ES2963740T3 - Composiciones de oligonucleótidos y procedimientos de fabricación de las mismas - Google Patents

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Abstract

La presente divulgación proporciona un método en fase sólida para preparar oligonucleótidos mediante ciclos de acoplamiento secuenciales que incluyen al menos un acoplamiento de una subunidad dímera de dinucleótido a un grupo terminal 3' libre de una cadena en crecimiento. Los oligonucleótidos incluyen al menos dos subunidades de nucleósidos unidas por un enlace fosforamidato N3'→P5'. El método puede incluir las etapas de (a) desproteger el grupo amino 3' protegido de un nucleósido terminal unido a un soporte de fase sólida, formando dicha desprotección un grupo amino 3' libre; (b) poner en contacto el grupo amino 3' libre con un dímero de amino-dinucleótido-5'-fosforamidita protegido en 3' en presencia de un catalizador nucleófilo para formar un enlace fosforamidita internucleósido N3'→P5'; y (c) oxidar (por ejemplo, sulfurar) el enlace. Las composiciones producidas mediante los métodos en cuestión pueden incluir una cantidad reducida de uno o más productos oligonucleotídicos (Nx). También se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen las composiciones de oligonucleótidos en cuestión. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones de oligonucleótidos y procedimientos de fabricación de las mismas
Introducción
La química de polímeros de ácidos nucleicos ha desempeñado un papel en muchas tecnologías en desarrollo en los campos farmacéutico, de diagnóstico y analítico, y más concretamente en los subcampos de la terapéutica antisentido y antigénica, la química combinatoria, la amplificación de señales de ADN ramificado y el diagnóstico y análisis de ADN basado en matrices. Parte de esta química de polímeros se ha dirigido a mejorar la fuerza de unión, la especificidad y la resistencia a las nucleasas de los polímeros de ácidos nucleicos naturales, tales como el ADN. Los enlaces internucleósidos de ácido nucleico peptídico (PNA), fosforotioato, metilfosfonato y fosforamidato son ejemplos de algunas químicas poliméricas que se han aplicado a los oligonucleótidos para conferirles una o más propiedades deseables, tales como la resistencia a las nucleasas, la captación celular y la solubilidad.
Los fosforamidatos N 3'^P5' de oligonucleótidos pueden formar dúplex estables con cadenas complementarias de ADN y ARN, así como tríplex estables con dúplex de ADN, y son resistentes a las nucleasas. Los tiofosforamidatos N 3'^P5' de oligonucleótidos se han usado como potentes agentes antisentido tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, los oligonucleótidos que contienen compuestos que inhiben la actividad de la telomerasa pueden usarse para tratar trastornos mediados por la telomerasa, tal como el cáncer, ya que las células cancerosas expresan actividad de la telomerasa y las células somáticas humanas normales no poseen actividad de la telomerasa a niveles biológicamente destacados. Como tales, los procedimientos de preparación y aislamiento de tales oligonucleótidos son de interés.
El documento WO 02/077184 A2 describe conjugados de oligonucleótidos.
El documento WO 97/37691 A1 describe inhibidores de la telomerasa.
Gryaznov et al., (2001) Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 20:401-410 describen y evalúan diversos fosforamidatos N 3'^P5' y tiofosforamidatos N 3'^P5' de oligonucleótidos como inhibidores potenciales de la telomerasa.
Gryaznov et al., (2003) Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 22:577-581 describen y evalúan tiofosforamidatos N 3'^P5' de oligonucleótidos como potenciales antagonistas de la plantilla telomerasa.
Sumario
Los aspectos de la invención cuya protección se solicita se definen en las reivindicaciones adjuntas. La presente divulgación describe un procedimiento en fase sólida para fabricar oligonucleótidos mediante ciclos de acoplamiento secuenciales que incluyen al menos un acoplamiento de una subunidad de dímero dinucleotídico a un grupo 3'-terminal libre (por ejemplo, un grupo 3'-hidroxilo o 3'-amino) de una cadena en crecimiento. Los procedimientos en cuestión incluyen la fabricación de oligonucleótidos en los que al menos dos de las subunidades nucleosídicas están unidas por un enlace entre subunidades de fosforamidato N3'^-P5'. El procedimiento puede incluir las etapas de (a) desproteger el grupo amino 3' protegido de un nucleósido terminal unido a un soporte en fase sólida, formando dicha desprotección un grupo amino 3' libre; (b) poner en contacto el grupo amino 3' libre con un dímero amino-dinucleótido-5'-fosforamidito 3'-protegido en presencia de un catalizador nucleofílico para formar un enlace fosforamidito N 3'^P5' internucleósido; y (c) oxidar el enlace. En algunos casos, la oxidación del enlace incluye la sulfuración para producir un enlace tiofosforamidato N 3'^P5' internucleósido.
La presente divulgación describe composiciones de oligonucleótidos producidas por los procedimientos en cuestión que incluyen una cantidad reducida de uno o más productos de oligonucleótidos (N-x). En algunos casos, la cantidad reducida es menor que (1,9 x N) partes a 100 en peso de uno o más productos (N-x) en relación con el producto N. Los oligonucleótidos preparados según los procedimientos en cuestión incluyen un oligonucleótido que tiene una secuencia de N subunidades nucleósidas complementaria al componente ARN de la telomerasa humana, en la que al menos dos de las subunidades nucleósidas están unidas por un enlace entre subunidades de tiofosforamidato N3'^P5'. También se describen composiciones farmacéuticas que incluyen las composiciones de oligonucleótidos en cuestión.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1A y 1B muestran un cromatograma HPLC (A) y espectros 31P RMN (B) para un tiofosforamidato dímero de TA (compuesto 7e, Esquema 1).
Las figuras 2A y 2B muestran un cromatograma HPLC (A) y espectros 31P RMN (B) para un tiofosforamidato dímero AA (compuesto 7a, Esquema 1).
Las figuras 3A y 3B muestran un cromatograma HPLC (A) y espectros 31P RMN (B) para un tiofosforamidato dímero de GG (compuesto 7c, Esquema 1).
Las figuras 4A y 4B muestran un cromatograma HPLC (A) y espectros 31P RMN (B) para un tiofosforamidato dímero de GT (compuesto 7d, Esquema 1).
Las figuras 5A y 5B muestran un cromatograma HPLC (A) y espectros 31P RMN (B) para un tiofosforamidato dímero de GA (compuesto 7b, Esquema 1).
Las figuras<6>A y<6>B muestran las trazas de LCMS para los amidatos dímeros TA, AA, GA, GT y GG.
La figura 7 muestra un cromatograma HPLC del producto de una síntesis a escala de 140 pmol de imetelstat usando una estrategia de acoplamiento de monómeros.
La figura<8>muestra un cromatograma HPLC del producto de una síntesis a escala de 140 pmol de imetelstat usando una estrategia de acoplamiento en bloque de dímeros.
Definiciones
Los siguientes términos tienen los siguientes significados, a menos que se indique lo contrario. Cualquier término indefinido tiene su significado reconocido por la técnica.
En la presente memoria, los términos polinucleótido y oligonucleótido se usan indistintamente. Siempre que un oligonucleótido se represente mediante una secuencia de letras, como "ATGUCCTG", se entiende que los nucleótidos están en orden 5 '^ 3 ' de izquierda a derecha y que "A" indica desoxiadenosina, "C" indica desoxicitidina, "G" indica desoxiguanosina, "T" indica timidina y "U" indica desoxiuridina, a menos que se indique lo contrario.
Como se usa en la presente memoria, "nucleósido" incluye los nucleósidos naturales, incluyendo las formas 2'-desoxi y 2'-hidroxilo, por ejemplo, como se describe en Kornberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992). En referencia a los nucleósidos, "análogos" incluye nucleósidos sintéticos con unidades estructurales de base modificadas y/o unidades estructurales de azúcar modificadas, por ejemplo, los descritos generalmente por Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, Nueva York, 1980). Tales análogos incluyen nucleósidos sintéticos diseñados para potenciar las propiedades de unión, por ejemplo, la estabilidad, la especificidad o similares, tales como los descritos por Uhlmann and Peyman (Chemical Reviews, 90:543-584, 1990). En algunas realizaciones, un nucleósido o análogo de nucleósido incluye un grupo 3'-hidroxilo o un grupo 3'-amino.
Los términos "base" y "nucleobase" se usan indistintamente y se definen en la presente memoria para incluir (i) bases convencionales de ADN y ARN (uracilo, timina, adenina, guanina y citosina), y (ii) bases modificadas o análogos de bases (por ejemplo, 5-metil-citosina, 5-bromouracilo o inosina). Un análogo de base es una sustancia química cuya estructura molecular imita la de una base convencional de ADN o ARN.
Como se usa en la presente memoria, "pirimidina" significa las pirimidinas presentes en nucleósidos naturales, incluyendo citosina, timina y uracilo, y análogos comunes de los mismos, tales como los que contienen sustituyentes oxi, metilo, propinilo, metoxi, hidroxilo, amino, tio, halo y similares. El término, como se usa en la presente memoria, incluye además pirimidinas con grupos de protección comunes unidos, tales como N4-benzoilcitosina. Otros grupos de protección de pirimidina comunes se describen en Beaucage and lyer Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992).
Como se usa en la presente memoria, "purina" significa las purinas que ocurren en nucleósidos naturales, incluyendo adenina, guanina e hipoxantina, y análogos comunes de los mismos, tales como los que contienen sustituyentes oxi, metilo, propinilo, metoxi, hidroxilo, amino, tio, halo y similares. El término, como se usa en la presente memoria, incluye además purinas con grupos de protección comunes unidos, tales como N2-benzoilguanina, N<2>‘isobutirilguanina, N6‘benzoiladenina y similares. Otros grupos de protección de purinas comunes se describen en Beaucage and lyer Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992). Como se usa en la presente memoria, el término "-protegido-" como componente de un nombre químico se refiere a grupos de protección reconocidos en la técnica para una unidad estructural particular de un compuesto, por ejemplo, "5'-protegidohidroxilo" en referencia a un nucleósido incluye trifenilmetilo (es decir, tritilo), p-anisildifenilmetilo (es decir, monometoxitritilo o MMT), di-p-anisilfenilmetilo (es decir, dimetoxitritilo o DMT), y similares; y una nucleobase protegida en referencia a una nucleobase que incluye un heteroátomo protegido con un grupo tal como dimetilaminoformamidina (DMF), benzoilo (Bz), isobutirilo, y similares. Los grupos de protección reconocidos por la técnica incluyen los descritos en las siguientes referencias: Gait, editor, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984); Amarnath and Broom, Chemical Reviews, 77:183-217, 1977; Pon et al., Biotechniques, 6:768-775, 1988; Ohtsuka et al, Nicleic Acids Research, 10:6553-6570, 1982; Eckstein, editor, Oligonucleotides. and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991), Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, segunda edición, (John Wiley & Sons, Nueva York, 1991), Narang, editor, Synthesis and Applications of DNA and RNA (Academic Press, Nueva York, 1987), Beaucage and lyer Tetrahedron 48: 2223 2311 (1992), y referencias similares.
Como se usa en la presente memoria, " fosforamidato N3'^-P5' de oligonucleótido" significa un oligómero, generalmente lineal, de subunidades nucleosídicas unidas por al menos un enlace fosforamidato N3'^-P5'. En términos generales, las subunidades nucleosídicas comprenden nucleósidos o análogos de nucleósidos, pero también pueden comprender unidades estructurales más generales con química compatible, tales como azúcares abásicos y otras unidades estructurales hidrocarburo, tales como las descritas en las referencias siguientes: Newton et al., Nucleic Acids Research, 21: 1155-1162 (1993); Griffin et al, J. Am. Chem. Soc., 114: 7976-7982 (1992); Jaschke et al, Tetrahedron Letters, 34: 301-304 (1992); Ma et al., solicitud internacional PCT/CA92/00423; Zon et al., solicitud internacional PCT/US90/06630; Durand et al., Nucleic Acids Research, 18: 6353-6359 (1990); Salunkhe et al., J. Am. Chem. Soc., 114: 8768-8772 (1992); y similares. En algunos casos, el término se refiere a un oligonucleótido en el que todos los enlaces internucleosídicos se sustituyen por enlaces de fosforamidato N3'^-P5', es decir, el término comprende oligómeros parcial o totalmente "amidados". En algunos casos, significa un oligonucleótido en el que todos los enlaces internucleosídicos se sustituyen por enlaces de fosforamidato N3'^-P5' y en el que las subunidades nucleosídicas son los nucleósidos naturales o análogos de los mismos. Un fosforamidato N3'^-P5' de oligonucleótido en cuestión en el que cada enlace es un enlace fosforamidato N3'^-P5' ("totalmente amidado") puede incrustarse o unirse a otros oligonucleótidos o polinucleótidos para formar un oligómero mayor que esté "parcialmente amidado." Un fosforamidato N3'^-P5' de oligonucleótido en cuestión puede incluir cualquier grupo terminal 3' y/o 5' conveniente. En algunas realizaciones, el fosforamidato N3'^-P5' de oligonucleótido incluye un grupo terminal 3'-hidroxilo o un grupo terminal 3'-amino.
Como se usan en la presente memoria, los términos "fosfato" y "grupo fosfato" abarcan un grupo tiofosfato y un grupo oxofosfato.
Como se usa en la presente memoria, el término "grupo amino fosforamidita" se refiere al grupo amino, -NR<4>R<5>, unido al átomo de fósforo de un grupo fosforamidita, y el término "nitrógeno fosforamidita" se refiere al átomo de nitrógeno del grupo amino fosforamidita.
"Alquilo" se refiere a grupos hidrocarbilo alifáticos saturados monovalentes que tienen desde 1 a 10 átomos de carbono y tales como de<1>a<6>átomos de carbono (por ejemplo, "un alquilo de<1>a<6>átomos de carbono"), o de<1>a 5 (por ejemplo, "un alquilo de 1a 5 átomos de carbono"), o de 1 a 4 (por ejemplo, "un alquilo de 1 a 4 átomos de carbono"), o de 1 a 3 átomos de carbono (por ejemplo, "un alquilo de 1 a 3 átomos de carbono"). Este término incluye, a modo de ejemplo, grupos hidrocarbilo lineales y ramificados como metilo (CH<3>-), etilo (CH<3>CH<2>-), npropilo (CH<3>CH<2>CH<2>-), isopropilo ((CH<3>)<2>CH-), n-butilo (CH<3>CH<2>CH<2>CH<2>-), isobutilo ((CH<3>)<2>CHCH<2>-), sec-butilo ((CH<3>)(CH<3>CH<2>)CH-), t-butilo ((CH<3>)<3>C-), n-pentilo (CH<3>CH<2>CH<2>CH<2>CH<2>-), y neopentilo ((CH<3>)<3>CCH<2>-).
El término "alquilo sustituido" se refiere a un grupo alquilo como se define en la presente memoria en el que uno o más átomos de carbono de la cadena alquilo se han sustituido opcionalmente por un heteroátomo tal como -O-, -N-, -S-, -S(O)n- (donde n es 0 a 2), -NR- (donde R es hidrógeno o alquilo) y que tiene desde 1 a 5 sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alcoxi, alcoxi sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, acilo, acilamino, aciloxi, amino, aminoacilo, aminoaciloxi, oxiaminoacilo, azido, ciano, halógeno, hidroxilo, oxo, tioceto, carboxilo, carboxilalquilo, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheterociclooxi, tiol, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, heterocíclico, heterociclooxi, hidroxiamino, alcoxiamino, nitro, -SO-alquilo, -SO-arilo, -SO-heteroarilo,-SO<2>-alquilo, -SO<2>-arilo, -SO<2>-heteroarilo y -NRaRb, en el que Ra y Rb pueden ser iguales o diferentes y se eligen entre hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo y heterocíclico. En algunos casos, un "alquilo sustituido" se refiere a un grupo alquilo como se define en la presente memoria que tiene desde 1 a 5 sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alcoxi, cicloalquilo, cicloalquenilo, acilo, acilamino, aciloxi, amino, aminoacilo, aminoaciloxi, oxiaminoacilo, azido, ciano, halógeno, hidroxilo, carboxilo, carboxilalquilo, tiol, tioalcoxi, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, heterocíclico, heterociclooxi, sulfonamido y -NRaRb, en el que Ra y Rb pueden ser iguales o diferentes y se eligen entre hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo y heterocíclico.
"Alquileno" se refiere a grupos hidrocarbilo alifáticos divalentes que tienen preferiblemente desde 1 a<6>y más preferiblemente de 1 a 3 átomos de carbono que son de cadena lineal o ramificada, y que están opcionalmente interrumpidos con uno o más grupos seleccionados entre -O-, -NR<10>-, -NR<10>C(O)-, -C(O)NR<10>-y similares. Este término incluye, a modo de ejemplo, metileno (-CH<2>-), etileno (-CH<2>CH<2>-), n-propileno (-CH<2>CH<2>CH<2>-), iso-propileno (-CH<2>CH(CH<3>)-), (-C(CH<3>)<2>CH<2>CH<2>-), (-C(CH<3>)<2>CH<2>C(O)-), (-C(CH<3>)<2>CH<2>C(O)NH-), (-CH(CH<3>)CH<2>-), y similares.
"Alquileno sustituido" se refiere a un grupo alquileno que tiene desde 1 a 3 hidrógenos sustituidos con sustituyentes como se describe para los carbonos en la definición de "sustituido" a continuación.
El término "alcano" se refiere al grupo alquilo y al grupo alquileno, como se definen en la presente memoria.
El término "alquilaminoalquilo", "alquilaminoalquenilo" y "alquilaminoalquinilo" se refiere a los grupos R NHR -donde R' es un grupo alquilo como se define en la presente memoria y R" es un grupo alquileno, alquenileno o alquinileno como se define en la presente memoria.
El término "alcarilo" o "aralquilo" se refiere a los grupos -alquileno-arilo y -alquileno-arilo sustituido, donde alquileno, alquileno sustituido y arilo se definen en la presente memoria.
"Alcoxi" se refiere al grupo -O-alquilo, en el que el alquilo es como se define en la presente memoria. Alcoxi incluye, a modo de ejemplo, metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, t-butoxi, sec-butoxi, n-pentoxi y similares. El término "alcoxi" también se refiere a los grupos alquenilo-O-, cicloalquilo-O-, cicloalquenilo-O-y alquinilo-O-, donde alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo y alquinilo son como se definen en la presente memoria.
El término "alcoxi sustituido" se refiere a los grupos alquil-O- sustituido, alquenil-O- sustituido, cicloalquil-O-sustituido, cicloalquenil-O- sustituido y alquinilo-O- sustituido donde alquilo sustituido, alquenilo sustituido, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo sustituido y alquinilo sustituido son como se definen en la presente memoria.
El término "alcoxiamino" se refiere al grupo -NH-alcoxi, en el que alcoxi se define en la presente memoria.
El término "haloalcoxi" se refiere a los grupos alquilo-O- en los que uno o más átomos de hidrógeno en el grupo alquilo han sido sustituidos con un grupo halo e incluyen, a modo de ejemplo, grupos tales como trifluorometoxi, y similares.
El término "haloalquilo" se refiere a un grupo alquilo sustituido como se ha descrito anteriormente, en el que uno o más átomos de hidrógeno del grupo alquilo han sido sustituidos con un grupo halo. Ejemplos de tales grupos incluyen, sin limitación, grupos fluoroalquilo, tales como trifluorometilo, difluorometilo, trifluoroetilo y similares.
El término "alquilalcoxi" se refiere a los grupos -alquileno-O-alquilo, alquileno-O-alquilo sustituido, alquileno sustituido-O-alquilo y alquileno sustituido-O-alquilo sustituido, en los que alquilo, alquilo sustituido, alquileno y alquileno sustituido son como se definen en la presente memoria.
El término "alquiltioalcoxi" se refiere al grupo -alquileno-S-alquilo, alquileno-S-alquilo sustituido, alquileno sustituido-S-alquilo y alquileno sustituido-S-alquilo sustituido en el que alquilo, alquilo sustituido, alquileno y alquileno sustituido son como se definen en la presente memoria.
"Alquenilo" se refiere a grupos hidrocarbilo de cadena lineal o ramificada que tienen de 2 a<6>átomos de carbono y preferentemente de 2 a 4 átomos de carbono y que tienen al menos 1 y preferentemente desde 1 a 2 sitios de insaturación de doble enlace. Este término incluye, a modo de ejemplo, el bi-vinilo, el alilo y el bu-3-en-1-ilo. Dentro de este término se incluyen los isómeros cis y trans o las mezclas de estos isómeros.
El término "alquenilo sustituido" se refiere a un grupo alquenilo como se define en la presente memoria que tiene desde 1 a 5 sustituyentes, o desde 1 a 3 sustituyentes, seleccionados de alcoxi, alcoxi sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, acilo, acilamino, aciloxi, amino, amino sustituido, aminoacilo, aminoaciloxi, oxiaminoacilo, azido, ciano, halógeno, hidroxilo, oxo, tioceto, carboxilo, carboxilalquilo, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheterociclooxi, tiol, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, heterocicloxilo, heterociclooxi, hidroxiamino, alcoxiamino, nitro, -SO-alquilo, -SO-alquilo sustituido, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO<2>-alquilo, -SO<2>-alquilo sustituido,-SO<2>-arilo y-SO<2>-heteroarilo.
"Alquinilo" se refiere a grupos hidrocarbilo monovalentes lineales o ramificados que tienen desde 2 a<6>átomos de carbono y preferentemente desde 2 a 3 átomos de carbono y que tienen al menos 1 y preferentemente desde 1 a 2 sitios de insaturación de triple enlace. Ejemplos de tales grupos alquinilo incluyen acetilenilo (-C=CH), y propargilo (-CH<2>CECH).
El término "alquinilo sustituido" se refiere a un grupo alquinilo como se define en la presente memoria que tiene desde 1 a 5 sustituyentes, o desde 1 a 3 sustituyentes, seleccionados de alcoxi, alcoxi sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, acilo, acilamino, aciloxi, amino, amino sustituido, aminoacilo, aminoaciloxi, oxiaminoacilo, azido, ciano, halógeno, hidroxilo, oxo, tioceto, carboxilo, carboxilalquilo, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheterociclooxi, tiol, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, heterocicloxilo, heterociclooxi, hidroxiamino, alcoxiamino, nitro, -SO-alquilo, -SO-alquilo sustituido, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO<2>-alquilo, -SO<2>-alquilo sustituido, -SO<2>-arilo, y- SO<2>-heteroarilo.
"Alquiniloxi" se refiere al grupo -O-alquinilo, en el que el alquinilo es como se define en la presente memoria. El alquinoxi incluye, a modo de ejemplo, el etiloxi, el propinotiloxi y similares.
"Acilo" se refiere a los grupos H-C(O)-, alquilo-C(O)-, alquilo-C(O)- sustituido, alquenilo-C(O)-, alquenilo-C(O)-sustituido, alquinilo-C(O)-, alquinilo-C(O)-sustituido, cicloalquilo-C(O)-, cicloalquilo-C(O)-sustituido, cicloalquenilo-C(O)-, cicloalquenilo-C(O)-, cicloalquenilo-C(O)- sustituido, arilo-C(O)-, arilo-C(O)- sustituido, heteroarilo-C(O)-, heteroarilo-C(O)- sustituido, heterocíclico-C(O)- y heterocíclico-C(O)- sustituido, en los que alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido son como se definen en la presente memoria. Por ejemplo, el acilo incluye el grupo "acetilo" CHaC(O)-
"Acilamino" se refiere a los grupos -NR<20>C(O)alquilo, -NR<20>C(O)alquilo sustituido, NR<20>C(O)cicloalquilo, -NR<20>C(O)cicloalquilo sustituido, -NR<20>C(O)cicloalquenilo, -NR<20>C(O)cicloalquenilo sustituido, -NR<20>C(O)alquenilo, -NR<20>C(O)alquenilo sustituido, -NR<20>C(O)alquinilo,-NR<20>C(O)alquinilo sustituido, -NR<20>C(O)arilo, -NR<20>C(O)arilo sustituido, -NR<20>C(O)heteroarilo,-NR<20>C(O)heteroarilo sustituido, -NR<20>C(O)heterocíclico y -NR<20>C(O)heterocíclico sustituido, en los que R<20>es hidrógeno o alquilo y en los que alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido son como se definen en la presente memoria.
"Aminocarbonilo" o el término "aminoacil" se refiere al grupo -C(O)NR<21>R<22>en el que R<21>y R<22>independientemente se seleccionan del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, y heterocíclico sustituido, y en el que R<21>y R<22>se unen opcionalmente con el nitrógeno ligado a ellos para formar un grupo heterocíclico o heterocíclico sustituido, y en el que alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido son como se definen en la presente memoria.
"Aminocarbonilamino" se refiere al grupo -NR<21>C(O)NR<22>R<23>donde R<21>, R<22>, y R<23>se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo, arilo o cicloalquilo, o donde dos grupos R se unen para formar un grupo heterocíclico.
El término "alcoxicarbonilamino" se refiere al grupo -NRC(O)OR donde cada R es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, heteroarilo o heterocíclico donde alquilo, alquilo sustituido, arilo, heteroarilo y heterocíclico son como se definen en la presente memoria.
El término "aciloxi" se refiere a los grupos alquilo-C(O)O-, alquilo-C(O)O- sustituido, cicloalquilo-C(O)O-, cicloalquilo-C(O)O-sustituido, arilo-C(O)O-, heteroarilo-C(O)O- y heterocíclico-C(O)O-, en los que alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, heteroarilo y heterocíclico son como se definen en la presente memoria.
"Aminosulfonilo" se refiere al grupo -SO<2>NR<21>R<22>, en el que R<21>y R<22>independientemente se seleccionan del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, y donde R<21>y R<22>se unen opcionalmente con el nitrógeno ligado a ellos para formar un grupo heterocíclico o heterocíclico sustituido, y alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido son como se definen en la presente memoria.
"Sulfonilamino" se refiere al grupo -NR<21>SO<2>R<22>, en el que R<21>y R<22>independientemente se seleccionan del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, y heterocíclico sustituido, y donde R<21>y R<22>se unen opcionalmente con los átomos unidos a ellos para formar un grupo heterocíclico o heterocíclico sustituido, y en el que alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido son como se definen en la presente memoria.
"Arilo" o "Ar" se refiere a un grupo carbocíclico aromático monovalente de<6>a 18 átomos desde carbono que tiene un solo anillo (tal como el presente en un grupo fenilo) o un sistema de anillos que tiene múltiples anillos condensados (ejemplos de tales sistemas de anillos aromáticos incluyen el naftilo, el antrilo y el indanilo) cuyos anillos condensados pueden o no ser aromáticos, siempre que el punto de unión sea a través de un átomo de un anillo aromático. Este término incluye, a modo de ejemplo, el fenilo y el naftilo. Salvo que la definición del sustituyente arilo establezca otra cosa, tales grupos arilo pueden estar opcionalmente sustituidos con 1 a 5 sustituyentes, o con 1 a 3 sustituyentes, seleccionados entre aciloxi, hidroxi, tiol, acilo, alquilo, alcoxi, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, alquilo sustituido, alcoxi sustituido, alquenilo sustituido, alquinilo sustituido, cicloalquilo sustituido, amino, amino sustituido, aminoacilo, acilamino, alcarilo, arilo, ariloxi, azido, carboxilo, carboxilalquilo, ciano, halógeno, nitro, heteroarilo, heteroariloxi, heterociclilo, heterociclooxi, aminoaciloxi, oxaciloamino, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, tioariloxi, tioheteroariloxi, -SO-alquilo, -SO-alquilo sustituido, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO<2>-alquilo, -SO<2>-alquilo sustituido, -SO<2>-arilo, -SO<2>-heteroarilo y trihalometilo. En tales casos, un grupo arilo que está sustituido con entre 1 y 5 sustituyentes (por ejemplo, como se describe en la presente memoria) se denomina "arilo sustituido".
"Ariloxi" se refiere al grupo -O-arilo, en el que arilo es como se define en la presente memoria, incluyendo, a modo de ejemplo, fenoxi, naftoxi, y similares, incluyendo grupos arilo opcionalmente sustituidos como también se define en la presente memoria.
"Amino" se refiere al grupo -NH<2>.
El término "amino sustituido" se refiere al grupo -NRR donde cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, heteroarilo y heterocíclico siempre que al menos un R no sea hidrógeno.
El término "azido" se refiere al grupo -N<3>.
"Carboxilo", "carboxi" o "carboxilato" se refiere a -CO<2>H o sales de los mismos.
"Éster carboxílico" o "éster carboxi" o los términos "carboxialquilo" o "carboxialquilo" se refieren a los grupos -C(O)O-alquilo, -C(O)O-sustituido
alquilo, -C(O)O-alquenilo, -C(O)O-alquenilo sustituido, -C(O)O-alquinilo, -C(O)O-alquinilo sustituido, -C(O)O-arilo, -C(O)O-arilo sustituido, -C(O)O-cicloalquilo, -C(O)O-cicloalquilo sustituido, -C(O)O-cicloalquenilo, -C(O)O-cicloalquenilo sustituido, -C(O)O-heteroarilo, -C(O)O-heteroarilo sustituido, -C(O)O-heterocíclico y -C(O)O-heterocíclico sustituido, en el que alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido son como se definen en la presente memoria.
"(Éster carboxílico)oxi" o "carbonato" se refiere a los grupos -O-C(O)O-alquilo, -O-C(O)O-alquilo sustituido, -O-C(O)O-alquenilo, -O-C(O)O-alquenilo sustituido, -O-C(O)O-alquinilo, -O-C(O)O-alquinilo sustituido, -O-C(O)O-arilo, -O-C(O)O-arilo sustituido, -O-C(O)O-cicloalquilo, -O-C(O)O-cicloalquilo sustituido, -O-C(O)O-cicloalquenilo, -O-C(O)O-cicloalquenilo sustituido, -O-C(O)O-heteroarilo, -O-C(O)O-heteroarilo sustituido, -O-C(O)O-heterocíclico sustituido y -O-C(O)O-heterocíclico sustituido, en los que alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido son como se definen en la presente memoria.
"Ciano" o "nitrilo" se refiere al grupo -CN.
"Cicloalquilo" se refiere a grupos alquilo cíclicos de 3 a 10 átomos de carbono con anillos cíclicos simples o múltiples, incluidos sistemas de anillos fusionados, en puente y espiro. Ejemplos de grupos cicloalquilo apropiados incluyen, por ejemplo, adamantilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclooctilo y similares. Tales grupos cicloalquilo incluyen, a modo de ejemplo, estructuras de anillo simple tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclooctilo y similares, o estructuras de anillo múltiple tales como adamantanilo y similares.
El término "cicloalquilo sustituido" se refiere a grupos cicloalquilo que tienen de 1 a 5 sustituyentes, o de 1 a 3 sustituyentes, seleccionados de alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, acilo, acilamino, aciloxi, amino, amino sustituido, aminoacilo, aminoaciloxi, oxiaminoacilo, azido, ciano, halógeno, hidroxilo, oxo, tioceto, carboxilo, carboxilalquilo, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheterociclooxi, tiol, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, heterociclilo, heterociclooxi, hidroxiamino, alcoxiamino, nitro, -SO-alquilo, -SO-alquilo sustituido, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO<2>-alquilo, -SO<2>-alquilo sustituido, -SO<2>-arilo y -SO<2>-heteroarilo.
"Cicloalquenilo" se refiere a grupos alquilo cíclicos no aromáticos desde 3 a 10 átomos de carbono con anillos simples o múltiples y con al menos un doble enlace y preferentemente desde<1>a<2>dobles enlaces.
El término "cicloalquenilo sustituido" se refiere a grupos cicloalquenilo que tienen desde 1 a 5 sustituyentes, o desde 1 a 3 sustituyentes, seleccionados entre alcoxi, alcoxi sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, acilo, acilamino, aciloxi, amino, amino sustituido, aminoacilo, aminoaciloxi, oxiaminoacilo, azido, ciano, halógeno, hidroxilo, ceto, tioceto, carboxilo, carboxilalquilo, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheterociclooxi, tiol, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, heterocicloxilo, heterociclooxi, hidroxiamino, alcoxiamino, nitro, -SO-alquilo, -SO-alquilo sustituido, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO<2>-alquilo, -SO<2>-alquilo sustituido, -SO<2>-arilo y -SO<2>-heteroarilo.
"Cicloalquilo" se refiere a grupos cicloalquilo no aromáticos desde 5 a 10 átomos de carbono con anillos simples o múltiples y que tienen al menos un triple enlace.
"Cicloalcoxi" se refiere a -O-cicloalquilo.
"Cicloalquiloxi" se refiere a -O-cicloalquenilo.
"Halo" o "halógeno" se refiere a flúor, cloro, bromo y yodo.
"Hidroxi" o "hidroxilo" se refiere al grupo -OH.
"Heteroarilo" se refiere a un grupo aromático desde 1 a 15 átomos de carbono, tal como desde 1 a 10 átomos de carbono y de<1>a<10>heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno y azufre dentro del anillo. Tales grupos heteroarilo pueden tener un solo anillo (tal como, piridinilo, imidazolilo o furilo) o múltiples anillos condensados en un sistema de anillos (por ejemplo, en grupos tales como, indolizinilo, quinolinilo, benzofurano, bencimidazolilo o benzotienilo), en los que al menos un anillo dentro del sistema de anillos es aromático y al menos un anillo dentro del sistema de anillos es aromático, siempre que el punto de unión sea a través de un átomo de un anillo aromático. En determinadas realizaciones, los átomos de anillo de nitrógeno y/o azufre del grupo heteroarilo se oxidan opcionalmente para proporcionar las unidades estructurales N-óxido (N ^O ), sulfinilo o sulfonilo. Este término incluye, a modo de ejemplo, piridinilo, pirrolilo, indolilo, tiofenilo y furanilo. A menos que la definición del sustituyente heteroarilo limite lo contrario, dichos grupos heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos con 1 a 5 sustituyentes, o desde 1 a 3 sustituyentes, seleccionados de entre aciloxi, hidroxi, tiol, acilo, alquilo, alcoxi, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, alquilo sustituido, alcoxi sustituido, alquenilo sustituido, alquinilo sustituido, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo sustituido, amino, amino sustituido, aminoacilo, acilamino, alcarilo, arilo, ariloxi, azido, carboxilo, carboxilalquilo, ciano, halógeno, nitro, heteroarilo, heteroariloxi, heterociclilo, heterociclooxi, aminoaciloxi, oxiacilamino, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, tioariloxi, tioheteroariloxi, -SO alquilo, -SO-alquilo sustituido, -SO-arilo, -SO-heteroarilo,-SO<2>-alquilo, -SO<2>-alquilo sustituido,-SO<2>-arilo y -SO<2>-heteroarilo, y trihalometilo. En tales casos, un grupo heteroarilo sustituido con entre 1 y 5 sustituyentes (por ejemplo, como se describe en la presente memoria) se denomina "heteroarilo sustituido".
El término "heteroaralquilo" se refiere a los grupos -alquileno-heteroarilo donde alquileno y heteroarilo se definen en la presente memoria. Este término incluye, a modo de ejemplo, piridilmetilo, piridiletilo, indolilmetilo y similares.
"Heteroariloxi" se refiere a -O-heteroarilo.
"Heterociclo", "heterocíclico", "heterocicloalquilo" y "heterocíclico" se refieren a un grupo saturado o insaturado con un único anillo o múltiples anillos condensados, incluidos sistemas de anillos espiro y con puentes fusionados, y que tiene desde 3 a 20 átomos de anillo, incluidos de 1 a 10 heteroátomos. Estos átomos de anillo se seleccionan del grupo que consiste en nitrógeno, azufre u oxígeno, en el que, en los sistemas de anillo fusionado, uno o más de los anillos pueden ser cicloalquilo, arilo o heteroarilo, siempre que el punto de unión sea a través del anillo no aromático. En determinadas realizaciones, los átomos de nitrógeno y/o azufre del grupo heterocíclico se oxidan opcionalmente para proporcionar las unidades estructurales N-óxido, -S(O)-, o -SO<2>-.
Ejemplos de heterociclos y heteroarilos incluyen, pero no se limitan a, azetidina, pirrol, imidazol, pirazol, piridina, pirazina, pirimidina, piridazina, indolizina, isoindol, indol, dihidroindol, indazol, purina, quinolizina, isoquinolina, quinolina, ftalazina, naftilpiridina, quinoxalina, quinazolina, cinolina, pteridina, carbazol, carbolina, fenantridina, acridina, fenantrolina, isotiazol, fenazina, isoxazol, fenoxazina, fenotiazina, imidazolidina, imidazolina, piperidina, piperazina, indolina, ftalimida, 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina, 4,5,6,7-tetrahidrobenzo[b]tiofeno, tiazol, tiazolidina, tiofeno, benzo[b]tiofeno, morfolinilo, tiomorfolinilo (también denominado tiamorfolinilo),<1>,<1>-dioxtiomorfolinilo, piperidinilo, pirrolidina, tetrahidrofuranoilo y similares.
A menos que la definición del sustituyente heterocíclico limite lo contrario, tales grupos heterocíclicos pueden estar opcionalmente sustituidos con 1 a 5, o desde 1 a 3 sustituyentes, seleccionados entre alcoxi, alcoxi sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, acilo, acilamino, aciloxi, amino, amino sustituido, aminoacilo, aminoaciloxi, oxiaminoacilo, azido, ciano, halógeno, hidroxilo, oxo, tioceto, carboxilo, carboxilalquilo, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheterociclooxi, tiol, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, heterocicloxi, heterociclooxi, hidroxiamino, alcoxiamino, nitro, -SO-alquilo, -SO-alquilo sustituido, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO<2>-alquilo, -SO<2>-alquilo sustituido, -SO<2>-arilo, -SO<2>-heteroarilo y heterociclo fusionado.
"Heterocicliloxi" se refiere al grupo -O-heterociciclilo.
El término "heterocicliltio" se refiere al grupo heterocíclico-S-.
El término "heterocicleno" se refiere al grupo diradical formado a partir de un heterociclo, como se define en la presente memoria.
El término "hidroxiamino" se refiere al grupo -NHOH.
"Nitro" se refiere al grupo -NO<2>.
"Oxo" se refiere al átomo (=O).
"Sulfonilo" se refiere al grupo SO<2>-alquilo, SO<2>-alquilo sustituido, SO<2>-alquenilo, SO<2>-alquenilo sustituido, SO<2>-cicloalquilo, SO<2>-cicloalquilo sustituido, SO<2>-cicloalquenilo, SO<2>-cicloalquenilo sustituido, SO<2>-cicloalquenilo sustituido, SO<2>-arilo, SO<2>-arilo sustituido, SO<2>-heteroarilo, SO<2>-heteroarilo sustituido, SO<2>-heterocíclico, y SO<2>-heterocíclico sustituido , en los que alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido son como se definen en la presente memoria. El sulfonilo incluye, a modo de ejemplo, metil-SO<2>- , fenil-SO<2>- y<4>-metilfenil-SO2-.
"Sulfoniloxi" se refiere al grupo-OSO<2>-alquilo, OSO<2>-alquilo sustituido, OSO<2>-alquenilo, OSO<2>-alquenilo sustituido, OSO<2>-cicloalquilo, OSO<2>-cicloalquilo sustituido, OSO<2>-cicloalquenilo, OSO<2>-cicloalquenilo sustituido, OSO<2>-arilo, OSO<2>-arilo sustituido, OSO<2>-heteroarilo, OSO<2>-heteroarilo sustituido, OSO<2>-heterocíclico, y OSO<2>-heterocíclico sustituido, en los que alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido son como se definen en la presente memoria.
El término "aminocarboniloxi" se refiere al grupo -OC(O)NRR donde cada R es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, heteroarilo o heterocíclico donde alquilo, alquilo sustituido, arilo, heteroarilo y heterocíclico son como se definen en la presente memoria.
"Tiol" se refiere al grupo -SH.
"Tioxo" o el término "tioceto" se refiere al átomo (=S).
"Alquiltio" o el término "tioalcoxi" se refiere al grupo -S-alquilo, en el que el alquilo es como se define en la presente memoria. En determinadas realizaciones, el azufre puede oxidarse a -S(O)-. El sulfóxido puede existir como uno o más estereoisómeros.
El término "tioalcoxi sustituido" se refiere al grupo -S-alquilo sustituido.
El término "tioariloxi" se refiere al grupo arilo-S- en el que el grupo arilo es como se define en la presente memoria, incluidos los grupos arilo opcionalmente sustituidos también definidos en la presente memoria.
El término "tioheteroariloxi" se refiere al grupo heteroarilo-S- en el que el grupo heteroarilo es como se define en la presente memoria, incluidos los grupos arilo opcionalmente sustituidos como también se define en la presente memoria.
El término "tioheterociclooxi" se refiere al grupo heterocíclico-S- en el que el grupo heterocíclico es como se define en la presente memoria, incluidos los grupos heterocíclico opcionalmente sustituidos como también se define en la presente memoria.
Además de lo divulgado en la presente memoria, el término "sustituido", cuando se usa para modificar un grupo o radical especificado, también puede significar que uno o más átomos de hidrógeno del grupo o radical especificado se reemplazan, cada uno independientemente del otro, con el mismo o diferentes grupos sustituyentes como se define a continuación.
Además de los grupos divulgados con respecto a los términos individuales en la presente memoria, los grupos sustituyentes para sustituir uno o más hidrógenos (cualquiera de dos hidrógenos en un único carbono pueden reemplazarse con =O, =NR70, =N-OR70, =N<2>o =S) en átomos de carbono saturados en el grupo o radical especificado son, a menos que se especifique otra cosa, -R60, halo, =O, -OR70, -SR70, -NR80R80, trihalometilo, -CN, -OCN, -SCN, -NO, -NO<2>, =N<2>, -N<3>, -SO<2>R<70>, -SO<2>O-M+, -SO<2>OR<70>, -OSO<2>R<70>, -OSO<2>O'M+, -OSO<2>OR<70>, -P(O)(O‘ )2(M+)2, -P(O)(OR70)O-M+, -P(O)(OR70)2, -C(O)R70, -C(S)R70, -C(NR70)R70, -C(O)O-M+, -C(O)OR70, -C(S)OR70, -C(O)NR80R80, -C(NR70)NR80R80, -OC(O)R70, -OC(S)R70, -OC(O)O 'M+, -OC(O)OR70, -OC(S)OR70, -NR70C(O)R70, -NR70C(S)R70, -NR70CO2'M+, -NR70CO2R70, -NR70C(S)OR70, -NR70C(O)NR80R80, -NR70C(NR70)R70
y -NR70C(NR70)NR80R80, donde R60 se selecciona del grupo que consiste en alquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquiloalquilo, arilo, arilalquilo, heteroarilo y heteroariloalquilo opcionalmente sustituido, cada R70 es independientemente hidrógeno o R60; cada R80es independientemente R70 o, alternativamente, dos R80, tomados junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un heterocicloalquilo de 5-,<6>- o 7-miembros que puede incluir opcionalmente desde 1 a 4 heteroátomos adicionales iguales o diferentes seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, de los cuales N puede tener sustitución -H o alquilo C<1>-C<3>; y cada M+ es un contraión con una sola carga positiva neta. Cada M+ puede ser independientemente, por ejemplo, un ion alcalino, tal como K+, Na+, Li+; un ion amonio, tal como N(R60)<4>; o un ion alcalinotérreo, tal como [Ca2+]<0.5>, [Mg2+]<0.5>, o [Ba2+]<0.5>("el subíndice 0.5 significa que uno de los iones contadores para dichos iones alcalinotérreos divalentes puede ser una forma ionizada de un compuesto como el descrito en la presente memoria y el otro un ion contador como el cloruro, o dos compuestos ionizados divulgados en la presente memoria pueden servir como iones contadores para tales iones alcalinotérreos divalentes, o un compuesto doblemente ionizado como el descrito en la presente memoria puede servir como ion contador para dichos iones alcalinotérreos divalentes). Como ejemplos específicos, -NR80R80 incluye NH<2>, -NH-alquilo, W-pirrolidinilo, W-piperazinilo, 4W-metil-piperazin-1-ilo y W-morfolinilo.
Además de lo divulgado en la presente memoria , los grupos sustituyentes para hidrógenos en átomos de carbono insaturados en grupos alqueno, alquino, arilo y heteroarilo "sustituidos" son, a menos que se especifique lo contrario, -R60, halo, -O‘M+, -OR70, -SR70, -S‘M+, -NR80R80, trihalometilo, -CF<3>, -CN, -OCN, -SCN, -NO, -NO<2>, -N<3>, -SO<2>R<70>, -SO<3>-M+, -SO<3>R<70>, -OSO<2>R<70>, -OSO<3>-M+, -OSO<3>R<70>, -PO<3>'2(M+)<2>, -P(O)(OR70)O'M+, -P(O)(OR70)<2>, -C(O)R70, -C(S)R70, -C(NR70)R70, -CO2-M+, -CO2R70, -C(S)OR70, -C(O)NR80R80, -C(NR70)NR80R80, -OC(O)R70, -OC(S)R70, -OCO<2>-M+, -OCO<2>R<70>, -OC(S)OR70, -NR70C(O)R70, -NR70C(S)R70, -NR70CO<2>'M+, -NR70CO<2>R70, -NR70C(S)OR70, -NR70C(O)NR80R80, -NR70C(NR70)R70 y -NR70C(NR70)NR80R80, donde R60, R70, R80 y M+ son como se han definido anteriormente, siempre que en caso de alqueno o alquino sustituido, los sustituyentes no sean -O'M+, -OR70, -SR70, o -S'M+.
Además de los grupos divulgados con respecto a los términos individuales en la presente memoria, los grupos sustituyentes para los hidrógenos en los átomos de nitrógeno en los grupos heteroalquilo y cicloheteroalquilo "sustituidos" son, a menos que se especifique lo contrario
, -R60, -O-M+, -OR70, -SR70, -S-M+, -NR80R80,
trihalometilo, -CF<3>, -CN, -NO, -NO<2>, -S(O)<2>R70, -S(O^O'M+, -S(O)<2>OR70, -OS(O)<2>R70, -OS(O)<2>O'M+, -
OS(O)2OR70, -P(O)(O-)2(M+)2, -P(O)(OR70)O-M+, -P(O)(OR70)(OR70), -C(O)R70, -C(S)R70, -C(NR70)R70, -
C(O)OR70, -C(S)OR70, -C(O)NR80R80, -C(NR70)NR80R80, -OC(O)R70, -OC(S)R70, -OC(O)OR70, -OC(S)OR70, -
NR70C(O)R70, -NR70C(S)R70, -NR70C(O)OR70, -NR70C(S)OR70, - NR70C(O)NR80R80, -NR70C(NR70)R70 y -NR<70>c (n R<70>)NR<80>R80, donde R60, R70, R80 y M+ son como se han definido anteriormente.
Además de la divulgación en la presente memoria, en una determinada realización, un grupo que está sustituido tiene 1,2, 3, o 4 sustituyentes, 1, 2, o 3 sustituyentes, 1 o 2 sustituyentes, o 1 sustituyente.
Se entiende que en todos los grupos sustituidos definidos anteriormente, los polímeros a los que se llega definiendo sustituyentes con sustituyentes adicionales a ellos mismos (por ejemplo, arilo sustituido que tiene un grupo arilo sustituido como sustituyente que está a su vez sustituido con un grupo arilo sustituido, que está además sustituido por un grupo arilo sustituido, etc.) no están previstos para su inclusión en la presente memoria. En estos casos, el número máximo de sustituciones es de tres. Por ejemplo, las sustituciones en serie de grupos arilo sustituido contempladas específicamente en la presente memoria se limitan a arilo sustituido-(arilo sustituido)-arilo sustituido.
A menos que se indique lo contrario, la nomenclatura de los sustituyentes que no se definen explícitamente en la presente memoria se obtiene nombrando la parte terminal de la funcionalidad seguida de la funcionalidad adyacente hacia el punto de unión. Por ejemplo, el sustituyente "arilalquiloxicarbonilo" se refiere al grupo (aril)-(alquilo)-O-C(O)-.
En cuanto a cualquiera de los grupos aquí divulgados que contienen uno o más sustituyentes, se entiende, por supuesto, que tales grupos no contienen ninguna sustitución o patrones de sustitución que sean estéricamente impracticables y/o sintéticamente inviables. Además, los compuestos en cuestión incluyen todos los isómeros estereoquímicos resultantes de la sustitución de estos compuestos.
El término "sal farmacéuticamente aceptable" significa una sal que es aceptable para la administración a un paciente, tal como un mamífero (sales con contraiones que tienen una seguridad aceptable para mamíferos para un régimen de dosificación dado). Tales sales pueden derivarse de bases inorgánicas u orgánicas farmacéuticamente aceptables y de ácidos inorgánicos u orgánicos farmacéuticamente aceptables. "Sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de un compuesto, cuyas sales se derivan de una variedad de contra-iones orgánicos e inorgánicos bien conocidos en la técnica e incluyen, a modo de ejemplo solamente, sodio, y similares; y cuando la molécula contiene una funcionalidad básica, sales de ácidos orgánicos o inorgánicos, como clorhidrato, y similares. Sales farmacéuticamente aceptables de interés incluyen, pero no se limitan a, sales de aluminio, amonio, arginina, bario, benzatina, calcio, colinato, etilendiamina, lisina, litio, magnesio, meglumina, procaína, potasio, sodio, trometamina, N-metilglucamina, N,N'-dibencileno-diamina, cloroprocaína, dietanolamina, etanolamina, piperazina, zinc, diisopropilamina, diisopropiletilamina, trietilamina y trietanolamina.
El término "sal del mismo" significa un compuesto formado cuando un protón de un ácido se reemplaza por un catión, tal como un catión metálico o un catión orgánico y similares. En su caso, la sal es una sal farmacéuticamente aceptable, aunque esto no es necesario para las sales de compuestos intermedios que no están destinados a ser administrados a un paciente. A modo de ejemplo, las sales de los presentes compuestos incluyen aquellas en las que el compuesto es protonado por un ácido inorgánico u orgánico para formar un catión, con la base conjugada del ácido inorgánico u orgánico como componente aniónico de la sal. Las sales de interés incluyen, pero no se limitan a, aluminio, amonio, arginina, bario, benzatina, calcio, cesio, colinato, etilendiamina, litio, magnesio, meglumina, procaína, N-metilglucamina, piperazina, potasio, sodio, trometamina, zinc, N,N'-dibenciletilenodiamina, cloroprocaína, dietanolamina, etanolamina, piperazina, diisopropilamina, diisopropiletilamina, trietilamina y sales de trietanolamina. Se entiende que para cualquiera de las estructuras de oligonucleótidos representadas en la presente memoria que incluyen un esqueleto de enlaces intemucleósidos, tales oligonucleótidos también pueden incluir cualquier forma de sal conveniente. En algunas realizaciones, las formas ácidas de los enlaces internucleósidos se representan por simplicidad. En algunos casos, la sal del compuesto en cuestión es una sal de catión monovalente. En determinados casos, la sal del compuesto en cuestión es una sal de catión divalente. En algunos casos, la sal del compuesto en cuestión es una sal de catión trivalente. "Solvato" se refiere a un complejo formado por la combinación de moléculas de disolvente con moléculas o iones del soluto. El disolvente puede ser un compuesto orgánico, un compuesto inorgánico o una mezcla de ambos. Algunos ejemplos de disolventes incluyen, pero no se limitan a, metanol, N,N-dimetilformamida, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido y agua. Cuando el disolvente es agua, el solvato formado es un hidrato.
"Estereoisómero" y "estereoisómeros" se refieren a compuestos que tienen la misma conectividad atómica pero diferente disposición atómica en el espacio. Los estereoisómeros incluyen isómeros cis-trans, isómerosEyZ, enantiómeros y diastereómeros.
"Tautómero" se refiere a formas alternativas de una molécula que difieren únicamente en el enlace electrónico de los átomos y/o en la posición de un protón, tal como los tautómeros enol-ceto e imina-enamina, -NH-P(=S)(OH)-O- y -NH-P(=O)(SH)-O-, o las formas tautoméricas de grupos heteroarilo que contienen una disposición de átomos de anillo -N=<c>(H)-NH-, tales como pirazoles, imidazoles, benzimidazoles, triazoles y tetrazoles. Un experto en la técnica reconocería que son posibles otras disposiciones tautoméricas de los grupos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, se entiende que un oligonucleótido descrito por la siguiente estructura:
también abarca la siguiente estructura que muestra una posible disposición tautomérica alternativa de los grupos de enlace:
donde "nps" representa un enlace tiofosforamidato (-NH-P(=O)(SH)-O- o -NH-P(=S)(OH)-O-) que conecta el carbono 3' de un nucleósido con el carbono 5' del nucleósido adyacente. Se entiende que todas las formas tautoméricas de un compuesto en cuestión están incluidas en una estructura en la que se describe una posible disposición tautomérica de los grupos del compuesto, aunque no se indique específicamente. Cualquier disposición tautomérica conveniente de los grupos de los compuestos en cuestión puede usarse para describir los compuestos.
Se apreciará que el término "o una sal o solvato o estereoisómero del mismo" pretende incluir todas las permutaciones de sales, solvatos y estereoisómeros, tales como un solvato de una sal farmacéuticamente aceptable de un estereoisómero del compuesto en cuestión. Se entiende que el término "o una sal del mismo" pretende incluir todas las permutaciones de sales. Se entiende que el término "o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo" pretende incluir todas las permutaciones de sales. Se entiende que el término "o un solvato del mismo" pretende incluir todas las permutaciones de solvatos. Se entiende que el término "o un estereoisómero del mismo" pretende incluir todas las permutaciones de estereoisómeros. Se entiende que el término "o un tautómero del mismo" pretende incluir todas las permutaciones de tautómeros. De este modo, por ejemplo, se pretende incluir un solvato de una sal farmacéuticamente aceptable de un tautómero de un estereoisómero del compuesto en cuestión.
"Cantidad farmacéuticamente eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" se refieren a una cantidad de un compuesto suficiente para tratar un trastorno o enfermedad específicos o uno o más de sus síntomas y/o para prevenir la aparición de la enfermedad o trastorno. En referencia a los trastornos proliferativos tumorigénicos, una cantidad farmacéutica o terapéuticamente eficaz comprende una cantidad suficiente para, entre otras cosas, hacer que el tumor se reduzca o disminuir la tasa de crecimiento del tumor.
"Paciente" se refiere a sujetos humanos y no humanos, especialmente a sujetos mamíferos.
El término "tratar" o "tratamiento", tal como se usa en la presente memoria, significa el tratamiento de una enfermedad o afección médica en un paciente, como un mamífero (en particular, un ser humano) que incluye: (a) prevenir que ocurra la enfermedad o afección médica, tal como, tratamiento profiláctico de un sujeto; (b) mejorar la enfermedad o afección médica, tal como, eliminando o causando la regresión de la enfermedad o afección médica en un paciente; (c) suprimir la enfermedad o afección médica, por ejemplo, ralentizando o deteniendo el desarrollo de la enfermedad o afección médica en un paciente; o (d) aliviar un síntoma de la enfermedad o afección médica en un paciente.
Como se usa en la presente memoria, el término "aislado" pretende describir un compuesto de interés que se encuentra en un entorno diferente de aquel en el que el compuesto se produce de forma natural. por "aislado" pretende incluir los compuestos que se encuentran en muestras sustancialmente enriquecidas para el compuesto de interés y/o en las que el compuesto de interés está parcial o sustancialmente purificado.
Como se usa en la presente memoria, el término "sustancialmente purificado" se refiere a un compuesto que se ha extraído de su entorno natural y que está libre al menos en un 60 %, al menos en un 75 %, al menos en un 80 %, al menos en un 85 %, al menos en un 90 %, al menos en un 95 %, al menos en un 98 % o en más de un 98 % de otros componentes con los que está asociado de forma natural.
El término "condiciones fisiológicas" pretende abarcar a aquellas condiciones compatibles con las células vivas, por ejemplo, condiciones predominantemente acuosas de temperatura, pH, salinidad, etc. que son compatibles con las células vivas.
Antes de que la presente invención se describa con más detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a las realizaciones particulares descritas, ya que éstas pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología empleada en la presente memoria tiene por objeto describir únicamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitativa, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, a la décima de la unidad del límite menor que menos que el contexto dicte claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor declarado o intermedio en ese intervalo declarado, está comprendido dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños, y también están comprendidos dentro de la invención, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen uno o ambos límites incluidos también se incluyen en la invención.
Se aprecia que determinadas características de la invención, que están, para la claridad, descritas en el contexto de realizaciones separadas, se pueden también proporcionar conjuntamente en una sola realización. Por el contrario, diversas características de la invención, que son, por brevedad, se describe en el contexto de una sola realización, también puede ser proporcionada por separado o en cualquier subcombinación apropiada. Todas las combinaciones de las realizaciones pertenecientes a la invención están específicamente comprendidas en la presente invención y se divulgan en la presente memoria como si todas y cada una de las combinaciones se divulgaran individual y explícitamente, en la medida en que dichas combinaciones abarcan materias que son, por ejemplo, compuestos que son compuestos estables (es decir, compuestos que pueden fabricarse, aislarse, caracterizarse y someterse a pruebas de actividad biológica). Además, todas las subcombinaciones de las diversas realizaciones y elementos de las mismas (por ejemplo, elementos de los grupos químicos enumerados en las realizaciones que describen tales variables) también se abarcan específicamente en la presente invención y se divulgan en la presente memoria como si todas y cada una de tales subcombinaciones se divulgaran individual y explícitamente en la presente memoria.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria también puede usarse en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación se describen los procedimientos y materiales de interés.
Cabe señalar que, tal como se usan en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Cabe señalar además que las reivindicaciones pueden redactarse de forma que excluyan cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración pretende servir como base previa para el uso de terminología exclusiva como "únicamente", "sólo" y similares en relación con el enunciado de los elementos de la reivindicación, o el uso de una limitación "negativa".
Se aprecia que determinadas características de la invención, que están, para la claridad, descritas en el contexto de realizaciones separadas, se pueden también proporcionar conjuntamente en una sola realización. Por el contrario, diversas características de la invención, que son, por brevedad, se describe en el contexto de una sola realización, también puede ser proporcionada por separado o en cualquier subcombinación apropiada.
Las publicaciones mencionadas en la presente memoria se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo expuesto en la presente memoria debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a ser anterior a dicha publicación en virtud de una invención anterior. Además, las fechas de publicación facilitadas pueden diferir de las fechas de publicación reales, que deberán confirmarse de forma independiente.
Descripción detallada
Como se ha resumido anteriormente, los aspectos de la invención para los que se solicita protección se definen en las reivindicaciones adjuntas. La presente divulgación describe un procedimiento en fase sólida para preparar oligonucleótidos mediante ciclos de acoplamiento secuenciales que incluyen el acoplamiento de un dímero dinucleotídico a un grupo 3'terminal libre (por ejemplo, un grupo 3'-hidroxilo o 3'-amino) de una cadena en crecimiento. En términos generales, la síntesis procede del 5'-terminal al 3'-terminal de una secuencia oligonucleotídica diana e incluye al menos un acoplamiento de un dímero dinucleotídico. El dímero puede acoplarse al grupo terminal 3' libre de una cadena en crecimiento mediante cualquier química conveniente. En algunos casos, el dímero es un dímero 3'-protegido-dinucleótido-5'-fosforamidito, donde el dinucleótido puede incluir cualquier enlace inter-nucleósido conveniente. El oligonucleótido puede incluir uno o más enlaces entre subunidades de fosforamidato (por ejemplo, un enlace oxo-fosforamidato o tiofosforamidato).
Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento de síntesis de un polinucleótido que tiene al menos dos subunidades nucleosídicas unidas por un enlace entre subunidades de oxofosforamidato N3'^-P5' o tiofosforamidato N3'^-P5', que comprende las etapas de:
(a) desprotección del grupo amino 3' protegido de un nucleósido terminal unido a un soporte en fase sólida, formando dicha desprotección un grupo amino 3' libre;
(b) poner en contacto el grupo amino 3' libre con un dímero amino-dinucleótido fosforamidato-5'-fosforamidito 3'-protegido en presencia de un catalizador nucleofílico para formar un enlace fosforamidito internucleósido N3'^P5'; y
(c) oxidar el enlace para producir un enlace entre subunidades oxifosforamidato N 3'^P5' o tiofosforamidato N3'^P5'.
Según un segundo aspecto de la invención, se proporciona un compuesto de tiofosforamidato dinucleótido descrito por la fórmula (II):
en la que:
B<1>y B<2>son cada uno independientemente una purina, una purina protegida, una pirimidina o una pirimidina protegida, o un análogo de las mismas;
R<11>es un grupo fosforamidito; y
R<12>y R<13>son cada uno independientemente un grupo protector; o una sal del mismo.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido incluye una secuencia de subunidades nucleosídicas que contiene al menos una subunidad definida por la fórmula:
donde B es una purina, una purina protegida, una pirimidina o una pirimidina protegida, o un análogo de las mismas; X es O o S; R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, un alquilo, un alquilo sustituido, un arilo, un arilo sustituido, un grupo protector de fosfato; yR<3>se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, O-R2, y halógeno, en la que R<2>es H, un alquilo, un alquilo sustituido (por ejemplo, - (CH<2>)nW(CH<2>)mH, donde n está entre 1-10, m está entre 0-10 y W es O, S o NH) o un grupo protector hidroxilo. Se entiende que algunos de los oligonucleótidos que incluyen una subunidad descrita por la fórmula anterior también pueden existir en forma de sal. Tales formas, en la medida en que puedan existir, se incluyen en el ámbito de la presente divulgación.
Los procedimientos en cuestión proporcionan un número reducido de ciclos de acoplamiento en relación con los procedimientos que implican solo acoplamientos de subunidades de monómeros nucleósidos y proporcionan cantidades reducidas de productos oligonucleótidos no diana de la síntesis. La estrategia retrosintética usada para preparar una secuencia de oligonucleótidos diana puede seleccionarse en función de diversos factores, tal como la longitud y la secuencia del oligonucleótido diana, con el fin de minimizar las cantidades de determinados productos oligonucleotídicos no diana de la síntesis.
En algunas realizaciones, los procedimientos en cuestión proporcionan la preparación de composiciones que tienen una cantidad reducida de uno o más productos (N-x) en relación con un oligonucleótido diana de interés.
En determinadas realizaciones, cualquiera de las composiciones escritas en la presente memoria que tienen una cantidad reducida de uno o más productos (N-x) en relación con un oligonucleótido diana de interés no se purifica.
Como se usa en la presente memoria, el término "producto (N-x)" (donde x es un número entero desde 1 a N-1 y N es el número de residuos nucleósidos en un oligonucleótido diana), se refiere a un oligonucleótido no diana producido durante los procedimientos de preparación en cuestión que carece de x residuos nucleósidos por comparación con la secuencia de un oligonucleótido diana de N residuos de longitud. El oligonucleótido diana es el producto para cuya obtención se ha diseñado el procedimiento de preparación en cuestión. Como tal, un producto (N-1) es un oligonucleótido no diana que carece de cualquier residuo nucleósido de la secuencia del oligonucleótido diana. Como tal, en algunos casos, el término "producto (N-1)" se refiere a una variedad de productos de oligonucleótidos no diana, cada uno de los cuales carece de un residuo nucleósido en comparación con la secuencia del oligonucleótido diana. Del mismo modo, el término "producto (N-x)" se refiere a una variedad de productos de oligonucleótidos no diana, cada uno de los cuales carece de x residuos nucleósidos en comparación con la secuencia del oligonucleótido diana. Por ejemplo, un producto (N-2) es un oligonucleótido no diana que carece de dos residuos nucleosídicos cualquiera de la secuencia del oligonucleótido diana. En algunos casos, los residuos x son contiguos entre sí en relación con la secuencia de nucleótidos del oligo diana. En otros casos, los residuos x son discontinuos entre sí en relación con la secuencia de nucleótidos del oligo diana. Los residuos de nucleósido x pueden faltar en cualquier lugar de la secuencia diana y pueden producirse a partir de grupos 3'-terminales sin reaccionar durante un ciclo de acoplamiento. Los productos (N-x) de los procedimientos en cuestión pueden incluir una o más modificaciones adicionales derivadas de los procedimientos de síntesis en cuestión, por ejemplo, una modificación de desprotección parcial, pérdida de una nucleobase (por ejemplo, depurinación), tapado de un grupo terminal, derivación mediante un reactivo de síntesis (por ejemplo, fenilacetilación mediante un reactivo de sulfuración), y similares. Es posible obtener una gran variedad de oligonucleótidos modificados, dependiendo de la química de la síntesis de oligonucleótidos y del reactivo usado. A menos que se indique lo contrario, todas estas modificaciones se incluyen en el término producto (N-x).
En algunas realizaciones, los procedimientos en cuestión dan lugar a la reducción de uno o más productos no diana de la síntesis de oligonucleótidos seleccionados de un producto parcialmente protegido o un producto parcialmente protegido (N-x), por ejemplo, un producto de oligonucleótido que incluye uno o más grupos protectores de nucleobase. En las composiciones de oligonucleótidos en cuestión, la secuencia de oligonucleótidos diana puede aislarse o purificarse más fácilmente de otros productos del procedimiento que contienen oligonucleótidos, por ejemplo, productos (N-x) y productos que carecen de una nucleobase.
Las realizaciones de los procedimientos y composiciones en cuestión se describen con más detalle en las secciones siguientes.
Métodos de fabricación de oligonucleótidos
La presente divulgación proporciona un procedimiento de preparación de un oligonucleótido. Los procedimientos en cuestión pueden incluir al menos un acoplamiento de un dímero de dinucelotida al grupo terminal 3' libre de una cadena de oligonucleótidos en crecimiento. En los procedimientos de preparación en cuestión puede usarse cualquier procedimiento de síntesis y química de oligonucleótidos. Las químicas de síntesis de oligonucleótidos y los procedimientos de interés que pueden adaptarse para su uso en los procedimientos en cuestión incluyen, pero no se limitan a, fosforamidito, H-fosfonato, fosfodiéster, fosfotriester, triéster de fosfito, y los descritos por Fearon et al. en U.S. 5,824,793. Los componentes oligonucleotídicos de los compuestos descritos en la presente memoria pueden sintetizarse adaptando protocolos convencionales para el tipo de química seleccionada. Los procedimientos de interés para la síntesis de oligonucleótidos que tienen químicas de fosforamidato N3'^-P5' incluyen, pero no se limitan a, los procedimientos descritos en McCurdy et al., (1997) Tetrahedron Letters, 38:207-210 y Pongracz & Gryaznov, (1999) Tetrahedron Letters, 49:7661-7664.
Un oligonucleótido de interés puede prepararse usando los procedimientos en cuestión mediante acoplamientos secuenciales comenzando por el 5'-terminal y procediendo hacia el 3'-terminal de la secuencia oligonucleotídica diana. La subunidad nucleósida 5'-terminal puede unirse a cualquier soporte sólido conveniente mediante un grupo de enlace opcional o un grupo 5'-terminal. A continuación, los acoplamientos de subunidades a la cadena de oligonucleótidos en crecimiento pueden conseguirse usando ya sea fosforamiditas de dímeros o fosforamiditas de monómeros. Alternativamente, la subunidad dinucleotídica 5'-terminal puede unirse a cualquier soporte sólido conveniente mediante un grupo de enlace opcional o un grupo 5'-terminal. Una vez que la primera subunidad (por ejemplo, la subunidad monómera o dímera) está unida al soporte sólido, la subunidad puede desprotegerse para producir un grupo 3'-terminal libre e inmovilizado. En algunos casos, el procedimiento incluye acoplar un grupo 3'-terminal unido al soporte con un dímero 3'-protegido-dinucleótido-5'-fosforamidito. En determinadas realizaciones, el grupo 3'-terminal es un grupo 3'-hidroxilo. En determinadas realizaciones, el grupo 3'-terminal es un grupo 3'-amino.
En algunos casos, el procedimiento incluye las etapas de: (a) desproteger el grupo amino 3' protegido de un nucleósido terminal unido a un soporte en fase sólida, formando dicha desprotección un grupo amino 3' libre; (b) poner en contacto el grupo amino 3' libre con un tiofosforamidato de amino-dinucleótido 3'-protegido o un dímero de fosforamidita-5'-fosforamidita en presencia de un catalizador nucleofílico para formar un enlace de fosforamidita N 3'^P5' internucleósido; y (c) oxidar el enlace.
La secuencia oligonucleotídica diana puede sintetizarse usando una estrategia retrosintética que incluye el acoplamiento secuencial de las subunidades dímero y monómero al grupo 3'terminal de la cadena oligonucleotídica en crecimiento. Como tal, en algunas realizaciones, el procedimiento incluye además las etapas de: (a) desprotección del grupo amino 3' protegido de un nucleósido terminal unido a un soporte en fase sólida, formando dicha desprotección un grupo amino 3' libre; (b) poner en contacto el grupo 3' amino libre con un monómero aminonucleósido-5'-fosforamidito 3'-protegido en presencia de un catalizador nucleofílico para formar un enlace fosforamidito N 3'^P5' internucleósido; y c) oxidar el enlace para producir un enlace fosforamidato N3'^-P5'.
Como se usa en la presente memoria, el término "enlace fosforamidito N3'^P5"' se refiere al intermediario fósforo (III) del enlace fosforamidato N3'^-P5'. En términos generales, un enlace fosforamidato N3'^P5' se forma oxidando un enlace fosforamidito N 3'^P5' a un producto fósforo (V) (por ejemplo, un enlace fosforamidato N3'^P5' que puede incluir un grupo oxo (P=O) o tio (P=S)). En algunos casos, la etapa de oxidación puede describirse como sulfuración del enlace fosforamidito N 3'^P5' para producir un enlace tiofosforamidato N3'^-P5'.
Como se usa en la presente memoria, "fosforamidato N3'^P5"', "fosforamidato P5'^N3"' y "fosforamidato" se refieren a un enlace de subunidad internucleosídica descrito por la fórmula:
3’-NH-P(=X)(0R)-0-5’
o un tautómero del mismo, en el que 3' y 5' se refieren a los átomos de carbono de las unidades estructurales de azúcar de nucleósidos consecutivos que están conectados mediante el enlace, y en el que R es hidrógeno, un alquilo, un alquilo sustituido, un arilo, un arilo sustituido o un grupo fosfato protector, y X es un calcógeno, como oxígeno o azufre. Se entiende que, cuando R es hidrógeno, un alquilo, un alquilo sustituido, un arilo, un arilo sustituido o un grupo protector de fosfato, algunos de los enlaces de subunidades internucleosídicas descritos por la fórmula anterior también pueden existir en forma de sal. Tales formas, en la medida en que puedan existir, se incluyen en el ámbito de la presente divulgación. En algunos casos, cuando X es azufre, el fosforamidato puede denominarse tiofosforamidato. En algunos casos, cuando X es oxígeno, el "fosforamidato" puede denominarse "oxofosforamidato". En algunos casos, cuando R es un grupo protector de fosfato puede ser un alquilo, un alquenilo, un arilo, un aralquilo, un cicloalquilo o una versión sustituida de los mismos. En algunos casos, R es un grupo fosfato protector que contiene 10 o menos átomos de carbono. En determinados casos, cuando R es un grupo protector de fosfato, es un alquilo que tiene desde<1>a<6>átomos de carbono; un etilo p-sustituido que absorbe electrones (por ejemplo, etilo p-trihalometil-, p-ciano-, p-sulfo-, o p-nitro-sustituido ); un fenilo sustituido que retiene electrones (por ejemplo, fenilo sustituido con halo, sulfo, ciano, o nitro); o un feniletilo sustituido que retiene electrones. En algunas realizaciones, cuando R es un grupo fosfato protector es metilo, p-cianoetilo, o 4-nitrofeniletilo. En determinadas realizaciones, R es hidrógeno, metilo o p-cianoetilo. Los sustituyentes que retienen electrones de interés incluyen, pero no se limitan a, halo, ciano, nitro, sulfo, o mono-, di-, o trihalometilo, y similares. Los sustituyentes de átomos de halógeno suelen ser fluoro, cloro, bromo o yodo; y en algunos casos, son fluoro o cloro. La "retirada de electrones" indica la tendencia de un sustituyente para atraer electrones de valencia de la molécula de la que forma parte, es decir, es electronegativo, por ejemplo, March, Advanced Organic Chemistry, pgs. 16-18 (John Wiley, Nueva York, 1985). Se proporciona orientación para seleccionar un grupo protector de fosfato en Beaucage and lyer, Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992). Por comodidad, los fosforamidatos de nucleótidos se indican a veces en la presente memoria con los subíndices "np" o "pn" para fosforamidatos N3'^P5' y fosforamidatos P3'^-N5', respectivamente. De este modo, "UnpU" es un dinucleótido en el que una 3'-aminouridina y una uridina están unidas por un enlace fosforamidato N3'^P5'. Cuando el enlace es un oxo-fosforamidato, el nucleótido oxo-fosforamidato se indica a veces en la presente memoria con los subíndices "npo" u "opn" para fosforamidatos N3'^P5' y fosforamidatos P3'^-N5', respectivamente. Del mismo modo, los tiofosforamidatos de nucleótidos se indican a veces en la presente memoria con los subíndices "nps" o "spn" para tiofosforamidatos N 3'^P5' y tiofosforamidatos P3'^-N5', respectivamente. Del mismo modo, los sustituyentes 2'-fluoro se indican con una "f" en superíndice. De este modo, "Uf.npU" es un dinucleótido en el que la 5'-másst 3'-amino-2'-fluorouridine está unida a una uridina por un enlace de fosforamidato N3'^P5'. Un único subíndice "p" al principio indica un monofosfato 5', y un único subíndice "n" al final indica un grupo 3'-amino.
En algunos casos, el enlace de la subunidad internucleósido se describe mediante la fórmula:
3’-NH-P(=X)(0R)-0-5’
o un tautómero del mismo, en el que 3' y 5' se refieren a los átomos de carbono de las unidades estructurales de azúcar de nucleósidos consecutivos que están conectados mediante el enlace, y donde R es hidrógeno y X es oxígeno o azufre. Se entiende que para cualquiera de los oligonucleótidos descritos en la presente memoria que incluyen dicho enlace internucleósido, tales oligonucleótidos también pueden incluir cualquier forma de sal conveniente del enlace. Como tal, el enlace intemucleósido puede estar en forma de sal que incluya cualquier contraión conveniente.
Cualquier estrategia conveniente de grupo protector puede ser usada en los procedimientos en cuestión para proteger los grupos base, fosforamidito, fosforamidato, 5', 2' y/o 3'. Los grupos protectores de interés incluyen, pero no se limitan a, los grupos protectores descritos porOhkubo et al., Org. Lett., 2010, 12 (11), pp 2496-2499; y Beaucage and Iyer, Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992).
Como se usa en la presente memoria, el término "grupo protector de fosfato" se refiere a un grupo protector que puede unirse a un enlace entre subunidades que contiene fósforo de un oligonucleótido. Cuando está presente, un grupo protector de fosfato puede impedir (es decir, bloquear) la reacción del enlace que contiene fósforo en el lugar donde está unido el grupo protector de fosfato. Cualquier enlace entre subunidades conveniente que contenga fósforo (por ejemplo, enlaces P(III) y P(V)) puede protegerse mediante los grupos protectores de fosfato en cuestión, incluidos, pero no se limitan a, fosforamidito, oxifosforamidato, tiofosforamidato, éster de fosfato, éster de tiofosfato, enlaces fosfodiéster y similares. El grupo protector fosfato puede estar unido a un átomo de oxígeno disponible del enlace entre subunidades que contiene fósforo. Como grupo protector de fosfato puede usarse cualquier grupo protector conveniente. Los grupos protectores de fosfato de interés incluyen, pero no se limitan a, un alquilo, un alquenilo, un arilo, un aralquilo, un cicloalquilo, o una versión sustituida de los mismos, tal como un alquilo que tenga desde<1>a<6>átomos de carbono, tal como un etilo p-sustituido que retiene electrones (por ejemplo, etilo p-trihalometilo-, p-ciano-, p-sulfo-, o p-nitro-sustituido); un fenilo sustituido que retiene electrones (por ejemplo, fenilo sustituido con halo, sulfo, ciano, o nitro.); o un feniletilo, metilo, p-cianoetilo, o 4-nitrofeniletilo. sustituido que retiene electrones. En determinadas realizaciones, el grupo fosfato protector es metilo, o p-cianoetilo. Los sustituyentes que retiran electrones de interés incluyen, pero no se limitan a, halo (por ejemplo, cloro o fluoro), ciano, nitro, sulfo, o mono-, di-, o trihalometilo, y similares.
El grupo 3'-terminal de la cadena de oligonucleótidos en crecimiento puede incluir un grupo 3'-hidroxilo, un grupo 3'-amino o una versión protegida de los mismos. Durante la síntesis del oligonucleótido puede usarse cualquier grupo protector hidroxilo y/o amino conveniente en el grupo 3'-terminal. En algunas realizaciones, el grupo 3'terminal es un grupo 3'-amino protegido y el procedimiento incluye desproteger o eliminar el grupo protector para producir un grupo 3'amino libre.
Como se usa en la presente memoria, el término "grupo amino libre" en referencia a los monómeros y dímeros significa un grupo amino disponible para reaccionar con el grupo fosforamidito de un monómero o dímero entrante. En algunas realizaciones, un grupo amino libre es una amina primaria. Tras la etapa de desprotección (por ejemplo, detritilación), el grupo amino puede estar en forma de sal (por ejemplo, la sal de una base conjugada del ácido usado para la detritilación). Esta sal puede neutralizarse opcionalmente con una solución básica, como trietilamina al<2>% o piridina en acetonitrilo, después de la etapa de detritilación.
En algunas realizaciones, el grupo 3'-terminal es un grupo 3'-hidroxilo protegido y el procedimiento incluye desproteger o eliminar el grupo protector para producir un grupo 3'-hidroxilo libre. En algunas realizaciones, el grupo 3'-terminal es un grupo 3'-amino protegido y el procedimiento incluye desproteger o eliminar el grupo protector para producir un grupo 3'-amino libre. El grupo 3'-amino o 3'-hidroxilo protegido puede protegerse con un grupo protector tritilo. En determinadas realizaciones, el grupo protector tritilo es trifenilmetilo (Tr,Ph<3>C-). En determinadas realizaciones, el grupo protector tritilo es 4,4'-dimetoxitritilo (DMT).
La desprotección del grupo amino o hidroxilo 3'-terminal puede lograrse usando cualquier procedimiento conveniente. Los procedimientos de interés incluyen, pero no se limitan a, los descritos por Beaucage and Iyer, Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992). En algunos casos, la desprotección del grupo amino 3' protegido de un nucleósido terminal incluye la detritilación para producir un grupo 3' terminal libre, por ejemplo, detritilación catalizada por ácido.
En general, las fosforamiditas de subunidad dímero o monómero incluyen un grupo 3'-hidroxilo o 3'-amino protegido que es el mismo que el grupo terminal 3' del nucleósido terminal unido al soporte sólido. -La protección en 3' de las fosforamiditas de la subunidad entrante evita la polimerización indeseable de la cadena.
En los procedimientos en cuestión puede usarse cualquier soporte de fase sólida conveniente. Los soportes sólidos de interés incluyen, pero no se limitan a, micropartículas hechas de vidrio de poro controlado (CPG), poliestireno altamente reticulado (por ejemplo, NittoPhase HL 400 o GE Primer 350), copolímeros acrílicos, celulosa, nylon, dextrano, látex, poliacroleína, y similares, tales como los divulgados en las siguientes referencias ejemplares: Meth. Enzymol, Section A, pages11-147, vol.44 (Academic Press, New York, 1976); Patentes de los Estados Unidos Nos.
4,678,814; 4,413,070; y 4,046;720; y Pon, Capítulo 19, en Agrawal, editor, Methods in Molecular Biology, Vol.20, (Humana Press, Totowa, N.J., 1993). Soportes de interés adicionales incluyen perlas de poliestireno; poliestireno injertado con polietilenglicol (por ejemplo, TentaGel™, Rapp Polymere, Tubingen Alemania); y similares. La selección de las características del soporte, tales como el material, la porosidad, el tamaño, la forma y similares, y el tipo de unidad estructural de enlace empleada depende una variedad de factores, tales como los grupos de protección empleados, la longitud del producto final, la cantidad de producto final y similares. Algunas unidades estructurales ejemplares de enlaces se divulgan en Pon et al, Biotechniques, 6:768-775 (1988); Webb , Patente de los Estados Unidos No. 4,659,774; Barany et al, Solicitud de Patente Internacional PCT/US91/06103; Brown et al, J. Chem. Soc. Commun., 1989: 891-893; Damha et al, Nucleic Acids Research, 18: 3813-3821(1990); Beattie et al, Clinical Chemistry, 39: 719-722 (1993); Maskos and Southern, Nucleic Acids Research, 20: 1679-1684 (1992); y similares.
En algunas realizaciones, los soportes sólidos que encuentran uso en los procedimientos en cuestión incluyen CPG y poliestireno injertado con polietilenglicol y que poseen un grupo amino terminal (por ejemplo,TentaGel-NH<2>™, Rapp Polymere, Tubingen Alemania). El grupo aminopropilo puede usarse como espaciador entre el CPG y el enlace nucleósido. En algunos casos, el enlace al 5'-hidroxilo del primer nucleósido es un grupo succinilo que proporciona un enlace éster base-lábil que puede escindirse después de la síntesis con amoníaco acuoso.
Tras la desprotección, el nucleósido unido al soporte es capaz de reaccionar con una subunidad de dímero o monómero de fosforamidito para formar un enlace internucleósido. Se entiende que el nucleósido unido al soporte puede referirse a un único residuo unido a un soporte sólido o puede referirse al residuo terminal de una cadena de oligonucleótidos que está unida al soporte.
En los procedimientos en cuestión puede usarse cualquier química de acoplamiento, reactivos de acoplamiento y procedimientos convenientes. En la bibliografía pueden encontrarse orientaciones considerables para seleccionar las condiciones de acoplamiento, los grupos protectores, los soportes en fase sólida, los grupos de enlace, los reactivos de desprotección, los reactivos para escindir los productos de los soportes en fase sólida, la purificación del producto y similares, en el contexto de los procedimientos en cuestión, por ejemplo Gait, editor, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984); Amarnath and Broom, Chemical Reviews, Vol. 77, pgs.
183-217 (1977); Pon et al, Biotechniques, Vol.<6>, pgs. 768-775 (1988); Ohtsuka et al, Nucleic Acids Research, Vol.
10, pgs. 6553-6570 (1982); Eckstein, editor Oligonucleotides. and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991), Greene and Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis", Third edition, Wiley, Nueva York 1999, Narang, editor, Synthesis and Applications of DNA and RNA (Academic Press, Nueva York, 1987), Beaucage and Iyer, Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992), y referencias similares.
La etapa de acoplamiento de los procedimientos en cuestión puede llevarse a cabo en un intervalo de temperatura de -20 a 200 grados centígrados. En algunos casos, la reacción se lleva a cabo a temperatura ambiente (unos 15 30 grados centígrados). La reacción puede realizarse agregando una solución del dímero o monómero de fosforamidita y una solución de un activador (o una solución que contenga el dímero o monómero de fosforamidita y el activador) al recipiente de reacción que contiene el grupo amino libre de un (oligo)nucleótido unido covalentemente a un soporte sólido. Generalmente, los activadores de interés incluyen catalizadores nucleofílicos que desplazan el grupo amino más estable de la fosforamidita para formar un intermediario altamente reactivo (y menos estable) que, a su vez, reacciona con el grupo amino 3' libre de un oligonucleótido N 3'^P5' fosforamidato soportado en un sólido. A continuación, la mezcla se mezcla por procedimientos como el vórtex mecánico, el rociado con un gas inerte, etc. Alternativamente, la(s) solución(es) de dímero o monómero y activador puede(n) hacerse fluir a través de un recipiente de reacción (o columna) que contenga el (oligo)nucleótido soportado en sólido con un grupo 3'-terminal libre. El monómero y el activador pueden premezclarse, mezclarse en el bloque de válvulas de un sintetizador apropiado, mezclarse en un recipiente de preactivación y preequilibrarse si se desea, o pueden agregarse por separado al recipiente de reacción.
Los activadores de interés que pueden usarse en los procedimientos en cuestión incluyen, pero no se limitan a, tetrazol, 5-(etiltio)tetrazol, 5-(4-nitrofenil)tetrazol, 5-(2-tiofeno) tetrazol, triazol, cloruro de piridinio, y similares, por ejemplo, agentes activadores como los descritos por Beaucage and Iyer Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992); Berner et al, Nucleic Acids Research, 17: 853-864 (1989); Benson, Chem. Rev. 41: 1-61 (1947). Como se usa en la presente memoria, el término "activador de tetrazol" se refiere a activadores que son tetrazoles o derivados de tetrazol. En algunas realizaciones, el activador es tetrazol. Los disolventes convenientes incluyen, pero no se limitan a, acetonitrilo, tetrahidrofurano, cloruro de metileno y similares. Se debe tener cuidado de usar dímero o monómero, activador y disolvente secos (sin agua) para la etapa de acoplamiento y para el disolvente usado para lavar el soporte sólido inmediatamente antes de la etapa de acoplamiento.
Después del acoplamiento, los grupos 3'-amino sin reaccionar de la cadena creciente unida al soporte del oligonucleótido pueden ser opcionalmente tapados con un agente de tapado conveniente antes de la siguiente etapa de desprotección (por ejemplo, etapa de detritilación) para hacerlos inertes a las etapas de acoplamiento subsiguientes. Esta etapa de tapado puede mejorar el perfil HPLC de la preparación para facilitar la purificación, y también puede mejorar el rendimiento global del producto. Los reactivos de tapado útiles en los procedimientos en cuestión incluyen reactivos electrofílicos tales como el anhídrido acético y el anhídrido isobutírico, cloruros ácidos tales como el cloruro de adamantilcarbonilo, el cloruro de pivaoilo y similares, isotiocianatos, cloroformiatos, etc. También son útiles las fosforamiditas en conjunción con un activador y seguidos de oxidación, y las sales de H-fosfonato tales como el isopropil-H-fosfonato de trietilamonio usado en conjunción con un cloruro ácido tal como el cloruro de pivaoilo o el cloruro de adamantilcarbonilo.
En algunas realizaciones, el procedimiento incluye oxidar un enlace fosforamidito N 3'^P5' internucleósido. Como se usan en la presente memoria, los términos "oxidar", "oxidación", "que oxida" y similares, en referencia a un enlace internucleosídico que contiene fósforo, significan un procedimiento o tratamiento para convertir el átomo de fósforo del enlace de una forma de fósforo (III) a una forma de fósforo (V). La oxidación de los enlaces intemucleotídicos puede realizarse en cualquier punto conveniente de la síntesis usando cualquier procedimiento conveniente. En algunas realizaciones, la oxidación se realiza de forma escalonada, por ejemplo, durante cada ciclo de acoplamiento. En otras realizaciones, la oxidación de múltiples enlaces internucleotídicos se realiza al final de la síntesis. En algunos casos, la oxidación de un enlace fosforamidito N 3'^P5' (por ejemplo, usando un agente oxidante a base de yodo/agua) produce un enlace oxo-fosforamidato. En otros casos, la oxidación de un enlace fosforamidito N 3'^P5' incluye la sulfuración para producir un enlace tiofosforamidato. La sulfuración puede realizarse mediante cualquier procedimiento conveniente. Los procedimientos de sulfuración de interés incluyen los descritos porGryazonov et al., WO2001018015. Los agentes sulfurantes para su uso en la invención incluyen azufre elemental, disulfuros de tiuram, tales como el disulfuro de tetraetilo de tiuram, disulfuros de acilo, tales como el fenacildisulfuro, disulfuros de fosfinotiol, tales como el S-Tetra™, y 1,1-dioxo-3H-1,2-benzoditiol-3-ona. En algunas realizaciones, la sulfuración puede llevarse a cabo usando azufre elemental (S<8>). En determinadas realizaciones, la sulfuración puede llevarse a cabo usando el reactivo Beaucage, usando procedimientos como los descritos por lyer et al., J. Organic Chemistry 55:4693-4699, 1990.
Los agentes oxidantes que son útiles en el procedimiento incluyen yodo, cloro, bromo, perácidos tales como ácido m-clorobenzoico, hidroperóxidos tales como t-butilhidroperóxido, hidroperóxido de etilo, hidroperóxido de metilo y similares, ozono, anhídridos acilsulfínicos mixtos tales como 3H-2,1-benzoxatiolan-3-ona-1-óxido, sales de persulfatos tales como persulfato de sodio, amonio y tetrabutilamonio y similares, monoperoxisulfatos tales como oxone™, hipocloritos de sodio y/u otros, peróxidos tales como peróxido de dietilo o bis(trimetilsilil)peróxido, o peróxido de hidrógeno o equivalentes no acuosos de peróxido de hidrógeno tales como complejo urea/peróxido de hidrógeno, etc. Otros agentes oxidantes útiles que pueden usarse para convertir fósforo (III) en fósforo (V) se describen en Beaucage and Iyer Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992).
En algunos casos, el agente oxidante o sulfurizante puede tener tendencia a sufrir una reacción secundaria de Arbuzov no deseada en paralelo con la oxidación deseada (Beaucage and Iyer, citados anteriormente). La reacción lateral de Arbuzov puede dar lugar a un fosforamidato desprotegido que es inestable a las condiciones ácidas de las etapas de detritilación posteriores, y dar lugar a la fragmentación del oligonucleótido. En determinadas realizaciones, el peróxido de hidrógeno se usa como agente oxidante para minimizar la reacción lateral de Arbuzov. En determinadas realizaciones, la oxidación incluye poner en contacto el oligonucleótido con una solución de 1,5 % de peróxido de hidrógeno, 3,5 % de agua, 20 % de piridina y 75 % de THF.
En algunas realizaciones divulgadas, el procedimiento incluye las etapas de
(a) desprotección de un grupo amino 3' protegido de un nucleósido terminal unido a un soporte en fase sólida, formando dicha desprotección un grupo amino 3' libre;
(b) haciendo reaccionar el grupo amino 3' libre con ya sea:
(i) un dímero amino-dinucleótido fosforamidato-5'-fosforamidito 3'-protegido; o
(ii) un monómero aminonucleósido-5'-fosforamidito 3'-protegido;
en presencia de un catalizador nucleofílico para formar un enlace fosforamidito N 3'^P5' internucleósido;
(c) oxidar el enlace; y
(d) repetir las etapas (a) a (c) hasta que se sintetice el polinucleótido, en el que la repetición de las etapas (a) a (c) comprende realizar la etapa (b)(i) al menos una vez.
En algunas realizaciones, la repetición de las etapas (a) a (c) comprende realizar la etapa (b)(i) dos veces o más. En determinadas realizaciones, la repetición de las etapas (a) a (c) comprende realizar las etapas (b)(i) 3 veces o más, tal como 4 veces o más, 5 veces o más,<6>veces o más, 7 veces o más,<8>veces o más, 9 veces o más, 10 veces o más, 15 veces o más, 20 veces o más, o incluso 30 veces o más. En determinadas realizaciones, la repetición de las etapas (a) a (c) comprende realizar la etapa (b)(i) en cada etapa de acoplamiento. En determinadas realizaciones, la repetición de las etapas (a) a (c) comprende realizar la etapa (b)(i) en cada etapa de acoplamiento excepto una. En determinadas realizaciones, la repetición de las etapas (a) a (c) comprende realizar la etapa (b)(ii) una y sólo una vez. En determinadas realizaciones, la repetición de las etapas (a) a (c) comprende realizar la etapa (b)(ii) dos veces y sólo dos veces.
Como se describe en la presente memoria, se entiende que el término enlace de fosforamidato abarca tanto enlaces de oxo-fosforamidato como de tiofosforamidato (por ejemplo, como se representa en la fórmula I). En determinadas realizaciones del procedimiento, la oxidación del enlace fosforamidito N3'^P5' internucleósido produce un enlace oxo-fosforamidato. En algunas realizaciones del procedimiento, la oxidación del enlace fosforamidito N 3'^P5' internucleósido incluye la sulfuración para producir un enlace tiofosforamidato.
En algunas realizaciones del procedimiento, el oligonucleótido se describe mediante la fórmula (I):
en la que:
cada B es independientemente una purina, una purina protegida, una pirimidina o una pirimidina protegida, o un análogo de las mismas;
cada X es independientemente oxígeno o azufre;
cada R<3>es hidrógeno, fluoro, hidroxilo, un alcoxi, un alcoxi sustituido o un hidroxilo protegido;
R<6>es amino, hidroxilo, un amino protegido, un hidroxi protegido, -O-L-Z o -NH-L-Z;
cada L es independientemente un enlazante opcional;
cada Z es independientemente H, un lípido, un soporte, un portador, un oligonucleótido, un polímero, un polipéptido, un marcador detectable o una etiqueta;
R es hidrógeno, un alquilo, un alquilo sustituido, un arilo, un arilo sustituido o un grupo protector de fosfato; y
n es un número entero de 1 a 1000. Cuando R es hidrógeno, un alquilo, un alquilo sustituido, un arilo, un arilo sustituido o un grupo fosfato protector, se entiende que algunos de los oligonucleótidos de fórmula (I), también pueden existir en forma de sal. Tales formas, en la medida en que puedan existir, se incluyen en el ámbito de la presente divulgación.
En algunas realizaciones de la fórmula (I), cada R<3>es hidrógeno. En algunas realizaciones de la fórmula (I), cada R<3>es fluoro. En algunas realizaciones de la fórmula (I), cada R<3>es hidroxilo.
En algunas realizaciones de la fórmula (I), R<6>es amino. En determinadas realizaciones de la fórmula (I), R<6>es hidroxilo.
En algunas realizaciones de la fórmula (I), cada R es hidrógeno. Se entiende que cuando R es hidrógeno, el enlace fosfato puede cargarse en condiciones acuosas, tales como las fisiológicas. Como tal, se entiende que los oligonucleótidos de Fórmula (I) también pueden incluir cualquier forma de sal conveniente del enlace. Como tal, el enlace internucleósido de fórmula (I) puede estar en forma de sal que incluya cualquier contraión conveniente. En algunas realizaciones de la fórmula (I), cada R es un alquilo o un alquilo sustituido. En algunas realizaciones de la fórmula (I), cada R es un arilo o un arilo sustituido. En algunas realizaciones de la fórmula (I), cada R es un grupo fosfato protector.
En algunas realizaciones de la fórmula (I), Z es H. En algunas realizaciones de la fórmula (I), Z es un lípido (por ejemplo, como se describe en la presente memoria). En determinados casos, el lípido es un ácido graso (por ejemplo, como se describe en la presente memoria). En algunas realizaciones de la fórmula (I), Z es un soporte. En algunas realizaciones de la fórmula (I), Z es un portador. En algunas realizaciones de la fórmula (I), Z es un oligonucleótido. En algunas realizaciones de la fórmula (I), Z es un polímero. En determinados casos, el polímero es un PEG. En algunas realizaciones de la fórmula (I), Z es un polipéptido. En algunas realizaciones de la fórmula (I), Z es un marcador detectable. En algunas realizaciones de la fórmula (I), Z es una etiqueta.
En algunas realizaciones de la fórmula (I), L está ausente.
En algunas realizaciones, cada B se selecciona independientemente de A, C, G, T y U o una versión protegida de los mismos.
En determinadas realizaciones de la fórmula (I), n es un número entero de entre 1 y 500, tal como entre 1 y 100, entre 1 y 75, entre 1 y 50, entre 1 y 40, entre 1 y 30, entre 1 y 20, entre 1 y 15, entre 1 y 10, o entre 4 y 10. En determinadas realizaciones, n es un número entero comprendido entre 1 y 100, tal como entre 5 y 50, entre<10>y 50, entre 10 y 40, entre 10 y 30, entre 10 y 25, entre 10 y 20, entre 12 y 18, o entre 12 y 16. En determinadas realizaciones, n es 4, 5,<6>, 7,<8>, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25
En determinadas realizaciones del procedimiento, el oligonucleótido comprende una secuencia de subunidades nucleósidas complementaria al componente ARN de la telomerasa humana, y en la que al menos dos de las subunidades nucleósidas están unidas por un enlace entre subunidades de fosforamidato N3'^P5'.
En algunas realizaciones del procedimiento, el oligonucleótido incluye una secuencia de entre 3 y 50 subunidades nucleósidas contiguas complementarias al componente ARN de la telomerasa humana, tales como entre 5 y 40, entre 10 y 40, entre 10 y 30, entre 10 y 25, entre 10 y 20, entre 12 y 18, o entre 12 y 16 subunidades nucleósidas. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido incluye una secuencia de 10 o más subunidades nucleósidas contiguas complementarias al componente ARN de la telomerasa humana. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido incluye una secuencia de 7 o más subunidades nucleósidas contiguas, tales como 7,<8>, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 subunidades nucleósidas contiguas. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido incluye una secuencia de entre<11>y 18, tal como entre<11>y 16 subunidades nucleósidas contiguas complementarias al componente ARN de la telomerasa humana.
En algunos casos del procedimiento, el enlace entre subunidades de tiofosforamidato N 3'^P5' se describe mediante la siguiente estructura:
3'-NH-P(S)(OR)-O-5'
donde R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, un alquilo, un alquilo sustituido, un arilo, un arilo sustituido y un grupo fosfato protector. Se entiende que, cuando R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, un alquilo, un alquilo sustituido, un arilo, un arilo sustituido y un grupo protector de fosfato, algunos de los enlaces de subunidad internucleósido descritos por la fórmula anterior también pueden existir en forma de sal. Tales formas, en la medida en que puedan existir, se incluyen en el ámbito de la presente divulgación.
En algunos casos del procedimiento, el enlace entre subunidades de tiofosforamidato N 3'^P5' se describe mediante la siguiente estructura:
3'-NH-P(S)(OR)-O-5'
donde R es hidrógeno. Se entiende que para cualquiera de los oligonucleótidos descritos en la presente memoria que incluya dicho enlace entre subunidades, tales oligonucleótidos también pueden incluir cualquier forma de sal conveniente del enlace. Como tal, el enlace entre subunidades puede estar en forma de sal que incluya cualquier contraión conveniente.
En algunas realizaciones del procedimiento, el oligonucleótido incluye la secuencia TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3). En determinadas realizaciones, todos los enlaces internucleotídicos entre subunidades de la secuencia TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3) son enlaces fosforamidato N3'^P5' entre subunidades. En determinados casos, todos los enlaces entre subunidades de fosforamidato N 3'^P5' de la secuencia son enlaces entre subunidades de tiofosforamidato N3'^- P5' (por ejemplo, enlaces nps). En determinados casos, todos los enlaces entre subunidades de fosforamidato N3'^P5' de la secuencia son enlaces entre subunidades de oxo-fosforamidato N 3'^P5' (por ejemplo, enlaces np).
En algunas realizaciones del procedimiento, el polinucleótido incluye un grupo 3'-amino o un grupo 3'-hidroxilo terminal. En determinadas realizaciones del procedimiento, el polinucleótido incluye un grupo 3'-amino terminal. En determinadas realizaciones del procedimiento, el polinucleótido incluye un grupo terminal 3'-hidroxilo.
En algunas realizaciones del procedimiento, el oligonucleótido se describe por la estructura:
donde "nps" representa un enlace tiofosforamidato (por ejemplo, -NH-P(=O)(SH)-O- o un tautómero del mismo), que conecta el carbono 3' de un nucleósido con el carbono 5' del nucleósido adyacente.
Se entiende que todas las realizaciones que se refieren a un oligonucleótido son también aplicables a las formas de sal de dicho oligonucleótido.
En algunas realizaciones del procedimiento, el oligonucleótido se describe por la estructura:
o una sal del mismo; donde "nps" representa un enlace tiofosforamidato (por ejemplo, -NH-P(=O)(SH)-O- o un tautómero del mismo, o una sal del mismo), que conecta el carbono 3' de un nucleósido con el carbono 5' del nucleósido adyacente. En determinadas realizaciones, la composición incluye una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto. En determinados casos, la composición incluye una sal sódica del compuesto. En determinadas realizaciones, la composición incluye una sal de catión divalente del compuesto, tal como una sal de magnesio del compuesto. En determinadas realizaciones, la composición incluye una sal de catión trivalente del compuesto, tal como una sal de aluminio del compuesto.
En determinadas realizaciones del procedimiento, el oligonucleótido se describe por la siguiente estructura, donde cada Mx+ es independientemente hidrógeno o cualquier contraión conveniente de una sal, cada x es independientemente 1,2 o 3 y n es un número entero desde 5 a 13, tal como 5,<6>, 7,<8>, 9, 10, 11, 12 o 13, tal como n es 13:
En algunos casos, cada x es 1. En determinados casos, cada x es independientemente 1 o 2. En determinados casos, cada x es independientemente 1 o 3. En determinados casos, Mx+ es hidrógeno.
En determinadas realizaciones del procedimiento, el oligonucleótido se describe mediante la siguiente estructura y puede incluir cualquier contraión catiónico conveniente de una sal:
En determinadas realizaciones del procedimiento, el oligonucleótido se describe por la estructura:
En determinadas realizaciones del procedimiento, el residuo de nucleótido C11 de la secuencia TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3) deriva de un monómero de aminonudeósido-5'-fosforamidita 3'-protegido. Por "deriva de" se entiende que el residuo de interés se introduce durante la síntesis a través de una subunidad concreta. En determinados casos, los residuos T1 a A10, A12 y A13 de la secuencia TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3) derivan de dímeros de tiofosforamidato-5'-fosforamidito de amino-dinucleótidos 3'-protegidos.
En algunos casos, el procedimiento incluye el acoplamiento secuencial de los siguientes dímeros de aminodinucleótido tiofosforamidato-5'-fosforamidito 3'-protegidos y monómero de aminonucleósido-5-fosforamidito 3'-protegido a un grupo terminal de un soporte en fase sólida: TA, GG, GT, TA, GA, C y AA. Se entiende que por simplicidad, una subunidad de fosforamidito protegida que encuentra uso en acoplamientos de los procedimientos en cuestión puede representarse mediante los símbolos X<1>o X<1>X2, donde X<1>y X<2>son independientemente cualquier nucleósido conveniente enlazado mediante cualquier enlace internucleósido conveniente (por ejemplo, como se describe en la presente memoria). Cualquier estrategia sintética conveniente puede ser usada en los procedimientos en cuestión. A continuación se muestran algunas estrategias de interés para demostrar cómo la preparación de una secuencia diana de oligonucleótidos puede asignarse a determinadas subunidades de dímeros y/o monómeros.
Se proporcionan estrategias retrosintéticas ejemplares representadas por las siguientes listas de subunidades secuenciales de dímeros y/o monómeros para una secuencia oligonucleotídica diana ejemplar TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3). Se entiende que esta lista de estrategias no es exhaustiva, y puede adaptarse para su aplicación a cualquier síntesis de oligonucleótidos diana conveniente. En algunas realizaciones, el procedimiento incluye el acoplamiento secuencial de una de las siguientes series de dímeros de amino-dinucleótido tiofosforamidato-5'-fosforamidito 3'-protegidos y/o monómeros de aminonucleósido-5-fosforamidito 3'-protegidos a un grupo terminal de un soporte en fase sólida:
TA, G, G, G, T, T, A, G, A, C, A, A
T, AG, G, G, T, T, A, G, A, C, A, A
T, A, GG, G, T, T, A, G, A, C, A, A
T, A, G, GG, T, T, A, G, A, C, A, A
T, A, G, G, GT, T, A, G, A, C, A, A
T, A, G, G, G, TT, A, G, A, C, A, A
T, A, G, G, G, T, TA, G, A, C, A, A
T, A, G, G, G, T, T, AG, A, C, A, A
T, A, G, G, G, T, T, A, GA, C, A, A
T, A, G, G, G, T, T, A, G, AC, A, A
T, A, G, G, G, T, T, A, G, A, CA, A
T, A, G, G, G, T, T, A, G, A, C, AA
TA, GG, G, T, T, A, G, A, C, A, A
TA, G, GG, T, T, A, G, A, C, A, A
TA, G, G, GT, T, A, G, A, C, A, A
TA, G, G, G, TT, A, G, A, C, A, A
TA, G, G, G, T, TA, G, A, C, A, A
TA, G, G, G, T, T, AG, A, C, A, A
TA, G, G, G, T, T, A, GA, C, A, A
TA, G, G, G, T, T, A, G, AC, A, A
TA, G, G, G, T, T, A, G, A, CA, A
TA, G, G, G, T, T, A, G, A, C, AA
T, AG, GG, T, T, A, G, A, C, A, A
T, AG, G, GT, T, A, G, A, C, A, A
T, AG, G, G, TT, A, G, A, C, A, A
T, AG, G, G, T, TA, G, A, C, A, A
T, AG, G, G, T, T, AG, A, C, A, A
T, AG, G, G, T, T, A, GA, C, A, A
T, AG, G, G, T, T, A, G, AC, A, A
T, AG, G, G, T, T, A, G, A, CA, A
T, AG, G, G, T, T, A, G, A, C, AA
T, A, GG, GT, T, A, G, A, C, A, A
T, A, GG, G, TT, A, G, A, C, A, A
T, A, GG, G, T, TA, G, A, C, A, A
T, A, GG, G, T, T, AG, A, C, A, A
T, A, GG, G, T, T, A, GA, C, A, A
T, A, GG, G, T, T, A, G, AC, A, A
T, A, GG, G, T, T, A, G, A, CA, A
T, A, GG, G, T, T, A, G, A, C, AA
T, A, G, GG, TT, A, G, A, C, A, A
T, A, G, GG, T, TA, G, A, C, A, A
T, A, G, GG, T, T, AG, A, C, A, A
T, A, G, GG, T, T, A, GA, C, A, A
T, A, G, GG, T, T, A, G, AC, A, A
T, A, G, GG, T, T, A, G, A, CA, A
T, A, G, GG, T, T, A, G, A, C, AA
T, A, G, G, GT, TA, G, A, C, A, A
T, A, G, G, GT, T, AG, A, C, A, A
T, A, G, G, GT, T, A, GA, C, A, A
T, A, G, G, GT, T, A, G, AC, A, A
T, A, G, G, GT, T, A, G, A, CA, A
T, A, G, G, GT, T, A, G, A, C, AA
T, A, G, G, G, TT, AG, A, C, A, A
T, A, G, G, G, TT, A, GA, C, A, A
T, A, G, G, G, TT, A, G, AC, A, A
T, A, G, G, G, TT, A, G, A, CA, A
T, A, G, G, G, TT, A, G, A, C, AA
T, A, G, G, G, T, TA, GA, C, A, A
T, A, G, G, G, T, TA, G, AC, A, A
T, A, G, G, G, T, TA, G, A, CA, A
T, A, G, G, G, T, TA, G, A, C, AA
T, A, G, G, G, T, T, AG, AC, A, A
T, A, G, G, G, T, T, AG, A, CA, A
T, A, G, G, G, T, T, AG, A, C, AA
T, A, G, G, G, T, T, A, GA, CA, A
T, A, G, G, G, T, T, A, GA, C, AA TA, GG, GT, T, A, G, A, C, A, A
TA, GG, G, TT, A, G, A, C, A, A
TA, GG, G, T, TA, G, A, C, A, A
TA, GG, G, T, T, AG, A, C, A, A
TA, GG, G, T, T, A, GA, C, A, A
TA, GG, G, T, T, A, G, AC, A, A
TA, GG, G, T, T, A, G, A, CA, A
TA, GG, G, T, T, A, G, A, C, AA
TA, G, GG, TT, A, G, A, C, A, A
TA, G, GG, T, TA, G, A, C, A, A
TA, G, GG, T, T, AG, A, C, A, A
TA, G, GG, T, T, A, GA, C, A, A
TA, G, GG, T, T, A, G, AC, A, A
TA, G, GG, T, T, A, G, A, CA, A
TA, G, GG, T, T, A, G, A, C, AA, etc.
TA, GG, GT, TA, G, A, C, A, A
TA, GG, GT, T, AG, A, C, A, A
TA, GG, GT, T, A, GA, C, A, A
TA, GG, GT, T, A, G, AC, A, A
TA, GG, GT, T, A, G, A, CA, A
TA, GG, GT, T, A, G, A, C, AA, etc.
TA, GG, GT, TA, GA, C, A, A
TA, GG, GT, TA, G, AC, A, A
TA, GG, GT, TA, G, A, CA, A
TA, GG, GT, TA, G, A, C, AA, etc.
TA, G, GG, TT, AG, AC, A, A
TA, G, GG, TT, AG, A, CA, A
TA, G, GG, TT, AG, A, C, AA
TA, G, G, GT, TA, GA, CA, A
TA, G, G, GT, TA, GA, C, AA
TA, G, G, GT, TA, GA, CA, A
TA, G, G, G, TT, AG, AC, AA
TA, G, GG, T, TA, GA, CA, A
TA, G, GG, T, TA, GA, C, AA
TA, G, GG, T, TA, G, AC, AA, etc.
T, A, G, GG, TT, AG, AC, AA T, A, GG, G, TT, AG, AC, AA
T, AG, G, G, TT, AG, AC, AA
TA, G, G, G, TT, AG, AC, AA
T, AG, G, GT, T, AG, AC, AA, etc.
T, AG, GG, T, T, AG, AC, AA, etc.
T, AG, GG, TT, A, G, AC, AA, etc.
T, AG, GG, TT, AG, A, C, AA, etc.
T, AG, GG, TT, AG, AC, A, A
T, AG, GG, TT, AG, AC, AA
TA, G, GG, TT, AG, AC, AA
TA, GG, G, TT, AG, AC, AA
TA, GG, GT, T, AG, AC, AA
TA, GG, GT, TA, G, AC, AA
TA, GG, GT, TA, GA, C, AA o
TA, GG, GT, TA, GA, CA, A.
En algunas realizaciones divulgadas, el procedimiento incluye el acoplamiento secuencial de una serie de dímeros de amino-dinucleótido tiofosforamidato-5'-fosforamidito 3'-protegidos y/o monómeros de aminonucleósido-5'-fosforamidito 3'-protegidos a un grupo terminal de un soporte en fase sólida, donde al menos el acoplamiento final de la síntesis es un acoplamiento de dímeros. En determinadas realizaciones, el penúltimo acoplamiento y el acoplamiento final son acoplamientos de dímeros. En determinados casos, cuando N es par, el procedimiento incluye acoplamientos de dímeros N/2. En determinados casos, cuando N es par, el procedimiento incluye acoplamientos de dímeros N/2-1. En determinados casos, cuando N es par, el procedimiento incluye acoplamientos de dímeros N/2-2. En determinados casos, cuando N es par, el procedimiento incluye acoplamientos de dímeros N/2-3. En determinados casos, cuando N es par, el procedimiento incluye acoplamientos de dímeros N/2-4. En determinados casos, cuando N es par, el procedimiento incluye acoplamientos de dímeros N/2-5. En determinados casos, cuando N es impar, el procedimiento incluye acoplamientos de dímeros N/2-1. En determinados casos, cuando N es impar, el procedimiento incluye acoplamientos de dímeros N/2-2. En determinados casos, cuando N es impar, el procedimiento incluye acoplamientos de dímeros N/2-3. En determinados casos, cuando N es impar, el procedimiento incluye acoplamientos de dímeros N/2-4. En determinados casos, cuando N es impar, el procedimiento incluye acoplamientos de dímeros N/2-5. En determinados casos, cuando N es impar, el procedimiento incluye acoplamientos de dímeros N/2-6. Por ejemplo, un acoplamiento secuencial de la siguiente serie de dímeros de tiofosforamidato-5-fosforamidito de amino-dinucleótidos 3'-protegidos y/o monómeros de aminonucleósido-5-fosforamidito 3'-protegidos a un grupo terminal de un soporte en fase sólida:
T, A, G, G, G, T, T, A, G, A, C, AA
T, A, G, G, G, T, T, A, G, AC, AA
T, A, G, G, G, T, T, A, GA, C, AA
T, A, G, G, G, T, T, AG, A, C, AA
T, A, G, G, G, T, TA, G, A, C, AA
T, A, G, G, G, TT, A, G, A, C, AA
T, A, G, G, GT, T, A, G, A, C, AA
T, A, G, GG, T, T, A, G, A, C, AA
T, A, GG, G, T, T, A, G, A, C, AA
T, AG, G, G, T, T, A, G, A, C, AA
TA, G, G, G, T, T, A, G, A, C, AA, etc.
T, A, G, G, G, T, T, AG, AC, AA
T, A, G, G, G, TT, AG, AC, AA
T, A, G, GG, TT, AG, AC, AA
T, AG, GG, TT, AG, AC, AA
TA, G, GG, TT, AG, AC, AA
TA, GG, G, TT, AG, AC, AA
TA, GG, GT, T, AG, AC, AA
TA, GG, GT, TA, G, AC, AA
TA, GG, GT, TA, GA, C, AA.
En algunas realizaciones del procedimiento, el dímero amino-dinudeótido tiofosforamidato-5'-fosforamidito 3'-protegido se describe mediante la fórmula X<1>X2, donde X<1>y X<2>se seleccionan independientemente de una adenina protegida, una citosina protegida, una guanina protegida, timina y uracilo.
Oligonucleótidos modificados con lípidos
Se puede usar una variedad de enfoques sintéticos para conjugar una unidad estructural lipídica L' con el oligonucleótido, dependiendo de la naturaleza del enlace seleccionado, incluyendo los enfoques descritos en Mishra et al., (1995) Biochemica et Biophysica Acta, 1264:229-237, Shea et al., (1990) Nucleic Acids Res.
18:3777-3783; y Rump et al., (1998) Bioconj. Chem. 9:341-349. La síntesis de compuestos en los que la unidad estructural lipídica se conjuga en el extremo 5' o 3' del oligonucleótido puede lograrse mediante el uso de grupos funcionales apropiados en el extremo apropiado, en algunos casos un grupo amino, que puede hacerse reaccionar con ácidos carboxílicos, cloruros de ácido, anhídridos y ésteres activos. Los grupos tiol también pueden usarse como grupos funcionales (véase Kupihar et al., (<2 0 0 1>) Bioorganic and Medicinal Chemistry 9:1241-1247). Para la síntesis de oligonucleótidos se comercializan modificadores tanto amino como tiol de diferentes longitudes de cadena. Los oligonucleótidos con enlaces fosforamidato N 3'^P5' (por ejemplo, tiofosforamidato N3'^P5') contienen grupos 3'-amino (en lugar de los 3'-hidroxi que se encuentran en la mayoría de las químicas de oligonucleótidos convencionales), por lo que estos oligonucleótidos ofrecen una oportunidad única para conjugar grupos lipídicos con el extremo 3'-del oligonucleótido.
Se pueden usar diversos enfoques para unir grupos lipídicos a los extremos de los oligonucleótidos con la química del fosforamidato N 3'^P5' (por ejemplo, tiofosforamidato N3'^P5') (véase, por ejemplo, el enlazante 3-palmitoilamido-1-O-(4,4'-dimetoxitritilo)-2-O-succinil propanodiol de la tabla 2). Para la unión al extremo 3', los compuestos conjugados pueden sintetizarse haciendo reaccionar el grupo 3'-amino libre del oligonucleótido unido al soporte sólido totalmente protegido con el anhídrido ácido correspondiente, seguido de desprotección con amoníaco y purificación. Alternativamente, puede usarse el acoplamiento de ácidos carboxílicos de lípidos al grupo 3'-amino libre del oligonucleótido unido al soporte usando agentes de acoplamiento como carbodiimidas, HBTU o yoduro de 2-cloro-1 -metilpiridinio para conjugar los grupos lipídicos. Estos dos procedimientos forman un enlace amida entre el lípido y el oligonucleótido. Los lípidos también pueden unirse a la cadena de oligonucleótidos usando un derivado fosforamidito del lípido acoplado a los oligonucleótidos durante la elongación de la cadena. Este enfoque produce un enlace fosforamidato (por ejemplo, tiofosforamidato) que conecta el lípido y el oligonucleótido (ejemplificado por los compuestos propil-palmitoil y 2-hidroxi-propil-palmitoil). Todavía otro enfoque implica la reacción del grupo 3'-amino libre del oligonucleótido unido al soporte totalmente protegido con un aldehído lipídico apropiado, seguido de la reducción con cianoborohidruro sódico, que produce un enlace amina.
Para la unión al extremo 5', el oligonucleótido puede sintetizarse usando un soporte sólido modificado que contenga lípidos, seguido de la síntesis del oligonucleótido en la dirección 5' a 3' como se describe en Pongracz & Gryaznov (1999). A continuación se proporciona un ejemplo del soporte modificado. En el caso en que n=14, el ácido graso es ácido palmítico: la reacción de 3-amino-1,2-propanediol con cloruro de palmitoilo, seguida de dimetoxitrilación y succinilación proporcionó el intermediario usado para el acoplamiento al soporte sólido. R puede ser vidrio poroso controlado por alquil amina de cadena larga.
Dímeros útiles para fabricar oligonucleótidos
En algunas realizaciones del procedimiento de fabricación de un oligonucleótido, el procedimiento incluye poner en contacto un grupo 3'-terminal libre unido al soporte (por ejemplo, un grupo 3'-hidroxilo o 3'-amino) con una subunidad dímero dinucleótido para formar un enlace entre subunidades. En general, el dímero dinucleotídico está 3'-protegido e incluye un 5'-grupo capaz de acoplarse con el grupo 3'-terminal. En algunas realizaciones, el dímero dinucleotídico incluye un 5'-fosforamidito. El dímero dinucleótido puede incluir un grupo amino 3'-protegido o un grupo hidroxilo 3'-protegido. En algunas realizaciones, el dinucleótido se describe mediante la fórmula X<1>X2, donde X<1>y X<2>son independientemente nucleósidos convenientes (por ejemplo, A, C, G, T o U o una versión protegida de los mismos) unidos mediante cualquier enlace internucleósido conveniente (por ejemplo, como se describe en la presente memoria). El dinucleótido puede incluir cualquier enlace internucleósido conveniente entre los dos nucleósidos. Los enlaces internucleósidos de interés que encuentran uso en los dímeros dinucleótidos incluyen, pero no se limitan a, un fosfodiéster, un fosfotriester, un metilfosfonato, un fosforamidato (por ejemplo, un tiofosforamidato) y un enlace fosforotioato.
En algunos casos, el dímero dinucleótido es un dímero 3'-protegido-dinucleótido-5'-fosforamidito, o un precursor sintético del mismo, donde el dinucleótido se describe mediante la fórmulaX<1>X2, donde X<1>y X<2>se seleccionan independientemente de A, C, G, T y U o una versión protegida de los mismos, y donde X<1>y X<2>están unidas mediante un fosfodiéster, un fosfotriester, un metilfosfonato, un fosforamidato (p. ej., un tiofosforamidato) o un enlace fosforotioato, o una versión protegida de los mismos.
En algunas realizaciones del procedimiento de fabricación de un oligonucleótido, el procedimiento incluye poner en contacto un grupo 3'-amino libre unido al soporte con un dímero amino-dinucleótido fosforamidato-5'-fosforamidito 3'-protegido para formar un enlace fosforamidito N 3'^P5' internucleósido. Cualquier dímero aminodinucleótido fosforamidato-5'-fosforamidito 3'-protegido conveniente, o precursores sintéticos de los mismos, puede usarse en los procedimientos en cuestión. En algunos casos, el dímero puede estar representado por una de las siguientes secuencias: AA, AC, AG, AT, AU, CA, CC, CG, CT o CU, GA, GC, GG, GT o GU, TA o UA, TC o UC, TG o UG y TT o UU. En algunos casos, el dímero incluye grupos 2'-hidroxilo protegidos.
En determinadas realizaciones, el dímero dinucleotídico es un compuesto tiofosforamidato dinucleotídico descrito por la fórmula (II):
en la que B1 y B2 son cada uno independientemente una purina, una purina protegida, una pirimidina o una pirimidina protegida, o un análogo de las mismas; R11 es hidrógeno, un grupo protector o un grupo fosforamidito; R12 es hidrógeno o un grupo protector; y R13 es hidrógeno, un alquilo, un alquilo sustituido, un arilo, un arilo sustituido o un grupo protector. En algunos casos, B1 y/o B2 incluyen un grupo protector de nucleobase. Se entiende que, cuando R13 es hidrógeno, un alquilo, un alquilo sustituido, un arilo, un arilo sustituido o un grupo protector, algunos de los dímeros de dinucleótidos descritos por la fórmula (II) también pueden existir en forma de sal. Tales formas, en la medida en que puedan existir, se incluyen en el ámbito de la presente divulgación.
En algunas realizaciones de la fórmula (II), R11 es hidrógeno. En algunas realizaciones de la fórmula (II), R11 es un grupo protector. Cualquier grupo protector conveniente puede encontrar uso en los dímeros en cuestión de Fórmula (II). En algunas realizaciones de la fórmula (II), R11 es un grupo protector basado en levulinato. En algunas realizaciones de la fórmula (II), R11 es un grupo protector de levulinato (es decir, -COCH<2>CH<2>COCH<3>). En algunas realizaciones de la fórmula (II), R11 es un grupo 5'-fosforamidito.
En algunas realizaciones de la fórmula (II), R12 es hidrógeno. En algunas realizaciones de la fórmula (II), R12 es un grupo protector. En determinadas realizaciones, R12 es un grupo tritilo (por ejemplo, un trifenilmetilo (Trt), un monometoxitritilo (MMT) o un dimetoxitritilo (DMT)). En algunas realizaciones de la fórmula (II), R12 es un grupo protector Trt.
En algunas realizaciones de la fórmula (II), R12 es un grupo protector fotoescindible. Cualquier grupo protector fotoescindible conveniente puede encontrar uso en la preparación de los dímeros de dinucleótidos en cuestión y precursores del mismo. En algunas realizaciones de la fórmula (II), R12 es un grupo protector de pixilo sustituido, tal como un grupo protector de pixilo sustituido con nitro, fluoro, metilo, trifluorometilo y/o metoxi . En algunas realizaciones de la fórmula (II), R12 es un grupo protector de pixilo (es decir, un 9-(9-fenil)xantenil).
En algunas realizaciones de la fórmula (II), R11 es un grupo protector levunilo y R12 es un grupo protector tritilo.
En algunas realizaciones de la fórmula (II), R13 es hidrógeno. En algunas realizaciones de la fórmula (II), R13 es un grupo protector. En determinadas realizaciones, R13 es un grupo 2-ciano-etilo.
En determinadas realizaciones, el dímero amino-dinucleótido fosforamidato-5'-fosforamidito 3'-protegido se describe mediante la fórmula (III):
en la que B<1>y B<2>son cada uno independientemente una purina, una purina protegida, una pirimidina o una pirimidina protegida, o un análogo de las mismas. En algunos casos, B<1>y/o B<2>incluyen un grupo protector de nucleobase.
En determinadas realizaciones, el dímero amino-dinucleótido fosforamidato-5'-fosforamidito 3'-protegido se describe mediante la fórmula (III):
en la que B1 y B2 son cada uno independientemente una purina, una purina protegida, una pirimidina o una pirimidina protegida, o un análogo de las mismas; y R18 es un grupo protector tritilo (como un Trt, un DMT o un MMT) o un grupo protector pixilo.
En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B1 y B2 se seleccionan cada uno independientemente de una adenina protegida, una citosina protegida, una guanina protegida, timina y uracilo. En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B1 y B2 se seleccionan cada una independientemente entre A(Bz), A(DMF), C(Bz), G(isobutiril), T y U. En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B1 es A(Bz). En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B1 es A(DMF). En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B1 es C(Bz). En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B1 es G(isobutiril). En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B1 es T o U. En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B2 es A(Bz) o A(DMF). En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B2 es C(Bz). En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B2 es G(isobutiril). En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B2 es T o U.
En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B1 es A(Bz) o A(DMF) y B2 es A(Bz) o A(DMF). En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B1 es A(Bz) o A(DMF) y B2 es C(Bz). En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III),B1 es A(Bz) o A(DMF) y B2 es G(isobutiril). En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B1 es A(Bz) o A(DMF) y B2 es T o U.
En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B1 es C(Bz) y B2 es A(Bz) o A(DMF). En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B1 es C(Bz) y B2 es C(Bz). En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B1 es C(Bz) y B2 es G(isobutiril). En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B1 es C(Bz) y B2 es T o U.
En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B1 es G(isobutiril) y B2 es A(Bz) o A(DMF). En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B1 es G(isobutiril) y B2 es C(Bz). En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B1 es G(isobutiril) y B2 es G(isobutiril). En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B1 es G(isobutiril) y B2 es T o U.
En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B1 es T o U y B2 es A(Bz) o A(DMF). En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B1 es T o U y B2 es C(Bz). En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B1 es T o U y B2 es G(isobutiril). En algunas realizaciones de las fórmulas (II) o (III), B1 es T o U y B2 es T o U. Se entiende que cualquiera de las realizaciones de las fórmulas (II) o (III) escritas en la presente memoria puede aplicarse también a la fórmula (IV).
Cualquiera de los dímeros descritos en la presente memoria puede adaptarse para su uso en los procedimientos en cuestión. Los dímeros en cuestión pueden prepararse según cualquier procedimiento conveniente a partir de cualquier monómero nucleósido conveniente. Los monómeros nucleósidos de interés que se usan en la preparación de los dímeros nucleósidos en cuestión incluyen, pero no se limitan a, los monómeros 16, 17, 12 y 13 que se representan en los esquemas sintéticos descritos en la presente memoria. Los dímeros dinucleotídicos de interés incluyen dímeros no fosfilados que se usan en la preparación de los dímeros dinucleotídicos fosfilados, tales como los dímeros 18 y 19, que se usan en la preparación de dímeros dinucleotídicos fosfilados, tales como el 20, o el dímero 14, que se usa en la preparación de dímeros dinucleotídicos fosfilados, tales como el 15.
En algunas realizaciones, los dímeros de las fórmulas (III) y (IV) se preparan mediante el procedimiento descrito en el siguiente esquema:
donde B1 y B2 son cada uno independientemente una purina, una purina protegida, una pirimidina o una pirimidina protegida, o un análogo de las mismas; R15 es hidrógeno o un grupo protector amino; R17 es un grupo protector amino; y R16 es un grupo protector hidroxilo. En determinadas realizaciones, R15 es hidrógeno. En determinadas realizaciones del monómero 16, R16 es un sililo. En determinadas realizaciones del monómero 16, R16 es TBDMS (tert-butildimetilsililo). En determinadas realizaciones del monómero 17, R17 es un tritil (Trt). En determinadas realizaciones del monómero 17, R17 es un monometoxitritilo (MMT).
En determinadas realizaciones del monómero 17, R17 es un dimetoxitritilo (DMT). En determinadas realizaciones del monómero 17, R17 es un pixilo. En determinadas realizaciones de los dímeros 18-20, R17 es un tritil (Trt). En determinadas realizaciones de los dímeros 18-20, R17 es un monometoxitritilo (MMT). En determinadas realizaciones de los dímeros 18-20, R17 es un dimetoxitritilo (DMT). En determinadas realizaciones de los dímeros 18-20, R17 es un pixilo.
En algunas realizaciones, los dímeros de las Fórmulas (III) y (IV) se preparan mediante el procedimiento representado en el siguiente esquema, donde el monómero 13 se prepara a partir de 11 mediante el monómero 12 y se acopla con un nucleósido amidito para producir el dímero 14 que se convierte en el dímero 15:
donde B1 y B2 son cada uno independientemente una purina, una purina protegida, una pirimidina o una pirimidina protegida, o un análogo de las mismas; y R13y R14 son cada uno independientemente un grupo protector. En determinadas realizaciones de los monómeros 12 y 13, R13 es un tritil. En determinadas realizaciones de los monómeros 12 y 13, R13 es un pixilo. En determinadas realizaciones de los dímeros 14 y 15, R14 es un tritil. En determinadas realizaciones de los dímeros 14 y 15, R14 es un dimetoxitritilo. En determinadas realizaciones de los dímeros 14 y 15, R14 es un monometoxitritilo. En determinadas realizaciones de los dímeros 14 y 15,R14 es un pixilo. Los monómeros de interés que se usan en la preparación de los dímeros de dinucleótidos según los procedimientos descritos en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a:
donde B es una purina, una purina protegida, una pirimidina o una pirimidina protegida, o un análogo de las mismas y R es hidrógeno o un alquilo (por ejemplo, metilo) o un halógeno (por ejemplo, bromo). En determinados casos, B se selecciona entre A(Bz), G(iBu), T, A(DMF), C(Bz) o U.
Composiciones de oligonucleótidos
Además de un oligonucleótido diana, durante la síntesis de oligonucleótidos puede producirse una variedad de productos de síntesis de oligonucleótidos no diana. Los productos menores que pueden estar presentes en las preparaciones de oligonucleótidos incluyen, pero no se limitan a, productos de deleción (por ejemplo, productos que carecen de uno o más residuos nucleosídicos), productos que incluyen uno o más grupos protectores, productos terminados (por ejemplo, productos que incluyen una cadena oligonucleotídica tapada), productos que carecen de una o más nucleobases, productos que incluyen enlaces fosforamiditas parcialmente oxidados y productos que incluyen enlaces parcialmente sulfurados. Como se usa en la presente memoria, oligonucleótido diana se refiere a una secuencia oligonucleotídica de interés, que es el producto diana del procedimiento de preparación. En la presente memoria, los términos "producto no diana" y "producto menor" se usan indistintamente y se refieren a cualquier producto que contenga oligonucleótidos que no sea el producto diana, y que puede aparecer durante y después de los ciclos de síntesis del oligonucleótido diana.
Los procedimientos en cuestión proporcionan composiciones que incluyen una pureza mejorada del oligonucleótido diana. En algunas realizaciones, la composición incluye un 50 % o más en peso del oligonucleótido diana, tal como aproximadamente 55 % o más, aproximadamente 60 % o más, aproximadamente 65 % o más, aproximadamente 70 % o más, aproximadamente 75 % o más, aproximadamente 80 % o más, aproximadamente 85 % o más, aproximadamente 90 % o más, o incluso aproximadamente 95 % o más en peso del oligonucleótido diana. En determinadas realizaciones, la composición incluye un 50 % o más en peso del oligonucleótido diana. En determinadas realizaciones, la composición incluye un 55 % o más en peso del oligonucleótido diana. En determinadas realizaciones, la composición incluye un 60 % o más en peso del oligonucleótido diana. En determinadas realizaciones, la composición incluye un 65 % o más en peso del oligonucleótido diana. En determinadas realizaciones, la composición incluye un 70 % o más en peso del oligonucleótido diana. En determinadas realizaciones, la composición incluye un 75 % o más en peso del oligonucleótido diana. En determinadas realizaciones, la composición incluye un 80 % o más en peso del oligonucleótido diana. En determinadas realizaciones, la composición incluye un 85 % o más en peso del oligonucleótido diana. En determinadas realizaciones, la composición incluye un 90%o más en peso del oligonucleótido diana. En determinadas realizaciones, la composición incluye un 95 % o más en peso del oligonucleótido diana.
En algunas realizaciones, los procedimientos en cuestión proporcionan una eficiencia de acoplamiento del 95 % o
más, tal como 96 % o más, 97 % o más, 98 % o más, o incluso 98 % o más.
En algunas realizaciones, los procedimientos en cuestión proporcionan una eficacia de acoplamiento media que
es del 0,5 % o más, tal como del 0,75 % o más, del 1,0 % o más, del 1,25 % o más, del 1,5 % o más, del 1,75 %
o más, del 2,0 % o más, del 2,5 % o más, o incluso del 3,0 % o más, que la eficacia de acoplamiento media de una
síntesis de control realizada usando únicamente subunidades monoméricas. En determinadas realizaciones, los procedimientos en cuestión proporcionan una eficacia de acoplamiento del 96 % o superior. En determinadas realizaciones, los procedimientos en cuestión proporcionan una eficacia de acoplamiento del 2 % o superior a la
eficacia de acoplamiento de una síntesis de control realizada usando únicamente subunidades monoméricas.
Después de la síntesis, las composiciones en cuestión pueden someterse a una o más etapas de purificación (por
ejemplo, cromatografía HPLC, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración en gel,
etc.), por ejemplo, para eliminar uno o más productos menores del oligonucleótido diana. Se entiende que, en las composiciones en cuestión de estudio, las cantidades reducidas de productos menores y/o la cantidad aumentada
de oligonucleótido diana proporcionadas por los procedimientos de preparación en cuestión pueden referirse a
tales cantidades y purezas obtenidas inmediatamente después de la síntesis y antes de que se haya realizado
cualquier etapa de purificación o de separación adicional (por ejemplo, cromatografía HPLC). Como tal, en algunos
casos, las composiciones en cuestión pueden denominarse preparaciones de síntesis, por ejemplo, preparaciones
de síntesis no purificadas. Por no purificado se entiende que no se han realizado etapas de purificación cromatográfica en la composición. La purificación cromatográfica se refiere a cualquier procedimiento de purificación conveniente que incluya la absorción del polinucleótido diana a un soporte cromatográfico y la posterior
elución del polinucleótido diana. En algunos casos, la purificación por cromatografía se refiere a la purificación por cromatografía de fase inversa.
Los procedimientos en cuestión proporcionan composiciones que incluyen una cantidad reducida de uno o más productos menores. Por cantidad reducida se entiende que la cantidad en peso del producto menor en la composición en relación con el oligonucleótido diana se reduce en relación con una síntesis de control, por ejemplo,
una síntesis en la que el oligonucleótido se prepara usando únicamente acoplamientos monoméricos. En algunas realizaciones, la cantidad reducida de producto menor es aproximadamente el 20 % o menor que la cantidad en
peso del oligonucleótido diana, tal como aproximadamente el 15 % o menos, aproximadamente el 10 % o menos,
o aproximadamente el 5 % o menor que la cantidad en peso del oligonucleótido diana. En determinadas realizaciones, la cantidad reducida de producto menor es 20 % o menos de la cantidad en peso del oligonucleótido
diana, tal como 15 % o menos, 10 % o menos, 9 % o menos, 8 % o menos, 7 % o menos, 6 % o menos, 5 % o
menos, 4 % o menos, 3 % o menos, 2 % o menos, o incluso 1 % o menos de la cantidad en peso del oligonucleótido
diana. En determinadas realizaciones, el producto menor es un producto (N-x).
Los procedimientos de preparación en cuestión pueden proporcionar composiciones que tienen una cantidad
reducida de uno o más productos (N-x) en relación con un oligonucleótido diana de interés, donde x es un número
entero de 1 a N-1 y N es el número de residuos nucleósidos en el oligonucleótido diana. Como tal, el producto (N-1) puede referirse a todos y cada uno de los productos de oligonucleótidos que carecen de un residuo de nucleótido
en comparación con un oligonucleótido diana (por ejemplo, un producto N). Como tal, un producto (N-2) se refiere
a todos y cada uno de los productos de oligonucleótidos que carecen de dos residuos de nucleótidos en comparación con un oligonucleótido diana (por ejemplo, un producto N). En determinadas realizaciones, el
producto menor es un producto (N-1). En determinadas realizaciones, el producto menor es un producto (N-2). En determinadas realizaciones, el producto menor es un producto (N-3). En determinadas realizaciones, el producto
menor es un producto (N-4). En determinadas realizaciones, el producto menor es un producto (N-5). En determinadas realizaciones, el producto menor es un producto (N-6). En determinadas realizaciones, el producto
menor es un producto (N-7).
En determinadas realizaciones, cualquiera de las composiciones escritas en la presente memoria que tienen una
cantidad reducida de uno o más productos (N-x) en relación con un oligonucleótido diana de interés no se purifica.
En algunas realizaciones, las composiciones en cuestión incluyen una proporción baja de producto (N-1) con
respecto al producto oligonucleótido diana. En algunos casos, la proporción baja es menor que (2,0 * N) partes
por 100 partes en peso de producto (N-1) en relación con el oligonucleótido diana, donde N se refiere al número
de residuos de nucleótidos en la secuencia del oligonucleótido diana. En determinadas realizaciones, la proporción
es menor que (1,9 * N) partes por 100 partes en peso de producto (N-1) en relación con el oligonucleótido diana,
tal como menor que (1,8 * N) partes por 100, menor que (1,7 * N) partes por 100, menor que (1,6 * N) partes por
100, menor que (1,5 * N) partes por 100, menor que (1,4 * N) partes por 100, menor que (1,3 * N) partes por 100,
menor que (1,2 * N) partes por 100, menor que (1,1 * N) partes por 100, men menor que (0,9 ) partes por 100, menor que (0,8 * partes por 100, men menor que (0,6 * N) partes por 100, menor que (0,5 * N) partes por 100, men menor que (0,3 * N) partes por 100, menor que (0,2 * N) partes por 100, o incluso menor que (0,1 * N) partes por
100 partes en peso del producto (N-1) en relación con el oligonucleótido diana. En determinadas realizaciones, las composiciones en cuestión incluyen una proporción baja de menor que (1,5 * N) partes por 100 partes en peso de producto (N-1) en relación con el oligonucleótido diana. En determinadas realizaciones, las composiciones en cuestión incluyen una proporción baja de menor que (1,2 * N) partes por 100 partes en peso de producto (N-1) en relación con el oligonucleótido diana. En determinadas realizaciones, las composiciones en cuestión incluyen una proporción baja de menor que (1,0 * N) partes por 100 partes en peso de producto (N-1) en relación con el oligonucleótido diana. En determinadas realizaciones, las composiciones en cuestión incluyen una proporción baja de menor que (0,5 * N) partes por 100 partes en peso de producto (N-1) en relación con el oligonucleótido diana.
En algunas realizaciones, las composiciones en cuestión incluyen una proporción baja de producto (N-2) con respecto al producto oligonucleótido diana. En algunos casos, la proporción baja es menor que (2,0 * N) partes por 100 partes en peso de producto (N-2) en relación con el oligonucleótido diana, donde N se refiere al número de residuos de nucleótidos en la secuencia del oligonucleótido diana. En determinadas realizaciones, la proporción es menor que (1,9 * N) partes por 100 partes en peso del producto (N-2) en relación con el oligonucleótido diana, como por ejemplo menor que (1,8 * N) partes por 100, menor que (1,7 * N) partes por 100, menor que (1,6 * N) partes por 100, menor que (1,5 * N) partes por 100, menor que (1,4 * N) partes por 100, menor que (1,3 * N) partes por 100, menor que (1,2 * N) partes por 100, menor que (1,1 * N) partes por 100, menor que (1,0 * N) partes por 100, menor que (0,9 * N) partes por 100, menor que (0,8 * N) partes por 100, menor que (0,7 * N) partes por 100, menor que (0,6 * N) partes por 100, menor que (0,5 * N) partes por 100, menor que (0,4 * N) partes por 100, menor que (0,3 * N) partes por 100, menor que (0,2 * N) partes por 100, o incluso menor que (0,1 * N) partes por 100 partes en peso del producto (N-2) en relación con el oligonucleótido diana. En determinadas realizaciones, las composiciones en cuestión incluyen una proporción baja de menor que (1,5 * N) partes por 100 partes en peso de producto (N-2) en relación con el oligonucleótido diana. En determinadas realizaciones, las composiciones en cuestión incluyen una proporción baja de menor que (1,2 * N) partes por 100 partes en peso de producto (N-1) en relación con el oligonucleótido diana. En determinadas realizaciones, las composiciones en cuestión incluyen una proporción baja de menor que (1,0 * N) partes por 100 partes en peso de producto (N-1) en relación con el oligonucleótido diana. En determinadas realizaciones, las composiciones en cuestión incluyen una proporción baja de menor que (0,5 * N) partes por 100 partes en peso de producto (N-2) en relación con el oligonucleótido diana.
En algunas realizaciones, las composiciones en cuestión incluyen el producto (N-1) en una cantidad del 20 % o menos del total de oligonucleótidos no diana en la composición, tal como 15 % o menos, 10 % o menos o incluso 5 % o menos del total de oligonucleótidos no diana.
Cualquiera de una amplia variedad de composiciones de oligonucleótidos puede prepararse usando los procedimientos descritos en la presente memoria. Una variedad de clases y tipos de oligonucleótidos son de interés para la preparación usando los procedimientos en cuestión (por ejemplo, como se describe en la presente memoria). Los oligonucleótidos apropiados para la preparación según los procedimientos descritos incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos antisentido, oligonucleótidos de ARN, oligonucleótidos de ARNsi, oligonucleótidos de ARNi, aptámeros de ADN, microARN y similares.
Oligonucleótidos complementarios del componente ARN de la telomerasa
Aspectos de la divulgación incluyen compuestos y composiciones que incluyen oligonucleótidos complementarios al componente ARN de la telomerasa humana, y procedimientos para fabricar los mismos. Los compuestos pueden inhibir la actividad de la telomerasa en las células con una potencia elevada y presentan características de captación celular.
Como se ha resumido anteriormente, los procedimientos en cuestión proporcionan cantidades reducidas de productos oligonucleótidos no diana de la síntesis. En determinados casos, los procedimientos en cuestión proporcionan cantidades crecientes del producto oligonucleótido diana de la síntesis. En algunas realizaciones, los procedimientos en cuestión proporcionan la preparación de composiciones que tienen una cantidad reducida de uno o más productos (N-x) en relación con un oligonucleótido diana de interés. En la tabla 1 se exponen las cantidades de interés de algunos productos oligonucleótidos no diana.
En determinadas realizaciones, cualquiera de las composiciones escritas en la presente memoria que tienen una cantidad reducida de uno o más productos (N-x) en relación con un oligonucleótido diana de interés no se purifica.
Tabla 1. Niveles de productos oligonucleotídicos en composiciones de interés. Las composiciones en cuestión pueden incluir uno o más de los siguientes componentes en uno de los niveles indicados en la tabla 1.
En determinadas realizaciones, la composición tiene menor que (2,0 * N) partes por 100 partes en peso de producto (N-1) en relación con un compuesto, en el que el compuesto incluye un polinucleótido que tiene una secuencia de N subunidades de nucleósido complementarias al componente de ARN de la telomerasa humana, en el que al menos dos de las subunidades de nucleósido están unidas por un enlace entre subunidades de tiofosforamidato N3'^-P5'. En determinadas realizaciones, la proporción es menor que (1,9 * N) partes por 100 partes en peso de producto (N-1) en relación con N producto, como por ejemplo menor que (1,8 * N) partes por 100, menor que (1,7 * N) partes por 100, menor que (1,6 * N) partes por 100, menor que (1,5 * N) partes por 100, menor que (1,4 * N) partes por 100, menor que (1,3 * N) partes por 100, menor que (1,2 * N) partes por 100, menor que (1,1 * N) partes por 100, menor que (1,0 * N) partes por 100, menor que (0,9 * N) partes por 100, menor que (0,8 * N) partes por 100, menor que (0,7 * N) partes por 100, menor que (0,6 * N) partes por 100, menor que (0,5 * N) partes por 100, menor que (0,4 * N) partes por 100, menor que (0,3 * N) partes por 100, menor que (0,2 * N) partes por 100, o incluso menor que (0,1 * N) partes por 100 partes en peso de producto (N-1) en relación con N producto.
En algunas realizaciones, la composición tiene menor que 1 parte en 4 en peso de un producto (N-1) en relación con un compuesto (tal como, menor que 1 parte en 5, menor que 1 parte en 6, menor que 1 parte en 7, menor que 1 parte en 8, menor que 1 parte en 9, menor que 1 parte en 10, menor que 1 parte en 15, menor que 1 parte en 20, menor que 1 parte en 25, menor que 1 parte en 50, menor que 1 parte en 100 en peso de un producto (N-1) en relación con un compuesto), en el que el compuesto comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de 10 o más subunidades de nucleósido complementarias al componente de ARN de la telomerasa humana, en el que al menos dos de las subunidades de nucleósido están unidas por un enlace entre subunidades de tiofosforamidato u oxifosforamidato N3'^-P5'. En determinadas realizaciones, el polinucleótido tiene una secuencia de 10 o más subunidades nucleósidas complementarias al componente ARN de la telomerasa humana, tales como 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más subunidades nucleósidas.
En determinados casos, el polinucleótido incluye una secuencia de 13 o más subunidades nucleósidas complementarias al componente ARN de la telomerasa humana, tales como 15 o más, 20 o más, 30 o más, 50 o más subunidades nucleósidas complementarias al componente ARN de la telomerasa humana.
En determinadas realizaciones, el polinucleótido incluye una secuencia de 7 o más subunidades nucleósidas complementarias al componente ARN de la telomerasa humana, tales como 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 subunidades nucleósidas complementarias al componente ARN de la telomerasa humana. En determinadas realizaciones, el polinucleótido incluye una secuencia de subunidades nucleósidas complementarias al componente ARN de la telomerasa humana de entre 11 y 18, tal como entre 11 y 16 subunidades nucleósidas contiguas complementarias al componente ARN de la telomerasa humana.
En algunas realizaciones, el polinucleótido incluye entre 3 y 50 subunidades nucleósidas contiguas complementarias al componente ARN de la telomerasa humana, tales como entre 5 y 40, entre 10 y 40, entre 10 y 30, entre 10 y 25, entre 10 y 20, o entre 12 y 15 subunidades nucleósidas. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido incluye una secuencia de 10 o más subunidades nucleósidas contiguas complementarias al componente ARN de la telomerasa humana. En determinadas realizaciones, la composición tiene menor que 1 parte en 10 en peso de un producto (N-1) en relación con el compuesto. En determinadas realizaciones, la composición tiene menor que 1 parte en 20 en peso de un producto (N-1) en relación con el compuesto. En determinadas realizaciones, la composición tiene menor que 1 parte en 25 en peso de un producto (N-1) en relación con el compuesto. En determinadas realizaciones, la composición tiene menor que 1 parte en 30 en peso de un producto (N-1) en relación con el compuesto. En determinadas realizaciones, la composición tiene menor que 1 parte en 50 en peso de un producto (N-1) en relación con el compuesto.
En algunas realizaciones, la composición tiene menor que 1 parte en 4 en peso de cualquier producto (N-x) relativo al compuesto, tal como menor que 1 parte en 5, menor que 1 parte en 6, menor que 1 parte en 7, menor que 1 parte en 8, menor que 1 parte en 9, menor que 1 parte en 10, menor que 1 parte en 20, menor que 1 parte en 25, menor que 1 parte en 30, o incluso menor que 1 parte en 50 en peso, de cualquier producto (N-x) relativo al compuesto.
En algunas realizaciones, la composición tiene menor que 40 partes en 100 en peso total de (N-x) productos que contienen polinucleótidos en relación con el compuesto, tales como menor que 35 partes en 100, menor que 30 partes en 100, menor que 25 partes en 100, menor que 20 partes en 100, o incluso menor que 15 partes en 100 en peso, de productos (N-x) que contienen polinucleótidos en relación con el compuesto.
En algunas realizaciones, la composición tiene al menos 5 partes en 100 en peso de productos (N-2) y (N-3) relativos al compuesto, tales como, al menos 10 partes en 100 en peso, al menos 12 partes en 100 en peso, al menos 14 partes en 100 en peso, al menos 15 partes en 100 en peso, al menos 20 partes en 100 en peso, al menos 30 partes en 100 en peso, o al menos 40 partes en 100 en peso de productos (N-2) y (N-3) relativos al compuesto.
En algunas realizaciones, la composición tiene el siguiente perfil de productos que contienen polinucleótidos (N-x):
menor que 1 parte en 4 en peso de un producto (N-1) en relación con el producto N; y
al menos 10 partes por 100 en peso de los productos (N-2) y (N-3) en relación con el producto N.
En determinadas realizaciones, el producto oligonucleótido N comprende una subunidad nucleósida 3'-terminal que está ausente en el producto (N-1).
El compuesto oligonucleótido puede describirse mediante la fórmula:
O-(x'-L')n
donde O representa el oligonucleótido que incluye una secuencia de subunidades nucleosídicas complementarias al componente ARN de la telomerasa humana, x' es un grupo enlazante opcional, L' representa la unidad estructural lipídica y n es un número entero comprendido entre 1-5.
Por lo tanto, el diseño de los compuestos requiere la selección de dos entidades, O y L', y la determinación del(los) enlace(s) estructural(es) entre estas entidades, que pueden incluir el grupo enlazante opcional x'.
En algunas realizaciones, el compuesto oligonucleótido puede describirse mediante la fórmula:
O-(x -L')n
donde O representa el oligonucleótido que incluye una secuencia de subunidades nucleosídicas complementaria al componente ARN de la telomerasa humana, x' es un grupo enlazante opcional, L' representa la unidad estructural lipídica y n es 1, tal como un oligonucleótido de Fórmula (I), o una sal del mismo, en el que en la fórmula (I), Z es la unidad estructural lipídica, L es el enlazante opcional y los grupos B corresponden a la secuencia de subunidades nucleósidas complementarias del componente ARN de la telomerasa humana.
El componente oligonucleótido O puede considerarse como el componente "efector" del compuesto, ya que es este componente el que produce la inhibición de la enzima telomerasa al unirse al componente ARN de la telomerasa. De este modo, la secuencia de O se selecciona de tal manera que incluya una región que sea complementaria a la secuencia del ARN de la telomerasa, que se muestra en SEQ ID NO: 1. La región complementaria al componente ARN de la telomerasa puede en teoría dirigirse a cualquier porción del ARN de la telomerasa, pero las regiones particulares del ARN de la telomerasa son dianas preferentes para los oligonucleótidos inhibidores. Una región diana preferida es la región que abarca los nucleótidos 30-67 de SEQ ID NO: 1, que incluye la "región plantilla", una región de 11 nucleótidos de secuencia 5'-CUAACCCUAAC-3' (SEQ ID NO: 2) que abarca los nucleótidos 46-56 de SEQ ID NO: 1. La región plantilla sirve para especificar la secuencia de las repeticiones teloméricas que la telomerasa agrega a los extremos del cromosoma y es esencial para la actividad de la enzima telomerasa (véase Chen at al., Cell 100:503-514, 2000; Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU. 98(14):7982-7987, 2001). Los compuestos de la divulgación que contienen una unidad estructural de oligonucleótido que comprende una secuencia complementaria a toda o parte de la región plantilla son, por tanto, particularmente preferidos. Otra región diana preferida es la que abarca los nucleótidos 137-179 de hTR (véase Pruzan et al, Nucl. Acids Research, 30:559-588, 2002). Dentro de esta región, la secuencia que abarca 141-153 es un diana preferente. La publicación PCT WO 98/28442 describe el uso de oligonucleótidos de al menos 7 nucleótidos de longitud para inhibir la telomerasa, donde los oligonucleótidos están diseñados para ser complementarios a porciones accesibles de la secuencia hTR fuera de la región plantilla, incluyendo los nucleótidos 137-196, 290-319, y 350-380 de hTR.
La región de O que se dirige a la secuencia hTR es preferiblemente exactamente complementaria a la secuencia hTR correspondiente. Aunque los desajustes pueden tolerarse en determinados casos, se espera que disminuyan la especificidad y la actividad del conjugado oligonucleotídico resultante. En realizaciones particulares, la secuencia de bases del oligonucleótido O se selecciona para incluir una secuencia de al menos 5 nucleótidos exactamente complementaria al ARN de la telomerasa, y puede obtenerse una mayor inhibición de la telomerasa si se emplean longitudes crecientes de secuencia complementaria, tales como al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 13 o al menos 15 nucleótidos exactamente complementarios al ARN de la telomerasa. En otras realizaciones, la secuencia del oligonucleótido incluye una secuencia de al menos 5 a 20, de al menos 8 a 20, de al menos 10 a 20 o de al menos 10 a 15 nucleótidos exactamente complementaria a la secuencia del ARN de la telomerasa. Puede obtenerse una actividad inhibidora de la telomerasa óptima cuando se selecciona la longitud completa del oligonucleótido O para que sea complementario del ARN de la telomerasa. Sin embargo, no es necesario que toda la longitud del componente oligonucleotídico sea exactamente complementaria a la secuencia diana, y la secuencia oligonucleotídica puede incluir regiones que no sean complementarias a la secuencia diana. Tales regiones pueden agregarse, por ejemplo, para conferir otras propiedades al compuesto, como secuencias que faciliten la purificación. Si el componente oligonucleotídico O debe incluir regiones que no son complementarias a la secuencia diana, tales regiones pueden situarse en uno o ambos de los extremos 5' o 3'. En los casos en los que la región de complementariedad exacta se dirige a la región plantilla, se puede conseguir una inhibición eficaz de la telomerasa con una región corta (5-8 nucleótidos) de complementariedad exacta a la que se une una secuencia similar a la telomerasa (rica en G) en el extremo 5'.
Secuencias ejemplares que son complementarias al ARN de la telomerasa humana y que pueden incluirse como parte del componente oligonucleotídico O, o que pueden usarse como todo el componente oligonucleotídico O incluyen las siguientes:
Secuencias complementarias de hTR (regiones de la secuencia de oligonucleótidos SEQ ID NO:1 de la Publicación de los Estados Unidos 2012329858)
GGGUUGCGGA GGGUGGGCCU GGGAGGGGUG GUGGCCAUUU
UUUGUCUAAC CCUAACUGAG AAGGGCGUAG GCGCCGUGCU UUUGCUCCCC GCGCGCUGUU UUUCUCGCUG ACUUUCAGCG GGCGGAAAAG CCUCGGCCUG CCGCCUUCCA CCGUUCAUUC UAGAGCAAAC AAAAAAUGUC AGCUGCUGGC CCGUUCGCCC CUCCCGGGGA CCUGCGGCGG GUCGCCUGCC CAGCCCCCGA ACCCCGCCUG GAGGCCGCGG UCGGCCCGGG GCUUCUCCGG AGGCACCCAC UGCCACCGCG AAGAGUUGGG CUCUGUCAGC CGCGGGUCUC UCGGGGGCGA GGGCGAGGUU CAGGCCUUUC AGGCCGCAGG AAGAGGAACG GAGCGAGUCC CCGCGCGCGG CGCGAUUCCC UGAGCUGUGG GACGUGCACC CAGGACUCGG CUCACACAUG C (SEQ ID NO: 1)
GCTCTAGAATGAACGGTGGAAGGCGGCAGG 137-166 (SEQ ID NO: 6) GTGGAAGGCGGCAGG 137-151 (SEQ ID NO: 7)
GGAAGGCGGCAGG 137-149 (SEQ ID NO: 8)
GTGGAAGGCGGCA 139-151 (SEQ ID NO: 9)
GTGGAAGGCGG 141-151 (SEQ ID NO: 10)
CGGTGGAAGGCGG 141-153 (SEQ ID NO: 11)
ACGGTGGAAGGCG 142-154 (SEQ ID NO: 12)
AACGGTGGAAGGCGGC 143-155 (SEQ ID NO: 13)
ATGAACGGTGGAAGGCGG 144-158 (SEQ ID NO: 14)
ACATTTTTTGTTTGCTCTAG 160-179 (SEQ ID NO: 15)
TAGGGTTAGACAA 42-54 (SEQ ID NO: 3)
GTTAGGGTTAG 46-56 (SEQ ID NO: 4)
GTTAGGGTTAGAC 44-56 (SEQ ID NO: 16)
GTTAGGGTTAGACAA 42-56 (SEQ ID NO: 17)
GGGTTAGAC 44-52
CAGTTAGGG 50-58
CCCTTCTCAGTT 54-65 (SEQ ID NO: 18)
CGCCCTTCTCAG 56-67 (SEQ ID NO: 19)
En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: GTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:4); TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3); y CAGTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:5). La elección del tipo de enlaces inter-nucleósidos usados en la síntesis del componente O puede hacerse a partir de cualquiera de las químicas de oligonucleótidos disponibles, incluyendo pero no limitado a, enlaces fosfodiéster, fosfotriester, metilfosfonato, fosforamidato P3'^N5', fosforamidato N3'^-P5', tiofosforamidato N3'^-P5', y fosforotioato.
En algunas realizaciones, el componente oligonucleotídico O tiene al menos un enlace fosforamidato N 3'^P5' (por ejemplo, tiofosforamidato N3'^P5'). En determinadas realizaciones, las subunidades nucleosídicas complementarias al componente ARN de la telomerasa humana están todas unidas por enlaces entre subunidades fosforamidato N3'^P5'. En determinados casos, los enlaces entre subunidades de fosforamidato N 3'^P5' son enlaces entre subunidades de tiofosforamidato N3'^P5'. En determinados casos, los enlaces entre subunidades de fosforamidato N 3'^P5' son enlaces entre subunidades de oxo-fosforamidato N3'^P5'.
En determinados casos, el enlace entre subunidades tiofosforamidato N3'^-P5' tiene la siguiente estructura:
3'-NH-P(S)(OR)-O-5'
donde R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, un alquilo, un alquilo sustituido, un arilo, un arilo sustituido y un grupo fosfato protector. Se entiende que algunos de los componentes oligonucleotídicos O que incluyen un enlace entre subunidades descrito por la fórmula anterior donde R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, un alquilo, un alquilo sustituido, un arilo, un arilo sustituido y un grupo protector de fosfato, también pueden existir en forma de sal. Tales formas, en la medida en que puedan existir, se incluyen en el ámbito de la presente divulgación.
En algunos casos, el enlace entre subunidades de tiofosforamidato N3'^-P5' se describe mediante la siguiente estructura:
3'-NH-P(S)(OR)-O-5'
donde R es hidrógeno. Se entiende que para cualquiera de los componentes oligonucleotídicos O descritos en la presente memoria que incluyan dicho enlace entre subunidades, tales componentes oligonucleotídicos O también pueden incluir cualquier forma de sal conveniente del enlace. Como tal, el enlace entre subunidades puede estar en forma de sal que incluya cualquier contraión conveniente.
Los compuestos de la divulgación son más eficaces para producir la inhibición de la telomerasa en las células que los oligonucleótidos correspondientes que no están conjugados con componentes lipídicos. Se cree que el componente lipídico L' tiene la función de potenciar la captación celular del compuesto, en particular facilitando el paso a través de la membrana celular. Aunque el mecanismo por el que esto ocurre no se ha dilucidado por completo, una posibilidad es que el componente lipídico facilite la unión del compuesto a la membrana celular, ya sea como molécula única o en forma agregada (micelar), con la subsiguiente internalización. Sin embargo, no es necesario comprender el mecanismo exacto para usar la invención.
El componente lipídico puede ser cualquier lípido o derivado lipídico que proporcione una mejor captación celular en comparación con el oligonucleótido no modificado. Los lípidos preferidos son hidrocarburos, grasas (por ejemplo, glicéridos, ácidos grasos y derivados de ácidos grasos, tales como las amidas grasas) y esteroles. Cuando el componente lipídico es un hidrocarburo, el componente L' puede ser un hidrocarburo cíclico sustituido o no sustituido o un hidrocarburo alifático de cadena lineal o ramificada, que puede ser saturado o insaturado. Los ejemplos preferidos son los hidrocarburos de cadena lineal no ramificada, totalmente saturados o poliinsaturados. La longitud de la cadena hidrocarbonada puede variar de C2-C30, pero puede obtenerse una inhibición óptima de la telomerasa con cadenas de carbono que sean C8-C22. A continuación se enumeran ejemplos preferentes de hidrocarburos saturados (alcanos):
Nombre sistemático / Cadena de carbono
Tetradecano C<14>H<30>
Pentadecano C<15>H<32>
Hexadecano C<16>H<34>
Heptadecano C<17>H<36>
Octadecano CisHss
Nonadecano C<19>H<40>
Eicosano C<20>H<42>
También pueden seleccionarse formas mono y poliinsaturadas (alquenos y polienos, tales como alcadienos y alcatrienos) de hidrocarburos, prefiriéndose compuestos que tengan de uno a tres dobles enlaces, aunque pueden emplearse compuestos que tengan más dobles enlaces. También se pueden usar alquinos (que contengan uno o más enlaces triples) y alquinos (con enlace(s) triple(s) y enlace(s) doble(s)).
Pueden emplearse formas sustituidas de hidrocarburos en los compuestos de la divulgación, prefiriéndose grupos sustituyentes que sean inertes in vivo e in vitro. Un sustituyente particularmente preferido es el flúor. Las estructuras genéricas ejemplares de los hidrocarburos polifluorados incluyen: CF<3>(CF<2>)n-(CH<2>)m- donde m es al menos 1, preferentemente al menos 2, y n=1-30, tales como el fluorotridecano: CF<3>(CF<2>)<9>(CH<2>)<3>; y CH<3>(CH<2>)a(CF<2>)b(CH<2>)cdonde a, b y c son independientemente 1-30.
Otros componentes lipídicos apropiados incluyen ácidos grasos simples y derivados de ácidos grasos, glicéridos y lípidos más complejos tales como los esteroles, por ejemplo el colesterol. Los ácidos grasos y sus derivados pueden ser totalmente saturados o mono o poliinsaturados. La longitud de la cadena de carbono puede variar desde C2-C30, pero puede obtenerse una inhibición óptima de la telomerasa con cadenas de carbono que sean C8-C22. A continuación se enumeran ejemplos preferentes de ácidos grasos saturados:
Nombre sistemático /Nombre trivial 1 Cadena carbonada
Tetradecanoico mirístico 14:0
Hexadecanoico palmítico 16:0
Octadecanoico esteárico 18:0
Eicosanoico araquídico 20:0
También pueden emplearse formas mono y poliinsaturadas de ácidos grasos, siendo preferibles los compuestos con uno a tres dobles enlaces, aunque también pueden emplearse compuestos con más dobles enlaces. Algunos ejemplos de ácidos grasos mono y poliinsaturados comunes que pueden emplearse son:
Nombre sistemático 1 Nombre trivial 1 Cadena de carbono
Cis-9-hexadecanoico palmitoleico 16:1(n-7)
Cis-6-octadecanoico petroselínico 18:1 (n-12)
Cis-9-octadecanoico oleico 18:1 (n-9)
9.12- octadecadienoico linoleico 18:2 (n-6)
6.9.12- octadecatrienoico gamma-linoleico 18:3 (n-6)
9,12,15-octadecatrienoico alfa-linoleico 18:3 (n-3)
5,8,11,14-eicosatetraenoico araquidónico 20:4 (n-6)
Los ácidos grasos con uno o más enlaces triples en la cadena de carbono, así como los ácidos grasos ramificados también pueden emplearse en los compuestos descritos en la presente memoria. En los compuestos descritos en la presente memoria pueden emplearse formas sustituidas de ácidos grasos. Como en el caso de los grupos hidrocarbonados, se prefieren los grupos sustituyentes que son inertes in vivo e in vitro, siendo el flúor uno de los preferidos. Estructuras genéricas ejemplares de derivados polifluorados de ácidos grasos apropiados para el uso descrito en la presente memoria: CF<3>(CF<2>)n-(CH<2>)mCO- donde m es al menos 1, preferentemente al menos 2, y n=1-30, y CH<3>(CH<2>)a(CF<2>)b(CH<2>)cCO- donde a, b y c son independientemente 1-30
En algunos casos, entre uno y cinco componentes L' (n=1-5) están unidos covalentemente al componente O, opcionalmente a través de un enlazante. Normalmente se usan1 o dos componentes L (n=1 o 2). Cuando más de un componente L' está unido al componente O, cada componente L' se selecciona de forma independiente.
Se apreciará que los compuestos de la divulgación descritos como teniendo un hidrocarburo especificado como la unidad estructural L' y los compuestos descritos como teniendo un ácido graso especificado (con el mismo número de átomos de carbono que el hidrocarburo especificado) están estrechamente relacionados y difieren en estructura sólo en la naturaleza del enlace que une la unidad estructural L' al oligonucleótido, que a su vez es un resultado del procedimiento de síntesis usado para producir el compuesto. Por ejemplo, y como se describe con más detalle a continuación, cuando se sintetizan compuestos que tienen la unidad estructural L' conjugada con el extremo 3'-amino de un oligonucleótido (con enlaces internucleósidos de fosforamidato o tiofosforamidato), el uso de la forma aldehídica de un ácido graso (un aldehído graso) como material de partida da lugar a la formación de un enlace amino entre la cadena lipídica y el oligonucleótido, de forma que el grupo lipídico aparece como un hidrocarburo. Por el contrario, el uso de las formas de ácido carboxílico, anhídrido ácido o cloruro ácido del mismo ácido graso da lugar a la formación de un enlace amida, de manera que el grupo lipídico aparece como un derivado de ácido graso, concretamente en este caso una amida grasa (como se ha indicado en la sección de definiciones anterior, en aras de la simplicidad, el término "ácido graso" al describir el grupo L' conjugado se usa en la presente memoria en sentido amplio para incluir derivados de ácidos grasos, incluidas las amidas grasas). Esto se ilustra en los siguientes esquemas que representan el extremo 3'-amino de un oligonucleótido fosforamidado unido a un componente lipídico C14. En el esquema A, L' es ácido tetradecanoico (ácido mirístico), en el que la conexión entre los grupos L' y O es una amida. En el esquema B, L' es tetradecano, y la conexión entre los grupos L' y O es una amina.
El enlace entre los componentes O y L' puede ser un enlace directo, o puede ser a través de una unidad estructural de enlazante opcional, por ejemplo, x' o el enlazante opcional L de Fórmula (I). El grupo enlazante puede servir para facilitar la síntesis química de los compuestos. Se utilice o no un grupo enlazante para mediar en la conjugación de los componentes O y L', existen múltiples sitios en el componente oligonucleotídico O a los que puede conjugarse convenientemente el componente o componentes L'. Los puntos de unión apropiados incluyen los extremos 5' y 3', uno o más anillos de azúcar, el esqueleto internucleósido y las nucleobases del oligonucleótido. En algunos casos, la unidad estructural L' está unida al extremo 3' o 5' del oligonucleótido.
Si el componente L' debe unirse al extremo 3', la unión puede ser directamente al sustituyente 3', que en el caso de los oligonucleótidos de fosforamidato y tiofosforamidato preferidos es el grupo 3'-amino, y en otros casos, tales como los oligonucleótidos de fosfodiéster convencionales, es un grupo 3'-hidroxi. Alternativamente, la unidad estructural L' puede unirse mediante un grupo fosfato 3', en el que un hidrocarburo hexadecano se une al fosfato 3' de un oligonucleótido de tiofosforamidato mediante un enlazante O-alquilo. Si la unidad estructural L' debe unirse al extremo 5', puede unirse mediante un grupo fosfato unido a 5'. La unión a una base en la unidad estructural O puede realizarse a través de cualquier átomo apropiado, por ejemplo al grupo amino N2 de la guanosina. Cuando n>1 es tal que una pluralidad de unidades estructurales lipídicas deben unirse al componente O, los componentes L' seleccionados individualmente pueden unirse en cualquier sitio(s) apropiado(s). Por ejemplo, se puede unir un grupo L' a cada terminación, se pueden unir diversos grupos L' a las bases, o se pueden unir dos o más grupos L' a una terminación.
El componente enlazante opcional x' puede usarse para unir los componentes O y L' de los compuestos. Se entiende que el enlazante opcional (por ejemplo, x', o L de Fórmula (I)) puede estar unido al polinucleótido (por ejemplo, O) a través de un grupo fosfato terminal, por ejemplo, un grupo fosfato 3'-enlazado o un grupo fosfato 5'-enlazado. Si se va a emplear un enlazante, se incorpora a los procedimientos de síntesis como se describe en la presente memoria. Entre los ejemplos de grupos enlazantes apropiados se incluyen los enlazantes de tipo amino glicerol y O-alquil glicerol, que pueden representarse respectivamente mediante las estructuras genéricas:
en la que R'=H, OH, NH2 o SH; Y=O, S o NR; R=H, un alquilo o un alquilo sustituido; y n y m son independientemente números enteros entre 1-18.
Ejemplos específicos de enlazantes apropiados son el enlazante aminoglicerol en el que R'=OH, Y=O, y m y n son cada uno 1:
el enlazante bis-aminoglicerol, en el que R'=OH, Y=NH, y m y n son 1 cada uno:
y el enlazante O-alquil glicerol en el que R H:
Oligonucleótidos modificados con lípidos ejemplares que pueden prepararse según los procedimientos descritos incluyen los compuestos descritos en la figura 1 (por ejemplo, las figuras 1A-1DD) de la Solicitud de los Estados Unidos US20120329858 a Gryaznov et al "Modified oligonucleotides for telomerase inhibition".
En determinadas realizaciones, la composición obtenida por el procedimiento de la invención incluye un compuesto descrito por la estructura:
donde "nps" representa un enlace tiofosforamidato (por ejemplo, -NH-P(=O)(SH)-O-), que conecta el carbono 3' de un nucleósido con el carbono 5' del nucleósido adyacente.
Se entiende que todas las realizaciones que se refieren a un compuesto son también aplicables a las formas de sal de dicho compuesto.
En determinadas realizaciones, la composición obtenida por el procedimiento de la invención incluye un compuesto descrito por la estructura:
o una sal del mismo,
donde "nps" representa un enlace tiofosforamidato (por ejemplo, -NH-P(=O)(SH)-O- o un tautómero del mismo, o una sal del mismo), que conecta el carbono 3' de un nucleósido con el carbono 5' del nucleósido adyacente. En determinadas realizaciones, la composición incluye una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto. En determinados casos, la composición incluye una sal sódica del compuesto. En determinadas realizaciones, la composición incluye una sal de catión divalente del compuesto, tal como una sal de magnesio del compuesto. En determinadas realizaciones, la composición incluye una sal de catión trivalente del compuesto, tal como una sal de aluminio del compuesto.
En determinadas realizaciones, la composición obtenida por el procedimiento de la invención incluye un oligonucleótido descrito por la siguiente estructura, donde cada Mx+ es independientemente hidrógeno o cualquier contraión conveniente de una sal, cada x es independientemente 1,2 o 3 y n es un número entero de 5 a 13, tal como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13, tal como n es 13:
En algunos casos, cada x es 1. En determinados casos, cada x es independientemente 1 o 2. En determinados casos, cada x es independientemente 1 o 3. En determinados casos, Mx+ es hidrógeno.
En determinadas realizaciones, la composición obtenida por el procedimiento de la invención incluye un oligonucleótido descrito por la siguiente estructura y puede incluir cualquier contraión catiónico conveniente de una sal:
En determinadas realizaciones, la composición obtenida por el procedimiento de la invención incluye un compuesto descrito por la estructura:
También se divulgan, pero no forman parte de la invención reivindicada, composiciones de ingredientes farmacéuticos activos compuestos que incluyen un compuesto que contiene oligonucleótidos. Como se usa en la presente memoria, un ingrediente farmacéutico activo se refiere a una composición que se produce usando los procedimientos de preparación en cuestión, donde la composición puede someterse opcionalmente a una o más etapas de purificación posteriores a la síntesis. En general, un principio activo farmacéutico es una composición apropiada para su formulación en una composición farmacéutica. En algunos casos, la composición del ingrediente farmacéutico activo compuesto no se purifica después de la síntesis, de modo que los componentes de la composición que contienen oligonucleótidos reflejan los productos producidos durante la síntesis de oligonucleótidos.
En algunas realizaciones, el ingrediente farmacéutico activo compuesto tiene menor que 9 % en peso de un producto (N-1), en el que el compuesto comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de 10 o más subunidades de nucleósido complementarias al componente de ARN de la telomerasa humana, en el que al menos dos de las subunidades de nucleósido están unidas por un enlace entre subunidades de tiofosforamidato u oxifosforamidato N 3'^P5' (por ejemplo, como se describe en la presente memoria).
En algunas realizaciones, el ingrediente farmacéutico activo compuesto tiene menor que 9 % en peso de un producto (N-1), en el que el compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de 10 o más subunidades de nucleósido complementarias al componente de ARN de la telomerasa humana, en el que al menos dos de las subunidades de nucleósido están unidas por un enlace entre subunidades de tiofosforamidato u oxifosforamidato N 3'^P5' (por ejemplo, como se describe en la presente memoria).
En algunas realizaciones del ingrediente farmacéutico activo compuesto, las subunidades nucleósidas complementarias al componente ARN de la telomerasa humana están todas unidas por enlaces entre subunidades de tiofosforamidato N3'^P5'.
En algunas realizaciones del ingrediente farmacéutico activo compuesto, el enlace entre subunidades de tiofosforamidato N 3'^P5' tiene la siguiente estructura:
3'-NH-P(S)(OR)-O-5'
donde R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, un alquilo, un alquilo sustituido, un arilo, un arilo sustituido y un grupo fosfato protector. Cuando R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, un alquilo, un alquilo sustituido, un arilo, un arilo sustituido y un grupo protector de fosfato, se entiende que algunos de los enlaces entre subunidades descritos por la fórmula anterior también pueden existir en forma de sal. Tales formas, en la medida en que puedan existir, se incluyen en el ámbito de la presente divulgación.
En algunas realizaciones del ingrediente farmacéutico activo compuesto, el enlace entre subunidades de tiofosforamidato N 3'^P5' tiene la siguiente estructura:
3'-NH-P(S)(OR)-O-5'
donde R es hidrógeno. Se entiende que para cualquiera de los ingredientes farmacéuticos activos compuestos descritos en la presente memoria que incluyen dicho enlace entre subunidades, tal ingrediente farmacéutico activo compuesto también puede incluir cualquier forma de sal farmacéuticamente aceptable conveniente del enlace. Como tal, el enlace entre subunidades puede estar en una forma de sal farmacéuticamente aceptable que incluya cualquier contraión conveniente de la sal.
En algunas realizaciones del ingrediente farmacéutico activo compuesto, el polinucleótido comprende entre 10 y 50 subunidades nucleósidas contiguas complementarias al componente ARN de la telomerasa humana (por ejemplo, como se describe en la presente memoria).
En algunas realizaciones del ingrediente farmacéutico activo compuesto, el polinucleótido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: GTTAGGGTTAG (S<e>Q ID NO:4); TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3); y CAGTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:5).
En algunas realizaciones del ingrediente farmacéutico activo compuesto, el polinucleótido incluye un grupo 3'amino o un grupo 3'-hidroxilo terminal. En determinadas realizaciones del ingrediente farmacéutico activo compuesto, el polinucleótido incluye un grupo 3'amino terminal. En determinadas realizaciones del ingrediente farmacéutico activo compuesto, el polinucleótido incluye un grupo terminal 3'-hidroxilo.
En algunas realizaciones del ingrediente farmacéutico activo compuesto, el compuesto tiene la estructura:
en la que "nps" representa un enlace tiofosforamidato -NH-P(=O)(SH)-O-, que conecta el carbono 3' de un nucleósido con el carbono 5' del nucleósido adyacente.
Se entiende que todas las realizaciones que se refieren a un principio activo farmacéutico compuesto son también aplicables a las formas de sal de dicho principio activo farmacéutico compuesto.
En algunas realizaciones del ingrediente farmacéutico activo compuesto, el compuesto tiene la estructura:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; en la que "nps" representa un enlace tiofosforamidato -NH-P(=O)(SH)-O- (o un tautómero del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se describe en la presente memoria), que conecta el carbono 3' de un nucleósido con el carbono 5' del nucleósido adyacente. En determinadas realizaciones del principio activo farmacéutico compuesto, la composición incluye una sal sódica del compuesto. En determinadas realizaciones, la composición incluye una sal de catión divalente del compuesto, tal como una sal de magnesio del compuesto. En determinadas realizaciones, la composición incluye una sal de catión trivalente del compuesto, tal como una sal de aluminio del compuesto.
En determinadas realizaciones del ingrediente farmacéutico activo compuesto, el compuesto se describe por la siguiente estructura, donde cada Mx+ es independientemente hidrógeno o cualquier contraión conveniente de una sal, cada x es independientemente 1,2 o 3 y n es un número entero de 5 a 13, tal como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13, tal como n es 13:
En algunos casos, cada x es 1. En determinados casos, cada x es independientemente 1 o 2. En determinados casos, cada x es independientemente 1 o 3. En determinados casos, Mx+ es hidrógeno.
En determinadas realizaciones del ingrediente farmacéutico activo compuesto, el compuesto es descrito por la estructura siguiente y puede incluir cualquier contraión catiónico conveniente de una sal:
En algunas realizaciones del ingrediente farmacéutico activo compuesto, el compuesto se describe por la estructura:
En algunas realizaciones, el ingrediente farmacéutico activo compuesto tiene menor que 9 % en peso del producto (N-1), tal como menor que 8 % en peso, menor que 7 % en peso, menor que 6 % en peso, menor que 5% en peso, menor que 4 % en peso, menor que 3 % en peso, menor que 2 % en peso, o incluso menor que 1 % en peso del producto (N-1). En determinadas realizaciones, el ingrediente farmacéutico activo compuesto tiene menor que 5 % en peso del producto (N-1). En determinadas realizaciones, el ingrediente farmacéutico activo compuesto tiene menor que 2 % en peso del producto (N-1).
En algunas realizaciones, el ingrediente farmacéutico activo tiene menor que 9 % de cualquier producto (N-x), tal como menor que 8 % en peso, menor que 7% en peso, menor que 6% en peso, menor que 5 % en peso, menor que 4 % en peso, menor que 3 % en peso, menor que 2 % en peso, o incluso menor que 1 % en peso de cualquier producto (N-x).
En algunas realizaciones, el ingrediente farmacéutico activo compuesto tiene menor que 9 % en peso en total de productos (N-x) que contienen polinucleótidos, tales como menor que 8 % en peso, menor que 7 % en peso, menor que 6 % en peso, menor que 5 % en peso, menor que 4 % en peso, menor que 3 % en peso, menor que 2 % en peso, o incluso menor que 1 % en peso en total de productos (N-x) que contienen polinucleótidos.
En algunas realizaciones, el ingrediente farmacéutico activo compuesto tiene el siguiente perfil de productos (N-x) que contienen polinucleótidos:
menor que 1 parte en 4 en peso de un producto (N-1) en relación con el producto N; y
al menos 10 partes por 100 en peso de los productos (N-2) y (N-3) en relación con el producto N.
Formulaciones
También se describen en la presente memoria composiciones farmacéuticas que incluyen una composición de oligonucleótidos (por ejemplo, como se describe en la presente memoria). Las composiciones de oligonucleótidos (por ejemplo, como se describe en la presente memoria) también pueden formularse como una composición farmacéutica para la inhibición de la transcripción o traducción en una célula en una condición de enfermedad relacionada con la sobreexpresión del gen diana.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica incluye una composición de oligonucleótidos (por ejemplo, como se describe en la presente memoria) formulada en un excipiente farmacéuticamente aceptable. En determinadas realizaciones, la composición oligonucleotídica es un ingrediente farmacéutico activo compuesto que tiene menos del 9 % en peso de un producto (N-1), en el que el compuesto comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de 10 o más subunidades de nucleósido complementarias al componente ARN de la telomerasa humana, en el que al menos dos de las subunidades de nucleósido están unidas por un enlace entre subunidades de tiofosforamidato N3'^P5'.
La presente divulgación describe compuestos que pueden inhibir específica y potentemente la actividad de la telomerasa, y que por lo tanto pueden usarse para inhibir la proliferación de células telomerasa-positivas, tales como células tumorales. Se ha demostrado que una gran variedad de células cancerosas son telomerasas positivas, entre ellas células de cáncer de piel, tejido conjuntivo, adiposo, mama, pulmón, estómago, páncreas, ovario, cuello uterino, útero, riñón, vejiga, colon, próstata, sistema nervioso central (CNS), retina y tumores hematológicos (tales como mieloma, leucemia y linfoma). Los cánceres de interés incluyen, pero no se limitan a, la mielofibrosis, la trombocitemia, el síndrome mielodisplásico y la leucemia mielógena.
Los compuestos en cuestión pueden usarse para tratar neoplasias hematológicas y trastornos mieloproliferativos, incluyendo pero sin limitarse a, trombocitemia esencial (ET), policitemia vera (PV) leucemia mielógena crónica (CML), mielofibrosis (MF), leucemia neutrofílica crónica, leucemia eosinofílica crónica y leucemia mielógena aguda (AML). Los compuestos en cuestión pueden usarse para tratar síndromes mielodisplásicos, que incluyen enfermedades como la anemia refractaria, la anemia refractaria con exceso de blastos, la citopenia refractaria con displasia multilinaje, la citopenia refractaria con displasia unilinaje y la leucemia mielomonocítica crónica (CMML). Los compuestos en cuestión de estudio pueden usarse para tratar enfermedades hematológicas, tales como las descritas en el documento WO 2014/088785.
De acuerdo con lo anterior, los compuestos descritos en la presente memoria son ampliamente útiles en el tratamiento de una amplia gama de neoplasias malignas. Más importante aún, los compuestos de la presente divulgación pueden ser eficaces para proporcionar tratamientos que discriminan entre células malignas y normales en un alto grado, evitando muchos de los efectos secundarios deletéreos presentes con la mayoría de los regímenes quimioterapéuticos actuales que se basan en agentes que matan indiscriminadamente a las células en división. Además, los compuestos de la divulgación son más potentes que los oligonucleótidos no conjugados equivalentes, lo que significa que pueden administrarse a dosis más bajas, proporcionando una seguridad potenciada y reducciones significativas en el coste del tratamiento. Por lo tanto, un aspecto de la divulgación es un procedimiento para tratar el cáncer en un paciente, que comprende administrar al paciente una dosis terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente divulgación. Los inhibidores de la telomerasa, incluidos los compuestos de la divulgación, pueden emplearse junto con otros enfoques de tratamiento del cáncer, incluida la extirpación quirúrgica de los tumores primarios, los agentes quimioterapéuticos y la radioterapia. Por tanto, la divulgación se refiere a los compuestos y composiciones proporcionados en la presente memoria para su uso como un medicamento. La divulgación también se refiere a compuestos y composiciones proporcionados en la presente memoria para su uso en el tratamiento o prevención de cualquiera de las neoplasias malignas mencionados anteriormente.
Para la aplicación terapéutica, un compuesto de la divulgación se formula en una cantidad terapéuticamente eficaz con un portador farmacéuticamente aceptable. En cualquier formulación pueden incluirse uno o más compuestos (por ejemplo, con diferentes componentes L' u O). El portador farmacéutico puede ser sólido o líquido. Los portadores líquidos pueden usarse en la preparación de soluciones, emulsiones, suspensiones y composiciones presurizadas. Los compuestos se disuelven o suspenden en un excipiente líquido farmacéuticamente aceptable. Ejemplos apropiados de portadores líquidos para la administración parenteral de las preparaciones de oligonucleótidos incluyen agua (que puede contener aditivos, por ejemplo, derivados de celulosa, preferentemente solución de carboximetilcelulosa sódica), solución salina regulada con fosfato (PBS), alcoholes (incluidos alcoholes monohídricos y alcoholes polihídricos, por ejemplo, glicoles) y sus derivados, y aceites (por ejemplo, aceite de coco fraccionado y aceite de arachis). El portador líquido puede contener otros aditivos farmacéuticos apropiados, incluidos, pero no se limitan a, los siguientes: solubilizantes, agentes de suspensión, emulsionantes, agentes reguladores, agentes espesantes, colorantes, reguladores de la viscosidad, conservantes, estabilizantes y reguladores de la osmolaridad.
Para la administración parenteral de los compuestos, el portador también puede ser un éster aceitoso tal como el oleato de etilo y el miristato de isopropilo. Los portadores estériles son útiles en composiciones estériles en forma líquida para administración parenteral.
Las composiciones, soluciones o suspensiones farmacéuticas líquidas estériles pueden usarse, por ejemplo, mediante inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, intravenosa o por vía tópica. Los oligonucleótidos también pueden administrarse por vía intravascular o a través de un stent vascular.
El portador líquido para composiciones presurizadas puede ser un hidrocarburo halogenado u otro propelente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones presurizadas también pueden encapsularse en lípidos para su administración por inhalación. Para la administración por inhalación o insuflación intranasal o intrabronquial, los oligonucleótidos pueden formularse en una solución acuosa o parcialmente acuosa, que luego puede usarse en forma de aerosol.
Los compuestos pueden administrarse por vía tópica como solución, crema o loción, mediante formulación con vehículos farmacéuticamente aceptables que contengan el compuesto activo.
Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden administrarse por vía oral en cualquier dosificación aceptable, incluidas, pero no se limitan a, formulaciones en cápsulas, comprimidos, polvos o gránulos, y como suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos. Las composiciones y/o formulaciones farmacéuticas que comprenden los oligonucleótidos de la presente divulgación pueden incluir portadores, lubricantes, diluyentes, espesantes, agentes saborizantes, emulsionantes, auxiliares de dispersión o aglutinantes. En el caso de los comprimidos para uso oral, los portadores que se usan habitualmente son la lactosa y el almidón de maíz. También pueden agregarse agentes lubricantes, como estearato de magnesio. Para la administración oral en forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen la lactosa y el almidón de maíz seco. Cuando se requieren suspensiones acuosas para uso oral, el principio activo se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, también pueden agregarse determinados agentes edulcorantes, saborizantes o colorantes.
Mientras que los compuestos de la divulgación tienen características superiores para la penetración celular y tisular, pueden ser formulados para proporcionar un beneficio aún mayor, por ejemplo en portadores liposomales. El uso de liposomas para facilitar la captación celular se describe, por ejemplo, en la U.S. Pat. No. 4,897,355 y U.S. Pat. No. 4,394,448. Numerosas publicaciones describen la formulación y preparación de liposomas. Los compuestos también pueden formularse mezclándolos con potenciadores de la penetración adicionales, tales como formas no conjugadas de las unidades estructurales lipídicas descritas anteriormente, incluidos los ácidos grasos y sus derivados. Algunos ejemplos son el ácido oleico, el ácido láurico, el ácido cáprico, el ácido mirístico, el ácido palmítico, el ácido esteárico, el ácido linoleico, el ácido linolénico, el dicaprato, el tricaprato, el recinleato, la monooleína (a.k.a. 1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido ariquidónico, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, mono- y di-glicéridos y sales fisiológicamente aceptables de los mismos (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.).
Pueden usarse formulaciones complejas que comprendan uno o más agentes potenciadores de la penetración. Por ejemplo, las sales biliares pueden usarse en combinación con ácidos grasos para elaborar formulaciones complejas. Las combinaciones ejemplares incluyen el ácido quenodesoxicólico (CDCA), generalmente usado en concentraciones de aproximadamente 0,5 a 2 %, combinado con caprato de sodio o laurato de sodio, generalmente usado en concentraciones de aproximadamente 0,5 a 5 %.
Las composiciones y/o formulaciones farmacéuticas que comprenden los oligonucleótidos de la presente divulgación también pueden incluir agentes quelantes, tensioactivos y no tensioactivos. Los agentes quelantes incluyen, pero no se limitan a, etilendiaminotetraacetato disódico (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (por ejemplo, salicilato sódico, 5-metoxisalicilato y homovanilato), derivados N-acílicos del colágeno, laureth-9 y derivados N-aminoacílicos de beta-dicetonas (enaminas). Los tensioactivos incluyen, por ejemplo, lauril sulfato sódico, polioxietilen-9-lauril éter y polioxietilen-20-cetil éter; y emulsiones perfluoroquímicas, tales como FC-43. Los no tensioactivos incluyen, por ejemplo, ureas cíclicas insaturadas, derivados de 1 -alquil- y 1-alquenilaciclo-alcanona y agentes antiinflamatorios no esteroideos tales como el diclofenaco sódico, la indometacina y la fenilbutazona.
De este modo, en otro aspecto de la divulgación, se proporciona un procedimiento para formular una composición farmacéutica, el procedimiento comprende proporcionar un compuesto como se describe en la presente memoria, y combinar el compuesto con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, el compuesto se suministra con pureza farmacéutica, como se define a continuación. El procedimiento puede comprender además la adición al compuesto, antes o después de la adición del excipiente, de un agente potenciador de la penetración.
La composición farmacéutica puede cumplir las normas de pureza farmacéutica. En algunos casos, para su uso como ingrediente activo en una preparación farmacéutica, un compuesto en cuestión se purifica lejos de componentes reactivos o potencialmente inmunogénicos presentes en la mezcla en la que se preparan.
La composición farmacéutica puede dividirse en alícuotas y envasarse en unidades monodosis o multidosis. Los requisitos de dosificación para el tratamiento con el compuesto oligonucleotídico varían con las composiciones particulares empleadas, la vía de administración, la gravedad de los síntomas presentados, la forma del compuesto y el sujeto particular que se está tratando.
Las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden administrarse a un sujeto en una formulación y en una cantidad eficaces para lograr un resultado clínicamente deseable. Para el tratamiento del cáncer, los resultados deseables incluyen la reducción de la masa tumoral (determinada por palpación o imagen; por ejemplo, mediante radiografía, exploración con radionucleótidos, exploración por TAC o MRI), la reducción de la tasa de crecimiento tumoral, la reducción de la tasa de formación de metástasis (determinada, por ejemplo, mediante análisis histoquímico de muestras de biopsia), reducción de marcadores bioquímicos (incluidos marcadores generales tales como la ESR, y marcadores específicos del tumor tales como el PSA sérico), y mejora de la calidad de vida (determinada mediante evaluación clínica, por ejemplo, puntuación de Karnofsky), aumento del tiempo hasta la progresión, supervivencia sin enfermedad y supervivencia global.
La cantidad de compuesto por dosis y el número de dosis requeridas para lograr tales efectos variarán dependiendo de muchos factores, incluyendo la indicación de la enfermedad, las características del paciente a tratar y el modo de administración. En algunos casos, la formulación y la vía de administración proporcionarán una concentración local en el lugar de la enfermedad de entre 1 pM y 1 nM del compuesto.
En general, los compuestos se administran a una concentración que proporciona resultados eficaces sin causar efectos secundarios dañinos o deletéreos. Dicha concentración puede alcanzarse mediante la administración de una dosis unitaria única o mediante la administración de la dosis dividida en subunidades convenientes a intervalos apropiados a lo largo del día.
Utilidad
Los procedimientos de la invención y los compuestos descritos en la presente memoria, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, encuentran uso en una variedad de aplicaciones. Las aplicaciones de interés incluyen, pero no se limitan a: aplicaciones terapéuticas, aplicaciones de diagnóstico, aplicaciones de investigación y aplicaciones de cribado, como se revisa con más detalle a continuación.
Los compuestos en cuestión encuentran uso en una variedad de aplicaciones terapéuticas. En algunas realizaciones, los procedimientos de producción de un oligonucleótido se aplican para preparar oligonucleótidos que proporcionan un beneficio terapéutico. Los tipos de enfermedades que pueden tratarse con las composiciones de la presente divulgación son ilimitados. Por ejemplo, las composiciones pueden usarse para el tratamiento de diversas enfermedades genéticas. En algunas realizaciones, los procedimientos y composiciones en cuestión tienen aplicaciones antisentido. En algunas realizaciones, los procedimientos y composiciones en cuestión tienen aplicaciones antigénicas. En determinadas realizaciones, los procedimientos y composiciones en cuestión tienen aplicaciones de inhibición de la telomerasa, como las descritas en la Patente de los Estados Unidos 6,835,826y Publicación de EE.UU. 20120329858.
Los compuestos y procedimientos en cuestión se usan en diversas aplicaciones diagnósticas, incluyendo, pero no limitando a, el desarrollo de diagnósticos clínicos, por ejemplo, diagnósticos in vitro o agentes de formación de imágenes tumorales in vivo. Tales aplicaciones son útiles para diagnosticar o confirmar el diagnóstico de una enfermedad o la susceptibilidad a la misma. Los procedimientos también son útiles para monitorizar la progresión de la enfermedad y/o la respuesta al tratamiento en pacientes a los que se ha diagnosticado previamente la enfermedad.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completas de cómo realizar y usar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni que los experimentos que se exponen a continuación sean todos o los únicos experimentos realizados. Se ha procurado garantizar la exactitud de las cifras utilizadas (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. Amenos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura es en grados Celsius y la presión es atmosférica o cercana a la atmosférica. Por "promedio" se entiende la media aritmética. Pueden usarse abreviaturas estándar, por ejemplo, pb, par(es) de bases; kb, kilobase(s); pl, picolitro(s); s o seg, segundo(s); min, minuto(s); h o hr, hora(s); aa, aminoácido(s); kb, kilobase(s); pb, par(es) de bases; nt, nucleótido(s); i.m., intramuscular(es); i.p., intraperitoneal(es); s.c., subcutáneo(s); y similares.
Procedimientos de síntesis generales
Se dispone de muchas referencias generales que proporcionan esquemas de síntesis química comúnmente conocidos y condiciones útiles para sintetizar los compuestos divulgados (véase, por ejemplo, Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Quinta edición, Wiley-Interscience, 2001o Vogel, A Textbook of Practical Organic Chemistry, Including Qualitative Organic Analysis, Cuarta edición, Nueva York: Longman, 1978).
Los compuestos descritos en la presente memoria pueden purificarse mediante cualquier protocolo de purificación conocido en la técnica, incluyendo cromatografía, tal como HPLC, cromatografía preparativa en capa fina, cromatografía en columna flash y cromatografía de intercambio iónico. Puede usarse cualquier fase estacionaria apropiada, incluidas fases normales e invertidas, así como resinas iónicas. En determinadas realizaciones, los compuestos divulgados se purifican mediante cromatografía en gel de sílice y/o alúmina. Véase, por ejemplo, Introduction to Modern Liquid Chromatography, 2a edición, ed., L. R. Snyder and J. J. Kirkland, John Wiley and Sons, 1979. L. R. Snyder and J. J. Kirkland, John Wiley and Sons, 1979y Thin Layer Chromatography, ed. E. Stahl, Springer-Verlag, Nueva York, 1969.
Durante cualquiera de los procedimientos de preparación de los compuestos en cuestión, puede ser necesario y/o deseable proteger grupos sensibles o reactivos en cualquiera de las moléculas en cuestión. Esto puede lograrse por medio de grupos protectores convencionales como se describe en obras estándar, tales como J. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, Londres y Nueva York 1973 en T W. Greene and P G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", Tercera edición, Wiley, Nueva York 1999 en "The Peptides"; Volumen 3 (editores: E. Gross and J. Meienhofer), Academic Press, Londres y Nueva York 1981 en "Methoden der organischen Chemie", Houben-Weyl, 4a edición, Vol. 15/l, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974 en H.-D. Jakubke and H. Jescheit, "Aminosauren, Peptide, Proteine", Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach, Basel 1982 y/o en Jochen Lehmann, "Chemie der Kohlenhydrate: Monosaccharide and Derivate", Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974. Los grupos protectores pueden eliminarse en una etapa posterior conveniente usando procedimientos conocidos en la técnica.
Los compuestos en cuestión pueden sintetizarse a través de una variedad de rutas de síntesis diferentes usando materiales de partida comercialmente disponibles y/o materiales de partida preparados por procedimientos sintéticos convencionales. En los esquemas siguientes se describen diversos ejemplos de rutas de síntesis que pueden usarse para sintetizar los compuestos descritos en la presente memoria.
Ejemplo 1
Síntesis de imetelstat sódico usando fosforamiditas diméricas.
El imetelstat sódico se sintetiza usando un soporte sólido (vidrio de poro controlado o soporte sólido polimérico) y fosforamiditas monoméricas tales como amiditas ABz o Admf, C, GiBu y T en la siguiente secuencia: 5'R-TAGGGTTAGACAA-NH2-3' (SEQ ID NO:3) donde R = Grupo enlazante de lípidos
el esqueleto del imetelstat es NPS, que es similar a las fosforamiditas de partida, por lo que la eficacia de acoplamiento es de aproximadamente el 92 %. La utilización de fosforamiditas dímeras permite menos etapas de acoplamiento, lo que puede conducir a un mayor rendimiento y pureza en la fase intermedia tras la síntesis. Las siguientes fosforamiditas dímeras se prepararon como se muestra a continuación usando un procedimiento como el descrito en el esquema de síntesis 1:
TA, AA, GA, GG y GT
La síntesis de las fosforamiditas dímeras requirió tres amidatos monoméricos (4a a 4c, esquema 1) y tres amino nucleósidos intermedios 5-TBDMS-3' (3a a 3c, esquema 1) para los nucleósidos A, G y T TBDMS es tertbutildimetilsililo. Los intermedios (3a a 3c, esquema 1) se prepararon a partir de dos tipos de materiales de partida, 5'-OH-3'-NH-Tr-2'-desoxi-N-benzoil adenosina (1a), 5'-OH-3'-NH-Tr-2'-desoxi-N-isobutiril guanosina (1b), y 5'-OH-3'-aminotimidina (2). Tr o Trt se refieren al tritil.
Los grupos 5'-hidroxilo de 1a y 1b se protegieron con grupos TBDMS usando cloruro de t-butildimetilsililo e imidazol en DMF (N,N-dimetilformamida), y a continuación los grupos tritilo en las posiciones 3'-amino se desprotegieron mediante tratamiento con ácido acético en agua. Los intermedios resultantes, 3a a 3c se acoplaron con los amidatos correspondientes, 4a a 4c, usando bencilmercaptotetrazol (BMT) como activador en dimetilformamida y la sulfuración posterior (P III a P V) se realizó usando hidruro de xantano y piridina (esquema 1). En general, la reacción de sulfuración se completó fácilmente. Los resultados de las reacciones de acoplamiento variaron en función de la humedad, el tiempo de reacción y la equivalencia de los amidatos. Se deseaban condiciones anhidras usando nitrógeno o gas argón y una reacción de acoplamiento rápida, ya que un tiempo de reacción más largo daba lugar a más productos secundarios tales como los productos de oxidación del P (V). Los intermedios P (III) del dímero tienen diferentes estabilidades. El intermedio TAera lo suficientemente estable como para monitorizar la finalización de la reacción mediante TLC y HPLC. Otros intermedios de P (III) no eran suficientemente estables para monitorizar la reacción de acoplamiento y se comprobó la finalización de la reacción una vez completada la sulfuración (esquema 1). Las especies P(V) son más estables para los dímeros AA, GA, GG y GT Para el dímero TA (5e), se usó 1,3 equivalentes de amidato (4c) para el acoplamiento y los otros cuatro dímeros (5a~5d) requirieron aproximadamente 3 equivalentes de amidatos (4a y 4b) (esquema 1). Los monómeros de amidato 4a-4c se preparan adaptando los procedimientos descritos en la Patente de los Estados Unidos 5,859,233.
Esquema 1. Esquema de síntesis de (limeros amidatos
(Reactivo P es cianoetoxi-bis(N.N-diisopropilamino)fosfina)
El grupo protector TBDMS en el grupo 5'-hidroxilo se desprotegió usando HF+piridina en acetonitrilo y la fosfilación final se realizó con reactivo fosfitilante en presencia de BMT y N-metilimidazol (NMI) para obtener los tiofosforoamidatos dímeros, 7a a 7e (Esquema 1). Los productos finales (7) y tres intermedios (3, 5, 6) se purificaron mediante cromatografía en columna. La etapa y los rendimientos globales de las reacciones con las cantidades de amidatos finales obtenidas se enumeran en la tabla 3. En la tabla 4 se muestra un resumen de los resultados de los análisis de los cinco amidatos dímeros.
Tabla 3. Rendimientos de la síntesis de dímeros
Tabla 4. Resumen del análisis de dímeros
Procedimiento de síntesis de tiofosforoamidatos dímeros
1) Preparación de 5'-TBDMS-3'-amino nucleósido (para Adenosina y Guanosina).
a) Disolver 5'-OH-3'-NH-Tr-2'-desoxinucleósido (1,0eq) e imidazol (5,0eq) en DMF y calentar a 60 °C. b) Agregar TBDMSCl (1,2 eq) a la solución de calentamiento y agitar durante 1 h a 60 °C.
c) Agregar solución acuosa saturada de NaHCO<3>a la mezcla de reacción y extraer con acetato de etilo. d) La capa orgánica se lava con solución acuosa saturada de NaHCO<3>y solución de salmuera. e) Agregar Na<2>SO<4>anhidro a la capa orgánica separada para secarla y filtrarla.
f) Se concentra el filtrado.
g) Agregar una solución acuosa de ácido acético al 80 % a la mezcla de reacción concentrada y agitar durante 1 hora a temperatura ambiente.
h) Eliminar el producto sólido por filtración, agregar solución acuosa saturada de NaHCO<3>al filtrado y extraer con acetato de etilo cuatro veces.
i) Se seca la capa orgánica sobre Na<2>SO<4>anhidro y se elimina el sólido por filtración.
j) El filtrado se concentra luego se purifica mediante cromatografía en columna (Eluyente: Acetato de etilo: Metanol=9:1 ^ 5:1).
k) El 5'-TBDMS-3'-amino-2'-daoxinucleósido se obtiene como sólido de color blanco.
2) Preparación de 5'-TBDMS-3'-amino nucleósido (para Timidina)
a) Disolver 5-OH-3-amino-2-desoxinucleósido (1,0eq) e imidazol (5,0eq) en DMF y calentar hasta 60 °C.
b) Agregar TBDMSCl (1,2 eq) a la solución de calentamiento y agitar durante 1 h a 60°C.
c) Agregar solución acuosa saturada de NaHCO<3>a la mezcla de reacción y, a continuación, extraer con acetato de etilo cuatro veces.
d) Agregar Na<2>SO<4>anhidro a la capa orgánica para secar y filtrar.
e) Se concentró el filtrado.
f) La mezcla en bruto concentrada se purifica mediante cromatografía en columna (Eluyente: Acetato de etilo: Metanol=15:1 ^ 5:1).
g) La 5'-TBDMS-3'-aminotimidina se obtiene como un sólido de color blanco.
3) Preparación del dímero 5'-TBDMS-3'-NH-Tr
a) Para eliminar la humedad, el 5'-TBDMS-3'-amino nucleósido (1,0eq) y el BMT (bencilmercaptotetrazol, 1,0~5,0eq) se azeotropan con acetonitrilo tres veces y luego se disuelven en DMF a temperatura ambiente bajo atmósfera de N<2>.
b) Agregar amidato de monómero (3,0 eq) en DMF (usando la cantidad mínima para disolver el amidato de monómero) a la solución de reacción gota a gota y después agitar durante 1 hora a temperatura ambiente bajo atmósfera de nitrógeno. El amidato de monómero se prepara según los procedimientos descritos en la Patente de los Estados Unidos 5,859,233.
c) Agregar hidruro de xantano (2,0 eq) y piridina (4,0 eq) a la solución de reacción y agitar durante 1 hora a temperatura ambiente bajo atmósfera de nitrógeno.
d) Agregar solución acuosa saturada de NaHCO<3>a la mezcla de reacción luego extraer con acetato de etilo.
e) La capa acuosa se extrae con acetato de etilo.
f) Se combinan las capas orgánicas separadas y se lavan con solución acuosa saturada de NaHCO<3>y solución de salmuera.
g) Agregar ñadirNa<2>SO<4>anhidro a la capa orgánica para secar y filtrar, después se concentra el filtrado. h) La mezcla en bruto concentrada se purifica mediante cromatografía en columna (Eluyente: acetato de etilo: metanol=1,5:1 ^ solo EA).
i) El dímero 5'-TBDMS-3'-NH-Tr se obtiene como un sólido de color amarillo pálido.
4) Preparación del dímero 5'-OH-3'-NH-Tr
a) Disolver el dímero 5'-TBDMS-3'-NH-Tr (1.0eq) en ACN (20 ml) bajo atmósfera de nitrógeno y luego agregar solución de HF-piridina con agitación a temperatura ambiente durante 1,5 horas.
b) Agregar solución acuosa saturada de NaHCO<3>a la mezcla de reacción y extraer con acetato de etilo. c) La capa orgánica separada se lava con solución acuosa saturada de NaHCO<3>y solución de salmuera. d) Se agrega Na<2>SO<4>anhidro a la capa orgánica para secarla y filtrarla y, a continuación, se concentra el filtrado.
e) La mezcla en bruto concentrada se purifica mediante cromatografía en columna (Eluyente: acetato de etilo, metanol, codisolvente cloruro de metileno)
f) El dímero 5'-OH-3'-NH-Tr se obtiene como sólido de color blanco.
5) Preparación de fosforotioamidato dímero (amidato dímero)
A) Para eliminar cualquier resto de humedad, el dímero 5'-Hidroxi-3'-NH-Tr se azeotropiza con acetonitrilo tres veces y luego se disuelve en ACN a temperatura ambiente bajo atmósfera de nitrógeno. b) Agregar BMT (1,3 eq), NMI (N-metil imidazol, 0,3 eq) y reactivo de fosfitilación (2,0 eq) a la solución de reacción y agitar durante 1 hora a temperatura ambiente.
c) Agregar solución acuosa saturada de NaHCO<3>a la mezcla de reacción y extraer con acetato de etilo. d) La capa orgánica separada se lava con solución de salmuera.
e) Se agrega Na<2>SO<4>anhidro a la capa orgánica para secarla y filtrarla, después se concentra el filtrado. f) Disolver la mezcla de reacción concentrada en cloruro de metileno (10mL) y agregar hexano para precipitar el sólido.
g) Decantar la capa superior de la solución para eliminar el exceso de reactivo de fosfitilación. (Repetir el procedimiento de decantación 5 veces).
h) El sólido restante se purifica mediante cromatografía en columna (Eluyente: acetato de etilo, acetona, codisolvente cloruro de metileno)
El dímero se obtiene como un sólido de color blanco.
Síntesis de Imetelstat con amidatos dímeros
Se usaron cinco amidatos de dímero en lugar de los amidatos de monómero como bloques de construcción para la síntesis de imetelstat y se compararon los resultados con los obtenidos con los amidatos de monómero. Para el acoplamiento del nucelósido C al imetelstat, se usó el reloj de construcción de monómeros tal y como se muestra en la secuencia siguiente. La síntesis se realizó a una escala de 140 pmol usando un Akta Oligopilot 100.
5'R-TA GG GT TA GA C AA-NH 3' (SEQ ID NO: 3)
Los amidatos dímeros se usaron como bloques de construcción para fabricar imetelstat. Usando los reactivos y parámetros de síntesis enumerados en las tablas 5A y 5B, se acoplan los cinco amidatos dímeros (AA, TA, GG, GA y GT) y un amidato monómero (C), como se ha mostrado anteriormente, para hacer la secuencia de imetelstat sobre CPG de baja carga (PALM 0051, 64,6 pmol/g). El tiempo de acoplamiento es de 500 s y se usaron 10 equivalencias de los amiditos. Tras la síntesis en fase sólida, el soporte se trata con solución etanólica de amonio (NH4OH:EtOH=3:1(v/v)) a 65 °C, durante 15 horas. El producto en bruto se aísla por evaporación de disolventes y se analiza por espectroscopia UV y HPLC.
Tabla 5. Parámetros de síntesis ejemplares (A) y composición de reactivos (S) para
la síntesis de oligonudeótidos. ACN es acetonitrilo, DCA es ácido didoroacético. PADS es
íemlacetit disulfido. ETT es 5-etiltio-IH-tetrazol
AB
'reactivos twmoo' RPM |m!
1 Lavar 313 300 □
2 Gas 4.0 •00
3 Desb 3.4 2500
< Desb 2,0 2500
3 Disparar 50.0
S Lavar 12.0 3500
7 Actrv 3.0 250
3 ACOP
300.0
ia a c o p
SI Actor 1.3 150
12 £sp*rjf 200.0
13 Lavar 3.0 300Q
1* 0-d 10.0 350
1$ Esp*r»r 300,0
150-d 10X1 350
12 Esparar 300,0
15 Lavar 5.0 3500
1) CapA 3X1 200
29 Cape 1,5 150
21 DC aparar 1.5
22 CapA 1.5 150
23 CapO 1.5 150
24 oe aparar 1.3
25 u w 4.0 3500
Usando un Akta Oligopilot 100, se realizaron análisis de síntesis a escala de 140 pmol usando el procedimiento de bloque de monómeros y el procedimiento de bloque de dímeros. Las condiciones de síntesis para las series de síntesis fueron similares a las indicadas en la tabla 5A-B.
Tabla 6. Parámetros de síntesis para la síntesis a escala de 140 pmol (AKTA Oligopilot 100)
El análisis de oligonucleótidos por HPLC-MS mostró que la pureza del FLP (producto de longitud completa) se mejoró significativamente cuando se usaron los cinco bloques de dímeros para la síntesis, dando 72 % de pureza por HPLC como se resume en las tablas 7 y 8. El oligo crudo preparado usando los bloques de monómeros mostró sólo un 45 % de pureza FLP. Además, la OD (densidad óptica) total se incrementó en más del doble, de 5,299 a 11,623, obteniéndose un rendimiento bruto de 3,34 g/mmol. El nivel de producto (N-1) y el contenido de PO disminuyeron del 11,2 % al 2,4 % y del 20 % al 5 %, respectivamente.
Una ventaja de usar bloques de dímeros es que se acorta el tiempo de producción y se reducen las cantidades de disolventes usados durante la síntesis en fase sólida.
Tabla 7. Resultado del análisis de la síntesis a escala de 140 pmol
La síntesis de cinco amidatos dímeros se completó con éxito con rendimientos del 9%al 19% apartir de 5'-hidroxi-3'-amino nucleósido o 5'-hidroxi-3'-tritilamino nucleósido dando 1,7 gramos a 3,4 gramos. La optimización de las condiciones de reacción para cada etapa no se estudió exhaustivamente. Las síntesis en bloque de dímeros de imetelstat se realizaron a escala de 140 pmol y los resultados se compararon con los datos obtenidos de la síntesis usando amidatos monoméricos. Se demostró que la estrategia de bloques de dímeros para la preparación de imetelstat proporcionaba mejoras sustanciales, ya que la pureza y el rendimiento mejoraron significativamente, por ejemplo, a escala de 140 pmol (Pureza por HPLC: dímero 74,0 % (Figura 8), monómero 44,4 % (Figura 7), rendimiento en bruto por TOD (densidad óptica total): dímero 468 mg, monómero 213 mg). Además, se generó una menor cantidad de enlace npo, ya que hubo menos etapas de acoplamiento en la síntesis con dímeros.
La eficiencia de acoplamiento para el dímero (Síntesis a escala de 140 pmol) muestra que la síntesis del dímero tuvo una eficiencia de acoplamiento del 96 % mientras que la síntesis del monómero es del 94 %. Dado que sólo había siete acoplamientos para el dímero, el FLP del dímero fue del 71,6 %, lo que se aproxima al Producto de Longitud Completa calculado teóricamente del 72 %, y el monómero con 13 acoplamientos registró un FLP del 45,6 %, frente al 44 % predicho teóricamente.
Tabla 8. Análisis de los resultados de la síntesis a escala de 140 pmol
La síntesis de Imetelstat usando menos etapas de acoplamiento proporciona tanto Pureza del Producto de Longitud Completa como Rendimiento que son sustancialmente más altos. La resolución de las impurezas facilita la purificación del imetelstat, ya que hay menos cantidades de productos menores cerca del pico principal en la HPLC para producir composiciones con mayor pureza de imetelstat. Esta mejora es deseable para reducir el coste de los bienes para la fabricación de imetelstat sódico, por ejemplo, el coste de los bienes puede ser un 30-40 % menor cuando se implementa a escala de fabricación.
Esouema 2. Esquema de síntesis de GA dímero amidato
Se prepararon 85 g de TBAG a partir de 300 g de APG2 según los procedimientos descritos en la presente memoria a través de las etapas mostradas en el Esquema 2.
Esquema 3. Esquema sintético del AA dimero amidato
Se obtuvieron 430 g de TBAPA1 a partir de 800 g de APA1 crudo (pureza: 46 %) según los procedimientos descritos en la presente memoria a través de las etapas mostrados en el Esquema 3.
Esquema 4 Síntesis de TA dimero amtdato
El amidato dímero TA (5) se ha preparado según los procedimientos descritos en el presente documento a través de las etapas mostradas en el Esquema 4 a escalas de síntesis de 100mg a 1g.
Se preparó una variedad de monómeros nucleósidos según los procedimientos descritos en la presente memoria que encuentran uso en la preparación de los compuestos dímeros.
Esquem a 8: Esquem a sintético de MMT, DMT y m onóm eros de pixil (A am iditas):
PG MMT DMT, Pixilo PG: MMT. DMT Pixilo

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un procedimiento de síntesis de un polinucleótido que tiene al menos dos subunidades nucleosídicas unidas por un enlace entre subunidades de oxofosforamidato N3'^-P5' o tiofosforamidato N3'^-P5', el procedimiento comprende las etapas de: (a) desprotección del grupo amino 3' protegido de un nucleósido terminal unido a un soporte en fase sólida, formando dicha desprotección un grupo amino 3' libre; (b) poner en contacto el grupo amino 3' libre con un dímero amino-dinucleótido fosforamidato-5'-fosforamidito 3'-protegido en presencia de un catalizador nucleofílico para formar un enlace fosforamidito internucleósido N3'^P5'; y (c) oxidar el enlace para producir un enlace entre subunidades oxifosforamidato N3'^-P5' o tiofosforamidato N3'^P5'. 2.El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la oxidación del enlace comprende sulfuración para producir un enlace tiofosforamidato u oxidación del enlace produce un enlace oxofosforamidato. 3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el dímero amino-dinucleótido fosforamidato-5'-fosforamidito 3'-protegido tiene la fórmula:
    en la que X es O o S y B1 y B2 son cada uno independientemente una purina, una purina protegida, una pirimidina o una pirimidina protegida, o un análogo de las mismas. 4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que B1 y B2 se seleccionan cada uno independientemente de adenina protegida, citosina protegida, guanina protegida, timina y uracilo. 5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que B1 y B2 se seleccionan cada uno independientemente de A(Bz), A(DMF), C(Bz), G(isobutiril), T y U. 6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en el que X es S. 7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el polinucleótido es de la fórmula:
    en la que: cada B es independientemente una purina, una purina protegida, una pirimidina o una pirimidina protegida, o un análogo de las mismas; cada X es independientemente oxígeno o azufre; cada R3 es hidrógeno, fluoro o hidroxilo, un alcoxi, un alcoxi sustituido o un hidroxilo protegido; L es un enlazante opcional; Z es H, un lípido, un soporte, un portador, un oligonucleótido, un PEG, un polipéptido, un marcador detectable o una etiqueta; R6 es amino, hidroxilo, un amino protegido, un hidroxi protegido, -O-L-Z o -NH-L-Z; R es hidrógeno, un alquilo, un alquilo sustituido, un arilo, un arilo sustituido o un grupo protector de fosfato; y n es un número entero de 1 a 1000; o una sal del mismo; y el procedimiento comprende las etapas de: (a) desprotección de un grupo amino 3' protegido de un nucleósido terminal unido a un soporte en fase sólida, formando dicha desprotección un grupo amino 3' libre; (b) hacer reaccionar el grupo amino 3' libre con un dímero amino-dinucleótido fosforamidato-5'-fosforamidito 3'-protegido en presencia de un catalizador nucleofílico para formar un enlace fosforamidito internucleósido N3'^P5'; (c) oxidar el enlace; y (d) repetir las etapas (a) a (c) hasta que se sintetice el polinucleótido. 8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el enlace entre subunidades de oxifosforamidato N3'^-P5' o tiofosforamidato N 3'^P5' es un enlace entre subunidades de tiofosforamidato N 3'^P5' que tienen la estructura: 3'-NH-P(S)(OR)-O-5' en el que R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, un alquilo, un alquilo sustituido, un arilo, un arilo sustituido y un grupo fosfato protector, o una sal de los mismos. 9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el polinucleótido comprende la secuencia TAGGGTTAGACAA y todos los enlaces internucleotídicos entre subunidades de la secuencia TAGGGTTAGACAA son enlaces entre subunidades de fosforamidato N 3 '^ P5' 10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en el que el polinucleótido tiene la estructura:
    o una sal del mismo; en el que "nps" representa un enlace tiofosforamidato -NH-P(=O)(SH)-O-, que conecta el carbono 3' de un nucleósido con el carbono 5' del nucleósido adyacente. 11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7-10, en el que el polinucleótido tiene la estructura:
    en la que cada Mx+ es independientemente hidrógeno o un contraión de una sal farmacéuticamente aceptable, cada x es independientemente 1,2 o 3 y n es un número entero de 5 a 13. 12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el polinucleótido tiene la estructura:
    13. Un compuesto de tiofosforamidato dinucleótido descrito mediante la fórmula (II):
    en la que: B1 y B2 son cada uno independientemente una purina, una purina protegida, una pirimidina o una pirimidina protegida, o un análogo de las mismas; R11 es un grupo fosforamidito; y R12 y R13 son cada uno independientemente un grupo protector; o una sal del mismo. 14. El compuesto de la reivindicación 13, en el que B1 y B2 se seleccionan cada uno independientemente de adenina protegida, citosina protegida, guanina protegida, timina y uracilo. 15. El compuesto de la reivindicación 14, en el que B1 y B2 se seleccionan cada uno independientemente de A(Bz), A(DMF), C(Bz), G(isobutiril), T y U. 16. El compuesto de la reivindicación 15, en el que: B1 es A(Bz) o A(DMF) y B2 es A(Bz) o A(DMF); B1 es A(Bz) o A(DMF) y B2 es C(Bz); B1 es A(Bz) o A(DMF) y B2 es G(isobutiril); B1 es A(Bz) o A(DMF) y B2 es T; B1 es A(Bz) o A(DMF) y B2 es U; B1 es C(Bz) y B2 es A(Bz) o A(DMF); B1 es C(Bz) y B2 es C(Bz); B1 es C(Bz) y B2 es G(isobutiril);. B1 es C(Bz) y B2 es T; B1 es C(Bz) y B2 es U; B1 es G(isobutiril) y B2 es A(Bz) o A(DMF); B1 es G(isobutiril) y B2 es C(Bz); B1 es G(isobutiril) y B2 es G(isobutiril); B1 es G(isobutiril) y B2 es T; B1 es G(isobutiril) y B2 es U; B1 es T o U y B2 es A(Bz) o A(DMF); B1 es T o U y B2 es C(Bz); B1 es T o U y B2 es G(isobutiril); B1 es T o U y B2 es T; o B1 es T o U y B2 es U.
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