UA119813C2 - Застосування алкогольдегідрогенази, що перетворює трихотецени, спосіб перетворення трихотеценів та добавка для перетворення трихотеценів - Google Patents

Abstract

Застосування алкогольдегідрогенази SEQ ID NO:1, яка містить іони металу та хіноновий кофактор, або, додатково, її функціонального варіанта, який є ідентичним послідовності принаймні на 89 %, та принаймні один окислювально-відновлювальний кофактор для перетворення принаймні одного трихотецену, який має гідроксильну групу на атомі С-3, а також спосіб ферментативного перетворення трихотеценів та добавка, що перетворює трихотецени.

Description

Цей винахід стосується застосування алкогольдегідрогенази, що перетворює трихотецени, способу перетворення трихотеценів та добавки для перетворення трихотеценів.

Трихотецени - це поширена група мікотоксинів, яка включає, серед інших, деоксиніваленол (СОМ, Мо САЗ 51481-10-8), токсин Т-2 (Мо САЗ 21259-20-1), токсин НТ-2 (Мо СА5 26934-87-2), ніваленол (Ме САБ 23282-20-4), фузеранон-Х (Мо САБ 23255-69-8), скріпентриол, 15- ацетоксисцирпенол (Ме САБ5Б 2623-22-5), 4,15-діадетоксисцирпенол (Ме САБ 2270-40-8), триходермол (Ме СА5З 2198-93-8), верукарин А (Мо СА5 3148-09-2), верукарин У (Мо САЗ 4643- 58-7), ізотриходермін (Ме САБ 91423-90-4), гідроксіїззотриходермін (Ме САБ5 344781-02-8), калонектрин (Мо СА5 38818-51-8), тетраол Т-2 (Мо СА5 34114-99-3), деацетилнеосоланіол (Мо

САБ 74833-39-9), неосоланіол (Мо СА5 36519-25-2), ацетилнеосоланіол (Мо САЗ 65041-92-1), споротрихіол (Ме СА 101401-89-2), трихотриол (Мо САБЗ 109890-37-1), самбуцинол (Мо СА5 90044-33-0) та кулморин (Мо СА5 18374-83-9).Трихотецени, особливо СОМ, відомий також як вомітоксин, може виділятися багатьма грибами фузаріум, зокрема, Р. дгатіпеагит та РК. сиітогит. Ці гриби завдають шкоди посівам, таким як кукурудза, різним типам зернових - пшениці, вівсу, ячменю тощо. Зараження грибами здебільшого має місце до жнив, а зростання грибів або утворення мікотоксинів також може бути до збору врожаю або, у випадку зберігання неналежним чином, після нього.

За оцінками Продовольчої та сільськогосподарської організації ООН (ФАО), 25 95 світових агрокультур заражені мікотоксинами, що призводить до значних економічних втрат. І. Коагіднев5 та К. Маепгег, автори недавнього дослідження, присвяченого токсинам (Тохіп5, 2012, 4, 663- 675), за період з січня 2009 до грудня 2011 проаналізували 23 781 зразок з усього світу і встановили, що 81 95 зразків виявилися позитивними на принаймні один мікотоксин, а 59 95 показали позитивну реакцію на трихотецени, особливо СОМ. Трихотецени, особливо РОМ, зустрічаються в усіх частинах світу з частотою до 100 95 в усіх досліджених зернових та кормах, зокрема, у кукурудзі, соєвому борошні, пшениці, пшеничних висівках, збродженому зерні з розчинними речовинами (00055) та у приготованих кормових сумішах. Докази наявності трихотеценів були виявлені як у сирих, необроблених харчових продуктах, так і в оброблених продуктах, наприклад, у борошні, сухих сніданках із зернових продуктів, макаронних виробах, хлібі, кондитерських виробах та продуктах дитячого харчування, виготовлених на основі

Зо пшениці.

Трихотецени мають таку структурну формулу:

Фа

Е сх ка я м де різні залишки заміщення від К! до К5 є різними в залежності від виду трихотецену.

Відомо, що епоксидна група разом з інтактною альфа-гідроксидною групою на атомі 0-3 трихотецену спільно відповідальні за їхній токсичний ефект. До видів трихотеценів з гідроксильною групою на атомі С-3 належать деоксініваленол, токсин Т-2, токсин НТ-2, ніваленол, фузеранон-Х, 15-ацетоксисцирпенол, 4,15-діацетоксисцирпенол, триходермол, тетраол 1-2, деацетилнеосоланіол, ацетилнеосоланіол, споротрихіол, трихотриол, самбуцінол та кулморин.

Деоксиніваленол (БОМ) містить характерну карбонільну групу на атомі С-8 і має таку структурну формулу:

Н не І В В Н

Гб. мет Н М і

Шь чий

У я

АЖ ца що

З пов фу щі з гу Й он Не сн. я бо і назву за класифікацією ІОРАС (За, 7с)-3,7,15-тригідроксі-12,13-епоксі-трихотец-9-ен-8-он. У природі існують також кілька токсичних підвидів ОМ з гідроксигрупою на атомі С-3. Це, наприклад, ацетильований ОМ (як, наприклад, 15-ацил-ЛООМ), глікозильований СОМ, сульфонати БОМ (як, наприклад, ПОМ5-1, 0ОМ5-2) або сульфати РОМ (15-сульфат БОМ). Ці підвиди ОМ також належать до трихотеценів з гідроксигрупою або заміщеною гідроксигрупою на атомі С-3.

Внаслідок токсичної дії ОМ компетентні відомчі органи встановили для нього гранично допустимі концентрації у харчових продуктах та кормах. Так, Європейський союз встановив допустимий вміст БОМ у харчових продуктах (ЕС Мо 1881/2006, ЕС Мо 1126/2007) та рекомендував граничні рівні для харчових продуктів (2006/576/ЕС). У США граничні рівні встановило Управління продовольства і медикаментів.

Хвороби у людей та тварин, спричинені споживанням мікотоксинів, звуться мікотоксикози. У разі трихотеценів або різновидів трихотецену вони також називаються "трихотеценові мікотоксикози", точніше "мікотоксикози, спричинені трихотеценами, які мають гідроксильну групу на атомі С-3", або ще точніше "ВОМ-мікотоксикози". Відомо, що токсична дія трихотеценів на людину та тварин зумовлюється кількома факторами. До них належать інгібування біосинтезу білків, можлива взаємодія з рецепторами серотоніну та допаміну, а також активація прозапалювальних цитокінів (ЕРА дШоигпа! 2004, 73, 1-41). Більш того, ВОМ-мікотоксикози викликають зміни у біомаркерах, діагностичними показниками яких є підвищена концентрація імуноглобуліну А (ІдА) у крові, підвищена концентрація 50ОС53 у печінці або зниження рівнів

ІСЕАЇ 5 у плазмі (Резіка єї аїЇ. 2004, ТохісоЇ. Гей. 153, 61-73), а також падіння концентрації клаудину у кишечнику (Ріпоп еї а!. 2009, Тох. Аррі. Рпаптасої. 237, 41-48).

Наприклад, трихотеценові мікотоксикози у свиней проявляються у поганому апетиті, затримці росту, появі блювання та діареї, а також в імунологічній дисфункції та погіршеному засвоєнні поживних речовин у кишечнику. У птиці трихотеценові мікотоксикози спричинюють погіршене засвоєння поживних речовин, уповільнення темпів росту, випадки діареї, потоншення яєчної шкаралупи тощо. Були описані випадки погіршення апетиту та зменшення надоїв у жуйних тварин. У аквакультур трихотеценові мікотоксикози спричиняють погіршення засвоєння

Зо корму та уповільнення росту в риб (наприклад, лосось, сом, форель) та креветок (Віпаег еї. аї,

Сиіде о МуКоюхіпв; ІЗВМ 978-0-9573721-0-8). Також була описана токсична дія на собак та котів (ЕЕБЗА дошгпаї 2004, 73, 1-41). У людини трихотеценові мікотоксикози можуть викликати нудоту, блювання, діарею, біль у животі, головний біль, лихоманку тощо (5оБбгома еї. аї, Іпіегаї5с. Тохісо). 2010, З (3), 94-99).

Основна стратегія зменшення зараження харчових продуктів та кормів трихотеценами або ром полягає в обмеженні ураження грибками, наприклад, за рахунок дотримання "доброї сільськогосподарської практики". Вона включає застосування насіння, вільного від паразитів та грибів, або переорювання стерні. Більш того, поширення грибів у полі можна скоротити правильним використанням фунгіцидів. Щоб запобігти росту грибів, після жнив зерно треба зберігати при залишковій вологості нижче 15 95 та низькій температурі. Крім того, заражене грибом збіжжя необхідно видаляти перед подальшою обробкою. Незважаючи на всі ці заходи, за повідомленням І/. Коагіде5 та К. Маепгег (2012), навіть у таких регіонах з найвищими сільськогосподарськими стандартами, як США та Центральна Європа, 7995 або 72 95 всіх зразків кукурудзи, які були протестовані за період 2009-2011 років, були заражені ООМ.

Також послабити зараження продуктів мікотоксинами можна шляхом адсорбції або перетворення. При адсорбції необхідно, щоб зв'язок адсорбента та мікотоксину був міцним та специфічним у широкому інтервалі рН і щоб він залишався стабільним у шлунково-кишковій області протягом усього процесу травлення. Хоча деякі небіологічні адсорбенти, як, наприклад, активоване вугілля, силікати або синтетичні полімери на зразок холестираміну, можуть ефективно діяти на афлатоксини, використання їх проти інших мікотоксинів, особливо трихотеценів, не є ефективним. У літературі також описані біологічні адсорбенти на зразок дріжджів або дріжджових екстрактів, але вони мають ті самі обмеження, що і небіологічні адсорбенти. Суттєвим недоліком адсорбентів є можливість неспецифічного зв'язування з іншими молекулами, які можуть виявлятися суттєвими для харчування.

Перетворення, особливо детоксикація трихотеценів шляхом застосування фізичної та хімічної обробки, також має обмеження, бо СОМ є дуже стабільним і лишається таким навіть при нагріванні аж до 350 "С.

Можливе мікробне перетворення СОМ було описане у патенті ЕР-В 1 042 449, де для детоксикації ООМ застосовують мікроорганізм ВВ5Н 797 (0О5М 11798). У цьому випадку детоксикація полягає у розкритті епоксидного кільця на атомах С-12 та С-13 у СОМ. У патенті

О5 2012/0263827 А йдеться про біоперетворення СОМ на З-епірОМ за допомогою мікроорганізму, що має міжнародний канадський код доступу 040408-1. Однак у багатьох процесах приготування харчових продуктів та кормів примішування мікроорганізмів чи адсорбентів технічно неможливе або заборонене, а тому перетворення або детоксикація таких трихотеценів, як БОМ або підвиди СОМ, є неможливим.

Такі трихотецени, як СОМ та підвиди ОМ, швидко поглинаються у травному тракті людини або тварини, що, в свою чергу, вказує на важливість швидкої та цілеспрямованої детоксикації.

Алкогольдегідрогеназа Послідовності Мо 1 була вперше описана у патенті УР-А 2003/159079 для вироблення 2-кетогулонової кислоти. У публікації УМО 2009/133464 описано спосіб окислення сахаридів за допомогою ферменту Послідовності Ме 1 у харчових продуктах та кормах з метою окислення крохмалю, зокрема, у хлібопеченні, для уповільнення черствіння хлібу. Тут алкогольдегідрогеназа застосовується для окислення гідроксильних груп вуглеводів.

Алкогольдегідрогенази Послідовностей Мо 2 та Мо З були виявлені у ході секвенування геному мікроорганізмів ЮОемовіа 5р. та зберігаються онлайн на сервері Національного центру біотехнологічної інформації (МСВІ) під номерами 01:737041022 та С1:630002266. Більш точно алкогольдегідроненази Послідовностей Мо 2 та Мо З не були охарактеризовані у цій роботі.

Оскільки трихотецени чинять різноманітну токсичну дію і зустрічаються дуже часто, існує потреба у виявленні речовин або груп речовин, таких як, наприклад, ферменти, здатних до специфічного, безпечного та дозволеного перетворення, зокрема, детоксикації трихотеценів.

Зо Метою цього винаходу є використання специфічної алкогольдегідрогенази та її варіантів для перетворення принаймні одного трихотецену, що має гідроксильну групу на атомі С-3, щоб зменшити токсичність продуктів.

При вирішенні цього завдання несподівано було продемонстровано, що використання алкогольдегідрогенази Послідовності Мо 1, яка містить іони металу та хіноновий кофактор, або, додатково функціонального варіанту, який є ідентичним принаймні на 80 9о, краще - на 86 95, оптимально - принаймні на 89 95, та принаймні один окислювально-відновлювальний кофактор, для перетворення принаймні одного трихотецену, що має гідроксильну групу на атомі С-3, дозволяє специфічно та надійно перетворювати трихотецени, що мають гідроксильну групу на атомі С-3, наприклад, СОМ, токсин Т-2 або ніваленол.

Перетворення має місце, коли структура токсинів змінюється так, що токсини переважно перетворюються на нетоксичні або менш токсичні метаболіти, тобто трансформуються. У даному випадку зміна структури має місце, зокрема, на атомі С-3 трихотеценів, що мають гідроксильну групу на атомі С-3, завдяки каталітичній конверсії гідроксильної групи С-3 на кетогрупу. Несподівано виявилося, що застосування алкогольдегідрогенази згідно з винаходом спричинює перетворення трихотеценів, що мають гідроксильну групу на атомі С-3, зокрема, ром, у найрізноманітніших хімічних та біологічних середовищах, як, наприклад, буферні розчини, суміші кормів, слина, шлункові соки, що містять корм, або вміст кишківника з наявністю кормів. Це є незвичайним, бо у зазначених середовищах для діяльності ферментів такі параметри, як значення рН, концентрація протеази, іонна сила або матриці речовин є дуже різними. В результаті активність ферменту може забезпечуватися при доданні води до харчових та кормових продуктів при оральному введенні, а також у ротовій порожнині та травному тракті.

Несподівано виявилося, що у певних середовищах можна обійтися без зовнішнього введення окислювально-відновлювальних факторів; це стосується, зокрема, сумішей кормів, слини та шлункових соків.

Алкогольдегідрогеназа Послідовності Мо 1 представляє собою залежну від хінонового кофактора алкогольдегідрогеназу. Для одержання активного голоферменту або активної алкогольдегідрогенази можна зв'язати з цим ферментом хіноновий кофактор, краще піролохінолінхінон (РСС), у присутності іона металу, краще Са. Отже, активована алкогольдегідрогеназа містить і хіноновий кофактор, і іон металу, причому молярне бо співвідношення ферменту та хінонового кофактора становить 1:1. Далі, для каталітичної активності алкогольдегідрогенази потрібен окислювально-відновлювальний кофактор, який може застосовуватися або у вигляді синтетичного окислювально-відновлювального кофактора додатково до активованої алкогольдегідрогенази, або він може бути присутнім у харчовому чи кормовому продукті та у секреціях людини чи тварин. Наприклад, такі природні окислювально- відновлювальні кофактори можна сформувати і, при необхідності, виділити з харчових та кормових продуктів під час введення, переробки та безпосереднього перетравлення у ротовій порожнині та шлунково-кишковому тракті людини чи тварини. Прикладами людських або тваринних секрецій, що містять природний окислювально-відновлювальний кофактор, можуть бути такі травні секреції, як, наприклад, слина, шлунковий сік, кишковий сік, секрет підшлункової залози, жовч або рубцевий секрет.

Терміни "варіант поліпептиду" або "варіант" стосуються функціональних поліпептидів, у яких у порівнянні з Послідовністю Мо 1 заміщена принаймні одна амінокислота при збереженні ферментативної функції. Перетворення, зокрема, окислення гідроксильної групи на атомі С-3 трихотеценів до кетогрупи, трактується як ферментативна функція. Більш того, "варіант поліпептиду" може мати вставки або виключення амінокислот, зокрема, на С- або М-кінці послідовності можуть бути подовжені або вкорочені відносно поліпептиду Послідовності Мо 1.

Тоді ферментативна функція "по суті зберігається", якщо механізм ферментативної реакції не змінюється, тобто трихотецен окислюється у тому ж місці, а ферментативна активність варіанту становить принаймні 10 95, краще - принаймні 50 95, оптимально - принаймні 9095, а в найкращому варіанті » 100 95 від оригінального батьківського поліпептиду Послідовності Мо 1.

Термін "їщдентичність послідовності" стосується проценту ідентичності у послідовності. У послідовностей амінокислот та нуклеотидних послідовностей ідентичність можна визначити візуально, але краще розрахувати її за допомогою комп'ютерної програми. Послідовність амінокислот Мо 1 визначається як реферативна послідовність Також порівнюються послідовності усередині сегментів, де під сегментом розуміється безперервна послідовність реферативної послідовності. Довжина сегментів у пептидних послідовностях становить зазвичай від З до 200, краще -- від 15 до 65, оптимально - від 30 до 50 амінокислот. Існує багато платних або безкоштовних біоінформаційних програм, які можна використати для визначення гомології та працювати з ними надалі. Як приклади можна навести пакет ССО Ууі5сопвзіп Вевіб й

Зо (Оємегеих єї аї. 1984), ВІ АБТ (Айб5спці еї аЇ. 1990) або ВІ А5Т 2 (Тайизома апа Мадаеп 1999).

Внаслідок різних варіантів коригування цих алгоритмів може статися, що з ідентичних вихідних послідовностей одержуються різні результати. Тому необхідно визначити алгоритм пошуку та відповідні налаштування. У даному випадку ідентичність послідовностей визначають за допомогою програм МСВІ ВГА5Т (Вавіс Іосаї! Аїйдпітепі Зеагсп Тоої), зокрема, ВГА5ТР для поліпептидів, які можна знайти на сайті Національного центру біотехнологічної інформації (МСВІ;. пер/Аммлиу.побі.піт.пій.дом/). Таким чином, є можливість порівнювати дві або кілька послідовностей між собою за алгоритмом Айв5спПиЇ еї аї., 1997 (Мисівїс Асід5 Ке5., 25:3389-3402).

У нашому випадку була використана версія програми від 12 серпня 2014 р. Застосовуються такі основні налаштування програми, зокрема, для порівняння амінокислот: "максимальна цільова послідовність" - 100; "очікуваний поріг" - 10; "довжина слова" - 3; "матриця" - ВГОБОМб2; "ціна інтервалу" - "Ехізїепсе: 11; Ехіепвіоп: 1"; "розрахункова наладка" - "Звичайна наладка матриці композиційними мітками".

Шляхом використання алкогольдегідрогенази, що містить іони металу та хіноновий кофактор, згідно з винаходом, або її функціонального варіанту стає можливим перетворити принаймні 20 9о, краще - принаймні 50 96, оптимально - щонайменше 90 95 принаймні одного трихотецену, що містить гідроксильну групу на атомі С-3, зокрема, СОМ, і для цього досить привести алкогольдегідрогеназу, що містить іони металів та хіноновий кофактор, або її функціональний варіант до контакту з принаймні одним трихотеценом, що містить гідроксильну групу на атомі С-3, протягом принаймні однієї хвилини, краще - принаймні 5 хвилин, в найкращому варіанті - принаймні 60 хвилин.

Згідно з ще одним варіантом здійснення винаходу, використовують функціональний варіант послідовності амінокислот, обраної з Послідовностей Мо 2 - Мо 4. З цими функціональними варіантами, які ідентичні принаймні на 86 95 з алкогольдегідрогеназою Послідовності Мо 1, стає можливим перетворювати трихотецени, що містять гідроксильну групу на атомі С-3, особливо ром, з незмінно високими результатами.

У відповідності до іншого варіанту здійснення винаходу, застосовують хіноновий кофактор, обраний з групи РОС, ТТС, ТРОС, І ТС та СТС, краще РОСС. При застосуванні одного з хінонових кофакторів - піролохінолінхінону (РОСС, Мо СА 72909-34-3), триптофантриптофілхінону (ТТО,

Мо САБ5 134645-25-3), топахінону (ТРС, Мо СА5 64192-68-3), лізинтірозилхінону (СТО, Ме СА5 60 178989-72-5) або цистеїнтриптофілхінону (СТО, Мо СА5 400616-72-0) з алкогольдегідрогеназою стає можливим перетворювати трихотецени, що містять гідроксильну групу на атомі С-3, зокрема, СОМ, на похідні, які не є токсичними або є нешкідливими з токсикологічної точки зору.

Особливо швидко та повно хіноновий кофактор приєднується до алкогольдегідрогенази при зв'язуванні принаймні одним іоном металу, обраним з групи Гі", Ма», КУ, Ма, Саг», 7пе, п,

Маг", Мп», Бе», Еезя, би, би, бо та Со", краще Са: та Мд?.

Також при застосуванні принаймні одного окислювально-відновлювального кофактора, обраного з групи феназинметасульфату (РМ5), похідних РМ5, гексаціаноферату (ІІ) калію, гексаціаноферату (І) натрію, цитохрому С, коферменту 01, коферменту 010, метиленового синього та М, М,М",М'-тетраметил-р-фенілендіаміну (ТМРО), краще феназинметасульфату (РМ5, Ме САБ5 299-11-6), коферменту 01 та коферменту 010, можливо досягти повного та швидкого перетворення трихотеценів виключно при наявності вологи, щоб забезпечити перетворення трихотеценів, наявних у компонентах корму, на нетоксичні похідні під час вироблення корму і в усякому разі до того, як корм споживатимуть тварини. Прикладами похідних РМБ5 є: 1-гідроксифеназин, 2-(пентапренілоксі)дигідрофеназин, 5,10-дигідро-9- диметилалілфеназин-1-карбонова кислота, 5,10-дигідрофеназин-1-карбонова кислота, 5- метилфеназинійметилсульфат, б-ацетофеназин-1-карбонова кислота, бентофенін, клофазимін, дигідрометанфеназин, есмеральдинова кислота, есмеральдин В, ізуміфеназин А - С, катіон

Янус зелений В, метанфеназинпелагіоміцин А, феназин-1,6-дикарбонова кислота, феназин-1- карбоксамід, феназин-1-карбонова кислота, феносафранін, піоціанин, сафенаміцин або метилефір сафенової кислоти. Згідно з винаходом завдяки перетворенню трихотеценів, що мають гідроксильну групу на атомі С-3, у харчових продуктах та кормах, зокрема, для свиней, птиці, великої рогатої худоби, коней, риб, аквакультур та свійських тварин, та у сировині рослинного походження, що використовується для приготування або обробки харчових продуктів та кормів, стає можливим запобігти шкоді для здоров'я людини та тварин.

Більш того, цей винахід передбачає спосіб, що дозволяє безпечно і надійно перетворювати трихотецени, зокрема, ті, що мають гідроксильну групу на атомі С-3, на менш токсичні сполуки, незалежно від того, чи піддавалися обробці продукти сільського господарства, в яких вони наявні, чи ні.

Для досягнення цієї мети спосіб ферментативного перетворення трихотеценів згідно з

Зо винаходом суттєво відрізняється тим, що принаймні один трихотецен, що містить гідроксильну групу на атомі С-3, вступає у контакт з алкогольдегідрогеназою Послідовності Мо 1, що містить іони металу та хіноновий кофактор, або з її функціональним варіантом, що має ідентичну послідовність принаймні на 80 95, краще - принаймні на 86 95, найкраще - принаймні на 89 905, з принаймні одним окислювально-відновлювальним кофактором та водою, а за потреби з принаймні однією допоміжною речовиною. Контакт між трихотеценом, що містить гідроксильну групу на атомі С-3, та алкогольдегідрогеназою Послідовності Мо 1, що містить іони металу та хіноновий кофактор, та додатково принаймні один окислювально-відновлювальний кофактор та воду, робить можливим окислення гідроксильної групи, присутньої на атомі С-3 трихотецену, до кетону, внаслідок чого трихотецен детоксикується і перетворюється на нетоксичну або малотоксичну сполуку.

При застосуванні функціонального варіанту послідовності амінокислот, обраного з групи

Послідовностей Мо 2 - Мо 4, замість Послідовності Мо 1, досягаються такі ж позитивні результати, що їі з алкогольдегідрогеназою Послідовності Мо 1, а перетворення трихотеценів, наявних у харчових продуктах та кормах відбувається особливо швидко і надійно, незалежно від того, чи піддавалися обробці сільськогосподарські продукти.

Особливо швидке та повне перетворення трихотецену, що містить гідроксильну групу на атомі С-3, досягається шляхом використання способу згідно з винаходом при температурі від 5 "С до 55 "С, краще - від 10 "С до 50 "С, оптимально - від 28 "С до 45 "С. Оскільки спосіб за винаходом можна здійснювати у такому широкому інтервалі температур, алкогольдегідрогеназу

Послідовності Мо 1 або її функціональні варіанти, які є ідентичними принаймні на 80 95 з

Послідовністю Мо 1, можна застосовувати у різноманітних умовах, наприклад, у аквакультурах, а також у технологічних процесах, що відбуваються при підвищених температурах. Як приклади таких технологічних процесів, де важливу роль відіграє перетворення трихотеценів при підвищених температурах, можна навести виробництво кормів, виробництво макаронних виробів і таких кукурудзяних продуктів, як полента, попкорн, кукурудзяні пластівці, пшенично- кукурудзяний хліб або тортильї, а також процеси зрідження крохмалю, цукрування, або бродильні процеси, як, наприклад, затирання солоду або бродіння, зокрема, виробництво біоетанолу. Тут важливо забезпечити, щоб одержані у цих процесах харчові або кормові продукти не містили у шкідливих кількостях трихотецени, що мають гідроксильну групу на атомі (510) С-3.

Згідно з іншим варіантом здійснення винаходу, спосіб виконують таким чином, що принаймні один трихотецен, що має гідроксильну групу на атомі С-3, вводять у контакт з алкогольдегідрогеназою, що містить іони металу та хіноновий кофактор, або з принаймні одним її функціональним варіантом, з окислювально-відновлювальним кофактором та водою, а за потреби з допоміжною речовиною, протягом принаймні однієї хвилини, краще - принаймні 5 хвилин, найкраще - принаймні 60 хвилин. Оскільки проміжок часу контакту від 1 до 60 хвилин є достатнім для адекватного перетворення трихотеценів на нетоксичні або малотоксичні похідні, спосіб згідно з винаходом можна застосовувати, наприклад, при переробці продуктів сільського господарства на харчові або кормові продукти. З іншого боку, фермери можуть застосовувати його безпосередньо перед годуванням, наприклад, додаючи воду до корму та витримуючи його впродовж часу від 1 хвилини до 1 години при температурі від 5 С до 55 "С, що ініціює перетворення трихотеценів на нетоксичні сполуки.

Особливо швидке та повне перетворення стає можливим, якщо хіноновий кофактор обрано з групи РОС, ТС, РТС, ГТС та СТС, краще РОСС, згідно з ще одним варіантом здійснення винаходу. Такий хіноновий кофактор дозволяє алкогольдегідрогеназі швидко та надійно діяти на гідроксильну групу на атомі С-3 трихотеценів і перетворювати її на кетогрупу, що містить нетоксичну похідну.

Подальше завершення реакції, а, зокрема її прискорення можливі, якщо кофактор у способі згідно з винаходом зв'язаний з алкогольдегідрогеназою за допомогою принаймні одного іону металу, обраного з групи Гі", Ма", КУ, Мд2», баг», 7пе, п, Мп, Мпя», Ре?т, ЕБезя, би, би, бог та Соз, краще Са?" та Мд2:. При здійсненні способу таким чином не лише хіноновий кофактор міцно зв'язується з алкогольдегідрогеназою, а і досягається швидке та надійне перетворення трихотеценів.

З метою подальшого удосконалення перетворення трихотеценів, зокрема, завершення реакції перетворення, у способі згідно з винаходом використовують окислювально- відновлювальний фактор, обраний з групи РМ5, похідних РМ5, гексаціаноферату (ІІІ) калію, гексаціаноферату (І) натрію, цитохрому С, коферменту 01, коферменту 010, метиленового синього та ТМРО, краще РМ5, коферменту 01 та коферменту О010. Додання цього окислювально-відновлювального кофактора дозволяє проводити реакцію перетворення

Зо трихотеценів, що містять гідроксильну групу на атомі С-3, у водному середовищі, наприклад, у кормі у вигляді суспензії або у кормі, що використовується у аквакультурах, без окислювально- відновлювальних факторів, які можуть бути одержані зі слини, шлункового соку або кишкового соку, наприклад, повинні бути додані або повинні бути присутніми, або коли тварина вже проковтнула корм у вигляді суспензії або якийсь інший корм і треба запобігти резорбції трихотеценів у ході травного процесу.

Нарешті, метою винаходу є створення добавки, що безпечно і надійно перетворює трихотецени у харчових або кормових продуктах на нетоксичні похідні.

Це завдання згідно з винаходом вирішується тим, що добавка містить алкогольдегідрогеназу

Послідовності Мо 1 з вмістом іонів металу хінонового кофактора, або її функціональний варіант, який є ідентичним принаймні на 80 95, краще - принаймні на 86 9о, а найкраще - принаймні на 89 95, а за потреби принаймні один додатковий компонент, обраний з групи, що складається з синтетичного окислювального-відновлювального кофактора та принаймні однієї допоміжної речовини. Такі добавки можна змішувати із звичайними кормами у малих концентраціях, наприклад, від близько 10 г до 1 кг на тону кормового продукту, і в таких малих концентраціях вони забезпечують перетворення трихотецену, що містить гідроксильну групу на атомі С-3, на нетоксичні похідні таким чином, що стан здоров'я та життєві показники тварин, які вживають цей корм, поліпшуються так, що можна не лише скоротити падіж поголів'я, а і покращити засвоєння корму.

Незмінно гарні результати приносить добавка згідно з винаходом, у якій замість алкогольдегідрогенази Послідовності Мо 1 використовується її функціональний варіант, обраний з групи Послідовностей Мо 2 -- Мо 4.

З метою повного перетворення гідроксильної групи трихотеценів, наявної на атомі С-3, добавка згідно з винаходом містить також хіноновий кофактор, обраний з групи РОС, ТС, ТРОС,

Ї ТС та СТО, а також іон металу, обраний з групи Гі", Мах, КУ, Ма, Са, 7пе, п, Має, Мп»,

Еег, Без, бу, би», бог та Соз:. Цей варіант здійснення винаходу, з одного боку, дозволяє безпечно та надійно зв'язати хіноновий кофактор з алкогольдегідрогеназою, а з іншого боку, коли алкогольдегідрогеназа містить такі доповнення, можна досягти повного перетворення таких трихотеценів, як деоксиніваленол, що мають гідроксильну групу на атомі С-3 своєї молекули.

Щоб така реакція відбувалася також без наявності окислювально-відновлювальних кофакторів, які природно містяться у слині, шлунковому соку або кишковому соку тощо, добавка згідно з винаходом виконана таким чином, що додатково містить як окислювально- відновлювальний кофактор синтетичний окислювально-відновлювальний кофактор, додатково обраний з групи РМ5, похідних РМ5, гексаціаноферату (ІІІ) калію, гексаціаноферату (ІІІ) натрію, цитохрому С, коферменту 01, коферменту 010, метиленового синього та ТМРО, краще РМ5, коферменту 01 та коферменту 010.

Наступний варіант здійснення винаходу передбачає, що добавка розроблена таким чином, що допоміжну речовину обрано з групи інертних носіїв, вітамінів, мінеральних речовин, фітогенних речовин, ферментів та додаткових компонентів для детоксикації мікотоксинів, таких як ферменти, що розкладають мікотоксини, як, наприклад, афлатоксиноксидази, ерготамінгідролази, ерготамінамідази, зеараленонестерази, зеараленонлактонази, зеараленонгідролази, охратоксинамідази, фумонізинамінотрансферази, фумонізинкарбоксилтрансферази, амінополіоламіноксидази, деоксиніваленолепоксидгідролази, деоксиніваленолдегідрогенази, деоксиніваленолоксидази, трихотецендегідрогенази, трихотеценоксидази; мікроорганізмів що перетворюють мікотоксини, наприклад, ОМ 11798, та речовин, що зв'язують мікотоксини, як, наприклад, стінки мікробних клітин або такі неорганічні матеріали, як бентоніт або смектит. Застосування такої добавки може гарантувати, наприклад, що будь-яка кількість трихотеценів, які мають гідроксильну групу на атомі С-3 і можуть міститися у харчових чи кормових продуктах, так само як будь-які додаткові мікотоксини, як, наприклад, токсини фузаріум, ерготаміни, охратоксини, будуть надійно детоксиковані так, що організму, який вживає цей продукт, не буде завдано жодної шкоди від мікотоксину.

Також винахід поширюється она добавки, які додатково до принаймні однієї алкогольдегідрогенази згідно з винаходом, містять ще принаймні один фермент, що розщеплює протеїни, як, наприклад, протеаза, або бере участь у метаболізмі крохмалю, волокон, жирів чи глікогену, як, наприклад, амілаза, целюлаза чи глюканаза, а також, наприклад, гідролази, ліполітичні ферменти, манозідази, оксидази, оксидоредуктази, фітази або ксиланази.

Зрозуміло, що добавка може, звичайно, існувати у капсульованій формі або бути вкритою оболонкою, що можна зробити відомими прийомами, описаними у публікації УМО 92/12645. У

Зо капсульованій формі або у оболонці добавку можна транспортувати до місця її споживання і застосовувати там без будь-яких змін, без ознак розкладання або пошкодження, так що поліпептид починає діяти, як тільки розчиниться оболонка, наприклад, у травному тракті тварин, завдяки чому досягається більш направлене, швидке та повне розкладання трихотеценів, що мають гідроксильну групу на атомі С-3, навіть у кислому, багатому на протеазу та анаеробному середовищі. Більш того, шляхом капсулювання або вживання оболонки можливо підвищити температурну стабільність алкогольдегідрогенази у добавці, що поліпшує, наприклад, умови процесу гранулювання кормів.

Добавку згідно з винаходом можна використовувати у багатьох сферах застосування, у тому числі для виготовлення сполуки для профілактики та/або лікування трихотеценових мікотоксикозів, зокрема, спричинених трихотеценами, що мають гідроксильну групу на атомі С-

З, особливо мікотоксикозів, спричинених деоксиніваленолом. Такі мікотоксикози мають серйозні наслідки для людини та тварин. Якщо добавка використовується для профілактики, можна підтримувати стан здоров'я людини та тварин по суті на рівні відсутності або обмеженого орального потрапляння токсинів, незважаючи на активний оральний прийом трихотеценів, особливо тих, що мають гідроксильну групу на атомі С-3, зокрема, деоксиніваленолу. У разі лікування мікотоксикозів можна послабити симптоми захворювання, зокрема, нормалізувати концентрацію 5ОС53 у печінці або рівню ІСЕАЇГ 5 у плазмі крові, а також концентрацію клаудину у кишечнику.

Більш того, при такому використанні можна підвищити продуктивність худоби, зокрема, засвоєння корму та збільшення ваги, а також скоротити падіж поголів'я.

Далі винахід пояснюється на прикладах здійснення та кресленнях, на яких:

Фіг. 1 показує хронологічну послідовність перетворення деоксиніваленолу під дією алкогольдегідрогенази Послідовності Мо 1, а також контроль (СТЕК) для порівняння, а

Фіг. 2 показує хронологічну послідовність перетворення БОМ під дією алкогольдегідрогенази

Послідовностей Мо 1 - Мо 4, а також контроль (СТЕ) для порівняння.

Приклад 1: Клонування генів та очистка алкогольдегідрогенази

Кодон-оптимізовані нуклеотидні послідовності алкогольдегідрогенази Послідовностей Мо 1 -

Мо 4 для відповідної клітини-хазяїна були взяті з ДНК2.О та містили сайти рестрикції на рівні нуклеїнової кислоти на кінцях 5" та 3" послідовності та додаткову мітку на С- або М-кінці бхНів на бо рівні амінокислот. Ці нуклеотидні послідовності проінтегрували стандартними прийомами у вектори експресії для ЕбсПегіспіа соїї або КотадаїаєПа равхіогі5, перетворили на Е. соїї або К. разіогіх, та здійснили експресію у Е. соїї або К. равіогі5 (9У.М. Стедо, Ріспіа Ргоїосої5, зесопа

Едайіоп, ІЗВІМ-10: 1588294293, 2007; 9). ЗатбгооК єї аІ. 2012, Моїесшаг Сіопіпд, А І абогаюгу

Мапиаї Ай Едіоп, Соїа 5ргіпу Нагбог).

Алкогольдегідрогенази Послідовностей Мо 1 - Мо 4 були вибірково підсилені хроматографічно з лізатів клітин у випадку експресії в Е. соїї та з міжклітинної експресії у К.

Равіогіх, або з супернатанту культури у випадку міжклітинної експресії у К. равіогі5 стандартними прийомами через колонки з нікель-сефарозою. Вибірково підсилені елюати інкубували та активували при наявності іонів металу та хінонових кофакторів, причому термін "активували" тут означає, що алкогольдегідрогенази містять і іон металу, і хіноновий кофактор у зв'язаній формі. Ці активовані алкогольдегідрогенази Послідовностей Ме 1 - Мо 4 були використані для визначення ферментативних властивостей алкогольдегідрогеназ

Послідовностей Мо 1 - Мо 4 у наступних прикладах 3-7. Повна концентрація протеїнів була визначена фотометрією за допомогою реактиву Бредфорда (бідта 2 Вб916), а поглинання було виміряне на мікропланшетному фотометрі (планшет-рідер Віоїек, зупегду НТ) на хвилі 595 нм.

Концентрація протеїнів була визначена, базуючись на калібрувальній кривій, побудованій за методом Бредфорда шляхом вимірювання розчинів альбуміну бичачої сироватки (ВЗА, бідта

ХА4919) з максимальними концентраціями до 1500 мкг/мл.

Приклад 2: Визначення ідентичності послідовності

Ідентичність повної довжини послідовності амінокислот алкогольдегідрогеназ

Послідовностей Мо 1 - Мо 4 відносно одна одної у відсотках була визначена за програмою

ВІ А5Т (Вабіс ГІ осаї АІїдпітепі Зеагсп Тоої), зокрема, ВІ А5ТР, що є доступною для використання на офіційній сторінці Національного центру біотехнологічної інформації /(МСВІ; пер://Лямли. порі. піт.пій.дом/), та дозволяє порівнювати дві або більше послідовностей між собою за алгоритмом АЇЇзепиЇ єї аї., 1997 (Мисівїс Асій5 Кев. (1997) 25:3389-3402). Основні програмні налаштування: "максимальна цільова послідовність" - 100; "очікуваний поріг" - 10; "довжина слова" - 3; "матриця" - ВГОБОМб62; "ціна інтервалу" - "Ехібвіїепсе: 11; Ехіепвіоп: 17"; "розрахункова наладка" - "Звичайна наладка матриці композиційними мітками". Ідентичність послідовностей амінокислот між собою у відсотковому відношенні наведена у Таблиці 1:

Коо)

Таблиця 1 11111111. |Послідовність Ме 1 |Послідовність Ме 2 |Послідовність Ме З|Послідовність Ме 4

Приклад 3: Перетворення трихотецену, який містить гідроксильну групу на атомі С-3

Для визначення їхньої здатності до перетворення трихотеценів, які містять гідроксильну групу на атомі С-3, зокрема, ОМ, рніваленолу та токсину Т-2, було одержано алкогольдегідрогенази Послідовностей Мо 1 - Мо 4 з міткою бхНів на С-кінці у Е. соїї, як описано у Прикладі 1.

Перетворення відбувається тоді, коли кількість трихотецену, який має гідроксильну групу на атомі С-3, зменшується при контакті з активованою алкогольдегідрогеназою, тобто алкогольдегідрогеназою, яка містить іони металу та хіноновий кофактор.

У кожному випадку було вибрано 100 мл культури Е. соїї з оптичною щільністю (00 600 нм) 2.0 -- 2.5 шляхом центрифугування при 4 "С та заново суспендовані у 30 мл калій-фосфатного буферу. Суспензію клітин тричі пропустили через френч-прес під тиском 20,000 фунтів/кв. дюйм (1380 бар). Лізати клітин розділили на розчинну та нерозчинну частини шляхом центрифугування. Супернатант було стерильно профільтровано, а алкогольдегідрогеназу підкріплено стандартними прийомами через колонки з нікель-сефарози. Після того виконано заміну буферу шляхом діалізу через спеціальні трубки з відсіканням 10 кілодальтонів.

Одержану концентрацію загального протеїну визначено методом Бредфорда.

Хінонові кофактори та іони металів були приєднані до алкогольдегідрогенази шляхом інкубації у водному розчині. Хіноновий кофактор, як, наприклад, піролохінолінхінон (РОСС, Мо

СА5 72909-34-3), триптофантриптофілхінон (ТТО, Мо САЗ 134645-25-3), топахінон (ТРОС, Мо САЗ 64192-68-3), лізинтирозилхінон (СТО, Мо СА5 178989-72-5) та цистеїнтриптофілхінон (СТО, Мо

СА5 400616-72-0), були додані до існуючої концентрації загального протеїну у вигляді водного розчину з приблизно двадцятикратним молярним надлишком. Іони металів, обрані з- І їх, Ма",

КУ, Маг, баг, йпе, йп3я, Мп, Мп, Ре», Рез, бу, би, бо» та Соз, використовують у вигляді водних розчинів їхніх солей. Якщо не зазначено інакше, алкогольдегідрогенази зазвичай використовували з РОСС (Зідта Аїагіспй 207783) та Са", активованим у вигляді розчину 5 мМ

Сасі». Очищені та активовані у такий спосіб ферменти були використані в експериментах іп міго з перетворення трихотецену, що має гідроксильну групу на атомі С-3. Якщо не зазначено інакше, терміни "фермент" або "алкогольдегідрогеназа" завжди стосуються відповідним чином активованих алкогольдегідрогеназ, які містять іони металів та хіноновий кофактор.

Досліди з перетворення були проведені у водному розчині наступного складу: 100 мМ Тті5-

НС з рН 7.5 або 10 95-ий буфер Теореля-Стенхагена з рН 7.5; синтетичний окислювально- відновлювальний кофактор, обраний з групи 1 мМ феназинметасульфату РМ5 (Зідта Аїагісп

ХРОб25), 1 мМ метиленового синього (Зідта ЯМ9140), 1 мМ коферменту 010 (Зідта 2ЖС9538), 1

ММ коферменту 01 (5ідта ЖС9538), та 20 мМ гексаціаноферату (ІІ) натрію РЕС (ІІ) (РіиКа

Я6О300); від 10 ррт до максимум 100 ррт трихотецену, що має гідроксильну групу на атомі С-3, шляхом додання у потрібній кількості вихідного розчину субстрату токсину; та від 10 мМ до 100

ММ, максимум 300 мМ активованої алкогольдегідрогенази Послідовностей Мо 1, 2, З або 4, що містить іони металів та хіноновий кофактор. Якщо не зазначено інакше, звичайно використовують буфер Ттгібз-НСІ, окислювально-відновлювальний кофактор РМ5, СОМ та алкогольдегідрогеназу Послідовності Мо 1. Кожний експеримент з перетворення було виконано у коричневій реакційній склянці Епендорфа на 1,5 мл. Реакційні суміші інкубовано при 30 "С у термоблоку впродовж часу тривалістю до 120 хвилин або ж принаймні 40 хвилин. Через 0, 10, 20, 30 та 40 хвилин у кожному випадку було відібрано пробу 0,1 мл, змішано з 0,1 мл метанолу та збережено при -20 "С, або ж негайно проведено аналізи методами рідинної хроматографії- мас-спектрометрії або високоефективної рідинної хроматографії.

Стерильно відфільтрований водний розчин 2000 ррт БОМ було використано у якості вихідного розчину субстрату ПОМ. Для одержання такого розчину СОМ у кристалічній формі (Віориге біапаага від Коптег І арз, ап. Мо 001050, чистота складає принаймні 98 95) було зважено та розчинено.

Кількісне визначення трихотецену, що має гідроксильну групу на атомі С-3, та їхніх перетворених метаболітів було виконано шляхом застосування високоефективної рідинної

Зо хроматографії, причому розділення речовин відбувалося хроматографічно за допомогою колонки Рпепотепех С18 Сетіпі МХ розміром 150 х 4,6 мм та розміром часток 5 мкм. У якості елюанта було використано метанол-водну суміш з вмістом ацетату амонію 5 мМ.

Ультрафіолетовий сигнал зафіксовано та проаналізовано на хвилі 220 нм. Для кількісного визначення рідинною хроматографією-мас-спектрометрією речовини було розділено хроматографічно на колонці 2огбрах есіїрхе С8 соїштп розміром 150 х 4,6 мм та розміром часток 5 мкм. У якості елюанта було використано метанол-водну суміш з вмістом ацетату амонію 5 мМ.

Ультрафіолетовий сигнал зафіксовано та проаналізовано на хвилі 220 нм. У якості джерела іонізації було використано електроспрей. Кількісне визначення трихотеценів, що мають гідроксильну групу на атомі С-3, здійснено методом рідинної хроматографії-мас-спектрометрії за допомогою С)Тгар - квадрупольного мас-спектрометру з іонною пасткою (потрійні квадрупольні прикладні біосистеми) у "розширеному режимі".

Негативний нахил кривих перетворення (-зменшення концентрації токсину з часом) у лінійному діапазоні був використаний у якості стандарту активності алкогольдегідрогеназ. Для визначення залишкової активності використано виміряні значення активності різних параметрів відносно базової активності за стандартних умов, зокрема, при 30 "С та рН 7.5. Як прийнято, їх надано у відсотках. На Фіг. 1 показано хронологічну послідовність перетворення СОМ під дією алкогольдегідрогенази Послідовності Мо 1, а Фіг. 2 демонструє активовані алкогольдегідрогенази Послідовностей Ме 2 - Мо 4 (Фіг. 18). З ілюстрацій чітко видно, що відбувається перетворення БОМ, бо його концентрацію було скорочено у реальному часі.

На Фіг. 1 показане перетворення БОМ алкогольдегідрогеназою Послідовності Мо 1 у 100 мМ

Ті НСІ при рН 7.5 при наявності 50 ррт СОМ та 1 мМ РМ5. Результати вимірювання були одержані за допомогою рідинної хроматографії-мас-спектрометрії (А), а перетворення СОМ алкогольдегідрогеназами Послідовностей Мо 2 - Мо 4 показане на Фіг. 2. Результати вимірювання були одержані за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (В). Для негативної перевірки було застосовано СТЕ-контроль, який містив усі компоненти експериментального розчину до алкогольдегідрогенази Послідовностей Мо 1 - Мо 4 включно.

Для порівняння ефективності хінонових кофакторів в експериментах з перетворення 10 нм алкогольдегідрогенази Послідовності Мо 1 активаної хіноновими кофакторами РОС, ТС, ТРОС,

ЇТС та СТС, було змішано з 10 ррт ОМ та 1 мМ синтетичного окислювально- бо відновлювального кофактора РМ5 у 100 мМ Ттібз-НСІ з рН 7.5 та інкубовано при 30 "с.

Концентрації ООМ було визначено за допомогою рідинної хроматографії-мас-спектрометрії через 30 хвилин. Результати наведені у Таблиці 2.

Для порівняння ефективності окислювально-відновлювальних кофакторів в експериментах з перетворення 10 нМ активованого ферменту (алкогольдегідрогенази Послідовності Мо 1), 10 ррт СОМ та 1 мМ або 20 мМ випробуваних синтетичних окислювально-відновлювальних кофакторів відповідно були змішані у 100 мМ Тті6-НСІ з рН 7.5 та інкубовані при 30 "с.

Концентрації СОМ були визначені рідинною хроматографією-мас-спектрометрією через 30 хвилин. Результати наведені у Таблиці 2.

Таблиця 2 кофактор відновлювальний кофактор

Щоб випробувати вплив іонів металів в активованому ферменті на перетворення, алкогольдегідрогеназу Послідовності Мо 1 та РОС кожного разу було активано іонами іншого металу, а саме Ма, Са, п, Мп, Ре? та Су. Експериментальний розчин містив 10 нм активованої алкогольдегідрогенази, 10 ррт СОМ та 1 мМ РМ5 у 100 мМ Ттгіб5-НСІ з рН 7.5 відповідно. Його інкубували при 30 "С. Концентрації ПОМ були визначені за допомогою рідинної хроматографії-мас-спектрометрії через 30 хвилин. Результати наведені у Таблиці 3.

Таблиця З

Подібним чином, як у вищеописаних експериментах з перетворення СОМ, було виконано аналогічні експерименти з іншими трихотеценами, які мають гідроксильну групу на атомі С-3. У цих експериментах замість 50 ррт БОМ, використовували 50 ррт токсину Т-2 або 50 ррт ніваленолу. Усі чотири алкогольдегідрогенази Послідовностей Ме 1 - Мо 4, що містили іони металу та хіноновий кофактор також були здатні перетворювати токсин 1-2 та ніваленол, і в кожному разі більше половини наявного токсину було перетворено через 30 хвилин.

Приклад 4: Вимірювання зон активності

При визначенні спроможності алкогольдегідрогеназ Послідовностей Ме 1 - Мо 4 перетворювати БОМ за різних умов за приклад була взята алкогольдегідрогеназа Послідовності

Мо 1.

Алкогольдегідрогеназу Послідовності Мо 1 було одержано та активовано з Са?" та РОСС, як

Зо описано у Прикладі 3. Для визначення активності ферменту в інтервалі температур 107С - 50 "С і в інтервалі рН 3.0 - 9.0, було застосовано 10 95 буфер Теореля-Стенхагена замість 100

ММ буферу Тті5-НСЇ з рН 7.5.

Експерименти з перетворення для визначення активності при різних температурах були проведені у водному розчині наступного складу: 10 95 буфер Теореля-Стенхагена з рН 7.5, 1 мМ синтетичного окислювально-відновлювального кофактора РМ5, 50 ррт СОМ та 10 нм активованих алкогольдегідрогеназ Послідовності Мо 1. Інкубація розчину тривала до 60 хвилин у термоциклері (Еррепоаогі) з градієнтом температури від 10 "С до 50 "С. Через 0, 10, 20, 30, 40 та 60 хвилин відбирали проби по 0.05 мл у кожному випадку, змішували з 0.05 мл метанолу, щоб зупинити реакцію, та зберігали при -20 "С. Проби були приготовані для рідинної хроматографії- мас-спектрометрії, як описано у Прикладі 3, та проаналізовані цим методом. Було визначено ступінь зменшення БОМ при кожній температурі і розраховано активність, як описано у Прикладі

З. Нахил лінійного інтервалу кривої перетворення при 30 "С було використано у якості реферативного значення для розрахунку залишкової активності при інших температурах. У

Таблиці 4 наведені температури у"С та відповідні значення залишкової активності у відсотках.

Несподівано встановлено, що алкогольдегідрогеназа Послідовності Мо 1 зберігає активність у широкому інтервалі температур. При 10 "С виміряна залишкова активність становила 48 95, а при температурі приблизно 50 "С - 67 95.

Таблиця 4 21271 Ї77111111160111111171711117171113311111 17111108 215117 Ї1771717171717171691111171711111113563 |7717171717111105...СС 11111205... | ..ЮюЮюЮ7Ююь86........|..Ю.Ю.ЮюЮ.407 |... вс 11171233 | 77777171717178987777771177117171717111432 | 77777108 11111262 | 7777171717178211|11111711145989 | 6 г щ « ни: и ТТ Я ПО: я ПО: З ПО

Експерименти з перетворення для визначення активності в інтервалі рН від 4.0 до 9.0 були проведені у водному розчині наступного складу: 10 95 буфер Теореля-Стенхагена з рН від 4.0 до 10.0, 20 мМ синтетичного окислювально-відновлювального кофактора РЕС, 100 ррт БОМ та 20 нМ активованих алкогольдегідрогеназ Послідовності Мо 1. Інкубація експериментального розчину тривала до 60 хвилин у термоциклері при 30 "С. Через 0, 10, 20, 30, 40 та 60 хвилин відбирали проби по 0.05 мл у кожному випадку, змішували з 0.05 мл метанолу, щоб зупинити реакцію, та зберігали при -20 "С. Проби були розбавлені та проаналізовані методами рідинної хроматографії-мас-спектрометрії, як описано у прикладі 3. Було визначено хід процесу зменшення СОМ при кожному значенні рН їі розраховано активність, як описано у Прикладі 3.

Нахил лінійного інтервалу кривої перетворення при рН 7.5 було використано у якості реферативного значення для розрахунку залишкової активності при інших температурах. У

Таблиці 5 наведені значення рН та відповідні значення залишкової активності (зменшення ПОМ відносно реферативного значення рн 7.5) у відсотках.

Таблиця 5 ее | ше | кн | ж рн й рн - активність активність нини ши т зи ПО: Я: по ПО Сл нини хи У з ПО: Я: По ПОЛ Ко У У

Приклад 5: Визначення температурної стабільності

Температурну стабільність алкогольдегідрогенази Послідовності Мо 1 було визначено в інтервалі від 30 "С до 55 "С. Для цього активовану алкогольдегідрогеназу інкубували у 100 мМ буферу Тгіє-НСІ з рН 7.5 впродовж 60 хвилин при заданих температурах у термоциклері (Еррепаогі). Через 0, 5, 10, 15, 20, 30, 40 та 60 хвилин відбирали аліквоту алкогольдегідрогенази та визначали її активність в експерименті з перетворення СОМ, як описано у прикладі 3.

Дослідний розчин мав наступний склад: 100 мМ Ттгі5-НСЇІ з рН 7.5, 1 мМ РМ5, 50 ррт БОМ, 10

НМ активованої алкогольдегідрогенази Послідовності Мо 1. Як описано у Прикладі 3, була проведена інкубація реакційного розчину та відібрані проби для визначення активності через 0, 10, 20, 30, 40 та 60 хвилин. Було визначено ступінь зменшення БОМ для кожної температури та

Зо кожного часу інкубації. Було розраховано нахил лінійного інтервалу кривої перетворення ОМ для визначення температурної стабільності Реферативним значенням для розрахунку залишкової активності слугував нахил лінійного інтервалу кривої перетворення СОМ для відповідної температури при Ї-0 хвилин. У таблиці 6 температури наведені у"С, час інкубації - у хвилинах, а остаточна активність - у відсотках. Найбільшу стабільність алкогольдегідрогеназа

Послідовності Мо 1 виявляла при зберіганні протягом години при температурах 30 "С та 37 "С. У порівнянні з цим алкогольдегідрогеназа ще виявляла залишкову активність, що складала 73 Фо при 40 "С після зберігання протягом години. Залишкова активність складала 50 95 після зберігання при 45 "С протягом 30 хвилин. Несподівано виявилося, що залишкова активність 84 95 мала місце після 5 хвилин зберігання при 50 "С.

Таблиця 6 ди ШТ Б

Приклад 6: Визначення стабільності рн

Стабільність рН активованої акогольдегідрогенази Послідовності Мо 1 була визначена в інтервалі від рН 4.0 до рН 10.0. Для цього активовану алкогольдегідрогеназу десятикратної концентрації (100 нМ) зберігали у 10 95 буфері Теореля-Стенхагена з рН від 4.0 до рН 10.0 впродовж 120 хвилин при температурі 30 "С. Через 0, 60 та 120 хвилин була взята аліквота алкогольдегідрогенази та визначена її активність в експерименті з перетворення, як описано у

Прикладі 3, який проведено при 30 "С з такими компонентами: 100 мМ Ттгі5-НСЇІ з рН 7.5, 1 мМ

РМ5, 50 ррт СОМ, 10 нМ активованих алкогольдегідрогеназ Послідовності Мо 1. Проби на активність відбирали через 0, 10, 20, 30 та 40 хвилин. Кожного разу визначають ступінь зменшення БОМ для кожного значення рН. Для визначення стабільності було розраховано нахил лінійного інтервалу кривої перетворення СОМ для кожного значення рН у відповідний момент. Реферативним для розрахунку активності у наступні моменти часу слугував нахил лінійного інтервалу кривої перетворення СОМ для відповідного значення рН при ї-0 хвилин. У

Таблиці 7 наведені значення рн, час інкубації у хвилинах та відповідна залишкова активність у відсотках. Алкогольдегідрогеназа Послідовності Мо 1 лишалася стабільною при рнН від 5.0 до 9.0 після 60 хвилин інкубації. Несподівано виявилося, що алкогольдегідрогеназа продемонструвала особливу стабільність у кислому середовищі (активність не зменшувалася при рН 5.0) та у сильно лужному середовищі (активність не зменшувалася після інкубації впродовж 120 хвилин при рН 9.0).

Таблиця 7 р оо85 « Л В Я Я фуЮ----

Приклад 7: Перетворення СОМ у комплексних матрицях

Для визначення спроможності активованих алкогольдегідрогеназ перетворювати трихотецени у комплексних матрицях без додавання ззовні синтетичних окислювально- відновлювальних факторів було отримано активовану алкогольдегідрогеназу Послідовності Мо 1, як описано у Прикладі 3, та проведено експерименти з перетворення СОМ у комплексних матрицях. Під комплексними матрицями тут маються на увазі рубцева рідина великої рогатої худоби, вміст тонкої кишки кишківника свиней, шлунковий сік свиней, слина людини та свиней, гранульований корм для поросят та гранульований корм для поросят, змішаний зі слиною, рубцевою рідиною або вмістом кишківника тощо. Для порівняння з буферною системою було проведено перевірки з Тгіб-НСІ, як описано у Прикладі 3. У якості корму для поросят було використано звичайний корм з кукурудзи, сої та ячменю.

Для визначення активності алкогольдегідрогенази у рубцевій рідині (рН 5.9) 1 мл стерильного фільтрату рубцевої рідини було додано до 100, 200 та 300 нМ активованої алкогольдегідрогенази Послідовності Мо 1 та 50 ррт БОМ у кожному випадку. Контрольні порції випробувано у водному розчині, як описано у Прикладі 3. Експерименти з перетворення були проведені шляхом інкубації при 30 "С у термоблоку впродовж 24 годин. Проби бралися через 0, 0.5, 1, 5 та 24 години, кожного разу по 0.1 мл, реакцію було зупинено 0.1 мл метанолу. Проби зберігали при -20 "С, розморожували та центрифугували впродовж 10 хвилин при 13,000 об/хв у настільній центрифузі Еррепаогї, після чого стерильно профільтрували за допомогою фільтру зЗрапйап з розміром отворів 0.2 мкм. Для виконання аналізу рідинною хроматографією-мас- спектрометрією проби було розбавлено, як описано у Прикладі 3, після чого проведено аналіз.

Концентрація СОМ у момент часу 1-0 годин була взята за реферативну (100 95) для наступних значень. Концентрації ООМ, що були виміряні у певні проміжки часу відносно вихідного часу 1-0 годин, надані у Таблиці 8 у відсотках. Для активності у буфері Тгі5-НСЇ обов'язковою є наявність доданого ззовні синтетичного окислювально-відновлювального кофактора, бо перетворення ром відбувається повільно, і проявилося лише через 24 години при концентрації алкогольдегідрогенази 300 нМ. Несподівано продемонстровано, що СОМ перетворюється без додання ззовні синтетичного окислювально-відновлювального кофактора у стерильному фільтраті рубцевої рідини при рН, що дорівнює 5.9. Це чітко демонструє наявність у рубцевій рідині речовин, які діють як природні окислювально-відновлювальні кофактори. При концентрації 300 нМ препарат містить через 5 годин інкубації лише 42 95 вихідної кількості ОМ.

Після 24 годин інкубації вміст ОМ стає незначним навіть при концентрації алкогольдегідрогенази вище 200 нМ.

Таблиця 8

Рубцева рідина з синтетичним Рубцева рідина без Ттів-НСЇІ з рН 7.5 без окислювально- синтетичного окислювально- | синтетичного окислювально- відновлювальним відновлювального кофактора | відновлювального кофактора кофактором 777777 лоонМм | їоонм | 2гоонм | зоонм | 1оонм | гоонм | зоонм

Для визначення активності алкогольдегідрогенази у шлунковому соці свиней без кашкоподібної маси при рН близько 3, у вмісті кишечника свиней при рН близько 6 та у слині людини та свиней, 300 нМ активованої алкогольдегідрогенази Послідовності Мо 1 та близько 20 ррт СОМ було змішано з 1 мл шлункового соку (стерильно відфільтрованого), 1 мл кашкоподібного вмісту кишечника або 1 мл слини у кожному випадку. Для негативної перевірки використовували лише розчини травних рідин з СОМ 20 ррт, а для позитивної перевірки середовище для перетворення містило всі компоненти, включно з 20 мМ синтетичного окислювально-відновлювального кофактора РЕС (ІІ). Проби були відібрані через 0, 3, 5 та 24 години, кожного разу по 0.1 мл, реакцію було зупинено 0.1 мл метанолу. Проби зберігали при - 20 С, розморожували та центрифугували впродовж 10 хвилин при 13,000 об/хв у настільній центрифузі Еррепабогї, після чого вони були стерильно профільтровані за допомогою фільтру

Зо Зрапцап з розміром отворів 0.2 мкм. Для дослідження проби було розбавлено елюантом у співвідношенні 1:10 (див. Приклад 3) та проаналізовано рідинною хроматографією-мас- спектрометрією, як у Прикладі 3. У Таблиці 9 наведені відповідні концентрації ОМ на момент зняття проб. Несподівано виявлено, що вміст ОМ у слині зменшувався без додання ззовні синтетичного окислювально-відновлювального кофактора (незалежно від виду). Це чітко доводить наявність у секреті слинних залоз людей та свиней речовин, які діють як природні окислювально-відновлювальні кофактори при перетворенні БОМ алкогольдегідрогеназою

Послідовності Мо 1. У чистому шлунковому соку без кашкоподібної маси не було виявлено суттєвого зменшення концентрації ОМ. У вмісті кишечника воно зменшувалося лише при доданні синтетичного окислювально-відновлювального кофактора.

Таблиця 9 11111111 ромрртССсСсС2С слинаслюдська) 1-3 ОММРЕСФЮ 1201 13112158 ііі НБН НИСТНИ НИОСНИ НОНСТНЯ

РЕС (ПІ слинассвиняча) 1-33 ОММРЕСФ) 331211 19185 ніна ШОН НИСТИНИ НОСОВ НОСОВ

РЕС (ПІ сі

Шлунковий сік :

РЕС (ПІ

Вміст кишечника : педитенямі в | 11

РЕС (ПІ

Для визначення активності алкогольдегідрогеназ у кормі для поросят 100 мг корму було змішано з 400 мкл 100 мМ буферу Тгіб-НСІ з рН 7.5, 400 мкл свинячої слини, 400 мкл стерильного шлункового соку свиней або 400 мкл вмісту кишечника свиней відповідно. Ці суспензії корму для поросят залишали на ніч при 4 "С. Після того до всіх проб було додано близько 20 ррт СОМ, та/або 300 нМ активованих алкогольдегідрогеназ Послідовності Мо 1, та/або 20 мМ синтетичного окислювально-відновлювального кофактора РЕС (І). Препарати без алкогольдегідрогенази та без доданого ззовні синтетичного окислювально-відновлювального кофактора слугували для негативної перевірки. Для позитивної перевірки використовували препарати з доданням алкогольдегідрогенази та синтетичного окислювально-відновлювального кофактора. Проби відбирали через 0, 3, 5 та 24 години. Кожного разу аналізували одну цілу пробу. До проби додавали 500 мкл метанолу та гомогенізували 30 хвилин у шейкері при

З00 об/хв... Після цього проби обробляли 15 хвилин на настільній центрифузі Еррепадогі при 13,000 об/хв та відфільтровували супернатант шприцом крізь фільтр 5рагап з розміром отворів 0.2 мкМ. Супернатанти зберігалися при -20 "С, розморожувалися, розбавлялися у елюанті у співвідношенні 1:10 та були проаналізовані за допомогою рідинної хроматографії-мас- спектрометрії, як описано у Прикладі 3.

У Таблиці 10 наведено концентрацію СОМ у пробах у відповідні моменти часу. У буферній суміші корму для поросят були присутні речовини, які грали роль введених ззовні синтетичних окислювально-відновлювальних кофакторів, оскільки, як це показано вище, концентрація ООМ постійно зменшується без додання ззовні синтетичного окислювально-відновлювального кофактора. Ці речовини надходять з корму для поросят, оскільки, як було продемонстровано раніше, жодне перетворення СОМ не може бути виміряне у буферному розчині без доданого ззовні синтетичного окислювально-відновлювального кофактору. У присутності введеного ззовні синтетичного окислювально-відновлювального кофактора перетворення БОМ у кормі для поросят відбувається швидше у порівнянні.

У суміші корму для поросят із слиною активність алкогольдегідрогенази також демонструє активність незалежно від наявності введеного ззовні синтетичного окислювально- відновлювального кофактора, тоді як більш швидке зменшення вмісту ОМ відбувалося у експериментальних розчинах, що містили введений ззовні синтетичний окислювально- відновлювальний кофактор.

Несподівано виявилося, що у суміші корму для поросят алкогольдегідрогеназа

Послідовності Мо 1 є також активною без додання ззовні синтетичного окислювально- відновлювального кофактора. Коли корм для поросят додавали до шлункового соку, то, з одного боку, підвищувався рівень рН шлункового соку, а з іншого боку, природні окислювально- відновлювальні кофактори, здатні замінити введений ззовні синтетичний окислювально- відновлювальний кофактор, вивільнялися корму для поросят. У вмісті кишківника активність алкогольдегідрогенази була виявлена тільки при введенні ззовні синтетичного окислювально- відновлювального кофактора до розчину для перетворення.

Таблиця 10 нн То Тс

Кормдляпоросят ОмМРЕС(ІШ | 20 | 0 | 9 1 5

РЕС (ПІ

Кормдляпоросят ОмМРЕС(ІШ | 20 | 12 | 9 1 8

РЕС (ПІ І ормдляпоросят етативна перевірка .1...21..1..21...1..20.1..20

Ку РЕС (ПІ ' ормдляпоросят етативна перевірка .1...21...1..20..1..20.1..20. сті ОММРЕСФ 17121 | 20 | 18 | 16

У вмісті Позитивна перевірка 20 мМ кишечника 20 5 З 0.7 ре 15 |з | м

«ЕІ. т т таттмл вЕСТЧЕТОЮ ГІВІ с Шин тр ЯН я ду хуичттту ин ту «110з КВЕБЕК АКЕіепзчевеіі вспвіЕє «120» тІ1спостпесанце ТІвпзЕоїтщіскКкейпсів Ептуще ще ря т ту-3-6Дїх м Зб анг «130» БЕ БРВ БІС боби «16б0з 8 ер» зве Вт Яку лу ще «173» Бабевпсїіп чУуашгвіов 3.5 пс дя : чшійм ї по жнинч -ла ії шоро «лій» БЕТ молота ни ни генію - «13» Бдазжіасцзіцсппораєссек аю, -400» 1

Кит ля ті ит бля Лотия п о и нь У т-83 1 те Ін що Тоня т ; мес АтЯ Рба о бій Тухг Бей АкФобіп Аза Ууді Уві біу ей Аїд Без дек ї 5 1 15 спін щот он пече ни т Се т т ит пт тн ра В пд'7 жу їїтл о ш лота. тпх Атїв їецз ї11е Аївя Бек Ге) беї піу Еко Аїд ЕПе Ата сій нія Агро; йо 5 ЗО дл Ач АТ Ав АТ дО (я покину деко Ту ДІ пляях 1 бпву ді ті то1. а1з Ана дів Аа Аз Сі Рто Бех пух дів пі біз Бек АЇяч тів сів 35 45 25

Ат пн сх зи и пл вл дах пошані т - ді т хотТати А НЕ пл

Авп оБпе бій Екс о Уаї ТБг о Аів Аво Авробец Аїв о сіу Бух Ав о Бкго дід зо зо ес с Пн ну То дії Дт сяк дя зр По т ях янв, (лу спать Ся бу

АвпоТтв Рко фТіе Геч Акщосоу Ап оТук о біп о біУу ТІрр обіу Тут ЗвкЕ Ро во ТВ 5 ВО

Тен Ду м те я Тляє Дві дет лів 0115 Де Тл (11 ето а тк іїви Авросій те Ап обуш Авро о Ап о Мві спіу Ар обєецп о біп о їеви Уві ТЕр ве пл кі

Зо 5

Су Вс ть я-е див 41: РЕ бУтяк о домо Дю 213 11 1 ях ді Ал тів ВІ що пів вдшЕ ЗЕ ІП ОБ ЗЕМ га сіу сов-І два лі піУ лпіа лів пс16 під 1 УК їпо 105 115

АвпозіУу Уві Іів ББе їелзсіу АвпоТптІ АвзпоАвроуваі Іїіе бій Аїд її8

У У я яв нк 1Ії5 То 175 с ійбляф; тою Фвом ст як о Шия Тоні Те ен а я т са с и НЯ току Тваії Тк

АВво йіуУу пу ТБтг о спіУу дет Бе) іє ТІрсів; ТУг АтоО Акчу пуд ви го і130 135 145 цк т пн бинт тт

З т хх Дт В У АгоО бат тів

І 1 ЕБпе о Іт1я- Авп обет їТеац о піу Атїа АТїа Був Агу 8 :

С ше ЖК - С-ек торт нпе їх дат он дав у г зеї під пегоБув пе еще гг 145 15 15 - - тро щ піну ош Ази БнНе о Зді 1 д І Чаї Тук Бе Уві бек Тур АвроАзпи Баг оЗаї їі вве іі Уа 1 Кая -. ті гаї сх і й їй т тиші Бір (1 хг кю їуув і; в

А1а пез Рапг іч дах х Ноя и 155 475 їіб5 я поз дров вих т тязі т: стр - ет із і тпЕ Біу Мув йБеч Аа ТЕр обі тТпг Авп о Ага 1 А 1 АБО Аїя Був тТпЕ о СіУу Гув Бец Аїд ТІ х : їд 1 Ацб Дід тм тп ц ІВт

УаАї Атд певи АБО пів у Ух ї Т5о 1805 іш 153; - - тт се Зак о пі Ртгоа тів Уді іч о біу Ха1! дів АзЗзп о бех Зегопіу Рео Іі Уді 2 і ж1Уу Уві бзіц о піч біУу Ма! дів Азп бек бе у піу лап 1У ча зда ла у п щі є Ба Ие 155 ше 3 я г - бдео лв (1 5) реа 1 тІ1в Аїв б5іУу бек о ТтТНгоСбух 51п Бе бет о біу РБа 1 І КО КУ Н іє до ї ше А дк ї-! ід: Авросіу Ув чві її дів о сі1уУ у чаї Авропіу уві Уа ів док ще Ди БОРИ

ТІ їз - - - пон А дюн іа пів бек піу піч 01; о їє) Тер

КУ ТВБЕ біу тТБкгоАвр о Ата біб бек о біу біз бів; Тво ток о Гяуо Птях сві Гах їлі УЧ повно лдіІД У ТЕ сл1у шу ГУК чав. іпЕолІМ 1 ї рфння зай по що оо

Ден; Піо ач, 1 пін піц пі Дак оАтУу Тьг оту ті па Ті Его Ага Рксозіу бій біц б51у Авр о Авр ота ї

Ав отак пш 115 ПО АгЯ вгОа У - - зв

АкЯ Ава о тТпЕ Рапе Ті га я: ТВ ще

Й таб 25О шо і пу ЩіУу Дів тгоойщіУ піп

Е ! Тук Сіц дяп о дк Ткр Мебс Тахо піу діа ткоосіу 51 т ЗІ Аз Еко Тек опій дай ДЕ ї ко г У ІТ

Бі оіу А18 ТО УКГ ї ї Р а

Й й 25 9 ес ОК сь т тої, дя тла (їх 1 ї ді МЕ Ім о ліІ У пек тп м у 1 1 ї де бец удо ТУЮ іч жі с т ве о тесрг оАду Бра піп тео) шва ді У у У

І12 Тайг ТтТуг Авр оБго біз Тео зр зу

МБ ще ех

Як т п че тля -х Тьтопіцй біх пі тв Гей 1 я І 7а2 сіп Аго сіу Тк осів соту С1у іпу

Ф тля х р , 194 Р дід Щек піц Уа! біп Авкеосіу у дід впіУу Ріо Аїд дек сій Уві бів я у і піЗ лішЖ АС іс пок и;

Зам зав

А т тик пі дії щд і ві Авіа Уві Буз Рго пу Тпк обі бін Уді

А піу тах Аза ТБ Ага о впе діа Уві Буз Рго пу їв лів лі гІпПЕ Ла іп ва ях 475

Й 319 вин 305 319 - ме ши т ух ост Тек Авро бат пір ппув

Н Нніз бів тах Гей РЕЗ Ак Аво АввотТЕр о Авробек У тв ТЕкв о пу НІіЗ піп тлу печо ог Кс я ЕХ ї пір: жі т пУєо па а ЗБ

ЗВ зо й зи 1 ул й площ тує 1 і Ззех Уві ввип НІ: ові У

Епе 5 ї-»-» Р оМеї Уа1і Уді Зег ТП о Зек Маї Авп о Рго Аз у я и ї- КІ ше а д Я Моз ВЕ Є їй тп ОБпе Бій Мер Ме Уві х тах цк зап во зи за:

з в що йтт г тт ди Фрію й тот ля ла тт- 1 бркт Аля зу 1271. теж

А13 Авр о б1іу Мет Мебє бек Уаї сіу Атїа Авп оуді Рго Аку БЗ1Уу Бі ТБ 55 35 За почин яті Тло тав лу ту бу б ялє т одти Лі а- лю ж д-1 так ач Бу Уві їй о ТБк обі Маї РЕ Су Буг Тк бі ві Аїв Ттр о бів 3 375 зо вна ва шотатш тт тлу йоду стро тумбу Фан тлу Влоцо ту ху слі

Рпе Авр оАї8 пу ТВБЕ Сі1у Авротут Рі Тюкробек Був Аіяд ТПх уві бів 385 18 385 апо 1 Да ба те т-щ4 Шен ті дет че Те 2 тч ще ли я

З1в Авп бек тів Аза бек т1іе АхроАвр о ТЕ Сіу Пе Уві ТИПБЕ Уві Азп

ДЕ дол Р Шк ав вс А15 ам з ен; Ме тло -т Тл (1111 рат 2330 т хктн По бно Ддошну Ля гя їун Шк 1 А Мет тів Гец їЇув'січ Еко сліу 1 ТпЕот уп лап о їУГТ Су ЕГО

Яд адь 42 лу зі тя Й я тод Фушуют о Я хежу кана и в НК Ен НИ Уж от ут уит ЕІ

ІпПг Овгпае пецч обіу пу Акч Авротур РІО сек дід пБіУу Туг іп РКО Буд 4335 24 2а5 пору 2 Толя бля ЗО, лін тові нн дня АЛ щу фтярто /Пекуї й ща З де звЕ Авпогец їУКг Маг діє ВЕГО 16 оОбвг дл лід СУД УК до Ув1 Мат й я г. ран жощде ап 55 Бо т що то стурьє пт, мо тт у пі тик би щі дя яті 7плган пд пн ше толо д1ід АкЧ о тТпЕ ТпнжІ Бім Аза Так о РгОо АівЗ Алр о Уві ТУ АвпоТпЕІ Ар Алі ав аз 475 аво тт пої ЗА тя дл яру 1 Ттре їн лпощ кис ко Дани 177 ок то

ІпПгоБєеп Уві їецй Аза РЕо Біу пу ТпкК Авп Мат -1У Ак Уві Ав Аа

За авт 1-й тону В пах т пт птоз; Фе Сб ЄПлатт 477 34 ія тую пот 118 Ав Бецп ойів ТБкЕ обі іч таж Був Тго бБег тує біцч ТЕ Акоа дів зо п5 вій к1 А тут т - Ще ре ТЕ тої Ноя пі узі ку 35 пен, тя 17 Мт ХК щі

А1Та Тео тУук Ахор о Рго Уві Гев тТпкК о Тпг осбіу пі Ахо о їеноУді Ре Уаії

БІБ БІ зиВ т з їй, 12 Де Тент д шва пит пл то дту М ан Сідшщтво т в

С1у Біу ч112е Ар АгЧ Аво гпе Аго Аа Белз АкроАіа бін бетг бі Був 53 535 5АВ 13 57 пані тлу 77 я дляню Тоді: Юа ту ВІ 7-3 біде 33 тяги п тп сів Уаі ТтТЕр бег ТБх Аку їТч Ребо біу Аів ді беїг біу Тут ТіК отТБбЕ дл кл реф дека аб шли іо зо дек Тук Бек тів Азропіу АхчЧ о бів Тук Узі Ага Уві УМаі беї біу б5іу вк пол Ек бо 7 вів

Зек їв обі бі РКО Таж РББпе о піу Бр ТАК о ТБг о Бтхо АвроУві Авросек

Бо и поп т ї - о пошта ох тло Тала ТІ т У -х шт ї гону я хо Жлжеє Тохтує

А1а дек біу Аів АвпосСіу тів ТУк Мві Рве Аа Бен БРго біб Було пуд 535 щВ 2ОЕ «дій» 5 «Ії» БАБ «ЛІ1ш» о БНТ «13» Пеустід звр, : зутшій вр «4005 2

Мет бек А1в Рута Атз Рбе Ага бів Ніл Аїа АвробіуУу Аза АТЗ Аїда біо і 5 10 15 тах Аїа віз РБко о зіу сіп йдех Ага Ті о біц Аза Ррпе біп РкЕз Узі так

БЕ 25 30 що ля дян те В ті їх де ді в ен по шву и НИК НН ВІ

А1тіа пів вВріЯи вів му З1У аз Ага Аів двпорго РгОо Іївббїяєцй го 35 ап й5 2 ; ка ту рило тт то, 1 у база Туя гл з- т т т тут тт 51 Ап Тук сів бзіу ТкКробіу ТуУух Так ойік їв Азропій ї1е Азво Гуд

Бо 55 ЕО дет по здо тлу дз (71 тео ДІ з пк ДІ ше ває Мн ги хи нт

Аво АзпоУуві бі сшіп Гезч біп Гей Аз тТгроАїа АкЧ ТтБЕ Мах сін вго

Балі г тт с бо Ще 15 во "1 хк що доку ІТ Тіз; ба 1-8 ттА дІ ту да я; лі т- Ден т 4 зЗіу Бек дДап сій зЗіу бак дДіз 1іе Аїва тТУукК Авпобіу Узі Уві Ре Те зо 25 и Що Ав п Дт тує хто хе но Во т г терну тт Того 1яДн -З1іу в»Би він дип во чні Уді іп Аїв 115 вав Ззіу пух іп їі У вп 130 135 119 жо Зоб яті Гдиня вк ие я ти пит В - т Сич р для тт їец) т1їе тгросій тує Аг Ака пуд Мей Бхо Рез віз Зх Буш Епе Іїї2 115 17о і75

В г тодтя тля; т- ді те о Вт лу те та отв Бе тк дові Ту

Ах дек о БТец о обліу Ата Аїва Буз Ако бек тІ1е Аїд Бен ББе 51 Авю Буд 130 155 140 до Про Б т сбодую о Фбінуху дошк дат льш ЗАТ 351 АТ У тя донні п тори чаі ТуУує Рі- Уві дек ТтТгроАвр Ада о БЕпе Уа! Уві від Бо Атщо Атва Буз 7 де, тапи тА т 145 155 185 160 т пляж тот т - вл тод сл 14 в ен проду Долині (т 5» г ги дя хе сля т. тп обі Був бецп дів тгросбі:ч ТтТаг о Адп о Акц біу с1іп сі Мав о біц обід 155 179 175 ой т- 1 рад еу Од ст: нн пн ххх теоодум с у иь а ги я тля п1у Мі Зек Авподеї бах сіу Рго Ті: Уві Уді Авробі Уві Уді ті попу Оле обу ка А ше а ОК т полях пе тре лу Лов пд т ней лях чн нини ни и ша КН и НН а1а пі пев Так оСуз (іп тТук дек осі Ре о біу св тТУук Чаї Тагосі» 155 БЕН ВОЗ ста ен г - іт тя Я дух оку 81113 (11130 Та Поу й Дощ б Бе тт Шк

ПЕ Ап АТ бін дет піУу піц бій обви Тк о Аку Аа тТпЕ Бе тів вто

АК вче дяв 71 щ-іїЗ шу т и т ж ою т ня тот ту. ля Го хи дв т с І ние Фк 153

Ах о РкЕЗз біу бін піч піу АвроАво ТБкЕ Ткропіу сіУу Атіда Рго Тух віз тт ет тс тал що А шоб таз

Даеат дя ти ет твоїх лоти т Мох Ти піно Піуя Дошх зер 113

АзпоАка тр мет тпробБіу дів тЕОб опіу Сіп ІРе о тпг тую АВо Бго зРЗ за зей тва а шлю -27

То-тхх дошку т ощтут дл т оба ІТ: ду пня ут ху І т ї а и ке а НН ій); Авроіви Уві Тук Тух сСіу Бек ТБкЕ обі Ага сіу Рко АТа бех віз тд зда пот

Бо во ша ке шани поутих кТ таро 731 ут т тля т - 1- й піддав оно лет чаї бів АкКо бі ТтТБгобБій біу Сі1іУ ТБЕ бен о Аів Сбіу тТБЕ Адп о тТапг Аг зай 85 впе дід Мві тІшува ко іч о твкК о піу пі: Уді уді тка туш Ні пір оте кпе лій Маї Був кгОо Було пк о сСлу піл Ущші хз ІС БУуюЮ пІ1В -пінпг

БЕН 235 303 т - - щ Цех дону пт Во ш рол ля тьом о бічну іт: Щи де тт ів. Бко Ак Аве Ази Тр оАвросевтг піц Сбуз Так Рпе обіц Меє Мет Уві зл 1 в т 5 за дО 219 зіцз: що т- т т о бпія уа Пію т г пат ло ТАЖ ГІ ля Щодо, пл З ат о й соти

Уві шаек тпЕ тах Уаі Авп орто Аво Ага піу Аїд Ар обіу Мет Меб пер

ЗІБ 33 335

Уві біУу дів Авп о Уді Рго Акєб пі піц тнк дкя Буш Уві тез Так опіу

Уві сліу ліва вп чаї то о АЕЧ о ІіУ січ гл атщ иуУЄ ві іє гпЕ су

Ас та зп заб АВ 350 хг - тлу їла т дк тавром од пиши шне 1 реА дах пі по: пек (7115

Уві РЕЗ Суд Буг ТпПЕ біу Уві Аїа То бів Ра Аво о Аів січ тп біу

З тп и 355 за Зб пуршчн, тет ні нн я тарт АТ ні чно Я - то тт. хо 7 - Фу ння

АВо Тук Рі ТЕ бек Був дів тат Уді піз; пів Авпобек тів дід Бек но а-к дом

Зо -т-а З ті - он дну Тр Зх; Тит хлів ти щ т ї7153 Дшу йно т Торі Тохкщ 115 Аво5 АБр оБуд зіУу Бецп о уУді тк Уві дал бів Авю Мет т1е Бер о гГУд б1іш Его сіу Був Ар о тТук Авпо тут Су Бк Тк Ре їей біу О1у Ахо жд дог АК 425 10 15

Аво Тгр обо пек діа піуУу Ту Цей Рко ГБух бек Ап о фей туго чаї тів а Е - - - хх я я йо йде 4385

Баг - нн дит т бут Пл у ун Товт Ток ТЕГ то дочиех Піуяя они зт В -

Рко Гей оЗег АвпоАід Сув ТУг Агро ої Буш АР Ако Так отпК січ Аід дл й ж дат 235 840 245 бу бануу АТ о А М лу дом в ян - бр-к Пл я-нох7в тякто Тоді ДТ що чн

ТтпЕ РЕ Аа Ав Уві БУК дл ІП аво ЗІ ТБкЕ Уві ів ей лів го вс яв ит 55 ап 1 т тео Ян що Ми 11 ху Дучх яв т - т бен тА па у китах п1Уу Був ТВг о АвпоМес о сіу АкКка Уді Аво Аза Ті Ар оУві Аа Так оліх ще я - кс 655 АТО 75 ап т - Пірат дуть Птанує Ст тя 1 не сна НЕО МИ ШЕ РІ тости Плядтя А оу отит л-

АТ ТВ пУз тТгробек Бпе осі) тнт піц діа Аїв о пеє ТтТуг АвзроБго Уді 455 аао 235

ХХ пояя сптія ян тот ТТ Волт т - 1-1 ТУ тр тт, яп я я ла Й -

Мас Тпу тк Аіз ЗіУу Авроїей уві Рлпе Уві сіу дех тТпх Ар о Ак Мет

БО зоб БІ

Різ АкчЧ о Ата Без оАхоровів ЗІ так опіУу Буш Бі) Уві ТгроБек тах Ак дл ще -та мАИ о дв-М да їви Рго біу Аїд тів бек о зіУу тую ТБЕ ТАК обек тТуг бек т1185 Аврвобіу 530 ІВ Бай

Томею стт тет лу ВІ Ме чт Кеш» поляк 01 Фея я т фк ню у ху щі

АБО сій ІУЕ Уді1 дів ув1 Уві Аа зЗіУ ці зеюкг о ївИРБ СІ ІпгройіУ гла г дв ЕЕ до 545 ово 55 оо хе ша нн ни Шо нн нн шо ВШ ЧЕ тал ля Му піт, ду гг па оБ»ух АТЗ Ав Уві рго сЗ1у чі ВАВ піВД ді сзІТ З1у 51 У ап оту т - п ко для ки ШКО т Тату, не я г ШК ЕК и т13 ТУк ч-Іі Бпе дід Гр БК 0-0 дід і1Ууй «210» З лиття дет «кед І1 щих про т «дій» РБЕтТ «ій» Пехсовзів зр, са» КІ

Мао Ат пі Дшто ла їла пі тем ді о тему леву льки дія тем т хлд

Ме Акту бій АвпоМді Уді Бі їзи Аіз ей; бег ТК Аїа Тез Т1е дів т Гящі тип вк й -к о о

Фееюо тощо Фет дл ня ді вн ді пл НА - АТ вл хг д пе НИ ШеШ век зви -еЕ Лів гЕгс лів Ббпе о віва зій ПпіБ ліва др осо у А1а Аїа дів 2 28 зо 2-14 пре АТ щої; лек А СТ ху тт Стоян Во т піз пах па ще зе туї 51: Тапг А13 Атад Ехо біу сіз бЗевг Аїд тів щі АзпоБпзеа бів Бго Уді тп дл й вл; 45 45 паю ту я пряну То от гля ту тт В з Вітовт Плану Юя тіятх З

ТпгодІіВв іс паші від зі ціУ деп під дів 'АВп о ро вшсл боб беЗ -й ге -о з зо по дгсопіо Ап отук ді йіо Тр пі Тк ТНК піп тв; Да» пів Ті дза лкш шліу Ал о стую сіп біу іїігропіу У опе сліпо збево ово піп іде дал шЕ -Е тк пи

РК 15 В тоятшо Вощуч йошт 7 поту йлово Тая т тод А во ану Ві в х ен пуд Авроавп ові сіу пів Гей біп бец Аів Тгровіз АкЧ тк Меб піц а щи зЗ5

РжЕо пі Бех Авпосзіц сСіУу бек Аза 1128 дід Тут АвпоСіу Уві Уді РБе 125 118 тотщія тя пат А Аж дою як ли тт нд. лоно пошу пт лу тот Під н т 1; іви зіу АВп Ага Аа» АЗроУні Мві піп Аїав Ті во бі Був ТЕ піу 115 125 ї25 шк т т т пла, тут - Щфронтя Аохтих тут зо Піни ант тт Ж як От

АвпоБей ї1а Тк зЗіз тук Аг Акп о Бу гей РЕб Ркго Аїв цех Був ЕБе

Ше чт лай ші 1 ян - 4 С тА дам дя тні 13; ДІ ві Тяащо Вовк підюя т х тошхі;о Ж (37 г он ч112 Ави Вер іши зіу вів дів пу авг ов Ії Аза Іши РБре їду др чл твА т. дл 145 150 155 155 т т т сптлу- пн ин чн ГЛ -к сум зн ЩА хтА площ тот пошу АТ іув Мві туї Ріпа о Уді бек Ткр о Авь» о Авпп о Ба Уві Мві Аїд Бей Адо Аїв 155 170 175 ложа Пт ля т ри нн а нн и и и т мк па Тпух ря я тло з Та Кк т пу Так Бі Був гей дід Тгробвіц Так о Адхп о Ак Сіу йійп спіу Уві зви ї5о 185 18о т паля ж ля душ дя Юре 313; Бу т те» 1781 кіл ЗЕ хг 518 сіу Уаї сбет Авпосет бек б1іУу Різ тів Уві Уві Авроб1іу Уаі1ї Уаї - ще Бека т в. 135 мМ М - - - Я 1 пат 1 пазах гоуян ї 1 х ТА т Ран Спяут ЗЕ пня т1з дід б1іУу бак Тахо Сув бБіп Туг Бек обіу Різ о спіу Су тую Уві таЕ

У У У і У і; -е- т яд лог ши 215 щи т ри щ-що-н АТ пт тн т Гл пл т - тПерекяо озяни Туру, плн ря ті сС1Уу Так АзроАів ій бех о сіу сій піз бе) ТІр Аг Ап о тах Ра ї12 тт пли ту тай пло ан; 235 во пе поз ся слот; тя т ся ит тя що лугу тя тя тлу утіх с, тт

РКО Ака о Бко шіУу ЗІ сіц 5іУ Ав» Ар отТпІ Тр обіу біу Аа БкЕо туг лав 50 255 1 їх ту Дози Пл З - Че 2714 пло яру їТ і кк ст ти в ян збути Дт Тр сій АвпоАхо ТЕроМес тТБЕ о сЗіу Аід Ттр о сіу біп о І115 Тих ТтТук Аво о Рго

ЕП ев п вижив: -5 Р, мачи ЕХ А Толя 321 птах хуя 031 390 я мя тд д м Ен п Ст -21с о їеч Аво іївп о Ууді їіут ІтІУук біу беКБ пі о піу діа ПІ РІО Аза пев - бюд толь

ВО 25 ря т тт з і а і АН і нн х плоду Ян па те 1 Маі піп Ака б5ІУ ТБЕ бій сіу пбіу ТБгоїецй АТа піу ТВ Ап ТБЕ

З і: і; З тих з ав злих

ШО Ва ек яІл: ячмо Лукич - ХЕ т - тк Тут пт7ну тт я ЕН дат бек тег 114 що т

Ага кпе А1воУгі пу Бго пу ТИХ піу сів ві Уді ТтТЕро обу Нів біп з щлойт --ї тий зпе ЗА 315 зи яти ї- ит Те Ту ше То ББидтья т -щх шт мае Її як голою втеч "Тл ал М ї тапгоїей со Аглч АзроАвп о ТІр вано бек осів Су тах Рвпе сі: Ме Ме шле да Зче

Зо За 3 лу-ї вх І о В т шою Туди -- ОЗ -о т то Даті тлу М, ди

Утаі1 Уві бек тТпх тпх Уві Авп о Руо Авор Аїд бі Аїв Авзрозі Ме Мет зА0 За БО дя хи - т ОТ даную ди пе шо АН НН Пл Дому Тлтн лк Толя ноя зек Уві сб1іу Від Ашп Уві Рго Ака піу пів ТВЕх Акч обу Уді Ббецп тах зе зей ик 355 ЗБ 305

Я

З пл т -; ущ. ура То блін ст ху тА 1 во пло т тн щу щоо-, ля: тя сіу Уві Рко був о Пув Таж сіу Уві Аів тТго бій РБе Ар Азія сій ТБг ях пот лю 3 375 ш "7 оон Прах зх Панно ду лу ДО ії лі пЬШН а РЕ пен те, ді 51Уу Ар тує Рпе Тир дек Гуз Ата Тпх Уві бій бів Анпобет тів Аді ш ще ще пи

ЗБ Бе зв од род тд ва ин и на шк Шк ть 17-11 ті два Ми тА Тв

Шег ІТів Ар Ад рів сіуУу і х ві тк Уві Дищт опір да її Мат тів бер те вт дя є 405 310 315 тА нні пд дуття ППєтує Торт Птттує тлу плуія- спідою си тодяу ил оту т їуш зій Риб обіУу ГПУ Ав оТтТУуК Авп о ТУук СУ РЕо тах Би Пец осі пі

Кл я зп

ЕВ але 43

Фан дош я зи тн ВАТ сту тра Тоді ля тт Лу Ат тота тт т

Ак чо Аврр тТгОо Его бер лід ші у ТУ Ко зі Ка Ту ж ще одн гц ТУБ У-щі1 ле Ам пи 440 да ки щи ти дтя о ух щу ВІ тях ППОяхує Воля Тодутіо Тяту Ду Дяння бпіцно мо т 115 Еко Бецп бек Ав» Аїв о сСув ТУК Аво їв Гуз АЇЗ Аг тТпг о тТх під їх М. дова а 455 чо р тео буть ДІ Ат З азу оту тд Фр пк ЗВТ ту Ту ВТ.

Аа ТЕ РКО Атд А рю оУуаї ГУК Ап оіЇлпЕ ЗАІЕросвЕ і1пг о оУуво УМ 1вИи Ав до з - 7 Ч А 4о5 АТО АБ НН

ЛК дя лу ГА че ота МУ Авт Тож у Те -я- ть т оди и - т тп ляяя ге ші у пп Іл Ав Мат сіу Акос о Уді А ща 12 да ожні ві 1пЕ 453 495 ж я ВА тя Тіз ян туя Ве ля тт 14 т. х то-і пізно щу Тая

Б51у Аіа тк Був Тгробдек Раз о сін: ТаКобіс Аїд лів бецп о Тук Аво га вав вив БІ т-7 Е. - пф ян п я х ож р Ж онктя І-ї ло ін -- сто ління ех сто чаї Меї тк тах Аів о сіу Аво їй о уді Епе умі піу бак тТпКЕ Азв Акос г Гео вл 515 шк НО)

Мен нн ни: и нн в в НН: а ШИ тз- Фле (т ху тод ФІ 15 Дан Є н 7пмях

Мет ВБе Ажтс о Ата Тез Аво бів біб ТапкобіУу бух біз Уві ТтТго о бек Ту

ЗО 535 540

Тед -А шт УЛ я тА т їз ою Тіт пу ТК ун нумо ятує Фунт т6- сх

Ако Бей Рус 5Ііу Аів тів дек сіу Тук ТАК Ту бек Тух Зект тів Авр ві У ТУ У : св: ве пи зав зви 555 Зо

Гм ово лази ща тлу тл- тт 7-7 тл-ї ті пи жи ху ная то-ї 271 пи ния

Б51У КТ із тує Уві Аїв Уді Уві Дів пі у міу сек іс п1іУу тв А -ДДЕ г па нев зи чів з; іа вн ня Тяга ВІВАТ и тр. Сх тд дозу Дт я г тп 7лоху лот

Ре впе пуд Аіа Аа Уві вгІо спі Уві Ав оАтїа Уві біп о біу піу Азвп во 55 550 т Тятоо п яи ти Вп руни тт чит. с1у Іі: Тук Уаі Рпе Аїа їй Ро Зі Аїа Буз

БУ во тя 4

Ха КО Не «Ії» 605 ар с3чу «пі» БЕТ 2 Тічлугущії ст кам іш УшВвіІіВ в, «400х 4 ден А тн т а ни НИ и п одне и ще 1-Х, 71598 т дія тона В я.

Ме Акач о ВБе віч Су тіе Атд о сіп АвпоАТя Уді б51у і-ши АТа і-й бек - я до ії 5 16 ї5 ти діщш тет Рі п Фет Ті Я ДТ кт АЛ рн 1 тім ні мае

Тк дів Пец тів дів бу пи беї Аза Бхо Аїва Рош Аіа сіб Біз Ав

ЕВ, го Б ке а ШЕ зар - ВІ тот 13 АТ Я бе АТ бен ВІ що т 1331 лу ат сту А18 дід ть опійп дів Уві бек дія пів бек дів 118 піп деп й кг ле 35 о 45 "кеш те Лімо хх плн у. т. 21330 тут тля ті кАОШН - пек сб ІН кут

Рпа гу Рхо Уві тої Аів сій Аво» о ІТ1- діваозіу А1я Авап бек Ав Адт й вк да що меж ФА

Плану м т шо Ж щі Фунт т х Ло ПОПкан о Ат її хі --- й то Пт ль яю ту тот

І го Еко 1 12 ір де щі У Ази іч овпай і У ТЕвр с 1у іп пе Еко тей 655 Не т НІ

Ат туя 1 да Тут щ-щеб боту ЛЯ «313; тр 71 То-л д прое Соя дз іі 12 Авп ТУ Ава ах Уві їі ап іїівц опів без Аа те росявЕ 4 п пе

З ЗБ пуряачит Пі нт Пани: І Фу Таня «7 сту ох жлнк ттяио оку

Ако о ТпкоМає бій Ро біу Бек дяп осі) біУу Ага Аа тіє 0813 тТук Анни зго т1а5 11:10 га, о хящ та бчан Толі (13,8 дачу В ща ек Ди хв тн тн дііщ т -е- 51 У Уві Маї Уго ІМ дл вАіа вт пз чаї її 18 Сів Аа тТІв. Адр 115 179 1275 хх тво Тр (іх, Ам ти ТІ пПпеух ї1Т753 багно Атут Дн Тло Ті тк т т1Уу Був ТпвЕ обіУу Аню оїши тів то сіб Тук АкЧ Ахс Гуд беец РІО Ро поту Яд т як 150 125 145

В тот Тор чн ни З ИН Фут тя ти нот Тоятя н- г -я тлу

А1з бах пув Бе ті Авпобек іш; піу піп Аївз Був АкуЧ цеї тів АіївВ чтлц яд тА чо 145 1БО 155 150

НН то Ву 01 45у шу тот 17 біт БІ тя ду ті Ду ду ті; їі АТ їй вва о спіУ Авропув Уві Ту РБбе Уді 5етг Тгр о Авр Агип о Бпе Уді Аа ї55 ії їх

В Те паж Кл ощо Тохащ кн т Тр т одкяя ДОЇ - и 033 пд А ощаяо Длчек ст;

А1а їз АзроАтв о пУуВ ТБї сзЗіу Буш їн Аїд Тео 514 ТБЕ Ав оАкО Зіу 180 185 155 ну білях 37381 дну 153 я 37 Си дош сідає У НАНУ сту тт- лм ХЕ іп зі Уді вве осів слу Ууя:і овЕ Ап оовг ЗвЕ сС1У Его 115 Уві Уді із5 оо 205

Дао стлітр я Ох ті пло сті тка тя (тка пло ті птн о їз хх ри т авг осіу Заі Уві тї11і2е Аїд о зіу тс ТБЕ Сув піп Ре бак СіУу Бпеосіу ій 215 22 хх зн яхт тля т 3; пт Вот т піз таня и ку 71150437 14 00Тояї о П'яні А дня ув Тук чаї гпКгосаіУу їпЕг опр Аід Зі шек шщі м ї5ій се под; гро Аг

ЗЕ 35 ле Ат ги 231 235 ай

Ап оТтТпгоББе о ї11а Его Ак РІО бСіу вій б5іц Біу Аль о Авротпг Тк осі пд ло зд пт т ва Глтря 7 я гу дл я АК роко 271 оо бані й Км ет сзіУу АіІв Рхо тТук Сіл Авв о АкЗз Тер оМеє Тахо сСіу Аїв Тер обі бій тів щоб Бо за піл Птах Вуж хе а п т п чн ктхе їт Сея пін тт у ВАТ тп Тук Ахр Его біз їв Авороїви Уві Тут Тух б5іу ву тп обі дів 275 Ва еВ

ТІЛ я рних В що ли ТТ хто (ія Лечо тт ть 1. Так (іх рю тот дО с1У РЕго дід беїг ів Уві 5Зіп о АЕ що шу ТП сіру зі У Так ої АіІВ зай пав ЗО пам їн дя готи ох віт пл т - Ноя Тс ППліяяак ля ж я ол тт сСіу Так Азап так Акад Ре Аіз ві Буг Рко Пузв ТПУ бі бій Уві ді

Зп 315 315 32о тен Ж як ТЯ ще ТТ тав ую т іа. Тк опе тод потодяюя празу ан НИ о у алея ткКроБуз Ні бІп т хо ївец Рто де чор вп ого пз злі о сСсап о оУузЗз інв з25 з3о 335

Флірт 21771: ме во ре що Шен ноя пня 7-1 -Ж пен да А дам пі впе о спіп Меї Мет Уа: ді Хек тк ТБбкг Уві Алп о Буг: Авп діа Ав поді зар 345 35 п лох; Ма Чер ра заз пл) АТ То отовг Пе дж бл 1 сяє й ке сій сіу Меї ЕвБе бек Уві сіу Аза ТпЕ іецш РБго Акго біу сі: ех Ахго т ят-щло т пе ств 17 пе тяж «що Фін тя, За Дід опеюк йтн о Ре

Її Уві Тви тк пі У ча 1 Вко ШУ Був ТпКосіту Мді Аід Тер о сіп вна іа 375 зно - от Бали ПОН п аа ОН талу БИ. тт тож, . пеладя тА тло А т

Авровів сін о тТБкоспіу АвроТУук РЧе Ттгр олег Був АТа тТпкЕ Уді Ата бій 355 зво 355 ап дяк для діщ ді пев тів да Дату Тл утіх те хр тн лу дно тя

Ак Аїв Мві Аів сет їв о АВвроАВЗе Був біуУу ем Уві тТпЕ Уві Авпозіцй 425 419 415

Авто Мет т ті Тххщо 1133 Ви ія Ті Аня Таун дів Ба обтув Бко тва аавроМеє тів тів Ппув о сій РгоЗ сі Був Азк Ту бін БРпе о Сузв БРго ТЕ дою де дол дей а 135 фрщшео Рош т як 15 до да тку Ви тд В пт, ФЧарко Тиіі Юа ДІ що бр вп пеи бі Сіу Ага о АвроТто Рго бек Аа сіу ТУук іа РЕз АРд йде

Ффжеуі Товуия ПП вяя тр тт хе н я Ше ля ВІ зятя Дені т дах тя ВТ

Ап оїгви ТтТУухк Уві Ті Рго Геюб бег піп Азія Суз Тут Ахр їец Тапг Від де ля коді

АБО 45 аз зе тн ліво п що ть я АТ я дош, лу сте Ди тні ла вії ть

Акц о оТпЕ так обіп АівЗ Тл РЕО Аза Азо» Уві ТУук Аво отпг о Авр о Ав ТОБ кА тя т - чи АНЯ го пн Вод дно й яу доку: дії дем дл тт. чаї Бу ї1ви Ага РО біУ Акс о ТпТ АвпоКетї пі Ак Уві Ар о дід тів йчкопши А1д Тв пі біз; твк ото Ту деко Бе ів; тк отТЬБг дід А18 аллюр о пшмМм олія ІПЕ су бій їпЕ пух ТО о-еевК гПа сів гпг гпгГ о під о лід по во 519 їв; оТУує Ар РЕ чаї Мет твер тн - їі фрі шк Ан тот Зо вне: чвеВ1 Щі іі І А, то омаї Ме оп о ІзлЛг ослІіІУ їі М длЮ ЄМ ще чщ ж-і У

БВ поп ви са Тье дач дек Зі Фірко дя ВІ Тел дух дід тк гак Тк с

Зек Тпг оАвроАго Уаї Тут Ако Аїд Гей Агро А1ів АРа так обіУу Буг сій чт- То т а шк ем в ИН Єнот 8-2 то пиши и и а У у льно фран рн чві ТЕвр дек Тл Аг Тіє РІО сіу Вів тТіе дек о біу ЕБне ТПготакг бег в А Б дл ве ді 5БО АБ Бай стяхає Сто Тодухя Дохя ст ху Дали сту бі ТАТО ТАТ онря зи ЩА (Тл; пд

ІУг оЗзекг опей паю саУу дЕбозіп ї1УтТ Ущі діа чаї ви ІВ З1У СЕУ ет до та те

Бе БИ БВ іїецозіу тТпкЕ о бек о Ре Бпе Пух Аїа Аїв Уві Бго Азп Улі Авор Аід Уді 5іап віу БіУу Азпосіу Тіїе Тук Уві РЕпе Аіа Гній Рго Азр Аїд ГПув Іїв вах вБЛО ви с1із

Claims (21)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Застосування алкогольдегідрогенази 5ЕО ОО МО:1, яка містить іони металу та хіноновий кофактор, або, додатково, її функціонального варіанта, який є ідентичним послідовності принаймні на 80 95, переважніше на 86 95, а саме на 89 95, та принаймні один окислювально- відновлювальний кофактор для перетворення принаймні одного трихотецену, який має гідроксильну групу на атомі С-3.

2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що послідовність амінокислот функціонального варіанта вибрана з групи 5ЕО 10 МО:2-5ЕО ІЮ МО.

3. Застосування за п. 1 або 2, яке відрізняється тим, що хіноновий кофактор вибраний з групи РОСС, ТТС, ТРОС, І ТС та СТС, переважніше РОСС.

4. Застосування за пп. 1, 2 або 3, яке відрізняється тим, що хіноновий кофактор зв'язаний з алкогольдегідрогеназою принаймні одним іоном металу, вибраним з групи Гі", Ма», КУ, Мод, баг, йпея, п Мп, Мпз», Бе?х, Резя, бує, би, бог та Соз», переважніше Са?" та Маг».

5. Застосування за одним з пп. 1-4, яке відрізняється тим, що принаймні один окислювально- відновлювальний кофактор вибраний з групи РМ5, похідних РМ5, гексаціаноферату (ІІІ) калію, гексаціаноферату (ІІ) натрію, цитохрому С, коферменту 01, коферменту 010, метиленового синього та ТМРО, переважніше РМ5, коферменту О1 та коферменту О10.

6. Застосування за одним з пп. 1-5, яке відрізняється тим, що перетворення трихотеценів, які мають гідроксильну групу на атомі С-3, здійснюють у харчових та кормових продуктах, зокрема для свиней, птиці, великої рогатої худоби, коней, риб, аквакультур та свійських тварин, та у сировині рослинного походження, які використовуються для виробництва або обробки харчових та кормових продуктів.

7. Спосіб ферментативного перетворення трихотеценів, який відрізняється тим, що принаймні один трихотецен, який має сгідроксильну групу на атомі С-3, вводять у контакт з алкогольдегідрогеназою 5ЕО ІЮО МО:1, яка містить іони металу та хіноновий кофактор, або з її функціональним варіантом, який додатково демонструє ідентичність послідовності принаймні на 80956, переважніше на 8695, а саме на 8995, з принаймні одним окислювально- відновлювальним кофактором та водою, а за потреби з принаймні однією допоміжною речовиною.

8. Спосіб за п. 7, який відрізняється тим, що послідовність амінокислот функціонального варіанта вибирають з групи 5ЕО 10 МО:2-5ЕО ІЮ МО 4.

9. Спосіб за п. 7 або 8, який відрізняється тим, що трихотецен, який має гідроксильну групу на атомі С-3, піддають перетворенню при температурі від 5 "С до 55 "С, переважніше від 10 "С до 50 "С, а саме від 28 "С до 45 76.

10. Спосіб за пп. 7, 8 або 9, який відрізняється тим, що принаймні один трихотецен, який має гідроксильну групу на атомі С-3, вводять у контакт з алкогольдегідрогеназою, яка містить іони металу та хіноновий кофактор, або принаймні з її функціональним варіантом, з окислювально- відновлювальним кофактором, водою, а за потреби з допоміжною речовиною, протягом принаймні однієї хвилини, переважніше 5 хвилин, а саме на 60 хвилин.

11. Спосіб за одним з пп. 7-10, який відрізняється тим, що хіноновий кофактор обирають з групи РОС, ТТС, ТРОС, І ТС та СТС, переважніше РОСС.

12. Спосіб за одним з пп. 7-11, який відрізняється тим, що хіноновий кофактор зв'язаний з алкогольдегідрогеназою принаймні одним іоном металу, вибраним з групи Їх, Ма", К", Маг, ба, пе, п, Мп, Ми, Бех, Без, бу, би, Со та Соз, переважніше Саг»та Маг.

13. Спосіб за одним з пп. 7-12, який відрізняється тим, що принаймні один окислювально- відновлювальний кофактор вибирається з групи РМ5, похідних РМ5, гексаціаноферату (І)

калію, гексаціаноферату (І) натрію, цитохрому С, коферменту О1, коферменту О10, метиленового синього, ТМРО, переважніше РМ5, коферменту О1 та коферменту О10.

14. Добавка для перетворення трихотеценів, яка відрізняється тим, що містить алкогольдегідрогеназу 5ЕО ІО МО:1, з вмістом іонів металу та хінонового кофактора, або її функціональний варіант, який додатково демонструє ідентичність послідовності принаймні на 80 95, переважніше на 86 95, а саме на 89 95, а за потреби додатково також принаймні один додатковий компонент, вибраний з групи, що містить окислювально-відновлювальний кофактор та принаймні одну допоміжну речовину.

15. Добавка за п. 14, яка відрізняється тим, що містить функціональний варіант алкогольдегідрогенази 5ЕО ІЮО МО:1, вибраний з групи БЕО 10 МО:2-5ЕБО ІЮ МО.

16. Добавка за пп. 14 або 15, яка відрізняється тим, що містить хіноновий кофактор, вибраний з групи РОС, ТТС, ТРОС, І ТС та СТС, переважніше РОСС.

17. Добавка за пп. 14, 15 або 16, яка відрізняється тим, що містить хіноновий кофактор, зв'язаний з алкогольдегідрогеназою принаймні одним іоном металу, вибраним з групи / іх, Ма», КУ, Мао, Са, пе, п, Мп, Мп, Ре, Рез, бу, би, бо» та Со, переважніше Са?" та

Маг.

18. Добавка за одним з пп. 14-17, яка відрізняється тим, що окислювально-відновлювальний кофактор вибрано з групи РМ5, похідних РМ5, гексаціаноферату (ІІІ) калію, гексаціаноферату (І) натрію, цитохрому С, коферменту 01, коферменту 010, метиленового синього та ТМРО, переважніше РМ5, коферменту О1,та коферменту 010 як окислювально-відновлювальний кофактор.

19. Добавка за одним з пп. 14-18, яка відрізняється тим, що допоміжна речовина вибрана з групи інертних носіїв, вітамінів, мінеральних речовин, фітогенних речовин, ферментів та додаткових компонентів для детоксикації мікотоксину, таких як ферменти, що розкладають мікотоксини, особливо, афлатоксиноксидази, ерготамінгідролази, ерготамінамідази, зеараленонестерази, зеараленонлактонази, зеараленонгідролази, охратоксинамідази, фумонізинамінотрансферази, фумонізинкарбоксилтрансферази, амінополіоламіноксидази, деоксиніваленолепоксидгідролази, деоксиніваленолдегідрогенази, деоксиніваленолоксидази, трихотецендегідрогенази, трихотеценоксидази; мікроорганізмів, що перетворюють мікотоксини, таких як О5М 11798; та речовин, що зв'язують мікотоксини, таких як, стінки мікробних клітин або такі неорганічні матеріали, як бентоніт.

20. Добавка за одним з пп. 14-19, яка відрізняється тим, що знаходиться у капсульованому вигляді або покрита оболонкою.

21. Застосування принаймні однієї добавки за одним з пп. 14-20 для одержання сполуки для профілактики та/або лікування трихотеце нових мікотоксикозів, переважно мікотоксикозів, спричинених трихотеценами, які мають гідроксильну групу на атомі С-3, особливо таких як, деоксиніваленолові мікотоксикози. 0 КомпютернаверсткаА. Крижанівський (00000000 Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП "Український інститут інтелектуальної власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601