primerima izvođenja, kompozicija ima manje od 1 u 30 težinskog dela (N-1) proizvoda u odnosu na jedinjenje. U određenim primerima izvođenja, kompozicija ima manje od 1 u 50 težinskog dela (N-1) proizvoda u odnosu na jedinjenje.
[0217] U nekim primerima izvođenja, kompozicija ima manje od 1 u 4 težinskog dela bilo kog (N-x) proizvoda u odnosu na jedinjenje, kao što je manje od 1 težinskog dela u 5, manje od 1 težinskog dela u 6, manje od 1 težinskog dela u 7, manje od 1 težinskog dela u 8, manje od 1 težinskog dela u 9, manje od 1 težinskog dela u 10, manje od 1 težinskog dela u 20, manje od 1 težinskog dela u 25, manje od 1 težinskog dela u 30, ili čak manje od 1 težinskog dela u 50, bilo kog (N-x) proizvoda u odnosu na jedinjenje.
[0218] U nekim primerima izvođenja, kompozicija ima manje od 40 delova u 100 ukupne težine proizvoda koji sadrže (N-x) polinukleotide u odnosu na jedinjenje, kao što je manje od 35 težinskih delova u 100, manje od 30 težinskih delova u 100, manje od 25 težinskih delova u 100, manje od 20 težinskih delova u 100, ili čak manje od 15 težinskih delova u 100, proizvoda koji sadrže polinukleotide (N-x) u odnosu na jedinjenje.
[0219] U nekim primerima izvođenja, kompozicija ima najmanje 5 težinskih delova u 100 (N-2) i (N-3) proizvoda u odnosu na jedinjenje, kao što je, najmanje 10 težinskih delova u 100, najmanje 12 težinskih delova u 100, najmanje 14 težinskih delova u 100, najmanje 15 težinskih delova u 100, najmanje 20 težinskih delova u 100, najmanje 30 težinskih delova u 100, ili najmanje 40 težinskih delova u 100 (N-2) i (N-3) proizvoda u odnosu na jedinjenje.
[0220] U nekim primerima izvođenja, kompozicija ima sledeći profil proizvoda koji sadrže (N-x) polinukleotide:
manje od 1 težinskog dela u 4 (N-1) proizvoda u odnosu na N proizvod; i
najmanje 10 težinskih delova u 100 (N-2) i (N-3) proizvoda u odnosu na N proizvod.
[0221] U određenim primerima izvođenja, oligonukleotidni N proizvod sadrži 3'-terminalnu nukleozidnu podjedinicu koja je odsutna u (N-1) proizvodu.
[0222] Oligonukleotidno jedinjenje se može opisati formulom:
O-(k'-L')n
gde O predstavlja oligonukleotid uključujući sekvencu nukleozidnih podjedinica komplementarnih RNK komponenti humane telomeraze, x' je izborna linker grupa, L' predstavlja lipidni deo i n je ceo broj od 1-5.
[0223] Dizajn jedinjenja stoga zahteva izbor dva entiteta, O i L', i određivanje strukturne veze(veza) između ovih entiteta, što može uključiti izbornu grupu linkera x'.
[0224] U nekim primerima izvođenja, oligonukleotidno jedinjenje se može opisati formulom:
O-(x-L')n
gde O predstavlja oligonukleotid uključujući sekvencu nukleozidnih podjedinica komplementarnih RNK komponenti humane telomeraze, x' je izborna linker grupa, L' predstavlja lipidni deo i n je 1, kao što je oligonukleotid formule (I), ili njegova so, gde je u formuli (I), Z lipidni deo, L je izborni linker i B grupe odgovaraju sekvenci nukleozidnih podjedinica komplementarnih RNK komponenti humane telomeraze.
[0225] Oligonukleotidna komponenta O može se smatrati „efektornom“ komponentom jedinjenja po tome što je ova komponenta ta koja utiče na inhibiciju enzima telomeraze vezivanjem za RNK komponentu telomeraze. Prema tome, sekvenca O je odabrana tako da uključuje region koji je komplementaran sekvenci RNK telomeraze, što je prikazano u SEQ ID NO: 1 Region koji je komplementaran komponenti RNK telomeraze može u teoriji da bude usmeren na bilo koji deo RNK telomeraze, ali određeni regioni RNK telomeraze su poželjna meta za inhibitorne oligonukleotide. Jedan poželjni ciljni region je region koji obuhvata nukleotide 30-67 SEQ ID NO: 1, koji uključuje "region obrasca", region od 11 nukleotida sekvence 5'-CUAACCCUAAC-3' (SEQ ID NO: 2) koji obuhvata nukleotid 46-56 SEQ ID NO: 1. Region obrasca funkcioniše tako da specificira sekvencu telomernih ponavljanja koje telomeraza dodaje krajevima hromozoma i koja je neophodna za aktivnost enzima telomeraze (videti Chen at al., Cell 100:503-514, 2000; Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 98(14):7982-7987, 2001). Stoga su posebno poželjna jedinjenja prema pronalasku koja sadrže oligonukleotidni deo koji sadrži sekvencu komplementarnu celom ili delu regiona obrasca. Drugi poželjni ciljni region je region koji obuhvata nukleotide 137-179 hTR (videti Pruzan et al, Nucl. Acids Research, 30:559-588, 2002). Unutar ovog regiona, sekvenca koja obuhvata 141-153 je poželjno ciljno mesto. PCT objava WO 98/28442 opisuje upotrebu oligonukleotida dužine najmanje 7 nukleotida za inhibiciju telomeraze, pri čemu su oligonukleotidi dizajnirani da budu komplementarni dostupnim delovima hTR sekvence izvan regiona obrasca, uključujući nukleotide 137-196, 290-3509 i 380 od hTR.
[0226] Region O koji je usmeren na hTR sekvencu je poželjno tačno komplementaran odgovarajućoj hTR sekvenci. Iako se nepodudarnosti mogu tolerisati u određenim slučajevima, očekuje se da će smanjiti specifičnost i aktivnost rezultujućeg oligonukleotidnog konjugata. U posebnim primerima izvođenja, bazna sekvenca oligonukleotida O je tako izabrana tako da uključuje sekvencu od najmanje 5 nukleotida tačno komplementarnih sa RNK telomeraze, a pojačana inhibicija telomeraze se može postići ako se koriste sve veće dužine komplementarne sekvence, kao što je najmanje 8, najmanje 10, najmanje 12, najmanje 13 ili najmanje 15 nukleotida tačno komplementarnih RNK telomeraze. U drugim primerima izvođenja, sekvenca oligonukleotida uključuje sekvencu od najmanje 5 do 20, od najmanje 8 do 20, od najmanje 10 do 20 ili od najmanje 10 do 15 nukleotida tačno komplementarnih sekvenci RNK telomeraze. Optimalna inhibitorna aktivnost telomeraze se može postići kada je puna dužina oligonukleotida O izabrana da bude komplementarna RNK telomeraze. Međutim, nije neophodno da puna dužina oligonukleotidne komponente bude tačno komplementarna ciljnoj sekvenci, a oligonukleotidna sekvenca može uključivati regione koji nisu komplementarni ciljnoj sekvenci. Takvi regioni se mogu dodati, na primer, da bi se jedinjenju dalo druga svojstva, kao što su sekvence koje olakšavaju prečišćavanje. Ako oligonukleotidna komponenta O treba da uključuje regione koji nisu komplementarni ciljnoj sekvenci, takvi regioni mogu biti pozicionirani na jednom ili oba kraja 5' ili 3'. U slučajevima kada je region tačne komplementarnosti usmeren na region obrasca, efikasna inhibicija telomeraze se može postići kratkim (5-8 nukleotida) regionom tačne komplementarnosti na koji se pridružuje sekvenca slična telomerazi (G-bogata) na 5' kraj.
[0227] Primeri sekvenci koje su komplementarne humanoj telomerazi RNK i koje mogu biti uključene kao deo oligonukleotidne komponente O, ili koje se mogu koristiti kao cela oligonukleotidna komponenta O uključuju sledeće:
[0228] hTR komplementarne sekvence (regioni oligonukleotidne sekvence SEQ ID NO:1 iz
1
[0229] U nekim primerima izvođenja, polinukleotid sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: GTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:4); TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3); i CAGTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:5).
[0230] Izbor tipa inter-nukleozidnih veza koji se koriste u sintezi O komponente može se izvršiti iz bilo koje od dostupnih hemija oligonukleotida, uključujući, ali ne ograničavajući se na, fosfodiestar, fosfotriestar, metilfosfonat, P3'→N5' fosforamidat, N3' →P5' fosforamidat, N3'→P5' tiofosforamidat i fosforotioatn veze.
[0231] U nekim primerima izvođenja, oligonukleotidna komponenta O ima najmanje jednu N3'→P5' fosforamidat vezu (npr. N3'→P5' tiofosforamidat). U određenim primerima izvođenja, sve nukleozidne podjedinice komplementarne RNK komponenti humane telomeraze su spojene N3'→P5' fosforamidatnim vezama između podjedinica. U određenim slučajevima, N3'→P5' fosforamidatne veze između podjedinica su N3'→P5' tiofosforamidne veze između podjedinica. U određenim slučajevima, N3'→P5' fosforamidatne veze između podjedinica su N3'→P5' okso-fosforamidne veze između podjedinica.
[0232] U određenim slučajevima, tiofosforamidatna veza između podjedinica N3'→P5' ima sledeću strukturu:
3'-NH-P(S)(OR)-O-5'
gde je R izabran iz grupe koja se sastoji od sledećih: vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril i fosfatna zaštitna grupa. Podrazumeva se da neke od oligonukleotidnih komponenti O uključujući vezu između podjedinica opisanu gornjom formulom gde je R izabran iz grupe koja se sastoji od sledećih: vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril i fosfatna zaštitna grupa, takođe može postojati u obliku soli. Takvi oblici, u meri u kojoj mogu da postoje, treba da budu uključeni u obim ovog otkrića.
[0233] U nekim slučajevima, N3'→P5' tiofosforamidatna veza između podjedinica je opisana sledećom strukturom:
3'-NH-P(S)(OR)-O-5'
gde je R vodonik. Podrazumeva se da za bilo koju od oligonukleotidnih komponenti O opisanih ovde koje uključuju takvu vezu između podjedinica, takve oligonukleotidne komponente O mogu takođe uključiti bilo koje pogodne oblike soli veze. Kao takva, veza između podjedinica može biti u obliku soli koja uključuje bilo koji pogodan protivjon.
2
[0234] Jedinjenja prema pronalasku su efikasnija u proizvodnji inhibicije telomeraze u ćelijama od odgovarajućih oligonukleotida koji nisu konjugovani sa lipidnim komponentama. Veruje se da lipidna komponenta L' funkcioniše tako da poboljša ćelijsko preuzimanje jedinjenja, posebno u olakšavanju prolaska kroz ćelijsku membranu. Iako mehanizam po kome se ovo dešava nije u potpunosti razjašnjen, jedna od mogućnosti je da lipidna komponenta može olakšati vezivanje jedinjenja za ćelijsku membranu ili kao pojedinačni molekul, ili kao agregat (micelarni) oblik, sa naknadnom internalizacijom. Međutim, razumevanje preciznog mehanizma nije potrebno da bi pronalazak bio korišćen.
[0235] Lipidna komponenta može biti bilo koji lipid ili derivat lipida koji obezbeđuje poboljšano ćelijsko usvajanje u poređenju sa nemodifikovanim oligonukleotidom. Poželjni lipidi su ugljovodonici, masti (npr., gliceridi, masne kiseline i derivati masnih kiselina, kao što su masni amidi) i steroli. Tamo gde je lipidna komponenta ugljovodonik, L' komponenta može biti supstituisani ili nesupstituisani ciklični ugljovodonik ili alifatični ravnolančani ili razgranati ugljovodonik, koji može biti zasićen ili nezasićen. Poželjni primeri su nerazgranati ugljovodonici ravnog lanca koji su potpuno zasićeni ili polinezasićeni. Dužina ugljovodoničnog lanca može da varira od C2-C30, ali optimalna inhibicija telomeraze se može postići sa ugljeničnim lancima koji su C8-C22. Poželjni primeri zasićenih ugljovodonika (alkana) su navedeni u nastavku:
Sistematski naziv / Ugljenični lanac
Tetradekan C14H30
Pentadekan C15H32
Heksadekan C16H34
Heptadekan C17H36
Octadecane CisHss
Nonadekan C19H40
Eikosan C20H42
[0236] Mono- i poli-nezasićeni oblici (alkeni i polieni, kao što su alkadieni i alkatrieni) ugljovodonika takođe mogu biti izabrani, pri čemu su poželjna jedinjenja koja imaju jednu do tri dvostruke veze, iako se može koristiti jedinjenja koja imaju više dvostrukih veza. Alkini (koji sadrže jednu ili više trostrukih veza) i alkenini (trostruke veze i dvostruke veze) takođe se mogu koristiti.
[0237] Supstituisani oblici ugljovodonika mogu se koristiti u jedinjenjima prema pronalasku, pri čemu su poželjne supstituentske grupe koje su inertne in vivo i in vitro. Posebno poželjan supstituent je fluor. Primeri generičkih struktura polifluorovanih ugljovodonika uključuju: CF3(CF2)n-(CH2)m- gde je m najmanje 1, poželjno najmanje 2, i n=1-30, kao što je fluorotridekan: CF3(CF2)9(CH2)3; i CH3(CH2)a(CF2)b(CH2)c- gde su a, b i c nezavisno 1-30.
[0238] Druge pogodne lipidne komponente uključuju jednostavne masne kiseline i derivate masnih kiselina, gliceride i složenije lipide kao što su steroli, na primer holesterol. Masne kiseline i njihovi derivati mogu biti potpuno zasićeni ili mono- ili poli-nezasićeni. Dužina ugljeničnog lanca može da varira od C2-C30, ali optimalna inhibicija telomeraze se može postići sa ugljeničnim lancima koji su C8-C22. Poželjni primeri zasićenih masnih kiselina su navedeni u nastavku:
Sistematski naziv /Trivijalni naziv 1 Ugljenični lanac
Tetradekanski miristik 14:0
Heksadekanski palmitik 16:0
Oktadekanski stearinski 18:0
Eikozanski arahid 20:0
[0239] Mono- i poli-nezasićeni oblici masnih kiselina se takođe mogu koristiti, pri čemu su poželjna jedinjenja koja imaju jednu do tri dvostruke veze, mada se mogu koristiti i jedinjenja koja imaju više dvostrukih veza. Primeri uobičajenih mono- i poli-nezasićenih masnih kiselina koje se mogu koristiti uključuju:
Sistematski naziv 1 Trivijalni naziv 1 Ugljenični lanac
Cis-9-heksadekanska palmitoleinska 16:1(n-7)
Cis-6-oktadekanska petroselinska 18:1 (n-12)
Cis-9-oktadekanska oleinska 18:1 (n-9)
9,12-oktadekadienska linolna 18:2 (n-6)
6,9,12-oktadekatrienska gama-linolna 18:3 (n-6)
9,12,15-oktadekatrienska alfa-linolna 18:3 (n-3)
5,8,11,14-eikozatetraenska arahidonska 20:4 (n-6)
[0240] Masne kiseline sa jednom ili više trostrukih veza u ugljeničnom lancu, kao i razgranate masne kiseline mogu se takođe koristiti u ovde opisanim jedinjenjima. Supstituisani oblici
4
masnih kiselina mogu se koristiti u ovde opisanim jedinjenjima. Kao i kod ugljovodoničnih grupa, supstituentske grupe koje su inertne in vivo i in vitro su poželjne, pri čemu je fluor posebno poželjan. Primeri generičkih struktura polifluorovanih derivata masnih kiselina pogodnih za upotrebu kako je ovde opisano: CF3(CF2)n-(CH2)mCO- gde je m najmanje 1, poželjno najmanje 2, i n=1-30, i CH3(CH2)a(CF2)b(CH2)cCO- gde su a, b i c nezavisno 1-30
[0241] U nekim slučajevima, između jedne i pet L' komponenti (n=1-5) je kovalentno vezano za O komponentu, izborno preko linkera. Obično se koriste 1 ili dve L' komponente (n=1 ili 2). Kada je više od jedne L' komponente povezano sa O komponentom, svaka L' komponenta se bira nezavisno.
[0242] Biće jasno da su jedinjenja iz otkrića opisana kao da imaju određeni ugljovodonik kao L' deo i jedinjenja opisana kao da imaju određenu masnu kiselinu (sa istim brojem atoma ugljenika kao i navedeni ugljovodonik) su blisko povezani i razlikuju se samo po strukturi u prirodi veze koja spaja L' deo sa oligonukleotidom, što je zauzvrat rezultat postupka sinteze koji se koristi za proizvodnju jedinjenja. Na primer, i kao što je detaljnije opisano u nastavku, kada se sintetišu jedinjenja koja imaju L' deo konjugovan sa 3'-amino terminusom oligonukleotida (koji imaju fosforamidatne ili tiofosforamidatne internukleozidne veze), upotreba aldehidnog oblika masne kiseline (masni aldehid) kao početni materijal dovodi do formiranja aminske veze između lipidnog lanca i oligonukleotida, tako da se lipidna grupa pojavljuje kao ugljovodonik. Nasuprot tome, upotreba oblika karboksilne kiseline, anhidrida kiseline ili hlorida kiseline iste masne kiseline dovodi do formiranja amidne veze, tako da se lipidna grupa pojavljuje kao derivat masne kiseline, posebno u ovom slučaju masni amid (kao navedeno u odeljku definicija iznad, radi jednostavnosti, termin "masna kiselina" kada se opisuje konjugovana L' grupa se ovde široko koristi da uključi derivate masnih kiselina, uključujući amide masnih kiselina). Ovo je ilustrovano na sledećim šemama koje prikazuju 3'-amino terminus fosforamidatnog oligonukleotida spojenog sa C14 lipidnom komponentom. U šemi A, L' je tetradekanska kiselina (miristinska kiselina), u kojoj je veza između L' i O grupa amid. Na šemi B, L' je tetradekan, a veza između L' i O grupa je amin.
[0243] Veza između O i L' komponenti može biti direktna veza, ili može biti preko izbornog vezujućeg dela, npr., x' ili izbornog linkera L formule (I). Linker grupa može poslužiti da olakša hemijsku sintezu jedinjenja. Bez obzira da li se linker grupa koristi za posredovanje u konjugaciji O i L' komponenti, postoji više mesta na oligonukleotidnoj komponenti O sa kojima se L' komponenta(e) može pogodno konjugovati. Pogodne tačke povezivanja uključuju 5' i 3' terminuse, jedan ili više šećernih prstenova, internukleozidnu kičmu i nukleobaze oligonukleotida. U nekim slučajevima, L' deo je vezan za 3' ili 5' terminus oligonukleotida.
[0244] Ako L' komponenta treba da bude vezana za 3'-terminus, veza može biti direktno za 3' supstituent, koji je u slučaju poželjnih fosforamidatnih i tiofosforamidatnih oligonukleotida 3'-amino grupa, a u drugim slučajevima, kao što su konvencionalni fosfodiestarski oligonukleotidi, je 3-hidroksi grupa. Alternativno, L' deo može biti povezan preko 3'-vezane fosfatne grupe, u kojoj je heksadekan ugljovodonik vezan za 3' fosfat tiofosforamidatnog oligonukleotida preko O-alkil linkera. Ako L' deo treba da bude vezan za 5' kraj, on može biti vezan preko 5'-vezane fosfatne grupe. Vezivanje za bazu na O grupi može preko bilo kog pogodnog atoma, na primer za N2 amino grupu guanozina. Tamo gde je n>1 tako da veći broj lipidnih delova treba da bude vezan za O komponentu, pojedinačno izabrane L' komponente mogu biti vezane na bilo kom pogodnom mestu(ima). Na primer, jedna L' grupa može biti vezana za svaki kraj, različite L' grupe mogu biti vezane za baze, ili dve ili više L' grupa mogu biti vezane na jednom kraju.
[0245] Izborna komponenta linkera x' može se koristiti za spajanje O i L' komponenti jedinjenja. Podrazumeva se da izborni linker (npr., x' ili L formule (I)) može biti vezan za polinukleotid (npr., O) preko terminalne fosfatne grupe, npr.3'-vezane ili 5'- vezane fosfatne grupe. Ako se koristi linker, on se uključuje u postupke sinteze kao što je ovde opisano. Primeri pogodnih linker grupa uključuju amino glicerol i O-alkil glicerol linkere koji se mogu opisati generičkim strukturama:
gde R'=H, OH, NH2ili SH; Y=O, S ili NR; R=H, alkil ili supstituisani alkil; i n i m su nezavisni celi brojevi između 1-18.
[0246] Specifični primeri pogodnih linkera su aminoglicerol linker u kome R'=OH, Y=O i m i n su svaki 1:
bis-aminoglicerol linker, u kojem R'=OH, Y=NH, i m i n su svaki 1:
i O-alkil glicerol linker u kome RH:
[0247] Primeri lipidom-modifikovanih oligonukleotida koji se mogu pripremiti prema predmetnim postupcima uključuju ona jedinjenja opisana na Slici 1 (npr., Slike 1A-1DD) iz U.S. US20120329858 od Gryaznov et al "Modified oligonucleotides for telomerase inhibition".
[0248] U određenim primerima izvođenja, kompozicija dobijena postupkom pronalaska uključuje jedinjenje opisano strukturom:
gde "nps" predstavlja tiofosforamidatnu vezu (npr., -NH-P(=O)(SH)-O-), koja povezuje 3'-ugljenik jednog nukleozida sa 5'-ugljenikom susednog nukleozida.
[0249] Podrazumeva se da su svi primeri izvođenja koji se odnose na jedinjenje takođe primenljivi na oblike soli pomenutog jedinjenja.
[0250] U određenim primerima izvođenja, kompozicija dobijena postupkom pronalaska uključuje jedinjenje opisano strukturom:
ili njegovu so,
gde "nps" predstavlja tiofosforamidatnu vezu (npr. -NH-P(=O)(SH)-O- ili njegov tautomer, ili njegovu so), povezujući 3'-ugljenik jednog nukleozida sa 5'- ugljenikom susednog nukleozida. U određenim primerima izvođenja, kompozicija uključuje farmaceutski prihvatljivu so jedinjenja. U određenim slučajevima, kompozicija uključuje natrijumovu so jedinjenja. U određenim primerima izvođenja, kompozicija uključuje dvovalentnu katjonsku so jedinjenja, kao što je magnezijumova so jedinjenja. U određenim primerima izvođenja, kompozicija uključuje trovalentnu katjonsku so jedinjenja, kao što je aluminijumska so jedinjenja.
[0251] U određenim primerima izvođenja, kompozicija dobijena postupkom pronalaska uključuje oligonukleotid opisan sledećom strukturom, gde svaki M<x+>je nezavisno vodonik ili bilo koji pogodan protivjon soli, svaki x je nezavisno 1, 2 ili 3 i n je ceo broj od 5 do 13, kao što je 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ili 13, kao što je n jednako 13:
U određenim slučajevima, svako x je 1. U određenim slučajevima, svako x je nezavisno 1 ili 2. U određenim slučajevima, svako x je nezavisno 1 ili 3. U određenim slučajevima, M<x+>je vodonik.
[0252] U određenim primerima izvođenja, kompozicija dobijena postupkom pronalaska uključuje oligonukleotid opisan sledećom strukturom i može uključivati bilo koje pogodne katjonske protivjone soli:
[0253] U određenim primerima izvođenja, kompozicija dobijena postupkom pronalaska uključuje jedinjenje opisano strukturom:
[0254] Takođe su otkrivene, ali nisu deo pronalaska za koji se traži zaštita, kompozicije aktivnih farmaceutskih sastojaka jedinjenja uključujući jedinjenje koje sadrži oligonukleotide. Kako se ovde koristi, aktivni farmaceutski sastojak se odnosi na kompoziciju koja se proizvodi primenom predmetnih postupaka pripreme, pri čemu kompozicija može izborno biti podvrgnuta jednom ili više dodatnih koraka prečišćavanja nakon sinteze. Generalno, aktivni farmaceutski sastojak je kompozicija pogodna za formulaciju u farmaceutsku kompoziciju. U nekim slučajevima, kompozicija aktivnog farmaceutskog sastojka jedinjenja nije prečišćena nakon
1
sinteze, tako da komponente kompozicije koje sadrže oligonukleotide odražavaju one proizvode proizvedene tokom sinteze oligonukleotida.
[0255] U nekim primerima izvođenja, aktivni farmaceutski sastojak jedinjenja ima manje od 9 težinskih % (N-1) proizvoda, pri čemu jedinjenje sadrži polinukleotid koji ima sekvencu od 10 ili više nukleozidnih podjedinica komplementarnih RNK komponenti ljudske telomeraze, gde najmanje dve od nukleozidnih podjedinica su spojene N3'→P5' tiofosforamidatnom ili oksofosforamidatnom vezom između podjedinica (npr., kako je ovde opisano).
[0256] U nekim primerima izvođenja, aktivni farmaceutski sastojak jedinjenja ima manje od 9 težinskih % (N-1) proizvoda, pri čemu jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so sadrži polinukleotid koji ima sekvencu od 10 ili više nukleozidnih podjedinica komplementarnih RNK komponenti humane telomeraze, pri čemu su najmanje dve nukleozidne podjedinice spojene N3'→P5' tiofosforamidatnom ili oksofosforamidatnom vezom između podjedinica (npr., kao što je ovde opisano).
[0257] U nekim primerima izvođenja aktivnog farmaceutskog sastojka jedinjenja, sve nukleozidne podjedinice komplementarne RNK komponenti humane telomeraze su spojene N3'→P5' tiofosforamidatnim vezama između podjedinica.
[0258] U nekim primerima izvođenja aktivnog farmaceutskog sastojka jedinjenja, N3'→P5' tiofosforamidatna veza između podjedinica ima sledeću strukturu:
3'-NH-P(S)(OR)-O-5'
gde je R izabran iz grupe koja se sastji od sledećih: vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril i fosfatna zaštitna grupa. Kada je R izabran iz grupe koju čine vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril i fosfat zaštitna grupa, podrazumeva se da neke od veza između podjedinica opisanih gornjom formulom mogu takođe postojati u obliku soli. Takvi oblici, u meri u kojoj mogu da postoje, treba da budu uključeni u obim ovog otkrića.
[0259] U nekim primerima izvođenja aktivnog farmaceutskog sastojka jedinjenja, N3'→P5' tiofosforamidatna veza između podjedinica ima sledeću strukturu:
3'-NH-P(S)(OR)-O-5'
gde je R vodonik. Podrazumeva se da za bilo koji od aktivnih farmaceutskih sastojaka jedinjenja koji su ovde opisani koji uključuju takvu vezu između podjedinica, aktivni farmaceutski sastojak takvog jedinjenja može takođe uključiti bilo koje pogodne farmaceutski prihvatljive
2
oblike soli veze. Kao takva, veza između podjedinica može biti u obliku farmaceutski prihvatljive soli koja uključuje bilo koji pogodan protivjon soli.
[0260] U nekim primerima izvođenja aktivnog farmaceutskog sastojka jedinjenja, polinukleotid sadrži između 10 i 50 susednih nukleozidnih podjedinica komplementarnih RNK komponenti humane telomeraze (npr., kao što je ovde opisana).
[0261] U nekim primerima izvođenja aktivnog farmaceutskog sastojka jedinjenja, polinukleotid sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja je sastoji od: GTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:4); TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3); i CAGTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:5).
[0262] U nekim primerima izvođenja aktivnog farmaceutskog sastojka jedinjenja, polinukleotid uključuje 3'amino ili 3'-hidroksil terminalnu grupu. U određenim primerima izvođenja aktivnog farmaceutskog sastojka jedinjenja, polinukleotid uključuje 3'amino terminalnu grupu. U određenim primerima izvođenja aktivnog farmaceutskog sastojka jedinjenja, polinukleotid uključuje 3'-hidroksil terminalnu grupu.
[0263] U nekim primerima izvođenja jedinjenja aktivnog farmaceutskog sastojka, jedinjenje ima strukturu:
pri čemu "nps" predstavlja tiofosforamidatnu vezu -NH-P(=O)(SH)-O-, koja povezuje 3'-ugljenik jednog nukleozida sa 5'-ugljenikom susednog nukleozida.
[0264] Podrazumeva se da su svi primeri izvođenja koji se odnose na aktivni farmaceutski sastojak jedinjenja takođe primenljivi na oblike soli navedenog jedinjenja aktivnog farmaceutskog sastojka.
[0265] U nekim primerima izvođenja jedinjenja aktivnog farmaceutskog sastojka, jedinjenje ima strukturu:
ili njegova farmaceutski prihvatljiva so;
pri čemu "nps" predstavlja tiofosforamidatu vezu -NH-P(=O)(SH)-O- (ili njegov tautomer ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, kako je ovde opisano), povezujući 3'-ugljenik jednog nukleozida sa 5'-ugljenikom susednog nukleozida. U određenim primerima izvođenja aktivnog farmaceutskog sastojka jedinjenja, kompozicija uključuje natrijumovu so jedinjenja. U određenim primerima izvođenja, kompozicija uključuje dvovalentnu katjonsku so jedinjenja, kao što je magnezijumova so jedinjenja. U određenim primerima izvođenja, kompozicija uključuje trovalentnu katjonsku so jedinjenja, kao što je aluminijumska so jedinjenja.
[0266] U određenim primerima izvođenja jedinjenja aktivnog farmaceutskog sastojka, jedinjenje je opisano sledećom strukturom, gde svaki M<x+>je nezavisno vodonik ili bilo koji pogodan protivjon soli, svaki x je nezavisno 1, 2 ili 3 i n je ceo broj od 5 do 13, kao što je 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ili 13, kao što je n jednako 13:
4
U određenim slučajevima, svako x je 1. U određenim slučajevima, svako x je nezavisno 1 ili 2. U određenim slučajevima, svako x je nezavisno 1 ili 3. U određenim slučajevima, M<x+>je vodonik.
[0267] U određenim primerima izvođenja aktivnog farmaceutskog sastojka jedinjenja, jedinjenje je opisano sledećom strukturom i može uključivati bilo koje pogodne katjonske protivjone soli:
[0268] U nekim primerima izvođenja jedinjenja aktivnog farmaceutskog sastojka, jedinjenje je opisano strukturom:
[0269] U nekim primerima izvođenja, aktivni farmaceutski sastojak jedinjenja ima manje od 9 težinskih % (N-1) proizvoda, kao što je manje od 8 težinskih % mase, manje od 7 težinskih %, manje od 6 težinskih %, manje od 5 težinskih %, manje od 4 težinskih %, manje od 3 težinskih %, manje od 2 težinskih %, ili čak manje od 1 težinskih % (N-1) proizvoda. U određenim primerima izvođenja, aktivni farmaceutski sastojak jedinjenja ima manje od 5 težinskih % (N-1) proizvoda. U određenim primerima izvođenja, aktivni farmaceutski sastojak jedinjenja ima manje od 2 težinskih % (N-1) proizvoda.
[0270] U nekim primerima izvođenja, aktivni farmaceutski sastojak ima manje od 9% bilo kog (N-x) proizvoda, kao što je manje od 8 težinskih %, manje od 7 težinskih %, manje od 6 težinskih %, manje od 5 težinskih %, manje od 4 težinskih %, manje od 3 težinskih %, manje od 2 težinskih %, ili čak manje od 1 težinskih % bilo kog (N-x) proizvoda.
[0271] U nekim primerima izvođenja, aktivni farmaceutski sastojak jedinjenja ima manje od 9 težinskih % u ukupnom broju proizvoda koji sadrže polinukleotide, kao što je manje od 8 težinskih %, manje od 7 težinskih %, manje od 6 težinskih %, manje od 5 težinskih %, manje od 4 težinskih %, manje od 3 težinskih %, manje od 2 težinskih % ili čak manje od 1 težinskih % ukupno proizvoda koji sadrže polinukleotide.
[0272] U nekim primerima izvođenja, aktivni farmaceutski sastojak jedinjenja ima sledeći profil proizvoda koji sadrže (N-x) polinukleotide:
manje od 1 težinska dela u 4 (N-1) proizvoda u odnosu na N proizvod; i
najmanje 10 težinskih delova u 100 (N-2) i (N-3) proizvoda u odnosu na N proizvod.
FORMULACIJE
[0273] Ovde su takođe opisane farmaceutske kompozicije koje uključuju oligonukleotidnu kompoziciju (npr., kako je ovde opisana). Oligonukleotidne kompozicije (npr., kako su ovde opisane) takođe mogu biti formulisane kao farmaceutski preparati za inhibiciju transkripcije ili translacije u ćeliji u bolesnom stanju povezanom sa prekomernom ekspresijom ciljnog gena.
[0274] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija uključuje oligonukleotidnu kompoziciju (npr., kako je ovde opisana) formulisanu u farmaceutski prihvatljivom ekscipijensu. U određenim primerima izvođenja, kompozicija oligonukleotida je aktivni farmaceutski sastojak jedinjenja koji ima manje od 9 težinskih % (N-1) proizvoda, pri čemu jedinjenje sadrži polinukleotid koji ima sekvencu od 10 ili više nukleozidnih podjedinica komplementarnih komponenti RNK humane telomeraze, pri čemu su najmanje dve od nukleozidnih podjedinica spojene N3'→P5' tiofosforamidatnom vezom između podjedinica.
[0275] Ovo otkriće opisuje jedinjenja koja mogu specifično i snažno inhibirati aktivnost telomeraze, i koja se stoga mogu koristiti za inhibiranje proliferacije ćelija pozitivnih na telomerazu, kao što su tumorske ćelije. Pokazalo se da je veoma širok spektar ćelija kancera pozitivnih na telomerazu, uključujući ćelije kancera kože, vezivnog tkiva, masnog tkiva, dojke, pluća, želuca, pankreasa, jajnika, grlića materice, materice, bubrega, bešike, debelog creva, prostate, centralnog nervnog sistema (CNS), retine i hematoloških tumora (kao što su mijelom, leukemija i limfom). Kanceri od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, mijelofibrozu, trombocitemiju, mijelodisplasični sindrom i mijelogenu leukemiju.
[0276] Predmetna jedinjenja se mogu koristiti za lečenje hematoloških maligniteta i mijeloproliferativnih poremećaja, uključujući, ali ne ograničavajući se na, esencijalnu trombocitemiju (ET), policitemiju veru (PV), hroničnu mijelogenu leukemiju (CML), mijelofibrozu (MF), hroničnu neutrofilnu leukemiju, hroničnu eozinofilnu leukemiju i akutnu mijelogenu leukemiju (AML). Predmetna jedinjenja se mogu koristiti za lečenje mijelodisplastičnih sindroma, koji uključuju takve bolesti kao što je refraktorna anemija, refraktorna anemija sa viškom blasta, refraktorna citopenija sa višelinijskom displazijom, refraktorna citopenija sa jednolinijskom displazijom i hronična mijelomonocitna leukemija (CMML). Predmetna jedinjenja se mogu koristiti za lečenje hematoloških oboljenja, kao što su ona opisana u WO 2014/088785.
[0277] Shodno tome, ovde opisana jedinjenja su široko korisna u lečenju širokog spektra maligniteta. Što je još važnije, jedinjenja ovog otkrića mogu biti efikasna u obezbeđivanju tretmana koji u velikoj meri razlikuju maligne i normalne ćelije, izbegavajući mnoge štetne nuspojave prisutne sa najsavremenijim hemoterapijskim režimima koji se oslanjaju na sredstva koja ubijaju ćelije koje se dele neselektivno. Pored toga, jedinjenja iz ovog otkrića su snažnija od ekvivalentnih nekonjugovanih oligonukleotida, što znači da se mogu primenjivati u nižim dozama, obezbeđujući povećanu bezbednost i značajno smanjenje troškova lečenja. Jedan aspekt otkrića je stoga postupak lečenja kancera kod pacijenta, koji sadrži primenu na pacijenta terapeutski efikasne doze jedinjenja prema ovom pronalasku. Inhibitori telomeraze, uključujući jedinjenja iz ovog otkrića, mogu se koristiti zajedno sa drugim pristupima lečenja kancera, uključujući hirurško uklanjanje primarnih tumora, hemoterapeutska sredstva i tretman zračenjem. Dakle, pronalazak se odnosi na jedinjenja i kompozicije date ovde za upotrebu kao lek. Otkrivanje se takođe odnosi na jedinjenja i kompozicije date ovde za upotrebu u lečenju ili prevenciji bilo kog od maligniteta pomenutih ranije.
[0278] Za terapeutsku primenu, jedinjenje prema pronalasku je formulisano u terapeutski efikasnoj količini sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Jedno ili više jedinjenja (na primer, koje imaju različite L' ili O komponente) mogu biti uključene u bilo koju datu formulaciju. Farmaceutski nosač može biti čvrst ili tečan. Tečni nosači se mogu koristiti u pripremi rastvora, emulzija, suspenzija i kompozicija pod pritiskom. Jedinjenja su rastvorena ili suspendovana u farmaceutski prihvatljivom tečnom ekscipijensu. Pogodni primeri tečnih nosača za parenteralnu primenu preparata oligonukleotida uključuju vodu (koja može sadržati aditive, npr. derivate celuloze, poželjno rastvor natrijum karboksimetil celuloze), fosfatno puferisan fiziološki rastvor (PBS), alkohole (uključujući monohidrične alkohole i polihidrične alkohole, npr., glikole) i njihove derivate i ulja (npr. frakcionisano kokosovo ulje i arahisovo ulje). Tečni nosač može da sadrži druge pogodne farmaceutske aditive uključujući, ali ne ograničavajući se na, sledeće: solubilizatore, suspendujuća sredstva, emulgatore, pufere, sredstva za zgušnjavanje, boje, regulatore viskoziteta, konzervanse, stabilizatore i regulatore osmolarnosti.
[0279] Za parenteralnu primenu jedinjenja, nosač takođe može biti uljani estar kao što je etil oleat i izopropil miristat. Sterilni nosači su korisni u kompozicijama sterilnog tečnog oblika za parenteralnu primenu.
[0280] Sterilne tečne farmaceutske kompozicije, rastvori ili suspenzije mogu se koristiti, na primer, intraperitonealnom injekcijom, subkutanom injekcijom, intravenski ili lokalno. Oligonukleotidi se takođe mogu primeniti intravaskularno ili preko vaskularnog stenta.
[0281] Tečni nosač za kompozicije pod pritiskom može biti halogenovani ugljovodonik ili drugi farmaceutski prihvatljiv propelant. Takve kompozicije pod pritiskom mogu takođe biti inkapsulirane lipidima za isporuku putem inhalacije. Za primenu intranazalnim ili intrabronhijalnim inhalacijom ili insuflacijom, oligonukleotidi se mogu formulisati u vodeni ili delimično vodeni rastvor, koji se zatim može koristiti u obliku aerosola.
[0282] Jedinjenja se mogu primenjivati lokalno kao rastvor, krema ili losion, formulacijom sa farmaceutski prihvatljivim vehikulumima koji sadrže aktivno jedinjenje.
[0283] Farmaceutske kompozicije ovog otkrića mogu se oralno primenjivati u bilo kojoj prihvatljivoj dozi uključujući, ali bez ograničenja, formulacije u kapsulama, tabletama, praškovima ili granulama, i kao suspenzije ili rastvori u vodi ili nevodenom medijumu. Farmaceutske kompozicije i/ili formulacije koje sadrže oligonukleotide prema ovom pronalasku mogu uključivati nosače, lubrikante, razblaživače, zgušnjivače, arome, emulgatore, dispergujuća pomoćna sredstva ili vezujuća sredstva. U slučaju tableta za oralnu upotrebu, nosači koji se obično koriste uključuju laktozu i kukuruzni skrob. Lubrikanti, kao što je magnezijum stearat, takođe se mogu dodati. Za oralnu primenu u obliku kapsula, korisni razblaživači uključuju laktozu i sušeni kukuruzni skrob. Kada su vodene suspenzije potrebne za oralnu upotrebu, aktivni sastojak se kombinuje sa sredstvima za emulgovanje i suspendovanje. Po želji se mogu dodati i određeni zaslađivači, arome ili boje.
[0284] Dok jedinjenja prema pronalasku imaju bolje karakteristike za penetraciju u ćelije i tkiva, mogu se formulisati da obezbede još veću korist, na primer u nosačima lipozoma. Upotreba lipozoma za olakšavanje ćelijske apsorpcije je opisana, na primer, u U.S. Pat. br.
4,897,355 i U.S. Pat. br. 4,394,448. Brojne publikacije opisuju formulaciju i pripremu lipozoma. Jedinjenja se takođe mogu formulisati mešanjem sa dodatnim pojačivačima prodiranja, kao što su nekonjugovani oblici lipidnih delova opisanih gore, uključujući masne kiseline i njihove derivate. Primeri uključuju oleinsku kiselinu, laurinsku kiselinu, kaprinsku kiselinu, miristinsku kiselinu, palmitinsku kiselinu, stearinsku kiselinu, linoleinsku kiselinu, linolensku kiselinu, dikaprat, trikaprat, recinleat, monoolein (takođe poznat kao 1-monooleoilrac-glicerol), dilaurin, kaprilinsku kiselinu, arahidonsku kiselinu, gliceril 1-monokaprat, 1-dodecilazacikloheptan-2-on, acilkarnitine, acilholine, mono- i di-gliceride i njihove fiziološki prihvatljive soli (tj. oleat, laurat, kaprat, miristat, palmitat, stearat, linoleat, itd.).
[0285] Mogu se koristiti složene formulacije koje sadrže jedan ili više sredstava za poboljšanje prodiranja. Na primer, žučne soli se mogu koristiti u kombinaciji sa masnim kiselinama za pripremu složenih formulacija. Primeri kombinacija uključuju henodeoksiholnu kiselinu (CDCA), koja se generalno koristi u koncentracijama od oko 0.5 do 2%, kombinovanu sa natrijum kapratom ili natrijum lauratom, koja se generalno koristi u koncentracijama od oko 0.5 do 5%.
[0286] Farmaceutske kompozicije i/ili formulacije koje sadrže oligonukleotide prema ovom pronalasku mogu takođe uključiti helatirajuća sredstva, surfaktante i ne-surfaktante. Sredstva za helatiranje uključuju, ali nisu ograničena na, dinatrijum etilendiamintetraacetat (EDTA), limunsku kiselinu, salicilate (npr., natrijum salicilat, 5-metoksisalicilat i homovanilat), N-acil derivate kolagena, lauret-9 i N-amino acil derivate beta-diketona (enamini). Surfaktanti uključuju, na primer, natrijum lauril sulfat, polioksietilen-9-lauril etar i polioksietilen-20-cetil etar; i perfluorohemijske emulzije, kao što je FC-43. Nesurfaktanti uključuju, na primer, nezasićene ciklične uree, derivate 1-alkil- i 1-alkenilazaciklo-alkanona i nesteroidna antiinflamatorna sredstva kao što su diklofenak natrijum, indometacin i fenilbutazon.
[0287] Prema tome, u sledećem aspektu otkrića, dat je postupak formulisanja farmaceutske kompozicije, pri čemu postupak sadrži obezbeđivanje jedinjenja kao što je ovde opisano, i kombinovanje jedinjenja sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom. Poželjno, jedinjenje je obezbeđeno farmaceutske čistoće, kao što je definisano u nastavku. Postupak može dalje da sadrži dodavanje jedinjenju, bilo pre ili posle dodavanja ekscipijensa, sredstva za poboljšanje prodiranja.
[0288] Farmaceutska kompozicija može biti u skladu sa standardima farmaceutske čistoće. U nekim slučajevima, za upotrebu kao aktivni sastojak u farmaceutskom preparatu, predmetno jedinjenje se prečišćava od reaktivnih ili potencijalno imunogenih komponenti prisutnih u smeši u kojoj se pripremaju.
[0289] Farmaceutska kompozicija može biti podeljena na alikvote i upakovana u pojedinačne ili višedozne jedinice. Zahtevi za doziranje za lečenje sa oligonukleotidnim jedinjenjem variraju u zavisnosti od određenih kompozicija koje se koriste, načina primene, težine prikazanih simptoma, oblika jedinjenja i određenog subjekta koji se leči.
1
[0290] Farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu se primenjivati na subjekta u formulaciji i u količini koja je efikasna da se postigne klinički poželjan rezultat. Za lečenje kancera, poželjni rezultati uključuju smanjenje tumorske mase (kako je utvrđeno palpacijom ili imidžingom; na primer, radiografijom, radionukleotidnim skeniranjem, CAT skeniranjem ili MRI), smanjenjem stope rasta tumora, smanjenjem stope formiranja metastaza (kako je utvrđeno npr. histohemijskom analizom uzoraka biopsije), smanjenjem biohemijskih markera (uključujući opšte markere kao što je ESR i tumor-specifične markere kao što je serumski PSA) i poboljšanje kvaliteta života (kako je utvrđeno kliničkom procenom, npr. Karnofsky skor), povećano vreme do progresije, preživljavanje bez bolesti i ukupno preživljavanje.
[0291] Količina jedinjenja po dozi i broj doza potrebnih za postizanje takvih efekata će varirati u zavisnosti od mnogih faktora uključujući indikaciju bolesti, karakteristike pacijenta koji se leči i način primene. U nekim slučajevima, formulacija i način primene će obezbediti lokalnu koncentraciju na mestu bolesti između 1 µM i 1 nM jedinjenja.
[0292] Generalno, jedinjenja se primenjuju u koncentraciji koja daje efikasne rezultate bez izazivanja štetnih ili štetnih neželjenih efekata. Takva koncentracija se može postići primenom bilo pojedinačne jedinične doze, ili primenom doze podeljene na pogodne podjedinice u odgovarajućim intervalima tokom dana.
KORIST
[0293] Postupci pronalaska i jedinjenja koja su ovde opisana, na primer, kao što je gore opisano, nalaze upotrebu u različitim primenama. Primene od interesa uključuju, ali nisu ograničene na: terapeutske primene, dijagnostičke primene, istraživačke primene i skrining primene, kao što je detaljnije prikazano u nastavku.
[0294] Predmetna jedinjenja nalaze primenu u raznim terapeutskim primenama. U nekim primerima izvođenja, postupci za proizvodnju oligonukleotida se primenjuju da bi se pripremili oligonukleotidi koji obezbeđuju terapeutsku korist. Vrste bolesti koje se mogu lečiti korišćenjem kompozicija ovog pronalaska su neograničene. Na primer, kompozicije se mogu koristiti za lečenje brojnih genetskih bolesti. U nekim primerima izvođenja predmetni postupci i kompozicije imaju antisens primene. U nekim primerima izvođenja predmetni postupci i kompozicije imaju primenu antigena. U određenim primerima izvođenja, predmetni postupci i kompozicije imaju primene inhibicije telomeraze, kao što su one opisane u U.S. Patentu 6,835,826, i U.S. objavi 20120329858.
2
Predmetna jedinjenja i postupci nalaze primenu u različitim dijagnostičkim primenama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, razvoj kliničke dijagnostike, npr. in vitro dijagnostiku ili in vivo sredstva za snimanje tumora. Takve primene su korisne u dijagnostikovanju ili potvrđivanju dijagnoze bolesnog stanja, ili podložnosti njemu. Postupci su takođe korisni za praćenje progresije bolesti i/ili odgovora na lečenje kod pacijenata kojima je prethodno dijagnostikovana bolest.
PRIMERI
[0295] Sledeći primeri su izneti tako da onima koji su uobičajeno kvalifikovani u ovoj oblasti pruže potpuno otkriće i opis kako da naprave i koriste ovaj pronalazak, i nemaju za cilj da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju svojim pronalaskom niti da li su oni namenjeni da predstavljaju da su eksperimenti u nastavku svi ili jedini eksperimenti izvedeni. Uloženi su napori da se obezbedi tačnost u odnosu na korišćene brojeve (npr. količine, temperaturu itd.), ali neke eksperimentalne greške i odstupanja treba uzeti u obzir. Osim ako nije drugačije naznačeno, delovi su delovi po težini, molekulska težina je prosečna molekulska težina, temperatura je u stepenima Celzijusa, a pritisak je na ili blizu atmosferskog. Pod „prosekom“ se podrazumeva aritmetička sredina. Mogu se koristiti standardne skraćenice, npr. bp, bazni par(ovi); kb, kilobaza(e); pl, pikolitar(pikolitri); s ili sek, sekunda(e); min, minuta(e); h ili hr, sat(i); aa, aminokiselina(e); kb, kilobaza(e); bp, bazni par(ovi); nt, nukleotid(i); i.m., intramuskularni(intramsularno); i.p., intraperitonealni(intraperitonealno); s.c., subkutani(subkutano); i slično.
Opšti sintetički postupci
[0296] Dostupne su mnoge opšte reference koje pružaju opšte poznate hemijske sintetičke šeme i uslove korisne za sintezu otkrivenih jedinjenja (videti, npr. Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Fifth Edition, Wiley-Interscience, 2001; ili Vogel, A Textbook of Practical Organic Chemistry, Including Qualitative Organic Analysis, Fourth Edition, New York: Longman, 1978).
[0297] Jedinjenja koja su ovde opisana mogu se prečistiti bilo kojim protokolom prečišćavanja poznatim u tehnici, uključujući hromatografiju, kao što je HPLC, preparativna tankoslojna hromatografija, fleš hromatografija na koloni i hromatografija sa izmenom jona. Može se koristiti bilo koja pogodna stacionarna faza, uključujući normalne i obrnute faze, kao i jonske smole. U određenim primerima izvođenja, otkrivena jedinjenja se prečišćavaju hromatografijom na silika gelu i/ili aluminijumom. Videti, npr. Introduction to Modern Liquid Chromatography, 2nd Edition, ed. L. R. Snyder and J. J. Kirkland, John Wiley and Sons, 1979; i Thin Layer Chromatography, ed E. Stahl, Springer-Verlag, New York, 1969.
[0298] Tokom bilo kog postupka za dobijanje predmetnih jedinjenja, može biti neophodno i/ili poželjno da se zaštite osetljive ili reaktivne grupe na bilo kom od dotičnih molekula. Ovo se može postići pomoću konvencionalnih zaštitnih grupa kao što je opisano u standardnim radovima, kao npr. J. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London and New York 1973, in T. W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", Third edition, Wiley, New York 1999, in "The Peptides"; Volume 3 (editors: E. Gross and J. Meienhofer), Academic Press, London and New York 1981, in "Methoden der organischen Chemie", Houben-Weyl, 4th edition, Vol. 15/l, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, in H.-D. Jakubke and H. Jescheit, "Aminosauren, Peptide, Proteine", Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach, and Basel 1982, i/ili in Jochen Lehmann, "Chemie der Kohlenhydrate: Monosaccharide and Derivate", Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974. Zaštitne grupe mogu biti uklonjene u pogodnoj sledećoj fazi korišćenjem postupaka poznatih u tehnici.
[0299] Predmetna jedinjenja se mogu sintetisati putem različitih sintetičkih puteva korišćenjem komercijalno dostupnih početnih materijala i/ili polaznih materijala pripremljenih konvencionalnim sintetičkim postpcima. Različiti primeri sintetičkih puteva koji se mogu koristiti za sintezu jedinjenja koja su ovde otkrivena su opisani u šemama ispod.
PRIMER 1
[0300] Sinteza imetelstat natrijuma korišćenjem dimernih fosforamidita.
[0301] Imetelstat natrijum se sintetiše korišćenjem čvrste podloge (staklo sa kontrolisanim porama ili polimerna čvrsta podloga) i monomernih fosforamidita kao što je A<Bz>ili A<dmf>, C, G<iBu>i T amiditi u sledećem redosledu:
5'R-TAGGGTTAGACAA-NH2-3' (SEQ ID NO:3) gde je R = lipidna linker grupa
4
ge dlo pote vrs ič itaid am ura kt tru
2:S ael
Tab
[0302] Okosnica imetelstata je NPS koji je sličan početnim fosforamiditima i stoga je efikasnost spajanja približno 92%. Korišćenje dimer fosforamidita omogućava manje koraka spajanja što može dovesti do većeg prinosa i čistoće u međufazi nakon sinteze. Sledeći dimer fosforamiditi su pripremljeni kao što je prikazano u nastavku korišćenjem postupka opisanog u sintetičkoj šemi 1:
TA, AA, GA, GG i GT.
[0303] Sinteza dimer fosforamidita zahtevala je tri monomerna amidata (4a do 4c, šema 1) i tri 5'-TBDMS-3' amino nukleozidna intermedijera (3a do 3c, šema 1) za A, G i T nukleozide. TBDMS je terc-butildimetilsilil. Intermedijeri (3a do 3c, šema 1) su pripremljeni od dve vrste početnih materijala, 5'-OH-3'-NH-Tr-2'-deoksi-N-benzoil adenozin (1a), 5'-OH-3 '-NH-Tr-2'-deoksi-N-izobutiril guanozin (1b) i 5'-OH-3'-aminotimidin (2). Tr ili Trt se odnose na tritil.
[0304] 5'-hidroksil grupa 1a i 1b zaštićena je TBDMS grupama korišćenjem t-butildimetilsilil hlorida i imidazola u DMF (N,N-dimetilformamid), a zatim su tritil grupe na 3'-amino pozicijama uklonjene tretmanom sa sirćetnom kiselinom u vodi. Dobijeni intermedijeri, 3a do 3c su spojeni sa odgovarajućim amidatima, 4a do 4c, korišćenjem benzilmerkaptotetrazola (BMT) kao aktivatora u dimetilformamidu, a naknadno sumporisanje (P III do P V) je izvedeno korišćenjem ksantan hidrida i piridina (šema 1). Generalno, reakcija sumporizacije je lako završena. Ishodi reakcija kuplovanja varirali su u zavisnosti od vlage, vremena reakcije i ekvivalentnosti amidata. Anhidrovani uslovi koji koriste gas azota ili argona i brza reakcija kuplovanja su bili poželjni jer duže vreme reakcije dovodi do više sporednih proizvoda kao što su P (V) oksidacioni proizvodi. P (III) intermedijeri dimera imaju različite stabilnosti. TA intermedijer je bio dovoljno stabilan da prati završetak reakcije pomoću TLC i HPLC. Ostali P (III) intermedijeri nisu bili dovoljno stabilni da bi se pratila reakcija kuplovanja i završetak reakcije je proveren nakon što je sumporizacija završena (šema 1). P(V) vrste su stabilnije za dimere AA, GA, GG i GT. Za TA dimer (5e), 1,3 ekvivalenta amidata (4c) je korišćeno za spajanje, a ostala četiri dimera (5a~5d) zahtevala su približno 3 ekvivalenta amidata (4a i 4b) (šema 1). Amidatni monomeri 4a-4c se pripremaju postupcima prilagođavanja opisanim u U.S. Patentu 5,859,233.
1
[0305] TBDMS zaštitna grupa na 5'-hidroksilnoj grupi je uklonjena korišćenjem HF•piridina u acetonitrilu i konačna fosfilacija je izvedena sa fosfitilacionim reagensom u prisustvu BMT i N-metilimidazola (NMI) da bi se napravio dimer tiofsoforoamidati, 7a do 7e (Šema 1). Finalni proizvodi (7) i tri intermedijera (3, 5, 6) su prečišćeni hromatografijom na koloni. Korak i ukupni prinosi reakcija sa dobijenim količinama konačnih amidata navedeni su u tabeli 3. Rezime rezultata analize za pet dimer amidata prikazani su u tabeli 4.
Tabela 3. Prinosi sinteze dimera
1 1
Postupak sinteze dimer tiofosforoamidata
[0306]
1) Priprema 5'-TBDMS-3'-amino nukleozida (za adenozin i guanozin).
1 2
a) Rastvoriti 5'-OH-3'-NH-Tr-2'-deoksinukleozid (1.0ekv.) i imidazol (5.0ekv.) u DMF i zagrejati na 60°C.
b) Dodati TBDMSCl (1.2ekv.) u rastvor za zagrevanje i zatim mešati 1 sat na 60°C. c) Dodati zasićeni vodeni rastvor NaHCO3u reakcionu smešu, zatim ekstrahovati etil acetatom.
d) Organski sloj je ispran zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3i fiziološkim rastvorom.
e) Dodati anhidrovani Na2SO4u izdvojeni organski sloj radi sušenja, a zatim filtriranja. f) Filtrat je koncentrovan.
g) Dodati 80% vodeni rastvor sirćetne kiseline u koncentrovanu reakcionu smešu, a zatim mešati 1 sat na temperaturi okoline.
h) Ukloniti čvrsti proizvod filtracijom, zatim dodati zasićeni vodeni rastvor NaHCO3u filtrat, a zatim ekstrahovati etil acetatom četiri puta.
i) Organski sloj je osušen preko anhidrovanog Na2SO4, zatim je uklonjena čvrsta supstanca filtriranjem.
j) Filtrat je koncentrovan, a zatim prečišćen hromatografijom na koloni (eluent: etil acetat: metanol=9:1 → 5:1).
k) 5'-TBDMS-3'-amino-2'-daoksinukleozid se dobija kao bela čvrsta supstanca.
) Priprema 5'-TBDMS-3'-amino nukleozida (za timidin)
a) Rastvoriti 5'-OH-3'-amino-2'-deoksinukleozid (1.0ekv.) i imidazol (5.0ekv.) u DMF i zagrejati do 60°C.
b) Dodati TBDMSCl (1.2ekv.) u rastvor za zagrevanje, a zatim mešati 1 sat na 60°C. c) Dodati zasićeni vodeni rastvor NaHCO3u reakcionu smešu, zatim ekstrahovati etil acetatom četiri puta.
d) Dodati anhidrovani Na2SO4u organski sloj za sušenje i filtriranje.
e) Filtrat je koncentrovan.
f) Koncentrovana sirova smeša je prečišćena hromatografijom na koloni (eluent: etil acetat: metanol=15:1 → 5:1).
g) 5'-TBDMS-3'-amino timidin se dobija kao bela čvrsta supstanca.
) Priprema 5'-TBDMS-3'-NH-Tr dimera
1
a) Da bi se uklonila vlaga, 5'-TBDMS-3'-amino nukleozid (1.0ekv.) i BMT (benzilmerkaptotetrazol, 1.0~5.0ekv.) su azeotropirani acetonitrilom tri puta, a zatim rastvoreni u DMF na temperaturi okoline pod atmosferom N2.
b) Dodati monomer amidat (3.0 ekv.) u DMF (koristeći minimalnu količinu da se rastvori monomer amidat) u reakcioni rastvor kap po kap, a zatim mešati 1 sat na sobnoj temperaturi u atmosferi azota. Monomer amidat se priprema prema postupcima opisanim u U.S. Patentu 5,859,233.
c) Dodati ksantan hidrid (2.0 ekv.) i piridin (4.0 ekv.) u reakcioni rastvor, a zatim mešati 1 sat na sobnoj temperaturi u atmosferi azota.
d) Dodati zasićeni vodeni rastvor NaHCO3rastvor u reakcionu smešu, zatim ekstrahovati etil acetatom.
e) Vodeni sloj je ekstrahovan etil acetatom.
f) Odvojeni organski slojevi su kombinovani i zatim isprani zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3i fiziološkim rastvorom.
g) Dodati anhidrovani Na2SO4u organski sloj radi sušenja i filtriranja, zatim se filtrat koncentruje.
h) Koncentrovana sirova smeša je prečišćena hromatografijom na koloni (Eluent: etil acetat: metanol=1.5:1 → samo EA).
i) 5'-TBDMS-3'-NH-Tr dimer se dobija kao bledo žuta čvrsta supstanca.
) Priprema 5'-OH-3'-NH-Tr dimera
a) Rastvoriti 5'-TBDMS-3'-NH-Tr dimer (1.0 ek) u ACN (20 mL) pod atmosferom azota i zatim dodati rastvor HF-piridina uz mešanje na sobnoj temperaturi tokom 1.5 sata. b) Dodati zasićeni vodeni rastvor NaHCO3u reakcionu smešu, zatim ekstrahovati etil acetatom.
c) Odvojeni organski sloj je ispran zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3i fiziološkim rastvorom.
d) Dodati anhidrovani Na2SO4u organski sloj radi sušenja i filtriranja i zatim se filtrat koncentruje.
e) Koncentrovana sirova smeša je prečišćena hromatografijom na koloni (eluent: etil acetat, metanol, ko-rastvarač metilen hlorid)
f) 5'-OH-3'-NH-Tr dimer se dobija kao bela čvrsta supstanca.
1 4
5) Priprema dimer fosforotioamidata (dimer amidata)
A) Da bi se uklonila vlaga, 5'-Hidroksi-3'-NH-Tr dimer je azeotropiran acetonitrilom tri puta, a zatim rastvoren u ACN na sobnoj temperaturi u atmosferi azota.
b) Dodati BMT (1.3ekv.), NMI (N-Metil imidazol, 0.3ekv.) i fosfitilacioni reagens (2.0ekv.) u reakcioni rastvor, a zatim mešati 1 sat na sobnoj temperaturi.
c) Dodati zasićeni vodeni rastvor NaHCO3u reakcionu smešu, zatim ekstrahovati etil acetatom.
d) Odvojeni organski sloj je ispran fiziološkim rastvorom.
e) Dodati anhidrovani Na2SO4u organski sloj za sušenje i filtriranje, zatim se filtrat koncentruje.
f) Rastvoriti koncentrovanu reakcionu smešu u metilen hloridu (10 mL), a zatim dodati heksan da se istaloži čvrsta supstanca.
g) Dekantirati gornji sloj rastvora da biste uklonili višak reagensa za fosfilaciju. (Ponovite postupak dekantacije 5 puta).
h) Preostala čvrsta supstanca je prečišćena hromatografijom na koloni (eluent: etil acetat, aceton, ko-rastvarač metilen hlorid)
i) Dimer se dobija kao bela čvrsta supstanca.
Sinteza imetelstata korišćenjem dimer amidata
[0307] Pet dimer amidata je korišćeno umesto monomernih amidata kao gradivnih blokova za sintezu imetelstata i rezultati su upoređeni sa rezultatima dobijenim od amidata monomera. Za spajanje C nucelozida u imetelstat, korišćen je sat izgradnje monomera kao što je prikazano u nizu ispod. Sinteza je izvedena na skali od 140 µmol koristeći Akta Oligopilot 100.
5'R-TA GG GT TA GA C AA-NH23' (SEQ ID NO: 3)
[0308] Dimer amidati su korišćeni kao gradivni blokovi za pripremu imetelstata. Korišćenjem reagensa i parametara sinteze navedenih u tabelama 5A i 5B, pet dimer amidata (AA, TA, GG, GA i GT) i jedan monomer amidat (C), kao što je prikazano gore, su spojeni da bi se imetelstat sekvenca napravila niskom-punjenju CPG (PALM 0051, 64.6 µmol/g). Vreme spajanja je 500 sekundi i korišćeno je 10 ekvivalenta amidita. Nakon sinteze u čvrstoj fazi, nosač se tretira etanolskim rastvorom amonijuma (NH4OH:EtOH=3:1 (v/v)) na 65°C tokom 15 sati. Sirovi proizvod je izolovan isparavanjem rastvarača i analiziran UV spektroskopijom i HPLC.
1
Tabela 5. Primer Parametara (A) sinteze i kompozicije (B) reagensa za sintezu oligonukleotida. ACN je acetoitril. DCA je dihlorosirćetna kiselina. PADS je fenilacetil disulfid. ETT je 5-etiltio-1H-tetrazol
B
[0309] Koristeći Akta Oligopilot 100, sprovedena je sinteza na skali od 140 µmol primenom postupka monomernog bloka i postupka bloka dimera. Uslovi sinteze za cikluse sinteze bili su slični onima navedenim u Tabeli 5A-B.
Tabela 6. Sintetički parametri za sintezu na skali od 140 µmol (AKTA Oligopilot 100)
1
1
[0310] Analiza oligonukleotida pomoću HPLC-MS je pokazala da je čistoća FLP (proizvod pune dužine) značajno poboljšana kada je pet blokova dimera korišćeno za sintezu, dajući 72% čistoće pomoću HPLC kao što je sumirano u tabelama 7 i 8. Sirovi oligo pripremljen korišćenjem monomernih blokova su pokazali samo 45% FLP čistoće. Dalje, ukupna OD (optička gustina) je povećana za više nego dvostruko sa 5.299 na 11.623 dajući sirovi prinos od 3.34 g/mmol. Nivo (N-1) proizvoda i sadržaj PO smanjeni su na 2.4% sa 11.2% i na 5% sa 20%, respektivno.
[0311] Prednost upotrebe dimer blokova uključuje to što je vreme proizvodnje skraćeno i smanjene količine rastvarača koji se koriste tokom sinteze u čvrstoj fazi.
Tabela 7. Rezultat analize za sintezu na skali od 140 µmol
1
[0312] Sinteza pet dimer amidata je uspešno završena sa prinosima od 9% do 19% od 5'-hidroksi-3'-amino nukleozida ili 5'-hidroksi-3'-tritilamino nukleozida dajući 1.7 grama do 3.4 grama. Optimizacija reakcionih uslova za svaki korak nije detaljno proučavana. Sinteze dimera blokova imetelstata su sprovedene na skali od 140 µmol i rezultati su upoređeni sa podacima dobijenim sintezom korišćenjem monomernih amidata. Pokazalo se da strategija dimer blokova za pripremu imetelstata daje značajna poboljšanja jer su čistoća i prinos značajno poboljšani, na primer, na skali od 140 µmol (HPLC čistoća: dimer 74.0% (Slika 8), monomer 44.4% (Slika 7), Sirovi prinos prema TOD (ukupna optička gustina): dimer 468 mg, monomer 213 mg). Pored toga, generisana je manja količina npo veze jer je bilo manje koraka spajanja u sintezi korišćenjem dimera.
[0313] Efikasnost kuplovanja za dimer (Sinteza na skali od 140 µmol) pokazuje da je sinteza dimera imala 96% efikasnosti kuplovanja, dok je sinteza monomera 94%. Pošto je bilo samo sedam spajanja za dimer, FLP za dimer je bio na 71.6% što je blizu teoretski izračunatom proizvodu pune dužine od 72%, a monomer sa 13 spojeva je prijavio FLP od 45.6% naspram teoretski predviđenog od 44%.
Tabela 8. Analiza rezultata za sintezu na skali od 140 µmol
1
[0314] Sinteza imetelstata koja koristi manje koraka kuplovanja obezbeđuje i čistoću proizvoda pune dužine i prinos koji su znatno veći. Rezolucija nečistoća omogućava lakše prečišćavanje imetelstata gde postoje manje količine sporednih proizvoda u blizini glavnog pika u HPLC da bi se dobile kompozicije koje imaju veću čistoću imetelstata. Ovo poboljšanje je poželjno zbog niže cene robe za proizvodnju imetelstat natrijuma, na primer, cena robe može biti 30-40% manja kada se primeni u proizvodnim razmerama.
11
Šema 2. Sintetička šema GA dimer amidata
[0315] 85 g TBAG je pripremljeno od 300 g APG2 prema ovde opisanim postupcima putem koraka prikazanih na Šemi 2.
Šema 3. Sintetička šema AA dimer amidata
[0316] 430 g TBAPA1 je dobijeno iz 800 g sirovog APA1 (čistoća: 46%) prema postupcima opisanim ovde preko koraka prikazanih na Šemi 3.
[0317] TA dimer amidat (5) je pripremljen prema postupcima opisanim ovde preko koraka prikazanih na Šemi 4 na skali sinteze od 100 mg do 1 g.
11
Šema 5. Kuplovanje i sumporizacija u toku sinteze dimer amidata
Tabela 9. Kuplovanje i sumporizacija tokom sinteze dimer amidata
[0318] Različiti nukleozidni monomeri su pripremljeni prema ovde opisanim postupcima koji nalaze primenu u pripremi jedinjenja dimera.
11
11
11

Claims (16)

  1. Patentni zahtevi 1. Postupak sinteze polinukleotida koji ima najmanje dve nukleozidne podjedinice spojene N3'→P5' oksofosforamidatnom ili N3'→P5' tiofosforamidatnom vezom između podjedinica, pri čemu postupak sadrži korake: (a) deprotekcije zaštićene 3' amino grupe terminalnog nukleozida vezanog za podlogu čvrste faze, pri čemu pomenuta deprotekcija formira slobodnu 3' amino grupu; (b) dovođenja u kontakt slobodne 3' amino grupe sa 3'-zaštićenim amino-dinukleotid fosforamidat-5'-fosforamidit dimerom u prisustvu nukleofilnog katalizatora da bi se formirala internukleozidna N3'→P5' fosforamiditna veza; i (c) oksidacije veze da bi se proizvela N3'→P5' oksofosforamidatna ili N3'→P5' tiofosforamidatna veza između podjedinica.
  2. 2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što oksidacija veze sadrži sumporisanje da bi se proizvela tiofosforamidatna veza ili oksidacija veze proizvodi oksofosforamidatnu vezu.
  3. 3. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što 3'-zaštićeni amino-dinukleotid fosforamidat-5'-fosforamidit dimer ima formulu:
    pri čemu X je O ili S i B<1>i B<2>su svaki nezavisno purin, zaštićeni purin, pirimidin ili zaštićeni pirimidin, ili njihov analog.
  4. 4. Postupak prema patentnom zahtevu 3, naznačen time što B<1>i B<2>su svaki nezavisno izabrani od zaštićenog adenina, zaštićenog citozina, zaštićenog guanina, timina i uracila.
  5. 5. Postupak prema patentnom zahtevu 4, naznačen time što B<1>i B<2>su svaki nezavisno izabrani od A(Bz), A(DMF), C(Bz), G(izobutirila), T i U.
  6. 6. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 3-5, naznačen time što X je S.
  7. 7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, naznačen time što polinukleotid je formule:
    gde: svaki B je nezavisno purin, zaštićeni purin, pirimidin ili zaštićeni pirimidin, ili njihov analog; svaki X je nezavisno kiseonik ili sumpor; svaki R<3>je vodonik, fluoro ili hidroksil, alkoksi, supstituisani alkoksi ili zaštićeni hidroksil; L je izborni linker; Z je H, lipid, podloga, nosač, oligonukleotid, PEG, polipeptid, detektabilni obeleživač ili oznaka; R<6>je amino, hidroksil, zaštićeni amino, zaštićeni hidroksi, -O-L-Z ili -NH-L-Z; R je vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril ili fosfatna zaštitna grupa; i n je ceo broj od 1 do 1000; ili njihova so; 11 i postupak sadrži korake: (a) deprotekcije zaštićene 3' amino grupe terminalnog nukleozida vezanog za podlogu čvrste faze, pri čemu navedena deprotekcija formira slobodnu 3' amino grupu; (b) reagovanje slobodne 3' amino grupe sa 3'-zaštićenim amino-dinukleotid fosforamidat-5'-fosforamidit dimerom u prisustvu nukleofilnog katalizatora da bi se formirala internukleozidna N3'→P5' fosforamiditna veza; (c) oksidacije veze; i (d) ponavljanja koraka (a) do (c) sve dok se ne sintetiše polinukleotid.
  8. 8. Postupak prema patentnom zahtevu 7, naznačen time što N3'→P5' oksofosforamidatna ili N3'→P5' tiofosforamidatna veza između podjedinica je N3'→P5' tiofosforamidatna veza između podjedinica koja ima strukturu: 3'-NH-P(S)(OR)-O-5' pri čemu R je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, alkila, supstituisanog alkila, arila, supstituisanog arila i fosfatne zaštitne grupe, ili njihove soli.
  9. 9. Postupak prema patentnom zahtevu 8, naznačen time što polinukleotid sadrži sekvencu TAGGGTTAGACAA i sve internukleotidne veze između podjedinica TAGGGTTAGACAA sekvence su N3'→ P5' fosforamidatne veze između podjedinica.
  10. 10. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 7-9, naznačen time što polinukleotid ima strukturu: 12
    ili njegova so; pri čemu "nps" predstavlja tiofosforamidatnu vezu -NH-P(=O)(SH)-O-, koja povezuje 3'-ugljenik jednog nukleozida sa 5'-ugljenikom susednog nukleozida.
  11. 11. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 7-10, naznačen time što polinukleotid ima strukturu:
    pri čemu svaki M<x+>je nezavisno vodonik ili protivjon farmaceutski prihvatljive soli, svako x je nezavisno 1, 2 ili 3 i n je ceo broj od 5 do 13.
  12. 12. Postupak prema patentnom zahtevu 11, naznačen time što polinukleotid ima strukturu:
  13. 13. Dinukleotidno tiofosforamidatno jedinjenje opisano Formulom (II): 12
    gde: B<1>i B<2>su svaki nezavisno purin, zaštićeni purin, pirimidin ili zaštićeni pirimidin, ili njihov analog; R<11>je fosforamiditna grupa; i R<12>i R<13>su svaki nezavisno zaštitna grupa; ili njegova so.
  14. 14. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 13, naznačeno time što B<1>i B<2>su svaki nezavisno izabrani od zaštićenog adenina, zaštićenog citozina, zaštićenog guanina, timina i uracila.
  15. 15. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 14, naznačeno time što B<1>i B<2>su svaki nezavisno izabrani od A(Bz), A(DMF), C(Bz), G(izobutirila), T i U.
  16. 16. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 15, naznačeno time što: B<1>je A(Bz) ili A(DMF) i B<2>je A(Bz) ili A(DMF); B<1>je A(Bz) ili A(DMF) i B<2>je C(Bz); B<1>je A(Bz) ili A(DMF) i B<2>je G(izobutiril); B<1>je A(Bz) ili A(DMF) i B<2>je T; B<1>je A(Bz) ili A(DMF) i B<2>je U; B<1>je C(Bz) i B<2>je A(Bz) ili A(DMF); B<1>je C(Bz) i B<2>je C(Bz); B<1>je C(Bz) i B<2>je G(izobutiril); B<1>je C(Bz) i B<2>je T; B<1>je C(Bz) i B<2>je U; B<1>je G(izobutiril) i B<2>je A(Bz) ili A(DMF); B<1>je G(izobutiril) i B<2>je C(Bz); B<1>je G(izobutiril) i B<2>je G(izobutiril); B<1>je G(izobutiril) i B<2>je T; B<1>je G(izobutiril) i B<2>je U; B<1>je T ili U i B<2>je A(Bz) ili A(DMF); B<1>je T ili U i B<2>je C(Bz); B<1>je T ili U i B<2>je G(izobutiril); B<1>je T ili U i B<2>je T; ili B<1>je T ili U i B<2>je U. 12
RS20231110A 2014-05-01 2015-04-29 Oligonukleotidne kompozicije i postupci za pripremu istih RS64860B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461987396P 2014-05-01 2014-05-01
US201562151909P 2015-04-23 2015-04-23
EP15785822.6A EP3137479B1 (en) 2014-05-01 2015-04-29 Oligonucleotide compositions and methods of making the same
PCT/US2015/028327 WO2015168310A1 (en) 2014-05-01 2015-04-29 Oligonucleotide compositions and methods of making the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64860B1 true RS64860B1 (sr) 2023-12-29

Family

ID=54359301

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20231110A RS64860B1 (sr) 2014-05-01 2015-04-29 Oligonukleotidne kompozicije i postupci za pripremu istih

Country Status (33)

Country Link
US (6) US9796747B2 (sr)
EP (2) EP4286519A3 (sr)
JP (7) JP7040892B2 (sr)
KR (4) KR102316282B1 (sr)
CN (3) CN106459134B (sr)
AP (1) AP2016009489A0 (sr)
AU (3) AU2015253158B2 (sr)
BR (1) BR112016025196B1 (sr)
CL (4) CL2016002749A1 (sr)
DK (1) DK3137479T5 (sr)
EA (1) EA034882B9 (sr)
ES (1) ES2963740T3 (sr)
FI (1) FI3137479T3 (sr)
HR (1) HRP20231505T1 (sr)
HU (1) HUE064289T2 (sr)
IL (2) IL248044B (sr)
JO (2) JOP20200257A1 (sr)
LT (1) LT3137479T (sr)
MA (1) MA63525B1 (sr)
MX (2) MX382233B (sr)
MY (2) MY178617A (sr)
PE (1) PE20170147A1 (sr)
PH (1) PH12016502080A1 (sr)
PL (1) PL3137479T3 (sr)
PT (1) PT3137479T (sr)
RS (1) RS64860B1 (sr)
SG (2) SG10201911086XA (sr)
SI (1) SI3137479T1 (sr)
SM (1) SMT202300405T1 (sr)
TW (2) TWI709406B (sr)
UA (1) UA126108C2 (sr)
WO (1) WO2015168310A1 (sr)
ZA (2) ZA201606624B (sr)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ME02933B (me) 2004-07-02 2018-04-20 Geron Corp Sinteza zaštićenih 3'-amino nukleozionih monomera
JOP20200257A1 (ar) * 2014-05-01 2017-06-16 Geron Corp تركيبات أوليجو نوكليوتيد وطرق لتحضيرها
KR102401252B1 (ko) * 2015-04-23 2022-05-24 제론 코포레이션 다가 양이온 염 조성물을 사용한 폴리뉴클레오티드 제조의 방법
JP7199410B2 (ja) * 2017-07-10 2023-01-05 ジェロン・コーポレーション 改善されたイメテルスタットの調製方法
EP4523681A1 (en) 2019-10-28 2025-03-19 Geron Corporation Amorphous solid succinylated 3-(fatty acid amido)-2-hydroxy-1-(protected hydroxy)-propane salts and methods of making the same
CA3155391A1 (en) 2019-10-28 2021-05-06 Geron Corporation Crystalline solids of 3-palmitoyl-amido-1,2-propanediol and 3-palmitoyl-amido-2-hydroxy-1-dimethoxytriphenylmethylether-propane and methods of making and using the same
CN115315430A (zh) * 2020-01-08 2022-11-08 日东电工株式会社 使用了链段型亚磷酰胺化合物的核酸合成法
US12565641B2 (en) 2021-10-15 2026-03-03 Codexis, Inc. Engineered terminal deoxynucleotidyl transferase variants
KR20250008345A (ko) 2023-07-07 2025-01-14 주식회사 엘지에너지솔루션 체결기구 및 체결기구를 포함하는 전지팩

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4046720A (en) 1974-01-17 1977-09-06 California Institute Of Technology Crosslinked, porous, polyacrylate beads
US4394448A (en) 1978-02-24 1983-07-19 Szoka Jr Francis C Method of inserting DNA into living cells
US4678814A (en) 1981-03-30 1987-07-07 California Institute Of Technology Polyacrolein microspheres
US4413070A (en) 1981-03-30 1983-11-01 California Institute Of Technology Polyacrolein microspheres
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US6448392B1 (en) 1985-03-06 2002-09-10 Chimerix, Inc. Lipid derivatives of antiviral nucleosides: liposomal incorporation and method of use
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US4757141A (en) 1985-08-26 1988-07-12 Applied Biosystems, Incorporated Amino-derivatized phosphite and phosphate linking agents, phosphoramidite precursors, and useful conjugates thereof
US4659774A (en) 1985-11-01 1987-04-21 American Hoechst Corporation Support for solid-phase oligonucleotide synthesis
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
DE69008521T2 (de) 1989-03-07 1994-10-20 Genentech Inc Kovalente konjugate von lipiden und oligonukleotiden.
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5411947A (en) 1989-06-28 1995-05-02 Vestar, Inc. Method of converting a drug to an orally available form by covalently bonding a lipid to the drug
US6114513A (en) 1990-01-11 2000-09-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized oligonucleotides
US6395492B1 (en) 1990-01-11 2002-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US6153737A (en) 1990-01-11 2000-11-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
EP0537299A1 (en) 1990-03-29 1993-04-21 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide-transport agent disulfide conjugates
US5420330A (en) 1990-09-07 1995-05-30 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Lipo-phosphoramidites
US5419966A (en) 1991-06-10 1995-05-30 Microprobe Corporation Solid support for synthesis of 3'-tailed oligonucleotides
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5629154A (en) 1993-11-12 1997-05-13 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5489508A (en) 1992-05-13 1996-02-06 University Of Texas System Board Of Regents Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
US5837453A (en) 1992-05-13 1998-11-17 Geron Corporation Telomerase activity assays
US6235886B1 (en) 1993-09-03 2001-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of synthesis and use
IL107150A0 (en) 1992-09-29 1993-12-28 Isis Pharmaceuticals Inc Oligonucleotides having a conserved g4 core sequence
US7067497B2 (en) 1992-09-29 2006-06-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of telomere length by oligonucleotides having a G-core sequence
US6087491A (en) 1993-01-08 2000-07-11 Hybridon, Inc. Extremely high purity oligonucleotides and methods of synthesizing them using dimer blocks
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
US6350853B1 (en) 1993-04-26 2002-02-26 Peter E. Nielsen Conjugated peptide nucleic acids having enhanced cellular uptake
DE4331670A1 (de) 1993-09-17 1995-03-23 Hoechst Ag Neue Antisense-Oligonucleotide gegen HSV-1 sowie deren Herstellung
DE69434569T2 (de) 1993-10-18 2006-08-24 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research, Parkville Verfahren zur erhöhung der überlebensrate von neuronen und dafür verwendbare mittel
US5863726A (en) 1993-11-12 1999-01-26 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5599922A (en) 1994-03-18 1997-02-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties
US5726297A (en) 1994-03-18 1998-03-10 Lynx Therapeutics, Inc. Oligodeoxyribonucleotide N3' P5' phosphoramidates
JP3482209B2 (ja) 1994-03-18 2003-12-22 ジェロン・コーポレーション オリゴヌクレオチドｎ３’→ｐ５’ホスホルアミデート：合成および化合物；ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ耐性特性
GB9413035D0 (en) 1994-06-29 1994-08-17 Scras Antisense oligonucleeotides
US5583016A (en) 1994-07-07 1996-12-10 Geron Corporation Mammalian telomerase
CZ3497A3 (en) 1994-07-07 1997-10-15 Geron Corp Rna component of mammal telomerase, oligonucleotide, recombinant expression plasmid containing the oligonucleotide, process for preparing eukaryotic host cell, process for preparing a recombinant telomerase enzyme
US5958680A (en) 1994-07-07 1999-09-28 Geron Corporation Mammalian telomerase
AU4101396A (en) 1994-11-07 1996-05-31 Hybridon, Inc. Synthesis of 35s-labeled oligonucleotides with 3h-1,2-benzodithiol-3-1,1-dioxide
US5760062A (en) 1995-04-18 1998-06-02 Geron Corporation Telomerase inhibitors
US5656638A (en) 1995-04-18 1997-08-12 Geron Corporation Telomerase inhibitors
US5863936A (en) 1995-04-18 1999-01-26 Geron Corporation Telomerase inhibitors
US5840490A (en) 1995-06-07 1998-11-24 Mcmaster University Telomerase activity associated with hematological and colorectal malignancies
US5770613A (en) 1995-09-29 1998-06-23 Geron Corporation Telomerase inhibitors
US5767278A (en) 1995-10-06 1998-06-16 Geron Corporation Telomerase inhibitors
US5684143A (en) 1996-02-21 1997-11-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligo-2'-fluoronucleotide N3'->P5' phosphoramidates
US5859233A (en) 1996-02-21 1999-01-12 Lynx Therapeutics, Inc. Synthons for synthesis of oligonucleotide N3-P5 phosphoramidates
GB9606158D0 (en) 1996-03-23 1996-05-29 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
US6015710A (en) 1996-04-09 2000-01-18 The University Of Texas System Modulation of mammalian telomerase by peptide nucleic acids
AU2445997A (en) 1996-04-10 1997-10-29 Lynx Therapeutics, Inc. Telomerase inhibitors
US6111085A (en) 1996-09-13 2000-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbamate-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US6261836B1 (en) 1996-10-01 2001-07-17 Geron Corporation Telomerase
US6444650B1 (en) 1996-10-01 2002-09-03 Geron Corporation Antisense compositions for detecting and inhibiting telomerase reverse transcriptase
US6001991A (en) 1996-10-04 1999-12-14 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense oligonucleotide modulation of MDR P-glycoprotein gene expression
US5846723A (en) 1996-12-20 1998-12-08 Geron Corporation Methods for detecting the RNA component of telomerase
JP2001507229A (ja) 1996-12-20 2001-06-05 ジェロン コーポレイション テロメラーゼのｒｎａ成分を検出および阻害するための方法
US5877309A (en) 1997-08-13 1999-03-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides against JNK
US5998604A (en) 1997-09-15 1999-12-07 The Perkin-Elmer Corporation Polynucleotide purification method
JP3722630B2 (ja) 1998-10-28 2005-11-30 パイオニア株式会社 記録再生装置
US6656730B1 (en) 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
DK1210357T3 (da) 1999-09-10 2008-07-21 Geron Corp Oligonukleotid-N3' -P5' -thiophosphoramidater: syntese og anvendelse deraf
GB9927674D0 (en) * 1999-11-23 2000-01-19 Aegis Eng Ltd Protective material
US6331399B1 (en) 2000-05-16 2001-12-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of tert expression
US7563618B2 (en) 2001-03-23 2009-07-21 Geron Corporation Oligonucleotide conjugates
WO2002077184A2 (en) * 2001-03-23 2002-10-03 Geron Corporation Oligonucleotide conjugates
KR101298493B1 (ko) 2003-09-09 2013-08-21 제론 코포레이션 텔로머라제 억제를 위한 변형 올리고뉴클레오티드
US20120329858A1 (en) * 2010-08-04 2012-12-27 Geron Corporation Modified oligonucleotides for telomerase inhibition
ME02933B (me) 2004-07-02 2018-04-20 Geron Corp Sinteza zaštićenih 3'-amino nukleozionih monomera
US7427675B2 (en) * 2004-08-23 2008-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for the characterization of oligonucleotides
CA2584984A1 (en) * 2004-10-18 2006-04-27 Codon Devices, Inc. Methods for assembly of high fidelity synthetic polynucleotides
US7998938B2 (en) 2005-04-15 2011-08-16 Geron Corporation Cancer treatment by combined inhibition of proteasome and telomerase activities
US8153604B2 (en) * 2006-04-24 2012-04-10 Geron Corporation CNS-tumor treatment method and composition
EP4474480A2 (en) 2006-10-30 2024-12-11 Geron Corporation Combined telomerase inhibitor and gemcitabine for the treatment of cancer
US8785409B2 (en) * 2007-01-30 2014-07-22 Geron Corporation Compounds having anti-adhesive effects on cancer cells
US9106103B2 (en) 2011-09-23 2015-08-11 Eaton Corporation Unintteruptible power supply systems and methods employing on-demand energy storage
US9006630B2 (en) 2012-01-13 2015-04-14 Altasens, Inc. Quality of optically black reference pixels in CMOS iSoCs
US20150342982A1 (en) 2012-12-07 2015-12-03 Geron Corporation Use of Telomerase Inhibitors for the Treatment of Myeloproliferative Disorders and Myeloproliferative Neoplasms
US9375485B2 (en) 2012-12-07 2016-06-28 Geron Corporation Use of telomerase inhibitors for the treatment of myeloproliferative disorders and myeloproliferative neoplasms
JOP20200257A1 (ar) 2014-05-01 2017-06-16 Geron Corp تركيبات أوليجو نوكليوتيد وطرق لتحضيرها

Also Published As

Publication number Publication date
NZ724764A (en) 2021-02-26
JOP20200257A1 (ar) 2017-06-16
HUE064289T2 (hu) 2024-02-28
MA63525A1 (fr) 2024-09-30
CN106459134A (zh) 2017-02-22
CA2943888A1 (en) 2015-11-05
EP4286519A2 (en) 2023-12-06
CN117357548A (zh) 2024-01-09
AU2020201707A1 (en) 2020-03-26
KR102316282B1 (ko) 2021-10-25
US20220306676A1 (en) 2022-09-29
PH12016502080A1 (en) 2017-01-09
CL2016002749A1 (es) 2017-04-28
AU2020201707B2 (en) 2022-02-17
MX382233B (es) 2025-03-13
EP3137479A4 (en) 2018-02-07
EA034882B1 (ru) 2020-04-01
CN106459134B (zh) 2020-02-18
CN111228288B (zh) 2023-10-20
US9796747B2 (en) 2017-10-24
JP2018131453A (ja) 2018-08-23
CL2018001212A1 (es) 2018-08-03
FI3137479T3 (fi) 2023-11-28
KR20160147768A (ko) 2016-12-23
TWI709406B (zh) 2020-11-11
DK3137479T5 (da) 2024-10-14
BR112016025196A2 (pt) 2017-12-12
NZ763996A (en) 2021-03-26
JP2026016798A (ja) 2026-02-03
ZA202005857B (en) 2024-01-31
SG10201911086XA (en) 2020-01-30
JP2023073510A (ja) 2023-05-25
EP3137479B1 (en) 2023-08-30
TWI712413B (zh) 2020-12-11
AU2022203273A1 (en) 2022-06-02
KR20210130822A (ko) 2021-11-01
JP7308309B2 (ja) 2023-07-13
CN111228288A (zh) 2020-06-05
JP2022044679A (ja) 2022-03-17
TW201622732A (zh) 2016-07-01
EA201691786A1 (ru) 2017-04-28
US10392418B2 (en) 2019-08-27
PL3137479T3 (pl) 2024-02-26
MX2016014178A (es) 2017-05-04
IL248044A0 (en) 2016-11-30
US20180016294A1 (en) 2018-01-18
US20240150391A1 (en) 2024-05-09
HRP20231505T1 (hr) 2024-03-01
US20250011359A1 (en) 2025-01-09
PE20170147A1 (es) 2017-04-12
MX2021004932A (es) 2021-08-16
US20180016293A1 (en) 2018-01-18
BR112016025196B1 (pt) 2022-08-02
JP7040892B2 (ja) 2022-03-23
IL268570A (en) 2019-09-26
MA63525B1 (fr) 2025-02-28
US20150337314A1 (en) 2015-11-26
EA034882B9 (ru) 2020-07-13
KR20230088509A (ko) 2023-06-19
SG11201608226YA (en) 2016-10-28
SI3137479T1 (sl) 2023-11-30
US11299511B2 (en) 2022-04-12
JP7736489B2 (ja) 2025-09-09
MY196927A (en) 2023-05-11
LT3137479T (lt) 2023-10-10
JP2020050670A (ja) 2020-04-02
MY178617A (en) 2020-10-19
KR102707216B1 (ko) 2024-09-19
SMT202300405T1 (it) 2024-01-10
AU2015253158A1 (en) 2016-10-20
PT3137479T (pt) 2023-11-30
CL2018001213A1 (es) 2018-08-03
AP2016009489A0 (en) 2016-10-31
KR20240144488A (ko) 2024-10-02
US11739114B2 (en) 2023-08-29
JO3767B1 (ar) 2021-01-31
IL248044B (en) 2019-08-29
JP2017514479A (ja) 2017-06-08
AU2015253158B2 (en) 2019-12-12
WO2015168310A1 (en) 2015-11-05
ZA201606624B (en) 2020-12-23
UA126108C2 (uk) 2022-08-17
TW202017574A (zh) 2020-05-16
DK3137479T3 (da) 2023-11-20
ES2963740T3 (es) 2024-04-01
JP2021182946A (ja) 2021-12-02
IL268570B (en) 2021-10-31
EP3137479A1 (en) 2017-03-08
CL2022000202A1 (es) 2023-02-10
EP4286519A3 (en) 2024-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7736489B2 (ja) オリゴヌクレオチド組成物及びその作製方法
HK40104434A (en) Oligonucleotide compositions and methods of making the same
CA2943888C (en) Oligonucleotide compositions and methods of making the same
HK40102389A (zh) 寡核苷酸组合物及其制备方法
HK40030910A (en) Oligonucleotide compositions and methods of making the same
OA19860A (en) Oligonucleotide compositions and methods of making the same.
HK1231885B (en) Oligonucleotide compositions and methods of making the same
HK1231885A1 (en) Oligonucleotide compositions and methods of making the same
OA18106A (en) Oligonucleotide compositions and methods of making the same
EA044343B1 (ru) Неочищенная композиция полинуклеотидного соединения