CN112771163A - 能够遏制补体c5的表达的双链核糖核酸 - Google Patents

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Abstract

提供了包含有义链和反义链的组合的双链核糖核酸，其中该有义链和反义链的组合选自由以下组合组成的组：SEQ ID NO:159和160、SEQ ID NO:141和142、SEQ ID NO:143和144、SEQ ID NO:145和146、SEQ ID NO:147和148以及SEQ ID NO:153和154。

Description

能够遏制补体C5的表达的双链核糖核酸
技术领域
本发明涉及能够遏制补体C5的表达的双链核糖核酸(dsRNA)。特别地，本发明涉及双链核糖核酸，包封该双链核糖核酸的脂质复合物、以及包含该双链核糖核酸或所述脂质复合物的补体C5抑制剂和药物组合物。
背景技术
称为补体的蛋白质组包括表示为C1至C9的蛋白质，并且这些蛋白质通过三种不同途径(经典途径、凝集素途径、替代途径)被连续激活，以引起免疫反应。第五补体组分(C5)通过C5转化酶切割为C5a和C5b。C5a被称为过敏毒素，并经由C5aR(CD88)和C5L2(GPR77)诱导各种细胞的炎性反应。C5b按顺序与C6至C9反应以转化为膜攻击复合物(MAC)作为最终产物，其引起病原体的溶菌作用或细胞裂解。如果不能适当控制补体系统或该补体系统被过度激活，则补体系统可能会对宿主细胞产生强烈的细胞毒性。
从先前的研究，已知补体C5与多种疾病有关，该疾病包括阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、非典型溶血尿毒综合征(aHUS)、重症肌无力(MG)、视神经脊髓炎(NMO)、抗体介导的肾移植排斥反应、吉兰-巴雷综合症(Guillain-Barre syndrome)、抗中性粒细胞胞质抗体相关血管炎(ANCA相关血管炎)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、帕金森病(PD)、自身免疫性脑炎、IgG4相关性疾病、哮喘、抗磷脂抗体综合征、缺血-再灌注损伤、典型溶血尿毒综合征(tHUS)、多灶性运动神经病(MMN)、多发性硬化(MS)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自然流产、习惯性流产、创伤性脑损伤、冷凝集素病、皮肌炎、与产志贺样毒素(Shigatoxin-producing)大肠杆菌(E.Coli)相关的溶血性尿毒症综合征、移植物功能障碍、心肌梗死、败血症、动脉粥样硬化、感染性休克、脊髓损伤、银屑病、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、抗磷脂综合征(APS)、心肌炎、免疫复合物血管炎、高安氏病(Takayasu's disease)及川崎病(Kawasaki's disease，动脉炎)。因此，抑制或遏制补体C5的表达有望于成功治疗这些疾病。特别地，补体C5的抑制被认为对治疗或预防阵发性睡眠性血红蛋白尿症(非专利文献1)、非典型溶血尿毒综合征(非专利文献2)、重症肌无力(非专利文献3)、视神经脊髓炎(非专利文献4)和抗体介导的肾移植排斥反应(非专利文献5)是有效的。
抗C5单克隆抗体依库利珠单抗(Soliris(注册商标))展示出对补体C5的高亲和性，且通过抑制C5裂解为C5a/C5b及伴随膜攻击复合物的形成来遏制补体的激活。由此，依库利珠单抗展现出对溶血的抑制作用，且因此作为阵发性睡眠性血红蛋白尿症和非典型溶血尿毒综合征的治疗剂。此外，依库利珠单抗被称为全身性重症肌无力(gMG)的治疗剂。然而，依库利珠单抗价格昂贵，因此希望可以开发适用于治疗和预防补体C5介导的疾病的替代手段。
遏制补体C5表达的方法的实例包括利用RNA干扰的方法(在下文中，也称为“RNAi”)。例如，已知双链核糖核酸(dsRNA)试剂，其经由RNA诱导的沉默复合物(RISC)来诱导C5基因的RNA转录物的裂解(专利文献1)。
引证文献清单
专利文献
[专利文献1]WO 2014/160129
非专利文献
[非专利文献1]非专利文献1：Peter Hillmen等人,The New England Journal ofMedicine[新英格兰医学杂志]2004年2月5日；350(6):552-559。
[非专利文献2]Legendre CM等人,The New England Journal of Medicine[新英格兰医学杂志]2013年6月6日；368(23):2169-2181。
[非专利文献3]Howard JF Jr等人,Muscle Nerve[肌肉神经]2013年7月；48(1):76-84。
[非专利文献4]Pittock SJ等人,The Lancet Neurology[柳叶刀神经病学]2013年6月；12(6):554-562。
[非专利文献5]Stegall MD等人,American Journal of Transplantation[美国移植杂志]2011年11月；11(11):2405-2413。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供用于遏制补体C5表达的新型双链核糖核酸。
解决问题的方案
本发明提供了，例如，如下<1>至<38>。
<1>一种双链核糖核酸，其包含：
有义链和反义链的组合，
其中该有义链和反义链的组合选自由以下组合组成的组：
SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:160；SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:116；SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:118；SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:120；SEQID NO:121和SEQ ID NO:122；SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:124；SEQ ID NO:125和SEQ IDNO:126；SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:128；SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:130；SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:132；SEQ ID NO:133和SEQ ID NO:134；SEQ ID NO:137和SEQ ID NO:138，SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:140；SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:142；SEQ ID NO:143和SEQID NO:144；SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:146；SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:148；SEQ IDNO:149和SEQ ID NO:150；SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:152；和SEQ ID NO:153和SEQ IDNO:154。
<2>一种双链核糖核酸，其包含：
有义链和反义链的组合，
其中该有义链和反义链的组合选自由以下组合组成的组：
SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:160；SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:140；SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:142；SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144；SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:146；SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:148；和SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:154。
<3>一种双链核糖核酸，其包含：
有义链和反义链的组合，
其中该有义链和反义链的组合选自由以下组合组成的组：
SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:160；SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:142；SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144；SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:146；SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:148；和SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:154。
<4>一种双链核糖核酸，其包含：
有义链和反义链的组合，
其中该有义链和反义链的组合选自由以下组合组成的组：
SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:142；SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144；SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:146；SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:148；和SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:154。
<5>一种双链核糖核酸，其包含：
SEQ ID NO:141的有义链；和
SEQ ID NO:142的反义链。
<6>一种双链核糖核酸，其包含：
SEQ ID NO:143的反义链；和
SEQ ID NO:144的反义链。
<7>一种双链核糖核酸，其包含：
SEQ ID NO:145的有义链；和
SEQ ID NO:146的反义链。
<8>一种双链核糖核酸，其包含：
SEQ ID NO:147的有义链；和
SEQ ID NO:148的反义链。
<9>一种双链核糖核酸，其包含：
SEQ ID NO:153的有义链；和
SEQ ID NO:154的反义链。
<10>一种双链核糖核酸，其包含：
SEQ ID NO:159的有义链；和
SEQ ID NO:160的反义链。
<11>一种补体C5抑制剂，其包含：
根据<1>至<10>中任一项所述的双链核糖核酸。
<12>一种药物组合物，其包含：
根据<1>至<10>中任一项所述的双链核糖核酸。
<13>根据<12>所述的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。
<14>根据<12>或<13>所述的药物组合物，其用于治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿症。
<15>根据<12>或<13>所述的药物组合物，其用于治疗非典型溶血尿毒综合征。
<16>一种包封根据<1>至<10>中任一项所述的双链核糖核酸的脂质复合物。
<17>根据<16>所述的脂质复合物，其包含：
阳离子脂质；和
选自由中性脂质、聚乙二醇修饰的脂质及固醇组成的组中的至少一种脂质。
<18>根据<17>所述的脂质复合物，其中该阳离子脂质是2-{9-氧代-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基1-甲基哌啶-4-甲酸酯。
<19>根据<17>所述的脂质复合物，其中该中性脂质是二硬脂酰卵磷脂(DSPC)。
<20>根据<17>所述的脂质复合物，其中该聚乙二醇修饰的脂是MPEG2000-DMG(MPEG2000-双肉豆蔻甘油)。
<21>根据<17>所述的脂质复合物，其中该固醇是胆固醇。
<22>一种补体C5抑制剂，其包含：
根据<16>至<21>中任一项所述的脂质复合物。
<23>一种药物组合物，其包含：
根据<16>至<21>中任一项所述的脂质复合物。
<24>根据<23>所述的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。
<25>根据<23>或<24>所述的药物组合物，其用于治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿症。
<26>根据<23>或<24>所述的药物组合物，其用于治疗非典型溶血尿毒综合征。
<27>一种治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿症的方法，该方法包括：
向有需要的患者施用根据<1>至<10>中任一项所述的双链核糖核酸。
<28>一种治疗非典型溶血性尿毒症综合征的方法，该方法包括：
向有需要的患者施用根据<1>至<10>中任一项所述的双链核糖核酸。
<29>根据<1>至<10>中任一项所述的双链核糖核酸，用于在治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿症中使用。
<30>根据<1>至<10>中任一项所述的双链核糖核酸，用于在治疗非典型溶血性尿毒症综合征中使用。
<31>根据<1>至<10>中任一项所述的双链核糖核酸，在制造用于治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿症药物组合物中的用途。
<32>根据<1>至<10>中任一项所述的双链核糖核酸，在制造用于治疗非典型溶血性尿毒症综合症药物组合物中的用途。
<33>一种治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿症的方法，该方法包括：
向有需要的患者施用根据<16>至<21>中任一项所述的脂质复合物。
<34>一种治疗非典型溶血性尿毒症综合征的方法，该方法包括：
向有需要的患者施用根据<16>至<21>中任一项所述的脂质复合物。
<35>根据<16>至<21>中任一项所述的脂质复合物，用于在治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿症中使用。
<36>根据<16>至<21>中任一项所述的脂质复合物，用于在治疗非典型溶血性尿毒症综合征中使用。
<37>根据<16>至<21>中任一项所述的脂质复合物，在制造用于治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿症药物组合物中的用途。
<38>根据<16>至<21>中任一项所述的脂质复合物，在制造用于治疗非典型溶血性尿毒症综合症药物组合物中的用途。
本发明的有利作用
根据本发明，可以提供能遏制补体C5表达的新型的双链核糖核酸、将核酸包封在脂质复合物中的脂质复合物，以及包含核酸或脂质复合物的补体C5抑制剂和药物组合物。
根据本发明的双链核糖核酸可以遏制补体C5的表达以遏制溶血，且因此可以作为阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)和非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)的治疗剂应用。
附图说明
图1显示了表示实例5中施用siRNA-008后肝C5的mRNA残留率及施用siRNA-008-34后肝C5的mRNA残留率结果的图表；
图2显示了表示实例5中施用siRNA-008后血浆C5残留率及施用siRNA-008-34后血浆C5残留率结果的图表；
图3显示了表示实例8中施用siRNA-008-34后补体活性结果的图表；
图4显示了表示实例9中施用siRNA-008-34后补体活性结果的图表；
图5显示了表示实例10中施用siRNA-008-34后补体活性结果的图表；并且
图6显示了表示实例11中施用siRNA-008-34后补体活性结果的图表。
具体实施方式
根据实施例，编码双链核糖核酸靶向的补体C5的基因的实例包括但不限于源于人、小鼠和猴子的C5。从包括登记的序列信息的公共数据库(例如由美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的GenBank数据库)，或可以通过基于来自密切相关的动物物种的C5的核苷酸序列的信息设计引物、然后用其从提取自所需动物物种的RNA中克隆来获得关于C5基因序列的信息。相对于靶基因人C5的mRNA转录物序列的实例包括以GenBank登录号NM_001735.2(GI:38016946)登记的人C5 mRNA转录物序列。本文中术语“C5基因”不限于具有特定序列的基因。例如，在该术语中也可以包括天然存在的具有单核苷酸多态性的C5基因。
在根据实施例的包含有义链和反义链的双链核糖核酸中，有义链和反义链的组合选自由以下组成的组：SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119和SEQID NO:120、SEQ ID NO:121和SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:124、SEQ IDNO:125和SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133和SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:137和SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:142、SEQID NO:143和SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147和SEQ IDNO:148、SEQ ID NO:149和SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:152以及SEQ IDNO:153和SEQ ID NO:154。这些组合各自对应于本说明书中的siRNA-008、siRNA-008-01、siRNA-008-02、siRNA-008-08、siRNA-008-09、siRNA-008-10、siRNA-008-11、siRNA-008-12、siRNA-008-13、siRNA-008-14、siRNA-008-22、siRNA-008-23、siRNA-008-30、siRNA-008-31、siRNA-008-32、siRNA-008-33、siRNA-008-34、siRNA-008-35、siRNA-008-36、siRNA-008-37和siRNA-008-38的序列。
在根据实施例的双链核糖核酸中，如组合(1)至(21)中任一组的有义链和反义链配对。
(1)SEQ ID NO:13的有义链，和SEQ ID NO:14的反义链
(2)SEQ ID NO:159的有义链，和SEQ ID NO:160的反义链
(3)SEQ ID NO:115的有义链，和SEQ ID NO:116的反义链
(4)SEQ ID NO:117的有义链，和SEQ ID NO:118的反义链
(5)SEQ ID NO:119的有义链，和SEQ ID NO:120的反义链
(6)SEQ ID NO:121的有义链，和SEQ ID NO:122的反义链
(7)SEQ ID NO:123的有义链，和SEQ ID NO:124的反义链
(8)SEQ ID NO:125的有义链，和SEQ ID NO:126的反义链
(9)SEQ ID NO:127的有义链，和SEQ ID NO:128的反义链
(10)SEQ ID NO:129的有义链，和SEQ ID NO:130的反义链
(11)SEQ ID NO:131的有义链，和SEQ ID NO:132的反义链
(12)SEQ ID NO:133的有义链，和SEQ ID NO:134的反义链
(13)SEQ ID NO:137的有义链，和SEQ ID NO:138的反义链
(14)SEQ ID NO:139的有义链，和SEQ ID NO:140的反义链
(15)SEQ ID NO:141的有义链，和SEQ ID NO:142的反义链
(16)SEQ ID NO:143的有义链，和SEQ ID NO:144的反义链
(17)SEQ ID NO:145的有义链，和SEQ ID NO:146的反义链
(18)SEQ ID NO:147的有义链，和SEQ ID NO:148的反义链
(19)SEQ ID NO:149的有义链，和SEQ ID NO:150的反义链
(20)SEQ ID NO:151的有义链，和SEQ ID NO:152的反义链
(21)SEQ ID NO:153的有义链，和SEQ ID NO:154的反义链
组合(1)至(21)中每一组的有义链和反义链包括彼此互补的区域。例如，包括SEQID NO:13的有义链和SEQ ID NO:14的反义链的组合(1)的双链核糖核酸包括以下互补链(3'-末端的dT^dT未显示，更多细节参见表1)。
5'-uGGuAuAuGuGuuGcuGAu-3'(SEQ ID NO:13)
3'-AcCAuAuAcAcAAcGAcUA-5'(SEQ ID NO:14)
在根据实施例的包含有义链和反义链的双链核糖核酸中，有义链和反义链的组合选自由以下组成的组：SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145和SEQID NO:146、SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:148以及SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:154。这些组合各自对应于本说明书中的siRNA-008-01、siRNA-008-31、siRNA-008-32、siRNA-008-33、siRNA-008-34、siRNA-008-35和siRNA-008-38的序列。
在根据实施例的包含有义链和反义链的双链核糖核酸中，有义链和反义链的组合选自由以下组成的组：SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147和SEQID NO:148以及SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:154。这些组合各自对应于本说明书中的siRNA-008-01、siRNA-008-32、siRNA-008-33、siRNA-008-34、siRNA-008-35和siRNA-008-38的序列。
在根据实施例的包含有义链和反义链的双链核糖核酸中，有义链和反义链的组合选自由以下组成的组：SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:148以及SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:154。这些组合各自对应于本说明书中的siRNA-008-32、siRNA-008-33、siRNA-008-34、siRNA-008-35和siRNA-008-38的序列。
根据实施例的包含有义链和反义链的双链核糖核酸包括SEQ ID NO:159的有义链和SEQ ID NO:160的反义链。该组合对应于本说明书中的siRNA-008-01的序列。
根据实施例的包含有义链和反义链的双链核糖核酸包括SEQ ID NO:141的有义链和SEQ ID NO:142的反义链。该组合对应于本说明书中的siRNA-008-32的序列。
根据实施例的包含有义链和反义链的双链核糖核酸包括SEQ ID NO:143的有义链和SEQ ID NO:144的反义链。该组合对应于本说明书中的siRNA-008-33的序列。
根据实施例的包含有义链和反义链的双链核糖核酸包括SEQ ID NO:145的有义链和SEQ ID NO:146的反义链。该组合对应于本说明书中的siRNA-008-34的序列。
根据实施例的包含有义链和反义链的双链核糖核酸包括SEQ ID NO:147的有义链和SEQ ID NO:148的反义链。该组合对应于本说明书中的siRNA-008-35的序列。
根据实施例的包含有义链和反义链的双链核糖核酸包括SEQ ID NO:153的有义链和SEQ ID NO:154的反义链。该组合对应于本说明书中的siRNA-008-38的序列。
根据实施例的反义链基本上与C5基因的mRNA转录物的至少一部分互补。本文中，短语“基本上互补”不只包括反义链与C5基因的mRNA转录物的一部分完全互补的情况，也包括在反义链和C5基因的mRNA转录物的一部分之间有一个或几个可接受的错配。
根据实施例的有义链基本上与反义链的核苷酸序列的至少一部分互补。短语“基本上互补”不只包括有义链与反义链的核苷酸序列的一部分完全互补的情况，也包括在有义链和反义链的核苷酸序列的一部分之间有一个或几个可接受的错配。短语“完全互补”可以用于当较长的有义链和反义链的寡核苷酸包括与较短的寡核苷酸完全互补的核苷酸序列的情况。
根据实施例的双链核糖核酸也包括经修饰的核苷酸，如后文描述(参见表1)。因此，本文所使用的术语“核苷酸”不仅旨在是指鸟嘌呤核苷-3'-磷酸盐、胞嘧啶核苷-3'-磷酸盐、腺嘌呤核苷-3'-磷酸盐和尿嘧啶核苷-3'-磷酸盐，也包含了各种经修饰的核苷酸。
在本文中术语“双链核糖核酸”或“dsRNA”是指具有双链结构的核糖核酸(RNA)分子，其包含两个反向平行、基本上互补的寡核苷酸或其复合物。本文中双链核糖核酸的实例包括但不限于siRNA(小干扰RNA)。根据实施例的双链核糖核酸包含有义链和反义链。通过使用根据实施例的双链核糖核酸的RNAi，C5基因的mRNA被裂解为在RISC复合物中的目标mRNA分子，且结果是遏制了C5的表达。例如，遏制受试者的细胞中C5的表达。
根据实施例的双链核糖核酸可以通过例如，使用本领域已知的化学合成方法(例如，Nucleic Acid Research,[核酸研究]35(10),3287-96(2007)中所描述)和酶转录来合成。
根据实施例的双链核糖核酸包括各种修饰。可以通过使用本领域已知的方法来进行修饰。修饰的实例包括糖修饰。
糖修饰的实例包括修饰构成核糖核苷的核糖部分，特别地，在2'-位点在羟基基团上的取代或添加，更具体地，其中用甲氧基基团取代羟基基团的2'-O-甲基修饰的核苷酸。在表1中以小写字母a、u、g和c表示的核苷酸是2'-O-甲基修饰的核苷酸，且根据实施例的双链核糖核酸的有义链和反义链各自包括2'-O-甲基修饰的核苷酸。
可以通过在有义链和反义链形成双链的区域的3’端或5’端插入额外的核苷酸或核苷酸衍生物(即称为突出端)来修饰双链核糖核酸。根据实施例的双链核糖核酸包括在3’-末端含有脱氧胸苷(dT)的有义链和/或反义链，如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14，且包括含有反向脱氧胸苷(idT)的有义链和/或反义链，如SEQ ID NO:129。根据实施例的双链核糖核酸也包括含有U、A等(作为突出端序列添加)的有义链和/或反义链，例如含有UUUU，在反义链的3’-末端添加，如SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:142。
可替代地，双链核糖核酸可以通过磷酸二酯键的修饰或取代来实现主链修饰。磷酸二酯键修饰或取代的实例包括硫代磷酸酯键。根据实施例的双链核糖核酸也包括包含与硫代磷酸酯键连接的邻近核苷酸，如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:121。
根据实施例的双链核糖核酸可以通过使用本领域已知的化学方法(例如，转染)、物理方法(例如，电穿孔、微注射)或生物学方法(例如，病毒载体)引进受试者的细胞。
转染是将核酸结合到带正电的物质(例如脂质体和多聚体)上以形成复合物，然后通过内吞作用将复合物吸引到带负电的细胞表面以使细胞与复合物合并的方法。可以通过使用已知的方法进行转染，且可以通过使用商业上可获得的转染试剂(例如，来自宝生物工程株式会社(Takara Bio Inc.)的TransIT(注册商标)系列，来自英杰公司(Invitrogen)的Lipofectamine(注册商标)系列)以简单的方式进行转染。
核酸分子容易被活体内存在的核糖核酸酶降解，且每个核酸分子本身是带负电的多聚体，且因此核酸分子很难穿过也带负电的细胞膜。作为将具有此类性质的核酸分子递送到细胞质的有效方法，已经开发了使用脂质复合物、多聚体或类似物的药物递送系统(DDS)的技术。
(脂质复合物)
在一些实施例中，提供了包含以下的脂质复合物：(I)双链核糖核酸、(II)阳离子脂质和(III)选自由中性脂质、聚乙二醇修饰的脂质(PEG脂质)及固醇组成的组中的至少一种脂质。本文的脂质复合物的实例包括但不限于LNP(脂质纳米颗粒)。
由含有阳离子脂质的脂质和双链核糖核酸形成的复合物的形式的实例包括双链核糖核酸及由脂质单层(单个分子)(反胶团)组成的膜的复合物；双链核糖核酸及脂质体的复合物；双链核糖核酸及胶束的复合物。在根据本发明的实施例的脂质复合物中，双链核糖核酸被包封在包含脂质(含有阳离子脂质)的细颗粒中。
根据实施例的脂质复合物以如下量含有双链核糖核酸，例如按脂质复合物总重的重量计，0.01％到50％、0.1％到30％、或1％到10％。
阳离子脂质是具有包括一个或多个烃基团的亲脂性区域、和在特定pH下经历质子化的极性基团的亲水性区域的两亲分子。根据实施例的阳离子脂质的实例包括但不限于在国际公开号WO 2015/105131、WO 2016/104580和WO 2017/222016中描述的阳离子脂质，以及可替代地可以使用国际公开号WO 2016/104580或WO 2017/222016中描述的具有改进了的生物可降解性的阳离子脂质。根据实施例的阳离子脂质的实例包括1-氧代-1-(十一烷-5-基氧基)十九烷-10-基-1-甲基哌啶-4-甲酸酯、1-((2-丁基辛基)氧基)-1-氧代十九烷-10-基-1-甲基哌啶-4-甲酸酯、1-氧代-1-(十一烷-5-基氧基)十七烷-8-基-1-甲基哌啶4-甲酸酯、21-氧代-21-(十一碳-5-基氧基)二十一烷-10-基-1-甲基哌啶4-甲酸酯、21-(辛烷-3-基氧基)-21-氧代二十一烷-10-基-1-甲基哌啶-4-甲酸酯、1-((2-丁基辛基)氧基)-1-氧代二十烷-10-基-1-甲基哌啶-4-甲酸酯、(Z)-1-((2-丁壬-3-烯-1-基)氧基)-1-氧代二十烷-10-基-1-甲基哌啶-4-甲酸酯、1-氧代-1-((3-戊基辛基)氧基)二十烷-10-基-1-甲基哌啶-4-甲酸酯、1-((3,4-二丙基庚基)氧基)-1-氧代二十烷-10-基-1-甲基哌啶-4-甲酸酯、1-((6-(丁基二硫烷基)-3-(3-(丁基二硫烷基)丙基)己基)氧基)-1-氧代二十烷-10-基-1-甲基哌啶-4-甲酸酯、2-丁基辛基-10-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)二十烷酸酯、2-{9-[(2-丁基辛基)氧基]-9-氧代壬基}十二烷基1-甲基哌啶-4-甲酸酯、2-{9-氧代-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基1-甲基哌啶-4-甲酸酯、2-壬基-11-氧代-11-[(3-戊基辛基)氧基]十一基1-甲基哌啶-4-甲酸酯、双(3-戊基辛基)9-{[(1-甲基哌啶-4-羰基)氧基]甲基}十七烷二酸酯、和二[(Z)-2-壬烯-1-基]9-{[(1-甲基哌啶-4-羰基)氧基]甲基}十七烷二酸酯。在实施例中，阳离子脂质是2-{9-氧代-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基1-甲基哌啶-4-甲酸酯。
根据实施例的脂质复合物以如下量含有上述阳离子脂质，例如基于该脂质复合物中所含的总脂质，10到100mol％、20到90mol％、或40到70mol％。可以单独使用一种阳离子脂质，也可以使用两种或更多种阳离子脂质的混合物。
根据实施例的脂质复合物包含(I)上文描述的阳离子脂质和(II)选自由中性脂质、聚乙二醇修饰的脂质和固醇组成的组中的至少一种脂质作为脂质组分。根据实施例的脂质复合物以如下量含有脂质组分，例如按脂质复合物总重的重量计，50％至99.99％、70％到99.9％或90％到99％。
术语“中性脂质”是指在生理pH下以不带电的形式或以中性两性离子存在。根据实施例的中性脂质的实例包括二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、蛋磷脂酰胆碱(EPC)、二肉豆蔻磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二花生酰基磷脂酰胆碱(DAPC)、二苯酰磷脂酰胆碱(DBPC)、二木质葡萄糖基磷脂酰胆碱(DLPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、鞘磷脂、神经酰胺、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)。在实施例中，中性脂质是二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。可以单独使用一种中性脂质，也可以使用两种或更多种中性脂质的混合物。
根据实施例的脂质复合物能以如下量含有中性脂质，例如基于该脂质复合物中所含的总脂质，0到50mol％、0到40mol％、0到30mol％、或0到20mol％。
根据实施例的聚乙二醇修饰的脂质(PEG脂质)的实例包括PEG2000-DMG(PEG2000-二肉豆蔻甘油)、MPEG2000-DMG(MPEG2000-二肉豆蔻甘油)、PEG2000-DPG(PEG2000-二棕榈酰甘油)、PEG2000-DSG(PEG2000-二硬脂酰甘油)、PEG5000-DMG(PEG5000-二肉豆蔻甘油)、PEG5000-DPG(PEG5000-二棕榈酰甘油)、PEG5000-DSG(PEG5000-二硬脂酰甘油)、PEG-cDMA(N-[(甲氧基聚(乙烯乙二醇)2000)氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺)、PEG-C-DOMG(R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙烯乙二醇)2000)氨基甲酰基)]-1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺)、聚乙二醇(PEG)-二酰甘油(DAG)、PEG-二烷基氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂和PEG-神经酰胺(Cer)。PEG-二烷基氧基丙基的实例包括PEG-二月桂氧基丙基、PEG-二肉豆蔻氧基丙基、PEG-二棕榈基氧基丙基、PEG-二硬脂基氧基丙基。在实施例中，聚乙二醇修饰的脂质是MPEG2000-DMG(MPEG2000-二肉豆蔻甘油)。可以单独使用一种聚乙二醇修饰的脂质，也可以使用两种或更多种聚乙二醇修饰的脂质的混合物。
根据实施例的脂质复合物能以如下量含有聚乙二醇修饰的脂质例如基于该脂质复合物中所含的总脂质，0到30mol％、0到20mol％、0到10mol％、或0.5到2mol％。
固醇是具有类固醇主链的醇。根据实施例的固醇的实例包括胆固醇、二氢胆固醇、羊毛固醇、β-谷固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、麦角固醇、岩藻固醇、和3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙基)氨基甲酰]胆固醇(DC-Chol)。在实施例中，固醇是胆固醇。可以单独使用一种固醇，也可以使用两种或更种固醇的混合物。
根据实施例的脂质复合物能以如下量含有固醇，例如基于该脂质复合物中所含的总脂质，0到90mol％、10到80mol％、或20到40mol％。
根据实施例的脂质复合物中脂质组分的组合并不特别地受限制，且其实例包括上文所描述的阳离子脂质、中性脂质和固醇的组合，以及上文所描述的阳离子脂质、中性脂质、聚乙二醇修饰的脂质和固醇的组合。
根据实施例的包封双链核糖核酸的脂质复合物包含阳离子脂质/中性脂质/聚乙二醇修饰的脂质/固醇的脂质组分，并且脂质的摩尔比可以是，例如，10至99/0至50/0至10/0至50或40至70/0至20/0.5至2/20至40。
根据本发明的包封双链核糖核酸的脂质复合物的“平均粒径”是指Z-平均粒径。根据实施例的包封双链核糖核酸的脂质复合物的平均粒径(Z-平均)通过使用粒度分析器(马尔文帕纳科公司(Malvern Panalytical Ltd.)，Zetasizer Nano ZS)测量可以是，例如，10至1000nm、30至500nm，或30至200nm，虽然平均粒径并不是特别受限制。
可以计算根据实施例的包封双链核糖核酸的脂质复合物的siRNA包封效率，例如，从无RNA酶的水(RNase Free Water)稀释的制剂中siRNA浓度(假设其为存在于LNP外部溶液中siRNA的浓度)，以及从用1％Triton X-100稀释的制剂中siRNA浓度(假设其为制剂中siRNA的总浓度)，其中通过使用Quant-iT RiboGreen RNA试剂(英杰公司，目录号R11491)来测量siRNA浓度(参见Kewal K.Jain,Drug Delivery System,[药物递送系统]Methodsin Molecular Biology,[分子生物学方法]1141期:109-120)。用这种方式计算的包封效率优选为，例如，高于80％、高于85％、或高于90％。优选地根据实施例的包封双链核糖核酸的脂质复合物的siRNA包封效率是高于90％。
<制备脂质复合物的方法>
用于将有效分子包封进脂质复合物中的方法的实例包括反相蒸发法、两性离子(NaCl)水和法、阳离子水和法以及使用乙醇和钙的方法(参见Biomembr.,[生物能学和生物膜杂志]1468,239-252(2000))。根据实施例的包封双链核糖核酸的脂质复合物可以通过使用本领域已知的这些方法来制备。
根据实施例的包封双链核糖核酸的脂质复合物可以通过，例如，将含有阳离子脂质和选自由中性脂质、聚乙二醇修饰的脂质和固醇组成的组中的至少一种脂质的脂质溶液，以及含有双链核糖核酸的酸性缓冲液混合来制备。通过使用这样的方法，可以得到在脂质复合物内充满双链核糖核酸的核和脂质。根据实施例的包封双链核糖核酸的脂质复合物可能含有阳离子脂质和选自由中性脂质、聚乙二醇修饰的脂质和固醇组成的组中的至少一种脂质。
根据实施例的包封双链核糖核酸的脂质复合物可以通过使用包括以下步骤的方法来制备：步骤(a)将含有(I)阳离子脂质和(II)选自由中性脂质、聚乙二醇修饰的脂质和固醇组成的组中的至少一种脂质的含极性有机溶剂的水溶液，与含有(III)双链核糖核酸的水溶液混合，以获得混合溶液；和步骤(b)降低该混合溶液中极性有机溶剂的含量。
通过双链核糖核酸和阳离子脂质(每个为可溶的)之间的静电作用，以及脂质间的疏水相互作用，可以形成将双链核糖核酸包封在包含脂质的细颗粒中的脂质复合物。例如，可以通过降低混合溶液中极性有机溶剂的含量以改变极性有机溶剂的水溶液中脂质组分的溶解度，从而形成脂质复合物，这些脂质组分包含(I)阳离子脂质以及(II)选自由中性脂质、聚乙二醇改性的脂质和固醇组成的组的至少一种脂质的。极性有机溶剂的实例包括醇，例如乙醇。
首先，在步骤(a)中，将其中溶解有含有(I)阳离子脂质和(II)选自由中性脂质、聚乙二醇修饰的脂质和固醇组成的组中的至少一种脂质的含极性有机溶剂的水溶液，与含有(III)双链核糖核酸的水溶液混合，以获得混合溶液。含极性有机溶剂的水溶液中的极性有机溶剂的浓度没有特别限制，只要即使与含有双链核糖核酸的水溶液混合后也满足溶解脂质分子的条件即可。在实例中，步骤(a)中的含极性有机溶剂的水溶液中的极性有机溶剂的浓度按重量计可以是0％至60％。含有(III)双链核糖核酸的水溶液通过，例如，将双链核糖核酸溶解于酸性缓冲液中来获得。
随后，在步骤(b)中，通过向混合溶液中加水或类似物来减少极性有机溶剂的含量。由此，可以形成脂质复合物。对于有效形成脂质复合物，快速降低极性有机溶剂的含量是优选的。在实例中，在步骤(b)中最终含极性有机溶剂的水溶液中的极性有机溶剂的浓度按重量计可以是0％至5％。
可以对步骤(a)中获得的混合溶液进行透析以除去极性有机溶剂，并用药学上可接受的介质取代溶剂。在透析期间溶液中极性有机溶剂的含量减少，借此可以形成脂质复合物。
通过使用用于产生根据实施例的组合物的方法，能以高包封效率获得将双链核糖核酸包封在细颗粒内部的脂质复合物。
在其中溶解双链核糖核酸的酸性缓冲液的实例包括硫酸缓冲液、磷酸缓冲液、邻苯二甲酸盐缓冲液、酒石酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、甲酸盐缓冲液、草酸缓冲液和乙酸盐缓冲液。
在其中溶解脂质的溶剂的实例包括极性有机溶剂，例如醇，并且溶剂可以是，例如，乙醇、异丙醇、氯仿或叔丁醇。
(补体C5抑制剂和药物组合物)
如上文所描述，可以通过使用根据实施例的双链核糖核酸通过RNAi抑制补体C5的表达。据此，可以提供含有根据实施例的双链核糖核酸或包封双链核糖核酸的脂质复合物的补体C5抑制剂和药物组合物。补体C5抑制剂和药物组合物可以含有除根据实施例的双链核糖核酸或包封双链核糖核酸的脂质复合物之外的药学上可接受的载体。
药学上可接受的载体的实例包括液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、生产辅助剂和溶剂包封材料。
根据实施例的药物组合物可以是，例如，通过冻干法或类似方法除去溶剂获得的粉末形式或液体形式。根据实施例的药物组合物是含有根据上述实施例中任一项的脂质复合物的粉末组合物。可以通过除去液体(分散体)形式组合物中的溶剂来制备粉末组合物，例如，通过过滤或离心分离，或通过冻干分散体。在药物组合物是粉末形式的情况中，该药物组合物在使用前可以悬于或溶解于药学上可接受的介质中，且作为注射剂使用。根据实施例的药物组合物是含有根据上述实施例中任一项的脂质复合物和药学上可接受的介质的液体组合物。在药物组合物是液体形式的情况中，该药物组合物可以直接用作注射剂，或者可以悬于或溶解于药学上可接受的介质中，且作为注射剂使用。
通过将根据实施例的补体C5抑制剂或药物组合物施用于有需要的受试者，可以通过RNAi抑制受试者中补体C5的表达。在此，“有需要的受试者”是指受试者表现出患有与C5基因的表达或活化相关的疾病或障碍，或被确定对此具有高发展风险的受试者。
在一些实施例中，双链核糖核酸可以抑制补体C5的表达，且因此含有双链核糖核酸或包封双链核糖核酸的脂质复合物的补体C5抑制剂或药物组合物可以对治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)和非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)有用。因此，在其他实施例中提供了用于治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿症或非典型溶血性尿毒症综合征的方法，该方法包括施用治疗有效量的根据实施例的补体C5抑制剂或药物组合物。在其他实施例中提供了，根据实施例的双链核糖核酸或包封根据实施例的双链核糖核酸的脂质复合物在制备用于阵发性睡眠性血红蛋白尿症或非典型溶血性尿毒症综合征的治疗药物中的用途。在其他实施例中，提供了根据实施例的双链核糖核酸或包封根据实施例的双链核糖核酸的脂质复合物用于在治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿症或非典型溶血性尿毒症综合征的方法中使用。
根据实施例的双链核糖核酸或包封根据实施例的双链核糖核酸的脂质复合物在治疗方案中可以单独使用，或与其他试剂或组合物组合使用。例如，根据实施例的双链核糖核酸或包封根据实施例的双链核糖核酸的脂质复合物可以与另一试剂同时施用或分开施用。这样的组合疗法包括组合施用(一种制剂或不同制剂中有两种或更多种试剂)和分别施用(例如，同时或顺序)。如果两种或更多种试剂分开施用，根据实施例的双链核糖核酸或包封根据实施例的双链核糖核酸的脂质复合物可以在伴随治疗方法之前或之后施用。
施用含有根据实施例的双链核糖核酸或包封根据实施例的双链核糖核酸的脂质复合物的补体C5抑制剂或药物组合物的受试者不受限制，且受试者可以是，例如人类或非人哺乳动物(如猴子、小鼠、大鼠、兔子、牛、马、羊)。
向受试者施用含有根据实施例的双链核糖核酸或包封根据实施例的双链核糖核酸的脂质复合物的补体C5抑制剂或药物组合物的方法(例如施用途径、剂量、每日施用频率、施用时间)不受限制，且适当地可以取决于本领域的普通技术人员(例如，内科医生)，根据受试者的健康状况、疾病的程度、组合中试剂的类型来决定。
(施用方法)
根据实施例的补体C5抑制剂和药物组合物的施用模式没有特别地受限制，并且可以是非消化道施用，且其实例包括静脉内施用、肌内施用、皮下施用、真皮内施用及鞘内施用。
根据实施例的补体C5抑制剂和药物组合物可以以取决于施用模式足以抑制补体C5的量施用。根据实施例的补体C5抑制剂和药物组合物的剂量可以是，例如，以每kg受试者体重计0.01mg至100mg、或0.1mg至50mg、或0.3mg至10mg。
本领域普通技术人员理解，可以通过本文所述的所有实施例中的任何一个或多个的适当组合来实施本发明，除非该组合引起了技术矛盾。此外，本领域普通技术人员理解，优选地，用本文所述的所有优选或有利实施例中的任何一个的适当组合来实施本发明，除非该组合引起了任何技术矛盾。
本文提及的文献中披露的所有内容均通过引用以其整体并入，并且根据本说明书的上下文，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可以引用和理解文献中披露的相关内容作为本说明书的一部分。
在本文中引用的文献仅是为了披露本申请的申请日前的相关技术而提供，不得解释为承认诸位发明人由于任何在先发明或任何其他原因而自认对本公开没有优先权。文献中所有的描述都是基于申请人可以获得的信息，且绝不构成对所描述内容正确的承认。
本文中所用的术语是用于描述特定的实施例，并非意在限定本发明。
除非上下文明显要求有不同的理解，否则本文中的术语“包含”意指所提及事物的存在(例如，成员、步骤、元素、或数字)，且不排除存在另一事物(例如，成员、步骤、元素、或数字)。术语“由……组成”涵盖以术语“由……组成”和/或“基本上由……组成”所描述的实施例。
除非另外定义，本文所用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。除非另有说明，否则本文中所用的每个术语应该理解为具有符合本说明书和相关领域的意义，且不应解释为相对于理想化的或过于字面的意思。
当术语例如“第一”和“第二”用于表达各种元素，应认识到这些元素不受这些术语本身的限制。这些术语仅用于区分一个元素与另一个元素，并且例如，类似地在不偏离本发明的范围的情况下是可以接受将第一元素表达为“第二元素”并把第二元素表达为“第一元素”(类似地)。
除非另外说明，否则在本文中用数值来表示组分含量、数值范围等，并应理解为以术语“大约”修饰。例如，除非另外说明，否则“4℃”应理解为表示“大约4℃”，且无需说明，本领域普通技术人员可以根据公共常识和本说明书的上下文，合理地理解容差。
除非上下文清楚地表明，否则，在本文中的实施例和权利要求中使用的单数形式应理解为允许复数形式，反之亦然，只要不会引起技术矛盾。
在下文中，将参考实例更加详细地描述本发明。然而，本发明可以通过各种实施例来体现，并且不应解释为限于本文中所描述的实例。本领域的普通技术人员在不改变本发明的精神和范围下，可以通过各种修饰、添加、删减、替换等来实现本发明。
实例
[实例1：单次施用(1)的体外筛查]
(制备双链核糖核酸)
表2中列出的有义链和反义链通过使用亚磷酰胺方法来合成，然后退火以合成双链核糖核酸(基因设计有限公司(GeneDesign))。序列中的缩写如表1中所示。每个合成的双链核糖核酸在每个3’-末端有一个羟基基团而不是磷酸酯基团。
[表1]
缩写 核苷酸
A 腺嘌呤核苷-3'-磷酸酯
U 尿嘧啶核苷-3'-磷酸酯
G 鸟嘌呤核苷-3'-磷酸酯
C 胞嘧啶核苷-3'-磷酸酯
a 2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯
u 2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯
g 2'-O-甲基鸟嘌呤-3'-磷酸酯
c 2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯
dT 脱氧-胸苷
(idT) 反向脱氧-胸苷(反向dT)
^ 硫代磷酸酯键
没有符号表明核苷酸是经由硫代磷酸键连接的
[表2]
Figure BDA0002993311810000241
Figure BDA0002993311810000251
(体外筛查)
用Opti-MEM培养基(来自吉布科公司(Gibco)，目录号：31985062)稀释与转染试剂Lipofectamine RNAiMax(来自英杰公司，目录号：13778150)的组合的表2中列出的每个双链核糖核酸，来制备最终浓度为3nM的双链核糖核酸和0.3％RNAiMax的siRNA/RNAiMax混合溶液。该siRNA/RNAiMax混合溶液在96孔培养板的孔中等分为每部分20μL，并将Hep3B细胞(从ATCC获得)作为衍生自人肝癌的细胞系以20000细胞/80μL/孔接种在每个孔中，并在37℃以及5％CO2的条件下培养过夜。从培养的细胞中，通过使用用于RT-PCR(实时)的CellAmp(注册商标)Direct RNA Prep试剂盒(来自宝生物工程株式会社，目录号：3732)和蛋白酶K(来自宝生物工程株式会社，目录号：9034)，根据宝生物工程株式会社提供的方案来制备用于实时PCR的模板溶解产物。在此之后，通过使用PrimeScript(注册商标)RT Master Mix(Perfect Real Time)(来自宝生物工程株式会社，目录号：RR036A)通过宝生物工程株式会社提供的方案来制备cDNA。此外，通过使用EagleTaq Universal Master Mix(ROX)(来自罗氏诊断公司(Roche Diagnostics K.K.)，目录号：07260296190)和TaqMan探针(来自应用生物系统公司(Applied Biosystems)，C5：Hs00156197_m1；GAPDH：Hs02758991_g1)与ABI7900HT实时PCR系统(来自应用生物系统公司)，根据应用生物系统公司提供的方案来测靶基因量人C5和内源对照基因人GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的Ct值。在仅用转染试剂处理不添加siRNA的情况下处理Hep3B细胞时的C5 mRNA的表达水平定义为100％，且每次引入siRNA，通过使用校准曲线来计算C5 mRNA的残留率(相对值)。作为阴性对照，使用不与任何人类基因交叉的模拟。
结果如表3中所示。
[表3]
Figure BDA0002993311810000271
[实例2：单次施用(2)的体外筛查]
(制备双链核糖核酸)
表4中列出的有义链和反义链通过使用亚磷酰胺方法来合成，然后退火以合成双链核糖核酸(基因设计有限公司)。
[表4]
Figure BDA0002993311810000291
Figure BDA0002993311810000301
(体外筛查)
以与实例1相同的方式进行测试来测量在培养的Hep3B细胞中靶基因人C5和内源对照基因人GAPDH的Ct值，除了制备的siRNA/RNAiMax混合溶液的最终浓度为1nM的双链核糖核酸和0.3％RNAiMax。如在实例1中，在仅Lipofection的条件下C5 mRNA的表达水平定义为100％，并计算每次引入siRNA时C5 mRNA的残留率(相对值)。
结果如表5中所示。在除了siRNA-008-29外的所有双链核糖核酸中都发现C5 mRNA残留率降低，说明C5的表达被遏制。
[表5]
Figure BDA0002993311810000321
[实例3：体内筛查(序列发现)]
(siRNA-LNP的制备)
将表6中列出的每个siRNA溶解于10mM柠檬酸钠(pH 4.0)中以制备稀释的siRNA溶液。通过在乙醇中以60/10.5/28/1.5的摩尔率来溶解2-{9-氧代-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基1-甲基哌啶-4-甲酸酯、DSPC(日本精细化工有限公司(NIPPON FINE CHEMICALCO.,LTD.))、胆固醇(日本精细化工有限公司)和MPEG2000-DMG(日本油脂株式会社(NOFCORPORATION))来制备脂质溶液。通过分别以3mL/min和1mL/min的流速混合稀释的siRNA溶液和脂质溶液来获得脂质纳米颗粒(LNP)，其中siRNA/脂质的重量比为0.1。通过使用Float-A-Lyzer G2(SPECTRUM，100K MWCO)进行渗析，将所得LNP水溶液的外部溶液用PBS(pH 7.4)取代。在渗析后，将所得物进行浓缩和过滤灭菌，用于在实验中使用。通过使用Quant-iT RiboGreen RNA试剂(英杰公司，目录号R11491)来测量siRNA浓度和包封效率。为计算包封效率，在用无RNA酶的水稀释后测量的siRNA浓度被假定为LNP外部溶液中存在的siRNA的浓度，并且在用1％Triton X-100稀释后测量的siRNA浓度被假定为制剂中siRNA的总浓度。通过使用粒度分析器(马尔文帕纳科公司，Zetasizer Nano ZS)来测量平均粒径(Z-平均)。制备的LNP的产品质量的评价结果如表7中所示。
[表6]
Figure BDA0002993311810000341
[表7]
Figure BDA0002993311810000351
(体内筛查)
将包封列于本文表6中的PBS或siRNA的LNP从尾静脉以0.1mg/kg siRNA的剂量静脉内施用于BALB/c小鼠(雄性，6周龄，n＝3/组)，并在麻醉下在施用后5天和14天将血液和肝脏作为样品。从用液氮冷冻的肝脏中，用RNeasy Plus Mini试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，目录号74106)，根据制造商所提供的方案来纯化总RNA。在此之后，通过使用PrimeScriptRT Master Mix(Perfect Real Time)(宝生物工程株式会社，目录号RR036A)，根据制造商所提供的方案来制备cDNA。此外，通过使用TaqMan(注册商标)Gene Expression MasterMix(应用生物系统公司，目录号4369510)和TaqMan探针(应用生物系统公司，C5:Mm01336776_g1；GAPDH:Mm99999915_g1)以及ABI7500 Fast(应用生物系统公司)，根据制造商所提供的方案来测量靶基因小鼠C5和内源对照基因小鼠GAPDH的Ct值。在施用PBS施用组后5天肝脏C5 mRNA的残留率被定义为100％，并且对每个siRNA施用组，通过使用比较Ct的方法来计算肝脏C5 mRNA的残留率(相对值)。结果如表8中所示。
[表8]
Figure BDA0002993311810000361
将每个采样日采样的血液以3000rpm离心15分钟，然后收集作为上清液的肝素血浆并在-80℃下储存。在此之后，通过ELISA定量血浆小鼠C5。特别地，将呈固定化抗体的小鼠抗C5抗体BB5.1(北京博蕾德生物科技有限公司(Hycult Biotech)，目录号HM1073-FS)用PBS(-)(和光纯药工业股份有限公司(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)，目录号045-29795)稀释以得到的最终浓度为2μg/mL，并将其添加到测试板(Nunc公司，目录号442404)，并在4℃下孵育过夜。在此之后，添加封闭液(含有1％BSA(安迪生物科技有限公司(R&D systems)，目录号DY995)的PBS(-)(和光纯药工业股份有限公司))，将所得的产物在室温下孵育1小时。丢弃封闭液，并用洗涤液(含有0.02％吐温20的PBS(-)(和光纯药工业股份有限公司))进行三次洗涤。丢弃洗涤液，然后添加经封闭液稀释的肝素血浆样品，并将所得产物在室温下孵育5小时。PBS施用组的血浆被用作标准样品。丢弃样品，然后用洗涤液进行5次洗涤，并添加经封闭液稀释4000倍的羊抗人C5抗体(Quidel公司，目录号A306)，并将所得产物在室温下孵育1小时。丢弃抗体，然后用洗涤液进行5次清洗，并添加经封闭液稀释40000倍的HRP-标记的驴抗山羊IgG(H+L)(杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearchInc.)，目录号805-035-180)，并将所得产物在室温下孵育1小时。丢弃抗体，然后用洗涤液进行5次清洗。在此之后，混合等量的TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)过氧化物酶底物(Kirkegaard&Perry Laboratories公司，目录号50-76-01)和过氧化物酶底物溶液B(Kirkegaard&Perry Laboratories公司，目录号50-65-00)作为检测试剂，将其添加并允许产生颜色。添加H2SO4(和光纯药工业股份有限公司，目录号198-09595)作为淬火液，并在450nm和650nm测量吸光度。如表9所示，在施用PBS施用组后5天样品的相对值(如血浆C5浓度)被定义为100％。
[表9]
Figure BDA0002993311810000371
[实例4：体外筛查]
表10中列出的有义链和反义链通过使用亚磷酰胺方法来合成，然后退火以合成双链核糖核酸(基因设计有限公司)。以与实例1相同的方式进行测试来测量在培养的Hep3B细胞中靶基因人C5和内源对照基因人GAPDH的Ct值，除了制备的siRNA/RNAiMax混合溶液的最终浓度为0.003至10nM的双链核糖核酸和0.3％RNAiMax。如在实例1中，在仅Lipofection的条件下C5 mRNA的表达水平定义为100％，并计算每次引入siRNA时C5 mRNA的残留率(相对值)。结果如表11中所示。
[表10]
Figure BDA0002993311810000381
[表11]
Figure BDA0002993311810000401
[实例5：体内筛查(突出端修饰)]
(siRNA-LNP的制备)
将其中包封siRNA的脂质纳米颗粒(LNP)以实例3中相同的方式制备，除了使用表12中列出的siRNA。制备的LNP的产品质量的评价结果如表13中所示。
[表12]
Figure BDA0002993311810000421
[表13]
Figure BDA0002993311810000431
(体内筛查)
将包封列于本文表12中的PBS或siRNA的LNP从尾静脉以0.3mg/kg siRNA的剂量静脉内施用于BALB/c小鼠(雄性，6周龄，n＝3/组)，并在麻醉下在施用后5天、14天和21天将血液和肝脏作为样品。从用液氮冷冻的肝脏中，用RNeasy Plus Mini试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，目录号74106)，根据制造商所提供的方案来纯化总RNA。在此之后，通过使用PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)(宝生物工程株式会社，目录号RR036A)，根据制造商所提供的方案来制备cDNA。此外，通过使用TaqMan(注册商标)GeneExpression Master Mix(应用生物系统公司，目录号4369510)和TaqMan探针(应用生物系统公司，C5:Mm01336776_g1；GAPDH:Mm99999915_g1)以及ABI7500 Fast(应用生物系统公司)，根据制造商所提供的方案来测量靶基因小鼠C5和内源对照基因小鼠GAPDH的Ct值。在每天施用PBS施用组后，测量的肝脏C5 mRNA的残留率被定义为100％，且对每个siRNA施用组，通过使用比较Ct方法来计算肝脏C5 mRNA的残留率(相对值)。结果如表14中所示。
[表14]
Figure BDA0002993311810000441
将每个采样日采样的血液以3000rpm离心15分钟，然后收集作为上清液的肝素血浆并在-80℃下储存。在此之后，通过ELISA定量血浆小鼠C5。特别地，将呈固定化抗体的小鼠抗C5抗体BB5.1(北京博蕾德生物科技有限公司(Hycult Biotech)，目录号HM1073-FS)用PBS(-)(和光纯药工业股份有限公司(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)，目录号045-29795)稀释以得到的最终浓度为2μg/mL，并将其添加到测试板(Nunc公司，目录号442404)，并在4℃下孵育过夜。在此之后，添加封闭液(含有1％BSA(安迪生物科技有限公司(R&D systems)，目录号DY995)的PBS(-)(和光纯药工业股份有限公司))，将所得的产物在室温下孵育1小时。丢弃封闭液，并用洗涤液(含有0.02％吐温20的PBS(-)(和光纯药工业股份有限公司))进行三次洗涤。丢弃洗涤液，然后添加经封闭液稀释的肝素血浆样品，并将所得产物在室温下孵育5小时。PBS施用组的血浆被用作标准样品。丢弃样品，然后用洗涤液进行5次洗涤，并添加经封闭液稀释4000倍的羊抗人C5抗体(Quidel公司，目录号A306)，并将所得产物在室温下孵育1小时。丢弃抗体，然后用洗涤液进行5次清洗，并添加经封闭液稀释40000倍的HRP-标记的驴抗山羊IgG(H+L)(杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearchInc.)，目录号805-035-180)，并将所得产物在室温下孵育1小时。丢弃抗体，然后用洗涤液进行5次清洗。在此之后，混合等量的TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)过氧化物酶底物(Kirkegaard&Perry Laboratories公司，目录号50-76-01)和过氧化物酶底物溶液B(Kirkegaard&Perry Laboratories公司，目录号50-65-00)作为检测试剂，将其添加并允许产生颜色。添加H2SO4(和光纯药工业股份有限公司，目录号198-09595)作为淬火液，并在450nm和650nm测量吸光度。如表15所示，在施用PBS施用组前一天样品的相对值(如血浆C5浓度)被定义为100％。
[表15]
Figure BDA0002993311810000451
定量在施用后5天、14天和21天的肝脏C5 mRNA残留率和血浆C5浓度，并且对siRNA-008-34施用组到siRNA-008施用组进行统计分析(未配对T检验)。结果如图1和图2所示。P值为0.05或更低的组用*(星号)提供，P值为0.01或更低的组用**提供。
[实例6：体外分析(顺序步态(sequence walk))]
表16中列出的有义链和反义链通过使用亚磷酰胺方法来合成，然后退火以合成双链核糖核酸(基因设计有限公司)。如在实例1中，在仅Lipofection的条件下C5 mRNA的表达水平定义为100％，并计算每次引入siRNA时C5 mRNA的残留率(相对值)。结果如表17中所示。
[表16]
Figure BDA0002993311810000471
[表17]
Figure BDA0002993311810000481
[实例7：药理学测试(溶血遏制效果)]
(siRNA-LNP的制备)
将其中包封siRNA的脂质纳米颗粒(LNP)以实例3中相同的方式制备，除了使用表18中列出的siRNA。制备的LNP的产品质量的评价结果如表19中所示。
[表18]
Figure BDA0002993311810000491
[表19]
Figure BDA0002993311810000501
(体内评价)
将包封列于本文表18中的PBS或siRNA的LNP从尾静脉以1至3mg/kg siRNA的剂量静脉内施用于BALB/c小鼠(雄性，6周龄，n＝3/组)，并在麻醉下在施用后5天和9天将血液作为样品。在每个采样日采样的血液置于含有凝块活化剂(免疫生物研究室公司，目录号31203)的血液分离管，并在3000rpm离心15分钟，然后收集作为上清液的血清并在-80℃下储存。在此之后，用以下方法定量血清中的补体活性。特别地，通过使用血清补体滴度CH50试剂盒(电化生研株式会社(DENKA SEIKEN Co.,Ltd.)，目录号400017)根据制造商提供的方案制备浓度为1.5×108细胞/mL的绵羊红细胞。随后，以20μg/mL的剂量，用附着血清补体滴度CH50试剂盒的稀释培养基制备酵母聚糖(和光纯药工业股份有限公司，目录号263-01491)。用同样的稀释培养基将样品血清稀释40倍。将每个体积为50μL的绵羊红细胞、酵母聚糖和稀释的血清样品混合在一起，并将该混合物在37℃下孵育过夜。在第二天，将测定板在2000rpm下在室温下离心10分钟，然后在405nm测量上清液的吸光度。如表20所示，每个个体施用前一天血清中补体活性的样品的值被定义为100％。
[表20]
Figure BDA0002993311810000502
[实例8：药理学测试(单独施用的溶血遏制效果)]
(siRNA-LNP的制备)
将其中包封siRNA的脂质纳米颗粒(LNP)以实例3中相同的方式制备，除了使用表21中列出的siRNA。制备的LNP的产品质量的评价结果如表22中所示。
[表21]
Figure BDA0002993311810000521
[表22]
Figure BDA0002993311810000531
(体内评价)
将包封列于本文表21中的PBS或siRNA的LNP从尾静脉以0.3、1和3mg/kg siRNA的剂量静脉内施用于BALB/c小鼠(雄性，7周龄，n＝4/组)，并在麻醉下在施用前(表23中的-1天)和施用后7天、13天、20天和27天(表23中的7天、13天、20天和27天)将血液作为样品。在每个采样日采样的血液置于含有凝块活化剂(免疫生物研究室公司，目录号31203)的血液分离管，并在3000rpm离心15分钟，然后收集作为上清液的血清并在-80℃下储存。在此之后，用以下方法定量血清中的补体活性。特别地，通过使用血清补体滴度CH50试剂盒(电化生研株式会社(DENKA SEIKEN Co.,Ltd.)，目录号400017)根据制造商提供的方案制备浓度为1.5×108细胞/mL的绵羊红细胞。随后，以20μg/mL的剂量，用附着血清补体滴度CH50试剂盒的稀释培养基制备酵母聚糖(和光纯药工业股份有限公司，目录号263-01491)。用同样的稀释培养基将样品血清稀释40倍。将每个体积为50μL的绵羊红细胞、酵母聚糖和稀释的血清样品混合在一起，并将该混合物在37℃下孵育过夜。在第二天，将测定板在2000rpm下在室温下离心10分钟，然后在405nm测量上清液的吸光度。如表23所示，每个个体施用前(表23中的-1天)血清中补体活性的样品的值被定义为100％。在1mg/kg组中的1只小鼠的补体活性被排除(因为其似乎是异常的)。因此，表23中只有1mg/kg组的值显示为3只小鼠的平均值。表23中PBS组、0.3mg/kg组和3mg/kg的组的值显示为4只小鼠的平均值。结果如图3中所示。
[表23]
Figure BDA0002993311810000541
[实例9：药理学测试(每两周一次施用的溶血遏制效果)]
(siRNA-LNP的制备)
将其中包封siRNA的脂质纳米颗粒(LNP)以实例8中相同的方式制备。
(体内评价)
将包封列于本文实例8的表21中的PBS或siRNA的LNP从尾静脉以每两周(Q2w)0.3、1和3mg/kg siRNA的剂量静脉内施用于BALB/c小鼠(雄性，7周龄，n＝4/组)。在麻醉下在施用前一天(表24中的-1天)和施用后7天、13天、20天和27天(表24中的7天、13天、20天和27天)将血液采样。在每个采样日采样的血液置于含有凝块活化剂(免疫生物研究室公司，目录号31203)的血液分离管，并在3000rpm离心15分钟，然后收集作为上清液的血清并在-80℃下储存。在此之后，用以下方法定量血清中的补体活性。特别地，通过使用血清补体滴度CH50试剂盒(电化生研株式会社(DENKA SEIKEN Co.,Ltd.)，目录号400017)根据制造商提供的方案制备浓度为1.5×108细胞/mL的绵羊红细胞。随后，以20μg/mL的剂量，用附着血清补体滴度CH50试剂盒的稀释培养基制备酵母聚糖(和光纯药工业股份有限公司，目录号263-01491)。用同样的稀释培养基将样品血清稀释40倍。将每个体积为50μL的绵羊红细胞、酵母聚糖和稀释的血清样品混合在一起，并将该混合物在37℃下孵育过夜。在第二天，将测定板在2000rpm下在室温下离心10分钟，然后在405nm测量上清液的吸光度。如表24所示，每个个体施用前(表24中的-1天)血清中补体活性的样品的值被定义为100％。结果如图4中所示。
[表24]
Figure BDA0002993311810000561
[实例10：药理学测试(每两周一次施用的溶血遏制效果)]
(siRNA-LNP的制备)
将其中包封siRNA的脂质纳米颗粒(LNP)以实例8中相同的方式制备。
(体内评价)
将包封列于本文实例8的表21中的PBS或siRNA的LNP从尾静脉以每两周(Q2w)0.3、1和3mg/kg siRNA的剂量静脉内施用于BALB/c小鼠(雄性，7周龄，n＝4/组)。在麻醉下在施用前一天(表25中的-1天)和在施用后7天、13天、20天、27天、34天、41天、48天和55天(表25中的7天、13天、20天、27天、34天、41天、48天和55天)将血液采样。在每个采样日采样的血液置于含有凝块活化剂(免疫生物研究室公司，目录号31203)的血液分离管，并在3000rpm离心15分钟，然后收集作为上清液的血清并在-80℃下储存。在此之后，用以下方法定量血清中的补体活性。特别地，通过使用血清补体滴度CH50试剂盒(电化生研株式会社(DENKASEIKEN Co.,Ltd.)，目录号400017)根据制造商提供的方案制备浓度为1.5×108细胞/mL的绵羊红细胞。随后，以20μg/mL的剂量，用附着血清补体滴度CH50试剂盒的稀释培养基制备酵母聚糖(和光纯药工业股份有限公司，目录号263-01491)。用同样的稀释培养基将样品血清稀释40倍。将每个体积为50μL的绵羊红细胞、酵母聚糖和稀释的血清样品混合在一起，并将该混合物在37℃下孵育过夜。在第二天，将测定板在2000rpm下在室温下离心10分钟，然后在405nm测量上清液的吸光度。如表25所示，每个个体施用前(表25中的-1天)血清中补体活性的样品的值被定义为100％。结果如图5中所示。
[表25]
Figure BDA0002993311810000581
[实例11：药理学测试(每三周一次施用的溶血遏制效果)]
(siRNA-LNP的制备)
将其中包封siRNA的脂质纳米颗粒(LNP)以实例8中相同的方式制备。
(体内评价)
将包封列于本文实例8的表21中的PBS或siRNA的LNP从尾静脉以每三周一次(Q3w)0.3、1和3mg/kg siRNA的剂量静脉内施用于BALB/c小鼠(雄性，7周龄，n＝4/组)。在麻醉下在施用前一天(表26中的-1天)和在施用后7天、13天、20天、27天、34天、41天、48天和55天(表26中的7天、13天、20天、27天、34天、41天、48天和55天)将血液采样。在每个采样日采样的血液置于含有凝块活化剂(免疫生物研究室公司，目录号31203)的血液分离管，并在3000rpm离心15分钟，然后收集作为上清液的血清并在-80℃下储存。在此之后，用以下方法定量血清中的补体活性。特别地，通过使用血清补体滴度CH50试剂盒(电化生研株式会社(DENKA SEIKEN Co.,Ltd.)，目录号400017)根据制造商提供的方案制备浓度为1.5×108细胞/mL的绵羊红细胞。随后，以20μg/mL的剂量，用附着血清补体滴度CH50试剂盒的稀释培养基制备酵母聚糖(和光纯药工业股份有限公司，目录号263-01491)。用同样的稀释培养基将样品血清稀释40倍。将每个体积为50μL的绵羊红细胞、酵母聚糖和稀释的血清样品混合在一起，并将该混合物在37℃下孵育过夜。在第二天，将测定板在2000rpm下在室温下离心10分钟，然后在405nm测量上清液的吸光度。如表26所示，每个个体施用前(表26中的-1天)血清中补体活性的样品的值被定义为100％。结果如图6中所示。
[表26]
Figure BDA0002993311810000601
Figure IDA0002993311900000011
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Claims (16)

1.一种双链核糖核酸，其包含：
有义链和反义链的组合，
其中该有义链和反义链的组合选自由以下组合组成的组：
SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:160；SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:142；SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144；SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:146；SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:148；和SEQID NO:153和SEQ ID NO:154。
2.一种双链核糖核酸，其包含SEQ ID NO:159的有义链；和SEQ ID NO:160的反义链。
3.一种双链核糖核酸，其包含SEQ ID NO:141的有义链；和SEQ ID NO:142的反义链。
4.一种双链核糖核酸，其包含SEQ ID NO:143的有义链；和SEQ ID NO:144的反义链。
5.一种双链核糖核酸，其包含SEQ ID NO:145的有义链；和SEQ ID NO:146的反义链。
6.一种双链核糖核酸，其包含SEQ ID NO:147的有义链；和SEQ ID NO:148的反义链。
7.一种双链核糖核酸，其包含SEQ ID NO:153的有义链；和SEQ ID NO:154的反义链。
8.一种药物组合物，其包含：
根据权利要求1至7中任一项所述的双链核糖核酸。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其用于治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿症。
10.根据权利要求8所述的药物组合物，其用于治疗非典型溶血尿毒综合征。
11.一种包封根据权利要求1至7中任一项所述的双链核糖核酸的脂质复合物。
12.根据权利要求11所述的脂质复合物，其包含：
阳离子脂质；和
选自由中性脂质、聚乙二醇修饰的脂质及固醇组成的组中的至少一种脂质。
13.根据权利要求12所述的脂质复合物，其中：该阳离子脂质是2-{9-氧代-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基1-甲基哌啶-4-甲酸酯。
14.一种药物组合物，其包含：
根据权利要求11-13中任一项所述的脂质复合物。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其用于治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿症。
16.根据权利要求14所述的药物组合物，其用于治疗非典型溶血尿毒综合征。
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