TWI797728B - 水凝膠組合物、其製造方法及酶促形成之水凝膠組合物 - Google Patents

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Abstract

本發明所提供之水凝膠組合物、其製造方法以及酶促形成之水凝膠組合物，其大體上係在酪胺酸酶催化聚合物的交聯反應時，藉由過氧化鈣作為其交聯反應之氧受體，並令聚合物與鈣離子螯合；進而令其所產生之水凝膠組合物不但保有良好的生物相容性，更進一步具備了良好的機械性值以及高凝膠化速率等特性。

Description

水凝膠組合物、其製造方法及酶促形成之水凝膠組合物
本發明主要係關於組合物之領域，但並非以此為限；本發明尤其係關於一種水凝膠組合物、其製造方法及酶促形成之水凝膠組合物。
多年以來，關節軟骨組織仍係組織再生相關領域極具重要性之課題之一；由於其複雜的生物結構、較低的代謝生物活性以及不具血管之特性，使其進行再生和修復之可能性相當低。另外，軟骨組織的自我修復能力相當有限，時常需要以手術治療；且若關節軟骨內小於2cm的微小裂縫沒有症狀時而未及時治療時，可能導致其緩慢擴大而最終導致骨關節炎。
目前常用以修復軟骨組織中小缺陷的方法包括骨軟骨移植術和微骨折手術等；然而，這些方法常引發纖維軟骨而非透明軟骨的產生，且與鄰近的原生器官之間的生物整合效果亦不佳。為解決這個問題，合成的生物相容性材料便逐漸被採納為修復軟骨之替代物；而在這些生物材料之中，水凝膠組合物是特別備受關注的項目。
水凝膠組合物可用於建構凝膠化的生物聚合物，其例如：玻尿酸、藻酸鹽或幾丁聚醣等。凝膠化生物聚合物可透過多種方式形成；其中，能 原位凝膠化的可注射或可植入之聚合物凝膠系統，由於可以直接並以最小侵入性之方式輸送到病變部位，令其具備相當高的價值。
發明人發現，關節軟骨組織屬於低氧濃度的生理環境，其可能會抑制酶的氧化反應；況且，部分聚合物材料並不包含細胞結合肽，因此亦有黏附性較低的問題。是以，如何令體內原位凝膠化的生物材料得以同時具備與周圍組織之黏附力、機械強度以及生物相容性確係一本技術領域重要且亟需被解決的問題。
有鑑於先前技術所提及的內容，本發明進一步提供一新穎之概念。基於鈣離子可用以與藻酸鹽聚合物的羧基螯合之特性，本發明人進一步經過驗證後發現，在酪胺酸酶催化聚合物的交聯反應時，可藉由過氧化鈣作為其交聯反應之氧受體，進而提高其反應效果；同時，過氧化鈣所提供之鈣離子得以進一步與聚合物螯合形成具有高生物相容性、高黏附性以及高凝膠化速率的水凝膠組合物。
具體而言，本發明一方面提供一種水凝膠組合物，其包括複數個聚合物，該聚合物中包括一主鏈，該主鏈包含複數羧基以及由酪胺所形成之一分支，其中該任兩條聚合物上之相鄰該分支之間具有一鍵結；並且，該複數羧基中至少一者與一鈣離子螯合。
根據本發明之一實施例，該主鏈係選自由明膠、幾丁聚醣、肝素、纖維素、葡聚醣、硫酸葡聚醣、硫酸軟骨素、硫酸角質素、硫酸皮膚素、藻酸鹽、膠原蛋白、白蛋白、纖維接合素、層連結蛋白、彈性蛋白、玻連蛋白、玻尿酸、纖維蛋白原、多支鏈聚合物(multi-arm polymer)及其組合所組成之群組。
根據本發明之一實施例，該主鏈係一多醣共聚物或一多醣均聚物。
根據本發明之一實施例，該鍵結係一酶促氧化偶聯；進一步地，其中該酶促氧化偶聯係該複數聚合物在具有一酶以及一過氧化鈣之環境下原位交聯所形成，其中該過氧化鈣之濃度為0.4至1mM之間，而該酶係一酪胺酸酶或一辣根過氧化酶。
本發明另一方面提供一種酶促形成之水凝膠組合物如以下式(II)，其係以酶促反應形成，其包括複數個聚合物，該聚合物中包括同質或異質之一主鏈，如式(I)之結構；其中，該主鏈之至少一羧基與至少一鈣離子螯合為如以下式(II)之結構
Figure 110131266-A0101-12-0003-1
Figure 110131266-A0101-12-0003-2
根據本發明之一實施例，該主鏈包含由酪胺所形成之一分支，其中該任兩條聚合物上之相鄰該分支之間具有一鍵結如以下式(III)結構之鍵結
Figure 110131266-A0101-12-0004-3
根據本發明之一實施例，該如式(II)之結構以及該如式(III)結構之鍵結，係該聚合物在具有一氧化酶以及一過氧化鈣之環境下原位交聯所形成；進一步地，該氧化酶係一酪胺酸酶或一辣根過氧化酶；更進一步地，該過氧化鈣之濃度為0.4至1mM之間。
本發明另一方面提供一種水凝膠組合物之製造方法，其包括下列步驟：(a)以一酪胺與一聚合物之一主鏈反應，產生一前驅聚合物；(b)加入一交聯促進劑以及一離子螯合劑令複數該前驅聚合物反應交聯以供形成一水凝膠組合物。
根據本發明之一實施例，在步驟(a)中，該聚合物以及該酪胺之反應比例係於1：0.4至1：6之間。
根據本發明之一實施例，該交聯促進劑係一酪胺酸酶或一辣根過氧化酶。
根據本發明之一實施例，該離子螯合劑係一過氧化鈣。
根據本發明之一實施例，在步驟(b)中，該離子螯合劑之反應濃度為0.4至1mM之間。
綜上所述，本發明相較於習知技術所具備之優勢在於：本發明所提供之水凝膠組合物、其製造方法以及酶促形成之水凝膠組合物，不但保有良好的生物相容性，更進一步具備了高黏附性以及高凝膠化速率等特性。
發明內容旨在提供本發明的簡化摘要，以令閱讀者對本發明具備基本的理解。此發明內容並非本發明的完整概述，且其用意並非指出本發明實施例的重要或關鍵元件或界定本發明的範圍。
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更淺顯易懂，所附圖式之說明如下：
圖1a至d係依據本發明一實施例所繪示之化學反應示意圖；
圖2係依據本發明一實施例所呈現之1H NMR光譜分析圖；
圖3係依據本發明一實施例所呈現之FTIR光譜分析圖；
圖4係依據本發明一實施例所呈現之凝膠化時間結果圖；
圖5係依據本發明一實施例所呈現之黏附應力測量結果圖；
圖6A係依據本發明一實施例所呈現之MTT細胞存活率分析圖，而圖6B則係依據本發明一實施例所呈現之LIVE/DEAD細胞生存力檢測結果圖；
圖7係依據本發明一實施例所呈現之凝膠化時間結果圖；
圖8係依據本發明一實施例所呈現之FTIR光譜分析圖；
圖9係依據本發明一實施例所呈現之SEM結果圖；
圖10A係依據本發明一實施例所呈現之應力相對於時間分析圖，而圖10B係依據本發明一實施例所呈現之應力相對於距離分析圖；
圖11係依據本發明一實施例所呈現之流變性質結果圖；
圖12係依據本發明一實施例所呈現之光學顯微鏡分析圖；
圖13A係依據本發明一實施例呈現之實驗/對照組組織染色分析圖，圖13B則係依據本發明一實施例所呈現之實驗組組織染色分析圖，而圖13C係依據本發明一實施例所呈現之實驗/對照組軟組織染色分析圖；
圖14A係依據本發明一實施例所呈現之實驗/對照組的手術/外觀視圖，圖14B則係依據本發明一實施例所呈現之實驗/對照組組織染色分析圖；
圖15A及15B分別係依據本發明一實施例所呈現之水凝膠黏附力分析圖，以及水凝膠整體拉伸強度分析圖；
圖16係依據本發明一實施例所呈現之光學/螢光顯微鏡觀察結果圖；
圖17係依據本發明一實施例所呈現之MTT細胞存活力分析圖；
圖18係依據本發明一實施例所呈現之應力相對應變分析圖；
根據慣常的作業方式，圖中各種特徵與元件並未依實際比例繪製，其繪製方式是為了以最佳的方式呈現與本發明相關的具體特徵與元件。此外，在不同圖式間，以相同或相似的元件符號指稱相似的元件及部件。
為了使本發明的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述，但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。在本說明書及後附之申請專利範圍中，除非上下文另外載明，否則「一」及「該」亦可解釋為複數。此外，在本說明書及後附之申請專利範圍中，除非另外載明，否則「設置於某物之上」可視為直接或間接以貼附或其他形式與某物之表面接觸，該表面之界定應視說明書內容之前後/段落語意以及本說明所屬領域之通常知識予以判斷。
雖然用以界定本發明的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或一範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，是本發明所屬領域中具有通常知識者的考量而定。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。
本發明一方面係關於一種水凝膠組合物。該水凝膠組合物包括複數個聚合物；該聚合物中包括一主鏈，而該主鏈包含複數羧基以及由酪胺所形成之一分支。其中，該任兩條聚合物上之相鄰該分支之間具有一鍵結；並且，該複數羧基中至少一者與一鈣離子螯合。
另一方面，本發明係關於一種酶促形成之水凝膠組合物如以下式(II)，其係以酶促反應形成，其包括複數個聚合物，該聚合物中包括同質或異質之一主鏈，如式(I)之結構；其中，該主鏈之至少一羧基與至少一鈣離子螯合為如以下式(II)之結構
Figure 110131266-A0101-12-0007-4
Figure 110131266-A0101-12-0008-5
如本文所用，術語「水凝膠(hydrogel)組合物，或稱水膠組合物)」係指一種親水性聚合物，其具有藉由分子鏈間之交聯反應所形成之三維網狀結構，進而令其得以在吸水後膨脹而不崩解。凡是水溶性或親水性的聚合物，其帶有官能基如：-OH、-CONH、-CONH2或-COOH等，經由化學交聯或物理交聯都可形成水凝膠組合物。而上述聚合物大體上可區分為天然、合成及其組合；天然的親水性聚合物包括多醣類(如纖維素、澱粉、透明質酸、海藻酸、幾丁聚醣等)以及多胜肽類(膠原蛋白、聚L-離氨酸、聚L-谷胺酸等)。合成的親水性聚合物包括醇、丙烯酸及其衍生物，例如：聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯醯胺等。在本發明之一些實施例中，該主鏈係選自由明膠、幾丁聚醣、肝素、纖維素、葡聚醣、硫酸葡聚醣、硫酸軟骨素、硫酸角質素、硫酸皮膚素、藻酸鹽、膠原蛋白、白蛋白、纖維接合素、層連結蛋白、彈性蛋白、玻連蛋白、玻尿酸、纖維蛋白原、多支鏈聚合物(multi-arm polymer)及其組合所組成之群組。
此外/或者，在本發明之一些實施例中，該主鏈係一多醣共聚物或一多醣均聚物。於一些實施例中，該主鏈係由一甘露醛酸以及一古羅醣醛酸所共聚而成之多醣共聚物。於一些實施例中，該主鏈係由一甘露醣醛酸或一古羅醣醛酸所聚合而成之多醣均聚物。於一些實施例中，
如本文所用，術語「酶促氧化偶聯(Enzyme-catalyzed oxidative coupling)」係泛指藉由酶(酵素)催化氧化反應，進而於兩分子或基團之間所形成之鍵結，且其大多係共價鍵；具體而言，依據本發明之一些實施例，其亦可指 稱產生於聚合物/高分子當中，分子鏈之間藉由酶(酵素)催化氧化反應進而形成之交聯(crosslinking)鍵結。在本發明之一些實施例中，該鍵結係一酶促氧化偶聯。於一些實施例中，該鍵結係一酶促氧化偶聯，且其包括一中間產物，該中間產物係一鄰苯醌。
於一些實施例中，該任兩條聚合物上之相鄰該分支之間具有之該鍵結係一醯胺鍵結。在本發明之一些實施例中，該主鏈包含由酪胺所形成之一分支，其中該任兩條聚合物上之相鄰該分支之間具有一鍵結如以下式(III)結構之鍵結：
Figure 110131266-A0101-12-0009-6
如本文所用，術語「原位交聯(in-situ crosslinking)」係指聚合物設置於特定生理環境時，藉由改變物理特性或化學參數(例如：溫度、pH值或離子濃度)而產生交聯之情形；具體而言，依據本發明之一些實施例，水凝膠組合物包含之聚合物可在注射進入目標之組織部位後，即可經由物理特性或是化學參數之調控而產生原位交聯，進而由液體或溶膠狀態轉變為凝膠狀態。在本發明之一些實施例中，該酶促氧化偶聯係該複數聚合物在具有一酶以及一過氧化鈣之環境下原位交聯所形成，其中該過氧化鈣之濃度為0.4至1mM之間，而該酶係一酪胺酸酶或一辣根過氧化酶。在本發明另一些實施例中，該如式(II)之結構以及該如式(III)結構之鍵結，係該聚合物在具有一氧化酶以及一過氧化鈣之環境下原位交聯所形成。具體而言，該氧化酶係一酪胺酸酶或一辣根過氧化酶；而本發明以下所提供之實施例係選用酪胺酸酶。除此之外，該過氧化鈣之濃度為0.4至1mM之間；較佳地，該過氧化鈣之濃度為0.4至0.8mM之間。前述過氧化鈣之 濃度例如但不限於：0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1mM或介於前述任二個數值之間。
另一方面，本發明係關於一種該水凝膠組合物之製造方法，其包括下列步驟：(a)以一酪胺與一聚合物之一主鏈反應，產生一前驅聚合物；(b)加入一交聯促進劑以及一離子螯合劑令複數該前驅聚合物反應交聯以供形成一水凝膠組合物。
在本發明之一些實施例中，在步驟(a)中，該聚合物以及該酪胺之反應比例係於1：0.4至1：6之間；較佳地，該反應比例係於1：0.4至1：5之間；該聚合物以及該酪胺之反應比例例如為1：0.4、1：0.5、1：0.6、1：0.7、1：0.8、1：0.9、1：1、1：1.1、1：1.3、1：1.5、1：1.7、、1：1.9、1：2.1、1：2.3、1：1：2.5、1：2.7、1：2.9、1：3.1、1：3.3、1：3.5、1：3.7、1：3.9、1：4.1、1：4.3、1：4.5、1：4.7、1：4.9、1：5.1、1：5.3、1：5.5、1：5.7、1：5.9或1：6。
在本發明之一些實施例中，該交聯促進劑係一酪胺酸酶或一辣根過氧化酶。於一較佳實施例中，該交聯促進劑係酪胺酸酶。
在本發明之一些實施例中，在步驟(b)中，該離子螯合劑之反應濃度為0.4至1mM之間；較佳地，該離子螯合劑之濃度為0.4至0.8mM之間；該離子螯合劑之濃度具體例如為0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1mM或介於前述任二個數值之間。在本發明之一些實施例中，該離子螯合劑係一過氧化鈣。不受任何理論限制，發明人發現，該離子螯合劑若為過氧化鈣，其中的鈣離子在該水凝膠組合物中進行螯合作用，使該水凝膠組合物產生空隙，使該水凝膠組合物凝固後仍有空間；因此，在該水凝膠組合物應用時，可使利於氣體交流、組織液流出等，讓該水凝膠組合物覆蓋的細胞存活率提高。
實施例
反應概述
圖1係依據本發明一實施例所繪示之化學反應示意圖，其闡述了本發明中水凝膠組合物、其製造方法以及酶促形成之水凝膠組合物的基礎化學反應；必須注意的是，圖式中的標號a~d僅用以概略地示意化學反應之流程，且其中標號c以及d部分之結果實質上係同時發生。請參閱圖1，首先將一聚合物與一酪胺(tyramine，以下簡稱為TYR)共同反應為一共軛的前驅化合物；具體而言，該聚合物係選用一海藻酸鹽類(alginate，以下簡稱為ALG)，更具體地係選用海藻酸鈉。接續，添加酪胺酸酶以及過氧化鈣於該共軛的前驅化合物，令酪胺酸酶在過氧化鈣作為氧受體的情形下催化該共軛的前驅化合物中相鄰的酚基氧化成醌基而偶聯，進一步產生交聯並凝膠化(如標號d所示)；另一方面，過氧化鈣更提供鈣離子以令該共軛的前驅化合物中的複數羧基中至少一者與其螯合，並形成類似「蛋盒(egg box)」之交聯結構(如標號c所示)。自此以下之內容即以上述化學反應為基礎，進一步詳述本發明一些實施例之實驗流程以及結果。
1.以ALG以及TYR製備前驅化合物
將海藻酸鈉溶解在去離子水(deionized H2O，DI H2O)(2wt%)中，並與等量的MES緩衝溶液(0.5M)混合。接續，以一含水性碳二亞胺之活化劑與ALG的羧基進行預處理以產生醯胺鍵；依據本實施例，該含水性碳二亞胺之活化劑包括一1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺化合物(EDC)以及一N-羥基丁二醯亞胺化合物(NHS)。ALG、NHS以及EDC在預處理的反應莫耳比係1：1.5：1.5；另外，為了避免與氧氣之間的氧化還原反應，進行氦氣的脫氣步驟。進一步地，為了增強預處理之反應，故加入HCl或NaOH將pH值調整至5.0。經過預處理反應30分鐘後，將經處理的ALG與TYR進行反應，進而生成ALG-TYR共軛之前驅化合物。經處理的ALG分別與不同比例的TYR進行反應，並依據其比 例而區分為不同組別；具體而言，經處理的ALG與TYR之反應莫耳比為1：0.4、1：1、1：2.5、1：5和1：6，其分別代表組別R0.4、R1、R2.5、R5以及R6。進一步地，前述兩者在MES緩衝溶液中混合，並將pH值調整至約5.5以加速反應；經過24小時之反應後，即獲得不同反應莫耳比的ALG-TYR前驅化合物。
接續，本實施例測定經上述步驟生成之ALG-TYR前驅化合物的化學結構並確認接枝狀態。具體而言，本發明分別採用核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)以及傅立葉轉換紅外光譜(Fourier-transform infrared spectroscopy，FTIR)進行所述測定。核磁共振主要係偵測原子核自旋受外加磁場激發轉向高能態，進而再回到平衡態所釋放之射頻訊號，藉以觀察分子結構及動態等，而傅立葉轉換紅外光譜係透過測定樣本所吸收之特定紅外線能量後而產生光譜，藉此鑑別分子當中所具有之官能基。圖2即係依據本發明之實施例所呈現之1H NMR光譜分析圖；請參閱圖2，ALG之光譜呈現由甘露糖醛酸(mannuronate)或古羅糖醛酸(guluronate)組成的藻酸鹽的典型均質聚合(homopolymeric)及異質聚合(heteropolymeric)嵌段部分(約4-5ppm)，而ALG-TYR前驅化合物之光譜係呈現TYR酚基之芳香族質子訊號(約7.0ppm)。另一方面，圖3係依據本發明之實施例所呈現之FTIR光譜分析圖；請參閱圖3，ALG的特徵峰係位於1596、1406和1026cm-1，分別係代表C=O、CH2以及-C-O-C-；TYR的特徵峰則位於3079及1254cm-1之位置，分別代表羥基和C-C官能基；對照之下即可確認ALG-TYR前驅化合物實質的接枝狀態。
除此之外，本實施例透過光譜儀更進一步測定ALG-TYR前驅化合物之取代度(degree of substitution,D.S.)。如本文所用，術語「取代度」係指聚合物材料的每個基本單元/單體單元中，共軛之取代基之平均數；根據本發明之一 些實施例，取代度係指ALG-TYR前驅化合物的每個基本單元/單體單元中，共軛之TYR之平均數。然而，準確評估D.S.數值並不容易，故本實施例係透過TYR於275nm的吸光度分別測定組別R0.4、R1、R2.5、R5以及R6之前驅化合物的D.S.之百分比，而結果如表1所示。根據表1可確認，增加TYR在反應中的莫耳比例時，得以相應地提升D.S.。
Figure 110131266-A0101-12-0013-7
2.ALG-TYR前驅化合物添加酪胺酸酶而凝膠化
為探尋本發明中可獲較佳效果之技術特徵，以下逐一實驗並分析與本實施例酶促凝膠化產物特性相關之變因。
2-1.取代度(D.S.)
2-1-1.不同D.S.之機械性質分析
普遍而言，聚合物材料之D.S.與產物的拉伸機械強度呈正相關。為了進一步驗證，本實施例於此將不同D.S的前驅化合物組別R0.4、R1、R2.5、R5以及R6，與濃度固定為10KU之酪胺酸酶共同形成一測試水凝膠組合物(以下簡稱為水凝膠)，並測定其機械性質。具體而言，本實施例係針對上述測試水凝膠測定其凝膠化時間以及黏附力。其中，凝膠化時間係透過觀察於裝有前驅化 合物的容器內加入酪胺酸酶後，其轉變為深棕色且倒置其容器仍得以黏附於底部之凝膠所需的時間。黏附力(黏附應力)係材料的重要機械參數；其測定過程大致上係將膠原蛋白膜固定在鋁板上，接著將二塊鋁板固定有膠原蛋白膜的表面與該測試水凝膠(50μL)黏合。進一步地，將固定有該測試水凝膠之鋁板置於高濕度環境中(在封閉系統中將受測凝膠置於PBS表面上方)或完全浸入PBS溶液中。經過24小時後，使用剪切測試方法(shearing test method，Instron MINI 44)測量該測試水凝膠黏附應力。
圖4係依據本發明一實施例所呈現之凝膠化時間結果圖，而圖5係依據本發明一實施例所呈現之黏附應力測量結果圖。依據圖4及5可發現，隨著D.S.的提升，凝膠化時間亦縮減；並且，組別R5之測試水凝膠分別在高濕度或完全浸入PBS溶液之環境中所測得之黏附應力皆高於D.S.相對較低之組別。據此可知，D.S.的提升不但加快凝膠化速率，更令其水凝膠產物具有更佳之黏附力。
2-1-2.不同D.S.之生物相容性分析
考量本發明後續應用於生物材料領域之目的，本實施例於此測定D.S.與生物相容性之關聯。
依據本實施例所使用之實驗步驟，首先係將小鼠L929細胞(10% FBS，1%青黴素/鏈黴素，DMEM-高糖)保存於培養箱(5% CO2，37℃)之中；接續，接種至96孔(105個細胞/mL)中直至達到匯聚(confluence)，隨後用於後續實驗用途。進一步，分別以固定濃度為10wt%之不同D.S的前驅化合物組別R0.4、R1、R2.5、R5以及R6與固定濃度(10KU)之酪胺酸酶共同形成一測試水凝膠；再依據ISO10993之基準，於37℃下將DMEM-高糖(10% FBS、1% PSA)添加至該測 試水凝膠中24小時；最後，將所述測試凝膠用以培養L929細胞，以利後續生物相容性分析之測定。
於此，生物相容性係透過MTT試驗以及LIVE/DEAD細胞生存力檢測所測定。MTT試驗係基於MTT染料可由活細胞所還原而結晶之特性，並進一步測定吸光值，藉以評估活細胞數目的檢驗方法；而LIVE/DEAD細胞生存力檢測則係藉由觀察可表現於活/死細胞之不同染料的螢光表現，進而評估細胞存活情形。圖6A係依據本發明一實施例所呈現之MTT細胞存活率分析圖，而圖6B則係依據本發明一實施例所呈現之LIVE/DEAD細胞生存力檢測結果圖；其中，上述兩圖式中所用之陰性對照組以及陽性對照組，皆分別係使用一般細胞培養基以及使用含10%DMSO之細胞培養基之樣本組別。依據圖6A可見，D.S.的上升確實會造成細胞存活率的下降。考量材料拉身強度與生物相容性兩項特性之平衡，本實施例進一步選用R5組進行LIVE/DEAD細胞生存力檢測；而如圖6B所示，以R5組別之測試水凝膠作為培養基之L929細胞樣本之中，死亡細胞數量相當少，且活細胞相較於陰性對照組亦無型態上顯著之變化。
2-1-3.酪胺酸酶的濃度與凝膠化時間之關聯性
於此，本實施例測定酪胺酸酶的濃度與凝膠化時間之關聯性；其中，凝膠化時間之測定方法請參閱上述內容。本實施例之中，分別以濃度為1、2、5以及10KU之酪胺酸酶與10wt%之R5前驅化合物反應。結果如圖7所示，酪胺酸酶之酵素濃度與樣本凝膠化時間呈現負相關。
3.ALG-TYR前驅化合物添加酪胺酸酶以及過氧化鈣之凝膠化
本段落旨在分析ALG-TYR前驅化合物同時添加酪胺酸酶以及過氧化鈣而凝膠化生成之水凝膠；並且，以下進一步逐一探討各式變因與其水凝膠特性之間的關聯。
3-1.光譜分析
於此，本實施例利用FTIR光譜分別針對以下四組樣本進行測定：ALG-TYR前驅化合物、酪胺酸酶、10wt%之ALG-TYR前驅化合物+10KU之酪胺酸酶以及10wt%之ALG-TYR前驅化合物+10KU之酪胺酸酶+0.8mM過氧化鈣。
圖8係據此所呈現之FTIR光譜分析圖。請參閱圖8，在10wt%之ALG-TYR前驅化合物+10KU之酪胺酸酶+0.8mM過氧化鈣之組別的部分，可觀察到3247和3124cm-1處的明顯峰，其表示NH和OH鍵存在。據此可理解，ALG-TYR前驅化合物加入酪胺酸酶及過氧化鈣後，酪胺酸酶可催化其形成NH鍵，並且氧亦得以產生。
3-2.結構型態分析
於此，本實施例利用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM)分別測定不添加/添加0.8mM過氧化鈣對於ALG-TYR之酶促凝膠化所造成之影響。圖9係據此所呈現之SEM結果圖。請參閱圖9，與不添加過氧化鈣的組別相比，添加0.8mM過氧化鈣之組別顯得更緻密、組織良好並且具有較多連通孔(以紅色箭頭表示)。據此可理解，過氧化鈣有助於形成足夠的交聯點和孔隙空間，以提供相互連通的孔隙和高孔隙率。此一形態變化的發現有利於先天細胞的調節、附著、遷移、增殖和潛在分化。
3-3.機械性質分析
首先，本實施例採用全質構分析(texture profile analysis,TPA)，並以其測定在pH值為7的環境下，添加0.8mM過氧化鈣於ALG-TYR前驅化合物(10wt%)/酪胺酸酶(10KU)，對於其水凝膠硬度、內聚性以及黏合性所造成之影響。TPA係一種可依據需求以不同模式測定材料機械性質之方法。細部而言，其步驟上係先以模具製備圓柱形水凝膠(直徑8mm，高約8mm)；進一步確保水凝膠完全凝膠化後，將其置於潮濕環境中至少48小時，接著使用質地分析儀(TA.XT plus Texture Analyzer)進行後續分析。圖10A係依據本實施例所呈現之應力相對於時間分析圖；而圖10B係依據本實施例所呈現之應力相對於距離分析圖。請參閱圖10A及10B，相較於不添加過氧化鈣的水凝膠，添加0.8mM之過氧化鈣後所製成之水凝膠顯然具有更佳的硬度、內聚性以及黏合性。
進一步地，本實施例利用流變儀(MCR 302，Anton-Paar)評估添加0.8mM過氧化鈣於ALG-TYR前驅化合物(10wt%)/酪胺酸酶(10KU)，對於其水凝膠流變性質之影響。圖11係依據本實施例所呈現之流變性質結果圖。如圖11所示，紅色表示R5前驅化合物/酪胺酸酶/過氧化鈣；黑色表示R5前驅化合物/酪胺酸酶；藍色則表示僅有R5前驅化合物。除此之外，圖式中實心圓係表示黏性並對應耗損模數G’座標軸，而空心圓則係表示彈性並對應儲存模數G”座標軸。由圖11可理解，R5前驅化合物/酪胺酸酶/過氧化鈣之組別表現更高的凝膠化速率，且其儲存模數G’以及耗損模數G”之表示線相交，表示其可順利凝膠化。
3-4.體外(in vitro)試驗分析
於此，本實施例之體外試驗步驟大體上為：自屠宰場取得豬的新鮮軟骨並用不含酒精的優碘(Betadine)消毒。用手術刀將豬的關節軟骨切成碎片(尺寸小於5mm2)。接著透過具有特定篩目尺寸的均質機(ReveilleTM)製備更小的 碎片，使其尺寸低於1mm2。為了去除基質，接著使用酵素(Liberase，每瓶以10mL HBSS回溶)處理較小的關節軟骨碎片20分鐘。接續，將0.2mL之R5前驅化合物與酪胺酸酶(10KU)以及0.8mM之過氧化鈣進行酶促凝膠化而形成一測試水凝膠，並放置在共軛焦培養皿(confocal dish)的蓋玻片上檢驗軟骨與凝膠的生物相互作用；同時，將上述較小的關節軟骨混合到共軛焦培養皿的該測試水凝膠中，以利後續藉由光學顯微鏡觀察及分析。
圖12係據此所呈現之光學顯微鏡分析圖。請參閱圖12，從第0天在光學顯微鏡下發現清晰的軟骨/水凝膠邊界。在第10天觀察時，發現少數細胞從軟骨遷移到水凝膠。進一步在第14-16天觀察時，軟骨界面已逐漸產生一些細胞外間質(extracellular matrix,ECM)，並觀察到2個軟骨碎片融合。由此可知，其水凝膠有助於軟骨細胞增殖、遷移和ECM形成。
3-5-1.體內(in vivo)試驗分析1
於此，本實施例將對照組(ALG/氯化鈣與豬軟骨碎片之混合)以及實驗組(ALG-TYR前驅化合物/酪胺酸酶/過氧化鈣與豬軟骨碎片混合)分別植入裸鼠皮下，經一或三個月後切開以進行組織的顯微鏡檢查和免疫染色，進而評估體內生物穩定性和材料相互作用。具體而言，本實施例所使用之染劑分別係番红O(safranin O)、艾爾遜藍(alcian blue)以及蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,H&E)。
圖13A係依據此實施例呈現之實驗/對照組組織染色分析圖；圖13B係依據此實施例所呈現之實驗組組織染色分析圖；而圖13C係依據此實施例所呈現之實驗/對照組軟組織染色分析圖。如圖13A至C所示，相較於對照組，實驗組周圍有更多的軟骨細胞外基質沉積；實驗組可保存更多的軟骨碎片並將每 個軟骨碎片緊密地彌合及整合在一起，進一步令細胞從軟骨碎片遷移和穿透至水凝膠區塊；最後，對於鄰近器官或其他軟組織(包括心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟)並未觀察到植入水凝膠在動物體內有造成肉眼可見的毒性跡象，包括充血、水腫或壞死等情形。
3-5-2.體內(in vivo)試驗分析2
於此，本實施例將對照組(ALG/氯化鈣與豬軟骨碎片之混合)以及實驗組(ALG-TYR前驅化合物/酪胺酸酶/過氧化鈣與豬軟骨碎片混合)分別植入兔體軟骨缺損之部位，經一個月後切開以進行肉眼觀察、組織顯微鏡檢查以及免疫染色，進一步評估組織修復情形；結果如圖14A及B所示。其中，本實施例所使用之染劑分別係艾爾遜藍(alcian blue)以及蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,H&E)。
外觀上而言(如圖14A所示)，對照組的關節髁表面呈凹形且不均勻，組織修復十分有限；相較之下，水凝膠-軟骨組的缺損明顯比對照組更小更淺，並且充滿了大量的修復組織。
在顯微鏡下，透過將組織學圖像區分為天然軟骨(NA)、修復區域(RT)和軟骨下區域(OT)的區域，進而觀察並評估每組的修復結果。如圖14B所示，對照組中未受損傷的天然軟骨和修復區域之間的界面並不均勻。相反地，在水凝膠-軟骨組中，缺損處充滿了可生長的植入軟骨碎片，且植入的軟骨與天然軟骨和下方的軟骨下骨在側向上充分整合。除此之外，僅有水凝膠-軟骨組中的修復區域顯示出艾爾遜藍的陽性染色，表示有軟骨細胞外基質沉積的情形。
3-6.過氧化鈣最適濃度分析
在此段落，本實施例分別測定添加不同過氧化鈣之情形下，對於機械性質以及生物相容性之影響。
3-6-1.不同過氧化鈣濃度與水凝膠機械性質之關聯性
於此，本實施例測驗R5前驅化合物/10KU酪胺酸酶在完全浸入PBS溶液中的情況下，分別添加不同濃度過氧化鈣後所產生之水凝膠的黏附力以及拉伸力；具體而言，拉伸力包括黏附力、內聚力和壓縮力。圖15A及15B分別係依據本實施例所呈現之水凝膠黏附力分析圖，以及水凝膠整體拉伸強度分析圖。如圖15A所示，過氧化鈣濃度為0.8mM之組別具有最高的黏附力，然而過氧化鈣之濃度進一步提升為1.0mM時，其黏附力則不增反減；進一步參閱圖15B可發現，過氧化鈣濃度為1.0mM之組別相較於其他組別具有最高的拉伸力；由此可理解，過氧化鈣濃度超過0.8mM後，水凝膠的黏附強度被補償為內聚力或壓縮力。
3-6-2.不同過氧化鈣濃度與水凝膠生物相容性之關聯性
進一步地，藉由光學顯微鏡以及螢光顯微鏡觀察R5前驅化合物/10KU酪胺酸酶添加不同濃度之過氧化鈣後所產生之水凝膠狀態。圖16係依據本實施例所呈現之光學/螢光顯微鏡觀察結果圖。如圖16所示，過氧化鈣濃度達1mM時，氧化產物亦相對地顯著增加。
除此之外，在本實施例中進一步採用MTT試驗(試驗細節詳見上述內容)評估過氧化鈣添加濃度對於細胞存活力之影響。圖17係依據本實施例所呈現之MTT細胞存活力分析圖。如圖17所示，相較於其他組別，以過氧化鈣濃度為0.4或0.8mM之組別處理的細胞表現出更高的細胞生存力。綜合考量以上面向而言，本實施例中所添加過氧化鈣之濃度為0.4至1mM之間；不過較佳地，過氧化鈣之濃度為0.4至0.8mM之間；而更具體而言，過氧化鈣之濃度可以為0.4、0.5、0.6、0.7或0.8mM。
3-7.反應條件分析
在此段落，本實施例分別測定不同緩衝液以及pH值的條件下，對於水凝膠產物機械性質之影響。
首先，普遍而言，相較於生理食鹽水或磷酸鹽緩衝液，Tris緩衝液可能不會使鈣鹽沉澱並能保護金屬鹽的溶解度。而另一方面，由於pH值可能會影響酪胺酸酶的酶活性和過氧化鈣釋放氧的能力。故於此進一步驗證ALG-TYR前驅化合物在不同pH條件下用不同緩衝液添加過氧化鈣和酪胺酸酶時的凝膠狀況。
具體而言，本實施例於此係採用TPA(細節如上所述)進行壓縮試驗以及楊氏模數(Young’s Modules)之測定，進一步評估本實施例最佳之緩衝液以及環境pH值。圖18係依據本實施例所呈現之應力相對應變分析圖，而表2則係依據本實施例所呈現之楊氏模數數據表。請參閱圖18及表2，在相同過氧化鈣濃度(0.8mM)的情形下，pH值為7搭配鹽水緩衝液或pH值為8搭配Tris緩衝液的組別，機械強度皆低於pH值為7搭配Tris緩衝液的組別。較可能的原因應係，相較於其他pH值，酪胺酸酶在pH值為7的環境下具有較高活性。除此之外，Tris緩衝液能夠避免金屬沉澱，增加金屬氧化物系鹽類的溶解度，進而增強過氧化鈣的反應性，並提供足夠的可溶性鈣離子及氧。綜合考量以上面向而言，本實施例所提供較佳之反應條件應為pH值為7搭配Tris緩衝液的組合。
Figure 110131266-A0101-12-0021-8
Figure 110131266-A0101-12-0022-10
綜上所述，本發明所提供之水凝膠組合物、其製造方法以及酶促形成之水凝膠組合物，不但保有良好的生物相容性，更進一步具備了良好的機械性值以及高凝膠化速率等特性。

Claims (11)

  1. 一種水凝膠組合物，其包括：複數個聚合物，該聚合物中包括一主鏈，該主鏈包含複數羧基以及由酪胺所形成之一分支，其中該任兩條聚合物上之相鄰該分支之間具有一鍵結，所述之鍵結係一酶促氧化偶聯，該酶促氧化偶聯係由該複數聚合物在具有一酶以及一過氧化鈣之環境下原位交聯所形成，其中該過氧化鈣之濃度為0.4至1mM之間，而該酶係一酪胺酸酶或一辣根過氧化酶；其中，該複數羧基中至少一者與一鈣離子螯合。
  2. 如請求項1所述之水凝膠組合物，其中該主鏈係選自由明膠、幾丁聚醣、肝素、纖維素、葡聚醣、硫酸葡聚醣、硫酸軟骨素、硫酸角質素、硫酸皮膚素、藻酸鹽、膠原蛋白、白蛋白、纖維接合素、層連結蛋白、彈性蛋白、玻連蛋白、玻尿酸、纖維蛋白原、多支鏈聚合物(multi-arm polymer)及其組合所組成之群組。
  3. 如請求項1所述之水凝膠組合物，其中該主鏈係一多醣共聚物或一多醣均聚物。
  4. 一種酶促形成之水凝膠組合物如以下式(II)，其係以酶促反應形成，其包括：複數個聚合物，該聚合物中包括同質或異質之一主鏈，如式(I)之結構；其中，該主鏈之至少一羧基與至少一鈣離子螯合為如以下式(II)之結構
    Figure 110131266-A0305-02-0025-1
    Figure 110131266-A0305-02-0025-2
     其中，該鈣離子為一過氧化鈣，該過氧化鈣之濃度為0.4至1mM之間。
  5. 如請求項4所述之酶促形成之水凝膠組合物，其中該主鏈包含由酪胺所形成之一分支，其中該任兩條聚合物上之相鄰該分支之間具有一鍵結如以下式(III)結構之鍵結
    Figure 110131266-A0305-02-0025-3
  6. 如請求項5所述之酶促形成之水凝膠組合物，其中該如式(II)之結構以及該如式(III)結構之鍵結，係該聚合物在具有一氧化酶以及一過氧化鈣之環境下原位交聯所形成。
  7. 如請求項6所述之酶促形成之水凝膠組合物，其中該氧化酶係一酪胺酸酶或一辣根過氧化酶。
  8. 一種水凝膠組合物之製造方法，其包括下列步驟： (a)以一酪胺與一聚合物之一主鏈反應，產生一前驅聚合物；(b)加入一交聯促進劑以及一離子螯合劑令複數該前驅聚合物反應交聯以供形成一水凝膠組合物，其中，該離子螯合劑之反應濃度為0.4至1mM之間。
  9. 如請求項8所述之製造方法，其中在步驟(a)中，該聚合物以及該酪胺之反應比例係於1：0.4至1：6之間。
  10. 如請求項8所述之製造方法，其中該交聯促進劑係一酪胺酸酶或一辣根過氧化酶。
  11. 如請求項8所述之製造方法，其中該離子螯合劑係一過氧化鈣。
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