UA117694U - Середовище для кріоконсервування соматичних клітин - Google Patents
Середовище для кріоконсервування соматичних клітин Download PDFInfo
- Publication number
- UA117694U UA117694U UAU201612433U UAU201612433U UA117694U UA 117694 U UA117694 U UA 117694U UA U201612433 U UAU201612433 U UA U201612433U UA U201612433 U UAU201612433 U UA U201612433U UA 117694 U UA117694 U UA 117694U
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- cells
- medium
- freezing
- vitrification
- sucrose
- Prior art date
Links
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 title 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 16
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims abstract description 16
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 10
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims abstract description 10
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims description 15
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 14
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 abstract description 23
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 abstract description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 abstract 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 26
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 25
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 description 24
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 16
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 13
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 3
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 3
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 3
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 229920006184 cellulose methylcellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 2
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 2
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical group [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 2
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- PFRQBZFETXBLTP-UHFFFAOYSA-N Vitamin K2 Natural products C1=CC=C2C(=O)C(CC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 PFRQBZFETXBLTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 231100000045 chemical toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000003624 condensation of chromatin Effects 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 230000002338 cryopreservative effect Effects 0.000 description 1
- 239000008150 cryoprotective solution Substances 0.000 description 1
- ZAKOWWREFLAJOT-UHFFFAOYSA-N d-alpha-Tocopheryl acetate Natural products CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000009477 glass transition Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M lipoate Chemical compound [O-]C(=O)CCCCC1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019136 lipoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- DKHGMERMDICWDU-GHDNBGIDSA-N menaquinone-4 Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CCC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 DKHGMERMDICWDU-GHDNBGIDSA-N 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 description 1
- 230000000065 osmolyte Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 229910052761 rare earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002910 rare earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000010583 slow cooling Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013526 supercooled liquid Substances 0.000 description 1
- VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N tetratriacontaethylene glycol monomethyl ether Chemical compound COCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002663 thioctic acid Drugs 0.000 description 1
- 229940042585 tocopherol acetate Drugs 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 235000019143 vitamin K2 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011728 vitamin K2 Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Середовище для кріоконсервування соматичних клітин містить ДМСО, поживні речовини, поліетиленгліколь, сахарозу та дистильовану воду. Як поживні речовини використовують DMEM, і середовище додатково містить фетальну сироватку теляти (ФСТ) та карбоксиметилцелюлозу, при наступному кінцевому співвідношенні компонентів, мас. %: ДМСО 2-10 DMEM 30-50 поліетиленгілколь 5-15 сахароза 5-15 ФСТ 10-30 карбоксиметилцелюлоза 5-15 фізіологічний розчин до 100.
Description
Корисна модель належить до галузі кріобіології та кріомедицини і може бути використана для низькотемпературного кріоконсервування соматичних клітин з метою їх подальшої трансфузії.
Проблема збереження живих і функціональних клітин поза організмом надзвичайно важлива в сучасній медицині і зачіпає багато її областей. Так розвиток медичних технологій сприяє розробці все нових підходів до лікування безпліддя за допомогою кріоконсервованих сперматозоїдів, ооцитів, ембріонів. У лікуванні онкологічних захворювань використовуються стовбурові клітини кісткового мозку. Клітинні методи регенераційної медицини базуються на використанні соматичних клітин диференційованих тканин та спрямованого диференціювання стовбурових клітин. Найбільш перспективним напрямком, що зараз інтенсивно розвивається в кріобіології, є вітрифікація, яка поступово витісняє традиційно використовуване повільне заморожування.
При вітрифікації значно спрощується не тільки процес охолодження, виключається небезпека фізичних і хімічних пошкоджень, викликаних міжклітинною та внутрішньоклітинною кристалізацією рідини. Під вітрифікацією розуміють перехід рідини в твердий стан, який викликаний не кристалізацією, а екстремальним підвищенням в'язкості рідини під час надшвидкого охолодження без проходження стадії кристалізації. Зазвичай середовище для вітрифікації складається з суміші проникаючого кріопротектора (ДМСО, ацетамід, пропіленгліколь, гліцерин, етиленгліколь) і непроникаючої кріопротектора (поліетиленгліколь, фіколл, сахароза) в буферному сольовому розчині.
Вітрифікацію можна розглядати як фазовий перехід, в якому переохолоджений розчин при надшвидкому охолодженні нижче температури склування (Т9), залишаючись аморфним, набуває структуру скла і має властивості, аналогічні некристалічним твердим тілам. Живі клітини і навіть цілі ембріони можна таким чином перетворити на "скло". Склоподібний стан рідини при вітрифікації досягається за рахунок її дуже швидкого охолодження - коли ентропія рідини знижується швидше, ніж ентропія відповідного кристалічного стану. Тобто, рідина просто не встигає замерзати, коли її ентропія наближається до ентропії кристала. Однак, щоб вітрифікувати живу клітину, необхідно досягти швидкості падіння температур «108 "С/хв, що на практиці є нездійсненним завданням, оскільки кріогенні рідини мають недостатню для цього
Зо температуру, і неможливе використання обсягу вітрифікованого розчину менше, аніж обсяг ооцита або ембріона.
Було показано, що додавання до середовища для заморожування кріопротекторів дозволяє різко знизити швидкість заморожування та досягти ефекту вітрифікації. Так, вже при концентрації 10 95 етиленгліколю та пропіленгліколю швидкість заморожування можна знизити на порядок, при концентрації 40 9о цих речовин вітрифікація стає можливою при швидкості охолодження 103"С/хв, а при концентрації 6095 можливе її зниження до 50 "С/хв. Але зі збільшенням концентрації кріопротекторів, що вносяться в середовище, збільшується і їхній негативний вплив на клітини, що піддаються заморожуванню. Повільне заморожування, по суті, також призводить до накопичення переохолодженої води в біологічному об'єкті з подальшою вітрифікацією внутрішньоклітинного компонента, тільки досягається цей стан за рахунок сильної дегідратації клітин при утворенні позаклітинного льоду.
Таким чином, при досягненні такого склоподібного стану зупиняються процеси хімічної та фізичної деградації об'єкта. Незважаючи на досить складний фізичний механізм процесу вітрифікації, речовини в такому стані найчастіше зустрічаються і в нашому повсякденному житті - це власне скло, солодка вата, деякі види силікону і безліч інших. Іншим способом різкого зниження температури зразка є можливість охолодження гамет та ембріонів при температурах, нижчих, ніж температура рідкого азоту. Найбільш холодний газ у рідкому стані - це гелій (його температура кипіння всього 4,2 К), і, природно, охолодження в ньому буде найбільш ефективним. Але такі гази надзвичайно важко підтримувати в зрідженому стані, а надтекучість гелію і його практично повна прозорість роблять будь-які маніпуляції в ньому практично неможливими. Тому був розроблений метод кріоконсервування в некиплячому рідкому азоті, температуру якого вдається знизити до -220 "С. Цей ефект досяжний при зниженні тиску, що призводить до зниження температури кипіння рідини. При поверненні нормального тиску безпосередньо перед вітрифікацією матеріалу азот не встигає нагрітися і закипіти, що створює можливість заморожування в переохолодженому рідкому азоті, тобто, з більшою швидкістю охолодження.
Переваги та недоліки методу надшвидкого заморожування: - Вітрифікація полегшує і спрощує процес заморожування як простих одноклітинних об'єктів (клітини) так й багатоклітинних (ембріонів).
- При контрольованій повільній кріоконсервації об'єкти пошкоджуються кристалами льоду, що знижує подальшу виживаність біологічних об'єктів та ефективність подальшого використання. Вітрифікація дозволяє підвищити відсоток живих об'єктів після розморожування та прискорити їх відновлення. - Пробопідготовка для надшвидкого заморожування на 1-му етапі не складна та наближена до стандартних процедур. - Недолік вітрифікації - хімічна токсичність яка прямо корелює з концентрацією кріопротекторів, часом і температурою експозиції об'єкта у цьому розчині. - Проблему пропонується вирішити шляхом підбору низькомолекулярних кріопротекторів.
Оскільки коефіцієнт проникності кріопротекторів до клітини знаходиться в прямому зв'язку з молекулярною вагою речовин, що входять до їх складу, і одночасно є передумовою швидкого проникнення кріопротектора в клітини або, навпаки, виходу з них, то низька молекулярна вага складових кріопротектора дозволяє зменшити час експозиції об'єкта у розчині для вітрифікації та досягти меншої хімічної інтоксикації.
Застосування спеціальних поживних середовищ та послідовності дегідратації перед заморожуванням присвячено досить багато робіт. Так, Міснає! Ю. Сессні (05 2012/0064504 А1, 15.03.2012) пропонує вдосконалити наявні промислові зразки середовищ для заморожування за рахунок розширення складу та додавання глюкози (0,18 г/л), пірувату (0,03 г/л), ліпоєвої та лінолінової кислої (0,000008 г/л та 0,00005 г/л, відповідно), альфа-токоферолацетату (0,00075 г/л), аскорбінової кислоти (0,01 г/л), вітаміну К2 (0,0005 г/л). Також до середовища пропонується додавати антиоксиданти для зниження пошкоджень мембран клітин та поліпшення процесу відновлення після розморожування. В результаті склад середовищ стає дуже складним та потребує адаптації під кожний зразок тканин, тип клітин та напрямки подальшого використання.
Так, наприклад, підвищений вміст пірувату та аскорбінової кислоти не є прийнятним для поліпотентних стовбурових клітин, оскільки викликає спонтанне диференціювання у напрямку хондроцитів. Крім того, запропонований спосіб не аналізує швидкість зниження температури та її вплив на виживаність клітин.
Інший підхід наведений Апіїа 5)огдеп єї аі. (05 2009/0093054 АТ, 09.04.2009) та Ззапспе
Сшіієте еї а). (05 2013/0157250 АТ, 20.06.2013). Для досягнення високої швидкості
Зо охолодження та стану вітрифікації рідини пропонується використовувати спеціальні "соломинки". Це тонкі трубочки з пластику або скла діаметром 1 мм, довжиною 10-13 мм, об'ємом 20-200 мкл. Малий об'єм "соломинки" дозволяє швидко охолоджувати об'єкт, але є суттєвим фактором, який обмежує використання зазначеного способу лише в процедурах запліднення іп міо. Тобто в таких процедурах, коли кількість об'єктів налічує одиниці та десятки. Для заморожування та зберігання достатньої кількості стовбурових клітин, тканин, органоїдів ці об'єми не ефективні.
Іншими авторами Чдонп М. Вайвзі, Кореп Мап Витік, допп с. Ваше (005 2001/0049140 АТ, 06.12.2001) пропонується середовище на базі 295 желатинового середовища. Для заморожування таке середовище цілком непридатне оскільки не вирішує головну проблему - заміщення води кріопротекторними розчинами для зниженні утворення кристалів та максимального збереження цілісності структур клітин.
В патенті України на корисну модель 106776 було описано середовище для кріоконсервування еритроцитів тварин, що містить 10 95 ДМСО, 0,9 95 Масі, 10 мМ фосфатного буфера, 15 95 ПЕО-1500, 5 95 1,2-пропандіолу, 5 95 сахарози та дистильовану воду.
До недоліків запропонованого середовища для кріоконсервування можна віднести його вузько специфічне використання для кріоконсервування еритроцитів і непридатність для кріоконсервування соматичних клітин, внаслідок низького відсотку живих соматичних клітин.
В основу корисної моделі поставлена задача підвищення відсотка живих соматичних клітин людини після заморожування-зберігання та розморожування.
Поставлена задача вирішується шляхом використання поживного середовища, насиченого мінералами, амінокислотами, фетальною сироваткою теляти, непроникаючими осмолітиками (сахароза, полієтиленгліколь, карбоксиметилцелюлоза) та проникаючим кріопротектором (диметилсульфоксид). Підвищення ефективності процесу замороження окремих клітин (клітинної суспензії) досягається також за рахунок використання тристадійного процесу заморожування. В інтервалі температур 37 "С до 4 "С та від 4 "С до -47С швидкість зниження температури складала 1 "С/хвилину. На третьому етапі від -4 "С до -200 "С швидкість зниження температури досягала більш ніж 150 С за хвилину з досягненням максимально високої виживаності клітин при заморожуванні/розморожуванні та зі збереженням проліферативної активності клітин.
Використання запропонованого складу поживних середовищ, які являють собою суміш органічних непроникаючих до клітини кріопротекторів та неорганічних проникаючих кріопротекторів дозволить підвищити відсоток живих клітин після процедури заморожування/розморожування, зберегти здатність клітин до подальшого поділу та диференціювання, залишити незмінними рецепторні маркери клітин, їх чутливість до зовнішньо клітинних сигналів та здатність до диференціювання. Новий склад поживних середовищ для надшвидкого заморожування дозволить підвищити ефективність клітинних біотехнологічних процедур та методів в таких сферах як регенераційна медицина, лікування безпліддя різної етіології, лікування за допомогою елементів пуповинної крові. Це дозволить підвищити пов'язаних з заморожуванням, зберіганням та розморожуванням клітинного матеріалу.
Відповідно об'єктом корисної моделі, що пропонується, є середовище для кріоконсервування соматичних клітин, що містить ДМСО, поживні речовини, поліеєтиленгліколь, сахарозу та карбоксиметилцелюлозу, в якому відповідно до корисної моделі, як поживні речовини використовують ОМЕМ, і яке додатково містить фетальну сироватку теляти (ФСТ) та сахарозу, при наступному кінцевому співвідношенні компонентів, мас. Фо: дМсо 2-10
ОМЕМ 30-50 поліетиленгілколь 5-15
Сахароза 5-15
Ффст 10-30 карбоксиметилцелюлоза 5-15 фізіологічний розчин до 100.
Як переважний варіант втілення корисної моделі використовують поліетиленгліколь з молекулярною масою 1500 г/моль.
Корисна модель пояснюється за допомогою графічних матеріалів, де:
На Фіг. 1 показана загальна схема кріоконсервування;
На Фіг. 2 показана стандартна пробірка для заморожування клітин фірми Мипс (Німеччина), пристосована для запису кріогенних температур. В центрі пробірки на центруючих розпірках знаходиться термопара;
На Фіг. З показана кінетика зниження температури зразка залежно від складу вітрифікаційного середовища;
На Фіг. 4 показана виживаність клітин МОСЕ-7 після тристадійного заморожування з використанням різних вітрифікаційних середовищ. Стандартний протокол триступеневого заморожування соматичних клітин з використанням розробленого середовища для кріоконсервування клітин реалізується наступним чином: 1. Попередньо відбирають від культури клітин З мл культурального середовища в
Зо центрифугальну пробірку, залишають при кімнатній температурі. Потім акуратно знімають клітини з субстрату за допомогою 0,25 95 розчину трипсин-Версену (близько 1 мл на 25 см? площі поверхні). Температура проведення процедури «37 "С. Час процедури - 15-20 хв. Після цього клітинну суспензію по краплях додають до З мл культурального середовища.
Температура процедури 22-25 "С. Після підрахунку кількості живих клітин, клітинну суспензію центрифугують при 200-400 д протягом 5 хвилин та видаляють супернатант, залишаючи клітинний осад в пробірці (для 4 ампул - 2 мл). 2. На першій стадії охолодження, клітинний осад ресуспендують в повному поживному середовищі (ї25"С), переносять в охолоджені ампули для заморожування по 0,5 мл.
Температура процедури 15 "С, вміст сироватки - 10 95. Ампули з клітинами витримують в холодильнику при 4 "С протягом 20 хвилин. 3. На другій стадії в кожну ампулу додають 0,5 мл холодного Вітрифікаційного Середовища
Мо 1 (ВС Мо 1: 60 95 0о/о фетальної сироватки теляти (ФСТ) і 40 95 0/о поживного середовища,
ОМЕМ). Температура процедури близько 4 "С, вміст сироватки 50 95. Потім ампули переносять в контейнері до морозильної камери з -2 "С, на 20-30 хв. 3. На третій стадії в ампули додають по 0,5 мл крижаного (-4"С) ВС Мо 4 (ВС Мо 2: 15 95
ДМСО; 50 95 фетальної сироватки теляти (ФСТ); 30 96 поживного середовища, ОМЕМ; 200 мІМоль сахарози). 4. Потім ампули відразу переносять в охолодженому боксі в морозилку з -120 С на 2 години, після чого занурюють в рідкий азот для зберігання. Стандартний протокол тристадійного заморожування клітин зі швидкістю більше 150 "С/хвилину та з використанням розробленого середовища для кріоконсервування:
Перша-друга стадії - повільне охолодження в діапазоні температур від 36 "С до -3"7С відповідає пунктам 1-3 Стандартного протоколу. Третя стадія - надшвидке заморожування/вітри фікація в діапазоні температур від -3 "С до -220 "С - пункт 4 протоколу. Для реалізації 4 пункту протоколу треба підготувати для використання вітрифікаційний прилад. 1. Підготовка вітрифікаційного приладу до використання. 1.1. Колбу вітрифікаційного приладу заливають рідким азотом, закривають кришку та вмикають прилад. 1.2. Прилад повинен працювати до зниження температури азоту до -220 "С (15-20 хв.) та утворення льоду (шуга). 1.3. Прилад вимикають, скидають тиск у колбі приладу. 2. На другій стадії в ампули додають по 0,5 мл крижаного (-4 "С) ВС Мо 4 (15 95 ДМСО, 50 95 фетальної сироватки теляти (ФСТ), 30 96 поживного середовища, ОМЕМ, 200 мМ сахарози та 10 956 КМЦ). Для порівняння використовували інші склади вітрифікаційних середовищ, згідно з
Таблицею 1 та Фіг. 1.
З. Після початку танення льоду у переохолоджений азот (-220 "С) занурюють ампули з клітинами. 4. Ампули інкубуються 20-30 хв. у переохолодженому азоті (-220 "С) після чого переносяться в рідкий азот для зберігання (-196 "С).
Таблиця 1
Склад вітрифікаційних середовищ: до 10 95 маси/об'єм
Розморожування клітин проводиться стандартно для всіх протоколів заморожування.
Спосіб відмиванням від кріоконсерванту/розморожування.
Ампули з рідкого азоту по одній розморожували у воді при температурі 36 "С 3-5 хв. (до останньої крижинки). Переписували дані з ампули та занурювали ампули в 70 95 спирт на 1-2 секунду. Потім вміст ампули, близько 1,6 мл, по 400 мкл переносили в стерильні центрифугальні пробірки з 7 мл холодного поживного середовища без сироватки (на 1 ампулу приготувати 4 пробірки з середовищем кімнатної температури). Клітини відмивали від кріопротекторів шляхом центрифугування при 1009 5 хв. Надосадкову рідину відбирали, залишивши 0,5 мл клітинного осаду. Клітинний осад ресуспендували в теплому повному поживному середовищі і переносили у культуральний посуд. Інкубували добу при стандартних умовах. Через добу середовище замінювали на свіже.
Зо Виживаність клітин визначали за допомогою МТТ-тесту після З діб культивування.
Температуру охолодження клітинної суспензії визначали за допомогою термодатчика на основі термопари (Фіг. 2, Табл. 2). В Табл. 2 та на Фіг. З продемонстровано, яким чином склад середовища впливає на швидкість охолодження суміші у переохолодженому азоті.
Таблиця 2
Швидкість зниження температури зареєстрованої термодатчиком ззовні контейнера (скраплений азот) та в середині кріоконтейнера
Термопара в: Ми л маса в межах від в межах від нм кріопротектора, 0 до -402С -40 до -1702С дальтон орідкомуазотії 77777171 ЛЯ18 | 19500ЙШЮОЬч
Увіалізфізрозчином. | (:И/-7777/7171717с7с-111111111111420 | 2280
Увіалізсахарозою | 100 17777 53423 177150. | 600 г г7-С
Згідно з отриманими даними (Табл. 2, Фіг. 3) можна зробити висновок, що присутність високомолекулярних сполук у вітрифікаційних середовищах призводить до стажування кривої зниження температури, порівняно з 68 мМ розчином сахарози (кінцева концентрація).
Одночасно, чим вища молекулярна маса поліетиленгликолів, тим повільніше відбувається зниження температури у віалі.
На Фіїг. 4 та в Табл. 4 видно, що з ряду порівняних, найбілош ефективним непроникаючим кріопротектором є ПЕГ з молекулярною масою 1500. Оскільки його додавання до стандартного (контрольного) складу середовища для кріоконсервування збільшувало відсоток живих клітин в 1,3 рази, а комбінація з КМЦ - у 2,1 разу. Присутність сахарози забезпечує по-перше осмотичну дегідратацію клітин та зниження утворення внутрішньоклітинного льоду, а, по-друге, швидке відновлення клітин після відтанення та, як результат, збільшення відсотку живих клітин.
Присутність ПЕГ 1500 та КМЦ призводить до осмотичного збільшення концентрації всіх компонентів внутрішньоклітинного середовища, призупинення біохімічних процесів в клітині, конденсації хроматину та модифікації структурних якостей мембран клітин.
Таблиця З
Виживаність клітин МСЕ-7 при різних складах вітрифікаційних середовищ оре вивести етлюттю контроль с Бонн МКГ вед ТЕТ ЕТО
ДМСО | сахароза| 1,57 47 Ісахароза| 1,57 157 20Т 40Т
Оптична
КстИннОї 0,405 | 04в. | 0605 0,495| О,бж |) 097 | 0,34ж | 0,895 | ОА | 0,585 с. 0,01 0,01 0,06 | 0,021 0,05 | 0,004 | 0,029 | 40,06 | 20,015 | 40,012 суспензії,
ОП540 нм
Відсоток живих клину 8795 100 | 131,9 |308,0| 130,6 | 212 | 752 |195,2) 96,2. 126,5 порівняно з контролем
Перевагами запропонованого середовища та способу кріоконсервування є його невисока собівартість та простота виконання, порівняно з підвищенням виживаності клітин. Також даний спосіб не потребує використання дороговартісних приладів програмованого охолодження та може бути використаний у лабораторіях без додаткових витрат на обладнання та реактиви.
Одночасно використані у методі реактиви, а саме сахароза, ПЕГ та КМЦ, є визнаними харчовими додатками, які у зазначених концентраціях не є шкідливими, а навпаки мають доказаний позитивний вплив на клітини людини.
Claims (2)
1. Середовище для кріоконсервування соматичних клітин, що містить ДМСО, поживні речовини, поліетиленгліколь, сахарозу та дистильовану воду, яке відрізняється тим, що як поживні речовини використовують ОМЕМ, і яке додатково містить фетальну сироватку теляти (ФСТ) та Зо карбоксиметилцелюлозу, при наступному кінцевому співвідношенні компонентів, мас. 9о: дМсо 2-10 ОМЕМ 30-50 поліетиленгілколь 5-15 сахароза 5-15 Ффст 10-30 карбоксиметилцелюлоза 5-15 фізіологічний розчин до 100.
2. Середовище для кріоконсервування соматичних клітин за п. 1, яке відрізняється тим, що як непроникаючий кріопротектор використовують поліетиленгліколь з молекулярною масою 1500 г/моль.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAU201612433U UA117694U (uk) | 2016-12-06 | 2016-12-06 | Середовище для кріоконсервування соматичних клітин |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAU201612433U UA117694U (uk) | 2016-12-06 | 2016-12-06 | Середовище для кріоконсервування соматичних клітин |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA117694U true UA117694U (uk) | 2017-07-10 |
Family
ID=59266199
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAU201612433U UA117694U (uk) | 2016-12-06 | 2016-12-06 | Середовище для кріоконсервування соматичних клітин |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| UA (1) | UA117694U (uk) |
-
2016
- 2016-12-06 UA UAU201612433U patent/UA117694U/uk unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Arav | Cryopreservation of oocytes and embryos | |
| JP5925826B2 (ja) | 細胞の凍結保存のための装置及び方法 | |
| CN104145943A (zh) | 一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液及其制备与应用 | |
| US20060019233A1 (en) | Delivery of high cell mass in a syringe and related methods of cryopreserving cells | |
| Ozkavukcu et al. | Cryopreservation: basic knowledge and biophysical effects | |
| CA2808101C (en) | Method of liquid nitrogen surface vitrification | |
| CA2719806A1 (en) | Method, system, and apparatus for hypothermic collection, storage, transport and banking of birth tissue | |
| WO2016040063A1 (en) | Cryopreservation instrument and method of using same | |
| JP6329468B2 (ja) | 線維芽細胞のガラス化凍結保存方法 | |
| US9005886B2 (en) | Method for cryopreservation of human spermatozoa free from seminal plasma using a fast and simple aseptic vitrification-devitrification process; portable kit for carrying out the method; and use of the same for treatment of disorders related to reproductive failures | |
| Arav et al. | Automation in oocyte and ovarian tissue vitrification | |
| UA117694U (uk) | Середовище для кріоконсервування соматичних клітин | |
| Quinn | Suppression of ice in aqueous solutions and its application to vitrification in assisted reproductive technology | |
| CN115152740A (zh) | 一种猪组织长期保存液及其使用方法 | |
| Dupesh et al. | Human Sperm Freezing: Mini Update | |
| RU2707252C1 (ru) | Способ заморозки ооцитов крупного рогатого скота | |
| Zacà et al. | Chapter 8 Human oocytes slow-rate freezing: methodology | |
| US20220408718A1 (en) | Aqueous solution for cell preservation | |
| Natarajamani | Cryopreservation of Human Semen | |
| Castellon et al. | Vitrification Solutions: Historical Development | |
| WO2022246746A1 (zh) | 玻璃化冷冻液套装及其制备方法和应用 | |
| Carnevale | COOLING AND CRYOPRESERVATION 17 OF EQUINE EMBRYOS | |
| JP2019110799A (ja) | 動物細胞のガラス化凍結保存方法 | |
| Liebermann et al. | Cryopreservation of Post-compaction Embryos for IVF |