TWI791347B - 一種用於評估胚胎植入成功率的預測方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種透過分析子宮頸分泌物的甲基化圖譜來確定胚胎植入成功率以識別出潛在生物標記的方法。

Description

一種用於評估胚胎植入成功率的預測方法
本發明係關於一種用於在胚胎植入前評估女性個體的子宮內膜容受性(endometrial receptivity)的方法，包含對女性個體的子宮頸分泌物的甲基化圖譜中與生育相關生物標記進行分析。
自從1978年透過體外受精(in vitro fertilization，IVF)，已對59位受孕困難的婦女來說成為最有效的治療方法，這種醫學輔助生殖方法誕生第一個嬰兒。體外受精治療的數量在全球持續增加。成功懷孕需依賴胚胎、子宮內膜以及胚胎-子宮內膜同步性。儘管藉由胚胎著床前染色體非整倍數性篩檢(preimplantation genetic testing for aneuploidies，PGT-A)的應用來實現整倍體胚胎的選擇，從而提高臨床懷孕率和活產率，但並不總是能保證胚胎移植後的良好結果。經過數十年的發展，實驗室的排卵誘導步驟準則和胚胎培養系統已經不斷優化，從而改善胚胎的數量和質量。然而，因植入率仍然保持在25-40%，阻礙了體外受精的理想結果。為了克服體外受精成功上的最後一個障礙，即植入過程，子宮內膜狀態必須變得容易評估。
著床需要發育中的胚胎和子宮內膜之間高度協調的相互作用。不正常著床和生殖失敗之間的關聯是顯而易見的。子宮內膜允許胚胎著床的能力稱為容受性。成功懷孕必須建立在容受性子宮內膜上。儘管已經努 力特性化容受性子宮內膜，但不論是形態參數或分子生物標記都與懷孕結果沒有很好的相關性。正常著床發生在分泌中期的短時間內，稱為著床窗期(window of implantation，WOI)。在此期間，子宮內膜變得最容易接受以支持胚胎植入。最近，基於子宮內膜活組織檢驗的轉錄體學概述提出植入失敗是因著床窗期的改變所造成。此外，根據轉錄體學分析，如果胚胎移植的時間提前或延遲，則可以實現懷孕。確定著床窗期的時間範圍可以透過優化胚胎和子宮內膜之間的同步性來改善體外受精的懷孕結果。然而，植入失敗更常見於具有不正常或無著床窗期的子宮內膜。
人類子宮內膜是一種獨特的組織，每個月都經歷包括再生、重塑和崩解的變化。在每個週期中，子宮內膜幹細胞/先驅細胞負責在舊子宮內膜脫落後構建新的子宮內膜。月經期中子宮內膜組織的大規模重組會伴隨著顯著的表觀基因改變。子宮內膜的DNA甲基化在整個月經週期中幾乎維持不變，直到子宮內膜開始崩解的晚期分泌階段。DNA甲基化是一種主要的表觀基因事件，其涉及將甲基(-CH3)添加到DNA模板中胞嘧啶殘基中第5個位置的碳上。已發現幾種基因啟動子區域的異常甲基化與疾病密切相關。由於子宮內膜的DNA甲基化僅在幹細胞/先驅細胞參與再生時才會發生劇烈變化，因此每個新生長的子宮內膜可能都有不同的DNA甲基化特徵來調節其行為，包括允許胚胎植入的能力。多項研究表明，DNA甲基化的改變會損害參與胚胎-子宮內膜交擾、著床和蛻膜化的基因表現，從而導致生育力降低。證據還指出，子宮內膜組織的DNA甲基化基因體學(methylome)在健康可孕的捐贈者和反覆植入失敗的婦女之間存在差異。到目前為止，大多數調查子宮內膜容受性的研究都是基於對透過活組織檢 驗所獲得的子宮內膜組織的分析。子宮內膜活組織檢驗是一種封閉和侵入性手術，其透過將細導管插入子宮頸的自然開口並進入子宮腔以對子宮內膜腔採樣。在子宮內膜活組織檢驗中，從子宮內層中取出一小塊組織。由於子宮內膜活組織檢驗的侵入性不利於胚胎植入，因此必須在與分析的週期分開的週期中移植胚胎。因此，不同月經週期之間的子宮內膜差異不可以透過侵入性方式來評估，因此總是被忽略。關於侵入性分析的批評，例如在同一個人的月經週期之間所獲得的結果不一致，以及基於轉錄體學定義的WOI之個人化胚胎移植的不確定益處，可以透過子宮內膜的每月變化來解釋。
根據癌症篩檢的經驗，可以在出現於體液和分泌物的無細胞DNA或DNA片段中檢測到與癌症相關的DNA甲基化。事實上，子宮頸抹片上的甲基化基因體已被應用為非侵入性生物標記，可作為子宮內膜癌檢測，其檢測精確度高。由於子宮頸分泌物可以反映子宮內環境，因此甲基化圖譜(methylation profiles)可以作為研究懷孕和非懷孕週期之間子宮內膜DNA甲基化基因體差異的參考。
本發明提供一種基於植入前階段子宮頸分泌物的甲基化圖譜來評估胚胎植入成功率的預測方法。
本文使用的術語「一」或「一個」描述了本發明的要素和成分。該術語僅是為了便於本發明的描述和基本概念。該描述應被理解為包括一個或至少一個，且除非上下文另有說明，單數的術語包括複數形和複數的術語，包括單數形。當在請求項中使用該字詞「包含」時，該術語「一」或 「一個」可以表示一個或多於一個。
如本文所用，術語「或」可表示「及/或」。
子宮內膜是覆蓋在子宮腔內部的黏膜。它的功能是容納胚胎，使其著床並有利於胎盤的發育。這個過程需要一個能夠響應囊胚訊號的容受性子宮內膜，其為胚胎植入時的胚胎發育階段。人類子宮內膜是由荷爾蒙週期性調節的組織；能使其達到所述容受狀態的荷爾蒙為誘導細胞增生的雌二醇和參與分化的黃體酮(progesterone)，其能引起子宮內膜基因表現圖譜的大量變化，在稱為「著床窗期」的短時間內達到接受性表型。因此，子宮內膜容受性是子宮內膜為胚胎著床做準備的狀態。本發明首先證實來自子宮頸樣本的基因甲基化模式與懷孕週期期間內子宮內膜容受性的變化有關。
本發明提供一種識別用於確定胚胎植入成功率的潛在生物標記的方法，包含：(1)提供一來自女性個體的子宮頸樣本；(2)分析該子宮頸樣本上的核酸以生成一包含表4所列的1733個基因之甲基化圖譜(methylation profile)；(3)計算來自該甲基化圖譜中1733個基因的至少一個基因的統計值；以及(4)當該至少一個基因的統計值高於一閾值時，將該至少一個基因識別為該子宮頸樣本中用於確定胚胎植入成功率的生物標記。
在一具體實施例中，該子宮頸樣本是從子宮頸管腔中所取得的生物樣本。子宮頸位於人類女性生殖系統中子宮的下面，其由兩個部位所組成：子宮頸外頸(ectocervix)和子宮頸內頸(endocervical canal)。子宮頸將陰道與子宮主體連接起來，作為它們之間的通道。在解剖學和組織學上， 子宮頸與子宮並不相同，因此本發明將其視為獨立的解剖結構。在一較佳的具體實施例中，該生物樣本包含分泌物、上皮細胞、基質細胞、鱗狀細胞、腺細胞、免疫細胞、陰道液、陰道微生物群、粘液分子或水。
在另一具體實施例中，該子宮頸樣本是透過使用一棉籤(cotton applicator)、棉花球(cotton wool ball)、棉花棒(cotton swab)或棉球(cotton balls)所獲得。它可以輕輕地在子宮頸上摩擦以獲取樣本。
胚胎移植是體外受精過程的一部分。在一具體實施例中，該子宮頸樣本是在該女性個體接受胚胎移植前1-5天或當天所獲得。換言之，該子宮頸樣本是在該女性個體接受胚胎移植的-5~-1天或當天所獲得。在一較佳的具體實施例中，該子宮頸樣本是在第P+0、P+1、P+2、P+3、P+4或P+5天所獲得。在一更佳的具體實施例中，該子宮頸樣本是在第P+0天或第P+5天所獲得。P+0意指開始黃體酮補充的日期(視為P+0)。P+5意指黃體酮補充或施予的第5天(視為P+5)。黃體酮可以口服、陰道內、肌肉內或皮下施用。不同的補充黃體酮起始方式都有相關報導，從取卵前到取卵後6天不等。在目前IVF操作上，第3天卵裂期胚胎移植和第5天囊胚期胚胎移植在許多輔助生殖技術中心屬於常規的。因此，第3天的胚胎應提前2天進行移植。在一較佳的具體實施例中，該生物樣本是在體外受精期間內於胚胎移植前所獲得。
如本文所用，術語「個體」是指包括人類在內的動物。因此，術語「個體」包含任何可以受益於本發明方法之哺乳動物。「哺乳動物」一詞是指哺乳動物綱的所有成員。在一具體實施例中，該個體為一人類。
如本文所用，術語「甲基化」是指於一基因的核心啟動子區 域的CpG雙核苷酸內胞嘧啶的C5位置上甲基團共價鍵結。術語「甲基化狀態(methylation state)」是指感興趣的一基因或核酸序列內一或多個CpG雙核苷酸上是否存在5-甲基-胞嘧啶(5-mCyt)。如本文所用，術語「甲基化程度(methylation level)」是指感興趣的一個或多個複製基因或核酸序列中甲基化的量。甲基化程度可計算來成為該感興趣的基因或核酸序列內的甲基化之絕對值。再者，「相對甲基化程度(relative methylation level)」可表示成相對於DNA總量的甲基化DNA的量，或是表示成相對於該基因或核酸序列的複製總數的感興趣基因或核酸序列之甲基化複製數目。此外，「甲基化程度(methylation level)」可以是指在感興趣的DNA片段中，甲基化CpG位點所佔的百分比。
如本文所用，術語「甲基化圖譜(methylation profile)」是指一組用於呈現感興趣樣本中一或多個目標基因的甲基化程度之數據。在一具體實施例中，該甲基化圖譜是透過亞硫酸氫鹽定序PCR(bisulfite sequencing PCR，BSP)、減少代表性亞硫酸氫鹽定序(reduced representation bisulfite sequencing，RRBS)、全基因體亞硫酸氫鹽定序(whole genome bisulfite sequencing，WGBS)、甲基化DNA免疫沈澱法定序(methylated DNA immunoprecipitation sequencing，MeDIP)、酶促甲基定序(enzymatic methyl sequencing，EM-Seq)、質譜法、甲基化特異度PCR(methylation specific PCR)、qPCR、PCR、Sanger氏定序法、次世代定序儀、甲基化晶片、甲基化晶片陣列、離子流定序儀(ion torrent sequencer)、即時奈米孔定序、小基因體定序、目標區間定序、目標擴增定序、光纖式粒子電漿共振(fiber optical particle plasmon resonance，FOPPR)或是橫向質子弛豫(transverse proton relaxation)的變化來產生。在一較佳的具體實施例中，該甲基化圖譜是透過Infinium甲基化陣列、分塊式陣列(tiling microarray)或甲基化特異度PCR來產生。
本發明使用計算預測器(computational predictor)來執行一使用數據矩陣的數學工具，在這種情況下是用甲基化圖譜所產生的數據，並學習區分類別，在這種情況下根據不同的懷孕圖譜(懷孕和非懷孕)來產生二或多個類別。訓練分類器來定義類別的樣本集稱為訓練集。換句話說，程式使用這些樣本的甲基化圖譜(用於子宮內膜容受性測量)來了解哪些探針是資訊最多並區分類別(不同的正常非接受狀態和接受狀態)。隨著受試之樣本個數的增加，該訓練集將逐漸成熟。
分類是由生物資訊程式使用不同的數學演算法來完成的，故有許多可用的演算法。演算法為允許解決問題的操作下之定義明確、有序且有限的串列。在給定初始狀態和輸入下，透過連續且定義明確的步驟來達到最終狀態，從而獲得解決方案。分類器透過稱為交叉驗證的過程來計算所犯的錯誤，該過程包括將已知實際類別的訓練集樣本的一個子集從用於定義類別的群組中保留出來，然後用生成的模型來測試，看看它是否正確。這是透過進行所有可能的組合來完成的。計算分類器的效能，並且獲得正確分類訓練集的所有樣本的預測模型。換言之，訓練集的所有樣本都被預測器分類在發明人已知所分配的實際類別中。
根據與上述計算預測器相關的所有參數，來生成預測模型，該預測模型根據分配的實際類別對所有樣本進行分類。因此，子宮頸樣本中甲基化圖譜的基因可用於子宮內膜容受性的陽性識別。
因此，本發明也提供一種識別用於與胚胎植入成功率相關的潛在基因的方法，包含：(a)提供一來自女性個體的子宮頸樣本；(b)從子宮頸樣本中萃取核酸；(c)分析該核酸以生成一甲基化圖譜；(d)在一程式計算機中，將包含來自步驟(c)中該甲基化圖譜的基因甲基化程度的數據輸入到一經過訓練的演算法中，並基於基因甲基化程度與子宮內膜容受性變化的關係，以識別在該子宮頸樣本中與胚胎植入成功率相關的的一或多個基因；以及(e)以電子方式輸出一份報告，該報告識別在該子宮頸樣本中與胚胎植入成功率相關的一或多個基因。
本發明使用統計分析來對子宮頸樣本中甲基化圖譜的差異性甲基化檢測進行處理，然後選出表4中所列的表現最好的1733個基因。本發明進一步利用階層式模型將1733個基因分群為三個群聚，即群聚A(cluster A)、群聚B(cluster B)以及群聚C(cluster C)。根據DNA甲基化程度，群聚A是較低甲基化(<10%)的組別，其包含319個基因；群聚B是中等甲基化(20%~55%)的組別，其包含174個基因；以及群聚C是較高甲基化(>55%)的組別，其包含1240個基因。在一具體實施例中，該1733個基因分為包含319個基因的群聚A、包含174個基因的群聚B以及包含1240個基因的群聚C，其中該群聚A、B和C的基因列於表4中。
本發明進一步識別多基因的基因組可以作為表觀遺傳生物標記基因組(epigenetic biomarker panel)，以用於確定胚胎植入成功率。因此，本發明從群聚A、B及/或C中選擇至少一個基因進行驗證。在一具體實施例中，該至少一個基因是選自由群聚A、群聚B以及群聚C所組成的群組。例如，本發明識別出基於四、五或六個基因的基因組。在4個基因組 合(SYNE1、KCNC2、SLITRK2和PDE4C)中，AUC達到0.81(>0.8)。在另一具體實施例中，在5個基因組合(SYNE1、KCNC2、SLITRK2、PDE4C和TMEM62)中，AUC為0.81。在另一具體實施例中，在5個基因組合(SYNE1、KCNC2、SLITRK2、PDE4C和ARID3C；SYNE1、KCNC2、SLITRK2、PDE4C和CASR)中，AUC為0.82。在另一具體實施例中，在6個基因組合(SYNE1、KCNC2、SLITRK2、PDE4C、CASR和TMEM62)中，AUC為0.82。在另一具體實施例中，在6個基因組合(SYNE1、KCNC2、SLITRK2、PDE4C、CASR和ARID3C)中，AUC為0.83。
本發明還提供一種包含一基因組合的組合物，該基因組合包含SYNE1、KCNC2、SLITRK2和PDE4C，且該基因組合是用於確定胚胎植入成功率。因此，該組合物包含可用於確定胚胎植入成功率的多基因的基因組。更一般地，本發明識別和驗證多基因的基因組，其可以高精準度地預測體外受精週期中的臨床懷孕結果。
在一具體實施例中，該基因組合進一步包含至少一個基因，其是選自由TMEM62、ARID3C和CASR所組成的群組。
本發明採用統計方法以計算來自1733個基因的基因組的統計值。因此，本發明使用5折交叉驗證來評估分類器性能。本發明對每個數據集使用具有10次重複(共500次反覆模擬抽樣)的5折交叉驗證。計算最大和最小AUC(超過500次反覆模擬抽樣)。AUC為反覆抽樣法(bootstrap sampling)下所有500次重複的平均值，信賴區間是透過這些反覆模擬抽樣程序，從預測值和實際值的串聯中計算而得。在一具體實施例中，該至少一個基因的統計值為一透過接受者操作特徵(receiver operating characteristic， ROC)曲線所計算出的曲線下面積(area under the curve，AUC)的值。在一較佳的具體實施例中，該至少一個基因的統計值是透過k折交叉驗證(k-fold cross validation)所計算出的AUC值，其中k為整數。在另一具體實施例中，該k為4、5、10、20、50、100或500。在一較佳的具體實施例中，該k為5或500。在一具體實施例中，該AUC值是透過該k折交叉驗證來計算，該k折交叉驗證是基於在接受胚胎植入後的非懷孕組別和在接受胚胎植入後的懷孕組別的子宮頸樣本的甲基化圖譜來進行的，其中k為整數。在一較佳的具體實施例中，該AUC值是透過500次反覆抽樣來計算，該抽樣法是基於在接受胚胎植入後的非懷孕組別和在接受胚胎植入後的懷孕組別的子宮頸樣本的甲基化圖譜來進行的。
另外，該閾值是由ROC曲線上的數據點來決定。在一具體實施例中，該閾值為0.5。在一較佳的具體實施例中，該閾值為0.7。在一更佳的具體實施例中，該閾值為0.8。在另一具體實施例中，該閾值為0.9。
本發明進一步提供一種用於確定胚胎植入成功率的套組，其包含一組合物，其中該組合物包含用於檢測SYNE1、KCNC2、SLITRK2和PDE4C的第一結合分子。
在一具體實施例中，該組合物進一步包含用於檢測至少一個基因的第二結合分子，其中該至少一個基因選自由TMEM62、ARID3C以及CASR所組成的群組。
在一具體實施例中，該結合分子的形式包含抗體、胜肽、引子或探針。
本發明揭示來自子宮頸分泌物的DNA甲基化圖譜在懷孕和 非懷孕週期之間是有差異的。利用在胚胎移植過程中所獲得的子宮頸分泌物，使用甲基化狀態來預測懷孕結果的準確率可高達86.0%，其對個人化胚胎移植檢測提供新的途徑。
本發明的優點在於使用一種能夠利用懷孕結果確認測試成果的非侵入性方法。用於分析之子宮頸分泌物的檢測能夠確保避免對植入環境的擾動，對於研究子宮內膜容受性的月變化提供了工具。因為所分析的週期是受孕週期本身，所以這種非侵入性分析適用於新鮮和冷凍解凍(frozen-thawed)的胚胎。即使對自然受孕的體內受精胚胎來說，這種非侵入性測試也是一種透過識別容受性子宮內膜來表明生育週期的有前景之方式。
因此，本發明證明使用由子宮頸分泌物所確定的甲基化狀態以非侵入性評估子宮內膜容受性的可行性。中期分泌樣本的甲基化圖譜可以識別96.4%的容受性子宮內膜，這可以透過在同一週期的胚胎移植後進行的可行性懷孕來證實。透過快速診斷測試於胚胎移植前預測子宮內膜的容受性，將能夠藉由將良好的胚胎保存到具有良好子宮內膜的週期中來最大化成功懷孕的機會。甲基化圖譜不僅為子宮內膜容受性提供了客觀診斷，還涉及進一步瞭解懷孕的分子機制，這可能為子宮內膜和產科相關疾病的治療方法提供了新的方向。
圖1顯示在給定時間期間內(P+0~P+5)歸納採樣過程和穩定甲基化模式的圖表。圖1A顯示在胚胎移植的-5~-1天以及當天採集的子宮頸樣本，其相當於在荷爾蒙替代療法週期(P+0~P+5)中黃體酮給藥的第 1天、第2天、第3天、第4天或第5天。圖1B顯示非監督階層式分群法(unsupervised hierarchical clustering)是基於橫跨16個樣本(個體ID#344的第0天和第5天，個體ID#342第0天和第5天，個體ID#350的第0天和第5天，個體ID#107的第0天和第5天，個體ID#314的第0天和第5天，個體ID#239的第0天和第5天，個體ID#041的第0天和第5天，個體ID#339的第0天和第5天)的子宮頸分泌物中具有top 2000 DMPs的甲基化基因體圖譜來執行。數據顯示，大多數樣本配對(相同個體ID)已分配到同一個群聚(cluster)。八對中的7對(7/8)所配對出的臨床樣本(個體ID#344、#342、#350、#107、#314、#239和#339)在第0天和第5天顯示出相似的甲基化圖譜。P+0：開始攝入黃體酮。
圖2顯示子宮頸分泌物的高度可重複性的基因體全甲基化圖譜。圖2A顯示一呈現同一樣本上重複微陣列之間的高度相關性(R2=0.990)的散佈圖。每一個點代表一個CpG位點的β值。圖2B顯示懷孕組和非懷孕組之間的差異性甲基化探針(DMPs)的火山圖(volcano plot)。每一個點代表一個CpG位點的差異性甲基化程度，即非懷孕組的中間β值減去懷孕組的中間β值。紅點和綠點分別代表顯著(P<0.05)高甲基化(H)和低甲基化(L)的DMP。NP：非懷孕組。P：懷孕組。
圖3顯示top 2000 DMPs使用機器學習演算法對57個樣本的分類。圖3A顯示由k平均分群(k-means clustering)所產生的五個群聚。兩個群聚(綠色和橄欖色圓點)僅包含非懷孕樣本，另外兩個群聚(藍色和橘色三角形)僅包含懷孕樣本。最後一個群聚包含9個懷孕(粉紅色三角形)和6個非懷孕(粉紅色圓點)樣本。圖3B顯示t分佈隨機鄰近嵌入(t- SNE)導致兩個與懷孕狀態兼容的群聚。NP：非懷孕樣本。P：懷孕樣本。
圖4顯示樣本和甲基化數據的非監督階層式分群法。圖4A顯示57個樣本和top 2000 DMPs的非監督階層式分群分析。樣本用垂直方式呈現，DNA甲基化的數值則以水平呈現。青色和紫紅色的色帶分別代表懷孕和非懷孕樣本。第一群聚(C1)包括3個懷孕樣本，第二群聚(C2)包括24個懷孕和7個非懷孕樣本，以及第三群聚(C3)包括1個懷孕和22個非懷孕樣本。樣本的其他臨床參數如下：控制性卵巢高度刺激(controlled ovarian hyperstimulation，COH)引起的超生理荷爾蒙程度的暴露、子宮內膜異位症的存在以及接受胚胎移植的婦女年齡。圖4B顯示在熱度圖的左側，透過使用階層式分群法將2000 DMPs分群成具有不同特徵的三個主要群聚，其稱為群聚A、群聚B和群聚C。靛藍色代表高甲基化探針以及黃色代表未甲基化探針。
圖5顯示整個月經週期中子宮內膜上皮細胞和基質成纖維細胞(stromal fibroblasts)中所選定基因的時間性總轉錄組動力學(temporal transcriptome dynamics)。數據取自公開可用的單細胞RNA-seq(single-cell RNA-seq，scRNA-seq)資料庫。橙色條紋標記排卵日，藍色條紋代表著床窗期的時間範圍。FSH：濾泡刺激素。LH：黃體成長激素。
以下實施例是非限制性的並且僅代表本發明的各個面向和特徵。
材料與方法
1.臨床樣本
樣本採集於2018年至2021年。本發明包括至少一個質量好的胚胎準備移植的週期。在倫理委員會的批准下，所有參與的婦女都獲得了書面知情同意書。優質胚胎定義如下：(1)卵裂期胚胎具有足夠數量的細胞(培養第2天4-5個細胞，培養第3天7-9個細胞)和小於20%的碎片；以及(2)根據Gardner和Schoolcraft分級系統，囊胚評分
Figure 110146409-A0202-12-0014-23
3BB。
在胚胎移植過程中採集子宮頸分泌物的樣本。在本發明中使用的樣本是從胚胎移植前的子宮頸樣本所獲得的。來自女性個體的子宮頸樣本應在荷爾蒙替代療法(HRT)週期(有施予黃體酮)或在不論是否由人類絨毛膜促性腺激素(hCG)調控而誘發排卵所控制的自然週期中的黃體酮給藥的第0、1、2、3、4或5天(P+0~P+5)進行採集。在這種情況下，應在取卵後的第5、6或7天進行胚胎移植。根據妊娠12週時是否存在穩定胚胎心跳的臨床懷孕定義將樣本分為懷孕組和非懷孕組。總體而言，59個懷孕樣本和67個非懷孕樣本用於匹配分析。這些樣本被分成發現集(discovery set)和驗證集(validation set)。甲基化基因體圖譜是使用發現集生成的，包括27個懷孕和30個非懷孕樣本，接著用於陣列數據的驗證。驗證集包括32個懷孕和37個非懷孕樣本，其用於驗證所選基因的甲基化程度(表1)。記錄了納入在胚胎移植週期的臨床特徵，包括胚胎移植時婦女的年齡、子宮內膜異位症的存在、卵巢刺激的使用以及每次移植的胚胎數量。在卵巢刺激和取卵後進行體外受精，隨後移植新鮮胚胎。在冷凍胚胎移植週期中，子宮內膜是透過荷爾蒙替代療法來進行調理。對於患有子宮內膜異位症或子宮肌腺症的婦女，在子宮內膜調理之前，垂體下調至少要1個月。
2.DNA提取
胚胎移植程序前(P+0~P+5)用棉球收集子宮頸分泌物，將其放入50ml離心管中，4℃保存。使用1毫升磷酸鹽緩衝液沖洗棉球，然後以1000g離心10分鐘以收集流出物。使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN,Hilden,Germany)從流出物中萃取基因體DNA。DNA萃取物在使用前儲存於-20℃或-80℃。
3.差異性甲基化基因體學和生物資訊學分析
本發明使用Infinium MethylationEPIC BeadChip陣列從發現集產生出樣本的甲基化基因體圖譜，該陣列覆蓋超過850,000個CpG位點(Illumina,San Diego,CA,USA)。在BeadChip系統中，β值(範圍從0到1)，其中在給定CpG雙核苷酸中0.0相當於0%甲基化，1.0相當於100%甲基化，其用於呈現每個探針的DNA甲基化程度。來自I型和II型探針的甲基化程度透過Beta混合分位數(Beta-Mixture Quantile，BMIQ)方法進行標準化。去除具有單核苷酸多型性(SNP)的探針後，透過檢測每個探針的P值<0.05和β差異>|0.02|來鑑定出差異性甲基化探針(differentially methylated probes，DMPs)。接下來，本發明關注啟動子區域的DMPs，並透過接受者操作特徵曲線下的面積(area under the receive roperating characteristic curve，AUC)對它們進行排序。較高的AUC意味著區分懷孕和非懷孕樣本的準確性更高。各種DMP集的表現，例如Top 3000、Top 2000和Top 1500，透過樣本在懷孕結果方面的準確分類百分比來進行評估。Top 2000的DMP集具有最佳表現，並被選擇用於之後的分析中(表2)。
4.亞硫酸氫鹽轉化
使用EZ DNA甲基化試劑盒、EZ DNA甲基化試劑盒-DIRECT、EZ DNA甲基化試劑盒-GOLD、EZ DNA甲基化試劑盒-Lightning(Zymo Research Corp.,Irvine,CA,USA)或其他商業套組，並根據製造商的建議，將500pg-2μg基因體DNA、cDNA或片段DNA中的DNA進行亞硫酸氫鹽轉化。
5.統計分析
Mann-Whitney無母數U檢定用於識別兩個樣本群組之間甲基化程度的差異。使用連續變量的雙尾t檢定和用於分類變量的Fisher精確檢定評估所有差異的顯著性，顯著性閾值P<0.05。AUC是使用ROC套裝軟體中的Youden指數進行計算。為了估算基因組合在預測懷孕結果的表現，對全部樣本進行基於500回的五折交叉驗證(five-fold cross-validation)的邏輯迴歸模型來計算出AUC。執行上述分析，並使用R(版本3.3.2)或MedCalc版本19(MedCalc Software Ltd.,Ostend,Belgium；2018)中的統計套裝軟體進行繪圖。
6.生物標記基因組選擇
熱度圖分析與階層式分群法相互結合以用來研究Top 2000 DMPs是否可明確區分非懷孕組和懷孕組(圖4A)。圖4B顯示Top 2000 DMPs的無監督階層式分群分析。
7.用qMSP測量甲基化程度
為了驗證陣列數據，設計並驗證生物標記基因組(biomarker panel)。選擇Top 2000 DMPs中每個子群的一到兩個基因，以用於使用即時聚合酶連鎖反應來定量DNA甲基化程度。引子由Oligo 7.0 Primer分析軟 體(Molecular Biology Insights,Inc.,Colorado Springs,CO,USA)進行設計。在LightCycler 480 System(Roche,Indianapolis,IN,USA)上進行定量甲基化特異性聚合酶連鎖反應(Quantitative methylation-specific polymerase chain reaction，qMSP)測定。對全部樣本中的每個基因進行重複測試。為了標準化每個qMSP反應中輸入DNA的量，使用位於非CpG區域的第II型膠原基因(COL2A1)作為參考值。DNA甲基化程度透過交叉點(△Cp)值的差異來估算，定義如下：目標基因的Cp-COL2A1的Cp。測試結果為COL2A1的Cp值>36的樣本則定義為不可檢測。
8.階層式分群分析
階層式分群分析是一個逐步進行分群分析的過程。透過Euclidean或Manhattan距離和完全連結方法(complete linkage method)來計算距離矩陣以生成樹突樹(dendritic tree)。使用距離閾值來分離出最佳子群。
結果
1.子宮頸分泌物的基因體全甲基化圖譜
如圖1A所示，本發明使用Infinium MethylationEPIC BeadChip陣列(Illumina,San Diego,CA,USA)測量在胚胎移植前所收集的子宮頸分泌物的基因體全DNA甲基化圖譜。本發明中使用的子宮頸樣本是在胚胎移植前所獲得的。本發明揭示來自子宮頸分泌物的DNA甲基化圖譜在懷孕和非懷孕週期之間是不同的。使用在胚胎移植過程中所獲得的子宮頸分泌物，可以評估子宮內膜容受性。如圖1B所示，第0天(P+0)和第5天(P+5)的子宮頸分泌物之甲基化圖譜相對相似。
子宮頸分泌物的樣本根據胚胎移植後妊娠12週時是否存在穩定胚胎心跳的臨床懷孕定義分為懷孕組和未懷孕組。發現集包括28個懷孕和29個非懷孕樣本。表1中描述納入在發現集中胚胎移植週期的臨床特徵。甲基化程度的測量是可信賴的，如技術性複製之間的高度相關性(R2=0.99)所示(圖2A)。於質量控制篩選後剩餘的739,266個探針，在標準化後，懷孕週期和非懷孕週期的子宮頸分泌物之甲基化圖譜相對相似。
表1、樣本的臨床特徵
Figure 110146409-A0202-12-0018-1
懷孕和非懷孕樣本之間甲基化差異顯著的CpG位點有23569個，佔探針總數的3.2%(圖2B)。關於在基因體上的位置，大多數DMP位於基因本體區(gene body regions)，其次是間隔區(intergenic regions)。除了CpG島外，一部分DMP則散布在open sea區域。
2.透過差異性DNA甲基化預測懷孕結果
所有DMP的非監督階層式分群分析根據懷孕狀態準確分類出57個樣本中的45個(78.9%)(表2)。當僅使用位於啟動子區域的5569個DMP進行分析時，準確分類的百分比則變得更高(84.2%)(表2)。本發明透過根據AUC對啟動子DMP進行排列以進一步剔除不太相關的探針，來鑑定出具有最佳表現的基因組；AUC代表能將懷孕與非懷孕樣本區分的甲基化程度之能力。在此過程中，全部樣本以及懷孕樣本的準確分類百分比都在增加，直到DMP的大小小於2000(表2)。Top 2000啟動子DMPs對全部樣本的準確率為86.0%，對懷孕樣本的準確率為96.4%，這構成了具有最少的探針和能區分懷孕和非懷孕樣本的最佳表現的圖譜。
表2、差異性DNA甲基化預測懷孕結果的表現
Figure 110146409-A0202-12-0019-2
透過無監督階層式分群法對Top 2000 DMPs進行分析，如表3所示，其揭示根據懷孕結果將57個子宮頸分泌物樣本分成三個主要群聚。第一群聚(C1)包括全部來自妊娠週期的3個樣本。第二群聚(C2)包括大多數懷孕樣本，即24個懷孕樣本和7個非懷孕樣本。相比之下，大多數非懷孕樣本分群到第三群聚(C3)中，其包括22個非懷孕樣本和一懷孕樣本(表3)。分析可能影響懷孕結果的因素，例如接受胚胎移植的婦女年齡、子宮內膜異位症的存在以及因卵巢刺激引起的超生理荷爾蒙程度的暴露。上述因素均與三個群聚無關，這意味著所選的DMP對懷孕狀態的特異性。
表3、57個子宮頸樣本(27個懷孕(P組)和30個非懷孕(nP組))的階層式分群分析
Figure 110146409-A0202-12-0020-3
Top 2000 DMPs依據懷孕結果對樣本進行分類的能力也可以用其他機器學習技術來表徵。透過k平均分群分析，Top 2000 DMPs將57個樣本劃分成5個群聚。兩個群聚僅包含懷孕樣本，另外兩個群聚僅包含非懷孕樣本。只有一個群聚包含兩種樣本，其包括來自9個懷孕案例和6個非懷孕案例的15個樣本(圖3A)。本發明使用t分佈隨機鄰近嵌入(t-SNE)，一種非線性降維技術，在二維空間中可視化Top 2000 DMPs，其將57個樣本分類成懷孕狀態有無的兩個群聚(圖3B)。因此，子宮頸分泌物 中的DNA甲基化圖譜能夠區分懷孕週期和非懷孕週期，這實驗顯示甲基化狀態可以反映子宮內膜容受性。
3.用qMSP進行微陣列驗證
為了驗證甲基化狀態如何去反映出透過微陣列所發現的懷孕狀態，使用產生微陣列結果的相同樣本透過qMSP來測量選定基因的甲基化程度。與Top 2000 DMPs相關的基因包括1733個基因。表4顯示該1733個候選基因。同時，本發明最小化了特色的數量以選出用於懷孕結果預測的最佳多生物標記基因組。1733個候選基因可以分為3個群聚：A、B和C(表4)。該演算法也將Top 2000 DMSs分群為三個主要群組，其由在群聚A(相對低甲基化)中的355個DMP、群聚B中的191個DMP以及群聚C(相對高甲基化)中的1454個DMP所組成。
表4、Top 2000 DMPs中1733個候選基因的列表
Figure 110146409-A0202-12-0021-4
Figure 110146409-A0202-12-0022-5
Figure 110146409-A0202-12-0023-6
Figure 110146409-A0202-12-0024-7
Figure 110146409-A0202-12-0025-8
Figure 110146409-A0202-12-0026-9
4.甲基化生物標記基因組
根據Top 2000 DMPs的階層式分群法，從3個子群(群聚A、B和C)中選擇一、二或更多個基因並創建生物標記基因組。透過定量甲基化特異性聚合酶連鎖反應(qMSP)測試懷孕和非懷孕樣本中選定基因的甲基化程度差異。本發明進一步選出來自群聚A的SYNE1；來自群聚B的ARID3C、CASR、PDE4C和SLITRK2；以及來自群聚C的TMEM62和KCNC2以驗證體外受精的懷孕結果預測。在選擇的7個基因中，20個懷孕和23個非懷孕樣本中每個單一基因的AUC範圍為0.53-0.73，另外在32個懷孕和37個非懷孕樣本中的AUC範圍為0.53-0.78。為了進一步測試這些標記的有效性，全部126個樣本都用於透過具有500次反覆抽樣法的邏輯迴歸模型來估算基因組合的表現。如表5所證實，每個單一基因的AUC範圍為0.5至0.70。在選定的基因中，有兩個基因(SLITRK2和KCNC2)僅 在神經系統中報導過，而它們在子宮內膜中的作用尚不清楚。SLITRK2會編碼一種參與突觸形成和維持的跨膜蛋白。KCNC2會編碼電位閘控鉀離子通道的成分，這些成分是維持新皮質GABA中間神經元的高頻放電所必需的。至於最後兩個基因，SYNE1會編碼一種含有血影蛋白重複(spectrin repeat)的蛋白質，其能將核套膜(nuclear envelope)固定到細胞骨架上，這對於核定位至關重要；ARID3C會編碼一種螺旋-轉折-螺旋轉錄因子，暗指其在細胞生長、分化和發育過程中調節基因表現的作用。生物標記基因組中的多個標記組合能提高診斷敏感性，有助於優化體外受精的懷孕結果預測。
表5、用於區分懷孕和非懷孕樣本的單一基因甲基化程度之表現
Figure 110146409-A0202-12-0027-10
5.用於預測懷孕結果的基因組合之交叉驗證
為了進一步測試這些選定基因的基因組合在預測懷孕結果的表現，對全部126個樣本(包括發現集和驗證集)進行五折交叉驗證，以模擬更大的數據集，其可以用於估算樣本外的表現。在每一回交叉驗證中， 樣本被隨機分成五個大小相同的子群。四個子群用於執行分析(訓練集)，剩下的子群則用於驗證分析(測試集)。透過執行5折交叉驗證計算AUC分數。該過程重複5次，每個子群僅使用一次作為驗證數據。經過500回五折交叉驗證，驗證結果進行邏輯迴歸，如表6所示。為了預測模型，建立一個四基因的基因組(包括SYNE1、KCNC、SLITRK2和PDE4C)。ROC曲線揭示出良好的預測表現(AUC=0.81)。五基因組合或六基因組合顯示略高的AUC(0.81~0.83)。
表6、使用交叉驗證重抽樣下預測懷孕結果的基因組合之表現
Figure 110146409-A0202-12-0028-11
特色選擇與模型估計一起進行是必要的，以減少數據維度和 模型複雜性。上述發現暗示，所選基因的甲基化程度具有潛在診斷用途，可作為生物標記。重要的是，特色與名為多生物標記基因組的組合可能是提高診斷準確性的有效策略。
從公開的單細胞RNA-seq數據中檢索到這些選定基因在整個月經週期中正常子宮內膜的表現。在資料庫中只有KCNC2、PDE4C、SYNE1和TMEM62可用。如圖5所示，這四個基因在子宮內膜上皮細胞和基質成纖維細胞中均有表現。在上皮細胞中，PDE4C、SYNE1和TMEM62的表現程度在排卵後立即波動，但迅速恢復到正常程度並保持相對穩定，直到著床窗期的後半段。KCNC2表現在整個月經週期中表現得更穩定。在基質成纖維細胞中，排卵後沒有波動，這與上皮細胞的情況不同。只有PDE4C和TMEM62顯示出著床窗期後半部分的轉錄體變化，這意味著基質細胞參與蛻膜化。KCNC2在基質成纖維細胞中的表現程度在整個月經週期中表現穩定。RNA-seq廣泛用於研究與生物條件相關的基因表現變化。RNA-seq數據可以解釋環境暴露如何改變基因表現。與單一基因生物標記相比，本發明發現基於群聚的生物標記更加穩健和有效。
子宮內膜經歷由類固醇激素所驅使的涉及細胞增生、分化和崩解的循環變化(圖5)。子宮內膜的狀況可以透過外源荷爾蒙來精確控制，例如在人工週期中準備子宮內膜以移植冷凍胚胎。然而，在卵巢排卵週期之間複製子宮內膜的可能性不大，因為即使是同一位女性，在自然週期中也可能呈現不同的月經模式，或者在受刺激的週期中對相同的卵巢刺激方式有不同的反應。此外，每個月經週期的再生子宮內膜是由一個新的前驅細胞群所構成的，這意味著子宮內膜每月都有變化。本發明中使用子宮頸分泌物的 分析確保了植入環境不受擾動，這為調查子宮內膜容受性的月變化提供了診斷工具。
透過快速診斷測試在胚胎移植前預測子宮內膜的容受性，將能夠藉由將良好的胚胎保存到具有良好子宮內膜的週期中來最大化成功懷孕的機會。甲基化圖譜不僅為子宮內膜容受性提供了客觀診斷，並且涉及進一步瞭解懷孕的分子機制，這可能為子宮內膜和產科相關疾病的治療方法提供了新的方向。
本領域技術人員理解前述概要作為傳達本發明資訊的方法的描述。本領域技術人員將認同這些僅是說明性的並且許多等效物是可能的。

Claims (8)

  1. 一種識別用於確定胚胎植入成功率的潛在生物標記的方法，包含：
    (1)提供一來自女性個體的子宮頸樣本；
    (2)分析該子宮頸樣本上的核酸以生成一包含表4所列的1733個基因之甲基化圖譜(methylation profile)；
    (3)計算來自該甲基化圖譜中1733個基因的至少一個基因的統計值；以及
    (4)當該至少一個基因的統計值高於一閾值時，將該至少一個基因識別為該子宮頸樣本中用於確定胚胎植入成功率的生物標記。
  2. 如請求項1所述的方法，其中該子宮頸樣本是從子宮頸管腔中所取得的生物樣本，其中該生物樣本包含分泌物、上皮細胞、基質細胞、鱗狀細胞、腺細胞、免疫細胞、陰道液、陰道微生物群、粘液分子或水。
  3. 如請求項1所述的方法，其中該子宮頸樣本是在該女性個體接受胚胎移植前1-5天或當天所獲得。
  4. 如請求項1所述的方法，其中該甲基化圖譜是透過亞硫酸氫鹽定序PCR(bisulfite sequencing PCR，BSP)、減少代表性亞硫酸氫鹽定序(reduced representation bisulfite sequencing，RRBS)、全基因體亞硫酸氫鹽定序(whole genome bisulfite sequencing，WGBS)、甲基化DNA免疫沈澱法定序(methylated DNA immunoprecipitation sequencing，MeDIP)、酶促甲 基定序(enzymatic methyl sequencing，EM-Seq)、質譜法、甲基化特異度PCR(methylation specific PCR)、qPCR、PCR、Sanger氏定序法、次世代定序儀、甲基化晶片、甲基化晶片陣列、離子流定序儀(ion torrent sequencer)、即時奈米孔定序、小基因體定序、目標區間定序、目標擴增定序、光纖式粒子電漿共振(fiber optical particle plasmon resonance，FOPPR)或是橫向質子弛豫(transverse proton relaxation)的變化來產生。
  5. 如請求項1所述的方法，其中該1733個基因分為包含319個基因的群聚A(cluster A)、包含174個基因的群聚B(cluster B)以及包含1240個基因的群聚C(cluster C)，其中該群聚A、B和C的基因列於表4中。
  6. 如請求項5所述的方法，其中該至少一個基因是選自由群聚A、群聚B以及群聚C所組成的群組。
  7. 如請求項1所述的方法，其中該至少一個基因的統計值為一透過接受者操作特徵(ROC)曲線所計算出的曲線下面積(AUC)的值。
  8. 如請求項1所述的方法，其中該閾值為0.7。
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