CN114099774A - 水凝胶组合物、其制造方法及酶促形成的水凝胶组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明所提供的水凝胶组合物、其制造方法以及酶促形成的水凝胶组合物，其大体上是在酪胺酸酶催化聚合物的交联反应时，藉由过氧化钙作为其交联反应的氧受体，并使聚合物与钙离子螯合；进而使其所产生的水凝胶组合物不但保有良好的生物兼容性，更进一步具备了良好的机械性值以及高凝胶化速率等特性。

Description

水凝胶组合物、其制造方法及酶促形成的水凝胶组合物
【技术领域】
本发明主要是关于组合物的领域，但并非以此为限；本发明尤其是关于一种水凝胶组合物、其制造方法及酶促形成的水凝胶组合物。
【先前技术】
多年以来，关节软骨组织仍是组织再生相关领域极具重要性的课题之一；由于其复杂的生物结构、较低的代谢生物活性以及不具血管的特性，使其进行再生和修复的可能性相当低。另外，软骨组织的自我修复能力相当有限，时常需要以手术治疗；且若关节软骨内小于2cm的微小裂缝没有症状时而未及时治疗时，可能导致其缓慢扩大而最终导致骨关节炎。
目前常用以修复软骨组织中小缺陷的方法包括骨软骨移植术和微骨折手术等；然而，这些方法常引发纤维软骨而非透明软骨的产生，且与邻近的原生器官之间的生物整合效果亦不佳。为解决这个问题，合成的生物兼容性材料便逐渐被采纳为修复软骨的替代物；而在这些生物材料之中，水凝胶组合物是特别备受关注的项目。
水凝胶组合物可用于建构凝胶化的生物聚合物，其例如：玻尿酸、藻酸盐或几丁聚糖等。凝胶化生物聚合物可通过多种方式形成；其中，能原位凝胶化的可注射或可植入的聚合物凝胶系统，由于可以直接并以最小侵入性的方式输送到病变部位，令其具备相当高的价值。
【发明内容】
发明人发现，关节软骨组织属于低氧浓度的生理环境，其可能会抑制酶的氧化反应；况且，部分聚合物材料并不包含细胞结合肽，因此亦有粘附性较低的问题。是以，如何令体内原位凝胶化的生物材料得以同时具备与周围组织的粘附力(或黏附力)、机械强度以及生物兼容性确是本技术领域重要且亟需被解决的问题。
有鉴于先前技术所提及的内容，本发明进一步提供一新颖的概念。基于钙离子可用以与藻酸盐聚合物的羧基螯合的特性，本发明人进一步经过验证后发现，在酪胺酸酶(或称酪氨酸酶)催化聚合物的交联反应时，可藉由过氧化钙作为其交联反应的氧受体，进而提高其反应效果；同时，过氧化钙所提供的钙离子得以进一步与聚合物螯合形成具有高生物兼容性、高粘附性以及高凝胶化速率的水凝胶组合物。
具体而言，本发明一方面提供一种水凝胶组合物，其包括多个聚合物，该聚合物中包括一主链，该主链包含多个羧基以及由酪胺所形成的一分支，其中该任两条聚合物上的相邻该分支之间具有一键结；并且，该多个羧基中至少一者与一钙离子螯合。
根据本发明的一实施例，该主链是选自由明胶、几丁聚糖、肝素、纤维素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、硫酸软骨素、硫酸角质素、硫酸皮肤素、藻酸盐、胶原蛋白、白蛋白、纤维接合素、层粘连蛋白、弹性蛋白、玻连蛋白、玻尿酸、纤维蛋白原、多支链聚合物(multi-armpolymer)及其组合所组成的群组。
根据本发明的一实施例，该主链是一多糖共聚物或一多糖均聚物。
根据本发明的一实施例，该键结是一酶促氧化偶联；进一步地，其中该酶促氧化偶联是该多个聚合物在具有一酶以及一过氧化钙的环境下原位交联所形成，其中该过氧化钙的浓度为0.4至1mM之间，而该酶是一酪胺酸酶或一辣根过氧化酶。
本发明另一方面提供一种酶促形成的水凝胶组合物如下式(II)，其是以酶促反应形成，其包括多个聚合物，该聚合物中包括同质或异质的一主链，如式(I)的结构；其中，该主链的至少一羧基与至少一钙离子螯合为如以下式(II)的结构
Figure BDA0003227698730000031
根据本发明的一实施例，该主链包含由酪胺所形成的一分支，其中该任两条聚合物上的相邻该分支之间具有一键结如以下式(III)结构的键结
Figure BDA0003227698730000032
根据本发明的一实施例，该如式(II)的结构以及该如式(III)结构的键结，系该聚合物在具有一氧化酶以及一过氧化钙的环境下原位交联所形成；进一步地，该氧化酶是一酪胺酸酶或一辣根过氧化酶；更进一步地，该过氧化钙的浓度为0.4至1mM之间。
本发明另一方面提供一种水凝胶组合物的制造方法，其包括下列步骤：(a)以一酪胺与一聚合物的一主链反应，产生一前驱聚合物；(b)加入一交联促进剂以及一离子螯合剂使多个该前驱聚合物反应交联以供形成一水凝胶组合物。
根据本发明的一实施例，在步骤(a)中，该聚合物以及该酪胺的反应比例是于1:0.4至1:6之间。
根据本发明的一实施例，该交联促进剂是一酪胺酸酶或一辣根过氧化酶。
根据本发明的一实施例，该离子螯合剂是一过氧化钙。
根据本发明的一实施例，在步骤(b)中，该离子螯合剂的反应浓度为0.4至1mM之间。
综上所述，本发明相较于习知技术所具备的优势在于：本发明所提供的水凝胶组合物、其制造方法以及酶促形成的水凝胶组合物，不但保有良好的生物兼容性，更进一步具备了高粘附性以及高凝胶化速率等特性。
发明内容旨在提供本发明的简化摘要，以令阅读者对本发明具备基本的理解。此发明内容并非本发明的完整概述，且其用意并非指出本发明实施例的重要或关键组件或界定本发明的范围。
【附图说明】
为让本发明的上述与其他目的、特征、优点与实施例能更浅显易懂，所附图式的说明如下：
图1a至d是依据本发明一实施例所绘示的化学反应示意图；
图2是依据本发明一实施例所呈现的1H NMR光谱分析图；
图3是依据本发明一实施例所呈现的FTIR光谱分析图；
图4是依据本发明一实施例所呈现的凝胶化时间结果图；
图5是依据本发明一实施例所呈现的粘附应力测量结果图；
图6A是依据本发明一实施例所呈现的MTT细胞存活率分析图，而图6B则是依据本发明一实施例所呈现的LIVE/DEAD细胞生存力检测结果图；
图7是依据本发明一实施例所呈现的凝胶化时间结果图；
图8是依据本发明一实施例所呈现的FTIR光谱分析图；
图9是依据本发明一实施例所呈现的SEM结果图；
图10A是依据本发明一实施例所呈现的应力相对于时间分析图，而图10B是依据本发明一实施例所呈现的应力相对于距离分析图；
图11是依据本发明一实施例所呈现的流变性质结果图；
图12是依据本发明一实施例所呈现的光学显微镜分析图；
图13A是依据本发明一实施例呈现的实验/对照组组织染色分析图，图13B则是依据本发明一实施例所呈现的实验组组织染色分析图，而图13C是依据本发明一实施例所呈现的实验/对照组软组织染色分析图；
图14A是依据本发明一实施例所呈现的实验/对照组的手术/外观视图，图14B则是依据本发明一实施例所呈现的实验/对照组组织染色分析图；
图15A及15B分别是依据本发明一实施例所呈现的水凝胶粘附力分析图，以及水凝胶整体拉伸强度分析图；
图16是依据本发明一实施例所呈现的光学/荧光显微镜观察结果图；
图17是依据本发明一实施例所呈现的MTT细胞存活力分析图；
图18是依据本发明一实施例所呈现的应力相对应变分析图；
根据惯常的作业方式，图中各种特征与组件并未依实际比例绘制，其绘制方式是为了以最佳的方式呈现与本发明相关的具体特征与组件。此外，在不同图式间，以相同或相似的组件符号指称相似的组件及部件。
【具体实施方式】
为了使本发明的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施态样与具体实施例提出了说明性的描述，但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。在本说明书及后附的申请专利范围中，除非上下文另外载明，否则“一”及“该”亦可解释为复数。此外，在本说明书及后附的申请专利范围中，除非另外载明，否则“设置于某物之上”可视为直接或间接以贴附或其他形式与某物的表面接触，该表面的界定应视说明书内容的前后/段落语意以及本说明所属领域的通常知识予以判断。
虽然用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或一范围的正负10％、5％、1％或0.5％的内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差的内，是本发明所属领域中具有通常知识者的考虑而定。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随申请专利范围所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。
本发明一方面是关于一种水凝胶组合物。该水凝胶组合物包括多个聚合物；该聚合物中包括一主链，而该主链包含多个羧基以及由酪胺所形成的一分支。其中，该任两条聚合物上的相邻该分支之间具有一键结；并且，该多个羧基中至少一者与一钙离子螯合。
另一方面，本发明是关于一种酶促形成的水凝胶组合物如下式(II)，其是以酶促反应形成，其包括多个聚合物，该聚合物中包括同质或异质的一主链，如式(I)的结构；其中，该主链的至少一羧基与至少一钙离子螯合为如下式(II)的结构
Figure BDA0003227698730000071
如本文所用，术语“水凝胶(hydrogel)组合物，或称水胶组合物)”是指一种亲水性聚合物，其具有藉由分子链间的交联反应所形成的三维网状结构，进而令其得以在吸水后膨胀而不崩解。凡是水溶性或亲水性的聚合物，其带有官能基如：-OH、-CONH、-CONH2或-COOH等，经由化学交联或物理交联都可形成水凝胶组合物。而上述聚合物大体上可区分为天然、合成及其组合；天然的亲水性聚合物包括多糖类(如纤维素、淀粉、透明质酸、海藻酸、几丁聚糖等)以及多肽类(胶原蛋白、聚L-离氨酸、聚L-谷胺酸等)。合成的亲水性聚合物包括醇、丙烯酸及其衍生物，例如：聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺等。在本发明的一些实施例中，该主链是选自由明胶、几丁聚糖、肝素、纤维素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、硫酸软骨素、硫酸角质素、硫酸皮肤素、藻酸盐、胶原蛋白、白蛋白、纤维接合素、层粘连蛋白、弹性蛋白、玻连蛋白、玻尿酸、纤维蛋白原、多支链聚合物(multi-arm polymer)及其组合所组成的群组。
此外/或者，在本发明的一些实施例中，该主链是一多糖共聚物或一多糖均聚物。于一些实施例中，该主链是由一甘露醛酸以及一古罗糖醛酸所共聚而成的多糖共聚物。于一些实施例中，该主链是由一甘露糖醛酸或一古罗糖醛酸所聚合而成的多糖均聚物。
如本文所用，术语“酶促氧化偶联(Enzyme-catalyzed oxidative coupling)”是泛指藉由酶(酵素)催化氧化反应，进而于两分子或基团之间所形成的键结，且其大多是共价键；具体而言，依据本发明的一些实施例，其亦可指称产生于聚合物/高分子当中，分子链之间藉由酶(酵素)催化氧化反应进而形成的交联(crosslinking)键结。在本发明的一些实施例中，该键结是一酶促氧化偶联。于一些实施例中，该键结是一酶促氧化偶联，且其包括一中间产物，该中间产物是一邻苯醌。
于一些实施例中，该任两条聚合物上的相邻该分支之间具有的该键结是一酰胺键结。在本发明的一些实施例中，该主链包含由酪胺所形成的一分支，其中该任两条聚合物上的相邻该分支之间具有一键结如以下式(III)结构的键结：
Figure BDA0003227698730000091
如本文所用，术语“原位交联(in-situ crosslinking)”是指聚合物设置于特定生理环境时，藉由改变物理特性或化学参数(例如：温度、pH值或离子浓度)而产生交联的情形；具体而言，依据本发明的一些实施例，水凝胶组合物包含的聚合物可在注射进入目标的组织部位后，即可经由物理特性或是化学参数的调控而产生原位交联，进而由液体或溶胶状态转变为凝胶状态。在本发明的一些实施例中，该酶促氧化偶联是该多个聚合物在具有一酶以及一过氧化钙的环境下原位交联所形成，其中该过氧化钙的浓度为0.4至1mM之间，而该酶是一酪胺酸酶或一辣根过氧化酶。在本发明另一些实施例中，该如式(II)的结构以及该如式(III)结构的键结，是该聚合物在具有一氧化酶以及一过氧化钙的环境下原位交联所形成。具体而言，该氧化酶是一酪胺酸酶或一辣根过氧化酶；而本发明以下所提供的实施例是选用酪胺酸酶。除此之外，该过氧化钙的浓度为0.4至1mM之间；较佳地，该过氧化钙的浓度为0.4至0.8mM之间。前述过氧化钙的浓度例如但不限于：0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1mM或介于前述任二个数值之间。
另一方面，本发明是关于一种该水凝胶组合物的制造方法，其包括下列步骤：(a)以一酪胺与一聚合物的一主链反应，产生一前驱聚合物；(b)加入一交联促进剂以及一离子螯合剂使多个该前驱聚合物反应交联以供形成一水凝胶组合物。
在本发明的一些实施例中，在步骤(a)中，该聚合物以及该酪胺的反应比例是于1:0.4至1:6之间；较佳地，该反应比例是于1:0.4至1:5之间；该聚合物以及该酪胺的反应比例例如为1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.3、1:1.5、1:1.7、、1:1.9、1:2.1、1:2.3、1:1:2.5、1:2.7、1:2.9、1:3.1、1:3.3、1:3.5、1:3.7、1:3.9、1:4.1、1:4.3、1:4.5、1:4.7、1:4.9、1:5.1、1:5.3、1:5.5、1:5.7、1:5.9或1:6。
在本发明的一些实施例中，该交联促进剂是一酪胺酸酶或一辣根过氧化酶。于一较佳实施例中，该交联促进剂是酪胺酸酶。
在本发明的一些实施例中，在步骤(b)中，该离子螯合剂的反应浓度为0.4至1mM之间；较佳地，该离子螯合剂的浓度为0.4至0.8mM之间；该离子螯合剂的浓度具体例如为0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1mM或介于前述任二个数值之间。在本发明的一些实施例中，该离子螯合剂是一过氧化钙。不受任何理论限制，发明人发现，该离子螯合剂若为过氧化钙，其中的钙离子在该水凝胶组合物中进行螯合作用，使该水凝胶组合物产生空隙，使该水凝胶组合物凝固后仍有空间；因此，在该水凝胶组合物应用时，可使利于气体交流、组织液流出等，让该水凝胶组合物覆盖的细胞存活率提高。
实施例
反应概述
图1是依据本发明一实施例所绘示的化学反应示意图，其阐述了本发明中水凝胶组合物、其制造方法以及酶促形成的水凝胶组合物的基础化学反应；必须注意的是，图式中的标号a～d仅用以概略地示意化学反应的流程，且其中标号c以及d部分的结果实质上是同时发生。请参阅图1，首先将一聚合物与一酪胺(tyramine，以下简称为TYR)共同反应为一共轭的前驱化合物；具体而言，该聚合物是选用一海藻酸盐类(alginate，以下简称为ALG)，更具体地是选用海藻酸钠。接着，添加酪胺酸酶以及过氧化钙于该共轭的前驱化合物，使酪胺酸酶在过氧化钙作为氧受体的情形下催化该共轭的前驱化合物中相邻的酚基氧化成醌基而偶联，进一步产生交联并凝胶化(如标号d所示)；另一方面，过氧化钙更提供钙离子以令该共轭的前驱化合物中的多个羧基中至少一者与其螯合，并形成类似“蛋盒(egg box)”的交联结构(如标号c所示)。自此以下的内容即以上述化学反应为基础，进一步详述本发明一些实施例的实验流程以及结果。
1.以ALG以及TYR制备前驱化合物
将海藻酸钠溶解在去离子水(deionized H2O，DI H2O)(2wt％)中，并与等量的MES缓冲溶液(0.5M)混合。接着，以一含水性碳二亚胺的活化剂与ALG的羧基进行预处理以产生酰胺键；依据本实施例，该含水性碳二亚胺的活化剂包括一1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺化合物(EDC)以及一N-羟基丁二酰亚胺化合物(NHS)。ALG、NHS以及EDC在预处理的反应摩尔比是1:1.5:1.5；另外，为了避免与氧气之间的氧化还原反应，进行氦气的脱气步骤。进一步地，为了增强预处理的反应，故加入HCl或NaOH将pH值调整至5.0。经过预处理反应30分钟后，将经处理的ALG与TYR进行反应，进而生成ALG-TYR共轭的前驱化合物。经处理的ALG分别与不同比例的TYR进行反应，并依据其比例而区分为不同组别；具体而言，经处理的ALG与TYR的反应摩尔比为1:0.4、1:1、1:2.5、1:5和1:6，其分别代表组别R0.4、R1、R2.5、R5以及R6。进一步地，前述两者在MES缓冲溶液中混合，并将pH值调整至约5.5以加速反应；经过24小时的反应后，即获得不同反应摩尔比的ALG-TYR前驱化合物。
接着，本实施例测定经上述步骤生成的ALG-TYR前驱化合物的化学结构并确认接枝状态。具体而言，本发明分别采用核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)以及傅立叶变换红外光谱(Fourier-transform infrared spectroscopy，FTIR)进行所述测定。核磁共振主要是侦测原子核自旋受外加磁场激发转向高能态，进而再回到平衡态所释放的射频信号，藉以观察分子结构及动态等，而傅立叶变换红外光谱是通过测定样本所吸收的特定红外线能量后而产生光谱，藉此鉴别分子当中所具有的官能基。图2即是依据本发明的实施例所呈现的1H NMR光谱分析图；请参阅图2，ALG的光谱呈现由甘露糖醛酸(mannuronate)或古罗糖醛酸(guluronate)组成的藻酸盐的典型均质聚合(homopolymeric)及异质聚合(heteropolymeric)嵌段部分(约4-5ppm)，而ALG-TYR前驱化合物的光谱是呈现TYR酚基的芳香族质子信号(约7.0ppm)。另一方面，图3是依据本发明的实施例所呈现的FTIR光谱分析图；请参阅图3，ALG的特征峰是位于1596、1406和1026cm-1，分别是代表C＝O、CH2以及-C-O-C-；TYR的特征峰则位于3079及1254cm-1的位置，分别代表羟基和C-C官能基；对照之下即可确认ALG-TYR前驱化合物实质的接枝状态。
除此之外，本实施例通过光谱仪更进一步测定ALG-TYR前驱化合物的取代度(degree of substitution,D.S.)。如本文所用，术语「取代度」是指聚合物材料的每个基本单元/单体单元中，共轭的取代基的平均数；根据本发明的一些实施例，取代度是指ALG-TYR前驱化合物的每个基本单元/单体单元中，共轭的TYR的平均数。然而，准确评估D.S.数值并不容易，故本实施例是通过TYR于275nm的吸光度分别测定组别R0.4、R1、R2.5、R5以及R6的前驱化合物的D.S.的百分比，而结果如表1所示。根据表1可确认，增加TYR在反应中的摩尔比例时，得以相应地提升D.S.。
表1.
Figure BDA0003227698730000121
Figure BDA0003227698730000131
2.ALG-TYR前驱化合物添加酪胺酸酶而凝胶化
为探寻本发明中可获较佳效果的技术特征，以下逐一实验并分析与本实施例酶促凝胶化产物特性相关的变因。
2-1.取代度(D.S.)
2-1-1.不同D.S.的机械性质分析
普遍而言，聚合物材料的D.S.与产物的拉伸机械强度呈正相关。为了进一步验证，本实施例于此将不同D.S的前驱化合物组别R0.4、R1、R2.5、R5以及R6，与浓度固定为10KU的酪胺酸酶共同形成一测试水凝胶组合物(以下简称为水凝胶)，并测定其机械性质。具体而言，本实施例是针对上述测试水凝胶测定其凝胶化时间以及粘附力。其中，凝胶化时间是通过观察于装有前驱化合物的容器内加入酪胺酸酶后，其转变为深棕色且倒置其容器仍得以粘附于底部的凝胶所需的时间。粘附力(粘附应力)是材料的重要机械参数；其测定过程大致上是将胶原蛋白膜固定在铝板上，接着将二块铝板固定有胶原蛋白膜的表面与该测试水凝胶(50μL)粘合。进一步地，将固定有该测试水凝胶的铝板置于高湿度环境中(在封闭系统中将受测凝胶置于PBS表面上方)或完全浸入PBS溶液中。经过24小时后，使用剪切测试方法(shearing test method，Instron MINI 44)测量该测试水凝胶粘附应力。
图4是依据本发明一实施例所呈现的凝胶化时间结果图，而图5是依据本发明一实施例所呈现的粘附应力测量结果图。依据图4及5可发现，随着D.S.的提升，凝胶化时间亦缩减；并且，组别R5的测试水凝胶分别在高湿度或完全浸入PBS溶液的环境中所测得的粘附应力皆高于D.S.相对较低的组别。据此可知，D.S.的提升不但加快凝胶化速率，更令其水凝胶产物具有更佳的粘附力。
2-1-2.不同D.S.的生物兼容性分析
考虑本发明后续应用于生物材料领域的目的，本实施例于此测定D.S.与生物兼容性的关联。
依据本实施例所使用的实验步骤，首先是将小鼠L929细胞(10％FBS，1％青霉素/链霉素，DMEM-高糖)保存于培养箱(5％CO2，37℃)之中；接着，接种至96孔(105个细胞/mL)中直至达到汇聚(confluence)，随后用于后续实验用途。进一步，分别以固定浓度为10wt％的不同D.S的前驱化合物组别R0.4、R1、R2.5、R5以及R6与固定浓度(10KU)的酪胺酸酶共同形成一测试水凝胶；再依据ISO10993的基准，于37℃下将DMEM-高糖(10％FBS、1％PSA)添加至该测试水凝胶中24小时；最后，将所述测试凝胶用以培养L929细胞，以利后续生物兼容性分析的测定。
于此，生物兼容性是通过MTT试验以及LIVE/DEAD细胞生存力检测所测定。MTT试验是基于MTT染料可由活细胞所还原而结晶的特性，并进一步测定吸光值，藉以评估活细胞数目的检验方法；而LIVE/DEAD细胞生存力检测则是藉由观察可表现于活/死细胞的不同染料的荧光表现，进而评估细胞存活情形。图6A是依据本发明一实施例所呈现的MTT细胞存活率分析图，而图6B则是依据本发明一实施例所呈现的LIVE/DEAD细胞生存力检测结果图；其中，上述两图式中所用的阴性对照组以及阳性对照组，皆分别是使用一般细胞培养基以及使用含10％DMSO的细胞培养基的样本组别。依据图6A可见，D.S.的上升确实会造成细胞存活率的下降。考虑材料拉伸强度与生物兼容性两项特性的平衡，本实施例进一步选用R5组进行LIVE/DEAD细胞生存力检测；而如图6B所示，以R5组别的测试水凝胶作为培养基的L929细胞样本之中，死亡细胞数量相当少，且活细胞相较于阴性对照组亦无型态上显著的变化。
2-1-3.酪胺酸酶的浓度与凝胶化时间的关联性
于此，本实施例测定酪胺酸酶的浓度与凝胶化时间的关联性；其中，凝胶化时间的测定方法请参阅上述内容。本实施例之中，分别以浓度为1、2、5以及10KU的酪胺酸酶与10wt％的R5前驱化合物反应。结果如图7所示，酪胺酸酶的酶浓度与样本凝胶化时间呈现负相关。
3.ALG-TYR前驱化合物添加酪胺酸酶以及过氧化钙的凝胶化
本段落旨在分析ALG-TYR前驱化合物同时添加酪胺酸酶以及过氧化钙而凝胶化生成的水凝胶；并且，以下进一步逐一探讨各式变因与其水凝胶特性之间的关联。
3-1.光谱分析
于此，本实施例利用FTIR光谱分别针对以下四组样本进行测定：ALG-TYR前驱化合物、酪胺酸酶、10wt％的ALG-TYR前驱化合物+10KU的酪胺酸酶以及10wt％的ALG-TYR前驱化合物+10KU的酪胺酸酶+0.8mM过氧化钙。
图8是据此所呈现的FTIR光谱分析图。请参阅图8，在10wt％的ALG-TYR前驱化合物+10KU的酪胺酸酶+0.8mM过氧化钙的组别的部分，可观察到3247和3124cm-1处的明显峰，其表示NH和OH键存在。据此可理解，ALG-TYR前驱化合物加入酪胺酸酶及过氧化钙后，酪胺酸酶可催化其形成NH键，并且氧也得以产生。
3-2.结构型态分析
于此，本实施例利用扫描电子显微镜(scanning electron microscopy，SEM)分别测定不添加/添加0.8mM过氧化钙对于ALG-TYR的酶促凝胶化所造成的影响。图9是据此所呈现的SEM结果图。请参阅图9，与不添加过氧化钙的组别相比，添加0.8mM过氧化钙的组别显得更致密、组织良好并且具有较多连通孔(以箭头表示)。据此可理解，过氧化钙有助于形成足够的交联点和孔隙空间，以提供相互连通的孔隙和高孔隙率。此一形态变化的发现有利于先天细胞的调节、附着、迁移、增殖和潜在分化。
3-3.机械性质分析
首先，本实施例采用全质构分析(texture profile analysis,TPA)，并以其测定在pH值为7的环境下，添加0.8mM过氧化钙于ALG-TYR前驱化合物(10wt％)/酪胺酸酶(10KU)，对于其水凝胶硬度、内聚性以及粘合性所造成的影响。TPA是一种可依据需求以不同模式测定材料机械性质的方法。细部而言，其步骤上是先以模具制备圆柱形水凝胶(直径8mm，高约8mm)；进一步确保水凝胶完全凝胶化后，将其置于潮湿环境中至少48小时，接着使用质地分析仪(TA.XT plus Texture Analyzer)进行后续分析。图10A是依据本实施例所呈现的应力相对于时间分析图；而图10B是依据本实施例所呈现的应力相对于距离分析图。请参阅图10A及10B，相较于不添加过氧化钙的水凝胶，添加0.8mM的过氧化钙后所制成的水凝胶显然具有更佳的硬度、内聚性以及粘合性。
进一步地，本实施例利用流变仪(MCR 302，Anton-Paar)评估添加0.8mM过氧化钙于ALG-TYR前驱化合物(10wt％)/酪胺酸酶(10KU)，对于其水凝胶流变性质的影响。图11是依据本实施例所呈现的流变性质结果图。如图11所示，淺灰色表示R5前驱化合物/酪胺酸酶/过氧化钙；黑色表示R5前驱化合物/酪胺酸酶；深灰色则表示仅有R5前驱化合物。除此之外，图式中实心圆系表示粘性并对应耗损模数G’坐标轴，而空心圆则是表示弹性并对应储存模数G”坐标轴。由图11可理解，R5前驱化合物/酪胺酸酶/过氧化钙的组别表现更高的凝胶化速率，且其储存模数G’以及耗损模数G”的表示线相交，表示其可顺利凝胶化。
3-4.体外(in vitro)试验分析
于此，本实施例的体外试验步骤大体上为：自屠宰场取得猪的新鲜软骨并用不含酒精的优碘(Betadine)消毒。用手术刀将猪的关节软骨切成碎片(尺寸小于5mm2)。接着通过具有特定筛目尺寸的均质机(ReveilleTM)制备更小的碎片，使其尺寸低于1mm2。为了去除基质，接着使用酶(Liberase，每瓶以10mL HBSS回溶)处理较小的关节软骨碎片20分钟。接着，将0.2mL的R5前驱化合物与酪胺酸酶(10KU)以及0.8mM的过氧化钙进行酶促凝胶化而形成一测试水凝胶，并放置在共轭焦培养皿(confocal dish)的盖玻片上检验软骨与凝胶的生物相互作用；同时，将上述较小的关节软骨混合到共轭焦培养皿的该测试水凝胶中，以利后续藉由光学显微镜观察及分析。
图12是据此所呈现的光学显微镜分析图。请参阅图12，从第0天在光学显微镜下发现清晰的软骨/水凝胶边界。在第10天观察时，发现少数细胞从软骨迁移到水凝胶。进一步在第14-16天观察时，软骨界面已逐渐产生一些细胞外间质(extracellular matrix,ECM)，并观察到2个软骨碎片融合。由此可知，其水凝胶有助于软骨细胞增殖、迁移和ECM形成。
3-5-1.体内(in vivo)试验分析1
于此，本实施例将对照组(ALG/氯化钙与猪软骨碎片的混合)以及实验组(ALG-TYR前驱化合物/酪胺酸酶/过氧化钙与猪软骨碎片混合)分别植入裸鼠皮下，经一或三个月后切开以进行组织的显微镜检查和免疫染色，进而评估体内生物稳定性和材料相互作用。具体而言，本实施例所使用的染剂分别是番红O(safranin O)、阿尔新蓝(alcian blue)以及苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,H&E)。
图13A是依据此实施例呈现的实验/对照组组织染色分析图；图13B是依据此实施例所呈现的实验组组织染色分析图；而图13C是依据此实施例所呈现的实验/对照组软组织染色分析图。如图13A至C所示，相较于对照组，实验组周围有更多的软骨细胞外基质沉积；实验组可保存更多的软骨碎片并将每个软骨碎片紧密地弥合及整合在一起，进一步令细胞从软骨碎片迁移和穿透至水凝胶区块；最后，对于邻近器官或其他软组织(包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)并未观察到植入水凝胶在动物体内有造成肉眼可见的毒性迹象，包括充血、水肿或坏死等情形。
3-5-2.体内(in vivo)试验分析2
于此，本实施例将对照组(ALG/氯化钙与猪软骨碎片的混合)以及实验组(ALG-TYR前驱化合物/酪胺酸酶/过氧化钙与猪软骨碎片混合)分别植入兔体软骨缺损的部位，经一个月后切开以进行肉眼观察、组织显微镜检查以及免疫染色，进一步评估组织修复情形；结果如图14A及B所示。其中，本实施例所使用的染剂分别是阿尔新蓝(alcian blue)以及苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,H&E)。
外观上而言(如图14A所示)，对照组的关节髁表面呈凹形且不均匀，组织修复十分有限；相较之下，水凝胶-软骨组的缺损明显比对照组更小更浅，并且充满了大量的修复组织。
在显微镜下，通过将组织学图像区分为天然软骨(NA)、修复区域(RT)和软骨下区域(OT)的区域，进而观察并评估每组的修复结果。如图14B所示，对照组中未受损伤的天然软骨和修复区域之间的界面并不均匀。相反地，在水凝胶-软骨组中，缺损处充满了可生长的植入软骨碎片，且植入的软骨与天然软骨和下方的软骨下骨在侧向上充分整合。除此之外，仅有水凝胶-软骨组中的修复区域显示出阿尔新蓝的阳性染色，表示有软骨细胞外基质沉积的情形。
3-6.过氧化钙最适浓度分析
在此段落，本实施例分别测定添加不同过氧化钙的情形下，对于机械性质以及生物兼容性的影响。
3-6-1.不同过氧化钙浓度与水凝胶机械性质的关联性
于此，本实施例测验R5前驱化合物/10KU酪胺酸酶在完全浸入PBS溶液中的情况下，分别添加不同浓度过氧化钙后所产生的水凝胶的粘附力以及拉伸力；具体而言，拉伸力包括粘附力、内聚力和压缩力。图15A及15B分别是依据本实施例所呈现的水凝胶粘附力分析图，以及水凝胶整体拉伸强度分析图。如图15A所示，过氧化钙浓度为0.8mM的组别具有最高的粘附力，然而过氧化钙的浓度进一步提升为1.0mM时，其粘附力则不增反减；进一步参阅图15B可发现，过氧化钙浓度为1.0mM的组别相较于其他组别具有最高的拉伸力；由此可理解，过氧化钙浓度超过0.8mM后，水凝胶的粘附强度被补偿为内聚力或压缩力。
3-6-2.不同过氧化钙浓度与水凝胶生物兼容性的关联性
进一步地，藉由光学显微镜以及荧光显微镜观察R5前驱化合物/10KU酪胺酸酶添加不同浓度的过氧化钙后所产生的水凝胶状态。图16是依据本实施例所呈现的光学/荧光显微镜观察结果图。如图16所示，过氧化钙浓度达1mM时，氧化产物亦相对地显著增加。
除此之外，在本实施例中进一步采用MTT试验(试验细节详见上述内容)评估过氧化钙添加浓度对于细胞存活力的影响。图17是依据本实施例所呈现的MTT细胞存活力分析图。如图17所示，相较于其他组别，以过氧化钙浓度为0.4或0.8mM的组别处理的细胞表现出更高的细胞生存力。综合考虑以上面向而言，本实施例中所添加过氧化钙的浓度为0.4至1mM之间；不过较佳地，过氧化钙的浓度为0.4至0.8mM之间；而更具体而言，过氧化钙的浓度可以为0.4、0.5、0.6、0.7或0.8mM。
3-7.反应条件分析
在此段落，本实施例分别测定不同缓冲液以及pH值的条件下，对于水凝胶产物机械性质的影响。
首先，普遍而言，相较于生理食盐水或磷酸盐缓冲液，Tris缓冲液可能不会使钙盐沉淀并能保护金属盐的溶解度。而另一方面，由于pH值可能会影响酪胺酸酶的酶活性和过氧化钙释放氧的能力。故于此进一步验证ALG-TYR前驱化合物在不同pH条件下用不同缓冲液添加过氧化钙和酪胺酸酶时的凝胶状况。
具体而言，本实施例于此是采用TPA(细节如上所述)进行压缩试验以及杨氏模数(Young’s Modules)的测定，进一步评估本实施例最佳的缓冲液以及环境pH值。图18系依据本实施例所呈现的应力相对应变分析图，而表2则是依据本实施例所呈现的杨氏模数数据表。请参阅图18及表2，在相同过氧化钙浓度(0.8mM)的情形下，pH值为7搭配盐水缓冲液或pH值为8搭配Tris缓冲液的组别，机械强度皆低于pH值为7搭配Tris缓冲液的组别。较可能的原因应是，相较于其他pH值，酪胺酸酶在pH值为7的环境下具有较高活性。除此之外，Tris缓冲液能够避免金属沉淀，增加金属氧化物系盐类的溶解度，进而增强过氧化钙的反应性，并提供足够的可溶性钙离子及氧。综合考虑以上面向而言，本实施例所提供较佳的反应条件应为pH值为7搭配Tris缓冲液的组合。
表2.
组别 杨氏模数
过氧化钙0mM/Tris/pH＝7 0.20
过氧化钙0.4mM/Tris/pH＝7 0.40
过氧化钙0.8mM/Tris/pH＝7 0.69
过氧化钙0.8mM/盐水/pH＝7 0.09
过氧化钙0.8mM/Tris/pH＝8 0.53
过氧化钙1.0mM/Tris/pH＝7 1.69
综上所述，本发明所提供的水凝胶组合物、其制造方法以及酶促形成的水凝胶组合物，不但保有良好的生物兼容性，更进一步具备了良好的机械性值以及高凝胶化速率等特性。

Claims (15)

1.一种水凝胶组合物，其包括：
多个聚合物，所述聚合物中包括一主链，所述主链包含多个羧基以及由酪胺所形成的一分支，其中任两条聚合物上的相邻所述分支之间具有一键结；
其中，所述多个羧基中至少一者与一钙离子螯合。
2.如权利要求1所述的水凝胶组合物，其中所述主链是选自由明胶、几丁聚糖、肝素、纤维素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、硫酸软骨素、硫酸角质素、硫酸皮肤素、藻酸盐、胶原蛋白、白蛋白、纤维接合素、层粘连蛋白、弹性蛋白、玻连蛋白、玻尿酸、纤维蛋白原、多支链聚合物(multi-arm polymer)及其组合所组成的群组。
3.如权利要求1所述的水凝胶组合物，其中所述主链是一多糖共聚物或一多糖均聚物。
4.如权利要求1所述的水凝胶组合物，其中所述键结是一酶促氧化偶联。
5.如权利要求4所述的水凝胶组合物，其中所述酶促氧化偶联是由所述多个聚合物在具有一酶以及一过氧化钙的环境下原位交联所形成，其中所述过氧化钙的浓度为0.4至1mM之间，而所述酶是一酪胺酸酶或一辣根过氧化酶。
6.一种酶促形成的水凝胶组合物，如下式(II)，其是以酶促反应形成，其包括：
多个聚合物，所述聚合物中包括同质或异质的一主链，如式(I)的结构；
其中，所述主链的至少一羧基与至少一钙离子螯合为如下式(II)的结构
Figure FDA0003227698720000021
7.如权利要求6所述的酶促形成的水凝胶组合物，其中所述主链包含由酪胺所形成的一分支，其中任两条聚合物上的相邻所述分支之间具有一键结如下式(III)结构的键结
Figure FDA0003227698720000022
8.如权利要求7所述的酶促形成的水凝胶组合物，其中所述如式(II)的结构以及所述如式(III)结构的键结，是所述聚合物在具有一氧化酶以及一过氧化钙的环境下原位交联所形成。
9.如权利要求8所述的酶促形成的水凝胶组合物，其中所述氧化酶是一酪胺酸酶或一辣根过氧化酶。
10.如权利要求8所述的酶促形成的水凝胶组合物，其中所述过氧化钙的浓度为0.4至1mM之间。
11.一种水凝胶组合物的制造方法，其包括下列步骤：
(a)以一酪胺与一聚合物的一主链反应，产生一前驱聚合物；
(b)加入一交联促进剂以及一离子螯合剂使多个所述前驱聚合物反应交联以供形成一水凝胶组合物。
12.如权利要求11所述的制造方法，其中在步骤(a)中，所述聚合物以及所述酪胺的反应比例是于1:0.4至1:6之间。
13.如权利要求11所述的制造方法，其中所述交联促进剂是一酪胺酸酶或一辣根过氧化酶。
14.如权利要求11所述的制造方法，其中所述离子螯合剂是一过氧化钙。
15.如权利要求11所述的制造方法，其中在步骤(b)中，所述离子螯合剂的反应浓度为0.4至1mM之间。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102688525A (zh) * 2012-05-07 2012-09-26 东南大学 一种生物大分子水凝胶及其制备方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2572804C (en) * 2004-07-09 2013-04-02 The Cleveland Clinic Foundation Hydroxyphenyl cross-linked macromolecular network and applications thereof
CN110343352B (zh) * 2019-07-24 2022-12-09 天津大学 基于过氧化钙/聚合物产氧粒子的双交联水凝胶及其制备方法
US20240082459A1 (en) * 2019-10-18 2024-03-14 Trustees of Tuffs College Chemical modification of silk fibroin for fabrication of enzymatically crosslinked hydrogels with tunable gelation kinetics and bioactivity

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102688525A (zh) * 2012-05-07 2012-09-26 东南大学 一种生物大分子水凝胶及其制备方法

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