TWI839729B

TWI839729B - 與Fc受體結合改變的Fc突變體

Info

Publication number: TWI839729B
Application number: TW111117182A
Authority: TW
Inventors: 付鳳根; 周帥祥; 吳志海
Original assignee: 大陸商信達生物製藥（蘇州）有限公司
Priority date: 2021-05-07
Filing date: 2022-05-06
Publication date: 2024-04-21

Abstract

本發明關於經過修飾的具有降低的與FcγR或C1q結合的免疫球蛋白恆定區(Fc)突變分子，該分子可以在機體內顯著降低不期望的ADCC和/或ADCP和/或CDC效應子功能。此外，本發明還關於上述Fc突變分子的用途、包含該突變分子的融合蛋白以及其用途。

Description

與Fc受體結合改變的Fc突變體

本發明總體上關於免疫學和抗體工程領域，具體而言，本發明關於IgG免疫球蛋白的變體，其製備方法及其應用。

隨著近年來治療性抗體的開發，研究人員一方面不斷探索尋找新的靶標，一方面對成藥性抗體進行不斷的升級改造，以努力提高或增強其有益效果，其中研究的焦點之一集中在對抗體Fc區的改造。

眾所周知，雖然抗體的Fc區無抗原結合活性，但是卻是抗體與細胞表面Fc受體相互作用的部位，因此對抗體的效應子功能發揮至關重要的作用，Fc區藉由與不同的Fc受體的相互作用，使得抗體可以發揮多種效應子功能，例如抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(ADCC)、抗體依賴的細胞吞噬作用(ADCP)、補體依賴性細胞毒性(CDC)。關於ADCC、ADCP、CDC效應子功能，對於識別表達在腫瘤細胞或病原體上的抗原並以清除惡性細胞為目標的抗體而言，有效甚至強化的ADCC、ADCP、CDC效應子功能有利於抗體的治療效果，然而對於針對例如表達在T細胞上的抗原以阻斷細胞表面受體/細胞因子或者免疫調節為目標的抗體而言，則往往需要降低的甚至消除的ADCC、ADCP、 CDC效應子功能，因為靶向細胞表面抗原的抗體可對免疫細胞誘發不必要的免疫刺激以及相關的效應子功能及補體活化，從而產生不利後果，這一點特別是對於需要目標細胞低損耗的免疫檢查點抑制劑抗體，尤其重要。

人IgG亞類(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)具有不同的免疫功能，例如不同亞類的IgG抗體具有不同的ADCC活性，相比較於其他亞類，IgG1和IgG3具有較強的ADCC活性；IgG1、IgG2、IgG3和IgG4具有抗體依賴細胞吞噬作用(ADCP)。由於治療性抗體和Fc融合構建體往往需要靶向和活化或中和靶配體功能區，但又不能破壞或損害所需的局部細胞或組織，因此在實際生產應用中，一直存在渴望降低或者消除Fc效應子功能(例如降低或者消除ADCC和/或ADCP活性、降低或者消除CDC活性)的Fc突變體的實際需求，本申請滿足了這種需求。

據已有文獻報導，Fc區的部分胺基酸突變可能產生降低或者消除ADCC和/或ADCP活性、降低或者消除CDC活性的效果，例如，XENCOR的專利家族US8734791B2、US10183999B2、US8883147B2，Roche的專利家族CN103476795B等，多數能夠達到降低ADCC、CDC活性的效果，然而，能夠達到完全消除ADCC和CDC效應的突變較為少見，本申請藉由對野生型Fc胺基酸序列進行定向改造，獲得了能夠完全消除ADCC和CDC效應的Fc突變分子。

[發明概述]

本發明提供了經過修飾的免疫球蛋白恆定區(Fc區)的突變分子，其可用於工程化改造抗體或抗體類治療劑。

藉由在Fc區包含本申請公開的突變和/或其組合，使得與包含野生型Fc區的分子相比，包含本申請突變Fc區的抗體、抗體類治療劑以及包含突變Fc區的其他分子與FcγR或C1q的結合作用極大降低，從而在機體內顯著降低不期望的ADCC和/或ADCP和/或CDC效應子功能。進一步地，本申請公開的Fc突變並沒有影響包含本申請突變Fc區的抗體、抗體類治療劑以及包含突變Fc區的其他分子與FcRn的結合能力，因而並不影響相應分子的半衰期。因此，本申請提供了攜帶特定突變的Fc區多肽分子、具有降低或者消除的ADCC和/或ADCP和/或CDC效應子功能，但仍保留了結合FcRn的能力的包含上文所述突變Fc區的抗體分子或類似結構分子。

第一方面，本申請提供了具有不同修飾的Fc突變體，與野生型Fc區相比，該Fc突變體顯示降低的與Fc受體和/或C1q的親和力，進而降低或者消除該Fc突變體誘導的ADCC、CDC和ADCP效應子功能。在一個實施方案中，Fc突變體誘導的ADCC、CDC和ADCP效應子功能降低至相應野生型Fc所誘導的ADCC、CDC和ADCP效應子功能的至少80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、2%、1%或完全消除。

在一個實施方案中，本申請提供的Fc突變體包含一個或者多個胺基酸缺失。在一個具體實施方案中，本申請提供的Fc突變體包含依據Kabat中的EU索引編號的第329位胺基酸的缺失(△329)。在一個具體實施方案中，本申請提供的Fc突變體與相應野生型Fc的區別在於依據Kabat中的EU索引編號的第329位的缺失(△329)。在另一個具體實施方案中，本申請提供的Fc突變體包含依據Kabat中的EU索引編號的第329位和第330位胺基酸的缺失(△329和△330)。在一個具體實施方案中，本申請提供的Fc突變體與相應野生型Fc 的區別在於依據Kabat中的EU索引編號的第329位和第330位胺基酸的缺失(△329和△330)。

在一個實施方案中，本申請提供的Fc突變體包含一個或者多個胺基酸取代。在一個具體實施方案中，本申請提供的Fc突變體包含依據Kabat中的EU索引編號的第234位和/或第235位胺基酸的取代，其中採用A、V、L、I分別取代第234位的L、V、F和/或第235位的L。在一個較佳的實施方案中，該Fc突變體包含L234A+L235A、V234A或F234A+L235A。在一個具體實施方案中，本申請提供的Fc突變體與相應野生型Fc的區別在於L234A+L235A、V234A或F234A+L235A。

在一個實施方案中，本申請提供的Fc突變體包含一個或者多個胺基酸缺失和一個或多個胺基酸取代。在一個具體實施方案中，本申請提供的Fc突變體包含依據Kabat中的EU索引編號的第329位胺基酸的缺失和第330位的取代，其中採用G、D或者Q對第330位進行取代。在一個較佳的實施方案中，該Fc突變體包含△329+A330G或△329+S330G。在一個具體實施方案中，本申請提供的Fc突變體與相應野生型Fc的區別在於△329+A330G或△329+S330G。

在一個具體實施方案中，本申請提供的Fc突變體包含依據Kabat中的EU索引編號的第329位胺基酸的缺失和第234位和第235位胺基酸的取代，其中採用A、V、L、I分別取代第234位的L、V、F和/或第235位的L。在一個較佳的實施方案中，該Fc突變體包含L234A+L235A+△329、V234A+△329或F234A+L235A+△329。在一個具體實施方案中，本申請提供的Fc突變體與相應野生型Fc的區別在於L234A+L235A+△329、V234A+△329或F234A+L235A+△329。

在另一個具體實施方案中，本申請提供的Fc突變體包含依據Kabat中的EU索引編號的第329位和第330位胺基酸的缺失以及第234位和第235位胺基酸的取代，其中採用A、V、L、I分別取代第234位的L、V、F和/或第235位的L。在一個較佳的實施方案中，該Fc突變體包含L234A+L235A+△329+△330、V234A+△329+△330或F234A+L235A+△329+△330。在一個具體實施方案中，本申請提供的Fc突變體與相應野生型Fc的區別在於L234A+L235A+△329+△330、V234A+△329+△330或F234A+L235A+△329+△330。

在另一個具體實施方案中，本申請提供的Fc突變體包含依據Kabat中的EU索引編號的第329位胺基酸的缺失和第234位、235位、330位胺基酸的取代，其中採用A、V、L、I分別取代第234位的L、V、F和/或第235位的L，採用G、D或者Q對第330位進行取代。在一個較佳的實施方案中，該Fc突變體包含L234A+L235A+A330G+△329、L234A+L235A+S330G+△329、V234A+L235A+A330G+△329、V234A+L235A+S330G+△329、F234A+L235A+S330G+△329或F234A+L235A+A330G+△329。在一個具體實施方案中，本申請提供的Fc突變體與相應野生型Fc的區別在於L234A+L235A+A330G+△329、L234A+L235A+S330G+△329、V234A+L235A+A330G+△329、V234A+L235A+S330G+△329、F234A+L235A+S330G+△329或F234A+L235A+A330G+△329。

在一些實施方案中，本發明提供的Fc突變體為IgG1型Fc突變體，與相應的野生型Fc區相比，該突變體具有降低甚至消除的結合FcγR的能力。在另一些實施方案中，本發明提供的Fc突變體為IgG2、IgG3、IgG4型Fc 突變體，與相應的野生型Fc區相比，該突變體具有降低甚至消除的結合FcγR的能力。較佳地，本發明提供的Fc突變體保留了與FcRn的結合能力。

本申請公開的Fc突變體可以作為一個平臺構件，應用於任何需要降低甚至消除ADCC/ADCP/CDC效應子功能的場景中，例如應用於任何類型的期望降低甚至消除ADCC/ADCP/CDC效應子功能的抗體分子中，具有類似抗體結構的分子中。

在一個實施方案中，該Fc突變體基本上基於IgG序列，在一個較佳的實施方案中，該Fc突變體基本上基於人IgG序列，在另一個實施方案中，該Fc突變體基本上基於人IgG1序列。

在另一個實施方案中，該Fc突變體還可以包含其他修飾，例如現有技術中已知的用於降低免疫原性、提高穩定性、溶解性、功能和臨床益處的其他修飾。

在一個具體的實施方案中，Fc突變體包含如下序列：

1)SEQ ID NO：2中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

2)SEQ ID NO：3中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

3)SEQ ID NO：4中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

4)SEQ ID NO：5中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

5)SEQ ID NO：6中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

6)SEQ ID NO：7中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

7)SEQ ID NO：8中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

8)SEQ ID NO：11中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

9)SEQ ID NO：12中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

10)SEQ ID NO：13中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

11)SEQ ID NO：14中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

12)SEQ ID NO：15中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

13)SEQ ID NO：16中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

14)SEQ ID NO：17中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

15)SEQ ID NO：19中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

16)SEQ ID NO：20中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

17)SEQ ID NO：21中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

18)SEQ ID NO：22中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

19)SEQ ID NO：23中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

20)SEQ ID NO：24中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

21)SEQ ID NO：25中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

22)SEQ ID NO：27中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

23)SEQ ID NO：28中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

24)SEQ ID NO：29中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

25)SEQ ID NO：30中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

26)SEQ ID NO：31中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

27)SEQ ID NO：32中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或

28)SEQ ID NO：33中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成。

第二個方面，本發明提供了包含第一方面所述Fc突變體的多肽，與包含野生型Fc區的多肽相比，該多肽具有降低或消除的ADCC和/或ADCP和/或CDC效應子功能，較佳地，該多肽不引起ADCC和/或ADCP和/或CDC效應。在一個具體實施方案中，該多肽同時具有延長的半衰期。在一個實施方案中，包含第一方面所述Fc突變體的多肽誘導的ADCC、CDC和ADCP效應子功能降低至包含相應野生型Fc的多肽所誘導的ADCC、CDC和ADCP效應子功能的至少80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、2%、1%或完全消除。

在一些實施方案中，該多肽是抗體分子，較佳地，該抗體分子是IgG類抗體分子。在另一個實施方案中，該抗體分子是多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、人源化抗體、嵌合抗體、抗體融合體。與相應的野生型抗體分子相比，本申請獲得的包含該Fc突變體的抗體分子與FcγR的能力得到降低甚至消除，因此具有降低或消除的ADCC和/或ADCP和/或CDC效應子功能。

在一些實施方案中，該多肽是融合蛋白，其包含與Fc突變體有效連接的一個或者多個融合配偶體，該融合配偶體通常可以為任何蛋白質或小分子，例如任何抗體的可變區、受體的靶結合區、黏附分子、配體、酶、細胞因子、趨化因子、或一些其他的蛋白或蛋白結構域。在一個實施方案中，該融合蛋白例如是免疫黏附素。

在一個實施方案中，本申請提供包含Fc突變體的IgG抗體，其包含依據Kabat中的EU索引編號的第329位胺基酸的缺失(△329)。在另一個具體實施方案中，本申請提供包含Fc突變體的IgG抗體，其包含依據Kabat中的EU索引編號的第329位和第330位胺基酸的缺失(△329和△330)。

在一個實施方案中，本申請提供包含Fc突變體的IgG抗體，其包含依據Kabat中的EU索引編號的第234位和/或第235位胺基酸的取代，其中採用A、V、L、I分別取代第234位的L、V、F和/或第235位的L。在一個較佳的實施方案中，該IgG抗體包含L234A+L235A、V234A或F234A+L235A。

在一個實施方案中，本申請提供包含Fc突變體的IgG抗體，其包含依據Kabat中的EU索引編號的第329位胺基酸的缺失和第330位的取代，其中採用G、D或者Q對第330位進行取代。在一個較佳的實施方案中，該IgG抗體包含△329+A330G或△329+S330G。

在一個實施方案中，本申請提供包含Fc突變體的IgG抗體，其包含依據Kabat中的EU索引編號的第329位胺基酸的缺失和第234位和第235位胺基酸的取代，其中採用A、V、L、I分別取代第234位的L、V、F和/或第235位的L。在一個較佳的實施方案中，該IgG抗體包含L234A+L235A+△329、V234A+△329或F234A+L235A+△329。

在一個實施方案中，本申請提供包含Fc突變體的IgG抗體，其包含依據Kabat中的EU索引編號的第329位和第330位胺基酸的缺失以及第234位和第235位胺基酸的取代，其中採用A、V、L、I分別取代第234位的L、V、F和/或第235位的L。在一個較佳的實施方案中，該IgG抗體包含L234A+L235A+△329+△330、V234A+△329+△330或F234A+L235A+△329+△330。

在一個實施方案中，本申請提供包含Fc突變體的IgG抗體，其包含依據Kabat中的EU索引編號的第329位胺基酸的缺失和第234位、235位、330位胺基酸的取代，其中採用A、V、L、I分別取代第234位的L、V、F和/或第235位的L，採用G、D或者Q對第330位進行取代。在一個較佳的實施方案中，該IgG抗體包含L234A+L235A+A330G+△329、L234A+L235A+S330G+△329、V234A+L235A+A330G+△329、V234A+L235A+S330G+△329、F234A+L235A+S330G+△329或F234A+L235A+A330G+△329。

在一些實施方案中，本發明提供的IgG抗體為IgG1型抗體，與相應的野生型抗體相比，該抗體具有降低甚至消除的結合FcγR的能力。在另一些實施方案中，本發明提供的IgG抗體為IgG2、IgG3、IgG4型抗體，與相應的野生型抗體相比，該抗體具有降低甚至消除的結合FcγR的能力。較佳地，本發明提供的抗體保留了與FcRn的結合能力。

在一些實施方案中，該抗體分子是抗claudin18.2的IgG抗體。

在一個具體的實施方案中，本發明提供的包含Fc突變體的IgG抗體包含如下的重鏈和輕鏈：

1)包含SEQ ID NO：2所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或

2)包含SEQ ID NO：3所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或

3)包含SEQ ID NO：4所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或

4)包含SEQ ID NO：5所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或

5)包含SEQ ID NO：6所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或

6)包含SEQ ID NO：7所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或

7)包含SEQ ID NO：8所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或

8)包含SEQ ID NO：11所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或

9)包含SEQ ID NO：12所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或

10)包含SEQ ID NO：13所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或

11)包含SEQ ID NO：14所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或

12)包含SEQ ID NO：15所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或

13)包含SEQ ID NO：16所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或

14)包含SEQ ID NO：17所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或

15)包含SEQ ID NO：19所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或

16)包含SEQ ID NO：20所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或

17)包含SEQ ID NO：21所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或

18)包含SEQ ID NO：22所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或

19)包含SEQ ID NO：23所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或

20)包含SEQ ID NO：24所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或

21)包含SEQ ID NO：25所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或

22)包含SEQ ID NO：27所示的重鏈和SEQ ID NO：34所示的輕鏈；或

23)包含SEQ ID NO：28所示的重鏈和SEQ ID NO：34所示的輕鏈；或

24)包含SEQ ID NO：29所示的重鏈和SEQ ID NO：34所示的輕鏈；或

25)包含SEQ ID NO：30所示的重鏈和SEQ ID NO：34所示的輕鏈；或

26)包含SEQ ID NO：31所示的重鏈和SEQ ID NO：34所示的輕鏈；或

27)包含SEQ ID NO：32所示的重鏈和SEQ ID NO：34所示的輕鏈；或

28)包含SEQ ID NO：33所示的重鏈和SEQ ID NO：34所示的輕鏈。

在另一個實施方案中，本申請提供的包含該Fc突變體的多肽(例如抗體)在Fc區還可以包含其他修飾，例如現有技術中已知的用於降低多肽(例如抗體)免疫原性、增加半衰期、提高穩定性、溶解性、功能和臨床益處的其他修飾。

在另一個實施方案中，本申請提供的包含該Fc突變體的抗體具有現有技術已知的針對不同靶抗原的重鏈可變區和輕鏈可變區。所屬技術領域具有通常知識者可以容易地將現有技術中已知的重鏈可變區和輕鏈可變區接枝到本申請公開的Fc突變體上，從而獲得具有期望特性(例如降低或消除的ADCC和/或ADCP和/或CDC效應子功能)的抗體變體。

第三方面，本發明提供了一種醫藥組成物，其包含第二方面所述的多肽及可藥用載體。在一個實施方案中，該醫藥組成物包含攜帶本發明所述Fc突變體的抗體分子。在一個實施方案中，該醫藥組成物包含攜帶本發明所述Fc突變體的IgG抗體。在另一個實施方案中，該醫藥組成物包含攜帶本發明所述Fc突變體的IgG1型抗體、IgG2型抗體、IgG3型抗體或IgG4型抗體。

第四方面，本發明提供了根據本申請所述Fc區修飾減少或者消除抗體的ADCC/ADCP/CDC效應子功能，且保留甚至提高半衰期的方法。在一個實施方案中，藉由對需要減少或者消除ADCC/ADCP/CDC效應子功能的抗體Fc區進行如本申請所公開的一種或者多種修飾，從而減少或者消除抗體的ADCC/ADCP/CDC效應子功能。

第五方面，本發明提供了Fc突變體在製備藥物中的用途。在一個實施方案中，該藥物用於免疫治療，輔助免疫治療。在一個實施方案中，該藥物具有降低或消除的ADCC/ADCP/CDC效應子功能作用。在一個具體的實施方案中，例如該藥物是包含本申請Fc突變體的融合蛋白，例如是IL-2 Fc融合蛋白。在另一個具體的實施方案中，例如該藥物是包含本申請Fc突變體的靶向免疫細胞表面分子的抗體，其具有降低或消除的ADCC/ADCP/CDC效應子功能作用。在另一個實施方案中，該藥物用於治療受試者中的腫瘤，例如在一個實施方案中，該藥物在不激活ADCC/ADCP/CDC作用且半衰期延長的情況下激活患者的免疫細胞，從而達到抗腫瘤的效果。

第六方面，本發明提供了治療受試者疾病的方法，包括將有效量的包含本申請所述Fc突變體的針對相應疾病的醫藥組成物施用給受試者。在一個實施方案中，該疾病是需要免疫治療或者免疫輔助治療的疾病。對於靶向細胞表面分子的抗體，特別是免疫細胞上的抗體，消除效應子功能是有利的。在一個實施方案中，本發明提供了治療受試者疾病的方法，包括將有效量的包含本申請所述Fc突變體的針對相應免疫細胞上的抗原的抗體施用給受試者。

第七方面，本發明提供了一種試劑盒，其包含本申請公開的Fc突變體、包含該Fc突變體的多肽或者包含該Fc突變體的免疫球蛋白分子。在一個實施方案中，本發明提供了一種檢測試劑盒，藉由將功能分子(如酶、抗原、受體、配體、細胞因子等)與Fc融合後，不僅可以提高融合蛋白的穩定性，還可以應用於流式細胞、免疫組化、體外活性檢測和蛋白質微陣列檢測等非臨床領域。

本申請提供的攜帶具體Fc突變的抗體分子具有降低或者消除的ADCC、ADCP和CDC效應子功能，但仍保留了結合FcRn的能力，因此可以作為改良型抗體突變體，不僅提高了抗體的療效，還確保了抗體的安全性，穩定性和低免疫原性。令人驚奇地發現，將Fc區的第329位脯胺酸殘基缺失將顯著降低Fc區與受體FcγRIII、FcγRII、FcγRI、C1q的結合、由此顯著降低或消除ADCC、ADCP和CDC活性。此外，Fc區的Pro329與例如選自A330缺失、A330G、L234A和L235A中一種或者多種的組合突變導致顯著降低與受體FcγRIII、FcγRII、FcγRI、C1q的結合，並由此顯著降低或消除ADCC、ADCP和CDC活性。

圖1顯示人IgG1 Fc與人CD16A的晶體結構(PDB：3SGJ)。

圖2顯示了本發明的Fc突變體與各種FcγR結合的情況，圖2a：Fc突變體與CD16A(F176)的結合曲線(pH 7.4)；圖2b：Fc突變體與CD16A(V176)的結合曲線(pH 7.4)；圖2c：Fc突變體與CD16B(NA1)的結合曲線(pH 7.4)；圖2d：Fc突變體與CD16B(NA2)的結合曲線(pH 7.4)；圖2e：Fc突變體與CD32A(H167)的結合曲線(pH 7.4)；圖2f：Fc突變體與CD32A(R167)的結合曲線(pH 7.4)；圖2g：Fc突變體與CD32B的結合曲線(pH 7.4)；圖2h：Fc突變體與CD64的結合曲線(pH 7.4)；圖2i：Fc突變體與FcRn在pH6.0的結合曲線；圖2J：Fc突變體與FcRn在pH 7.0的結合曲線；圖2k.Fc突變體與C1q的結合與解離曲線。

圖3顯示了基於生物膜薄層干涉技術測定的Fc突變體與各種FcγR結合的情況，其中溶液中包含200nM的抗體。圖3a：Fc突變體與CD16A(V176)的結合曲線(pH 7.4)；圖3b：Fc突變體與CD16A(F176)的結合曲線(pH 7.4)；圖3c：Fc突變體與CD16B(NA1)的結合曲線(pH 7.4)；圖3d：Fc突變體與CD16B(NA2)的結合曲線(pH 7.4)；圖3e：Fc突變體與CD32A(H167)的結合曲線(pH 7.4)；圖3f：Fc突變體與CD32A(R167)的結合曲線(pH 7.4)；圖3g：Fc突變體與CD32B的結合曲線(pH 7.4)；圖3h：Fc突變體與CD64的結合曲線(pH 7.4)；圖3i：Fc突變體與FcRn在pH6.0的結合曲線。

圖4顯示了抗體的ADCC活性。

[發明詳述]

除非明確指明相反，否則本發明的實施將採用本領域技術內的常規化學、生物化學、有機化學、分子生物學、微生物學、重組DNA技術、遺傳學、免疫學和細胞生物學的方法。這些方法的描述可以參見，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版，2001)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，1989)；Maniatis等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1982)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley和Sons,2008年7月更新)；Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,GreenePub.Associates和Wiley-Interscience；Glover,DNACloning：A Practical Approach,vol.I&II(IRL Press,Oxford,1985)；Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992)；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；Harlow和Lane,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)Current Protocols in Immunology Q.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach和W.Strober,eds.,1991)；Annual Review of Immunology；以及期刊專著如Advances in Immunology。

[定義]

在下文詳細描述本發明前，應理解本發明不限於本文中描述的特定方法學、方案和試劑，因為這些可以變化。還應理解本文中使用的術語僅為了描述具體實施方案，而並不意圖限制本發明的範圍，其僅會由所附ㄍ申請專利範圍限制。除非另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語與本發明所屬技術領域具有通常知識者通常的理解具有相同的含義。

為了解釋本說明書，將使用以下定義，並且只要適當，以單數形式使用的術語也可以包括複數，並且反之亦然。要理解，本文所用的術語僅是為了描述具體的實施方案，並且不意欲是限制性的。

術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值。

術語“和/或”意指當用於連接兩個或多個可選項時，應理解為意指可選項中的任一項或可選項中的任意兩項或更多項。

術語“包含”或“包括”意指包括該要素、整數或步驟，但是不排除任意其它要素、整數或步驟。在本文中，當使用術語“包含”或“包括”時，除非另有指明，否則也涵蓋由該及的要素、整數或步驟組合的情形。例如，當提及“包含”某個具體序列的抗體可變區時，也旨在涵蓋由該具體序列組成的抗體可變區。

術語“抗體”在本文中以最廣意義使用並且涵蓋多種抗體結構物，包括但不限於單株抗體、多株抗體、重組抗體、人源化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、單鏈抗體、完整抗體或其顯示出所需的抗原結合活性的抗體片段。完整抗體通常將包含至少兩條全長重鏈和兩條全長輕鏈，但在某些情況下可包括較少的鏈，例如駱駝中天然存在的抗體可僅包含重鏈。

如本文所用，術語“結合”和“特異性結合”意指抗體的結合作用對抗原是選擇性的，並且可以與不想要的或非特異的相互作用區別開。抗體與特定抗原結合的能力可以藉由酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、表面電漿共振法(SPR) 或生物膜層光學干涉技術(ForteBio)或本領域已知的其它常規結合測定法測定。例如在SPR中，抗體以大約1×10^-7或更低的KD，大約1×10^-8或更低的KD，大約1×10^-9或更低的KD，大約1×10^-10或更低的KD、大約1×10^-11或更低的KD與BCMA或CD3結合，則該抗體是“與BCMA或CD3特異性結合”的抗體。然而，特異性結合人BCMA或CD3的抗體可以與來自其它物種的BCMA或CD3蛋白具有交叉反應性。例如，特異於人BCMA或CD3的抗體，在一些實施方案中，可以與食蟹猴BCMA或CD3發生交叉反應。測定交叉反應性的方法包括實施例中所述的方法以及本領域已知的標準測定法，例如藉由使用生物光干涉，或流式細胞術技術。

術語“Kabat的可變結構域殘基編號方式”、“Kabat編號系統”或“根據Kabat的胺基酸位置編號方式”及其變化形式指根據Kabat等人的用於抗體重鏈可變域或輕鏈可變域編輯的編號系統(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。Kabat編號系統一般適用於抗體的可變域中的殘基(大約是第1-107位的輕鏈殘基和第1-113位的重鏈殘基)。

術語“EU編號系統”、“如Kabat中的EU索引”或“EU索引”一般適用於免疫球蛋白重鏈恆定區中的殘基(例如參見Kabat等人，參見上文)。除非本文中另有說明，否則本文的抗體可變結構域中的殘基編號是根據Kabat編號系統的殘基編號；抗體恆定結構域中的殘基編號根據EU編號系統的殘基編號方式。

抗體“效應子功能”指歸因於抗體Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變體Fc區)且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應子功能的例子包括：補體依賴的細胞毒性作用(CDC)、抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(ADCC)、抗體依賴的細胞吞噬作用(ADCP)、細胞表面受體(例如B細胞受體)下調、B細胞活化等。

術語“效應細胞”指表達一種或者多種FcR並行使效應子功能的細胞，例如表達FcγRIIIA並行使ADCC效應子功能的細胞，在一個實施方案中，介導ADCC功能的細胞例如是NK細胞、外周血單個核細胞、單核細胞、細胞毒T細胞、嗜中性粒細胞。效應細胞可以來源於天然環境，例如血液。

術語“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”或“ADCC”指是細胞介導的免疫反應，其中某些細胞毒性細胞表面上存在的Fc受體識別靶細胞上結合的抗體，使得細胞毒性細胞可以特異性結合攜帶抗原的靶細胞，並激活免疫系統的效應細胞從而裂解靶細胞的作用。經典的ADCC作用由自然殺傷細胞(NK)介導，巨噬細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞(嗜酸性球)也能介導ADCC作用。比如嗜酸性粒細胞(嗜酸性球)能藉由ADCC作用殺死某些特定的寄生蟲。

術語“抗體依賴性細胞吞噬”或“ADCP”指一種細胞反應，其中藉由結合靶細胞的抗體與巨噬細胞表面的FcγRIIIa結合，誘導激活巨噬細胞，從而使靶細胞內化和被吞噬體酸化降解。ADCP也可由FcγRIIa和FcγRI介導，但是占比較小。

補體系統是由一系列蛋白質組成的先天免疫系統的一部分。補體系統的蛋白質稱為“補體”，以縮寫符號C1、C2、C3等表示，其是存在於人或脊椎動物血清、組織液中的一組不耐熱的，經活化後具有酶活性的蛋白質。C1q是依賴補體的細胞毒性(CDC)途徑的第一成分，其能夠結合六個抗體，但與兩個IgG結合就足以活化補體級聯。

術語“依賴補體的細胞毒性”或“CDC”指補體參與的細胞毒性作用，其中結合靶標的抗體的Fc效應子結構域活化一系列補體級聯反應，在靶細胞膜中形成孔洞，從而導致靶細胞死亡。

術語“Fc區”指免疫球蛋白重鏈的C端區域，包括天然序列Fc區和變異Fc區。人IgG重鏈Fc區通常定義為自其Cys226或Pro230位置的胺基酸殘基至竣基末端的區段，Fc區的C末端447位的賴胺酸殘基(依照EU編號系統)可以存在或者缺失。因而，完整抗體組成物可以包括所有K447殘基都被消除的抗體群、無K447殘基被消除的抗體群、或者混合了有K447殘基的抗體和沒有K447殘基的抗體的抗體群。

在某些實施方案中，免疫球蛋白的Fc區包含兩個恆定結構域，即CH2和CH3，在另一些實施方案中，免疫球蛋白的Fc區包含三個恆定結構域，即CH2、CH3和CH4。

IgG與Fcγ受體或C1q的結合依賴於定位在鉸鏈區和CH2結構域中的殘基。CH2結構域的兩個區域對FcγR和補體C1q結合至關重要，並且在IgG2和IgG4中具有唯一的序列。已顯示取代人IgG1和IgG2中233-236位的殘基和取代人IgG4中327、330和331位的殘基可大幅降低ADCC和CDC活性(Armour等人，Eur.J.Immunol.29(8)，1999，2613-2624；Shields等人，J.Biol.Chem.276(9)，2001，6591-6604)。此外，Idusogie等人表明在包括K322在內的不同位置上的丙胺酸取代顯著降低了補體激活(Idusogie EE等人，J.Immunol 164(8)，2000，4178-84)。

“功能性Fc區”與“有功能Fc區”等類似術語可以互換使用，指具有野生型Fc區的效應子功能的Fc區。

“變異Fc區”、“Fc突變體”、“攜帶突變的Fc區”、“突變Fc區”、“Fc區變體”、“Fc變體”、“變體Fc區”和“突變的Fc區”等類似術語可以互換使用，指包含至少一處胺基酸修飾而區別於天然序列Fc區/野生型Fc區的Fc區。

在一些實施方案中，變異Fc區包含與天然序列Fc區的胺基酸序列相差一處或多處胺基酸取代、缺失或添加的胺基酸序列。在一些實施方案中，變異Fc區與野生型IgG的Fc區相比具有至少一處胺基酸缺失。在一些實施方案中，變異Fc區與野生型IgG的Fc區相比具有至少一處胺基酸取代。在一些實施方案中，變異Fc區在野生型抗體的Fc區中具有一個或多個胺基酸取代以及一個或者多個胺基酸缺失。在一些實施方案中，變異Fc區具有至少一處或兩處本文所述Fc區胺基酸缺失。在一些實施方案中，變異Fc區具有至少一處、兩處、三處或更多處本文所述Fc區胺基酸取代。在一些實施方案中，變異Fc區具有至少一處、兩處、三處或更多處本文所述Fc區胺基酸取代和至少一處、兩處本文所述Fc區缺失。在一些實施方案中，變異Fc區與野生型Fc區和/或親本Fc區具有至少約80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同源性。

“Fc受體”或“FcR”指結合抗體Fc區的分子。在一些實施方案中，FcR是天然人FcR。在一些實施方案中，FcR是結合IgG抗體的受體，即FcγR，包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)三種受體，以及這些受體的等位變體和可變剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA和FcγRIIB，FcγRIII受體包括FcγRIIIA和FcγRIIIB。

根據受體功能，可以將FcγR分為激活型受體(FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcγRIIIB，又稱為CD64、CD32A、CD32C、CD16A、CD16B)和抑制型受體(FcγRIIB，又稱為CD32B)。激活型受體在其胞質結構域中包含免疫受體基於酪胺酸的活化基序(Immunoreceptor Tγrosine-based Activation Motif，或ITAM)，該基序起傳遞活化信號，促進細胞激活的作用，抑制型受體在其胞質結構域中包含免疫受體基於酪胺酸的抑制基序(Immunoreceptor Tγrosine-based Inhibitorγ Motif，或ITIM)，該基序起抑制細胞激活的作用。激活性FcγR的效應功能主要有ADCC、ADCP和抗原呈遞；而抑制性FcγR的效應功能主要有抑制、清掃等功能。FcγRIIB是人類和小鼠表達的唯一抑制性FcγR，在直接靶向腫瘤的抗體中，FcγRIIB的表達與抗體療效降低有關。

不同的FcγR具有不同的細胞表達譜，例如FcγRIIIA(CD16A)在巨噬細胞、單核細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)等細胞上均有表達。FcγRIIIA受體是NK細胞上僅表達唯一受體，可以介導ADCC功能。

術語“FcR”還包括新生兒受體(FcRn)，FcRn是一種位於細胞膜表面的IgG抗體受體。FcRn負責將母體IgG轉移給胎兒，並調節免疫球蛋白在體內的穩態。FcRn可以和IgG的Fc部分結合，阻止IgG分子被溶酶體裂解，可以起到增長IgG體內半衰期的作用，參與到IgG的體內轉運、維持和分佈代謝過程中。

IgG1-IgG4亞類結合Fc受體的能力不盡相同，針對不同的FcγR，IgG1和IgG3是通用的配體，它們結合所有的FcγR，具有很強的ADCC作用。IgG2或IgG4，通常又被稱為“惰性”IgG亞類，採用這兩種亞類可以避免免疫激活效應。事實上，許多單抗都選擇以IgG4作為抗體的主幹，以避免ADCC效應。然而IgG2和IgG4並非完全“惰性”，其分別可以結合激活型的FcγRIIa-H131和FcγRI，從而啟動中性粒細胞激活。

此外，實際情況中，存在降低IgG1亞類引起的ADCC效應的需求，現有技術中，廣泛採用IgG1的“LALA”(L234A+L235A)突變，該突變可以將抗體Fc區與FcγR的結合親和力降低100倍。而藉由本申請獲得的Fc突變體，相比較於“LALA”突變，與FcγR的結合親和力更低，因此更強地降低了ADCC的作用。

在關於ADCC/ADCP/CDC的語境中，表述“降低的ADCC和/或ADCP和/或CDC效應子功能”或“降低的ADCC/ADCP/CDC效應子功能”以及類似表述指與相應的野生型分子引起的ADCC和/或ADCP和/或CDC效應子功能的數值相比，本申請所述的Fc突變體、包含Fc突變體的多肽等所引起的ADCC和/或ADCP和/或CDC效應子功能的數值具有足夠高的降低，使得所屬技術領域具有通常知識者將認為該降低在相應的生物學背景內具有統計學顯著性。例如，在某些實施方案中，該兩個數值的降低例如大於約10%、大於約20%、大於約30%、大於約40%、大於約50%、大於約60%、大於約70%、大於約80%、大於約90%、或者大於約100%甚至更高。

“胺基酸取代”指，將預定的胺基酸序列中存在的至少一個胺基酸殘基替代為另外的不同“取代”胺基酸殘基。

術語“保守取代”是指一個胺基酸經相同類別內的另一胺基酸取代，例如一個酸性胺基酸經另一酸性胺基酸取代，一個鹼性胺基酸經另一鹼性胺基酸取代，或一個中性胺基酸經另一中性胺基酸取代。示例性的取代如下表所示：

按照共同的側鏈性質分組：(1)疏水性：Ile、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu； (4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向的殘基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。非保守取代將需要將這些種類之一的成員換為另一種類。

“胺基酸缺失”指從預定的胺基酸序列去除至少一個胺基酸殘基。

術語“宿主細胞”、“宿主細胞系”和“宿主細胞培養物”可交換地使用且是指其中引入外源核酸的細胞，包括這種細胞的後代。宿主細胞包括“轉化體”和“轉化的細胞”，其包括最初原代轉化的細胞和來源於其的後代，而不考慮傳代的數目。後代在核酸內容上可能與親本細胞不完全相同，而是可以包含突變。本文中包括在最初轉化的細胞中篩選或選擇的具有相同功能或生物學活性的突變體後代。

如下進行序列之間序列同一性的計算。

為確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的同一性百分數，將該序列出於最佳比較目的比對(例如，可以為了最佳比對而在第一和第二胺基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以為比較目的而拋棄非同源序列)。在一個較佳實施方案中，為比較目的，所比對的參考序列的長度是至少30%、較佳地至少40%、更佳地至少50%、60%和甚至更佳地至少70%、80%、90%、100%的參考序列長度。隨後比較在對應胺基酸位置或核苷酸位置處的胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位置由第二序列中對應位置處的相同胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則該分子在這個位置處是相同的。

可以利用數學算法實現兩個序列間的序列比較和同一性百分數的計算。在一個較佳實施方案中，使用已經集成至GCG軟體包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48：444-453)算法(在http：//www.gcg.com可獲得)，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣和空位權重 16、14、12、10、8、6或4和長度權重1、2、3、4、5或6，確定兩個胺基酸序列之間的同一性百分數。在又一個較佳的實施方案中，使用GCG軟體包中的GAP程序(在http：//www.gcg.com可獲得)，使用NWSgapdna.CMP矩陣和空位權重40、50、60、70或80和長度權重1、2、3、4、5或6，確定兩個核苷酸序列之間的同一性百分數。特別佳的參數集合(和除非另外說明否則應當使用的一個參數集合)是採用空位罰分12、空位延伸罰分4和移碼空位罰分5的Blossum 62評分矩陣。

還可以使用PAM120加權餘數表、空位長度罰分12，空位罰分4)，利用已經併入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法，((1989)CABIOS,4：11-17)確定兩個胺基酸序列或核苷酸序列之間的同一性百分數。

抗體的靶抗原

本申請所提供的包含Fc突變體的抗體可以靶向任何抗原，包括但不限於屬於下列靶抗原中的蛋白、亞基、結構域、基序、和/或表位，該靶抗原例如是細胞因子、膜結合因子、酶、受體、配體、病原體及其毒素、病毒顆粒、腫瘤相關因子、信號通路成員分子等等。合適的抗原取決於所需的應用。對於抗癌治療，期望具有表達限制在癌細胞內的靶。已證明特別適於抗體治療的一些靶是具有信號傳導功能的那些。其他治療抗體藉由抑制受體與其軛合配體之間的結合阻斷受體的信號傳導來發揮其作用。

已經被批准用於臨床試驗或正在開發的許多抗體可獲益於本發明的Fc突變體。因此，可以將這些抗體的可變區與本申請公開的Fc突變體整合形成具有改進的優良性質的產品。在一個實施方式中，可以將本申請公開的Fc 突變體整合到人源化抗體、親和力成熟的抗體、工程化的抗體中，例如與其重鏈可變區融合。

Fc區的其他修飾

可以利用現有技術中已經公開的多種方法，對本申請提供的Fc突變體、包含Fc突變體的融合蛋白(例如抗體)等進行進一步的修飾，例如以用於降低免疫原性、提高穩定性、溶解性、功能和臨床益處的其他修飾。此類修飾包括但不限於下列修飾，例如可以延長血清半衰期的在位置252，254和256處的修飾。

[實施例]

以下實施例進一步說明本發明，然而，應理解實施例以說明而非限定的方式來描述，並且所屬技術領域具有通常知識者可以進行多種修改。

除非明確指明相反，否則本發明的實施將採用本領域技術內的常規化學、生物化學、有機化學、分子生物學、微生物學、重組DNA技術、遺傳學、免疫學和細胞生物學的方法。

實施例1.Fc突變體設計

鑑於抗體Fc區與Fc受體的相互作用可能產生不利影響，在單株抗體應用中有時需要消除Fc區的效應子功能(例如ADCC、CDC)。例如對於IgG1亞類抗體，其主要藉由Fc區結合FcγRIIIA而實現ADCC功能。針對需要降低ADCC、CDC功能的IgG1亞類抗體，則需要對其Fc區加以改造，以降低其與Fcγ受體的結合。因此，本實施例基於人IgG1 Fc與FcγR的共結晶結構，探討了人IgG1 Fc與FcγR相互作用的關鍵位點，並設計了相應的Fc突變體，以降低其與FcγR的相互作用。

人IgG1 Fc與人CD16A(FcγRIII)的晶體結構(PDB：3SGJ)如圖1所示，其中Fc的兩個區段P232-V240和N325-E333構成了與CD16A表位結合的位點，其中Fc的胺基酸P329與CD16A的胺基酸W90和W113之間形成的π鍵相互作用，是它們相互結合界面上的關鍵胺基酸。基於該關鍵區段和胺基酸，發明人基於分子間作用界面設計了如表1所示的Fc突變體。

在本實施例中，以信達製藥內部篩選獲得的針對人claudin18.2蛋白的一個IgG1單株抗體(Fcmut-01)作為示例，進行相關設計和研究。即，基於作為親本和對照的Fcmut-01，獲得了表1所示的一系列具有Fc不同突變的突變體(Fcmut-02~Fcmut-024)。Fcmut-25是Herceptin(Genentech),Fcmut-26~Fcmut32是對Herceptin的Fc進行的不同改造。

表1.Fc突變體設計

實施例2：攜帶Fc突變的抗體的表達和純化

質粒構建：根據常規實驗方法，獲得上述重鏈Fc突變和輕鏈的核苷酸序列，並分別選殖到pcDNA3.1載體中獲得各個質粒。

蛋白質表達及純化

瞬時轉染質粒準備：取1/10(以轉染體積計算)的減血清培養基Opti-MEM^TM(Gibco，貨號31985-070)，加入質粒混合物(50ug/50mL，其中重鏈和輕鏈質量比1：1)，將含有質粒的Opti-MEM^TM培養基過濾至新的50ml離心管中，並向該離心管中加入已過濾的PEI(1g/L,Polγsciences)(質量比(質粒：PEI)=1：3)，混勻靜置20min。

細胞轉染：將上述獲得的DNA/PEI混合物輕柔倒入Expi293細胞(Gibco)並混勻，在37℃，8% CO₂的條件下轉染14h，隨後分別按轉染細胞體積計，補加0.1%丙戊酸鈉鹽(VPA)(2.2M,Sigma)，補加2.5%的葡萄糖(200g/L，Sigma)以及2.5%的Feed溶液(1g/L Phγtone Peptone+1g/L Difco Select Phγtone)，再次將細胞置於37℃，8% CO₂的條件培養7d。

純化產物：將培養後的細胞培養液以4000rpm離心50min，收集上清，用預裝管柱Hitrap Mabselect Sure(GE,11-0034-95)純化上清液。具體操作如下：純化前用5倍管柱體積的平衡液(20mM Tris,150mM NaCl,pH7.2)平衡填料管柱；將收集的上清液藉由管柱，再用10倍管柱體積的平衡液清洗填料管柱，消除非特異性結合蛋白；用5倍管柱體積的沖提緩衝液(100mM檸檬酸鈉，pH 3.5)沖洗填料，收集沖提液。將沖提液用2M Tris調節pH至6.0，並測定濃度，獲得純化的抗體產物。

將收集的抗體產物超濾濃縮交換到PBS(Gibco，70011-044)中，然後用superdex200 increase(GE,10/300GL,10245605)進一步分離純化，收集單體的沖提峰，管柱的平衡和沖提緩衝液為PBS(Gibco，70011-044)。

實施例3.Fc突變體與Fc受體的親和力測定

一、SPR法測定攜帶Fc突變體的抗體的親和力

採用表面電漿共振法(SPR)測定本發明獲得的攜帶Fc突變體的抗體與人FcγR結合的情況，其中具體檢測了各個抗體突變體與FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb及FcRn的平衡解離常數(KD)。基於SPR原理，當一束偏振光以一定的角度入射到棱鏡端面，在棱鏡與金膜的界面將產生表面電漿波，引起金屬膜內自由電子產生共振，即表面電漿共振。分析時，先在傳感芯片表面固定一層生物分子識別膜，然後將待測樣品流過芯片表面，若樣品中有能夠與芯片表面的生物分子識別膜相互作用的分子，則會引起金膜表面折射率變化，最終導致SPR角度變化，藉由檢測SPR角度變化，獲得被分析物的親和力、動力學常數等信息。

本實施例藉由Biacore(Cγtiva，T200)測定實施例2獲得的攜帶Fc區突變的抗體與人FcγR的KD，具體方法如下：將含有組胺酸標簽的各個FcγR及FcRn蛋白(各個Fc受體的信息參見下文的表2)捕獲到偶聯有抗組胺酸抗體的芯片表面，然後藉由檢測芯片表面蛋白與流動相中的抗體之間的結合與解離獲得親和力及動力學常數。該方法包括芯片製備和親和力檢測。測定過程使用10倍稀釋後的10×HBS-EP+(BR-1006-69,Cγtiva)作為實驗緩衝液。

表2檢測用受體信息

根據廠商說明，具體方法如下：

芯片製備：使用胺基偶聯試劑盒(BR-1006-33,Cγtiva)和組胺酸捕獲試劑盒(28995056，Cγtiva)，將組胺酸捕獲試劑盒中的抗組胺酸抗體偶聯在CM5芯片(29-1496-03,Cγtiva)表面，偶聯後注入1M乙醇胺，對剩餘的活化位點進行封閉。

親和力檢測：每個循環包括捕獲受體、結合一定濃度的本申請攜帶Fc區突變的抗體及芯片再生。將梯度稀釋後的各個抗體突變體溶液(與FcγRs結合時，稀釋梯度為0、12.5、25、50、100、200、400nM；與FcRn結合時，稀釋梯度為0、50、100、200、400、800、1600nM)，以從低濃度到高濃度的順序分別完成各個親和力檢測循環。在每個循環中，以30μl/min的流速使抗體突變體溶液流過芯片表面，結合時間60s，解離時間60s。最後使用10mM Glγcine pH 1.5(BR-1003-54,Cγtiva)對芯片進行再生。獲得的數據使用Biacore T200分析軟體(版本號3.1)，採用分析1：1結合或穩態分析模型進行分析，獲得相應結果。

下表3給出了本研究各個抗體突變體與各個Fc受體的親和力數據，圖2示出了相應的分子的擬合曲線。

從結果可知：作為本研究的對照抗體，IgG1野生型Fcmut-01抗體與CD64有很高的親和力，K_D值為1.07E-09；與CD32A的兩個亞型H167和R167都結合，K_D值分別為2.01E-07和4.60E-08；與CD16A的兩個亞型F176和V176的親和力分別為1.57E-07和2.44E-08；而對CD16B(NA1)，CD16B(NA2)和CD32B為弱結合。

除了突變體Ecmut-05與CD16A(V176)有較弱的親和力(3.06E-07)，其他攜帶Fc突變的抗體分子都不與CD16A(F176)、CD16A(V176)、CD16B(NA1)、CD16B(NA2)、CD32A(H167)、CD32A(R167)和CD32B結合。關於與野生型IgG1有強結合的CD64，突變體Fcmut-06/07/08都不與CD64結合，而Fcmut-02/03/04/05對CD64的結合也得到大幅度降低，與對照Fcmut-01相比，分別減弱了8.7倍，12.9倍，14.02倍和50.75倍。此外，Fcmut-26~Fcmut-32也顯示出相似的結果，與Fcmut-25相比，除Fcmut-29外，其他攜帶Fc突變的抗體分子都不與CD16A(F176)、CD16A(V176)、CD16B(NA1)、CD16B(NA2)、CD32A(H167)、CD32A(R167)和CD32B結合。

F176和V176是CD16A主要的基因型，並且根據晶體結構可知CD16A的176位胺基酸位於與Fc的結合區中，因此對CD16A與Fc的親和力有重要影響。本申請獲得的Fc突變體基本上不與CD16A的基因型F176和V176相互作用，因此可以明確本申請獲得的Fc突變體將基本上不與所有的功能性CD16A相互作用，由此不引發ADCC效應。包含本申請Fc突變體的蛋白質分子(例如抗體)分子因此基本上不具有ADCC效應子功能。

已知抗體的Fc區與FcRn在pH中性條件下不結合，僅在酸性條件下結合，這是抗體分子具體較長半衰期的主要機制。經檢測可知，對照抗體Fcmut-01在pH6.0與FcRn的親和力是3.86E-07，而在pH7.0條件下不與FcRn結合，本研究獲得的攜帶Fc突變的抗體分子在相同條件下與FcRn的結合與對照抗體Fcmut-01一致(圖2i、2j)，說明本研究獲得的Fc突變體不影響與FcRn的結合。

FcRn在體內多種細胞上表達，且FcRn與Fc區的結合是pH依賴型的，只在弱酸性pH6.0左右結合，而在中性pH無結合，由此可以延長相應抗體的半衰期。本申請的實驗數據表明抗體所攜帶的Fc區突變並沒有影響抗體分子與FcRn的結合，因此，FcRn依然能夠延長本申請抗體突變體的體內半衰期。

本申請獲得的抗體突變體不與CD32B結合，表明藉由對抗體的Fc區進行突變，可以增強抗體的療效。

現有技術中廣泛採用的“LALA”突變(Fcmut-05)將抗體Fc區與FcγR的結合親和力降低100倍。而藉由本申請獲得的Fc突變體，相比較於“LALA”突變，與FcγR的結合親和力更低，因此更強地降低了ADCC的作用。

野生型IgG2和IgG4具有弱的ADCC效應或者沒有ADCC效應，因此許多期望避免ADCC效應的抗體分子在生產中選擇IgG2亞型或者IgG4亞型的Fc區。然而在有些情況下，仍然希望進一步降低IgG2亞型或者IgG4亞型的ADCC效應功能。為此，申請人進一步探討了對IgG2和IgG4亞型的Fc區相應位點(參見表1)進行相應突變後，其與各種FcR結合的情況。數據表明，包含本申請相應突變的IgG2亞型或者IgG4亞型Fc突變體相對於野生型的Fc，減弱了對FcγR的結合。

表3.Fc突變體與Fc受體的結合常數

二、生物膜薄層干涉技術測定本發明Fc突變體與Fc受體的結合

採用生物膜薄層干涉測定技術(BLI)測定本發明Fc突變體結合人Fc受體的親和力(KD)。

實驗開始前半個小時，根據樣品數量，取合適數量的HIS1K傳感器(18-5120，Sartorius)浸泡於SD緩衝液(1x PBS，0.1% BSA，0.05% Tween-20)中，與FcRn結合時，實驗所用緩衝液更改為10mM HEPS、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05% P20、pH 6.0。將抗體稀釋至200nM，Fc受體(樣品信息見表2)稀釋至100nM。

分別將200μl的SD緩衝液、200ul標記的抗體溶液、200ul Fc受體加入到96孔黑色聚苯乙烯微孔板(Greiner，655209)中。使用Fortebio Octet Red96e進行檢測，根據樣品位置布板，選擇傳感器位置。儀器設置參數如下：運行步驟：平衡基線120s、固化Fc受體100s、平衡基線120s、結合抗體60s和解離60s，轉速為1000rpm，溫度為30℃。實驗完成後，使用ForteBio Octet分析軟體分析KD值。

結果見下表4和圖3。與Fcmut-25相比，除Fcmut-29外，其他攜帶Fc突變的抗體分子都不與CD16A(F176)、CD16A(V176)、CD16B(NA1)、CD16B(NA2)結合。突變體Fcmut-26/27/28/29/30/31/32突變體都不與CD32A H167、CD32A R167、CD32B結合。突變體Fcmut-30/31/32都不與CD64結合，而Fcmut-/26/27/28/29對CD64的結合也得到大幅度降低。

Fc-25是結合HER2的抗體，其抗體的恆定區為野生型的IgG1序列；從結果可知，刪除P329可以降低分子對Fc gamma受體的結合，但對FcRn(pH6.0)的結合不受影響。

表4a突變體與HIS1K傳感器上的CD16A V176結合

表4b突變體與HIS1K傳感器上的CD16A F176結合

表4c突變體與HIS1K傳感器上的CD16B NA1結合

表4d突變體與HIS1K傳感器上的CD16B NA2結合

表4e突變體與HIS1K傳感器上的CD32A H167結合

表4f突變體與HIS1K傳感器上的CD32A R167結合

表4g突變體與HIS1K傳感器上的CD32B結合

表4h突變體與HIS1K傳感器上的CD64結合

表4i突變體與HIS1K傳感器上的FcRn結合

實驗例4.生物膜薄層干涉技術測定本發明Fc突變體與C1q的親和力

抗體Fc與C1q的親和力的強弱直接決定了抗體是否具有CDC效應子功能，因此本實施例藉由檢測各個Fc突變體與C1q的親和力來判斷該Fc突變體是否還具有CDC效應子功能。

採用生物膜薄層干涉測定技術(BLI)測定本發明抗體結合人C1q的親和力(KD)。BLI法親和力測定按照現有的方法(Estep,P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2)：第270-8頁)進行。

首先使用EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin(21327，Thermo Scientific)生物素與抗體按莫耳比3：1混合後靜置進行生物素標記，離心去除未標記的生物素，並將抗體等體積置換至PBS溶液中。

實驗開始前半個小時，根據樣品數量，取合適數量的SA傳感器(Foretbio,18-5019)浸泡於SD緩衝液(1x PBS，0.1% BSA，0.05% Tween-20)中。將抗體稀釋至約100nM，C1q(A099,Complement Technology)稀釋至40nM。

分別將200μl的SD緩衝液、200ul標記的抗體溶液、200ulC1q抗原加入到96孔黑色聚苯乙烯微孔板(Greiner，655209)中。使用Fortebio Octet Red96e進行檢測，根據樣品位置布板，選擇傳感器位置。儀器設置參數如下：運行步驟：基線、加樣~3nm、基線、締合(Kon)和解離(Kdis)；各個步驟運行時間取決於樣品結合和解離速度，轉速為1000rpm，溫度為30℃。實驗完成後，使用ForteBio Octet分析軟體分析KD值，導出坐標軸數據使用Graphpad Prism 8軟體作圖。

結果如表5和圖2k所示，只有Fcmut-01可與C1q結合，親和力為2.02E-08，Fcmut-2~Fcmut-8都不與C1q結合。說明本研究的Fc突變體可以減弱或阻止Fc與C1q的結合，因而可以降低或消除抗體的CDC效應子功能。與相應的野生型對照相比，Fcmut-10~Fcmut-16、Fcmut-18~Fcmut-24同樣不與C1q結合。此外，與Fcmut-25相比，Fcmut-26~Fcmut-32同樣不與C1q結合。

表5.Fc突變體與C1q的親和力

實驗例5.生物膜薄層干涉技術測定本發明的抗體與抗原的親和力

除以下內容，採用與實施例4該方法相同的BLI法進行親和力的檢測。

實驗開始前半個小時，根據樣品數量，取合適數量的AHC(Foretbio,18-5060)傳感器浸泡於SD緩衝液(1x PBS，0.1% BSA，0.05% Tween-20)中。將抗體和Claudin18.2(cp0007,Genscript)分別稀釋至100nM。

取200μl的SD緩衝液、200μl的抗體、200μl的Claudin18.2抗原分別加入到96孔黑色聚苯乙烯微孔板(Greiner，655209)中。使用Fortebio Octet Red96e進行檢測，根據樣品位置布板，選擇傳感器位置。儀器設置參數如下：運行步驟：基線、加樣、基線、締合(Kon)和解離(Kdis)；各個步驟運行時間取決於樣品結合和解離速度，轉速為1000rpm，溫度為30℃。實驗完成後，使用ForteBio Octet分析軟體分析KD值。

結果見表6，Fcmut-02~08和抗原的KD值與Fcmut-01和抗原的KD值處於相同的數量級，因此說明本發明公開的在Fc區的具體突變不會影響相應抗體與其抗原的親和力，進而表明包含本發明Fc突變體的抗體將保留其自有的抗原親和力。

表6.抗體與抗原的親和力

實施例6.抗體介導的ADCC效應

FcγR介導的主要效應子功能之一為抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(ADCC)，其由NK細胞和巨噬細胞上的FcγRIIIA(CD16A)介導。在前面實施例研究了本申請獲得的攜帶Fc突變的抗體與Fc受體的親和力之後，本實施例繼續探討該抗體突變體的ADCC效應子功能。

本實施例使用Promega公司的Jurkat-ADCCNF-AT luciferase效應細胞株(以下簡稱ADCC效應細胞)，藉由檢測NF-AT信號的激活情況，從而檢測抗體的ADCC活性。具體實驗過程如下：

1)細胞準備

對表面過表達人claudin18.2的細胞DANG-18.2(CLS Cell Lines Service)和ADCC效應細胞進行細胞計數：離心消除細胞DANG-18.2和ADCC效應細胞的上清，並用PBS溶液洗滌細胞兩次，然後用檢測培養基(含5%低IgG血清的1640培養基(Gibco))重新懸浮細胞，將ADCC效應細胞的濃度調整為6×10⁶個/mL，將DANG-18.2細胞的濃度調整為1×10⁶個/ml。

2)鋪板：將靶細胞DANG-18.2鋪96孔板，每孔25uL。

3)加入系列稀釋的本發明的抗體：每個攜帶Fc區突變的抗體樣品及對照樣品的起始濃度如表7所列，然後進行三倍稀釋，共獲得10個稀釋梯度，分別依次加入孔板中，每孔25uL。

表7.抗體的起始濃度

4)將ADCC效應細胞加入各個孔板中，每孔25uL。

5)37℃培養箱中孵育12小時。

6)取出96孔板，室溫放置10分鐘，每孔加入解凍的Luciferase測試試劑(Bio-Glo^TM Luciferase assaγ reagent)75ul。用酶標儀檢測，用GraphPad軟體擬合濃度依賴的曲線。

檢測結果如圖4所示，對照抗體Fcmut-01具有野生型IgG1單株抗體的Fc區，其藉由結合靶細胞(DANG-18.2)上的抗原，可以有效激活ADCC效應細胞的NF-AT信號，從而啟動ADCC的下游信號通路，表明該抗體具有優良的ADCC殺傷能力。然而，本申請獲得的攜帶Fc區突變的其他抗體則表現出非常弱或幾近於無的ADCC效應，具體而言：突變體Fcmut-05(攜帶L234A &L235A突變)在10倍大於對照Fcmut-01的濃度下展示出非常弱的ADCC活性，而其他的突變體即便在10倍大於對照Fcmut-01的高濃度下也沒有ADCC活性，表明本申請獲得的攜帶Fc區突變的抗體分子的ADCC效應功能實質上被消除，該結果也與實施例3中各個抗體分子與CD16A的親和力數據一致。

根據現有技術可知，藉由對Fc區進行LALA突變，可以顯著降低抗體的ADCC效應，本實施例的結果表明相比較於LALA突變，本申請獲得的Fc突變體對ADCC效應的降低效果更大。

本申請藉由對抗體Fc區第329位、330位、234位或235位的一個或者多個胺基酸進行突變修飾(例如，缺失、取代)獲得的抗體突變體基本上消除了ADCC效應子功能，由此表明，上述胺基酸位置對於抗體的ADCC/ADCP效應子功能至關重要。當目標抗體在實際需求中需要避免ADCC/ADCP效應子功能時，所屬技術領域具有通常知識者將可以根據本申請公開的內容選擇對Fc區第329位、330位、234位或235位的一個或者多個胺基酸進行相應修飾，從而產生實際的技術效果。具體而言，可以考慮缺失抗體Fc區的第329位胺基酸、缺失第329-330位胺基酸、缺失第329位胺基酸以及取代第320位胺基酸，以及將上述修飾與LALA修飾(L234A+L235A)組合應用，從而獲得消除ADCC/ADCP效應子功能的抗體分子。

Claims

一種Fc突變體，為人IgG型Fc突變體，其相對於人野生型IgG Fc區包含一個或者多個胺基酸修飾，該修飾選自依據Kabat中的EU索引編號的第329位、第234位、第235位或第330位胺基酸，其中，所述Fc突變體包含如下修飾：1)依據Kabat中的EU索引編號的第329位胺基酸的缺失(△329)；或2)依據Kabat中的EU索引編號的第329位和第330位胺基酸的缺失(△329和△330)；或4)依據Kabat中的EU索引編號的如下修飾：△329+A330G或者△329+S330G；或5)依據Kabat中的EU索引編號的如下修飾：L234A+L235A+△329、V234A+△329或F234A+L235A+△329；或6)依據Kabat中的EU索引編號的如下修飾：L234A+L235A+△329+△330、V234A+△329+△330或F234A+L235A+△329+△330；或7)依據Kabat中的EU索引編號的如下修飾：L234A+L235A+A330G+△329、L234A+L235A+S330G+△329、V234A+L235A+A330G+△329、V234A+L235A+S330G+△329、F234A+L235A+S330G+△329或F234A+L235A+A330G+△329。
如請求項1所述的Fc突變體，其中，所述人IgG型Fc突變體為IgG1、IgG2、IgG4型Fc突變體。
如請求項1或2所述的Fc突變體，其包含如下序列： 1)SEQ ID NO：2中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或2)SEQ ID NO：3中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或3)SEQ ID NO：4中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或4)SEQ ID NO：5中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或5)SEQ ID NO：6中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或6)SEQ ID NO：7中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或7)SEQ ID NO：8中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或 8)SEQ ID NO：11中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或9)SEQ ID NO：12中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或10)SEQ ID NO：13中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或11)SEQ ID NO：14中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或12)SEQ ID NO：15中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或13)SEQ ID NO：16中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或14)SEQ ID NO：17中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或 15)SEQ ID NO：19中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或16)SEQ ID NO：20中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或17)SEQ ID NO：21中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或18)SEQ ID NO：22中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或19)SEQ ID NO：23中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或20)SEQ ID NO：24中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或21)SEQ ID NO：25中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或 22)SEQ ID NO：27中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或23)SEQ ID NO：28中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或24)SEQ ID NO：29中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或25)SEQ ID NO：30中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或26)SEQ ID NO：31中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或27)SEQ ID NO：32中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成，或28)SEQ ID NO：33中按照EU索引第221-447位胺基酸的序列，或者與該序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、甚至更高的同一性的胺基酸序列，或者由該序列組成。
一種多肽，其包含如請求項1至3中任一項所述的Fc突變體。
如請求項4所述的多肽，其是抗體分子。
如請求項5所述的多肽，其為包含Fc突變體的抗體分子，其包含如下的重鏈和輕鏈：1)包含SEQ ID NO：2所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或2)包含SEQ ID NO：3所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或3)包含SEQ ID NO：4所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或4)包含SEQ ID NO：5所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或5)包含SEQ ID NO：6所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或6)包含SEQ ID NO：7所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或7)包含SEQ ID NO：8所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或8)包含SEQ ID NO：11所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或9)包含SEQ ID NO：12所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或10)包含SEQ ID NO：13所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或11)包含SEQ ID NO：14所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或12)包含SEQ ID NO：15所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或13)包含SEQ ID NO：16所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或14)包含SEQ ID NO：17所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或15)包含SEQ ID NO：19所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或16)包含SEQ ID NO：20所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或17)包含SEQ ID NO：21所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或18)包含SEQ ID NO：22所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或19)包含SEQ ID NO：23所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或 20)包含SEQ ID NO：24所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或21)包含SEQ ID NO：25所示的重鏈和SEQ ID NO：9所示的輕鏈；或22)包含SEQ ID NO：27所示的重鏈和SEQ ID NO：34所示的輕鏈；或23)包含SEQ ID NO：28所示的重鏈和SEQ ID NO：34所示的輕鏈；或24)包含SEQ ID NO：29所示的重鏈和SEQ ID NO：34所示的輕鏈；或25)包含SEQ ID NO：30所示的重鏈和SEQ ID NO：34所示的輕鏈；或26)包含SEQ ID NO：31所示的重鏈和SEQ ID NO：34所示的輕鏈；或27)包含SEQ ID NO：32所示的重鏈和SEQ ID NO：34所示的輕鏈；或28)包含SEQ ID NO：33所示的重鏈和SEQ ID NO：34所示的輕鏈。
一種醫藥組成物，其包含如請求項1至3中任一項所述的Fc突變體、或者包含如請求項4至6中任一項所述的多肽，及可藥用載體。
一種如請求項1至3中任一項所述的Fc突變體在製備減少或者消除ADCC、ADCP或CDC效應子功能之藥物的用途。
一種編碼如請求項1至3中任一項所述的Fc突變體、或編碼如請求項4至6中任一項所述的多肽的核酸分子。
一種載體，其包含如請求項9所述的核酸分子。
一種宿主細胞，其包含如請求項9所述的核酸分子或如請求項10所述的載體。
一種如請求項7所述的醫藥組成物、或如請求項1至3中任一項所述的Fc突變體、或者如請求項4至6中任一項所述的多肽於製備治療受試者的腫瘤之藥物的用途。
一種試劑盒，其包含如請求項1至3中任一項所述的Fc突變體、如請求項4至6中任一項所述的多肽。
一種製備如請求項1至3中任一項所述的Fc突變體、或者製備如請求項4至6中任一項所述的多肽的方法，包括在適當的條件下在如請求項11所述的宿主細胞中表達如請求項9所述的核酸分子或者表達如請求項10所述的載體。
如請求項14所述的方法，還包括回收表達的Fc突變體或多肽。