TWI794800B - 克弗爾胜肽用於改善或治療憂鬱行為及其相關病症之用途 - Google Patents

Abstract

本發明係揭露胺基酸序列編碼為SEQ ID No.:1之克弗爾胜肽或是含有前述克弗爾胜肽之發酵產物係具有抗憂鬱活性，意即藉由投予一有效量之克弗爾胜肽或是含有有效量之克弗爾胜肽的組合物至一具有憂鬱行為之個體時，係能夠有效地改善或減緩個體之憂鬱行為，並且由於本發明所揭克弗爾胜肽係非為化合物，故長時間服用下，仍不會對於人體具有副作用。

Description

克弗爾胜肽用於改善或治療憂鬱行為及其相關病症之用途

本發明係有關於胜肽之第二用途，特別係指一種克弗爾胜肽用於改善或治療憂鬱行為及其相關病症之用途。

按，克弗爾發酵乳乃係由細菌及酵母菌所組成之克弗爾菌（kefir grain）發酵牛奶所得者，許多研究已經證實克弗爾發酵乳對於肥胖、腸胃道疾病、過敏等病症有改善之功效，並具有抗菌、提高傷口癒合、預防高血壓、抗氧化等功效。目前亦有針對上述功效而進一步將克弗爾發酵乳開發成為產品，於市面上銷售，不過，截止目前為止仍未有研究證實克弗爾發酵乳對於抑制或改善憂鬱行為具有幫助。

抑鬱症（Depression）是一種普遍且嚴重的精神疾病，目前已經成為全球發病率和死亡率的主要原因之一，亦成為一個重大的公共衛生問題。然而，有研究指出，由於抑鬱症的發病機制很複雜，因此臨床治療對於約3分之1的抑鬱症患者來說是沒有效的，並且，目前臨床上所使用之常規抗抑鬱藥，如選擇性單胺再攝取抑製劑（selective monoamine reuptake inhibitors）、三環類抗抑鬱藥（tricyclic antidepressants）、單胺氧化酶抑製劑（monoamine oxidase inhibitors），其投予至人體內會較慢被代謝於體外，意即會滯留於體內較長的時間，對於具有自殺傾向之抑鬱症患者來說可能會產生較高的危險性。

因此，開發更有效且無副作用之抑鬱症治療藥物或方法對於公共衛生與個人醫療來說都十分重要。

本發明之主要目的在於提供一種克弗爾胜肽用於改善或治療憂鬱行為及其相關病症之用途，其中，由於本發明所揭克弗爾胜肽係具有抗憂鬱活性，能夠上調海馬組織內BDNF（brain-derived neurotrophic factor）及其下游靶點之表現，以達到有效抑制個體憂鬱行為或改善與之相關之病症的功效。

本發明之另一目的係在於提供供一種克弗爾胜肽用於改善或治療憂鬱行為及其相關病症之用途，其中，由於本發明所揭克弗爾胜肽係得分離自一乳發酵產物，而非為人工合成之化合物，因此即便長時間服用下，仍不會對患者健康產生不良影響或副作用，將有利於臨床上長期使用於預防或治療與憂鬱行為相關病症。

緣是，為能達成上述目的，本發明係揭露一種克弗爾胜肽，其胺基酸編碼係包含有如SEQ ID No.:2所示之序列，而由於該克弗爾胜肽具有抗憂鬱活性，能更抑制或改善憂鬱行為，因此，透過投予有效量之該克弗爾胜肽或含有有效量克弗爾胜肽之組合物至一罹患憂鬱症之個體或憂鬱症高風險個體，係能夠調控個體海馬組織中與憂鬱行為相關基因或蛋白之表現，如提升BDNF表現、提升p-Erk1/2和p-TrkB之磷酸化狀態，以改善或抑制個體憂鬱行為，進而達到治療或預防憂鬱行為或其相關病症之功效。

其中，該克弗爾胜肽胺基酸編碼係如SEQ ID No.:2所示。

於本發明所揭實施例中，該含有有效量克弗爾胜肽之組合物係為一食品、一醫藥組合物或一機能性營養品。

於本發明之一實施例中，該含有有效量克弗爾胜肽之組合物係為一克弗爾發酵產物，其係將牛乳以克弗爾菌進行發酵反應後，移除菌體所得者。

於本發明之一實施例中，該含有有效量克弗爾胜肽之組合物係更包含有一胺基酸序列編碼SEQ ID No.:1之胜肽。

於本發明之一實施例中，該含有有效量克弗爾胜肽之組合物係更包含有一胺基酸序列編碼SEQ ID No.:3之胜肽。

於本發明之另一實施例中，該克弗爾胜肽係被用於製備為BDNF促進劑，意即藉由投予含有有效量之克弗爾胜肽至一個體中，係能有效地提升個體海馬組織內BDNF之表現。

本發明係揭露胺基酸序列編碼為SEQ ID No.:1之克弗爾胜肽或是含有前述克弗爾胜肽之發酵產物係具有抗憂鬱活性，意即藉由投予一有效量之克弗爾胜肽或是含有有效量之克弗爾胜肽的組合物至一具有憂鬱行為之個體時，係能夠有效地改善或減緩個體之憂鬱行為，並且能夠提升個體海馬組織中BDNF（brain-derived neurotrophic factor）之表現，以及活化BDNF / TrkB信息通道之能力，因此，本發明所揭克弗爾胜肽或是含有有效量之克弗爾胜肽的組合物係能夠具有治療或改善憂鬱行為或其相關病症之能力，並且能夠被開發為相關組合物，如機能性食品、營養補充品、醫藥品等。此外，相較於現有臨床藥物來說，由於本發明所揭克弗爾胜肽係非為化合物，故長時間服用下，仍不會對於人體具有副作用。

更進一步來說，當個體受到壓力或是其他外來因素而使海馬組織內BDNF表現下降，會導致有憂鬱行為之發生，而本發明所揭實例證實透過投予本發明所揭克弗爾胜肽或是含有克弗爾胜肽之組合物至一個體，係能夠提升其海馬組織內BDNF及其下游靶點p-TrkB / TrkB、p-Erk1/2 / Erk1/2之表現量，因而能更達到改善個體憂鬱行為或其相關病症之功效。

本發明所揭「克弗爾胜肽」，係包含有一胺基酸序列編碼為SEQ ID No.:1之序列，而克弗爾胜肽係得以人工合成方式或重組生物平台製備而成，或可由乳發酵產物中所分離得到。

舉例來說，本發明所揭克弗爾胜肽係能由一克弗爾發酵產物中分離得到，其中，而該克弗爾發酵產物係以一動物乳，如牛乳以一克弗爾菌（kefir grain）進行發酵所得之混合物。將上述該克弗爾發酵產物與本發明所揭克弗爾胜肽分別以以HPLC儀器以下列條件進行分析：檢測波長為215nm，分離管柱為SEC管柱，沖提液為100mM磷酸鹽緩衝液、1M氯化鈉以及1mM乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid；EDTA)，酸鹼值6.5，流速為0.5ml/min，結果如圖1A及圖1B所示，而比對圖1A及圖1B之結果可知，該克弗爾發酵產物中確實包含有本發明所揭克弗爾胜肽。

以下，為能驗證本發明之技術特徵及其功效，將茲舉若干實例並搭配圖式作更詳細說明如後。

以下實例中所使用之CD-1小鼠係購於國家實驗動物中心（National Laboratory Animal Center；NLAC；台灣台北）。

以下實例中所使用之胜肽係得由克弗爾發酵粉分離出，亦得由人工合成方法所製得。

以下實例中之數據都以平均數±標準差之方式呈現，並且以鄧肯檢測法（Duncan’s test）進行統計分析。

實例一：製備胜肽

將牛奶經克弗爾菌（kefir grain）進行發酵反應後，移除克弗爾菌元移除，凍乾得到克弗爾粉。根據計算，克弗爾粉末中肽含量計算為三甘氨酸當量，23.1 g / 100 g。

而後，透過HPLC進行分離程序，其中，使用之條件為流動相：100 mM KH2PO4、1 M NaCl、1 mM EDTA （pH = 6.5），流動速率0.5 ml/min，於215 nm進行檢測；並藉由LC-MS-MC分析胜肽分子量，並藉由已知胜肽序列庫進行所分離出來胜肽之確認及鑑定，結果如圖1A至圖1D所示，並且得到胺基酸序列如下表1所示。

表1：各胜肽及其序列

圖1中的序號	名稱	胺基酸序列	胺基酸序列編碼
1	胜肽1	TEIPAINTIASAEPTVH	SEQ ID No.:1
3	胜肽2	YQEPVLGPVRGPFPI	SEQ ID No.:2
5	胜肽3	KLHLPLPLVQSWM	SEQ ID No.:3

此外，上述胜肽1、胜肽2或胜肽3亦得由化學合成之方式合成而得。

實例二：動物試驗

取5週齡CD-1小鼠，提供標準實驗室動物飼料（Altromin, Germany）和蒸餾水（dH2O），並保持12小時在22-24°C下進行明/暗循環，在開始試驗之前，將各組小鼠先於實驗動物房中飼養1週以適應環境，而後隨機將小鼠分為4組，並依據下列條件處理各組小鼠並飼養8天（稱為飼養第1天至飼養第8天）：

第一組：口服蒸餾水；

第二組：口服150 mg/kg奶粉；

第三組：口服150毫克/公斤克弗爾發酵粉；

第四組：口服10 mg/kg藥物曲唑酮（trazodone hydrochloride）。

試驗結束後，麻醉各組小鼠並分離其海馬組織，冷凍保存，供後續實例使用。

實例二：高架迷宮測試（Elevated plus maze test，EPMT）

將實例一各組小鼠於飼養第7天依據上述條件處理6小時後，進行高架迷宮測試，並以攝影機觀察各組小鼠5分鐘內之路徑，結果如圖2A至圖2D所示，且分析各組小鼠於高架迷宮中之開放臂或封閉臂上所花費時間，結果如圖2E至圖2H所示。

比較圖2A至圖2D之結果可知，相較於第一組小鼠來說，第二組小鼠幾乎為移動到開放臂上，第三組小鼠與第四組小鼠係有移動到開放臂上，並且第三組小鼠於開放臂之路徑係多於第四組小鼠；又，由圖2F之結果可知，雖然第二組至第四組小鼠移動至中心之時間都較第一組小鼠來得增加，但是，由圖2G及圖2H之結果可知，相較於第二組及第四組小鼠來說，第三組小鼠於開放臂上之時間係明顯增加，並且降低於封閉臂上之時間。是以，由圖2A至圖2H之結果顯示，投予含有有效量本發明所揭克弗爾胜肽之組合物至一個體係能有效地緩解其焦慮行為，並且其改善焦慮行為之效果係優於臨床上所使用之抗憂鬱藥物。

實例三：開放空間測試（Open field test，OFT）

將實例二中各組小鼠於飼養第8天依據上述條件處理30分鐘後，進行開放空間測試，具體來說，各組小鼠先分別放置於開放空間（45 x 45 x 40 公分）5分鐘，並分別觀察其行進路徑、立即速度，並且，計算其至中心所花費的時間及在固定位置所花費的時間，結果如圖3A至圖3H所示。

由圖3A至圖3D之結果可看出各組小鼠於新環境之行為模式，並且第三組小鼠與第四組小鼠相較於第一組小鼠來說較為不焦慮；並由圖3E至圖3H之結果可知，相較於第一組小鼠來說，第三組與第四組小鼠之移動距離較長、移動速度較快，並願意花費時間移動到中心，且固定於某處不移動之時間較少，顯示第三組及第四組小鼠之憂鬱行為係有被改善。

由此實例之結果可知，含有有效量本發明所揭克弗爾胜肽之組合物確實具有改善個體憂鬱行為之能力，故本發明所揭克弗爾胜肽係能夠用以作為抗憂鬱藥物或是機能性組合物中之活性成分。

實例四：強制游泳試驗（Forced swimming test，FST）

將實例二各組小鼠於飼養第7天依據上述條件處理30分鐘後，進行游泳測試，測試時間為6分鐘，並以相機測量分析運動及不動的時間，結果如圖4所示，其中，不動時間係為不進行任何主動運動而僅有漂浮在水中之時間；運動時間係為進行主動運動或是圓周運動之時間。

由圖4之結果可知，第一組小鼠之不動和運動時間分別為1.5±0.3分鐘和2.5±0.3分鐘；第三組小鼠之不動和運動時間分別為0.7±0.2分鐘及 3.3±0.3分鐘；第四組小鼠之不動和運動時間分別為0.9±0.2分鐘及 3.1±0.3分鐘。

將上述結果相比顯示，相較於第一組小鼠來說，第三組及第四組小鼠之不動時間明顯減少（P ＜0.05），並且運動時間顯著增加（P ＜0.05）；由此可知，投予含有有效量本發明所揭克弗爾胜肽之組合物至具有憂鬱行為之個體，係能夠改善其憂鬱行為，並且，改善效果係將近於臨床上所使用之抗憂鬱藥物。

實例五：尾部懸掛測試（Tail suspension test，TST）

參照實例二之步驟，隨機將CD-1小鼠分為五組，並以下列條件進行飼養：

第一組：口服蒸餾水；

第二組：口服150 mg/kg克弗爾發酵粉；

第三組：口服實例一所揭胜肽1（10毫克/公斤），胺基酸序列為SEQ ID No.:1；

第四組：口服實例一所揭胜肽2（10毫克/公斤），胺基酸序列為SEQ ID No.:2。

第五組：口服實例一所揭胜肽3（10毫克/公斤），胺基酸序列為SEQ ID No.:3。

於各組小鼠飼養至第7天時，依據下列條件處理30分鐘後，進行尾部懸掛測試6分鐘，並於最後4分鐘測量不動時間，結果如圖5所示，其中，不動時間係指小鼠被懸掛且處於完全靜止不動之狀態。

由圖5之結果可知，第一組小鼠之不動和運動時間分別為2.2±0.3分鐘和1.8±0.3分鐘，而第二組、第三組、第四組及第五組小鼠之不動/運動時間分別為2.0±0.3分鐘/2.0±0.3分鐘、1.5±0.3分鐘/2.5±0.3分鐘、1.0±0.2分鐘/ 3.0±0.2分鐘和1.8±0.3分鐘/ 2.2±0.3分鐘。由圖5之結果顯示，相較於第一組小鼠來說，投予克弗爾發酵粉之第二組小鼠的不動時間略有減少且運動時間略有增加，但是將第三組至第五組小鼠之數據相比，僅有投予胜肽2（即圖1A中序號為3之波段）之第四組小鼠顯著減少了小鼠之不動時間（P ＜0.05），並增加了小鼠的運動時間（P ＜0.05）。

藉由實例二至實例四之結果已可清楚得知，投予克弗爾發酵粉係能夠有效地改善憂鬱個體之憂鬱行為及其相關病症，並且，經由本實例之結果更進一步證實克弗爾發酵粉中之胜肽2係具有抗抑鬱活性，意即投予含有有效量之胜肽2（即為本發明所揭克弗爾胜肽）係能夠達到治療或預防憂鬱行為及其相關病症之功效。

實例六：蛋白質表現分析

以RT-PCR法及西方墨點法分析實例二中之各組小鼠海馬組織之蛋白質與mRNA之表現，結果分別如圖6及圖7所示。

由圖6A至圖6C之結果可知，各組小鼠海馬組織中之CREB（cAMP responsive element-binding protein）mRNA皆無明顯變化，而相較於第一組小鼠來說，第三組及第四組小鼠係能夠明顯地提升BDNF mRNA表現；更進一步地由圖6D之結果可知，相較於第一組小鼠來說，第三組及第四組小鼠海馬組織中BDNF蛋白表現量皆提升2倍以上。

再者，由圖7B及圖7D之結果可知，相較於第一組小鼠來說，第三組及第四組小鼠海馬組織中TrkB和Erk1 / 2蛋白表現量沒有明顯改變，但是由圖7C及圖7E之結果可知，第三組及第四組小鼠海馬組織中p-Erk1/2 / Erk1/2和p-TrkB / TrkB的磷酸化狀態顯著增加（P ＜0.05）。

由圖6及圖7之結果顯示，投予含有本發明所揭克弗爾胜肽之組合物，如克弗爾發酵粉係能夠有效地提升個體海馬組織中BDNF蛋白表現量，並且提高p-Erk1/2 / Erk1/2、和p-TrkB / TrkB磷酸化表現量，由此證實本發明所揭克弗爾胜肽或含有本發明所揭克弗爾胜肽之組合物係能夠有效預防或改善憂鬱行為及其相關病症。

無

圖1A係為克弗爾發酵粉以HPLC儀進行分析後所得到之圖譜。 圖1B係為由克弗爾發酵粉分離之胜肽1以HPLC儀進行分析後所得到之圖譜。 圖1C係為由克弗爾發酵粉分離之胜肽2以HPLC儀進行分析後所得到之圖譜。 圖1D係為由克弗爾發酵粉分離之胜肽3以HPLC儀進行分析後所得到之圖譜。 圖2A係為第一組小鼠進行高架迷宮測試以攝影機所觀察之路徑。 圖2B係為第二組小鼠進行高架迷宮測試以攝影機所觀察之路徑。 圖2C係為第三組小鼠進行高架迷宮測試以攝影機所觀察之路徑。 圖2D係為第四組小鼠進行高架迷宮測試以攝影機所觀察之路徑。 圖2E係為統計分析各組小鼠進入高架迷宮所有臂入口所花費之時間的結果。 圖2F係為統計分析各組小鼠進入高架迷宮中心所花費之時間的結果。 圖2G係為統計分析各組小鼠進入高架迷宮開放臂所花費之時間的結果。 圖2F係為統計分析各組小鼠進入高架迷宮封閉臂所花費之時間的結果。 圖3A係為第一組小鼠於開放空間之移動路徑。 圖3B係為第二組小鼠於開放空間之移動路徑。 圖3C係為第三組小鼠於開放空間之移動路徑。 圖3D係為第四組小鼠於開放空間之移動路徑。 圖3E係為統計分析各組小鼠於開放空間之移動距離的結果。 圖3F係為統計分析各組小鼠於開放空間之移動速度的結果。 圖3G係為統計分析各組小鼠於開放空間移動至中心所花費之時間的結果。 圖3F係為統計分析各組小鼠於開放空間中於固定位置所花費之時間的結果。 圖4係為統計分析各組小鼠進行游泳試驗之不動和運動時間的結果。 圖5係為統計分析各組小鼠進行尾部懸掛測試之不動和運動時間的結果。 圖6A係以RT-PCR法分析各組小鼠海馬組織中BDNF（brain-derived neurotrophic factor）與CREB（cAMP responsive element-binding protein） mRNA之表現。 圖6B係定量各組小鼠海馬組織中BDNF mRNA表現量之結果。 圖6C係定量各組小鼠海馬組織中CREB mRNA表現量之結果。 圖6D係以西方墨點法分析各組小鼠海馬組織中BDNF與CREB蛋白之表現。 圖6E係定量各組小鼠海馬組織中BDNF 蛋白表現量之結果。 圖7A係以西方墨點法分析各組小鼠海馬組織中p-TrkB / TrkB蛋白之表現。 圖7B係定量各組小鼠海馬組織中TrkB總蛋白表現量之結果。 圖7C係定量各組小鼠海馬組織中p-TrkB蛋白相對於TrkB總蛋白表現量之結果。 圖7D係以西方墨點法分析各組小鼠海馬組織中p-Erk1/2 / Erk1/2蛋白之表現。。 圖7E係定量各組小鼠海馬組織中Erk1/2總蛋白表現量之結果。 圖7F係定量各組小鼠海馬組織中p-Erk1/2蛋白相對於Erk1/2總蛋白表現量之結果。

無

Claims (10)

1. 一種將克弗爾胜肽用於製備改善或抑制憂鬱行為或其病症之組合物之用途，其中，該克弗爾胜肽之胺基酸序列係包含有一如SEQ ID No.:2所示之編碼。
2. 如請求項1所述用途，其中，該克弗爾胜肽之胺基酸序列係如SEQ ID No.:2所示編碼。
3. 如請求項1所述用途，其中，該組合物中更包含有一胺基酸序列編碼SEQ ID No.:1之胜肽。
4. 如請求項1、2或3所述用途，其中，該組合物中更包含有一胺基酸序列編碼SEQ ID No.:3之胜肽。
5. 如請求項1所述用途，其中，該組合物係為一克弗爾發酵產物，而由下列步驟所製成： 將一牛乳以一克弗爾菌進行發酵反應後，移除菌體所得者。
6. 一種將克弗爾胜肽用於製備BDNF（brain-derived neurotrophic factor）促進劑之用途，其中，該克弗爾胜肽之胺基酸序列係包含有一如SEQ ID No.:2所示之編碼。
7. 如請求項6所述用途，其中，該克弗爾胜肽之胺基酸序列係如SEQ ID No.:2所示編碼。
8. 如請求項6所述用途，其中，該BDNF促進劑中更包含有一胺基酸序列編碼SEQ ID No.:1之胜肽。
9. 如請求項6、7或8所述用途，其中，該BDNF促進劑中更包含有一胺基酸序列編碼SEQ ID No.:3之胜肽。
10. 如請求項6所述用途，其中，該BDNF促進劑係為一克弗爾發酵產物，而由下列步驟所製成： 將一牛乳以一克弗爾菌進行發酵反應後，移除菌體所得者。

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