TWI818225B - 抑制補體c5表現的雙股核糖核酸 - Google Patents

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Abstract

本發明公開一種雙股核糖核酸，其具有選自由序列編號159及160、序列編號141及142、序列編號143及144、序列編號145及146、序列編號147及148、以及序列編號153及154所組成之群中的正義股及反義股之組合。

Description

抑制補體C5表現的雙股核糖核酸
本發明涉及一種抑制補體C5表現的雙股核糖核酸(dsRNA)。本發明尤其涉及一種雙股核糖核酸、封入有該雙股核糖核酸的脂質複合物、以及含有該雙股核糖核酸或脂質複合物的補體C5抑制劑及醫藥組成物。
被稱為補體的蛋白質群中有C1~C9所表示的蛋白質，該等蛋白質藉由3條不同的途徑(經典途徑、凝集素途徑、第二途徑)被連鎖活化，由此引起免疫反應。補體的第5成分C5被C5轉化酶分解為C5a和C5b。所產生的C5a被稱為過敏毒素，藉由C5aR(CD88)及C5L2(GPR77)在各種細胞中引發炎症反應。所產生的C5b藉由依序與C6-C9反應而成為最終產物即膜攻擊複合物(MAC)，引起病原體的溶菌、細胞溶解。補體系統在未受適當控制或發生過度活化時，有可能對宿主細胞產生強力的傷害作用。
從現有的研究中已知補體C5會參與以下各種疾病：陣發性睡眠性血紅蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒症綜合症(aHUS)、重症肌無力症(MG)、視神經脊髓炎(NMO)、抗體介導型腎移植排斥反應、吉蘭巴雷綜合症、抗嗜中性粒細胞質抗體相關血管炎(ANCA相關血管炎)、肌萎縮性側索硬化症(ALS)、帕金森病(PD)、自身免疫性腦炎、IgG4相關疾病、氣喘、抗磷脂抗體綜合症、缺血-再灌注損傷、典型溶血性尿毒症綜 合症(tHUS)、多灶性運動神經病(MMN)、多發性硬化症(MS)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自然流產、習慣性流產、創傷性腦損傷、冷凝集素病、皮肌炎、與產志賀毒素大腸桿菌(E.coli)相關的溶血性尿毒症綜合症、移植物功能障礙、心肌梗塞、敗血症、動脈粥樣硬化症、敗血症性休克、脊髓損傷、牛皮癬、自身免疫溶血性貧血(AIHA)、抗磷脂綜合症(APS)、心肌炎、免疫複合物性血管炎、高安病、川崎病(動脈炎)等。因此，期待阻礙補體C5或抑制其表現有助於該等疾病的治療。特別是關於陣發性睡眠性血紅蛋白尿症(非專利文獻1)、非典型溶血性尿毒症綜合症(非專利文獻2)、重症肌無力症(非專利文獻3)、視神經脊髓炎(非專利文獻4)、抗體介導型腎移植排斥反應(非專利文獻5)，提示抑制補體C5對該等疾病的治療或預防有用。
抗C5單株抗體依庫珠單抗(Soliris(註冊商標))對補體C5表現出高親和性，藉由阻礙由C5分解為C5a/C5b及隨之形成膜攻擊複合物，從而抑制補體的過度活化。由此，依庫珠單抗表現出其對溶血的抑制效果，作為陣發性睡眠性血紅蛋白尿症及非典型溶血性尿毒症綜合症的治療劑而為人所知。另外，依庫珠單抗也作為全身型重症肌無力症(gMG)的治療劑而為人所知。但是，依庫珠單抗非常昂貴，所以期待開發出能夠用於治療及預防補體C5相關疾病的代替手段。
作為抑制補體C5表現的方法，例如，可列舉利用RNA干擾(RNA interference，以下也稱為「RNAi」)的方法。例如，已知一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其經由RNA誘導沈默複合物(RISC)引起C5基因的RNA轉錄物的切斷(專利文獻1)。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2014/160129號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Peter Hillmen et al., The New England Journal of Medicine 2004 Feb 5; 350(6): 552-559
[非專利文獻2]Legendre CM et al., The New England Journal of Medicine 2013 Jun 6; 368(23): 2169-2181
[非專利文獻3]Howard JF Jr et al., Muscle Nerve 2013 Jul; 48(1): 76-84
[非專利文獻4]Pittock SJ et al., The Lancet Neurology 2013 Jun; 12(6): 554-562
[非專利文獻5]Stegall MD et al., American Journal of Transplantation 2011 Nov; 11(11): 2405-2413
本發明的課題在於提供一種用來抑制補體C5表現的新穎雙股核糖核酸。
本發明例如提供以下的[1]至[38]。
[1]一種雙股核糖核酸，其具有正義股及反義股之組合，且正義股及反義股之組合選自由：序列編號13及序列編號14、序列編號159及序列編號160、序列編號115及序列編號116、序列編號117及序列編號118、序列編號119及序列編 號120、序列編號121及序列編號122、序列編號123及序列編號124、序列編號125及序列編號126、序列編號127及序列編號128、序列編號129及序列編號130、序列編號131及序列編號132、序列編號133及序列編號134、序列編號137及序列編號138、序列編號139及序列編號140、序列編號141及序列編號142、序列編號143及序列編號144、序列編號145及序列編號146、序列編號147及序列編號148、序列編號149及序列編號150、序列編號151及序列編號152、以及序列編號153及序列編號154所組成之群。
[2]一種雙股核糖核酸，其具有正義股及反義股之組合，且正義股及反義股之組合選自由：序列編號159及序列編號160、序列編號139及序列編號140、序列編號141及序列編號142、序列編號143及序列編號144、序列編號145及序列編號146、序列編號147及序列編號148、以及序列編號153及序列編號154所組成之群。
[3]一種雙股核糖核酸，其具有正義股及反義股之組合，且正義股及反義股之組合選自由：序列編號159及序列編號160、序列編號141及序列編號142、序列編號143及序列編號144、序列編號145及序列編號146、序列編號147及序列編號148、以及序列編號153及序列編號154所組成之群。
[4]一種雙股核糖核酸，其具有正義股及反義股之組合，且正義股及反義股之組合選自由：序列編號141及序列編號142、序列編號143及序列編號144、序列編號145及序列編號146、序列編號147及序列編號148、以及序列編號153及序列編號154所組成之群。
[5]一種雙股核糖核酸，其具有序列編號141的正義股、及序列編號142的反義股。
[6]一種雙股核糖核酸，其具有序列編號143的正義股、及序列編號144的反義股。
[7]一種雙股核糖核酸，其具有序列編號145的正義股、及序列編號146的反義股。
[8]一種雙股核糖核酸，其具有序列編號147的正義股、及序列編號148的反義股。
[9]一種雙股核糖核酸，其具有序列編號153的正義股、及序列編號154的反義股。
[10]一種雙股核糖核酸，其具有序列編號159的正義股、及序列編號160的反義股。
[11]一種補體C5抑制劑，其含有[1]至[10]中任一項所述之雙股核糖核酸。
[12]一種醫藥組成物，其含有[1]至[10]中任一項所述之雙股核糖核酸。
[13]根據[12]所述之醫藥組成物，其還含有藥學上可接受的載體。
[14]根據[12]或[13]所述之醫藥組成物，其用於治療陣發性睡眠性血紅蛋白尿症。
[15]根據[12]或[13]所述之醫藥組成物，其用於治療非典型溶血性尿毒症綜合症。
[16]根據[12]或[13]所述之醫藥組成物，其用於治療或預防抗體介導型排斥反應。
[17]根據[16]所述之醫藥組成物，其中抗體介導型排斥反應為抗體介導型腎移植排斥反應。
[18]根據[12]或[13]所述之醫藥組成物，其用於治療重症肌無力症。
[19]根據[12]或[13]所述之醫藥組成物，其用於治療視神經脊髓炎。
[20]一種脂質複合物，其封入有[1]至[10]中任一項所述之雙股核糖核酸。
[21]根據[20]所述之脂質複合物，其含有陽離子性脂質、及選自由中性脂質、聚乙二醇修飾脂質、及固醇所組成之群中的至少一種脂質。
[22]根據[21]所述之脂質複合物，其中陽離子性脂質為1-甲基哌啶-4-羧酸2-{9-側氧基-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基酯。
[23]根據[21]所述之脂質複合物，其中中性脂質為二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)。
[24]根據[21]所述之脂質複合物，其中聚乙二醇修飾脂質為MPEG2000-DMG(MPEG2000-二肉豆蔻基甘油)。
[25]根據[21]所述之脂質複合物，其中固醇為膽固醇。
[26]一種補體C5抑制劑，其含有[20]至[25]中任一項所述之脂質複合物。
[27]一種醫藥組成物，其含有[20]至[25]中任一項所述之脂質複合物。
[28]根據[27]所述之醫藥組成物，其還含有藥學上可接受的載體。
[29]根據[27]或[28]所述之醫藥組成物，其用於治療陣發性睡眠性血紅蛋白尿症。
[30]根據[27]或[28]所述之醫藥組成物，其用於治療非典型溶血性尿毒症綜合症。
[31]根據[27]或[28]所述之醫藥組成物，其用於治療或預防抗體介導型排斥反應。
[32]根據[31]所述之醫藥組成物，其中抗體介導型排斥反應為抗體介導型腎移植排斥反應。
[33]根據[27]或[28]所述之醫藥組成物，其用於治療重症肌無力症。
[34]根據[27]或[28]所述之醫藥組成物，其用於治療視神經脊髓炎。
[35]一種陣發性睡眠性血紅蛋白尿症之治療方法，其包括將[1]至[10]中任一項所述之雙股核糖核酸對需要其的患者給藥。
[36]一種非典型溶血性尿毒症綜合症之治療方法，其包括將[1]至[10]中任一項所述之雙股核糖核酸對需要其的患者給藥。
[37]一種抗體介導型排斥反應的治療或預防方法，其包括將[1]至[10]中任一項所述之雙股核糖核酸對需要其的患者給藥。
[38]根據[37]所述之治療或預防方法，其中抗體介導型排斥反應為抗體介導型腎移植排斥反應。
[39]一種重症肌無力症之治療方法，其包括將[1]至[10]中任一項所述之雙股核糖核酸對需要其的患者給藥。
[40]一種視神經脊髓炎之治療方法，其包括將[1]至[10]中任一項所 述之雙股核糖核酸對需要其的患者給藥。
[41]根據[1]至[10]中任一項所述之雙股核糖核酸，其用於在治療陣發性睡眠性血紅蛋白尿症中使用。
[42]根據[1]至[10]中任一項所述之雙股核糖核酸，其用於在治療非典型溶血性尿毒症綜合症中使用。
[43]根據[1]至[10]中任一項所述之雙股核糖核酸，其用於在治療或預防抗體介導型排斥反應中使用。
[44]根據[43]所述之雙股核糖核酸，其中抗體介導型排斥反應為抗體介導型腎移植排斥反應。
[45]根據[1]至[10]中任一項所述之雙股核糖核酸，其用於在治療重症肌無力症中使用。
[46]根據[1]至[10]中任一項所述之雙股核糖核酸，其用於在治療視神經脊髓炎中使用。
[47]一種[1]至[10]中任一項所述之雙股核糖核酸之用途，其用於製造陣發性睡眠性血紅蛋白尿症治療用的醫藥組成物。
[48]一種[1]至[10]中任一項所述之雙股核糖核酸之用途，其用於製造非典型溶血性尿毒症綜合症治療用的醫藥組成物。
[49]一種[1]至[10]中任一項所述之雙股核糖核酸之用途，其用於製造抗體介導型排斥反應治療或預防用的醫藥組成物。
[50]根據[49]所述之雙股核糖核酸之用途，其中抗體介導型排斥反應為抗體介導型腎移植排斥反應。
[51]一種[1]至[10]中任一項所述之雙股核糖核酸之用途，其用於製造重症肌無力症治療用的醫藥組成物。
[52]一種[1]至[10]中任一項所述之雙股核糖核酸之用途，其用於製造視神經脊髓炎治療用之醫藥組成物。
[53]一種陣發性睡眠性血紅蛋白尿症之治療方法，其包括將[20]至[25]中任一項所述之脂質複合物對需要其的患者給藥。
[54]一種非典型溶血性尿毒症綜合症之治療方法，其包括將[20]至[25]中任一項所述之脂質複合物對需要其的患者給藥。
[55]一種抗體介導型排斥反應的治療或預防方法，其包括將[20]至[25]中任一項所述之脂質複合物對需要其的患者給藥。
[56]根據[55]所述之治療或預防方法，其中抗體介導型排斥反應為抗體介導型腎移植排斥反應。
[57]一種重症肌無力症之治療方法，其包括將[20]至[25]中任一項所述之脂質複合物對需要其的患者給藥。
[58]一種視神經脊髓炎之治療方法，其包括將[20]至[25]中任一項所述之脂質複合物對需要其的患者給藥。
[59]根據[20]至[25]中任一項所述之脂質複合物，其用於在治療陣發性睡眠性血紅蛋白尿症中使用。
[60]根據[20]至[25]中任一項所述之脂質複合物，其用於在治療非典型溶血性尿毒症綜合症中使用。
[61]根據[20]至[25]中任一項所述之脂質複合物，其用於在治療或預防抗體介導型排斥反應中使用。
[62]根據[61]所述之脂質複合物，其中抗體介導型排斥反應為抗體介導型腎移植排斥反應。
[63]根據[20]至[25]中任一項所述之脂質複合物，其用於在治療重 症肌無力症中使用。
[64]根據[20]至[25]中任一項所述之脂質複合物，其用於在治療視神經脊髓炎中使用。
[65]一種[20]至[25]中任一項所述之脂質複合物之用途，其用於製造陣發性睡眠性血紅蛋白尿症治療用的醫藥組成物。
[66]一種[20]至[25]中任一項所述之脂質複合物之用途，其用於製造非典型溶血性尿毒症綜合症治療用的醫藥組成物。
[67]一種[20]至[25]中任一項所述之脂質複合物之用途，其用於製造抗體介導型排斥反應治療或預防用的醫藥組成物。
[68]根據[67]所述之脂質複合物之用途，其中抗體介導型排斥反應為抗體介導型腎移植排斥反應。
[69]一種[20]至[25]中任一項所述之脂質複合物之用途，其用於製造重症肌無力症治療用的醫藥組成物。
[70]一種[20]至[25]中任一項所述之脂質複合物之用途，其用於製造視神經脊髓炎治療用之醫藥組成物。
根據本發明，能夠提供一種抑制補體C5表現的新穎雙股核糖核酸、封入有該核酸的脂質複合物、以及含有該核酸或該脂質複合物的補體C5抑制劑及醫藥組成物。
本發明的雙股核糖核酸由於具有抑制補體C5表現、抑制溶血的作用，故而具有作為陣發性睡眠性血紅蛋白尿症(PNH)或非典型溶血性尿毒症綜合症(aHUS)的治療劑的可利用性。
[圖1]係表示實施例5中siRNA-008給藥後的肝臟中C5 mRNA殘存率及siRNA-008-34給藥後的肝臟中C5 mRNA殘存率的結果之圖。
[圖2]係表示實施例5中siRNA-008給藥後的血漿中C5殘存率及siRNA-008-34給藥後的血漿中C5殘存率的結果之圖。
[圖3]係表示實施例8中siRNA-008-34給藥後的補體活性的結果之圖。
[圖4]係表示實施例9中siRNA-008-34給藥後的補體活性的結果之圖。
[圖5]係表示實施例10中siRNA-008-34給藥後的補體活性的結果之圖。
[圖6]係表示實施例11中siRNA-008-34給藥後的補體活性的結果之圖。
作為編碼本實施方式的雙股核糖核酸的目標即補體C5的基因，例如可列舉來自人、小鼠及猴的C5，但不限於該等。C5基因的序列資訊可從美國國家生物技術資訊中心(NCBI)提供的GenBank等登錄序列資訊的公共資料庫獲得，除此以外，可基於有近緣關係的動物品種的C5的鹼基序列資訊來設計引物，由從所需動物品種提取的RNA進行選殖，由此而獲得。作為與目標基因人C5對應的mRNA轉錄物的序列，例如可列舉GenBank Accession No.NM_001735.2(GI：38016946)的人C5 mRNA轉錄物的序列。本說明書中所謂C5基因並非指具有特定序列的基因，例如也包括天然存在的具有單核苷酸多態性的C5基因。
一實施方式的具有正義股及反義股的雙股核糖核酸的正義股及反義股之組合選自由：序列編號13及序列編號14、序列編號159及序列編號160、序列編號115及序列編號116、序列編號117及序列編號118、序列編號119及序列編號120、序列編號121及序列編號122、序列編號123及序列編號124、序列編號125及序列編號126、序列編號127及序列編號128、序列編號129及序列編號130、序列編號131及序列編號132、序列編號133及序列編號134、序列編號137及序列編號138、序列編號139及序列編號140、序列編號141及序列編號142、序列編號143及序列編號144、序列編號145及序列編號146、序列編號147及序列編號148、序列編號149及序列編號150、序列編號151及序列編號152、以及序列編號153及序列編號154所組成之群。上述組合分別相當於本說明書中的siRNA-008、siRNA-008-01、siRNA-008-02、siRNA-008-08、siRNA-008-09、siRNA-008-10、siRNA-008-11、siRNA-008-12、siRNA-008-13、siRNA-008-14、siRNA-008-22、siRNA-008-23、siRNA-008-30、siRNA-008-31、siRNA-008-32、siRNA-008-33、siRNA-008-34、siRNA-008-35、siRNA-008-36、siRNA-008-37、及siRNA-008-38的序列。
上述實施方式的雙股核糖核酸中，下述(1)~(21)的任一組合的正義股及反義股形成對。
(1)序列編號13的正義股、及序列編號14的反義股
(2)序列編號159的正義股、及序列編號160的反義股
(3)序列編號115的正義股、及序列編號116的反義股
(4)序列編號117的正義股、及序列編號118的反義股
(5)序列編號119的正義股、及序列編號120的反義股
(6)序列編號121的正義股、及序列編號122的反義股
(7)序列編號123的正義股、及序列編號124的反義股
(8)序列編號125的正義股、及序列編號126的反義股
(9)序列編號127的正義股、及序列編號128的反義股
(10)序列編號129的正義股、及序列編號130的反義股
(11)序列編號131的正義股、及序列編號132的反義股
(12)序列編號133的正義股、及序列編號134的反義股
(13)序列編號137的正義股、及序列編號138的反義股
(14)序列編號139的正義股、及序列編號140的反義股
(15)序列編號141的正義股、及序列編號142的反義股
(16)序列編號143的正義股、及序列編號144的反義股
(17)序列編號145的正義股、及序列編號146的反義股
(18)序列編號147的正義股、及序列編號148的反義股
(19)序列編號149的正義股、及序列編號150的反義股
(20)序列編號151的正義股、及序列編號152的反義股
(21)序列編號153的正義股、及序列編號154的反義股
上述(1)~(21)的正義股及反義股之組合包括彼此互補的區域。例如，具有序列編號13的正義股及序列編號14的反義股的組合即上述(1)的雙股核糖核酸包含以下互補股(分別不包含3'末端的dT^dT，詳細參照表1)。
5'-uGGuAuAuGuGuuGcuGAu-3'(序列編號13)
3'-AcCAuAuAcAcAAcGAcUA-5'(序列編號14)
一實施方式的具有正義股及反義股的雙股核糖核酸的正義股及反義股之組合選自由：序列編號159及序列編號160、序列編號139及序列編號140、序列編號141及序列編號142、序列編號143及序列編號144、序列編號145及序列編號146、序列編號147及序列編號148、以及序列編號153及序列編號154所組成之群。上述組合分別相當於本說明書中的siRNA-008-01、siRNA-008-31、siRNA-008-32、siRNA-008-33、siRNA-008-34、siRNA-008-35、及siRNA-008-38的序列。
一實施方式的具有正義股及反義股的雙股核糖核酸的正義股及反義股之組合選自由：序列編號159及序列編號160、序列編號141及序列編號142、序列編號143及序列編號144、序列編號145及序列編號146、序列編號147及序列編號148、以及序列編號153及序列編號154所組成之群。上述組合分別相當於本說明書中的siRNA-008-01、siRNA-008-32、siRNA-008-33、siRNA-008-34、siRNA-008-35、及siRNA-008-38的序列。
一實施方式的具有正義股及反義股的雙股核糖核酸的正義股及反義股之組合選自由：序列編號141及序列編號142、序列編號143及序列編號144、序列編號145及序列編號146、序列編號147及序列編號148、以及序列編號153及序列編號154所組成之群。上述組合分別相當於本說明書中的siRNA-008-32、siRNA-008-33、siRNA-008-34、siRNA-008-35、siRNA-008-38的序列。
一實施方式的具有正義股及反義股的雙股核糖核酸具有序列編號159的正義股、及序列編號160的反義股。上述組合相當於本說明書中的siRNA-008-01的序列。
一實施方式的具有正義股及反義股的雙股核糖核酸具有序列編號141的正義股、及序列編號142的反義股。上述組合相當於本說明書中的siRNA-008-32的序列。
一實施方式的具有正義股及反義股的雙股核糖核酸具有序列編號143的正義股、及序列編號144的反義股。上述組合相當於本說明書中的siRNA-008-33的序列。
一實施方式的具有正義股及反義股的雙股核糖核酸具有序列編號145的正義股、及序列編號146的反義股。上述組合相當於本說明書中的siRNA-008-34的序列。
一實施方式的具有正義股及反義股的雙股核糖核酸具有序列編號147的正義股、及序列編號148的反義股。上述組合相當於本說明書中的siRNA-008-35的序列。
一實施方式的具有正義股及反義股的雙股核糖核酸具有序列編號153的正義股、及序列編號154的反義股。上述組合相當於本說明書中的siRNA-008-38的序列。
本實施方式的反義股與C5基因的mRNA轉錄物的至少一部分實質上互補。這裡所謂實質上互補不僅包括與C5基因的mRNA轉錄物完全互補的情形，也包括包含可接受的1~多個錯配的情形。
本實施方式的正義股與反義股的鹼基序列的至少一部分實質上互補。所謂實質上互補不僅包括與反義股的鹼基序列完全互補的情形，而且也包括包含可接受的1~多個錯配的情形。正義股及反義股中任一較長者的寡核苷酸含有與較短者的寡核苷酸完全互補的鹼基序列時，也可表述為「完全互補」。
本實施方式的雙股核糖核酸如下文所述，也包括被修飾的核苷酸(也參照表1)。因此，本說明書中所謂核苷酸係以不僅包括鳥苷-3'-磷酸、胞苷-3'-磷酸、腺苷-3'-磷酸及尿苷-3'-磷酸，而且也包括各種修飾核苷酸的含義使用。
本說明書中所謂「雙股核糖核酸」或「dsRNA」係指含有2條反向平行且實質上互補的寡核苷酸的具有雙股結構的核糖核酸(RNA)分子或其複合物。另外，本說明書中，作為雙股核糖核酸，例如可列舉siRNA(small interfering RNA，小干擾RNA)，但不特別限定於此。本實施方式的雙股核糖核酸具有正義股及反義股。由使用本實施方式的雙股核糖核酸的RNAi而在RISC複合物內將目標mRNA分子即C5基因的mRNA分解，結果C5的表現受到抑制。例如，抑制對象細胞內的C5的表現。
本實施方式的雙股核糖核酸可利用該技術領域中公知的使用化學合成的方法(例如，記載於Nucleic Acid Research,35(10),3287-96(2007)中)及酶轉錄法等來合成。
本實施方式的雙股核糖核酸包含各種修飾。修飾可利用該技術領域中公知的方法進行。作為修飾，例如可列舉糖修飾。
作為糖修飾，例如可列舉2'位的羥基上的取代或加成，其係構成核糖核苷的核糖部的修飾，具體而言，例如可列舉將羥基取代為甲氧基而成的2'-O-甲基修飾核苷酸。表1中小寫字母a、u、g及c表示的核苷酸表示2'-O-甲基修飾核苷酸，本實施方式的雙股核糖核酸的正義股及反義股含有2'-O-甲基修飾核苷酸。
另外，也可以藉由在正義股及反義股形成雙股的區域的3'側或5'側插入被稱為突出(overhang)的追加的核苷酸或核苷酸衍生物，來 對雙股核糖核酸進行修飾。本實施方式的雙股核糖核酸包括像序列編號13及序列編號14那樣在正義股及反義股的3'末端具有去氧胸苷(dT)的雙股核糖核酸、像序列編號129那樣具有反向結合的去氧胸苷(idT)的雙股核糖核酸。另外，本實施方式的雙股核糖核酸也包括附加有作為突出序列的U及A等的雙股核糖核酸、例如像序列編號140及142那樣在反義股的3'末端附加有UUUU的雙股核糖核酸。
另外，也可以藉由磷酸二酯鍵的修飾或取代來對雙股核糖核酸進行骨架修飾。作為磷酸二酯鍵的修飾或取代，例如可列舉硫代磷酸酯鍵。本實施方式的雙股核糖核酸例如也包括像序列編號13、序列編號14、及序列編號121那樣存在隔著硫代磷酸酯鍵鄰接的核苷酸的雙股核糖核酸。
本實施方式的雙股核糖核酸可藉由該技術領域中公知的化學方法(例如轉染)、物理方法(例如電穿孔、顯微注射)、及生物學方法(例如病毒載體)向對象細胞內導入。
轉染係如下方法：使核酸與具有陽電荷的物質(脂質體及聚合物等)結合形成複合物，該複合物被牽引至帶陰電荷的細胞表面，由此藉由內噬作用被吸收進細胞。也可以利用公知的方法進行，也可以藉由使用市售的轉染試劑(例如，TAKARA BIO股份有限公司的TransIT(註冊商標)系列、或Invitrogen公司的Lipofectamine(註冊商標)系列)容易地進行。
核酸分子容易被生物體記憶體在的核糖核酸酶分解，且核酸分子自身為帶負電荷的高分子，因此難以透過同樣帶負電的細胞膜。作為用來將具有這種性質的核酸分子遞送至細胞質的有效方法，開發出使用 脂質複合物及聚合物等的藥物遞送系統(Drug Delivery System，DDS)技術。
(脂質複合物)
本發明提供一種脂質複合物，其含有：(I)上述雙股核糖核酸；(II)陽離子性脂質；以及(III)選自由中性脂質、聚乙二醇修飾脂質(PEG脂質)及固醇所組成之群中的至少一種脂質。本說明書中，作為脂質複合物，例如可列舉LNP(脂質奈米粒子)，但不特別限定於此。
作為由含有陽離子性脂質的脂質與雙股核糖核酸形成的複合物的形態，例如可列舉雙股核糖核酸與由脂質單(單分子)層組成的膜(反膠束)的複合物、雙股核糖核酸與脂質體的複合物、雙股核糖核酸與膠束的複合物等。本發明的一實施方式的脂質複合物中，雙股核糖核酸被封入由含有陽離子性脂質的脂質構成的微粒內。
本實施方式的脂質複合物相對於脂質複合物的總重量，含有例如0.01~50重量%、0.1~30重量%或1~10重量%的上述雙股核糖核酸。
所謂陽離子性脂質係這樣的兩親分子：其具有：含有一個以上烴基的脂質親和性區域、及含有在特定的pH值下質子化的極性基的親水性區域。作為本實施方式的陽離子性脂質，沒有特別限定，例如可使用國際公開第2015/105131號、國際公開第2016/104580號、國際公開第2017/222016號所記載的陽離子性脂質，另外，可使用提高了生物降解能力的國際公開第2016/104580號或國際公開第2017/222016號所記載的陽離子性脂質。作為一實施方式的陽離子性脂質，例如可列舉：1-甲基哌啶-4-羧酸1-側氧基-1-(十一烷-5-基氧基)十九烷-10-基酯、1-甲基哌啶-4-羧 酸1-((2-丁基辛基)氧基)-1-側氧基十九烷-10-基酯、1-甲基哌啶4-羧酸1-側氧基-1-(十一烷-5-基氧基)十七烷-8-基酯、1-甲基哌啶4-羧酸21-側氧基-21-(十一烷-5-基氧基)二十一烷-10-基酯、1-甲基哌啶-4-羧酸21-(辛烷-3-基氧基)-21-側氧基二十一烷-10-基酯、1-甲基哌啶-4-羧酸1-((2-丁基辛基)氧基)-1-側氧基二十烷-10-基酯、(Z)1-甲基哌啶-4-羧酸1-((2-丁基壬-3-烯-1-基)氧基)-1-側氧基二十烷-10-基酯、1-甲基哌啶-4-羧酸1-側氧基-1-((3-戊基辛基)氧基)二十烷-10-基酯、1-甲基哌啶-4-羧酸1-((3,4-二丙基庚基)氧基)-1-側氧基二十烷-10-基酯、1-甲基哌啶-4-羧酸1-((6-(丁基二硫基)-3-(3-(丁基二硫基)丙基)己基)氧基)-1-側氧基二十烷-10-基酯、10-((4-(二甲基胺基)丁醯基)氧基)二十烷酸2-丁基辛酯、1-甲基哌啶-4-羧酸2-{9-[(2-丁基辛基)氧基]-9-側氧基壬基}十二烷基酯、1-甲基哌啶-4-羧酸2-{9-側氧基-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基酯、1-甲基哌啶-4-羧酸2-壬基-11-側氧基-11-[(3-戊基辛基)氧基]十一烷基酯、9-{[(1-甲基哌啶-4-羰基)氧基]甲基}十七碳二酸雙(3-戊基辛基)酯或9-{[(1-甲基哌啶-4-羰基)氧基]甲基}十七碳二酸二[(Z)-2-壬烯-1-基]酯等。一實施方式中，陽離子性脂質為1-甲基哌啶-4-羧酸2-{9-側氧基-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基酯。
本實施方式的脂質複合物以脂質複合物含有的全部脂質為基準，含有例如10~100莫耳%、20~90莫耳%或40~70莫耳%的上述陽離子性脂質。陽離子性脂質可單獨使用1種，或可將2種以上混合使用。
本實施方式的脂質複合物含有(I)上述陽離子性脂質及(II)選自由中性脂質、聚乙二醇修飾脂質、及固醇所組成之群中的至少一種脂質作為脂質成分。本實施方式的脂質複合物相對於脂質複合物的總重量， 含有例如50~99.99重量%、70~99.9重量%或90~99重量%的脂質成分。
中性脂質指在生理pH值下以非電荷或中性的兩性離子中的任一形式存在的脂質。作為本實施方式的中性脂質，例如可列舉：二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)、棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼(POPC)、蛋黃磷脂醯膽鹼(EPC)、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼(DMPC)、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、二花生醯磷脂醯膽鹼(DAPC)、二山萮醯磷脂醯膽鹼(DBPC)、二木蠟醯磷脂醯膽鹼(DLPC)、二油醯磷脂醯膽鹼(DOPC)、神經鞘磷脂、神經醯胺、二油醯磷脂醯甘油(DOPG)、二棕櫚醯磷脂醯甘油(DPPG)、棕櫚醯油醯磷脂醯乙醇胺(POPE)、二油醯-磷脂醯乙醇胺4-(N-馬來醯亞胺甲基)-環己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)等。一實施方式中，中性脂質為二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)。中性脂質可單獨使用1種，或可將2種以上混合使用。
本實施方式的脂質複合物以脂質複合物含有的全部脂質為基準，可含有例如0~50莫耳%、0~40莫耳%、0~30莫耳%或0~20莫耳%的中性脂質。
作為本實施方式的聚乙二醇修飾脂質(PEG脂質)，例如可列舉：PEG2000-DMG(PEG2000-二肉豆蔻基甘油)、MPEG2000-DMG(MPEG2000-二肉豆蔻基甘油)、PEG2000-DPG(PEG2000-二棕櫚醯甘油)、PEG2000-DSG(PEG2000-二硬脂醯甘油)、PEG5000-DMG(PEG5000-二肉豆蔻基甘油)、PEG5000-DPG(PEG5000-二棕櫚醯甘油)、PEG5000-DSG(PEG5000-二硬脂醯甘油)、PEG-cDMA(N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)胺甲醯基]-1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺)、PEG-C- DOMG(R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)胺甲醯基]-1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺)、聚乙二醇(PEG)-二醯基甘油(DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神經醯胺(Cer)等。作為PEG-二烷氧基丙基，可列舉：PEG-二月桂氧基丙基、PEG-二肉豆蔻氧基丙基、PEG-二棕櫚氧基丙基、PEG-二硬脂氧基丙基等。一實施方式中，聚乙二醇修飾脂質為MPEG2000-DMG(MPEG2000-二肉豆蔻基甘油)。聚乙二醇修飾脂質可單獨使用1種，或可將2種以上混合使用。
本實施方式的脂質複合物以脂質複合物含有的全部脂質為基準，可含有例如0~30莫耳%、0~20莫耳%、0~10莫耳%或0.5~2莫耳%的聚乙二醇修飾脂質。
固醇為具有類固醇骨架的醇。作為本實施方式的固醇，例如可列舉：膽固醇、二氫膽固醇、羊毛固醇、β-穀固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、麥角固醇、岩藻固醇、3β-[N-(N',N'-二甲基胺基乙基)胺甲醯基]膽固醇(DC-Chol)等。一實施方式中，固醇為膽固醇。固醇可單獨使用1種，或可將2種以上混合使用。
本實施方式的脂質複合物以脂質複合物含有的全部脂質為基準，可含有例如0~90莫耳%、10~80莫耳%或20~40莫耳%的固醇。
本實施方式的脂質複合物中的脂質成分的組合沒有特別限定，例如可列舉：上述陽離子性脂質、中性脂質及固醇的組合；上述陽離子性脂質、中性脂質、聚乙二醇修飾脂質及固醇的組合等。
一實施方式的封入有本發明的雙股核糖核酸的脂質複合物中，脂質成分由陽離子性脂質/中性脂質/聚乙二醇修飾脂質/固醇構成，其脂質的莫耳比例例如可為10~99/0~50/0~10/0~50、或40~70/0~ 20/0.5~2/20~40。
封入有本發明的雙股核糖核酸的脂質複合物粒子的「平均粒徑」係指Z-平均粒徑。一實施方式的封入有雙股核糖核酸的脂質複合物的平均粒徑(Z-平均)在利用粒徑測定裝置(Malvern，Zetasizer Nano ZS)測定時，沒有特別限定，可為例如10~1000nm、30~500nm或30~200nm。
一實施方式的封入有雙股核糖核酸的脂質複合物中siRNA的封入率例如可使用Quant-iT RiboGreen RNA Reagent(Invitrogen，Cat#R11491)，以利用無RNase水加以稀釋而測得的siRNA濃度作為LNP外液中存在的siRNA，以利用1% Triton X-100加以稀釋而測得的siRNA濃度作為製劑中的總siRNA濃度，算出封入率(也參照Kewal K.Jain,Drug Delivery System,Methods in Molecular Biology,Vol.1141：109-120)。利用上述方法算出的封入率例如較佳的是高於80%、85%或90%。一實施方式的封入有雙股核糖核酸的脂質複合物中siRNA的封入率較佳的是高於90%。
<脂質複合物的製造方法>
作為將有效的分子封入脂質複合物的方法，例如可列舉逆相蒸發法、兩性離子(Zwitterion)(NaCl)水合法、陽離子性核水合法及使用乙醇與鈣的方法(也參照Biomembr.,1468,239-252(2000))等。利用如上所述之該技術領域中公知的方法，可製備一實施方式的封入有雙股核糖核酸的脂質複合物。
一實施方式的封入有雙股核糖核酸的脂質複合物例如可藉由將含有陽離子性脂質與選自由中性脂質、聚乙二醇修飾脂質、及固醇所 組成之群中的至少一種脂質的脂質溶液、和含有雙股核糖核酸的酸性緩衝液加以混合而製備。藉由這種方法，可獲得內部被雙股核糖核酸與脂質的核填充的脂質複合物。一實施方式的封入有雙股核糖核酸的脂質複合物可含有陽離子性脂質及選自由中性脂質、聚乙二醇修飾脂質及固醇所組成之群中的至少一種脂質。
一實施方式的封入有雙股核糖核酸的脂質複合物例如可藉由包括如下步驟的方法製造：步驟(a)，將含有(I)陽離子性脂質與(II)選自由中性脂質、聚乙二醇修飾脂質及固醇所組成之群中的至少一種脂質的含有極性有機溶劑的水溶液與含有(III)雙股核糖核酸的水溶液加以混合，獲得混合液；及步驟(b)，減少混合液中的極性有機溶劑的含有率。
利用水溶性的雙股核糖核酸與陽離子性脂質的靜電相互作用、及脂質間的疏水相互作用，可形成由脂質構成的微粒內封入有雙股核糖核酸的脂質複合物。例如，藉由減少混合液中的極性有機溶劑的含有率，改變含有(I)陽離子性脂質及(II)選自由中性脂質、聚乙二醇修飾脂質及固醇所組成之群中的至少一種脂質的脂質成分相對於含有極性有機溶劑的水溶液的溶解度，能夠形成脂質複合物。作為極性有機溶劑，可列舉乙醇等醇。
首先，在步驟(a)中，將使(I)陽離子性脂質與(II)選自由中性脂質、聚乙二醇修飾脂質及固醇所組成之群中的至少一種脂質溶解而成的含有極性有機溶劑的水溶液與含有(III)雙股核糖核酸的水溶液加以混合，而獲得混合液。含有極性有機溶劑的水溶液中的極性有機溶劑的濃度只要在與含有雙股核糖核酸的水溶液混合後也滿足使脂質分子溶解的條件即可，沒有特別限定。列舉一例來說，步驟(a)的含有極性有機溶劑的水 溶液中的極性有機溶劑的濃度可為0~60重量%。含有(III)雙股核糖核酸的水溶液例如可藉由在酸性緩衝液中溶解雙股核糖核酸而獲得。
其次，在步驟(b)中，藉由在上述混合液中添加水等來減少極性有機溶劑的含有率。由此，能夠形成脂質複合物。為了高效率地形成脂質複合物，較佳的是急速降低極性有機溶劑的含有率。列舉一例來說，步驟(b)中的最終的含有極性有機溶劑的水溶液中的極性有機溶劑的濃度可為0~5重量%。
另外，對於步驟(a)中獲得的上述混合液，可藉由透析去除極性有機溶劑，而將溶劑置換為藥學上可接受的介質。由於透析過程中溶液中的極性有機溶劑的含有率減少，故而由此能夠形成脂質複合物。
根據本實施方式的組成物的製造方法，可獲得雙股核糖核酸被高效率地封入微粒內部的脂質複合物。
作為使雙股核糖核酸溶解的酸性緩衝液，例如可列舉：硫酸緩衝液、磷酸緩衝液、鄰苯二甲酸緩衝液、酒石酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、甲酸緩衝液、草酸緩衝液及乙酸緩衝液等。
作為使脂質溶解的溶劑，可列舉醇等極性有機溶劑，例如可為乙醇、異丙醇、氯仿或三級丁醇。
(補體C5抑制劑及醫藥組成物)
如上所述，藉由使用本實施方式的雙股核糖核酸，能夠利用RNAi抑制補體C5表現。因此，可提供含有一實施方式的雙股核糖核酸或封入有本發明的雙股核糖核酸的脂質複合物的補體C5抑制劑及醫藥組成物。補體C5抑制劑及醫藥組成物除了含有一實施方式的雙股核糖核酸或封入有本發明的雙股核糖核酸的脂質複合物以外，可含有藥學上可接受的載體。
作為藥學上可接受的載體，例如可列舉：液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、製造助劑及溶劑封入材料等。
本實施方式的醫藥組成物例如可為藉由冷凍乾燥等去除了溶劑的粉末狀態，也可為液體狀態。本發明的一實施方式的醫藥組成物係含有上述實施方式的脂質複合物的粉末組成物。粉末組成物可以藉由例如過濾、離心分離等從液體狀態的組成物(分散液)去除溶劑而製備，也可以將該分散液冷凍乾燥而製備。當醫藥組成物為粉末狀態時，可以在使用前將其懸浮或溶解於藥學上可接受的介質中而作為注射劑使用。本發明的一實施方式的醫藥組成物係含有上述實施方式的脂質複合物及藥學上可接受的介質的液體組成物。當醫藥組成物為液體狀態時，可直接或者將其懸浮或溶解於藥學上可接受的介質中作為注射劑使用。
藉由將一實施方式的補體C5抑制劑或醫藥組成物對需要的對象給藥，能夠利用RNAi抑制對象中的補體C5表現。所謂需要的對象係患有與C5基因的表現或活性相關的疾病或障礙的對象、及判斷其發病風險高的對象。
根據一實施方式，本發明的雙股核糖核酸能夠抑制補體C5表現，因此含有本發明的雙股核糖核酸或封入有本發明的雙股核糖核酸的脂質複合物的補體C5抑制劑或醫藥組成物可對於治療陣發性睡眠性血紅蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒症綜合症(aHUS)、重症肌無力症(MG)或視神經脊髓炎(NMO)有用。即，本發明在其它實施方式中，包含陣發性睡眠性血紅蛋白尿症、非典型溶血性尿毒症綜合症、重症肌無力症或視神經脊髓炎之治療方法，其包括將治療上有效量的一實施方式的補體C5抑制劑或醫藥組成物向對象給藥的步驟。另外，本發明在其它實施方 式中，包含本實施方式的雙股核糖核酸或封入有本實施方式的雙股核糖核酸的脂質複合物之用途，其用於製造陣發性睡眠性血紅蛋白尿症、非典型溶血性尿毒症綜合症、重症肌無力症或視神經脊髓炎的治療藥。本發明在其它實施方式中，包含本實施方式的雙股核糖核酸或封入有本實施方式的雙股核糖核酸的脂質複合物，它們用於在治療陣發性睡眠性血紅蛋白尿症、非典型溶血性尿毒症綜合症、重症肌無力症或視神經脊髓炎的的方法中使用。
根據一實施方式，本發明的雙股核糖核酸能夠抑制補體C5表現，因此含有本發明的雙股核糖核酸或封入有本發明的雙股核糖核酸的脂質複合物的補體C5抑制劑或醫藥組成物可對於治療或預防抗體介導型排斥反應有用。在特定的實施方式中，含有本發明的雙股核糖核酸或封入有本發明的雙股核糖核酸的脂質複合物的補體C5抑制劑或醫藥組成物可對於治療或預防抗體介導型腎移植排斥反應有用。本發明在其它實施方式中，包含抗體介導型排斥反應的治療或預防方法，其包括將治療上有效量的一實施方式的補體C5抑制劑或醫藥組成物向對象給藥的步驟。本發明在特定的實施方式中，包含抗體介導型腎移植排斥反應的治療或預防方法，其包括將治療上有效量的一實施方式的補體C5抑制劑或醫藥組成物向對象給藥的步驟。另外，本發明在其它實施方式中，包含本實施方式的雙股核糖核酸或封入有本實施方式的雙股核糖核酸的脂質複合物之用途，其用於製造抗體介導型排斥反應的治療藥或預防藥。本發明在特定的實施方式中，包含本實施方式的雙股核糖核酸或封入有本實施方式的雙股核糖核酸的脂質複合物之用途，其用於製造抗體介導型腎移植排斥反應的治療藥或預防藥。進而，本發明在其它實施方式中，包含本實施方式的雙股核 糖核酸或封入有本實施方式的雙股核糖核酸的脂質複合物，它們用於在治療或預防抗體介導型排斥反應的方法中使用。本發明在特定的實施方式中，包含本實施方式的雙股核糖核酸或封入有本實施方式的雙股核糖核酸的脂質複合物，它們用於在治療或預防抗體介導型腎移植排斥反應的方法中使用。
本實施方式的雙股核糖核酸或封入有本實施方式的雙股核糖核酸的脂質複合物在治療法中可單獨使用，或者可與其它藥劑或組成物併用。例如，本實施方式的雙股核糖核酸或封入有本實施方式的雙股核糖核酸的脂質複合物可與其它藥劑同時或不同時給藥。這種並用療法包括併用給藥(在相同或不同的製劑中含有2種以上的藥劑)及分離給藥(例如同時或連續)。當分開將2種以上的藥劑給藥時，本實施方式的雙股核糖核酸或封入有本實施方式的雙股核糖核酸的脂質複合物的給藥可先於附帶的治療法或於其後接著進行。
含有本實施方式的雙股核糖核酸或封入有本實施方式的雙股核糖核酸的脂質複合物的補體C5抑制劑或醫藥組成物的給藥對象沒有限定，例如可對人或非人哺乳動物(猴、小鼠、大鼠、兔、牛、馬、山羊等)使用本發明。
將含有本實施方式的雙股核糖核酸或封入有本實施方式的雙股核糖核酸的脂質複合物的補體C5抑制劑或醫藥組成物向對象給藥的方法(給藥途徑、給藥量、1天的給藥次數、給藥的時間點等)沒有限定，可根據對象的健康狀態、疾病的程度、併用的藥劑的種類等由熟悉該項技術者(例如醫生)適當決定。
(給藥方法)
一實施方式的補體C5抑制劑及醫藥組成物的給藥的形態沒有特別限定，可為非經口給藥，例如可列舉：靜脈內給藥、肌內給藥、皮下給藥、皮內給藥及髓腔內給藥等。
一實施方式的補體C5抑制劑及醫藥組成物可根據給藥的形態而以足以抑制補體C5的量給藥。一實施方式的補體C5抑制劑及醫藥組成物的給藥量例如相對於對象的體重每1kg為0.01mg~100mg，也可為0.1mg~50mg，也可為0.3mg~10mg。
熟悉該項技術者應理解，只要技術上不矛盾，則可將本說明書所記載的所有實施方式的任意一種或多種適當組合來實施本發明。而且，熟悉該項技術者應理解，只要技術上不矛盾，則較佳的是將本說明書所記載的較佳的是或有利的所有實施方式適當組合來實施本發明。
本說明書中引用的文獻應被視為藉由參照而將它們的全部公開內容明確地援引至本說明書中，熟悉該項技術者可根據本說明書的上下文，在不脫離本發明的精神及範圍的情況下將該等文獻中相關的公開內容作為本說明書的一部分加以援引來理解。
提供本說明書中引用的文獻僅是為了公開本申請的申請日前的關聯技術，不可解釋為本發明人等因在先發明或任意的其它理由而承認不具有該公開中的在先權利。該等文獻的全部記述都是基於本申請人可獲得的資訊，並不構成對該等記述內容準確性的承認。
本說明書中使用的用語用來說明特定的實施方式，無意對發明進行限定。
本說明書中使用的用語「包含(comprise)」除了根據上下文應作明顯不同的理解時以外，意為存在所記載的事項(部件、步驟、要 素或數字等)，不排除存在除此以外的事項(部件、步驟、要素或數字等)。用語「由......組成(consist of)」包含以用語「由......組成(consist of)」及/或「實質上由......組成(consist essentially of)」記載的實施方式。
只要沒有不同的定義，此處使用的全部用語(包括技術用語及科學用語)具有與本發明所屬技術的技術人員廣泛理解的含義相同的含義。這裡使用的用語只要沒有明示不同的定義，則應解釋為具有與本說明書及相關技術領域中的含義一致的含義，不應以理想化或過度正式的含義來解釋。
第1、第2等用語用來表現各種要素，應理解該等要素不應被該等用語自身所限定。該等用語僅用來將一個要素與其它要素區別，例如，在不脫離本發明的範圍的情況下，可將第1要素記為第2要素，同樣地，第2要素可記為第1要素。
在本說明書中，用於表示成分含量或數值範圍等的數值只要沒有特別明示，則應理解為經用語「約」修飾的數值。例如，只要沒有特別明示，「4℃」應理解為指「約4℃」，當然，熟悉該項技術者可根據技術常識和本說明書的文意來合理地理解其程度。
應理解以單數形式表示的各實施方式除了根據上下文明確表示其它含義的情形外，在本說明書及申請專利範圍中使用時，只要在技術上不矛盾，也可以是複數形式，反之亦然。
以下，參照實施例進一步詳細地說明本發明。但本發明能以各種實施方式實現，不可解釋為限定於此處記載的實施例。相關技術領域的技術人員可在不變更本發明的精神或範圍的情況下伴隨各種改變、附 加、缺失、置換等地實施本發明。
[實施例]
[實施例1：單次給藥體外篩選(1)]
(雙股核酸的製備)
利用亞磷醯胺法合成表2所示的正義股及反義股，然後將它們退火，合成雙股核酸(GeneDesign公司)。各序列中的縮寫如以下的表1所示。此外，所合成的雙股核酸於3'末端具有羥基而非磷酸基。
Figure 110101897-A0305-02-0031-1
未標註時，核苷酸以磷酸二酯鍵結合
[表2]
Figure 110101897-A0305-02-0032-2
Figure 110101897-A0305-02-0033-3
(體外篩選)
用Opti-MEM培養基(Gibco公司製造，目錄編號：31985062)稀釋表2所記載的雙股核酸與轉染試劑Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen公司製造，目錄編號：13778150)，以雙股核酸的最終濃度成為3nM及RNAiMax的最終濃度成為0.3%的方式製備siRNA/RNAiMax混合液。將20μL的siRNA/RNAiMax混合液分別分注於96孔培養板中，將來自人類肝臟癌的細胞株Hep3B細胞(從ATCC獲得)以20,000細胞數/80μL/孔接種於各孔中，在37℃、5% CO2條件下培養一晚。使用CellAmp(註冊商標)Direct RNA Prep Kit for PT-PCR(Real Time)(TAKARA BIO股份有限公司製造，目錄編號：3732)及蛋白酶K(TAKARA BIO股份有限公司製造，目錄編號：9034)，按照TAKARA BIO股份有限公司提供的操作說明，由培養細胞製備即時PCR用模板溶解物。然後，使用PrimeScript(註冊商標)RT Master Mix(Perfect Real Time)(TAKARA BIO股份有限公司製造，目錄編號：RR036A)，按照TAKARA BIO股份有限公司提供的操作說明製備cDNA。進而，使用EagleTaq Universal Master Mix(ROX)(Roche Diagnostics公司製造，目錄編號：07260296190)及TaqMan探針(Applied Biosystems公司製造，C5：Hs00156197_m1；GAPDH：Hs02758991_g1)，按照Applied Biosystems公司提供的操作說明，利用ABI7900HT即時PCR系統(Applied Biosystems公司製造)測定目標基因人C5及內參基因人GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，甘油醛-3-磷酸脫氫酶)的Ct值。將不添加siRNA、僅以轉染試劑處理Hep3B細胞時(僅脂轉染)的C5 mRNA表現量設為100%，利用校準曲線法算出導入了各siRNA時的C5 mRNA殘存率(相對值)。另外， 作為陰性對照，使用不與人的任何基因交叉的Mock。
將結果示於表3。
Figure 110101897-A0305-02-0035-4
Figure 110101897-A0305-02-0036-5
[實施例2：單次給藥體外篩選(2)]
(雙股核酸的製備)
利用亞磷醯胺法合成表4所示的正義股及反義股，然後，將它們退火，合成雙股核酸(GeneDesign公司)。
[表4]
Figure 110101897-A0305-02-0037-6
Figure 110101897-A0305-02-0038-7
(體外篩選)
以雙股核酸的最終濃度成為1nM及RNAiMax的最終濃度成為0.3%的方式製備siRNA/RNAiMax混合液，除此以外，與實施例1同樣地進行試驗，測定Hep3B培養細胞中的目標基因人C5及內參基因人GAPDH的Ct值。與實施例1同樣地，將僅脂轉染時的C5 mRNA表現量設為100%，算出導入了各siRNA時的C5 mRNA殘存率(相對值)。
將結果示於表5。當使用siRNA-008-29以外的所有雙股核酸時，均可確認C5 mRNA殘存率降低，表明C5表現受到抑制。
Figure 110101897-A0305-02-0039-9
Figure 110101897-A0305-02-0040-10
[實施例3：體內篩選(序列發現)]
(siRNA-LNP的製備)
將表6所示的siRNA溶解於10mM檸檬酸鈉(pH值4.0)中，製成siRNA稀釋液。將1-甲基哌啶-4-羧酸2-{9-側氧基-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基酯、DSPC(日本精化)、膽固醇(日本精化)、MPEG2000-DMG(日油)以莫耳比60/10.5/28/1.5的比例溶解於乙醇中，製成脂質溶液。將siRNA與脂質的比設為重量比0.1，將siRNA稀釋液與脂質溶液分別以3mL/min、1mL/min的流速混合，由此獲得脂質奈米粒子(LNP)。對於所獲得的LNP水溶液，使用Float-A-Lyzer G2(SPECTRUM，100K MWCO)，藉由透析將外液置換為PBS(pH值7.4)。透析後進行濃縮及過濾殺菌，用於各種實驗。siRNA濃度及封入率使用Quant-iT RiboGreen RNA Reagent(Invitrogen，Cat#R11491)進行測定(以利用無RNase水稀釋而測得的siRNA濃度作為存在於LNP外液中的siRNA，以利用1% Triton X-100稀釋而測得的siRNA濃度作為製劑中的總siRNA濃度，算出封入率)。平均粒徑(Z-平均)利用粒徑測定裝置(Malvern，Zetasizer Nano ZS)進行測定。將對製備的LNP的製劑品質進行評估的結果示於表7。
[表6]
Figure 110101897-A0305-02-0041-11
Figure 110101897-A0305-02-0042-12
(體內篩選)
將PBS或封入有表6所記載的siRNA的LNP以0.1mg/kg siRNA對BALB/c小鼠(雄性，6週齡，每組n=3)尾靜脈內給藥，於給藥起5天後及14天後在麻醉下實施採血及採集肝臟。使用RNeasy Plus Mini Kit(Quiagen，Cat#74106)，按照製造商的操作說明，自經液態氮冷凍的肝臟純化出總RNA。然後，使用Prime Script RT Master Mix(Perfect Real Time)(Takara，Cat#RR036A)，按照製造商的操作說明，製備cDNA。進而，使用TaqMan(註冊商標)Gene Expression Master Mix(Applied Biosystem，Cat#4369510)及TaqMan探針(Applied Biosystems，C5：Mm01336776_g1；GAPDH：Mm99999915_g1)，按照製造商的操作說明，利用ABI7500 Fast(Applied Biosystems)測定目標基因小鼠C5、及內參基因小鼠GAPDH的Ct值。將PBS給藥組中給藥5天後的肝臟C5 mRNA殘存率設為100%，利用比較Ct法算出各siRNA給藥組的肝臟C5 mRNA殘存率(相對值)。將結果示於表8。
Figure 110101897-A0305-02-0042-13
將各採集日採集的血液以3000rpm離心15分鐘後，採集上清液的肝素血漿，於-80℃下保存。然後，利用ELISA(enzyme linked immunosorbent assay，酶聯免疫吸附測定)法對血漿中的小鼠C5進行定量。具體而言，利用PBS(-)(Wako，#045-29795)將作為固相化抗體的小鼠抗C5抗體BB5.1(Hycult，Cat#HM1073-FS)稀釋成最終濃度2μg/mL，並將其添加至酶聯板(Nunc，Cat#442404)中，於4℃下溫育一晚。然後，添加封閉液(含有1% BSA(R&D systems，Cat#DY995)的PBS(-)(Wako))，於室溫下溫育1小時。廢棄封閉液，利用洗淨液(含有0.02% Tween20的PBS(-)(Wako))洗淨3次。廢棄洗淨液後，添加經封閉液稀釋的上述肝素血漿樣本，於室溫下溫育5小時。標準樣本設為PBS給藥組的血漿。廢棄樣本後，利用洗淨液洗淨5次，利用封閉液將山羊抗人C5抗體(Quidel，Cat#A306)稀釋4000倍並添加，於室溫下溫育1小時。廢棄上述抗體後，利用洗淨液洗淨5次，利用封閉液將HRP標記驢抗山羊IgG(H+L)(Jackson Immunoresearch，Cat#805-035-180)稀釋40000倍並添加，於室溫下溫育1小時。廢棄上述抗體後，利用洗淨液洗淨5次。然後，將作為檢測試劑的TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine，3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)過氧化物酶底物(KPL，Cat#50-76-01)及過氧化物酶底物溶液B(KPL，Cat#50-65-00)等量混合後添加，使其顯色。添加作為停止液的H2SO4(Wako，Cat#198-09595)後，測定450nm及650nm的吸光度。將PBS給藥組中給藥5天後的血漿中所含的C5濃度設為100%，將各樣本的相對值示於表9。
Figure 110101897-A0305-02-0044-14
[實施例4：體外篩選]
利用亞磷醯胺法合成表10所示的正義股及反義股，然後，將它們退火，合成雙股核酸(GeneDesign公司)。以雙股核酸的最終濃度成為0.003~10nM及RNAiMax的最終濃度成為0.3%的方式製備siRNA/RNAiMax混合液，除此以外，與實施例1同樣地進行試驗，測定Hep3B培養細胞中的目標基因人C5及內參基因人GAPDH的Ct值。與實施例1同樣地，將僅脂轉染時的C5 mRNA表現量設為100%，算出導入了各siRNA時的C5 mRNA殘存率(相對值)。將結果示於表11。
[表10]
Figure 110101897-A0305-02-0045-16
Figure 110101897-A0305-02-0046-38
Figure 110101897-A0305-02-0047-18
[實施例5：體內篩選(突出修飾)]
(siRNA-LNP的製備)
除了使用表12所記載的siRNA以外，與實施例3同樣地製備封入有siRNA的脂質奈米粒子(LNP)。將對製備的LNP的製劑品質進行評估的結果示於表13。
[表12]
Figure 110101897-A0305-02-0048-19
Figure 110101897-A0305-02-0049-20
(體內篩選)
將PBS或封入有表12所記載的siRNA的LNP以0.3mg/kg siRNA對BALB/c小鼠(雄性，6週齡，每組n=3)尾靜脈內給藥，於給藥起5天後、14天後及21天後在麻醉下實施採血及採集肝臟。使用RNeasy Plus Mini Kit(Quiagen，Cat#74106)，按照製造商的操作說明，自經液態氮冷凍的肝臟純化出總RNA。然後，使用PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)(Takara，Cat#RR036A)，按照製造商的操作說明，製備cDNA。進而，使用TaqMan(註冊商標)Gene Expression Master Mix(Applied Biosystem，Cat# 4369510)及TaqMan探針(Applied Biosystems，C5：Mm01336776_g1；GAPDH：Mm99999915_g1)，按照製造商的操作說明，利用ABI7500 Fast(Applied Biosystems)測定目標基因小鼠C5、及內參基因小鼠GAPDH的Ct值。將PBS給藥組中各測定日的肝臟C5 mRNA殘存率設為100%，利用比較Ct法算出siRNA給藥組的肝臟C5 mRNA殘存率(相對值)。將結果示於表14。
Figure 110101897-A0305-02-0050-23
將各採集日採集的血液以3000rpm離心15分鐘後，採集上清液的肝素血漿，於-80℃下保存。然後，利用ELISA法對血漿中的小鼠C5進行定量。具體而言，利用PBS(-)(Wako，#045-29795)將作為固相化抗體的小鼠抗C5抗體BB5.1(Hycult，Cat#HM1073-FS)稀釋成最終濃度2μg/mL，並將其添加至酶聯板(Nunc，Cat#442404)中，於4℃下溫育一晚。然後，添加封閉液(含有1% BSA(R&D systems，Cat#DY995)的PBS(-)(Wako))，於室溫下溫育1小時。廢棄封閉液，利用洗淨液(含有0.02% Tween 20的PBS(-)(Wako))洗淨3次。廢棄洗淨液後，添加經封閉液稀釋的上述肝素血漿樣本，於室溫下溫育5小時。標準樣本設為PBS給藥組的血漿。廢棄樣本後，利用洗淨液洗淨5次，利用封閉液將山羊抗人C5抗體(Quidel，Cat#A306)稀釋4000倍並添加，於室溫下溫育1小時。廢棄上述抗體後，利用洗淨液洗淨5次，利用封閉液將HRP標記驢抗山羊IgG(H+L)(Jackson Immunoresearch，Cat#805-035-180)稀釋40000倍並添加，於室溫下溫育1小時。廢棄上述抗體後，利用洗淨液洗淨5次。然後，將作為檢測試劑的TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine，3,3',5,5'-四 甲基聯苯胺)過氧化物酶底物(KPL，Cat#50-76-01)及過氧化物酶底物溶液B(KPL，Cat#50-65-00)等量混合後添加，使其顯色。添加作為停止液的H2SO4(Wako，Cat#198-09595)後，測定450nm及650nm的吸光度。將PBS給藥組的給藥前一天的血漿中所含的C5濃度設為100%，將各樣本的相對值示於表15。
Figure 110101897-A0305-02-0051-24
對給藥5天後、14天後、21天後肝臟中C5 mRNA殘存量與血漿中C5濃度進行定量，對它們分別進行siRNA-008-34給藥組相對於siRNA-008給藥組的統計分析(未配對T檢驗(unpaired T-test))。將各結果示於圖1及圖2。對P值為0.05以下的組標註*(星號)，對P值為0.01以下的組標註**。
[實施例6：體外分析(序列步移)]
利用亞磷醯胺法合成表16所示的正義股及反義股，然後，將它們退火，合成雙股核酸(GeneDesign公司)。與實施例1同樣地，將僅脂轉染時的C5 mRNA表現量設為100%，算出導入了各siRNA時的C5 mRNA殘存率(相對值)。將結果示於表17。
[表16]
Figure 110101897-A0305-02-0052-25
Figure 110101897-A0305-02-0053-26
[實施例7：藥理試驗(溶血抑制效果)]
(siRNA-LNP的製備)
除了使用表18所示的siRNA以外，與實施例3同樣地製備封入有siRNA的LNP。將對製備的LNP的製劑品質進行評估的結果示於表19。
[表18]
Figure 110101897-A0305-02-0054-27
Figure 110101897-A0305-02-0055-28
(體內評估)
將PBS或封入有表18所記載的siRNA的LNP以1~3mg/kg siRNA對BALB/c小鼠(雄性，6週齡，每組n=3)尾靜脈內給藥，於給藥起5天後及9天後在麻醉下實施採血。將各採集日採集的血液裝入添加了凝固促進劑及血液分離劑的試管(IBL，Cat#31203)中，以3000rpm離心15分鐘後，採集上清液的血清，於-80℃下保存。然後，利用以下的方法對血清中的補體活性進行定量。具體而言，使用血清補體效價CH50套組(DENKA SEIKEN股份有限公司，Cat#400017)，按照製造商的操作說明，將綿羊紅血球製備成1.5×108cells/mL。之後使用血清補體效價CH50套組附帶的稀釋液，將酵母聚糖(Wako，Cat#263-01491)製備成20μg/mL。使用相同的稀釋液，將樣本血清稀釋成40倍。將上述綿羊紅血球、酵母聚糖、及稀釋的血清樣本各50μL加以混合，在37℃下溫育一晚。第二天，在室溫下以2000rpm將酶聯板離心10分鐘後，測定上清液的405nm的吸光度。將各個體的給藥前一天的血清中所含的補體活性設為100%，將各樣本的值示於表20。
Figure 110101897-A0305-02-0055-29
[實施例8：藥理試驗(單次給藥所獲得的溶血抑制效果)]
(siRNA-LNP的製備)
除了使用表21所示的siRNA以外，與實施例3同樣地製備封入有siRNA的LNP。將對製備的LNP的製劑品質進行評估的結果示於表22。
[表21]
Figure 110101897-A0305-02-0057-31
Figure 110101897-A0305-02-0058-32
(體內評估)
將PBS或封入有表21所記載的siRNA的LNP以0.3、1及3mg/kg siRNA對BALB/c小鼠(雄性，7週齡，每組n=4)尾靜脈內給藥。於給藥前一天(表23中的「給藥1天前」)、給藥起7天後、13天後、20天後及27天後在麻醉下實施採血。將各採集日採集的血液裝入添加了凝固促進劑及血液分離劑的試管(IBL，Cat#31203)中，以3000rpm離心15分鐘後，採集上清液的血清，於-80℃下保存。然後，利用以下的方法對血清中的補體活性進行定量。具體而言，使用血清補體效價CH50套組(DENKA SEIKEN股份有限公司，Cat#400017)，按照製造商的操作說明，將綿羊紅血球製備成1.5×108cells/mL。之後使用血清補體效價CH50套組附帶的稀釋液，將酵母聚糖(Wako，Cat#263-01491)製備成20μg/mL。使用相同的稀釋液，將樣本血清稀釋成40倍。將上述綿羊紅血球、酵母聚糖、及稀釋的血清樣本各50μL加以混合，在37℃下溫育一晚。第二天，在室溫下以2000rpm將酶聯板離心10分鐘後，測定上清液的405nm的吸光度。將各個體的給藥前一天的血清中所含的補體活性設為100%，將各樣本的值示於表23。1mg/kg給藥組的1隻小鼠個體的補體活性因被認為係異常值而排除。因此，表23中的1mg/kg給藥組的值係3隻小鼠個體的平均值。表23中的PBS給藥組、0.3mg/kg給藥組及3mg/kg給藥組係4隻小鼠個體的平均值。將結果也示於圖3。
[表23]
Figure 110101897-A0305-02-0059-33
[實施例9：藥理試驗(隔週給藥所獲得的溶血抑制效果)]
(siRNA-LNP的製備)
與實施例8同樣地製備封入有siRNA的LNP。
(體內評估)
將實施例8中的PBS或封入有表21所記載的siRNA的LNP以0.3、1及3mg/kg siRNA隔週對BALB/c小鼠(雄性，7週齡，每組n=4)尾靜脈內給藥。於給藥前一天(表24中的「給藥1天前」)、給藥起7天後、13天後、20天後及27天後在麻醉下實施採血。將各採集日採集的血液裝入添加了凝固促進劑及血液分離劑的試管(IBL，Cat#31203)中，以3000rpm離心15分鐘後，採集上清液的血清，於-80℃下保存。然後，利用以下的方法對血清中的補體活性進行定量。具體而言，使用血清補體效價CH50套組(DENKA SEIKEN股份有限公司，Cat#400017)，按照製造商的操作說明，將綿羊紅血球製備成1.5×108cells/mL。之後使用血清補體效價CH50套組附帶的稀釋液，將酵母聚糖(Wako，Cat#263-01491)製備成20μg/mL。使用相同的稀釋液，將樣本血清稀釋成40倍。將上述綿羊紅血球、酵母聚糖、及稀釋的血清樣本各50μL加以混合，在37℃下溫育一晚。第二天，在室溫下以2000rpm將酶聯板離心10分鐘後，測定上清液的405nm的吸光度。將各個體的給藥前一天的血清中所含的補體活性設為100%，將各樣本的值示於表24。將結果也示於圖4。
[表24]
Figure 110101897-A0305-02-0061-34
[實施例10：藥理試驗(隔週給藥所獲得的溶血抑制效果)]
(siRNA-LNP的製備)
與實施例8同樣地製備封入有siRNA的LNP。
(體內評估)
將實施例8中的PBS或封入有表21所記載的siRNA的LNP以0.3、1及3mg/kg siRNA隔週對BALB/c小鼠(雄性，7週齡，每組n=4)尾靜脈內給藥。於給藥前一天(表25中的「給藥1天前」)、給藥起7天後、13天後、20天後、27天後、34天後、41天後、48天後及55天後在麻醉下實施採血。將各採集日採集的血液裝入添加了凝固促進劑及血液分離劑的試管(IBL，Cat#31203)中，以3000rpm離心15分鐘後，採集上清液的血清，於-80℃下保存。然後，利用以下的方法對血清中的補體活性進行定量。具體而言，使用血清補體效價CH50套組(DENKA SEIKEN股份有限公司，Cat#400017)，按照製造商的操作說明，將綿羊紅血球製備成1.5×108cells/mL。之後使用血清補體效價CH50套組附帶的稀釋液，將酵母聚糖(Wako，Cat#263-01491)製備成20μg/mL。使用相同的稀釋液，將樣本血清稀釋成40倍。將上述綿羊紅血球、酵母聚糖、及稀釋的血清樣本各50μL加以混合，在37℃下溫育一晚。第二天，在室溫下以2000rpm將酶聯板離心10分鐘後，測定上清液的405nm的吸光度。將各個體的給藥前一天的血清中所含的補體活性設為100%，將各樣本的值示於表25。將結果也示於圖5。
[表25]
Figure 110101897-A0305-02-0063-35
[實施例11：藥理試驗(每隔3週給藥所獲得的溶血抑制效果)]
(siRNA-LNP的製備)
與實施例8同樣地製備封入有siRNA的LNP。
(體內評估)
將實施例8中的PBS或封入有表21所記載的siRNA的LNP以0.3、1及3mg/kg siRNA每隔3週對BALB/c小鼠(雄性，7週齡，每組n=4)尾靜脈內給藥。於給藥前一天(表26中的「給藥1天前」)、給藥起7天後、13天後、20天後、27天後、34天後、41天後、48天後及55天後在麻醉下實施採血。將各採集日採集的血液裝入添加了凝固促進劑及血液分離劑的試管(IBL，Cat#31203)中，以3000rpm離心15分鐘後，採集上清液的血清，保存於-80℃下。然後，利用以下的方法對血清中的補體活性進行定量。具體而言，使用血清補體效價CH50套組(DENKA SEIKEN股份有限公司，Cat#400017)，按照製造商的操作說明，將綿羊紅血球製備成1.5×108cells/mL。之後使用血清補體效價CH50套組附帶的稀釋液，將酵母聚糖(Wako，Cat#263-01491)製備成20μg/mL。使用相同的稀釋液，將樣本血清稀釋成40倍。將上述綿羊紅血球、酵母聚糖、及稀釋的血清樣本各50μL加以混合，在37℃下溫育一晚。第二天，在室溫下以2000rpm將酶聯板離心10分鐘後，測定上清液的405nm的吸光度。將各個體的給藥前一天的血清中所含的補體活性設為100%，將各樣本的值示於表26。將結果也示於圖6。
[表26]
Figure 110101897-A0305-02-0065-36
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
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Figure 12_A0101_SEQ_0021
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Figure 12_A0101_SEQ_0023
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Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
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Figure 12_A0101_SEQ_0052
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Figure 12_A0101_SEQ_0166
Figure 12_A0101_SEQ_0167

Claims (10)

  1. 一種醫藥組成物，其含有具有正義股及反義股之組合之雙股核糖核酸，且 正義股及反義股之組合係選自由： 序列編號159及序列編號160、序列編號141及序列編號142、序列編號143及序列編號144、序列編號145及序列編號146、序列編號147及序列編號148、以及序列編號153及序列編號154所組成之群。
  2. 如請求項1之醫藥組成物，其中正義股及反義股之組合具有序列編號159的正義股、及序列編號160的反義股。
  3. 如請求項1之醫藥組成物，其中正義股及反義股之組合具有序列編號141的正義股、及序列編號142的反義股。
  4. 如請求項1之醫藥組成物，其中正義股及反義股之組合具有序列編號143的正義股、及序列編號144的反義股。
  5. 如請求項1之醫藥組成物，其中正義股及反義股之組合具有序列編號145的正義股、及序列編號146的反義股。
  6. 如請求項1之醫藥組成物，其中正義股及反義股之組合具有序列編號147的正義股、及序列編號148的反義股。
  7. 如請求項1之醫藥組成物，其中正義股及反義股之組合具有序列編號153的正義股、及序列編號154的反義股。
  8. 如請求項1至7中任一項之醫藥組成物，其包含脂質複合物，該脂質複合物封入有具有正義股及反義股之組合之雙股核糖核酸。
  9. 如請求項8之醫藥組成物，其中脂質複合物含有 陽離子性脂質、及 選自由中性脂質、聚乙二醇修飾脂質、及固醇所組成之群中的至少一種脂質。
  10. 如請求項9之醫藥組成物，其中陽離子性脂質為1-甲基哌啶-4-羧酸2-{9-側氧基-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基酯。
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