TWI838804B - 肉毒桿菌毒素乾餅的製備方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種肉毒桿菌毒素減壓乾燥方法。當利用基於本發明減壓乾燥方法的肉毒桿菌毒素乾餅的製備方法時，能夠在保持肉毒桿菌毒素效能的同時極大縮短乾燥時間。

Description

肉毒桿菌毒素乾餅的製備方法
本發明係關於毒素配方的乾燥製程，具體係關於基於減壓乾燥方法的肉毒桿菌毒素乾餅（Cake）的製備方法。
肉毒桿菌毒素（Botulinum toxin；BTX）係一種由稱之為肉毒梭狀芽胞桿菌（ C.botulinum）的厭氧菌產生的神經毒素，共有7個種類（A~G型），目前其中的肉毒桿菌A（BTX-A）型、B（BTX-B）型兩種被純化用於醫學。
肉毒桿菌毒素藉由抑制神經傳遞質乙醯膽鹼釋放而阻斷肌肉收縮訊號傳遞，以發揮放鬆肌肉的作用。即，在神經肌肉接合點（neuromuscular junction）阻斷突觸前末梢（presynaptic terminal）分泌的神經傳遞質乙醯膽鹼釋放以誘發神經麻痹。填充劑是用於在皮膚體積不足部位填充既定物質的醫療器械，相反，肉毒桿菌毒素配方係一種含有阻止使肌肉收縮的神經傳遞質釋放以減少肌肉使用的成分的醫藥品，兩者存在差異。
肉毒桿菌毒素主要用於抑制或去除眉間褶皺、眼周褶皺，也用於中風的上肢僵硬、眼瞼痙攣、尖頭畸形等的治療，其適應症正在逐漸擴大。
市售可獲得的肉毒桿菌毒素製品可以溶劑形態與包含氯化鈉和人血清白蛋白的賦形劑一同提供，或可經乾燥製程而以固體（乾餅）形態提供。大部分肉毒桿菌毒素製造公司正在生產經冷凍乾燥製程的製品。可例如meditoxin ®、Xeomin ®、Dysport ®等。
另一方面，在肉毒桿菌毒素的乾燥製程中，已知有多種常規的冷凍乾燥方法（KR 10-2012-0112248 A等），但相應方法必須伴隨冷凍（freezing）過程，藉由昇華（Sublimation）過程去除水分，因而需要很長時間（大約18~48小時）。特別是作為冷凍乾燥製程必需過程的冷凍製程，由於形成冰核（Ice nucleus）或在冷凍期間部分發生的賦形劑濃度不均，會藉由破壞蛋白質結構而導致活性降低。
這種冷凍乾燥製程一般被認為是用於蛋白質醫藥品乾劑型的先進形態的乾燥方式，但不適合於使用極微量蛋白質的肉毒桿菌毒素配方。
因此，迫切需要開發一種適合肉毒桿菌毒素配方特性的乾燥製程。另外，由於冷凍乾燥製程的特性，需要一種能夠高效使用進行第一次乾燥和第二次乾燥的較長製程時間的方案。
[技術問題]
本發明人深入研究致力於開發一種保持有效性和穩定性的經優化的肉毒桿菌毒素減壓乾燥方法。結果發現，藉由高效調節壓力、（架子）溫度等乾燥製程相關的參數，能夠保護作為蛋白質的肉毒桿菌毒素不受製程中發生的外部刺激影響，並極大縮短乾燥時間，從而完成了本發明。
因此，本發明目的係提供一種肉毒桿菌毒素乾餅（Cake）的製備方法。 [技術方案]
本發明人深入研究致力於開發一種保持有效性和穩定性的經優化的肉毒桿菌毒素減壓乾燥方法。結果發現，藉由高效調節壓力、（架子）溫度等乾燥製程相關的參數，能夠保護作為蛋白質的肉毒桿菌毒素不受製程中發生的外部刺激影響，並極大縮短乾燥時間。
本發明係關於肉毒桿菌毒素乾餅的製備方法。
下文更詳細描述本發明。
根據本發明一種形態，本發明提供一種肉毒桿菌毒素乾餅的製備方法，包括：以1500毫托至60000毫托壓力條件及3℃至25℃溫度條件使肉毒桿菌毒素減壓乾燥的步驟。
在本說明書中，術語「肉毒桿菌毒素（Botulinum toxin；BTX）」指可從肉毒梭狀芽胞桿菌（ C.botulinum）菌株純化收得的毒素。肉毒梭狀芽胞桿菌（ C.botulinum）菌株生成的肉毒桿菌毒素，具有約150kDa的尺寸。肉毒桿菌毒素複合物作為肉毒桿菌毒素與一個或更多非-毒素蛋白質結合狀態的複合物質，具有約300 kDa至900 kDa的尺寸。
前述肉毒桿菌毒素不僅用於抑制或改善眉間褶皺、眼周褶皺，還可用於多種醫療目的。
在本說明書中，術語「餅（Cake）」係指在小瓶（vial）乾燥配方的底面乾燥的物質，可與粉末（powder）配方區分使用。
在本發明一實現例中，本發明的肉毒桿菌毒素生成菌株為肉毒梭狀芽胞桿菌（ C.botulinum）。更具體地，可使用但不限於Clostridium botulinum A型（ATCC 19397）菌株。肉毒桿菌毒素A型已被美國食品藥品監督管理局（FDA）批准用於12歲及以上患者的原發性眼瞼痙攣、斜視和面肌痙攣，以及頸肌張力障礙、眉間（面部）褶皺治療和多汗症治療。
在本發明另一實現例中，本發明的肉毒桿菌毒素可為使用常規已知的多樣製程製備的，不特別限制。
具體地，例如，可為培養肉毒桿菌毒素生成菌株後，經過1次或2次以上沉澱、過濾、再溶解、純化過程的肉毒桿菌毒素生成菌株培養液。
更具體地，例如，本發明的肉毒桿菌毒素可為由在本領域技藝人士顯而易見認為適合培養肉毒梭狀芽胞桿菌（ C.botulinum）的特定培養基中培養的肉毒梭狀芽胞桿菌（ C.botulinum）的培養物，藉由一系列酸沉澱，將肉毒桿菌毒素複合物純化為由活性高分子量毒素蛋白質和相關紅血球凝集素蛋白質構成的結晶型複合物，將所純化的結晶型複合物溶解於包含鹽水和穩定劑的溶液而製備的肉毒桿菌毒素生成菌株培養液。
前述肉毒桿菌毒素生成菌株培養液的培養條件可根據培養環境，立足於技藝人士的技術常識而適當調節。
在本發明又一實現例中，本發明的前述肉毒桿菌毒素的濃度可為250U/mL至5000U/mL。
具體地，在較佳實施形態中，前述肉毒桿菌毒素的濃度可為250U/mL至5000U/mL、300U/mL至5000U/mL、400U/mL至5000U/mL、500U/mL至5000U/mL、600U/mL至5000U/mL、700U/mL至5000U/mL、800U/mL至5000U/mL、900U/mL至5000U/mL、1000U/mL至5000U/mL、1000U/mL至4500U/mL、1000U/mL至4000U/mL、1000U/mL至3500U/mL、1000U/mL至3000U/mL、1000U/mL至2500U/mL、1000U/mL至2000U/mL、1000U/mL至1500U/mL、1000U/mL至1200U/mL、800U/mL至1200U/mL、800U/mL至1100U/mL、800U/mL至1000U/mL、800U/mL至900U/mL、900U/mL至1200U/mL、1000U/mL至1200U/mL、或1100U/mL至1200U/mL。
在本發明又一實現例中，本發明的肉毒桿菌毒素乾餅的製備方法可為將上述的肉毒桿菌毒素以1500毫托以上、小於60000毫托的壓力進行減壓乾燥而進行製備。
具體地，在較佳實施形態中，本發明的減壓乾燥可以1500至60000毫托、1500至55000毫托、1500至50000毫托、1500至45000毫托、1500至40000毫托、1500至35000毫托、1500至30000毫托、1500至25000毫托、1500至20000毫托、1500至15000毫托、1500至14000毫托、1500至13000毫托、1500至12000毫托、1500至11000毫托、1500至10000毫托、1500至9000毫托、1500至8000毫托、1500至7000毫托、1500至6000毫托、1500至5000毫托、1500至4000毫托、1500至3500毫托、1500至3000毫托、1500至2500毫托、1500至2000毫托、2500至3000毫托、2500至3500毫托、2500至4000毫托、2500至4500毫托、2500至5000毫托、2500至6000毫托、2500至7000毫托、2500至8000毫托、2500至9000毫托、2500至10000毫托、2500至11000毫托、2500至12000毫托、2500至13000毫托、2500至14000毫托、2500至15000毫托、2500至20000毫托、2500至25000毫托、2500至30000毫托、22500至35000毫托、2500至40000毫托、2500至45000毫托、2500至50000毫托、2500至55000毫托、或2500至60000毫托的壓力執行。
當超出前述範圍時，可能因沸騰等現象而對蛋白質造成損傷，並且存在由於未進行充分乾燥而無法獲得完全乾燥物的問題。
另一方面，前述減壓乾燥需要以穩定控制狀態、以既定速度從作為一般大氣條件的常壓（normal[atmospheric] pressure）達到目標壓力。
在本發明又一實現例中，本發明的肉毒桿菌毒素乾餅的製備方法可為將上述的肉毒桿菌毒素在3℃至25℃溫度下減壓乾燥而進行製備。
具體地，在較佳實施形態中，本發明的減壓乾燥可在3℃至25℃、5℃至25℃、7℃至25℃、9℃至25℃、11℃至25℃、12℃至25℃、3℃至20℃、5℃至20℃、7℃至20℃、9℃至20℃、11℃至20℃、12℃至20℃、3℃至18℃、3℃至16℃、3℃至14℃、或3℃至12℃的溫度下執行。
當超出前述範圍時，由於溫度高、低，會增加肉毒桿菌毒素的結構不穩定性或發生物理損傷和變形，存在可能因此降低效能的問題。
在本發明又一實現例中，本發明的肉毒桿菌毒素乾餅的製備方法可為執行至本發明的肉毒桿菌毒素乾餅含水率達到3%以內時為止。
具體地，本發明的肉毒桿菌毒素乾餅的製備方法可為將上述的肉毒桿菌毒素乾燥0.5小時以上，較佳地，減壓乾燥0.5小時至4小時而進行製備。
具體地，在較佳實施形態中，本發明的減壓乾燥可為在0.5小時至4小時、0.5小時至3小時、0.5小時至2小時、0.5小時至1小時、1小時至4小時、2小時至4小時、或3小時至4小時的範圍內執行。
根據本發明的肉毒桿菌毒素乾餅的製備方法而製備的最終產物，即肉毒桿菌毒素乾餅可具有80%至120%或85%至115%的基準滴度。
在本發明的肉毒桿菌毒素乾餅的製備過程中，根據用於製品乾燥的溶劑的體積及表面積，由於溶解氧含量或乾燥製程中濃縮的組合物的濃度變化而會發生沸騰溢出，由於冰點變化而會發生意外的冰核形成等。如果在這種狀態下進行製品的乾燥，則會因製品性狀不均和蛋白質損傷等而導致製品質量低下。因此，較佳乾燥製程在適度保持用於製品乾燥的溶劑體積或表面積的狀態下進行，這屬於熟知本說明書內容的一般技藝人士可容易地調節並執行的範圍內。
本發明的肉毒桿菌毒素乾餅的製備方法使用上述的減壓乾燥製程，因而廢棄了先前技術的冷凍乾燥製程。在本發明的一種形態中，本發明使用減壓乾燥製程，因而縮短製程時間，最大限度減少蛋白質醫藥品乾燥中的損傷，與先前技術相比，本發明可具有更高效進行商業化生產的優點。 [發明效果]
本發明係關於肉毒桿菌毒素減壓乾燥方法，當利用基於本發明減壓乾燥方法的肉毒桿菌毒素乾餅的製備方法時，可在保持肉毒桿菌毒素效能的同時極大縮短乾燥時間。
下文藉由實施例，更詳細地描述本發明。本行業的一般技藝人士可理解，這些實施例只用於更具體描述本發明，根據本發明要旨，本發明的範圍不由這些實施例所限制。
如在實施例中未不同地揭示，「毒素」或「肉毒桿菌毒素」指具有約900kDa分子量的肉毒桿菌毒素A型複合物。本說明書中公開的方法對製備約150 kDa、約300 kDa、約500 kDa以及其他分子量的毒素、複合物、肉毒桿菌毒素血清型和肉毒桿菌神經毒素成分配方具有適用性。
製備例.肉毒桿菌毒素最終原液的製備
添加0.9%氯化鈉（默克公司，1.37017.5000）、0.5%人血清白蛋白（綠十字公司，161B19508）、1000U/mL肉毒桿菌毒素A型原液（依妮寶有限公司（inibio），韓國），製備了肉毒桿菌毒素的最終原液。
比較例1.冷凍乾燥下的肉毒桿菌毒素的滴度比較
1-1.乾燥實驗
分別比較了以冷凍乾燥條件和減壓乾燥條件執行乾燥的配方。冷凍乾燥條件和減壓乾燥條件參見下表1。
[表1]
乾燥方法 製程名 架子溫度（℃） 時間（m） 壓力（mTorr）
冷凍乾燥 冷凍 -50 180
第一乾燥 -50 480 200
第二乾燥 20 180 100
減壓乾燥 乾燥 11.5 60 2500
從圖1確認可知，相比減壓乾燥（圖1的左側瓶），冷凍乾燥（圖1的右側瓶）情況下，形成了較厚的白色乾餅狀。這種乾餅很容易因施加於小瓶的衝擊等而破碎，並且破碎的乾餅會發生飛散。
1-2.滴度實驗
針對上述製備例中製備的肉毒桿菌毒素的最終原液，將以冷凍乾燥條件（參見下表2）執行乾燥的配方溶解於生理鹽水2.8mL中，分別對10隻ICR-鼠（4週齡、體重18~22g；科盛科技（coretech），韓國）腹腔給藥（0.1mL/隻），確認了3日死亡及存活動物數。使用統計程式（CombiStats 6.1 EDQM）算出了滴度。適合的滴度基準設置為包括動物試驗誤差範圍的區間（參見下表3），其結果參見下表4。
[表2]
製程名 架子溫度（℃） 時間（m） 壓力（mTorr）
冷凍 -50 180
第一乾燥 -50 480 200
第二乾燥 20 180 100
[表3]
試驗 基準滴度範圍（%）
滴度試驗 100±15%
[表4]
瓶號 乾燥條件 基準滴度（%）
#1 （比較例1） 冷凍乾燥 65.0
#2 （比較例2） 冷凍乾燥 56.3
#3 （比較例3） 冷凍乾燥 56.5
從表4確認可知，執行以往普通冷凍乾燥製程的肉毒桿菌毒素配方的滴度為56~65%，超出上述表3記載範圍，因蛋白質損傷導致效果下降。
這種結果表明，相比冷凍乾燥配方，肉毒桿菌毒素的減壓乾燥配方可更優異地保持肉毒桿菌毒素活性。
參考例. 減壓乾燥下的肉毒桿菌毒素改性及損壞的確認
將上述製備例中製備的肉毒桿菌毒素的最終原液在瓶內各填充5mL或1mL，確認了普通低真空乾燥壓力變化導致的物理變化和冰點變化。
具體地，使壓力從1巴變化到0.0019巴（約1500毫托），執行了減壓乾燥。此時，架子溫度為5℃。作為對照組，使用了蒸餾水（Distilled water；DW）和0.9% NaCl溶液。
圖2a確認了將各個溶液在瓶內各填充5mL後隨壓力的相變。在上述條件下，在10000毫托以下，肉毒桿菌毒素最終原液中出現了溶液沸騰現象，對照組中未出現。
圖2b確認了在各個溶液在瓶內各填充1mL後因壓力導致的相變。在上述條件下，在1500毫托下，最終原液出現了沸騰和冰晶形成，對照組未出現。
這種現象被認為是因為溶劑的體積及表面積不適合溶劑的特性和乾燥條件而發生的，這使得無法適當控制乾燥過程，或由於製程中發生的冰晶形成等而發生並非完全蒸發（Evaporation）的昇華（sublimation），會導致難以執行正常的減壓乾燥。另外，如果在如此無法適當控制的狀態下進行製品的乾燥等，則會因製品性狀不均和蛋白質損傷等導致製品質量低下。
實施例1. 藉由確認肉毒桿菌毒素的滴度確定減壓乾燥條件
將上述製備例中製備的肉毒桿菌毒素的最終原液在瓶內各填充0.1mL並按下表5記載條件進行減壓乾燥，針對所得的配方，以與上述比較例1-2相同方法算出了滴度。適當的滴度基準設置為包括動物試驗誤差範圍的區間（參見上述表3），其結果參見下表5。
[表5]
瓶號 壓力（mTorr） 架子溫度（℃） 基準滴度（%）
#4 1500 3 99.5
#5 1500 3 97.7
#6 2500 3 108.8
#7 3500 3 113.5
#8 3500 5 102.8
#9 1500 12 84.4
#10 2500 11.5 94.8
#11 3500 11.5 105.8
#12 1500 20 91.6
#13 2500 20 95.1
#14 3500 20 100.4
#15 3500 20 105.9
#16 （比較例4） 500 25 81.6
#17 （比較例5） 70000 25 91.0
從表5確認可知，在1500~30000毫托、3~25℃下執行1小時乾燥製程的肉毒桿菌毒素配方的滴度滿足上述表3記載的範圍。相反，在1500~30000毫托之外範圍執行乾燥製程時（比較例4和5），肉毒桿菌毒素配方的滴度不滿足適合範圍。
實施例2. 確認本發明減壓乾燥條件的乾燥時間#1
乾燥大致可由兩個步驟構成。分離藉由氫鍵（hydrogen bonding）連接的水分子，去除能夠與構成最終原液的其他賦形劑和蛋白質發生多種相互作用的水分子。水分子之間形成鍵時，相比與其他分子發生相互作用的水分子，以相對較小的能量便可分離。大多數情況下是水分子之間形成鍵，藉由將其分離，第一次執行蒸發。在此過程中，表現為液相製品變化為氣相的過程。第二次蒸發在水分子與其他賦形劑間相互作用的鍵斷裂期間發生，如果此過程幾乎結束，則判定為乾燥完成。含水率測量結果必須具有3%以內含水率，才滿足乾餅注射劑的基準。
因此，藉由製品的相變，可確認水分蒸發的速度和適合性。
2-1.不同壓力條件的相變（液體→氣體）時間確認
基於上述實施例1的結果，針對空瓶和將上述製備例中製備的肉毒桿菌毒素最終原液在瓶內各填充0.1mL，確認了不同壓力條件下的相變時間。
具體地，如下表6所示，在1000~70000毫托、25℃條件下執行乾燥製程1小時，在瓶內設置溫度感測器並確認了相變導致的溫度變化。壓力越低，出現相變的速度越快，由此可確認發生了蒸發。
[表6]
瓶號 壓力（mTorr） 相變時間（min）
#18 （比較例6） 1000 11
#19 3000 13
#20 10000 15
#21 30000 43
#22 50000 -
#23 60000 -
#24 （比較例7） 70000 -
從表6及圖3a和圖3b確認可知，在大部分的瓶底面形成有白色乾餅，出現因蒸發導致的相變，發生相變所需時間為11~43分鐘。但在1小時內，在50000毫托、60000毫托和70000毫托下未出現相應過程。
這種結果表明，壓力越高，完全乾燥（蒸發）所需時間越增加，進而在超過既定範圍的壓力（比較例7）下，難以製備本發明希望的肉毒桿菌毒素乾餅。
2-2. 所製備肉毒桿菌毒素乾餅的含水率確認
基於上述實施例1和實施例2-1的結果，針對空瓶和將上述製備例中製備的肉毒桿菌毒素最終原液在瓶內各填充0.1mL，對於盛裝有在3500毫托、5℃條件下執行減壓乾燥的肉毒桿菌毒素乾餅的瓶，測量了濕度10%以內環境中的水分。藉由下述計算式算出了含水率（%），適當的含水率基準參考藥典，示出於下表7。
[計算式] 含水率（%）=
[表7]
試驗 範圍 參考文獻
含水率試驗 3%以下 USP、EP
[表8]
瓶號 時間（h） 含水率（%）
#25 0.5 1.01
#26 1 1.53
#27 4 1.49
從表8確認可知，執行乾燥製程0.5~4小時的肉毒桿菌毒素配方的含水率滿足上表7記載的範圍。
實施例3. 本發明減壓乾燥條件下的乾燥時間確認#2
基於上述實施例2的結果，針對空瓶和將上述製備例中製備的肉毒桿菌毒素最終原液在瓶內各填充0.1mL，確認了不同壓力條件下的相變時間。
具體地，如下表9所示，在50000~70000毫托、25℃條件下執行乾燥製程3小時，在瓶內設置溫度感測器並確認了相變導致的溫度變化。壓力越低，相變發生速度越快，由此可確認發生了蒸發。
[表9]
瓶號 壓力（mTorr） 相變時間（min）
#28 50000 143
#29 60000 183
#30 （比較例8） 70000 -
從表9和圖4確認可知，在50000毫托和60000毫托條件下發生相變所需的時間分別為143分鐘、183分鐘。但在70000毫托下，不發生相應過程。
這種結果表明，壓力越高，完全乾燥（蒸發）所需時間越增加，進而在超過既定範圍的壓力（比較例8）下，難以製備本發明希望的肉毒桿菌毒素乾餅。
無。
圖1示出確認減壓乾燥製品與冷凍乾燥製品的餅性狀差異的結果。 圖2a和圖2b示出確認通常低真空減壓乾燥條件下肉毒桿菌毒素的改性和損壞可能性的結果。 圖3a和圖3b示出在本發明減壓乾燥中，確認在1000至70000毫托範圍的壓力條件下餅性狀差異（圖3a）和瓶內溫度變化（圖3b）的結果。 圖4示出在本發明減壓乾燥中，確認50000至70000毫托範圍壓力條件下瓶內溫度變化的結果。

Claims (11)

  1. 一種肉毒桿菌毒素乾餅的製備方法，其特徵在於，包括：以1500毫托至60000毫托壓力條件使肉毒桿菌毒素減壓乾燥的步驟。
  2. 如請求項1所述之肉毒桿菌毒素乾餅的製備方法，其中，前述減壓乾燥以3℃至25℃溫度條件執行。
  3. 如請求項2所述之肉毒桿菌毒素乾餅的製備方法，其中，前述減壓乾燥執行0.5小時以上或0.5小時至4小時時間。
  4. 如請求項3所述之肉毒桿菌毒素乾餅的製備方法，其中，前述肉毒桿菌毒素的濃度為250U/mL至5000U/mL。
  5. 如請求項4所述之肉毒桿菌毒素乾餅的製備方法，其中，所製備的肉毒桿菌毒素乾餅具有80%至120%或85%至115%的基準滴度。
  6. 如請求項5所述之肉毒桿菌毒素乾餅的製備方法，其中，前述減壓乾燥執行至肉毒桿菌毒素乾餅的含水率達到3%以內時為止。
  7. 如請求項6所述之肉毒桿菌毒素乾餅的製備方法，其中，前述肉毒桿菌毒素生成菌株為肉毒梭狀芽胞桿菌(C.botulinum)A型。
  8. 如請求項7所述之肉毒桿菌毒素乾餅的製備方法，其中，用於前述減壓乾燥的壓力條件為：藉由以穩定控制狀態、以既定速度從常壓達到目標壓力而形成。
  9. 如請求項1至8中任一項所述之肉毒桿菌毒素乾餅的製備方法，其中，前述減壓條件在1500至60000毫托、1500至55000毫托、1500至50000毫托、1500至45000毫托、1500至40000毫托、1500至35000毫托、1500至30000毫托、1500至25000毫托、1500至20000毫托、1500至15000毫托、1500至14000毫托、1500至13000毫托、1500至12000毫托、1500至11000毫托、1500至10000毫托、1500至9000毫托、1500至8000毫托、1500至7000毫托、1500至6000毫托、1500至5000毫托、1500至4000毫托、1500至3500毫托、1500至3000 毫托、1500至2500毫托、1500至2000毫托、2500至3000毫托、2500至3500毫托、2500至4000毫托、2500至4500毫托、2500至5000毫托、2500至6000毫托、2500至7000毫托、2500至8000毫托、2500至9000毫托、2500至10000毫托、2500至11000毫托、2500至12000毫托、2500至13000毫托、2500至14000毫托、2500至15000毫托、2500至20000毫托、2500至25000毫托、2500至30000毫托、22500至35000毫托、2500至40000毫托、2500至45000毫托、2500至50000毫托、2500至55000毫托、或2500至60000毫托的壓力下執行。
  10. 如請求項1至8中任一項所述之肉毒桿菌毒素乾餅的製備方法，其中，前述減壓條件在5℃至25℃、7℃至25℃、9℃至25℃、11℃至25℃、12℃至25℃、3℃至20℃、5℃至20℃、7℃至20℃、9℃至20℃、11℃至20℃、12℃至20℃、3℃至18℃、3℃至16℃、3℃至14℃、或3℃至12℃的溫度下執行。
  11. 如請求項1至8中任一項所述之肉毒桿菌毒素乾餅的製備方法，其中，前述減壓條件在0.5小時至4小時、0.5小時至3小時、0.5小時至2小時、0.5小時至1小時、1小時至4小時、2小時至4小時、或3小時至4小時的範圍執行。
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