TWI844607B

TWI844607B - 遺傳性徐脈性心律不整治療藥

Info

Publication number: TWI844607B
Application number: TW108148121A
Authority: TW
Inventors: 朝野仁裕; 髙島成二; 山田憲明; 山下徹
Original assignee: 國立大學法人大阪大學; 日商日產化學股份有限公司
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2024-06-11
Also published as: JPWO2020138428A1; WO2020138428A1; EP3903882A4; US20230248694A1; TW202034916A; EP3903882A1; US20220071951A1; JP7468869B2; CN113543849A

Abstract

本發明課題在於提供一種遺傳性徐脈性心律不整治療藥。解決手段為一種徐脈性心律不整之治療藥，其係包含下述化合物(I)或者化合物(II)或彼等之藥理學上可容許之鹽作為有效成分；

Description

遺傳性徐脈性心律不整治療藥

本發明係有關於一種遺傳性徐脈性心律不整治療藥。

心律不整係指心跳率或心臟的跳動節律呈不規則的狀態，會呈現各種心電圖異常。心跳率的異常所引起的心律不整可分類為過速性心律不整及徐脈性心律不整。人穩靜時的心跳率通常為50～100拍/分左右，低於此值時係稱徐脈、多於此值時則稱為過速。徐脈性心律不整可舉出心房腔失調症候群(SSS: Sick sinus syndrome)、房室傳導阻滯(A-V block)、房室解離(A-V dissociation)、房室結性節律(Junctional rhythm)等。

心房腔失調症候群係指主要因竇結節的機能降低而導致脈搏變慢，由此呈現腦、心臟、腎臟等的功能不全之疾病。在心電圖上，可分類為1)竇性心率過緩(心跳率50拍/分以下)、2)竇停止或竇房性阻滯、3)徐脈過速症候群此3種。臨床上會慢性顯現阿-斯綜合症(Adam-Stokes)發作、心衰竭、易疲勞性等症狀。作為治療方法，為了使竇結節的自發性興奮次數增強，會使用抗膽鹼藥(硫酸阿托品)、β刺激劑等口服藥或靜脈注射劑，若藉由此等之投予仍未改善徐脈時，或一旦中止藥劑投予而導致症狀惡化時，則會使用心律調整器。

作為心臟之電刺激起源的竇結節係心肌的一部分特殊化而獲得自律性的組織，係由特異性蛋白質表現。其中，對竇結節之機能最重要的是稱為通道(channel)的細胞膜蛋白群。通道係經由細胞膜，使離子穿透而有助於細胞內外之電位梯度的形成，不僅與竇結節有關，亦與所有心肌細胞之電訊號的傳遞，及後續所發生之心臟的收縮之最重要的心臟機能有關。

向來已知通道基因的異常會引起心律不整，近年來隨著基因解析技術的進展，作為與心律不整有關之引發基因，已鑑定出數種通道基因。

近年來，本案發明人等針對先天性呈現徐脈的家族，對與徐脈有關之基因進行解析的結果，在對竇結節之機能屬重要的通道當中，鑑定出屬G蛋白質控制鉀通道之一的KCNJ3之新穎基因突變。針對具有脈搏異常遲緩之表現型的患者，在得到對患者之告知後同意及醫療機構之倫理委員會的認可後，進行患者及其家族之基因解析的結果確認，家族中有無徐脈表現型會與有無KCNJ3之該基因突變連動。此突變係對應屬KCNJ3的基因產物之KCNJ3蛋白質的N末端至第83號胺基酸由天門冬胺酸(N)轉變為組胺酸(H)者(以下有稱為「KCNJ3 N83H」)。由於KCNJ3 N83H的表現型會呈現徐脈，由此暗示與KCNJ3基因之KCNJ3 N83H有關的突變為顯性遺傳(例如參照專利文獻1)。

屬KCNJ3的基因產物之KCNJ3蛋白質係與KCNJ5共同以異四聚物(heterotetramer)形式構成心臟乙醯膽鹼活性化鉀通道(KACh通道或Kir3.1/3.4通道)。若由迷走神經終端釋放出乙醯膽鹼，則會經由屬蕈鹼作動性乙醯膽鹼受體之M2受體的活化使KACh通道開口，鉀離子朝細胞外流出而使心跳率減少。在根據使用非洲爪蟾的卵母細胞之雙電極電位箝制法的實驗中，確認在乙醯膽鹼(ACh)添加前及添加後，突變型(KCNJ3 N83H)KACh通道與野生型(KCNJ3 WT)KACh通道相比皆更容易流通5～10倍的電流，且突變型其通道活性較大。此KCNJ3的突變所引起的疾病係重新定義為遺傳性徐脈性心律不整之一。該疾病亦可稱為KACh離子通道病變或Kir3.1/3.4離子通道病變。該疾病係因徐脈而導致維持生物體機能所需之心輸出量降低，而使身體活動性、生活品質降低的罕見心律不整。而且，該疾病會隨著惡化而有低心輸出量性心衰竭、意識消失、猝死等嚴重的風險。

諸如前述，KACh離子通道病變係KCNJ3的突變所引起的遺傳性徐脈性心律不整，可望藉由KCNJ3之調節劑(促效劑或拮抗劑)來改善症狀。然而，及至目前為止尚無人報導具有以KACh通道為標的之徐脈性心律不整的治療效果之具體化合物。而且，何種調節劑對治療有效仍舊不明。亦不易預測人類野生型KCNJ3之調節劑對「KCNJ3 N83H」亦是否有效。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本特開2010-136660號

[發明所欲解決之課題]

本發明係以提供新穎徐脈性心律不整治療藥為課題。 [解決課題之手段]

(3R,4S)-7-羥甲基-2,2,9-三甲基-4-(苯乙基胺基)-3,4-二氫-2H-吡喃基[2,3-g]喹啉-3-醇(以下記載為化合物(I))係具有心房顫動之治療效果的化合物(參照國際公開第2005/090357號等)。本案發明人等發現化合物(I)具有由屬人類野生型KCNJ3的基因產物之人類野生型KCNJ3蛋白質與屬人類野生型KCNJ5的基因產物之人類野生型KCNJ5蛋白質所構成的人類野生型KACh通道(以下有稱為「KCNJ3 WT KACh通道」)之抑制作用。又，(3R,4S)-6-胺基-3,4-二氫-2,2-二甲基-7-硝基-4-(2-苯乙基胺基)-2H-1-苯并哌喃-3-醇(以下記載為化合物(II)，化合物(I)與(II)一併記載為本發明化合物)係具有心房選擇性不反應期延長作用，且經報導對心律不整具有效性的化合物(參照國際公開第01/21610號等)。本案發明人等發現化合物(II)亦具有「KCNJ3 WT KACh通道」之抑制作用。諸如上述，本發明化合物已知有KCNJ3 WT KACh通道的抑制作用所產生之抗心房顫動作用。然而，過速性疾病當中尤其是高過速之心房顫動與徐脈性疾病之遺傳性徐脈性心律不整可謂幾乎完全相反的症狀。又，本發明化合物是否顯示由KCNJ3 N83H蛋白質與人類野生型KCNJ5蛋白質所構成的突變KACh通道(以下有稱為「KCNJ3 N83H KACh通道」)抑制作用仍舊不明。從而，不易預測本發明化合物是否可作為遺傳性徐脈性心律不整之治療藥。然而，本案發明人等致力研究的結果，意外發現本發明化合物對於「KCNJ3 N83H KACh通道」比起「KCNJ3 WT KACh通道」顯示更強的抑制作用。

此外，本案發明人等研究的結果闡明，KACh離子通道病變除了竇性心率過緩外，還會呈現竇停止、竇房性阻滯、房室傳導阻滯等各種的症狀。就以往的心律不整治療，尚未已知有對此等各種所有症狀以一劑即有效的現有藥物。然而，本案發明人等致力研究的結果，意外發現本發明化合物在斑馬魚模型中對源自「KCNJ3 N83H KACh通道」之竇性心率過緩、竇停止、竇房性阻滯、房室傳導阻滯的所有症狀顯示高抑制效果，闡明本發明化合物可作為KACh通道基因的突變所引起之遺傳性徐脈性心律不整(KACh離子通道病變)的最初藥劑。

再者，本案發明人等研究的結果，在野生型斑馬魚模型中，本發明化合物也會使心跳率增加。亦即，可確認本發明化合物對與KACh通道突變無關的徐脈亦屬有效。此外，經確認本發明化合物對根據KCNJ5蛋白質的突變之心律不整，尤其是根據由KCNJ5蛋白質的N末端至第101號胺基酸之色胺酸(W)突變為半胱胺酸(C)的徐脈性心律不整亦屬有效。從而，本發明係如下所述。

(1) 一種徐脈性心律不整之治療藥，其係包含下述化合物(I)或者化合物(II)或彼等之藥理學上可容許之鹽作為有效成分； (式中，Ph表示苯基)。 (2) 如(1)之治療藥，其中前述徐脈性心律不整為遺傳性徐脈性心律不整。 (3) 如(1)之治療藥，其中前述徐脈性心律不整為竇性心率過緩、竇停止、竇房性阻滯或房室傳導阻滯的任一種。 (4) 如(1)之治療藥，其中前述徐脈性心律不整為竇性心率過緩、竇停止、竇房性阻滯或房室傳導阻滯的任一種，且為遺傳性徐脈性心律不整。 (5) 如(1)至(4)中任一項之治療藥，其係包含下述化合物(I)或彼等之藥理學上可容許之鹽作為有效成分； (式中，Ph表示苯基)。 (6) 如(1)至(4)中任一項之治療藥，其係包含下述化合物(II)或彼等之藥理學上可容許之鹽作為有效成分； (式中，Ph表示苯基)。 (7) 如(1)至(6)中任一項之治療藥，其中前述徐脈性心律不整係根據由KCNJ3蛋白質的N末端至第83號胺基酸之天門冬胺酸(N)突變為組胺酸(H)的心律不整。 (8) 如(1)至(6)中任一項之治療藥，其中前述徐脈性心律不整係根據由KCNJ5蛋白質的N末端至第101號胺基酸之色胺酸(W)突變為半胱胺酸(C)的心律不整。 [發明之效果]

本發明係提供一種徐脈性心律不整之治療藥。

[實施發明之形態]

遺傳性徐脈性心律不整係指在先天性呈現徐脈的家族中所發現到的遺傳性且徐脈性的心律不整。本案發明人等已確認該家族之遺傳性徐脈性心律不整會與有無KCNJ3的基因突變連動。更具體而言，已確認此突變係屬由KCNJ3的基因產物之KCNJ3蛋白質的N末端至第83號胺基酸之天門冬胺酸(N)突變為組胺酸(H)者。KACh離子通道病變或Kir3.1/3.4離子通道病變可理解為屬遺傳性且徐脈性心律不整的一種新的症狀。從而，本發明中的遺傳性徐脈性心律不整可理解為以下所記載之疾病： (1)根據KCNJ3的突變之徐脈性心律不整。 (2)根據KCNJ3蛋白質的N末端至第83號胺基酸的突變之徐脈性心律不整。 (3)根據由KCNJ3蛋白質的N末端至第83號胺基酸之天門冬胺酸(N)突變為組胺酸(H)的徐脈性心律不整。 (4)如(1)至(3)中任一項之疾病，其中徐脈性心律不整為竇性心率過緩、竇停止、竇房性阻滯或房室傳導阻滯。

於本發明中，竇性心率過緩係指心律不整之症狀當中，跳動節律雖正常且呈規則性但心跳率變慢的症狀。竇性心率過緩一般而言可理解為心跳率減少至每分鐘50次以下的症狀。竇性心率過緩可理解為心房腔失調症候群當中根據Rubenstein分類的I群症狀。

於本發明中，竇停止係指無法由竇結節產生電訊號而無法引起心房興奮的症狀。

於本發明中，竇房性阻滯係指因竇結節與心房之間的興奮傳導障礙而無法引起心房興奮的症狀。

於本發明中，房室傳導阻滯係指因心房與心室之間的興奮傳導障礙而無法引起心室興奮的症狀。房室傳導阻滯係包含以下病型分類： (1)第I度房室傳導阻滯心房-心室間的傳導時間延長者。(仍維持興奮的傳導) (2)第II度房室傳導阻滯：心房-心室的傳導突然中止者。包含以下2類型。 (2-1)Wenckebach型：心房-心室間的傳導緩緩延長後喪失心室興奮者。 (2-2)MobitzII型：心房-心室間的傳導未延長即突然喪失心室興奮者。 (2-3)高度房室傳導阻滯：極少看出房室傳導。 (3)第III度房室傳導阻滯：心房-心室間的傳導完全中止者。

KCNJ3係指人類的基因之一，屬KCNJ3的基因產物之KCNJ3蛋白質係與KCNJ5蛋白質共同以異四聚物形式構成心臟乙醯膽鹼活性化鉀通道(KACh通道或Kir3.1/3.4通道)。此外，KCNJ3蛋白質亦稱Kir3.1或GIRK1；KCNJ5蛋白質亦稱Kir3.4或GIRK4。

於本發明中，所稱KCNJ3 N83H，係如前述，意指屬KCNJ3之基因產物的KCNJ3蛋白質的N末端至第83號胺基酸由天門冬胺酸(N)轉變為組胺酸(H)者。

本發明之治療藥的對象患者，只要本治療劑對其有效則不予限定。更詳細指定，本發明之治療藥的對象患者係以下任一種態樣。 (1)可能有遺傳性徐脈性心律不整之患者 (2)經診斷為遺傳性徐脈性心律不整之患者 (3)KCNJ3基因具有突變之患者。 (4)於KCNJ3蛋白質的N末端至第83號胺基酸具有突變之患者。 (5)KCNJ3蛋白質的N末端至第83號胺基酸由天門冬胺酸(N)轉變為組胺酸(H)之患者。 (6)KCNJ5基因具有突變之患者 (7)遺傳性且徐脈性心律不整患者。 (8)徐脈性心律不整之患者。 (9)心律不整之患者。

本發明之治療藥的對象疾病，只要本治療劑對其有效則不予限定。本發明之治療藥的對象症狀可包含以下者。 (1)心律不整、(2)徐脈性心律不整、(3)竇性心率過緩、(4)竇停止、(5)竇房性阻滯、(6)房室傳導阻滯、(7)竇房結機能異常、(8)徐脈性心衰竭。

諸如前述，針對具有脈搏異常遲緩之表現型的患者，進行患者及其家族之基因解析的結果確認，家族中有無徐脈表現型會與有無KCNJ3之該基因突變連動。

本案發明人等針對KCNJ3及KCNJ5，亦鑑定N83H以外的罕見突變。此等突變亦有可能與心律不整的症狀有關。 N83H以外的突變係指(1)KCNJ3 F85L、(2)KCNJ3 N496H、(3)KCNJ5 D262G、(4)KCNJ5 V303I、(5)KCNJ5 G387R。

此外，除前述專利文獻1(日本特開2010-136660號)外，本發明之優先日中亦報導GIRK通道的突變，尤為KCNJ5的突變所引起之遺傳性徐脈性心律不整的實例(參照Circ Genom Precis Med. 2019;12:e002238 2019年1月15日公開)。諸如前述，此KCNJ5的突變所引起之心律不整亦為本發明之治療對象。作為其他態樣，N83H以外的突變係指(6)KCNJ5 W101C。本說明書所示之本發明化合物，對於根據前述(1)至(6)的突變之心律不整皆有可能具有治療效果。此外，本發明化合物對前述(1)至(6)之突變所產生的效果可與對KCNJ3 N83H突變之效果為相乘性或相加性，或為其他效果。從而，本發明之治療藥的對象疾病，除前述根據KCNJ3的N83H突變之徐脈性心律不整(於此重述時記載為(A))以外亦可舉出以下者。 (A1)根據由KCNJ3蛋白質的N末端至第85號胺基酸之(F)突變為(L)的心律不整。 (A2)根據由KCNJ3蛋白質的N末端至第496號胺基酸之(N)突變為(H)的心律不整。 (B)根據KCNJ5的突變之心律不整。 (B1)根據由KCNJ5蛋白質的N末端至第262號胺基酸之(D)突變為(G)的心律不整。 (B2)根據由KCNJ5蛋白質的N末端至第303號胺基酸之(Y)突變為(I)的心律不整。 (B3)根據由KCNJ5蛋白質的N末端至第387號胺基酸之(G)突變為(R)的心律不整。此5項當中，更重要的疾病為(A2)及(B1)，該心律不整係特別假設為心房顫動。

就其他態樣，本發明之治療藥的對象疾病，除前述根據KCNJ3的N83H突變之徐脈性心律不整以外尚可舉出以下者。 (B4)根據由KCNJ5蛋白質的N末端至第101號胺基酸之色胺酸(W)突變為半胱胺酸(C)的心律不整。疾病(B4)亦極重要，該心律不整係假設為徐脈性心律不整。從而，前述本發明之治療藥的對象患者的詳細態樣亦包含以下者。 (10)KCNJ5蛋白質的N末端至第101號胺基酸由色胺酸(W)轉變為半胱胺酸(C)之患者。此外，保險起見，如下補足前述記載中的胺基酸之單字母符號。F：苯丙胺酸、L：白胺酸、N：天冬醯胺、H：組胺酸、D：天門冬胺酸、G：甘胺酸、V：纈胺酸、I：異白胺酸、R：精胺酸、W：色胺酸、C：半胱胺酸。

本發明之治療藥所含之化合物(I)係如前述，意指(3R,4S)-7-羥甲基-2,2,9-三甲基-4-(苯乙基胺基)-3,4-二氫-2H-吡喃基[2,3-g]喹啉-3-醇。作為一態樣，化合物(I)亦可為包含(3R,4S)體之消旋混合物或非鏡像異構物混合物。作為其他態樣，本發明之治療藥所含之化合物亦可為化合物(I)的類似物。該類似物的實例可舉出國際公開第2005/090357號所記載之化合物。

本發明之治療藥所含之化合物(II)係如前述，意指(3R,4S)-6-胺基-3,4-二氫-2,2-二甲基-7-硝基-4-(2-苯乙基胺基)-2H-1-苯并哌喃-3-醇。作為一態樣，化合物(II)亦可為包含(3R,4S)體之消旋混合物或非鏡像異構物混合物。作為其他態樣，本發明之治療藥所含之化合物亦可為化合物(II)的類似物。該類似物的實例可舉出國際公開第01/21610號所記載之化合物。

本發明之治療藥所含之化合物(I)及(II)可為藥理學上可容許之鹽的形態。藥理學上可容許之鹽的實例可舉出鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、甲磺酸鹽、乙酸鹽、苯甲酸鹽、酒石酸鹽、磷酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、蘋果酸鹽、葡萄糖酸鹽及水楊酸鹽等。化合物(I)之較佳之鹽為鹽酸鹽、馬來酸鹽及甲磺酸鹽。化合物(II)之較佳之鹽為鹽酸鹽。

本發明之治療藥所含之化合物亦可為結晶。就結晶而言，只要不妨礙本發明目的則可為任何結晶形。化合物(I)之較佳結晶形的實例可舉出國際公開第2010/126138號所記載之結晶形。作為一態樣，該結晶係在X光源使用Cu・Kα時的粉末X光繞射圖形中，於繞射角2θ=5.6、8.2、12.0、14.7、16.6、16.9、17.9、18.4、22.5、24.5、27.6(±0.2˚)具有特徵峰的結晶。作為其他態樣，該結晶係具有前述11根譜峰當中任意的3根、5根、7根或9根譜峰之結晶。根據粉末X光繞射之結晶形的鑑定係基於本業者之技術常識，例如日本藥典之記載來進行。使用Cu・Kα射線以外的X射線時，係根據基於布拉格方程式之2θ值的換算來比較繞射角圖形。2θ值的測定誤差通常為±0.2˚之範圍，但即使存在少數具有0.2˚以上之誤差的譜峰，也不會妨礙本業者之合理的鑑定。

本發明之治療藥所含之化合物(I)可藉由周知方法來製造。該周知方法係指例如國際公開第2005/090357號、國際公開第2010/126138號。又，在製造化合物(I)時，能以國際公開第2007/105658號、國際公開第2014/050613號、國際公開第2014/051077號、國際公開第2015/012271號等為參考。

本發明之治療藥所含之化合物(II)可藉由國際公開第01/21610號等周知方法來製造。

本發明係提供一種包含對前述治療屬有效的量之本發明化合物的醫藥組成物或獸醫藥組成物。本發明之化合物的投予形態可舉出注射劑(皮下、靜脈內、肌肉內、腹腔內注射)、軟膏劑、栓劑、氣霧劑等之非口服投予或錠劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、糖漿、液劑、乳劑、懸浮液劑等之口服投予。含有本發明之化合物的上述醫藥或獸醫藥組成物，相對於總組成物的重量，係含有約0.01～99.5%，較佳為約0.1～30%的本發明之化合物。

可使本發明之化合物或除了含有該化合物之組成物，亦含有其他醫藥或獸醫藥上呈活性的化合物。又，此等組成物可包含多種本發明之化合物。

本發明化合物的臨床投予量係隨年齡、體重、患者的感受性、症狀的程度等而異；一般有效的投予量係成人每日0.003～1.5g，較佳為0.01～0.6g左右。惟，亦可視需求使用上述範圍外的量。

本發明化合物可藉由製藥的慣用手段製劑化成供投予用。亦即，口服投予用之錠劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑可使用賦形劑，例如白糖、乳糖、葡萄糖、澱粉、甘露糖醇；黏合劑，例如羥丙基纖維素、糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨醇、黃耆膠、甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮；崩解劑，例如澱粉、羧甲基纖維素或其鈣鹽、細晶纖維素、聚乙二醇；滑劑，例如滑石、硬脂酸鎂或鈣、二氧化矽；潤滑劑，例如月桂酸鈉、甘油等來調製。注射劑、液劑、乳劑、懸浮劑、糖漿劑及氣霧劑可使用活性成分之溶劑，例如水、乙醇、異丙醇、丙二醇、1,3-丁二醇、聚乙二醇；界面活性劑，例如山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、氫化蓖麻油之聚氧乙烯醚、卵磷脂；懸浮劑，例如羧甲基鈉鹽、甲基纖維素等纖維素衍生物、黃耆膠、阿拉伯膠等天然橡膠類；保存劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯化苄烷銨、山梨酸鹽等來調製。屬經皮吸收型製劑的軟膏可使用例如白色凡士林、流動石蠟、高級醇、聚乙二醇軟膏、親水軟膏、水性凝膠基劑等。栓劑可使用例如可可脂、聚乙二醇、羊毛脂、脂肪酸三酸甘油酯、椰子油、聚山梨醇酯等來調製。 [實施例]

以下示出實施例更詳細地說明本發明，惟本發明非限定於此等實施例。此外，以下補足實施例中所使用之用語。 PCR：聚合酶連鎖反應 cRNA：互補RNA Addgene：非營利性質體庫的名稱 DMSO：二甲基亞碸 ND96溶液：以下水溶液 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂ , 1 mM MgCl₂ , 5 mM HEPES, pH 7.4 Ba²⁺ ：氯化鋇水溶液(或其他二價鋇鹽水溶液) mCherry：紅色螢光蛋白質(參照實驗醫學增刊 Vol.35 No.5等) GFP：綠色螢光蛋白質(參照日本藥理學雜誌 Vol.138 (2011) No.1 P13-17等) germline transmission：生殖細胞系傳遞

(實施例1) 為了針對化合物(II)對KCNJ3 N83H KACh通道的抑制作用進行解析，而藉由對非洲爪蟾的卵母細胞注入KCNJ3 N83H或野生型KCNJ3(KCNJ3 WT)的cRNA及野生型KCNJ5的cRNA而使其表現KACh通道，插入電極並藉由雙電極電位箝制法來確認通道活性。透過與G蛋白質的β及γ亞單位共同表現，可直接測定經由處於活化狀態之KACh通道的總細胞電流量。人類KCNJ3 WT的編碼序列係將人類KCNJ3 cDNA殖株(Invitrogen公司)以PCR擴增，次選殖成pCS2+載體(Addgene製)。提供KCNJ3 N83H的c.247A＞C突變係藉由採PCR的部位特異性突變導入法導入。人類KCNJ5編碼序列係同樣地將人類KCNJ5 cDNA殖株(Invitrogen公司)以PCR擴增，次選殖成pCS2+載體。KCNJ3 WT、KCNJ3 N83H及KCNJ5的cRNA係由線性化之cDNA，使用mMESSAGE mMACHINE套組(Life Technologies公司)進行in vitro轉錄來合成。將KCNJ3 N83H或KCNJ3 WT的cRNA及野生型KCNJ5的cRNA與G蛋白質之β及γ亞單位的cRNA共同注入於非洲爪蟾的卵母細胞中，在ND96溶液中以18℃進行孵化48-96小時。玻璃吸量管電極，在填充有3M的氯化鉀水溶液時，係具有0.3～1.0MΩ的電阻。細胞外液係將包含40mM的氯化鉀、50mM的氯化鈉、3mM的氯化鎂M、0.15mM的尼氟酸及5mM的HEPES的試驗浴溶液以氫氧化鉀調整為pH7.4。經由表現之KACh通道的總細胞電流量係使用GeneClamp 500放大器(Molecular Devices公司)，藉由雙電極電位箝制法來測定。化合物(II)係溶解於DMSO，以最終濃度成為0.001, 0.01, 0.03, 0.1, 1, 10 μM的方式調製成灌流液。在電流量略呈恆定的狀態下由低濃度添加包含化合物(II)的灌流液，其後同樣地依序取代為高濃度灌流液並同時記錄電流量。於記錄結束時添加Ba²⁺ (3mM)並測定內生性漏電流。脈波協定係表示圖中的凡例。測定數據係使用Clampfit 10.2(Molecular Devices公司)來解析。IC50值係使用GraphPad Prism version 5.00(GraphPad Software公司)來算出。化合物(II)對於KCNJ3 N83H KACh通道亦可看出濃度相依性的抑制效果，其IC50值係低於針對KCNJ3 WT KACh通道者(N83H突變型; 50±12 nM (n=14), 野生型; 230±60 nM (n=13), p ＜ 0.01)，化合物(II)對突變型KACh通道顯示出更高的親和性(圖1、2)。

(實施例2) 為了針對生物體內之化合物(II)對KCNJ3 N83H KACh通道的抑制作用進行解析，而藉由對斑馬魚(Danio rerio)的受精卵導入編碼KCNJ3 N83H之基因，來製作導入KCNJ3突變作為疾病模型動物的基因轉殖斑馬魚。作為比較例，KCNJ3 WT表現用斑馬魚亦同樣地製作。

藉由使用轉位子Tol2之轉位子轉移系統來製作基因轉殖斑馬魚。由於心臟KACh通道係表現於竇房結、房室結、心房肌，而於斑馬魚中在使目標基因心房特異性地表現之amhc(atrial myosin heavy chain)啟動子的控制下製作以2A胜肽連結人類KCNJ3 WT或N83H與人類KCNJ5，以及mCherry此3種基因的基因構造(圖3)，其中mCherry係為了在螢光顯微鏡下可判別人類KCNJ3 WT或N83H與人類KCNJ5之基因導入者。其次，將Tol2所編碼之轉移酶的mRNA與此構造同時微量注入於受精卵。藉由使以此形成的成魚與野生型斑馬魚交配，而以藉由在螢光顯微鏡下於心房mCherry產出陽性幼魚而能夠確認生殖細胞系統傳遞的魚作為F0創立者(founder)。藉由使此F0創立者與在心室・心房此兩者表現GFP的野生型斑馬魚hspGFF3A(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2008;105:1255-1260.)交配，而使用在心室表現GFP及在心房表現GFP與mCherry之出生後第2日的F1基因轉殖斑馬魚幼魚(圖4)，來進行心跳率及心臟之跳動節律的解析。具體而言，係在直徑35mm的玻璃底培養皿上以0.5%的低熔點瓊脂膠體固定斑馬魚幼魚，在0.03% sea salt水溶液中以螢光顯微鏡觀察幼魚的心臟。對以螢光顯微鏡隨附攝影機取得之心跳動的動態圖像，使用原始的M模式解析軟體(The Journal of clinical investigation. 2007;117:2812-2824.)進行心跳率與跳動節律之詳細的解析。心跳率係測定存在竇結節之靜脈竇部的跳動。心房之mCherry的表現程度，由於KCNJ3 WT斑馬魚與KCNJ3 N83H突變斑馬魚之間未看出差異，故研判為KACh通道基因的表現量係兩者同等。就KCNJ3 N83H突變斑馬魚，可看出顯著的心房擴大與人類症例同樣之徐脈性心律不整的表現型(竇停止、竇性心率過緩、竇房性阻滯、房室傳導阻滯)(圖5)。其次，將0.03% sea salt水溶液取代為含100 nM化合物(II)的0.03% sea salt水溶液，同樣地解析1小時後的心跳。出乎意料地，100 nM的化合物(II)對KCNJ3 N83H突變斑馬魚顯示出心跳率的增加與徐脈性心律不整的改善效果(圖5、6)。此外，圖5中橫軸的線狀比例尺為2秒。由以上所述，化合物(II)在生物體內亦具有對KCNJ3 N83H KACh通道的抑制作用，暗示其可作為KACh通道基因的突變所引起的遺傳性徐脈性心律不整治療藥。再者，化合物(II)對於KCNJ3 WT斑馬魚也不會引起過度的拍頻，由於可引起適度的心跳率增加，從而暗示其對於與KACh通道基因的突變無關的徐脈亦可能顯示有效性(圖6)。

(實施例3) 對於化合物(I)，亦在與實施例1及2同樣的手法，亦即採非洲爪蟾卵母細胞之雙電極電位箝制法及使用基因轉殖斑馬魚模型的實驗中確認對KCNJ3 N83H KACh通道的抑制效果與突變斑馬魚之心跳率增加與徐脈性心律不整的改善效果(圖7、8)。化合物(I)不僅對於KCNJ3 WT KACh通道，對於KCNJ3 N83H KACh通道亦可看出抑制效果，惟其作用比起對於WT，對於N83H較強(圖7)。再者，化合物(I)在使用基因轉殖斑馬魚模型的實驗中，可改善根據N83H突變的竇停止及房室傳導阻滯(圖8)。

(實施例4) 以與實施例1同樣的方式，針對化合物(I)對KCNJ5 WT/W101C KACh通道(W101C異型接合突變型KACh通道)的抑制作用進行解析。為了對非洲爪蟾的卵母細胞模擬根據體染色體顯性遺傳形式的異型接合，而透過與野生型KCNJ3(KCNJ3 WT)的cRNA共同注入等莫耳量之野生型KCNJ5(KCNJ5 WT)及KCNJ5 W101C的cRNA，而使W101C異型接合突變型KACh通道表現，插入電極並藉由雙電極電位箝制法來確認通道活性。將前述人類KCNJ5 cDNA殖株(Invitrogen公司)以PCR擴增，次選殖成pCS2+載體(Addgene製)後作為模板，藉由採PCR的部位特異性突變導入法導入提供KCNJ5 W101C的c.303G＞C突變。KCNJ5 WT、KCNJ5 W101C及KCNJ3的cRNA係由線性化之cDNA，使用mMESSAGE mMACHINE套組(Life Technologies公司)進行in vitro轉錄來合成。將等莫耳量之KCNJ5 WT與KCNJ5 W101C的cRNA及野生型KCNJ3的cRNA注入於非洲爪蟾的卵母細胞中，在ND96溶液中以18℃進行孵化48-96小時。玻璃吸量管電極，在填充有3M的氯化鉀水溶液時，係具有0.3～1.0MΩ的電阻。細胞外液係將包含40mM的氯化鉀、50mM的氯化鈉、3mM的氯化鎂M、0.15mM的尼氟酸及5mM的HEPES的試驗浴溶液以氫氧化鉀調整為pH7.4。經由表現之KACh通道的總細胞電流量係使用GeneClamp 500 放大器 (Molecular Devices公司)，藉由雙電極電位箝制法來測定。化合物(I)係溶解於DMSO，以最終濃度成為0.01, 0.1, 1 μM的方式調製成灌流液。在電流量略呈恆定的狀態下由低濃度添加包含化合物(I)的灌流液，其後同樣地依序取代為高濃度灌流液並同時記錄電流量。於記錄結束時添加Ba²⁺ (3mM)並測定內生性漏電流。脈波協定係表示圖中的凡例。化合物(I)對於KCNJ5 WT/W101C KACh通道(W101C異型接合突變型KACh通道)亦顯示濃度相依性的抑制效果(圖10、11)。

(比較例1) 托肽品Q(Tertiapin-Q)係具有KCNJ3 WT KACh通道之抑制作用的胜肽 (Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels. Jin W, Lu Z. Biochemistry. 1999 Oct 26;38(43):14286-93.)。使用此作為KCNJ3 WT KACh通道之抑制的Tertiapin-Q來探討對KCNJ3 N83H KACh通道的抑制效果。以與實施例2同樣的手法，針對Tertiapin-Q進行使用基因轉殖斑馬魚模型的實驗。Tertiapin-Q無法改善根據N83H突變的竇停止(圖9)。根據本比較實驗確認，本發明之治療效果係本發明化合物所特有的效果，且為顯著的效果。 [產業上可利用性]

根據本發明，本發明化合物(I)及(II)可作為徐脈性心律不整之治療藥使用。

[圖1]為化合物(II)之使用雙電極電位箝制法檢測非洲爪蟾的卵母細胞所表現之KCNJ3 WT KACh通道(Kir3.1-WT)及KCNJ3 N83H KACh通道(Kir3.1-N83H)之電流振幅的變化時的曲線圖。 [圖2]為使用雙電極電位箝制法檢測化合物(II)的濃度的對數對非洲爪蟾的卵母細胞所表現之KCNJ3 WT KACh通道(WT)及KCNJ3 N83H KACh通道(N83H)之電流振幅的變化率(%)(膜電位係以+20mV的點處的電流量評定)時的曲線圖。 [圖3]為用來製作基因轉殖斑馬魚之包含以2A胜肽連結人類KCNJ3 WT、人類KCNJ5及mCherry此3種基因之基因的基因構造(Kir3.1-WT)以及包含以2A胜肽連結人類KCNJ3 N83H、人類KCNJ5及mCherry此3種基因之基因的基因構造(Kir3.1-N83H)。 [圖4]為以螢光顯微鏡觀察在心室表現GFP及在心房表現GFP與mCherry之出生後第2日的KCNJ3 WT斑馬魚及KCNJ3 N83H突變斑馬魚之幼魚的心臟之GFP及mCherry的表現程度時的照片。 [圖5]為基於使化合物(II)作用於KCNJ3 WT斑馬魚及KCNJ3 N83H突變斑馬魚時、及作用前之各斑馬魚之靜脈竇、心房及心室跳動的動態圖像，使用解析軟體進行心跳率與跳動節律之詳細解析的圖。 [圖6]為KCNJ3 WT斑馬魚及KCNJ3 N83H突變斑馬魚之比較使化合物(II)作用時及作用前的心跳率的曲線圖。 [圖7]為使用雙電極電位箝制法來測定使化合物(I)以0.01μM、0.1μM及1μM此3種用量作用於非洲爪蟾的卵母細胞所表現之KCNJ3 WT KACh通道(野生型KACh通道)及KCNJ3 N83H KACh通道(N83H突變型通道)時之各膜電位的電流量時的曲線圖。 [圖8]為基於使化合物(I)的100nM作用於引起竇停止及房室傳導阻滯之KCNJ3 N83H突變斑馬魚前及作用後1小時之靜脈竇、心房及心室跳動的動態圖像，使用解析軟體進行心跳率與跳動節律之詳細解析的圖。 [圖9]為基於使Tertiapin-Q的100nM作用於引起竇停止之KCNJ3 N83H突變斑馬魚前及作用後1小時之靜脈竇、心房及心室跳動的動態圖像，使用解析軟體進行心跳率與跳動節律之詳細解析的圖。 [圖10]為使用雙電極電位箝制法測定使化合物(I)以0.01μM、0.1μM及1μM此3種用量作用於非洲爪蟾的卵母細胞所表現之KCNJ5 WT/W101C KACh通道(W101C異型接合突變型KACh通道)時之各膜電位的電流量時的曲線圖。 [圖11]為顯示使化合物(I)以0.01μM、0.1μM及1μM此3種用量作用於非洲爪蟾的卵母細胞所表現之KCNJ5 WT/W101C KACh通道(W101C異型接合突變型KACh通道)時在-70mV與+30mV此2種膜電位下使各濃度作用時之電流量的抑制率的圖。

Claims

一種下述化合物(I)或者化合物(II)或彼等之藥理學上可容許之鹽的用途，其係用以製備治療徐脈性心律不整之藥物，

(式中，Ph表示苯基)。
如請求項1之用途，其中前述徐脈性心律不整為遺傳性徐脈性心律不整。
如請求項1之用途，其中前述徐脈性心律不整為竇性心率過緩、竇停止、竇房性阻滯或房室傳導阻滯的任一種。
如請求項1之用途，其中前述徐脈性心律不整為竇性心率過緩、竇停止、竇房性阻滯或房室傳導阻滯的任一種，且為遺傳性徐脈性心律不整。
如請求項1至4中任一項之用途，其係使用下述化合物(I)或彼等之藥理學上可容許之鹽作為有效成分；
(式中，Ph表示苯基)。
如請求項1至4中任一項之用途，其係使用下述化合物(II)或彼等之藥理學上可容許之鹽作為有效成分；
(式中，Ph表示苯基)。
如請求項1至4中任一項之用途，其中前述徐脈性心律不整係根據由KCNJ3蛋白質的N末端至第83號胺基酸之天門冬胺酸(N)突變為組胺酸(H)的心律不整。
如請求項1至4中任一項之用途，其中前述徐脈性心律不整係根據由KCNJ5蛋白質的N末端至第101號胺基酸之色胺酸(W)突變為半胱胺酸(C)的心律不整。