TWI782920B - 新型抗-pcsk9抗體 - Google Patents

Abstract

本發明提供針對前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶Kexin 9型(PCSK9)之單株抗體，其可阻斷PCSK9與LDL受體之結合，因此降低LDL-C之水準。本發明之抗體提供治療多種CVD疾病之非常有效的試劑。

Description

新型抗-PCSK9抗體

本發明係關於新型抗PCSK9抗體。

心血管疾病一直是威脅人類健康及生命的頭號殺手(World Health Organization (WHO), World Health Organization (2011)。各類研究報導顯示，低密度脂蛋白膽固醇的降低可有效減少患心血管疾病的風險。目前降低膽固醇主要採用他汀類藥物。但很多患者由於副作用而無忍受高劑量的他汀類藥物或藉由他汀類藥物無法有效控制血脂(Baigent, C.等人, Lancet 2000, 376(9753), 1670-1681)，該領域強烈需要新型治療方法。 前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶Kexin 9型(PCSK9)最早作為調控神經細胞凋亡的轉化酶-1而被發現。其主要在小腸及肝臟中合成(Seidah NG等人, Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100:928-33)。其前結構域經過細胞內的自裂解後成為成熟的PCSK9，然後經由肝臟細胞分泌出來(McNutt, M.C.等人, J. Biol. Chem. 2007, 20(282), 20799-20803)。在膽固醇代謝調節中，PCSK9扮演很重要的角色。研究人員在兩個患有常染色體顯性遺傳高膽固醇血症的法國家族中發現了PCSK9的功能增強型突變基因，從而發現了其在膽固醇代謝調節中的作用(Abifadel M等人, Nat Genet 2003;34:154-6)。PCSK9主要藉由結合低密度脂蛋白受體(LDL-R)從而在肝臟中經分解以達成調節膽固醇水準的作用。在不存在PCSK9的條件下，肝臟細胞上的低密度脂蛋白受體在運送低密度脂蛋白膽固醇至溶菌酶進行降解之後，將循環回到細胞膜表面。當PCSK9結合至低密度脂蛋白受體上時，將阻礙LDL-R之循環使用，且將加劇其降解(Verbeek, R.,等人, Eur J Pharmacol 2015; Lo Surdo P等人, EMBO Rep 2011;12:1300-5)。 目前在研中的幾種抑制PCSK9之方法包括藉由抗體或多肽結合來阻止PCSK9與LDL-R的結合，藉由基因沉默來抑制PCSK9的合成，藉由小分子藥物來抑制PCSK9的細胞內的合成(Michel Farnier, Archives of Cardiovascular Disease, 2014, 107, 58-66)。近期獲批的單株抗體Alirocumab及Evolocumab在二期及三期臨床研究中均顯示在降低低密度脂蛋白膽固醇方面的顯著效果。現有資料顯示，無論是否接受過他汀類藥物治療，低密度脂蛋白膽固醇水準的降低可達到70% (Dias, C.S等人, J.Am.Coll.Cardiol. 2012, 60(19), 1888-1898; Giugliano, R.P等人, Lancet, 2012, 380(9858), 2007-2017; McKenney, J.M等人, J. Am. Coll. Cardiol. 2012, 59(25), 2344-2353)。

本申請提供新型抗PCSK9單株抗體(尤其為全人源抗體)、編碼其之多核苷酸及使用其之方法。 在一態樣中，本申請提供分離的抗體或其抗原結合片段，其包括選自下組之重鏈CDR序列：SEQ ID NO: 1、3、5、13、15、17、25、27、29、37、39、41、49、55、57、59、67及69。 在某些實施例中，所述之抗體或其抗原結合片段包括輕鏈CDR序列，所述序列選自：SEQ ID NO: 7、9、11、19、21、23、31、33、35、43、45、47、51、53、61、63、65及71。 在某些實施例中，所述之抗體或其抗原結合片段包括選自下組之重鏈可變區： a) 重鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3及/或SEQ ID NO: 5； b) 重鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15及/或SEQ ID NO: 17； c) 重鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27及/或SEQ ID NO: 29； d) 重鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 93及/或SEQ ID NO: 41； e) 重鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 49及/或SEQ ID NO: 17； f) 重鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57及/或SEQ ID NO: 59；及 g) 重鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 67及/或SEQ ID NO: 69。 在某些實施例中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段包括輕鏈可變區，所述輕鏈可變區選自： a) 輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9及/或SEQ ID NO: 11； b) 輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21及/或SEQ ID NO: 23； c) 輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO:31、SEQ ID NO: 33及/或SEQ ID NO: 35； d) 輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45及/或SEQ ID NO: 47； e) 輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53及/或SEQ ID NO: 23； f) 輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 63及/或SEQ ID NO: 65；及 g) 輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9及/或SEQ ID NO: 71。 在某些實施例中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段包括： a) 重鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3及/或SEQ ID NO: 5；及輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9及/或SEQ ID NO: 11； b) 重鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15及/或SEQ ID NO: 17；及輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO:19、SEQ ID NO: 21及/或SEQ ID NO: 23； c) 重鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27及/或SEQ ID NO: 29；及輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33及/或SEQ ID NO: 35； d) 重鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39及/或SEQ ID NO: 41；及輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 35及/或SEQ ID NO: 47； e) 重鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 49及/或SEQ ID NO: 17；及輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53及/或SEQ ID NO: 23； f) 重鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57及/或SEQ ID NO: 59；及輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 63及/或SEQ ID NO: 65；或 g) 重鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 67及/或SEQ ID NO: 69；及輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9及/或SEQ ID NO: 71。 在某些實施例中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段包括選自下組之重鏈可變區：SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 93及SEQ ID NO: 97及與其具有至少80% (如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性之同源序列。 在某些實施例中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段包括選自下組之輕鏈可變區：SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 95及SEQ ID NO: 99及與其具有至少80% (如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性之同源序列。 在某些實施例中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段包括 a) 重鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 73；及輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 75； b) 重鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 77；及輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 79； c) 重鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 81；及輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 83； d) 重鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 85；及輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 87； e) 重鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 89；及輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 91； f) 重鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 93；及輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 95； g) 重鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 97；及輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 99；或 h) 與a)、b)、c)、d)、e)、f)或g)具有至少80% (如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性之重鏈可變區及輕鏈可變區。 在某些實施例中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段能夠以不超過10^-7 M、不超過10^-8 M、不超過10^-9 M、不超過10^-10 M、不超過10^-11 M或不超過10^-12 M之KD值特異性地與人PCSK9結合，所述Kd值藉由表面電漿(SPR)共振結合法測定。 在某些實施例中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段能夠以不超過10^-7 M、不超過10^-8 M、不超過10^-9 M、不超過10^-10 M、不超過10^-11 M或不超過10^-12 M之KD值特異性地與人PCSK9結合，所述Kd值藉由ELISA法測定。 在某些實施例中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段能夠以不超過10^-7 M、不超過10^-8 M、不超過10^-9 M、不超過10^-10 M、不超過10^-11 M或不超過10^-12 M之KD值特異性地與猴PCSK9結合。 在某些實施例中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段能夠以不超過2.1 nM (例如不超過3 nM、2.5 nM、1.8 nM、1.7 nM、1.6 nM、1.5 nM、1.4 nM、1.3 nM、1.2 nM或1 nM)之IC50值阻斷人PCSK9與其配位體的結合。在某些實施例中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段能夠以不超過0.15 nM (例如不超過0.14、0.13、0.12、0.11、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03或0.02 nM)之EC50值與人PCSK9結合。 在某些實施例中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段能夠以不超過115 nM、不超過106 nM、不超過80 nM、不超過77 nM、不超過66 nM或不超過40 nM之IC50值(例如不超過120 nM、110 nM、100 nM、90 nM、85 nM、80 nM、75 nM、70 nM、65 nM、60 nM、55 nM、50 nM、45 nM、40 nM、35 nM、30 nM、25 nM、20 nM、15 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM或1 nM)恢復細胞LDL吸收。 在某些實施例中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段在血清中至少1天、至少3天、至少4天、至少5天、至少一週、至少2週、至少一個月為穩定的。 在某些實施例中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段不介導ADCC或CDC或兩者均不介導。 在某些實施例中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段為全人源單株抗體。在某些實施例中，所述全人源單株抗體由宿主細胞或轉殖基因動物生產。 在某些實施例中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段能夠在動物中減少LDL膽固醇水準至10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、77%、80%、84%、85%、90%、95%或更多。在某些實施例中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段能夠在動物中維持HDL膽固醇水準。 在某些實施例中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段具有至少165小時、至少250小時、至少360小時、至少390小時或至少450小時之血清半衰期(例如至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少180、至少200、至少300、至少350、至少400、或至少500小時)。 在一態樣中，本申請提供抗體或其抗原結合片段，其與本申請所述之抗體或其抗原結合片段競爭相同抗原決定區。 在某些實施例中，本申請提供一種抗體或其抗原結合片段為駱駝化單域抗體(camelized single chain domain antibody)、雙功能抗體(diabody)、scFv、scFv二聚體、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、ds雙功能抗體(ds diabody)、奈米抗體、域抗體或雙價域抗體。 在某些實施例中，本申請提供一種抗體或其抗原結合片段進一步包括免疫球蛋白恆定區。 在某些實施例中，本申請提供一種抗體或其抗原結合片段進一步包括綴合物。在某些實施例中，所述綴合物可為可偵測標記、藥代動力學修飾部分或純化部分。 在一態樣中，本申請亦提供分離的多核苷酸，其編碼如本申請所述之抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，本申請提供的多核苷酸編碼如本申請所述之抗體或其抗原結合片段的胺基酸序列。在某些實施例中，本申請提供包括此等多核苷酸的載體。在某些實施例中，本申請提供表現本申請所述之一或多種抗體或抗原結合片段之方法，其藉由在載體中表現由多核苷酸編碼的抗體或抗原結合片段的條件下培養宿主細胞實現。在某些實施例中，本申請提供的多核苷酸在載體中與啟動子如SV40啟動子可操作地連接。在某些實施例中，包括本申請提供之載體的宿主細胞為中國倉鼠卵巢細胞，或293細胞。 在一態樣中，本申請提供表現如本申請所述之抗體或其抗原結合片段的之方法，包括在表現所述多核苷酸之條件下培養所述宿主細胞。 在一態樣中，本申請提供包括本申請所述之抗體或其抗原結合片段之套組。 在一態樣中，本申請提供在個體中治療與PCSK9相關之疾病或病況之方法，其包括向所述個體施用治療有效量之本申請所述之抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，所述個體經鑑定為患有可能對PCSK9抑制劑響應之病症或病況。在某些實施例中，所述個體經鑑定為在來自所述個體之待測生物樣品中血清LDL膽固醇(LDL-C)、總膽固醇及/或非HDL膽固醇水準上調或LDL受體水準下降。在某些實施例中，在施用所述抗體或其抗原結合片段後，所述LDL-C及/或總膽固醇水準減少。 在一態樣中，本申請亦提供醫藥組合物，包括本申請所述之抗體或其抗原結合片段以及一或多種醫藥學上可接受之載體。在某些實施例中，所述醫藥學載體可為例如稀釋劑、抗氧化劑、輔劑、賦形劑或無毒的輔助物質。 在一態樣中，本申請亦提供治療將自上調的免疫響應獲益的個體病況之方法，包括對所述個體施用有效量之本申請所述之抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，所述個體具有上調的LDL-C、總膽固醇及/或非HDL膽固醇水準或下調的LDL受體水準。 在一態樣中，提供本申請所述之抗體或其抗原結合片段在製備用於治療將自上調的免疫響應中獲益的病況之藥物中之用途。在某些實施例中，所述病況為心血管疾病、發炎性疾病及感染性疾病。在一態樣中，所述感染性疾病為敗血症。

本申請之以下描述僅為說明本申請之多種實施例。因此，此處討論之具體修改方式不應理解為對申請範圍之限制。熟習此項技術者在不偏離本申請範圍之情況下即可很容易地得出多種等同方式，變化及修改，應理解，此類等同實施例包括在本發明範圍內。在本申請中引用之所有文獻，包括公佈出版物、專利及專利申請均以全文引用的方式併入。定義 本發明中的「抗體」一詞包括任意可結合某特定抗原的免疫球蛋白、單株抗體、多株抗體、多特異性抗體或雙特異性(雙價)抗體。一個天然的完整抗體包含兩條重鏈及兩條輕鏈。各重鏈由一可變區及第一、第二、第三恆定區組成；各輕鏈由一可變區及一恆定區組成。哺乳動物之重鏈可分為α、δ、ε、γ及μ，哺乳動物之輕鏈可分為λ或κ。抗體呈「Y」型，「Y」型結構的頸部由兩條重鏈的第二及第三恆定區組成，其藉由二硫鍵結合。「Y」型結構之各臂包括其中一重鏈之可變區及第一恆定區，其與一輕鏈之可變區及恆定區結合。輕鏈及重鏈之可變區決定抗原之結合。各鏈之可變區均含有三個高變區，稱互補決定區(CDR)(輕鏈(L)之CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重鏈(H)之CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本發明中揭示之抗體及抗原結合片段之CDR邊界可藉由Kabat、Chothia或Al-Lazikani命名法命名或識別。(Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M., J. Mol. Biol., 273(4), 927 (1997); Chothia, C.等人，J Mol Biol. Dec 5;186(3):651-63 (1985); Chothia, C.及Lesk, A.M., J.Mol.Biol., 196,901 (1987); Chothia, C.等人，Nature. Dec 21-28;342(6252):877-83 (1989) ; Kabat E.A.等人，National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。其中，三個CDR由稱為框架區(FR)的側面連續部分間隔開，框架區比CDR更加高度保守且形成一個支架支撐超變環。重鏈及輕鏈的恆定區與抗原結合無關，但具有多種效應功能。抗體依據重鏈恆定區的胺基酸序列可分成幾類。根據是否含有α、δ、ε、γ及μ重鏈，抗體可分別分為五個主要的分類或異構體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。幾個主要的抗體分類亦可分為亞類，如IgG1(γ1重鏈)、IgG2(γ2重鏈)、IgG3(γ3重鏈)、IgG4(γ4重鏈)、IgA1(α1重鏈)或IgA2(α2重鏈)等。 本申請中之「抗原結合片段」一詞係指由含有一或多個CDR的抗體部分或任何其他結合抗原但不具有完整抗體結構的抗體片段所形成的一種抗體片段。抗原結合片段的例子包括，但不限於，如雙功能抗體(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')₂ 、Fv片段、二硫鍵穩定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂ 、雙特異性dsFv(dsFv－dsFv')、二硫鍵穩定的雙功能抗體(ds diabody)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv二聚體(雙價的雙功能抗體)、雙價單鏈抗體(BsFv)、多特異性抗體、駱駝化單域抗體(camelized single domain antibody)、奈米抗體、域抗體及雙價域抗體。抗原結合片段可與母體抗體結合相同抗原。在某些實施例中，抗原結合片段可含有來自某特定人抗體的一或多個CDR，移接至來自一或多個不同人抗體的框架區。 抗體的「Fab」片段係指由一條輕鏈(包括可變區及恆定區)及一條重鏈的可變區及恆定區經二硫鍵結合起來的那部分抗體分子。 「Fab'」片段係指包含部分鉸鏈區之Fab片段。 「F(ab')₂ 」係指Fab的二聚體。 抗體的「Fc」係指由重鏈的第二、第三恆定區經二硫鍵結合組成的那部分抗體。抗體的Fc段負責多種不同的效應功能如ADCC及CDC，但不參與抗原的結合。 抗體的「Fv」段係指含有完整抗原結合位點的最小抗體片段。Fv片段由一條輕鏈的可變區及一條重鏈的可變區組成。 「單鏈Fv抗體」或「scFv」係指由輕鏈可變區與重鏈可變區直接相連或經由一個肽鏈連接而成的工程抗體(Huston JS等人，Proc Natl Acad Sci USA, 85:5879 (1988))。 「單鏈抗體Fv-Fc」或「scFv-Fc」係指由連接至某抗體Fc段的scFv組成之工程抗體。 「駱駝化單域抗體(Camelized single domain antibody)」、「重鏈抗體」或「HCAb(Heavy-chain-only antibodies，HCAb)」均係指含有兩個V_H 域而不含有輕鏈之抗體(Riechmann L.及Muyldermans S., J Immunol Methods. 12月10日;231(1-2):25-38 (1999); Muyldermans S., J Biotechnol. 6月;74(4):277-302 (2001); WO94/04678; WO94/25591; 美國專利第6,005,079號)。重鏈抗體最初自駝科(駱駝、單峰駝及美洲駝)衍生得到。雖然缺失輕鏈，駱駝化抗體(camelized antibodies)有確證的抗原結合全部功能(Hamers-Casterman C.等人，Nature. 6月3日;363(6428):446-8 (1993); Nguyen VK.等人，「Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation,」 Immunogenetics. 4月;54(1):39-47 (2002); Nguyen VK.等人，Immunology. 5月;109(1):93-101 (2003))。重鏈抗體的可變區(VHH域)為最小的已知的獲得性免疫產生的抗原結合單位(Koch-Nolte F.等人，FASEB J. Nov;21(13):3490-8. 電子版2007年6月15日 (2007))。 「奈米抗體」係指一種抗體片段，其由一個來自重鏈抗體之VHH域及兩個恆定區CH2及CH3組成。 「雙功能抗體(diabody)」包括帶有兩個抗原結合位點之小抗體片段，其中該片段含有在同一條多肽鏈上相連的V_H 域及V_L 域(V_H -V_L 或V_H -V_L ) (請參見，Holliger P.等人，Proc Natl Acad Sci U S A. 7月15日;90(14):6444-8 (1993)；EP404097；WO93/11161)。兩個域之間銜接物很短，使同一條鏈上的兩個域不能互相配對，從而迫使兩個域與另一條鏈的互補域配對，形成兩個抗體結合位點。這兩個抗體結合位點可靶向結合相同或不同的抗原(或抗原之抗原決定區)。 「域抗體」係指僅含有一條重鏈可變區或一條輕鏈可變區之抗體片段。在某些情況下，兩個或多個V_H 域由一個多肽銜接物共價結合且形成雙價域抗體。雙價域抗體的兩個V_H 域可靶向作用於相同或不同的抗原。 在某些實施例中，「(dsFv)₂ 」含有三條肽鏈：兩個V_H 基團間藉由一條多肽銜接物相連，且藉由二硫鍵與兩個V_L 基團結合。 在某些實施例中，「雙特異性ds雙功能抗體」含有V_L1 -V_H2 (由一個多肽銜接物相連)及V_H1 -V_L2 (亦由一個多肽銜接物相連)，兩者在V_H1 及V_L1 間藉由二硫鍵結合。 「雙特異性dsFv」或「dsFv-dsFv」含有三條多肽鏈：V_H1 -V_H2 基團，其中兩者之重鏈藉由多肽銜接物(如：長彈性銜接物)相連，且藉由二硫鍵分別與V_L1 及V_L2 基團結合，每對藉由二硫鍵配對的重鏈輕鏈具有不同的抗原特異性。 在某些實施例中，「scFv二聚體」為雙價雙功能抗體或雙價單鏈抗體(BsFv)，含有二聚化的兩個V_H -V_L (由多肽銜接物連接)基團，其中一個基團的V_H 與另一個基團的V_L 協作形成兩個結合位點，這兩個結合位點可靶向結合相同抗原(或抗原之抗原決定區)或不同抗原(或抗原之抗原決定區)。在另一些實施例中，「scFv二聚體」為雙特異性雙功能抗體，含有相互連接的V_L1 -V_H2 (由多肽銜接物連接)及V_H1 -V_L2 (由多肽銜接物連接)，其中V_H1 及V_L1 協作，V_H2 及V_L2 協作，且各協作之配對具有不同抗原特異性。 本申請中使用之術語「全人源」當用於抗體或抗原結合片段時，係指所述抗體或抗原結合片段具有某胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成，所述胺基酸序列對應於由人或人免疫細胞生產的、或自例如利用人源抗體庫的轉殖基因非人動物等非人來源衍生之抗體的胺基酸序列，或其他編碼人源抗體的序列。在某些實施例中，全人源抗體不包含來源於非人抗體的胺基酸殘基(特別是抗原結合殘基)。 本申請中使用之術語「人源化」當用於抗體或抗原結合片段時，係指包括來源於非人動物的CDR、來源於人的FR區，以及來源於人的恆定區(當適用時)的抗體或抗原結合片段。由於人源化的抗體或抗原結合片段具有降低的免疫原性，其在某些實施例中可用作人的治療劑。在一些實施例中，所述非人動物為哺乳動物例如小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、豚鼠或倉鼠。在一些實施例中，所述人源化抗體或抗原結合片段除了CDR序列為非人源的以外，基本上全部由人源序列組成。在一些實施例中，所述來源於人的FR區可包括與其來自的人源抗體相同的胺基酸序列，或其可包括一些胺基酸改變，例如，不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸改變。在一些實施例中，該胺基酸改變可僅存在於重鏈FR區、僅存在於輕鏈FR區或同時存在於兩個鏈中。在一些較佳實施例中，所述人源化抗體包括人源FR1-3及人源JH及Jκ。 本申請中使用之術語「嵌合」係指具有來源於一種物種之重鏈及/或輕鏈的一部分，及所述重鏈及/或輕鏈其餘部分來源於不同物種的抗體或抗原結合片段。在一例示性實例中，嵌合抗體可包括來源於人之恆定區及來源於非人動物，例如小鼠之可變區。 本申請使用之「PCSK9」係指前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶Kexin 9型，其為屬於分泌性枯草桿菌蛋白酶家族的蛋白酶K亞家族的天然的人前蛋白轉化酶。PCSK9作為溶酶原合成，在內質網中經歷自催化型分子內處理，且視為作為前蛋白轉化酶起作用。PCSK9在調節血液中膽固醇水準具有關鍵作用。PCSK9的功能獲得性(如S127R、F216L及D374Y)突變可能與一種常染色體顯性遺傳的家族性高膽固醇血症相關，其中PCSK9突變提高了LDL受體水準(參見如Burnett及Hooper, Clin Biochem Rev (2008) 29(1): 11-26、Benjannet等人 J. Biol. Chem., (2004) 279(47):48865-48875及Fasano T等人, Atherosclerosis. (2009) 203(1):166-71)。人源PCSK9代表性的胺基酸序列由GenBank登記號NP_777596.2揭示，且編碼所述人源PCSK9的代表性核酸序列由GenBank登記號FJ525880.1揭示。在某些實施例中，術語PCSK9包括PCSK9胺基酸序列的轉譯後修飾的PCSK9揭示，如糖基化、聚乙二醇化PCSK9序列、剪切掉其信號序列的PCSK9序列或自催化結構域中剪切掉其原結構域(pro domain)但不與所述催化結構域分離的PCSK9序列。 本申請使用之「LDL-C」係指低密度脂蛋白膽固醇，且「HDL-C」係指高密度脂蛋白膽固醇。LDL及HDL屬於5個主要的脂蛋白群組：乳糜微粒，極低密度脂蛋白(VLDL)、中間密度脂蛋白(IDL)，低密度脂蛋白及高密度脂蛋白(HDL)(順序為自大顆粒至最密集的(最小的粒子)。LDL(含有顆粒的「壞」的膽固醇)能夠運輸脂質/固醇分子，如膽固醇(即LDL-C)至動脈壁，吸引巨噬細胞，因此誘發動脈粥樣硬化。相反，HDL(含有顆粒的「好」的膽固醇)能夠自動脈壁上的巨噬細胞移除脂質分子，如膽固醇(即HDL-C)。因此，高水準的LDL-C為心血管疾病(CVD)的主要風險，如外周動脈疾病、冠狀動脈疾病(CAD，如心絞痛、心肌梗塞(俗稱心臟病)、高脂血症、高膽固醇血症、高甘油三酯血症)、動脈粥樣硬化、中風、高血壓性心臟病、風濕性心臟病、心肌病、心律失常、先天性心臟病、心臟瓣膜病、心肌炎、主動脈瘤、周圍動脈疾病、肥胖、肝膽疾病、腎病症候群、甲狀腺功能減退症及靜脈血栓形成。 本申請中使用之「LDL-R」或「LDL受體」為細胞表面嵌合蛋白，其具有839個胺基酸(移除21個胺基酸的信號肽後)，介導LDL-C的內吞且自血液中移除LDL-C。人源LDL-R之代表性胺基酸序列由GenBank登記號P01130.1揭示，且其編碼人源LDL-R的代表性mRNA核酸序列由GenBank登記號NM_000527.4揭示。當PCSK9與LDL受體結合時，所述抗體經破壞且無法將LDL-C自血液中移除。相反，當PCSK9經阻斷時，在肝臟表面將有更多LDL受體且將自血液中移除更多LDL膽固醇。本申請使用之「抗PCSK9抗體」係指能夠特異性結合PCSK9(例如人源或猴PCSK9)的抗體，其具有足以提供診斷及/或治療用途之親和性。 本申請中之「特異性結合」或「特異性的結合」係指，指兩分子間的非隨機結合反應，如抗體及抗原間的反應。在某些實施例中，本申請的抗體或其抗原結合片段與人及/或猴PCSK9特異性結合，且其結合親和力(K_D )≤10^-6 M(如：≤5×10^-7 M，≤2×10^-7 M，≤10^-7 M，≤5×10^-8 M，≤2×10^-8 M，≤10^-8 M，≤5×10^-9 M，≤2×10^-9 M，≤10^-9 M，≤10^-10 M)。本申請中之KD係指解離速度與結合速度之比值(koff/kon)，可藉由表面表面電漿子共振之方法測定，例如使用如Biacore之儀器。 本申請中之「阻斷結合」或「競爭性同樣的抗原決定區」的能力係指抗體或其抗原結合片段將兩個分子間結合(例如人PCSK9及抗-PCSK9抗體)的相互作用抑制到任何可偵測程度之能力。在某些實施例中，阻斷兩個分子間結合的抗體或抗原結合片段可將兩個分子間結合的相互作用抑制至少50%。在某些實施例中，此類抑制作用可大於60%，大於70%，大於80%，或大於90%。 本申請中使用之「抗原決定區」係指抗原分子中與抗體結合的那部分胺基酸或原子基團。若兩種抗體表現出對抗原的競爭性結合，則可能結合抗原上的相同抗原決定區。例如，若本申請提供的抗體或其抗原結合片段阻斷例示抗體，例如WBP3011-2.6.6, 11.4、18.156.8、15.14.2、17.72.3、18.136.7、19.3.8、40409與人PCSK9的結合，則所述抗體或其抗原結合片段可視為與彼等例示之抗體結合相同抗原決定區。 本申請使用的抗體名稱中的符號具有不同代表意義：「hIgG4」係指具有人源IgG4同種型恆定區的抗體；「uAb」係指人源抗體，uAb1、uAb2等係指所述人源抗體的不同版本；「K」或「L」係指所述抗體使用κ輕鏈或λ輕鏈。 本申請所述之「11.4」係指具有如SEQ ID NO：73所示的重鏈可變區及如SEQ ID NO：75所示的輕鏈可變區的全人源單株抗體。抗體「11.4.1」為11.4的次純系。 本申請所述之「18.156.8」係指具有如SEQ ID NO：77所示的重鏈可變區及如SEQ ID NO：79所示的輕鏈可變區的全人源單株抗體。「18.156.8 (hIgG4)」為具有人源IgG4同種型恆定區的18.156.8抗體。 本申請所述之「15.14.2」係指具有如SEQ ID NO：81所示的重鏈可變區及如SEQ ID NO：83所示的輕鏈可變區的全人源單株抗體。「15.14.2-uAb-IgG4L」為具有人源IgG4同種型恆定區的18.156.8抗體。 本申請所述之「17.72.3」係指具有如SEQ ID NO：85所示的重鏈可變區及如SEQ ID NO：87所示的輕鏈可變區的全人源單株抗體。「17.72.3-uAb1-IgG4K」及「17.72.3-uAb2-IgG4K」為具有人源IgG4同種型恆定區的17.72.3抗體的不同版本。 本申請所述之「18.136.7」係指具有如SEQ ID NO：89所示的重鏈可變區及如SEQ ID NO：91所示的輕鏈可變區的全人源單株抗體。「18.136.7-IgG4K」為具有人源IgG4同種型恆定區的18.136.7抗體。 本申請所述之「19.3.8」係指具有如SEQ ID NO：93所示的重鏈可變區及如SEQ ID NO：95所示的輕鏈可變區的全人源單株抗體。「19.3.8-IgG4L」及「19.3.8-uAb1-IgG4L」為具有人源IgG4同種型恆定區的19.3.8抗體。 本申請所述之「40409」係指具有如SEQ ID NO：97所示的重鏈可變區及如SEQ ID NO：99所示的輕鏈可變區的全人源單株抗體。40409與其親本抗體11.4相比具有改善的親和力。「40409 (hIgG4)」及「40409 (hIgG2)」分別為具有人源IgG4同種型及IgG2同種型恆定區的40409抗體。 在本申請中當「保守替代」用於胺基酸序列時，係指將一個胺基酸殘基用另一個具有相似理化性質的側鏈的胺基酸殘基替代。例如，可在疏水側鏈胺基酸殘基間(例如Met、Ala、Val、Leu及Ile)、中性親水側鏈殘基間(例如Cys、Ser、Thr、Asn及Gln)、酸性側鏈殘基間(例如Asp、Glu)、鹼性側鏈胺基酸間(例如His、Lys及Arg)或方向側鏈殘基間(例如Trp、Tyr及Phe)進行保守替代。此項技術已知保守替代通常不會引起蛋白構象結構的顯著變化，因此能夠保留蛋白質的生物活性。 當「百分比序列同一性」用於胺基酸序列(或核酸序列)時，係指在進行序列比對，且必要時引入間隔使相同胺基酸(或核酸)數目達到最多後，在候選序列中，與參比序列相同的胺基酸(或核酸)殘基占所述候選序列的胺基酸(或核酸)殘基的百分比。所述胺基酸殘基的保守替代可視為或可不視為相同殘基。可藉由此項技術揭示之工具，例如BLASTN, BLASTp (美國國家生物技術資訊中心網站(NCBI)，亦可參見，Altschul S.F.等人、J. Mol. Biol.，215:403-410 (1990); Stephen F.等人，Nucleic Acids Res.，25:3389-3402 (1997))、ClustalW2(歐洲生物資訊研究所網站，可參見，Higgins D.G.等人，Methods in Enzymology，266:383-402 (1996); Larkin M.A.等人，Bioinformatics (Oxford、England)，23(21): 2947-8 (2007))及ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體，對序列進行比對以確定胺基酸(或核酸)序列的百分比序列同一性。熟習此項技術者可使用所述工具的默認參數或根據比對的需要適當調整參數，例如藉由挑選適合的算法。 本申請中使用的「效應功能」係指抗體的Fc區與其效應器例如C1複合物及Fc受體結合的生物活性。例示性效應功能包括抗體與C1複合物上的C1q相互作用誘導的補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體之Fc區與效應細胞上之Fc受體結合誘導的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)以及吞噬。 對某種病況的「治療」或「療法」包括預防或減輕某種病況，降低某種病況興起或發展的速度，減少發展出某種病況之風險，預防或延遲與某種病況相關的症狀發展，減少或終止與某種病況相關的症狀，產生某種病況的完全或部分的逆轉，治癒某種病況，或以上之組合。 「經分離」的物質已經經人工由自然狀態改變。若自然界中出現某種「經分離」的物質或成分，則其已經改變或脫離其原始狀態，或二者均有發生。例如，某一活體動物體內天然存在的多核苷酸或多肽為未經分離的，但若此等多核苷酸或多肽與之在天然狀態下共存的物質足夠分離且以足夠純的狀態存在，則可視為「經分離」。在某些實施例中，抗體及抗原結合片段的純度為至少90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%，其由電泳方法(如SDS-PAGE、等電聚焦、毛細管電泳)，或層析法(如離子交換層析或反相HPLC)確定。 本發明中之「載體」係指，可將編碼某蛋白的多核苷酸操作性地插入其中且使該蛋白獲得表現的一種運載工具。載體可用於轉化、轉導或轉染宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞內得以表現。舉例來說，載體包括：質粒、噬菌粒、柯斯質粒、人工染色體如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1衍生的人工染色體(PAC)、噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體，以及動物病毒等。用作載體的動物病毒種類有逆轉錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒(如單純疱疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如SV40)。載體可含有多種控制表現的元件，包括啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。另外，載體亦可含有複製起始位點。載體亦可包括協助其進入細胞的成分，包括但不限於，病毒顆粒、脂質體或蛋白外殼。 本發明中之「宿主細胞」係指導入外源多核苷酸及/或載體的細胞。 本發明中之「與PSCK9介導的疾病或症狀」係指藉由PCSK9的變化引起或表徵的疾病或症狀，如表現水準、活性的改變，及/或PCSK9的變體或突變的存在。由PCSK9介導的疾病或病況的例子包括，但不限於，血脂異常，高脂蛋白血症，高脂血症；血脂異常；高膽固醇血症、心臟病、中風、冠心病、動脈粥樣硬化、周圍血管病、跛行、II型糖尿病、高血壓、心血管疾病或病況、炎症或自身免疫性疾病。鑑定/診斷上述疾病或症狀之方法在此項技術為已知的。對於本申請的抗體或其抗原結合片段在治療CVD(如急性心肌梗死(AMI)、急性冠狀動脈症候群(ACS)、中風及心血管死亡)中的用途，本申請使用的「治療有效量」或「有效劑量」係指能夠在血漿或血清中降低脂質(如膽固醇)、緩解與CVD病況相關的症狀或標記物、預防或延遲CVD病況的發展，或上述之組合的所述抗體或其抗原結合片段的劑量或濃度。 「藥用可接受之」係指所指的載劑、溶媒、稀釋劑、輔料及/或鹽，一般在化學上及/或在物理上與製劑中之其他配料相容，且在生理上與接受者相容。抗 -PCSK9 抗體 在某些實施例中，本申請提供例示性的全人源單株抗體11.4、18.156.8、15.14.2、17.72.3、18.136.7、19.3.8及40409，其CDR序列如表1中所示，且重鏈或輕鏈可變區序列亦如下列出。表 1

11.4-VH: 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 73):

核酸序列 (SEQ ID NO: 74)

11.4-VL: 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 75):

核酸序列 (SEQ ID NO: 76)

18.156.8-VH 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 77):

核酸序列 (SEQ ID NO: 78)

18.156.8-VL 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 79):

核酸序列 (SEQ ID NO: 80)

15.14.2-VH 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 81):

核酸序列 (SEQ ID NO: 82)

15.14.2-VL 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 83):

核酸序列 (SEQ ID NO: 84)

17.72.3-VH 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 85):

核酸序列 (SEQ ID NO: 86)

17.72.3-VL 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 87):

核酸序列 (SEQ ID NO: 88)

18.136.7-VH 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 89):

核酸序列 (SEQ ID NO: 90)

18.136.7-VL 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 91):

核酸序列 (SEQ ID NO: 92)

19.3.8-VH 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 93):

核酸序列 (SEQ ID NO: 94)

19.3.8-VL 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 95):

核酸序列 (SEQ ID NO: 96)

40409-VH 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 97):

核酸序列 (SEQ ID NO: 98)

40409-VL 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 99):

核酸序列 (SEQ ID NO: 100)

在一些實施例中，本申請所述之一或多個CDR序列可經修飾或改變以使獲得的抗體在一或多個性質上相對原來的抗體有所改進(例如改進的抗原結合、改進的糖基化模式、降低的CDR殘基上的糖基化風險、增加的藥代動力學半衰期、pH敏感性及對綴合的相容性)，或與原來的抗體相當(即除上述修飾及改變外具有相同CDR序列的抗體)，或至少實質上保留了原來的抗體的抗原結合特性。 熟習此項技術者應理解，可將表1中提供的CDR序列進行修飾以包含一個或更多胺基酸的取代，由此得到提高的生物學活性例如提高的與人PCSK9的結合親和性。例如，可利用噬菌體展示技術生產且表現抗體變體庫(例如Fab或FcFv變體)，隨後篩選與人PCSK9有親和性的抗體。在另一實例中，可用電腦軟體模擬所述抗體與人PCSK9的結合且鑑別抗體上形成結合界面的胺基酸殘基。可避免此等殘基的替代以防止結合親和性降低，或可靶向此等殘基進行替代以形成更強的結合。在某些實施例中，CDR序列中之至少一個(或全部)取代為保守替代。 在某些實施例中，所述抗體及抗原結合片段包括一或多個CDR序列，此等序列具有與表1中所列的序列至少80%(例如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)的序列同一性，且同時保留了與其親本抗體相似或甚至高於其之與人PCSK9的結合親和性，所述親本抗體具有基本相同的序列，但其相應的CDR序列與表1所列的序列具有100%序列同一性。 在某些實施例中，所述抗-PCSK9抗體及其抗原結合片段為全人源的。此等全人源抗體保留了與人PCSK9的結合親和性，較佳與例示性抗體：11.4、18.156.8、15.14.2、17.72.3、18.136.7、19.3.8及40409的水準相似。 本申請亦包括與本申請抗-PCSK9抗體及其抗原結合片段競爭相同抗原決定區的抗體及其抗原結合片段。在某些實施例中，所述抗體以低於10^-6 M、低於10^-7 M、低於10^-7.5 M、低於10^-8 M、低於10^-8.5 M或低於 10^-9 M或低於10^-10 M的IC₅₀ 值(即半數抑制濃度)阻斷11.4、18.156.8、15.14.2、17.72.3、18.136.7、19.3.8及40409與人或猴PCSK9的結合。IC₅₀ 值藉由競爭性測試，例如ELISA測定及放射性配位體競爭結合測定法。 在一些實施例中，本申請所述抗-PCSK9抗體及其抗原結合片段能夠以不超過10^-8 M、不超過10^-9 M或不超過10^-10 M(例如≤2.5×10^-8 M、≤2×10^-8 M、≤7.5×10^-9 M、≤3.5×10^-9 M、≤7×10^-10 M、≤6×10^-10 M、≤5×10^-10 M、≤2.5×10^-10 M、≤2×10^-10 M、≤1.5×10^-10 M、≤7.5×10^-11 M、≤6.5×10^-11 M或≤5.5×10^-11 M)的結合親和性(Kd)與人PCSK9及/或猴PCSK9特異性結合，其藉由表面電漿子共振結合法或ELISA量測。結合親和性可用K_D 值表示，其藉由當抗原及抗原結合分子的結合達到平衡時的解離速率與結合速率的比值(koff/kon)計算得到。所述抗原結合親和性(例如K_D )可藉由此項技術已知的適宜方法適宜地確定，所述方法包括使用儀器如如Biacore的表面電漿子共振結合法(參加例如Murphy, M.等人, Current protocols in protein science, 第19章, 第19.14單元, 2006)。 在某些實施例中，本申請所述抗體及其抗原結合片段與人PCSK9以0.01nM-0.2 nM (例如0.02nM-0.2nM、0.02nM-0.15nM、0.02nM-0.05nM、0.01nM-0.05nM或0.02nM-0.3nM)的EC50 (即半數結合濃度)結合。所述抗體與人PCSK9的結合可藉由此項技術已知之方法，如夾心法，如ELISA，Western印跡或其他結合試驗測定。在例示性實例中，將待測抗體(即一抗)與固定化的人PCSK9結合，隨後洗掉未結合抗體，引入標記的二抗，其能夠與一抗結合因此能夠偵測出結合的一抗。當使用固定化的PCSK9時可在酶標儀板上進行所述偵測。 在某些實施例中，本申請所述抗體及其抗原結合片段以0.5nM-3nM (例如0.5nM-2.5nM、1nM-2.5nM、1nM-2nM或1nM-1.5nM)的IC₅₀ 抑制人PCSK9與其配位體的結合，其藉由競爭性測試測得。 在某些實施例中，所述抗體及其抗原結合片段與猴PCSK9以與人PCSK9相似的結合親和性結合。例如，例示性抗體11.4、18.156.8、15.14.2、17.72.3、18.136.7、19.3.8及40409與猴PCSK9以與人PCSK9相似的親和性或EC₅₀ 值結合。 在一些實施例中，所述之抗-PCSK9抗體及其抗原結合片段亦包括免疫球蛋白恆定區。在一些實施例中，免疫球蛋白恆定區包括重鏈及/或輕鏈恆定區。所述重鏈恆定區包括CH1、CH1-CH2或CH1-CH3區。在一些實施例中，所述恆定區亦可包括一或多個修飾以得到需要的性質。例如，所述恆定區可經修飾以減少或耗竭一或多個效應功能，以增強FcRn受體結合，或引入一或多個半胱胺酸殘基。在一些實施例中，所述之抗-PCSK9抗體及其抗原結合片段具有IgG4同種型的恆定區，其具有降低的或耗竭的效應功能。已知有許多測試用來評估ADCC或CDC活性，例如Fc受體結合試驗、補體C1q結合實驗及細胞裂解法，熟習此項技術者能夠容易選擇。 在一些實施例中，所述抗體及其抗原結合片段可用作抗體-藥物綴合物、雙特異性或多價抗體的基礎分子。 本申請所述之抗-PCSK9抗體及其抗原結合片段可為單株抗體、多株抗體、全人源抗體、全人源抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組抗體、雙特異性抗體、標記抗體、二價抗體或抗獨特型抗體。重組抗體為在體外使用重組方法而非動物製備的抗體。雙特異性抗體或雙價抗體為具有兩種不同的單株抗體的片段的人工抗體，其能結合兩種不同的抗原。「二價」的抗體及其抗原結合片段包括兩個抗原結合位點。兩個抗原結合位點可結合相同抗原，或可各自結合至不同抗原，在此情況下，抗體或抗原結合片段為「雙特異性」。 在一些實施例中，本申請所述之抗-PCSK9抗體及其抗原結合片段為全人源抗體。在一些實施例中，使用重組方法製備所述全人源抗體。例如，可製備轉殖基因動物，如小鼠，使其攜帶人源免疫球蛋白基因的轉殖基因或轉染色體，且因此在用適宜的抗原如人源PCSK9免疫後能夠生產全人源抗體。全人源抗體可自此類轉殖基因動物中分離，或另選地，可藉由雜交瘤技術製備，將所述轉殖基因動物的脾細胞與永生細胞系融合以生成分泌所述全人源抗體的雜交瘤細胞。例示性的轉殖基因動物包括但不限於，Omni大鼠，其內源性大鼠免疫球蛋白基因之表現經失活且同時經基因工程化以包含功能性的重組人源免疫球蛋白基因座；Omni小鼠，其內源性小鼠免疫球蛋白基因的表現經失活且同時經基因工程化以包含具有J-基因座缺失及C-κ突變的重組人源免疫球蛋白基因座。OmniFilc，其為轉殖基因大鼠，其內源性大鼠免疫球蛋白基因的表現經失活，且同時經基因工程化以包含具有單個的共有的、重組的VkJk輕鏈及功能性重鏈的重組人源免疫球蛋白基因座。具體資訊請進一步參見：Osborn M.等人, Journal of Immunology, 2013, 190: 1481-90; Ma B.等人, Journal of Immunological Methods 400-401 (2013) 78-86; Geurts A.等人, Science, 2009, 325:433; 美國專利8,907,157；歐洲專利2152880B1；歐洲專利2336329B1，其均以全文引用的方式併入本申請。亦可使用其他適宜的轉殖基因動物，例如，HuMab小鼠 (具體參見Lonberg, N.等人 Nature 368(6474): 856 859 (1994)), Xeno-小鼠(Mendez等人 Nat Genet., 1997, 15:146-156), TransChromo小鼠(Ishida等人 Cloning Stem Cells, 2002, 4:91-102)及VelocImmune小鼠(Murphy等人 Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111:5153-5158), Kymouse轉殖基因小鼠(Lee等人 Nat Biotechnol, 2014, 32:356-363)，及轉殖基因兔(Flisikowska等人 PLoS One, 2011, 6:e21045)。 在一些實施例中，本申請所述之抗-PCSK9抗體及其抗原結合片段為駱駝化單域抗體(camelized single chain domain antibody)、雙功能抗體(diabody)、scFv、scFv二聚體、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、ds雙功能抗體(ds diabody)、奈米抗體、域抗體或雙價域抗體。 在某些實施例中，所述抗-PCSK9 抗體及其抗原結合片段進一步包含綴合物。可設想，本發明中的抗體或其抗原結合片段可與多種綴合物連接(見例如「Conjugate Vaccines」、Contributions to Microbiology and Immunology、J. M. Cruse and R. E. Lewis、Jr. (eds.)、Carger Press、New York、(1989))。此等綴合物可藉由共價結合、親和結合、嵌入、同等結合(coordinate binding)、錯合、結合、混合或加入等其他方式與所述抗體或抗原結合物連接。在某些實施例中，本發明揭示之抗體及抗原結合片段可藉由工程化方法使其含有抗原決定區結合部分以外的特定位點，此等位點可用來結合一或多種綴合物。例如，此類位點可包含一或多種反應性胺基酸殘基，例如半胱胺酸殘基及組胺酸殘基，用於協助與結合物的共價連接。在某些實施例中，抗體可間接連於綴合物，或藉由另一個綴合物相連。例如，所述抗體或其抗原結合片段可結合生物素，然後間接結合第二個綴合物，其與親和素相連。所述綴合物可為可偵測之標記、藥代動力學修飾部分、純化部分或細胞毒性部分。可偵測的標記的例子可包括螢光標記(例如螢光素、羅丹明、丹醯、藻紅蛋白或德克薩斯紅)、酶-受質標記物(例如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、螢光素酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、放射性同位素(例如、¹²³ I、¹²⁴ I、¹²⁵ I、¹³¹ I、³⁵ S、³ H、¹¹¹ In、¹¹² In、¹⁴ C、⁶⁴ Cu、⁶⁷ Cu、⁸⁶ Y、⁸⁸ Y、⁹⁰ Y、¹⁷⁷ Lu、²¹¹ At、¹⁸⁶ Re、¹⁸⁸ Re、¹⁵³ Sm、²¹² Bi、及³² P、其他鑭系元素、發光標記)、發色團部分、地高辛、生物素/親和素、DNA分子或金以進行偵測。在某些實施例中，所述綴合物可為藥代動力學修飾部分如PEG，其幫助延長抗體的半衰期。其他適宜的聚合物包括例如羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、乙二醇/丙二醇共聚物等。在某些實施例中，所述綴合物可為純化部分，例如磁珠。「細胞毒性部分」可為對細胞有害的或可能損壞或殺死細胞的任何試劑。細胞毒性部分的例示包括，但不限於，紫杉醇、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根鹼、絲裂黴素、依託泊苷、替尼泊苷、長春新鹼、長春鹼、秋水仙鹼、阿黴素、柔紅黴素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神黴素、放線菌素D、1-去氫睾酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、嘌呤黴素及其類似物、抗代謝物(例如，甲胺蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶達卡巴)、烷化劑(例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)及洛莫司汀(CCNU)、環磷醯胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲黴素、絲裂黴素C及順-二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑)、蒽環類抗生素(例如柔紅黴素(以前的道諾黴素)及阿黴素)、抗生素(例如更生黴素(以前稱為放線菌素)、博來黴素、光神黴素及氨茴黴素(AMC))以及抗有絲分裂劑(例如長春新鹼及長春鹼)。多核苷酸及重組方法 本申請提供編碼抗-PCSK9抗體及其抗原結合片段的分離的多核苷酸。在某些實施例中，所述分離的多核苷酸包括一或多個如表1中的核苷酸序列，其編碼如表1中的CDR序列。 在一些實施例中，所述分離的多核苷酸編碼重鏈可變區且包括選自下組之序列：SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 34，以及與其具有至少80%(例如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)的序列同一性之同源序列。在一些實施例中，所述分離的多核苷酸編碼輕鏈可變區且包括選自下組之序列：SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 36，以及與之具有至少80%(例如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)的序列同一性之同源序列。在某些實施例中，所述一致性的百分比是源自遺傳密碼的簡併性，而編碼的蛋白序列保持不變。 使用此項技術公知的重組技術，可將包括編碼所述抗-PCSK9抗體及其抗原結合片段(例如包括表1所示的序列)的多核苷酸的載體引入宿主細胞用於選殖(擴增DNA)或基因表現。在另一實施例中，所述抗體可藉由此項技術公知的同源重組之方法製得。編碼所述單株抗體的DNA可藉由習知方法分離及測序(如可使用寡核苷酸探針，該探針可特異性與編碼所述抗體的重鏈及輕鏈的基因結合)。多種載體可供選擇。載體組分通常包括，但不限於，以下的一或多種：信號序列、複製起始點、一或多種標記基因、增強序列、啟動子(例如：SV40、CMV、EF-1α)及轉錄終止序列。 在一些實施例中，所述載體系統包括哺乳動物、細菌、酵母系統等，且將包括質粒例如但不限於pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pCMV、pEGFP、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO,pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS420、pLexA、pACT2等其他可自實驗室獲得或市售的載體。適宜的載體可包括質粒或病毒載體(例如，複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。 可將包括編碼所述抗體及其抗原結合片段的多核苷酸的載體引入宿主細胞用於選殖或基因表現。本發明中適用於選殖或表現所述載體中的DNA的宿主細胞為原核細胞、酵母或上述高級真核細胞。適用於本發明用途的原核細胞包括真細菌如，革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽性菌，例如，腸桿菌科，如大腸桿菌，腸桿菌屬，歐文氏菌屬，克雷白氏桿菌屬，變形桿菌屬，沙門氏菌屬，如鼠傷寒沙門(氏)桿菌，沙雷氏菌屬，如黏質沙雷氏菌，以及志賀氏菌屬，及桿菌屬，如枯草芽孢桿菌及地衣芽孢桿菌，假單胞菌，如綠膿桿菌及鏈黴菌。 除了原核細胞以外，真核微生物如絲狀真菌或酵母亦可作宿主細胞選殖或表現編碼抗PCSK9抗體的載體。釀酒酵母，或麵包酵母為最常用的低等真核宿主微生物。但是，許多其他屬、種及株均比較常用且在本發明中適用，如粟酒裂殖酵母；克魯維酵母屬宿主如，乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(ATCC 16,045)、魏氏克魯維酵母(ATCC 24,178)、克魯雄酵母(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母及馬克斯克魯維酵母；解脂耶氏酵母(EP 402,226)；巴斯德畢赤酵母(EP 183,070)；假絲酵母；里氏木黴(EP 244,234)；鏈孢黴；西方許旺酵母，如：西方許旺酵母；及絲狀真菌，如：脈孢菌、青黴菌、彎頸黴及曲黴菌，如：鉤巢麯黴及黑麯黴。 本發明中提供的適用於表現糖基化抗體或其抗原結合片段的宿主細胞由多細胞生物衍生得到。無脊椎細胞的實例包括植物及昆蟲細胞。已發現多種桿狀病毒株(baculoviral strains)及其變體以及對應的許可性昆蟲宿主細胞(permissive insect host cells)，來自於諸如以下的宿主：草地夜蛾(毛蟲)、埃及斑蚊(蚊子)、白紋伊蚊(蚊子)、黑腹果蠅(果蠅)及家蠶。多種用於轉染的病毒株為公眾可得，例如苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒及家蠶核型多角體病毒的Bm-5變種，此等病毒均可在本發明中使用，特別是用於轉染草地夜蛾細胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牽牛花、西紅柿及菸草的植物細胞培養亦可用作宿主。 但是，最感興趣的為脊椎細胞，且脊椎細胞的培養(組織培養)已成為習知操作。可用的哺乳動物宿主細胞實例有，SV40轉化的猴腎細胞CV1系(COS-7, ATCC CRL 1651)；人胚胎腎細胞系(293 或懸浮培養的293細胞次選殖，Graham等人, J. Gen Virol. 36:59 (1977))；幼地鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR (CHO，Urlaub等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；小鼠睾丸支持細胞(TM4，Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人肝癌細胞系(Hep G2)。在某些較佳的實施例中，所述宿主細胞為293F細胞。 用上述的可產生抗PCSK9抗體的表現或選殖載體轉化宿主細胞，且將其在習知營養培養基中培養，所述營養培養基經修飾後適宜於誘導啟動子、選擇轉化細胞或擴增編碼目的序列的基因。 本發明中用於產生所述抗體或其抗原結合片段的宿主細胞可在多種培養基中培養。市售的培養基如Ham's F10 (Sigma)、最低基本培液 (MEM， (Sigma))、RPMI-1640 (Sigma)及Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)，Sigma)可用於培養所述宿主細胞。另外，任何在Ham等人, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等人, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 美國專利號4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 或5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 或美國專利申請Re. 30,985中說明的培養基均可用作所述宿主細胞的培養基。此等培養基均可添加必要的激素及/或其他生長因子(如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽類(如氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂及磷酸鹽)、緩衝液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷酸及胸腺嘧啶)、抗生素(如慶大黴素)、微量元素(定義為終濃度通常在微莫耳範圍無機化合物)，及葡萄糖或與之等同的能量源。所述培養基亦可含有此項技術公知的適當濃度的任何其他必要的添加劑。所述培養基的條件，如溫度、pH值等類似條件，為選擇用於表現的宿主細胞此前所使用的條件，為熟習此項技術者所熟知。 在使用重組技術時，所述抗體可在胞內、壁膜空間生成，或直接分泌至培養基中。若所述抗體在胞內生成，則首先除去宿主細胞或裂解片斷的顆粒殘骸，例如，可藉由離心或超音方法。Carter等人, Bio/Technology 10:163-167 (1992)描述將分泌至大腸桿菌壁膜空間的抗體分離之方法。簡言之，在醋酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯甲磺醯氟(PMSF)存在的條件下化開細胞糊(cell paste)約30分鐘以上。離心除去細胞碎片。如所述抗體分泌至培養基中，則通常首先使用市售的蛋白濃度過濾器，如Amicon或Millipore Pellicon ultrafiltration unit，濃縮該表現系統的上清液。在任何前述的步驟中均可加入蛋白酶抑制劑如PMSF以抑制蛋白降解，以及抗生素以防止偶然污染物的生長。 自所述細胞中製得的抗體可採用純化方法進行純化，例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析、DEAE-纖維素離子交換層析柱、硫酸銨沈澱、鹽析以及親和層析，其中親合層析為較佳的純化技術。所述抗體的種類以及所述抗體中存在任何免疫球蛋白的Fc結構域決定了蛋白A作為親和配位體是否適合。蛋白A可用於純化基於人γ1，γ2或γ4重鏈的抗體(Lindmark等人, J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))。蛋白G適用於所有鼠源異構體及人γ3 (Guss等人, EMBO J. 5:1567 1575 (1986))。瓊脂糖為最常用的親和配位體附著基質，但亦可選用其他基質。機械力穩定的基質如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯)苯與用瓊脂糖相比可實現更快的流速及更短的處理時間。如該抗體含有CH3結構域，則可用Bakerbond ABX.TM樹脂進行純化(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)。亦可根據需要獲得的抗體確定其他蛋白純化的技術，如離子交換管柱中的分餾、乙醇沈澱、反相HPLC、矽膠層析、基於陰離子或陽離子交換樹脂的肝素瓊脂糖凝膠層析(如聚天冬胺酸管柱)、層析聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸銨沈澱。 在任意初步純化步驟之後，可用低pH疏水相互作用層析之方法處理含有感興趣的抗體及雜質的混合物，用pH約2.5-4.5的洗滌緩衝液，較佳在低鹽濃度下進行(例如，約0至0.25M鹽濃度)。套組 本申請提供包括所述抗-PCSK9抗體及其抗原結合片段的套組。在一些實施例中，所述套組用於偵測在生物樣品中的PCSK9的存在情況或水準。所述生物樣品可包括血清。在一些實施例中，所述套組包括與可偵測標記綴合的抗-PCSK9抗體及其抗原結合片段。在一些實施例中，所述套組包括未標記的抗-PCSK9抗體及其抗原結合片段，且進一步包括能夠與未標記的抗-PCSK9抗體及其抗原結合片段結合標記的二抗。所述套組可進一步包括使用說明及在套組中將各組件分隔開的包裝。 在一些實施例中，所述套組用於治療、預防或延遲由PCSK9介導的疾病或病況。在一些實施例中，所述抗-PCSK9抗體及其抗原結合片段與受質或儀器連接用於夾心測定如ELISA或免疫層析測定。適用的受質或儀器可為例如微孔板及試紙。 在一些實施例中，所述套組亦包括一或多種已知對降低膽固醇有益的試劑。例示性的試劑包括他汀類藥物、他汀類以外的HMG-CoA還原酶抑制劑，菸酸(尼克酸)、膽固醇吸收抑制劑、膽固醇酯轉移蛋白(CETP)、膽汁酸螯合劑、貝特類、植物甾醇；或選自小分子的脂質/脂質濃度比的調節劑、擬肽、反義RNA、小干擾RNA(siRNA)及天然或改性脂。在某些實施例中，膽固醇吸收抑制劑為依折麥布或SCH-48461；CETP為evacetrapib，anacetrapib或dalcetrapib；膽汁酸螯合劑較佳為考來維侖，消膽胺或貝特類降脂寧較佳為非諾貝特，吉非貝齊，安妥明，或苯札貝特；或上述試劑之組合。醫藥組合物及治療方法 本申請進一步提供包括所述抗-PCSK9抗體及其抗原結合片段的醫藥組合物及一或多個醫藥學上可接受之載體。 用於本申請揭示之醫藥組合物中的藥用可接受載劑可包括，例如，藥用可接受的液體、凝膠或固體載劑、水相介質、非水相介質、抗微生物物質、等滲物質、緩衝液、抗氧劑、麻醉劑、懸浮劑/分散劑、螯合劑、稀釋劑、佐劑、輔料或無毒輔助物質，其他此項技術公知的組分或以上的多種組合。 適用的組分可包括例如抗氧劑、填充劑、黏合劑、崩解劑、緩衝液、防腐劑、潤滑劑、攪味劑、增稠劑、著色劑、乳化劑或穩定劑，例如糖及環糊精。適用的抗氧劑可包括例如甲硫胺酸、抗壞血酸、EDTA、硫代硫酸鈉、鉑、過氧化氫酶、檸檬酸、半胱胺酸、巰基甘油、巰基乙酸、巰基山梨醇、丁基甲基茴香醚、丁基化羥基甲苯及/或沒食子酸丙酯。如本發明所揭示，在一種含有本發明揭示之抗體或其抗原結合片段之組合物中包括一或多種抗氧劑如甲硫胺酸，可將降低所述抗體或其抗原結合片段的氧化。對氧化作用的減少可防止或減少結合親和力的降低，從而提高抗體穩定性且延長保質期。因此，在某些實施例中，本發明提供之組合物中含有一或多種所述之抗體或其抗原結合片段以及一或多種抗氧劑，例如甲硫胺酸。本發明進一步提供多種方法，藉由將本發明中提供的抗體或其抗原結合片段與一或多種抗氧劑混合，例如甲硫胺酸，可防止所述抗體或其抗原結合片段氧化、延長其保質期及/或提高其活性。 進一步的說，藥用可接受的載劑可包括，例如，水相介質如氯化鈉注射液、林格氏液注射液、等滲葡萄糖注射液、無菌水注射液、或葡萄糖及乳酸林格注射液、非水介質例如：植物來源的不揮發性油、棉花子油、玉米油、芝麻油、或花生油、細菌抑制或真菌抑制濃度下的抗菌物質、等滲劑如：氯化鈉或葡萄糖、緩衝液如：磷酸鹽或枸櫞酸酸鹽緩衝液，抗氧化劑如：硫酸氫鈉，局部麻醉劑如：鹽酸普魯卡因，助懸劑及分散劑如：羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素或聚乙烯吡咯啶酮，乳化劑如：聚山梨醇酯80 (吐溫-80)、螯合試劑如EDTA (乙二胺四乙酸) 或EGTA (乙二醇雙(2-胺基乙基醚)四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。作為載劑的抗菌劑可加入多次劑量容器中的醫藥組合物中，其包括酚類或甲酚、汞製劑、苯甲醇、氯代丁醇、甲基及丙基對羥基苯甲酸酯、噻汞撒、氯苯甲烷銨及氯苯乙銨。適用的輔料可包括，例如，水、鹽、葡萄糖、甘油或乙醇。適用的無毒輔助物質可包括，例如，乳化劑、pH值緩衝劑、穩定劑、增溶劑，或醋酸鈉、去水山梨糖醇月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或環糊精之類的物質。 所述醫藥組合物可為液體溶液、懸浮液、乳劑、丸劑、膠囊、錠劑、持續釋放製劑或粉末。口服製劑可包括標準載體如藥物級的甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、聚乙烯吡咯啶酮、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。 在某些實施例中，所述醫藥組合物經製備為可注射組合物。可注射醫藥組合物可以任何習知之形式製備，例如，液體溶劑、懸浮劑、乳化劑或適用於產生液體溶劑、懸浮劑或乳化劑的固體形式。注射製劑可包括現用的無菌及/或無熱原溶液、使用前先與溶劑結合的無菌乾燥的可溶物，如凍乾粉，包括皮下片、注射即用的無菌懸浮劑、使用前先與介質結合的無菌乾燥不溶產品，及無菌及/或無熱原的乳劑。溶劑可為水相或非水相。 在某些實施例中，單位劑量的注射製劑包裝在一個安瓿、一支管或一支帶有針的針筒中。此項技術習知，所有注射給藥的製劑應為無菌無熱原。 在某些實施例中，藉由將本申請揭示之抗體或其抗原結合片段溶解於某適當的溶劑中可製備無菌凍乾的粉末。所述溶劑可含有一種可提高粉或由粉末製得的重組溶液的穩定性，或改善粉末或重組溶液的其他藥理組分。適用的輔料包括，但不限於，水、葡萄糖、三梨糖醇、果糖、玉米糖漿、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他適用的物質。溶劑可含有緩衝液，如枸櫞酸緩衝液、磷酸鈉或磷酸鉀緩衝液或其他熟習此項技術者公知的緩衝液，在一個實施例中，緩衝液的pH為中性。在此項技術公知的標準條件下進行對所述溶解進行隨後的過濾除菌，然後凍乾製得理想的製劑。在一個實施例中，將所得的溶劑分裝至小管中凍乾。每支小管可容納單次劑量或多次劑量的所述抗-PCSK9抗體或其抗原結合片段或其組合物。每支小管中的裝入量可略微高於每次劑量所需或多次劑量所需(例如10%過量)，從而保證取樣精確及給藥精確。凍乾粉可在適當的條件下儲存，如在約4℃至室溫範圍。 用注射用水將凍乾粉重溶得到用於注射給藥的製劑。在一個實施例中，可將凍乾粉加至無菌無熱原水或其他適用的液體載劑中重溶。精確的量由選擇的療法決定，可根據經驗值決定。 亦提供治療方法，包括將治療有效量的本申請所述之抗體或其抗原結合片段施用給需要其之個體，由此治療或預防與PCSK9相關的病況或病症。在另一態樣中，亦提供治療將自上調的免疫響應獲益的個體病況之方法，包括對所述需要其之個體施用治療有效量的本申請所述之抗體或其抗原結合片段。 本申請中提供的抗體或其抗原結合片段的治療有效劑量依賴於此項技術公知的多種因素，例如體重、年齡、過往病史、現用治療、對象的健康病況及交叉感染的潛力、過敏、超敏及副作用，以及給藥途徑及腫瘤發展的程度。熟習此項技術者(例如醫生或獸醫)可根據此等或其他條件或要求按比例降低或升高劑量。 在某些實施例中，本發明提供的抗體或其抗原結合片段可在治療有效劑量約0.01 mg/kg至約100 mg/kg之間給藥(例如，約0.01 mg/kg、約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約2 mg/kg、約3mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg、約50 mg/kg、約55 mg/kg、約60 mg/kg、約65 mg/kg、約70 mg/kg、約75 mg/kg、約80 mg/kg、約85 mg/kg、約90 mg/kg、約95 mg/kg或約100 mg/kg)。在某些實施例中，所述抗體或其抗原結合片段以約50 mg/kg或更少的劑量給藥，在某些實施例中，給藥劑量為10 mg/kg或更少、5 mg/kg或更少、3 mg/kg或更少、1 mg/kg或更少、0.5 mg/kg或更少或0.1 mg/kg或更少。某特定劑量可在多個間隔給藥，例如每天一次、每天兩次或更多、每月兩次或更多、每週一次、每兩週一次、每三週一次、每月一次或每兩月或更多月一次。在某些實施例中，給藥劑量可隨治療進程變化。例如，在某些實施例中，初始給藥劑量可比後續給藥劑量高。在某些實施例中，給藥劑量在治療進程中根據給藥對象的反應進行調整。 給藥方案可藉由調整達到最優反應(如治療反應)。例如，可進行單劑量給藥或在一段時間分多個分隔的劑量給藥。 本發明中揭示之抗體及抗原結合片段可藉由此項技術公知的給藥方式給藥，例如注射給藥(如，皮下注射、腹腔注射、靜脈注射，包括靜脈滴注，肌肉注射或皮內注射)或非注射給藥(如，口服給藥、鼻腔給藥、舌下給藥、直腸給藥或外用給藥)。 使用方法 本申請進一步提供使用所述抗-PCSK9抗體或其抗原結合片段之方法。 在一些實施例中，本申請提供在個體中治療PCSK9介導的病況或病症之方法，包括施用治療有效量的本申請所述之PCSK9抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，所述個體經鑑定為患有可能對PCSK9抑制劑響應之病症或病況。在某些實施例中，所述個體處於具有或發展由PCSK9介導的疾病或病況的風險，所述PCSK9介導的疾病或病況表現出一或多種所述疾病或病況的症狀，如超重、具有升高的膽固醇水準、具有編碼LDL-R或APOB的基因的遺傳性突變或具有此類疾病或病況的家族病史。在某些實施例中，所述個體在治療中對另一種降低膽固醇的試劑(例如，他汀類藥物)為抵抗的或不耐受的，因此在該治療中膽固醇水準無法有效地降低至可接受的水準。在某些實施例中，所述由PCSK9介導之疾病或病況包括感染性疾病，如嚴重蜂窩織炎、腸胃炎、敗血症、肺炎、皮膚及軟組織感染、腎盂腎炎、病毒感染，例如，乙型肝炎、丙型肝炎、疱疹病毒的病毒感染、Epstein-Barr病毒、艾滋病毒、巨細胞病毒、單純疱疹病毒I型、單純疱疹病毒2型、人乳頭狀瘤病毒、腺病毒、卡波西西肉瘤相關疱疹病毒流行病、薄環病毒(Torquetenovirus)、JC病毒或BK病毒，或包括炎性疾病，如阿茲海默氏症、強直性脊柱炎、關節炎(骨關節炎、類風濕關節炎(RA)、牛皮癬性關節炎)、哮喘、動脈粥樣硬化、克羅恩病、結腸炎、皮炎、憩室炎、纖維肌痛、肝炎、腸易激症候群(IBS)、系統性紅斑狼瘡(SLE)、腎炎、帕金森氏病及潰瘍性結腸炎。 在目標生物組織中LDL-C的存在情況及水準可指示所述生物樣品來源的個體是否可能對PCSK9抑制劑響應。可使用多種方法在來自所述個體的待測生物樣品中確定LDL-C的存在情況或水準。在美國使用毫克(mg)每分升(dL)血液量測膽固醇水準，而在加拿大及許多歐洲國家則使用毫莫耳(mmol)每公升(L)血液量測。 在一些實施例中，在所述待測生物樣品中LDL-C、總膽固醇或非HDL-C的存在或水準上調表示響應的可能性。本申請使用的術語「上調」係指與使用相同抗體偵測的參照樣品中膽固醇水準相比，使用本申請所述之抗體或其抗原結合片段在待測樣品中偵測的膽固醇水準的總的增加不少於10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或更多。所述參照樣品可為自健康或無疾病的個體中獲得的對照樣品，或自待測樣品來源的個體中獲得的健康或無疾病的樣品。 本發明揭示之抗體及抗原結合片段可單獨給藥或與一或多種其他治療手段或物質聯合給藥。例如，本發明揭示之抗體及抗原結合片段可與他汀類藥物、他汀類以外的HMG-CoA還原酶抑制劑，菸酸(尼克酸)、膽固醇吸收抑制劑、膽固醇酯轉移蛋白(CETP)、膽汁酸螯合劑、貝特類、植物甾醇；或選自小分子的脂質/脂質濃度比的調節劑、擬肽、反義RNA、小干擾RNA(siRNA)及天然或改性脂。在某些實施例中，膽固醇吸收抑制劑為依折麥布或SCH-48461；CETP為evacetrapib，anacetrapib或dalcetrapib；膽汁酸螯合劑較佳為考來維侖，消膽胺或貝特類降脂寧較佳為非諾貝特，吉非貝齊，安妥明，或苯札貝特；或上述試劑之組合進行聯用。 在某些此類實施例中，本發明揭示之抗體及抗原結合片段與一或多種上述治療物質聯用時，可與所述之一或多種治療物質同時給藥，在某些此類實施例中，所述之抗體及抗原結合片段可作為同一個醫藥組合物的一部分同時給藥。但是，與其他治療物質「聯用」的抗體及抗原結合物不需要同時給藥或與該治療物質在同一組合物中給藥。本發明中「聯用」的含義亦包括在另一個治療物質之前或之後給藥的抗體及抗原結合物亦視為與該治療物質「聯用」，即使所述抗體或其抗原結合片段與第二種物質藉由不同給藥方式給藥。在可能的情況下，與本發明揭示之抗體或其抗原結合片段聯用的其他治療物質可參照該其他治療物質的產品說明書之方法用藥，或參照外科醫生的案頭參考書2003(Physicians' Desk Reference，第57版; Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 第57版 (2002年11月))，或參照其他此項技術公知之方法。 以下實施例旨在更好地說明本發明，且不應理解為限制本發明的範圍。所有下述的特定組合物、材料及方法，其整體或部分，均在本發明的範圍內。此等特定組合物、材料及方法不是為了限制本發明，而只是為說明特定的實施例在本發明的範圍內。熟習此項技術者可不添加創造性及不偏離本發明範圍而開發出等同的組合物、材料及方法。應理解，在對本發明之方法作出之多種改動仍可包括在本發明範圍內。發明人意在將此類變動包括在本發明的範圍內。實施例 1 ：抗原及其他蛋白的產生 1.1人源及鼠源PCSK9 將人及鼠的PCSK9基因分別組裝至pcDNA3.3載體，C端融合了6-His標籤或鼠源Fc標籤。用轉染試劑PlasFect (Bioline USA, BIO-46026)，將此等質粒分別轉染至HEK293細胞。轉染後收集細胞上清。His標籤蛋白藉由Ni柱(Qiagen Inc)純化，鼠源Fc融合蛋白藉由Protein A管柱(MabSelect SuRe, GE)純化。 1.2人源 LDL-R 將LDL-R胞外區基因組裝至pcDNA3.3載體，C端融合了6-His標籤。用轉染試劑PlasFect (Bioline USA, BIO-46026)，將此等質粒轉染至HEK293細胞。轉染後收集細胞上清，LDL-R蛋白第一步用Ni 柱(Qiagen Inc) 純化，第二步用離子交換管柱純化。 1.3參照抗體 參照抗體BMK.115的序列為基於美國專利號8889834B2中的21B12序列。將含有重鏈及輕鏈的質粒共轉染至HEK293細胞。轉染後收集細胞上清，抗體藉由Protein A管柱(MabSelect SuRe, GE) 純化。實施例 2 ：抗體的產生 2.1免疫 用含有人源免疫球蛋白可變區基因的轉殖基因大鼠OmniRat® (OMT)進行免疫以獲得全人抗體。人源PCSK9蛋白足底注射，每三天一次。6次免疫後進行第一次效價偵測，之後每週免疫一次。 2.2血清效價偵測 使用酶聯免疫吸附法(ELISA)偵測大鼠血清效價。先用pH值9.2的包被液將人源PCSK9蛋白稀釋至1 μg/ml，加入至酶標板(Nunc)中，4℃隔夜培育。洗板後封閉，每孔加入200 μl封閉液1× PBS/ 2% BSA，室溫靜置培育1小時。起始孔加入稀釋100倍的大鼠血清，然後用封閉液以3倍的比例進行連續梯度稀釋，室溫靜置培育1小時。洗板後加入山羊抗大鼠IgG1及山羊抗大鼠IgG2b的HRP酶標二抗混合物(Bethyl)，室溫靜置培育1小時。洗板後加入TMB受質顯色液，然後用2M 鹽酸終止顯色。使用酶標儀(Molecular Device)讀取在450 nM處的吸光值。 2.3動物免疫與雜交瘤的產生 選取滴度達到要求的大鼠，取出淋巴結及脾臟，轉移至組織研磨器中研磨。100目篩網過濾後計數B細胞。骨髓瘤P3細胞用培養基調整至適當的體積後計數。將兩種細胞按照B細胞:P3 = 1:1數目重懸且混勻。細胞懸浮液加入融合槽內進行電融合 (BTX ECM2001). 融合後將細胞轉移至含有1/2 HA培養基中，按每板5×10⁵ 個細胞的密度鋪板。 免疫後的動物血清中抗原特異性抗體的滴度用ELISA進行偵測。挑選出滴度達到312500的大鼠進行融合產生雜交瘤細胞。 2.4雜交瘤篩選 ELISA法偵測結合：先用pH值9.2的包被液將鏈黴親和素(Streptavidin)稀釋至1 μg/ml，加入至96孔酶標板中(Nunc)，4℃隔夜培育。封閉洗板後加入生物素標記的人源PCSK9蛋白，濃度為250 ng/ml，室溫靜置培育1小時。洗板後加入雜交瘤細胞上清，室溫靜置培育1小時。洗板後加入山羊抗大鼠IgG1及山羊抗大鼠IgG2b的HRP酶標二抗 (Bethyl)混合物，室溫培育45 分鐘。洗板後加入TMB受質顯色液，用2M 鹽酸終止顯色，然後使用酶標儀(Molecular Device)讀取在450奈米處的吸光值。 競爭ELISA：酶標板(Nunc)中加入LDL-R，4℃隔夜培育。同時將雜交瘤細胞上清與生物素標記的人PCSK9蛋白混合，PCSK9蛋白的終濃度為250 ng/ml，4℃隔夜培育。酶標板洗板封閉後，加入雜交瘤細胞上清與PCSK9蛋白的混合物，室溫靜置培育1小時。洗板後加入HRP標記的鏈黴親和素。最後加入TMB受質顯色液，且用2 M鹽酸終止顯色，然後使用酶標儀(Molecular Device)讀取在450奈米處的吸光值。 抗體篩選 首輪篩選用雜交瘤培養上清進行抗原結合偵測。4次融合共篩選出13000個與抗原有特異性結合的雜交瘤。對此等雜交瘤細胞株進行進一步的競爭實驗的篩選。藉由競爭ELISA的篩選得到104株雜交瘤細胞，其分泌的抗體可阻斷人源PCSK9與人源LDL-R的結合。將此等能夠結合抗原併有阻斷功能的抗體自雜交瘤細胞上清中純化出來。同時對此等雜交瘤細胞株進行次選殖。次選殖用結合及競爭ELISA進行偵測，且對其亞型進行鑑定。 純化後的抗體進行細胞LDL吸收實驗。結合與阻斷活性亦將藉由純化的抗體進行進一步偵測。最終的候選純系係根據結合的親和力，阻斷PCSK9結合LDL-R的能力以及恢復細胞LDL吸收的能力選定。 2.5雜交瘤細胞次選殖 將選取的雜交瘤細胞株按照每孔0.5個、1個及5個細胞的密度鋪至96孔板中。選出其中的單株孔用ELISA進行偵測。各雜交瘤細胞株保留且凍存3個次純系。 2.6抗體亞型偵測 用ELISA鑑定抗體同種型(見表2)。分別用包被液將山羊抗大鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgM的抗體(Bethyl)稀釋至1 μg/ml，加入至96孔酶標板(Nunc)中，4℃隔夜培育。洗板封閉後，加入雜交瘤細胞培養上清，室溫靜置培育1小時。洗板後分別加入山羊抗人Kappa鏈酶標二抗(Southern Biotech)，或山羊抗人Lambda鏈酶標二抗(Southern Biotech)，室溫靜置培育45 分鐘。洗板後加入TMB受質顯色液，用2 M鹽酸終止顯色後使用酶標儀(Molecular Device)讀取在450奈米處的吸光值。表 2. 抗體亞型

2.7抗體純化 將收集的雜交瘤上清調節pH至7.0後，上樣至Protein A管柱 (MabSelect SuRe, GE)。抗體用Glycine洗脫，且立即用1M Tris中和。純化後的蛋白濃度用Nano Drop (Thermal-Fisher)偵測。蛋白的純度藉由SDS-PAGE (Invitrogen, NuPAGE4%-12% Bis-Tris Gel) 及HPLC-SEC (Agilent)偵測。實施例 3 ：全人源抗體的產生 3.1 雜交瘤測序 採用Trizol套組(Invitrogen-15596018)自雜交瘤細胞中提取RNA，再利用5'-RACE套組(Takara-28001488)擴增得到cDNA，然後藉由3'-簡併引物及3'-接頭引物(ExTaq: Takara-RR001B)擴增cDNA。將擴增得到的片段插入至pMD18-T載體(Takara-D101C)且送測序(上海鉑尚公司)。 選擇的抗體11.4、18.156.8、15.14.2、17.72.3、18.136.7、19.3.8及40409的可變區序列(胺基酸序列及核酸序列)如SEQ ID NO: 73-100所示。 3.2全人源抗體的表現與純化 將各抗體(人-鼠嵌合抗體)可變區基因序列選殖至含有人源恆定區基因的pcDNA3.3載體上。將重鏈及輕鏈質粒轉染至HEK293細胞中進行抗體表現。離心收集細胞上清。用Protein A (MabSelect SuRe, GE)純化抗體，且將純化後的抗體透析至PBS中。抗體濃度藉由Nanodrop。蛋白的純度藉由SDS-PAGE (Invitrogen, NuPAGE4%-12% Bis-Tris Gel)及HPLC-SEC (Agilent)偵測。 3.3親和力成熟 構建11.4 重鏈CDR3區的飽和突變文庫，且用ELISA方法進行篩選。挑選與原始純系相比，單點突變使PCSK9親和力提高之純系。將挑選出的突變位點建成一個組合文庫。根據ELISA 結合實驗及 SPR k_off 排序結果，挑選出親和力提高的突變組合。 以11.4序列作為模板，構建2個隨機突變文庫。藉由對該文庫進行2輪淘選及篩選，挑選出能夠提高親和力的突變，且與飽和突變文庫中得到的突變組合，從而進一步提高抗體的親和力。 構建11.4 重鏈CDR3區的飽和突變文庫，且用ELISA方法進行篩選。與原始純系相比，單點突變挑選出PCSK9親和力提高的純系(圖1)。將挑選出的突變位點建成一個組合文庫。根據ELISA結合實驗及SPR k_off 排序結果，挑選出親和力提高的突變組合。CDR3區的3個位點的突變組合可使親和力提高10倍，如純系B4G2及C1B4(見表3)。 表3. 親和力成熟後的抗體的親和力

以11.4序列作為模板，構建2個隨機突變文庫。藉由對該文庫進行2輪淘選及篩選，得到5個能夠提高親和力的突變。將其中3個突變與B4G2中的突變組合，得到三個純系40408、40409及40410，從而使親和力進一步提高2倍。最終親和力成熟後的抗體40409的親和力比參照抗體BMK.115高2倍 (見表4)。 表4. 親和力成熟後的抗體的親和力

3.4瞬轉表現全人抗體 3.4.1 18.156.8 (hIgG4) 全人抗體18.156.8-hIgG4)在還原條件下的SDS-PAGE上的表徵分子量為25 kDa 及55 kDa，分別對應抗體的輕鏈及重鏈。在非還原SDS-PAGE上的主條帶對應了完整的IgG分子，分子量約150 KD。HPLC-SEC結果顯示抗體純度為99.6% (圖3)。內毒素含量小於0.5 EU/mg。 3.4.2 40409 (hIgG4) 全人抗體WBP301-40409 (hIgG4)在還原條件下的SDS-PAGE上的表徵分子量為25 kDa 及55 kDa，分別對應抗體的輕鏈及重鏈。在非還原SDS-PAGE上的主條帶對應了完整的IgG分子，分子量約150 KD。HPLC-SEC結果顯示抗體純度為98%(圖5)。內毒素含量小於0.5 EU/mg。 3.4.3 15.14.2-uAb-IgG4L 全人抗體15.14.2-uAb-IgG4L在還原條件下的SDS-PAGE上的表徵分子量為25 kDa 及55 kDa，分別對應抗體的輕鏈及重鏈。在非還原SDS-PAGE上的主條帶對應了完整的IgG分子，分子量約150 KD。HPLC-SEC結果顯示抗體純度為99.8% (圖7)。內毒素含量小於0.5 EU/mg。 3.4.4 17.72.3-uAb2-IgG4K 全人抗體17.72.3-uAb2-IgG4K在還原條件下的SDS-PAGE上的表徵分子量為25 kDa 及55 kDa，分別對應抗體的輕鏈及重鏈。在非還原SDS-PAGE上的主條帶對應了完整的IgG分子，分子量約150 KD。HPLC-SEC結果顯示抗體純度為98.9%(圖9)。內毒素含量小於0.5 EU/mg。 3.4.5 18.136.7-IgG4K 全人抗體18.136.7-IgG4K在還原條件下的SDS-PAGE上的表徵分子量為25 kDa 及55 kDa，分別對應抗體的輕鏈及重鏈。在非還原SDS-PAGE上的主條帶對應了完整的IgG分子，分子量約150 KD。HPLC-SEC結果顯示抗體純度為99.2% (圖11)。內毒素含量小於0.5 EU/mg。 3.4.6 19.3.8-uAb1-IgG4L 全人抗體19.3.8-uAb1-IgG4L在還原條件下的SDS-PAGE上的表徵分子量為25 kDa 及55 kDa，分別對應抗體的輕鏈及重鏈。在非還原SDS-PAGE上的主條帶對應了完整的IgG分子，分子量約150 KD。HPLC-SEC結果顯示抗體純度為99.9% (圖13)。內毒素含量小於0.5 EU/mg。實施例 4 ：候選抗體表徵 4.1全人抗體的結合與阻斷活性 ELISA方法驗證全人抗體與PCSK9結合的活性以及阻斷PCSK9與LDL-R結合的活性分別見圖14及15。結合實驗EC50與阻斷實驗的IC50結果見表5及表6。候選抗18.156.8(hIgG4)、40409(hIgG4)、15.14.2-uAb-IgG4L及17.72.3-uAb2-IgG4K顯示與參照抗體BMK.115及Repatha相當的結合與阻斷活性。表 5. 抗體與PCSK9結合活性

表 6. 阻斷活性

4.2 LDL 吸收實驗： HepG2或Huh-7細胞用含10% FBS的DMEM培養液以每孔1×10⁵ 的密度接種於96孔板，置於37℃培養箱中。次日將含10% FBS的DMEM培養液換成無血清培養液，且將野生型PCSK9或變體PCSK9 (D374Y) 與一系列濃度梯度稀釋的抗體混合後加入相應的孔中，37℃培育1小時。野生型PCSK9及變體PCSK9 (D374Y) 的終濃度分別為20μg/ml及1.3μg/ml。向96孔板中加入Bodipy螢光標記的LDL (Invitrogen L-3483)，終濃度為1.5μg/ml。在37℃培養箱中培育3小時後取出96孔板，棄去含有LDL的培養液，用胰酶消化收集細胞且洗滌兩次。細胞內的螢光用FACS偵測，螢光強度表徵了LDL的吸收量。LDL吸收的回復率由如下公式計算：LDL吸收回復率 (%) = (MFI_樣品 - MFI_LDL+Ag1H )/ (MFI_{LDL - MFILDL+Ag1H} ) ×100% 。 在野生型及突變體PCSK9存在情況下，在HepG2及Huh-7細胞上對抗體18.156.8 及40409進行LDL吸收活性的實驗(見圖16及17)，IC50值見表7。實驗證明無論在有野生型或突變型PCSK9存在的條件下，抗體18.156.8 及40409均能有效地恢復HepG2及Huh-7細胞對LDL的吸收能力。在野生型PCSK9存在情況下，在HepG2細胞上對抗體15.14.2, 17.72.3及19.3.8進行LDL吸收活性的實驗 (圖18)， IC50值見表8. 實驗證明在有野生型PCSK9存在的條件下，抗體15.14.2, 17.72.3及19.3.8能有效地恢復HepG2細胞對LDL的吸收能力。 表7. 抗體恢復HepG2及Huh-7細胞LDL吸收的IC50

表8. 抗體恢復HepG2細胞LDL吸收的IC50

4.3動力學親和力 4.3.1運用SPR技術偵測結合動力學常數 使用Biacore T200 (GE) 偵測抗體與人源PCSK9及恆河猴PCSK9的結合親和力常數。使用Protein A或抗IgG Fc抗體偶聯的芯片補貨待測抗體。然後將不同濃度的人源PCSK9或恆河猴PCSK9分別注入傳感器芯片上，進樣速度為30μl/min。樣品結合時間為180 s, 解離時間為1200 s。每次抗原結合後，用2 M MgCl₂ 再生芯片。 最終結合解離曲線為扣除參比通道Fc1及緩衝液通道信號後的結果。實驗資料用1：1 Langmiur模式進行擬合。計算PCSK9莫耳濃度時所用分子量為85 KDa。 4.3.2與恆河猴PCSK9蛋白結合反應 用pH值9.2的包被液將小鼠抗His標籤的抗體(Genscript)稀釋至1 μg/ml，加入至96孔酶標板中，4℃隔夜培育。洗板封閉後，加入恆河猴PCSK9-His (Sino Biological)蛋白，濃度為1 μg/ml，室溫培育1小時。洗板後加入待測抗體，室溫培育1小時。洗板後加入山羊抗大鼠IgG1及山羊抗大鼠IgGb的HRP酶標二抗 (Bethyl)混合物，室溫培育45 分鐘。最後加入TMB受質顯色液，反應後用2M 鹽酸終止顯色，然後使用酶標儀(Molecular Device)讀取在450奈米處的吸光值。 用SPR實驗偵測抗體的動力學結合常數。抗體與人源PCSK9及猴源PCSK9結合的親和力見表9。 表9. 抗體與人源PCSK9及猴源PCSK9結合之動力學常數

4.4抗體在血清中之穩定性偵測 待測抗體用新鮮分離的人血清稀釋(血清含量＞95%)後，置於37℃培養箱中分別培育0、1、3、7、14天。在各時間終點處，自37℃培養箱中取出樣品後，在乙醇-乾冰浴中迅速冷凍且將樣品置於-80℃冰箱保存。穩定性測試前取出樣品迅速溶解。96孔酶標板用Na₂ CO₃ /NaHCO₃ (pH 9.2)緩衝液稀釋的鏈黴親和素包被，置於4℃冰箱。次日，96孔板用0.1% PBST洗滌且用2% BSA/PBS封閉1小時後，加入生物素標記的PCSK9。在室溫下培育1小時後洗滌，加入一系列濃度梯度稀釋的樣品。在室溫下培育1小時後洗滌，加入HRP標記的羊抗人IgG抗體。在室溫下培育1小時後洗滌，加入TMB受質，待顯色後用2M HCl終止。用酶標儀(Molecular Device)讀取波長450nm處的吸光度。 抗體在37度人血清中培育後，用ELISA偵測其與PCSK9結合的活性(見圖19)。抗體18.156.8 及B4G2在血清中培育1天，3天，7天及14天後，結合活性與未培育的抗體相同，說明18.156.8及B4G2在37度可穩定存在於人血清中至少14天。抗體15.14.2, 17.72.3 及19.3.8在血清中培育3天後，結合活性與未培育的抗體相同。說明抗體可穩定存在於血清中至少3天。實施例 5 ：動物實驗 5.1食蟹猴中單次注射藥效 使用LDLC及HDLC3套組(Roche)在Roche/Hitachi cobas c系統上偵測猴子血清中低密度脂蛋白膽固醇LDL-C及高密度脂蛋白膽固醇HDL-C的濃度。總膽固醇TCHO用cholesterol FS 套組 (DiaSys)偵測。 5.1.1實驗1: 6隻3-4歲的雌性食蟹猴，體重在2.6至2.9公斤之間，隨機分為6組(每組1隻)。6組猴子分別進行單次靜脈注射10 mg/kg或30 mg/kg劑量之BMK.115或18.156.8 (hIgG4)或40409 (hIgG4)抗體。給藥當天定義為第一天。每組猴子給藥後觀測36天。

備註：在本實驗中，「劑量水準」及「劑量」互換使用。^a 除非另有說明書，否則劑量代表活性成分。 抗體18.156.8 及40409在食蟹猴中降低低密度膽固醇的療效。食蟹猴分別按10 mg/kg及30 mg/kg的劑量給藥後，抗體BMK.115 及W301-18.156.8可快速且持久地降低低密度脂蛋白膽固醇及總膽固醇含量。 在10 mg/kg及30 mg/kg的劑量組中，與注射前相比，BMK.115分別使低密度膽固醇降低至83.4% 及 89.6%；18.156.8分別使低密度膽固醇降低至79.5% 及83.5%。最大降低量在第8天達到。直至偵測結束，無論10 mg/kg或30 mg/kg劑量組，注射了18.156.8的猴子的低密度膽固醇一直維持在很低水準；對照抗體BMK.115隻在30 mg/kg劑量組中可使低密度脂蛋白水準維持在低水準至36天，但在10 mg/kg劑量組中，低密度脂蛋白水準自第24天開始回升，到第28天已恢復至給藥前水準 (圖20A及20B)。所以與參照抗體BMK.115相比，18.156.8可更長時間地將低密度脂蛋白維持在較低水準。 在10 mg/kg 及30 mg/kg的劑量組中，與注射前相比，40409 (hIgG4)分別使低密度膽固醇降低至32.2%及38.1%(圖20A及20B)。 18.156.8 (hIgG4)及40409 (hIgG4)抗體給藥的猴子中，無論10 mg/kg或30 mg/kg劑量組，高密度脂蛋白膽固醇水準在實驗過程中均沒有明顯變化。參照抗體BMK.115給藥的猴子中，10 mg/kg劑量組的猴子的高密度膽固醇水準無明顯變化，但30 mg/kg劑量組的高密度膽固醇水準與給要前相比降低了30% (圖21A及21B)。 5.1.2實驗2：10隻3-4歲的雌性食蟹猴，體重在2.5至3.5公斤之間，隨機分為10組(每組1隻)。10組猴子分別進行單次靜脈注射3 mg/kg或10 mg/kg劑量的Repatha或15.14.2、17.72.3、18.136.7或19.3.8抗體。給藥當天定義為第一天。每組猴子給藥後觀測36天。

備註：在本實驗中，「劑量水準」及「劑量」互換使用。^a 除非另有說明書，否則劑量代表活性成分。 抗體15.14.2、17.72.3、18.136.7及19.3.8在食蟹猴中降低低密度膽固醇療效。 食蟹猴分別按3 mg/kg 及10 mg/kg的劑量給藥後，抗體15.14.2及Repatha可快速且持久地降低低密度脂蛋白膽固醇及總膽固醇含量(圖22A及22B)。抗體18.136.7在3 mg/kg及10 mg/kg劑量組中，亦使低密度膽固醇有顯著降低(~50%)。17.72.3及19.3.8在10 mg/kg劑量組中使低密度膽固醇有少量降低。 在3 mg/kg及10 mg/kg的劑量組中，與給藥前相比，Repatha分別使低密度膽固醇降低至80%及77%；15.14.2在兩個劑量組均使低密度膽固醇降低至77%。最大降低量在第8-16天到達。在10 mg/kg劑量組中，注射了15.14.2的猴子的低密度膽固醇一直維持在很低水準，直至偵測結束。而對照抗體Repatha給藥的猴子的低密度脂蛋白水準自第24天開始回升，到第36天已恢復至給藥前水準(圖22A及22B)。在3 mg/kg劑量組中，Repatha給藥的猴子的低密度脂蛋白水準第12天開始回升至80%，到第20天已恢復至給藥前水準。15.14.2給藥的猴子到第28天低密度膽固醇水準仍維持在給藥前50%以下。所以與Repatha相比，在3 mg/kg 及10 mg/kg兩個劑量組中，15.14.2均可更長時間地將低密度脂蛋白維持在較低水準。 高密度脂蛋白膽固醇在所有給藥的猴子中均沒有明顯變化(圖23 A及23B)。 5.2藥代動力學 藉由測定動物血清中的BMK.115、18.156.8、40409、15.14.2、17.72.3、18.136.7、19.3.8濃度以獲得體內藥物暴露水準。自所有存活的食蟹猴採集0小時(給藥前)，及給藥後0.5、1、2、4、24、48、96、168、336、504、672、744及840小時的血樣。 自動物的頭靜脈或股靜脈採集約2mL全血，置於無抗凝劑的採血管中。血樣採集後常溫靜置至少30分鐘。約4℃下2000 g離心10分鐘獲取血清(血樣採集後2小時內完成)。血清轉移至貼有標籤的聚丙烯樣品管中。立即垂直放入乾冰中速凍，然後保存在 ≤-60°的超低溫冰箱中。 在藥代動力學偵測前，將血清樣品迅速解凍。用Na₂ CO₃ /NaHCO₃ 緩衝液稀釋山羊抗人多株抗體後，包被酶標偵測板，4℃隔夜培育。用0.1% Tween-PBS洗板後，加入2% BSA/PBS封閉。將稀釋後的食蟹猴血清樣品加入酶標板中，於室溫下培育一小時。洗板後，先後於酶標板中加入生物素標記的山羊抗人IgG抗體及鏈黴親和素-HRP，分別於室溫下培育一小時。加入TMB受質，待顯色後用2M HCl終止。在450nm波長下讀取每孔吸光值。藉由標準曲線計算血清中抗體的濃度。 藥代動力學參數包括但不侷限於初始血清濃度(C₀ )及自0小時至給藥後840小時的血藥濃度-時間曲線下的面積(AUC_0-840h )，用驗證過的WinNonlin程序(PharsightVersion 6.2.1)進行計算。用非房室法的線性上升/對數下降梯形法則，計算AUC_0-840h ，限於對供試品處理的動物。在計算平均值時，將BLQ(低於定量值)當成0來計算。 血清中抗體的濃度用ELISA偵測(圖24及25)。由0至840小時血清中抗體濃度計算得到的BMK.115, 18.156.8(hIgG4)、40409(hIgG4)的C₀ 值及AUC_{0 - 840h} ，以及抗體半衰期見表10。 劑量自10 mg/kg增加至30 mg/kg時，18.156.8及40409的藥物暴露水準(AUC_{0 - 840h} 及/或C₀ )成比例增加，但BMK.115的藥物暴露水準增加與劑量的增加不成正比。 表10.藥代動力學資料I

由0至840小時血清中抗體濃度計算得到的Repatha、15.14.2、17.72.3、18.136.7及19.3.8的C₀ 值及AUC_{0 - 840h} ，以及抗體半衰期見表11。在3 mg/kg及10 mg/kg兩個劑量組，抗體15.14.2、17.72.3、18.136.7及19.3.8的半衰期均長於Repatha。 劑量自10 mg/kg增加至30 mg/kg時，Repatha、15.14.2、17.72.3、18.136.7及19.3.8的藥物暴露水準(AUC_{0 - 840h} 及/或C₀ )均成比例增加。 表11. 藥代動力學資料II

5.3免疫原性 自動物的頭靜脈或股靜脈採集0小時(給藥前), 及給藥後336、672、840小時的血樣。 用Na₂ CO₃ /NaHCO₃ 緩衝液稀釋抗體115、18.156.8及40409後鋪板(NUNC)，4度培育隔夜。用0.1% Tween-PBS洗板後加入2% BSA/PBS封閉。將PBS稀釋的猴子血清加入酶標板中室溫培育1小時。洗板後加入山羊抗食蟹猴IgG-HRP(與人IgG無交叉反應)培育。洗板後加入TMB受質，待顯色後用2M HCl終止。在450nm波長下讀取每孔吸光值。 抗體BMK.115, 18.156.8 (hIgG4) 及40409 (hIgG4)的免疫原性偵測結果見圖26。在給藥後336、672、840小時的猴子血清中，針對BMK.115、18.156.8 (hIgG4)、40409 (hIgG4) 的抗抗體的滴度與給藥前沒有明顯差異，說明單次注射10 mg/ml或30 mg/ml劑量的BMK.115、18.156.8 (hIgG4)或40409 (hIgG4) 抗體引起的免疫原性很低。 抗體Repatha、15.14.2、17.72.3、18.136.7及19.3.8的免疫原性偵測結果見圖27。在給藥後336、672、840小時的猴子血清中，針對Repatha、15.14.2、17.72.3、18.136.7、19.3.8的抗抗體的滴度與給藥前無明顯差異，說明單次注射10 mg/ml或30 mg/ml劑量之Repatha、15.14.2、17.72.3、18.136.7或19.3.8抗體引起的免疫原性很低。 5.4毒性 死亡/瀕死: 實驗期間每天2次報導各動物之健康狀態，上午1次下午1次，除動物到達設施及解剖當天動物檢查1次。 在整個實驗過程中動物無計劃外死亡。 詳細臨床觀察：對所有動物(包括替代動物)在實驗前進行1次詳細臨床觀察，對所有實驗動物在給藥日(約給藥後2±0.5小時)進行1次觀察，此後實驗過程中每週進行1次詳細臨床觀察。 整個實驗過程中未觀察到藥物相關的臨床症狀。 籠邊觀察：在實驗前期，自給藥前2天開始對所有動物(包括替代動物)每天進行1次籠邊觀察。在實驗第一天進行1次，在給藥日進行每天2次籠邊觀察(給藥後30分鐘以內及給藥後約6±0.5小時)，恢復期每天進行1次籠邊觀察。在相同時間段安排了詳細臨床觀察，未進行籠邊觀察。 體重：每隻動物實驗前期稱重1次。對實驗動物，在實驗第一天給藥前進行1次體重稱量，隨後實驗過程中每週稱重一次。 未觀察到藥物相關的體重變化，所有體重變化均在正常生物學差異範圍內。 攝食量：對所有動物，在實驗給藥前2天及整個實驗給藥及觀察過程中，評估動物的攝食量。藉由監視所有動物的食慾(動物是否進食構成評估文件)來評估每天的攝食量。 無藥物相關的攝食量變化。實施例 6 ：抗體 18.156.8 與參照抗體之間的活性比較 1. 參照抗體的產生 用實施例1及實施例2中所述之方法，基於專利CN101932607中12H11.1及24B9.1的序列產生參照抗體12H11.1.uIgG4K及24B9.1.uIgG4L。 抗體12H11.1.uIgG4K及24B9.1.uIgG4L在還原條件下的SDS-PAGE上的表徵分子量為25 kDa及55 kDa，分別對應抗體的輕鏈及重鏈(圖28A)。在非還原SDS-PAGE上的主條帶對應了完整的IgG分子，分子量約150 KD。HPLC-SEC結果顯示24B9.1.uIgG4L的抗體純度為96.8%(圖28B)。HPLC-SEC結果顯示12H11.1.uIgG4K的抗體純度為95.3%(圖28C)。 2. ELISA測定的與人PCSK9的結合 根據實施例2第2.4節雜交瘤篩選中所述之方法，用ELISA方法驗證參照抗體12H11.1.uIgG4K及24B9.1.uIgG4L與人PCSK9結合的活性(圖29)。結合EC50值見表12。參照抗體12H11.1.uIgG4K顯示低於抗體18.156.8及BMK.115的結合活性。參照抗體24B9.1.uIgG4L不與人PCSK9結合。 表12. 結合活性

3. ELISA法偵測阻斷 根據實施例2第2.4節雜交瘤篩選中所述之方法，藉由競爭ELISA偵測參照抗體12H11.1.uIgG4K及24B9.1.uIgG4L阻斷PCSK9與LDLR結合的活性(圖30)。IC50值見表13。抗體24B9.1.uIgG4L未顯示出阻斷活性。抗體12H11.1.uIgG4K顯示與抗體18.156.8近似的IC50，但無法完全阻斷PCSK9與LDLR的結合。 表13. 阻斷活性

4. 運用SPR技術偵測親和力 藉由使用實施例4第4.3.1節運用SPR技術偵測結合動力學常數中所述之同一方法測定，抗體12H11.1.uIgG4K的動力學親和力遠低於抗體18.156.8。結果示於表14。 表14.與人PCSK9結合的動力學親和力

5. LDL吸收實驗 根據實施例4第4.2節全人抗體的LDL吸收實驗中所述之方法，在HepG2細胞上對抗體18.156.8及12H11.1.uIgG4K進行LDL吸收活性的實驗(參見表15及圖31)。12H11.1.uIgG4K在HepG2細胞中顯示較低的恢復細胞LDL吸收的活性。 表15. LDL吸收實驗

雖然本公開案已具體示出且參考特定實施例(其中一些為較佳實施例)進行了描述，但熟習此項技術者應理解，如本申請所示可在不脫離本發明之精神及範圍內，可進行各種形式上及細節上的改變。

圖1顯示11.4重鏈CDR3區挑選出的突變。 圖2顯示全人源抗體18.156.8 (hIgG4) 的SDS-PAGE在SDS-PAGE膠中之染色結果。M: 蛋白質分子量標記; Lane5: 18.156.8 (hIgG4), 還原條件; Lane6: 18.156.8 (hIgG4), 非還原條件。 圖3顯示全人源抗體18.156.8 (hIgG4)的HPLC-SEC圖譜中顯示為99.6%之純度。 圖4顯示全人源抗體40409 (hIgG4)的SDS-PAGE在SDS-PAGE膠中之染色結果。M: 蛋白質分子量標記; Lane5: 40409 (hIgG4), 還原條件; Lane6: 40409 (hIgG4), 非還原條件。 圖5顯示全人源抗體40409 (hIgG4)的HPLC-SEC圖譜中顯示為98%之純度。 圖6顯示全人源抗體15.14.2-uAb-IgG4L的SDS-PAGE在SDS-PAGE膠中之染色結果。M: 蛋白質分子量標記; Lane5: 15.14.2-uAb-IgG4L, 還原條件; Lane6: 15.14.2-uAb-IgG4L, 非還原條件。 圖7顯示全人源抗體15.14.2-uAb-IgG4L 的HPLC-SEC圖譜中顯示為99.8%之純度。 圖8顯示全人源抗體17.72.3-uAb2-IgG4K的SDS-PAGE在SDS-PAGE膠中之染色結果。M: 蛋白質分子量標記; Lane5: 17.72.3-uAb2-IgG4K, 還原條件; Lane6: 17.72.3-uAb2-IgG4K, 非還原條件。 圖9顯示全人源抗體17.72.3-uAb2-IgG4K的HPLC-SEC圖譜中顯示為98.9%之純度。 圖10顯示全人源抗體18.136.7-IgG4K的SDS-PAGE在SDS-PAGE膠中之染色結果。M: 蛋白質分子量標記; Lane5: 18.136.7-IgG4K, 還原條件; Lane6: 18.136.7-IgG4K, 非還原條件。 圖11顯示全人源抗體18.136.7-IgG4K的HPLC-SEC圖譜中顯示為99.2%之純度。 圖12顯示全人源抗體19.3.8-uAb1-IgG4L的SDS-PAGE在SDS-PAGE膠中之染色結果。M: 蛋白質分子量標記; Lane5: 19.3.8-uAb1-IgG4L, 還原條件; Lane6: 19.3.8-uAb1-IgG4L, 非還原條件。 圖13顯示全人源抗體19.3.8-uAb1-IgG4L的HPLC-SEC圖譜中顯示為99.9%之純度。 圖14顯示全人源抗體與人源PCSK9結合之ELISA實驗。 圖15顯示全人源抗體阻斷PCSK9與LDL-R結合ELISA實驗。 圖16顯示全人源抗體18.156.8藉由分別結合野生型(圖16A及16B)及突變PCSK9(D374Y)(圖16C及16D)恢復肝細胞癌(HepG2)細胞及Huh-7細胞中之LDL吸收實驗結果。 圖17顯示全人源抗體40409藉由分別結合野生型(圖17A及17B)及突變PCSK9(D374Y)(圖17C及17D)恢復肝細胞癌(HepG2)細胞及Huh-7細胞中之LDL吸收實驗結果。 圖18顯示全人源抗PCSK9抗體15.14.2-uAb1-IgG4L、17.72.3-uAb1-IgG4K及19.3.8-uAb1-IgG4L在肝細胞癌(HepG2)細胞中恢復LDL吸收之實驗結果。 圖19顯示ELISA法結合測定的由濃度指示的全人源PCSK9抗體(圖19A：18.156.8; 圖19B: B4G2; 圖19C: 15.14.2、19.3.8及17.72.3)在血清中之穩定性。 圖20顯示抗體18, 156.8、40409及BMK.115給藥後食蟹猴低密度脂蛋白(LDL-C)之變化百分率。圖20A顯示單次注射10mg/kg之結果，圖20B顯示單次注射30mg/kg之結果。 圖21顯示抗體18, 156.8、40409及BMK.115給藥後食蟹猴高密度脂蛋白(HDL-C)之變化百分率。圖21A顯示單次注射10mg/kg之結果，圖21B顯示單次注射30mg/kg之結果。 圖22顯示抗體15.14.2、19.3.8、17.72.3、18.136.7及Repatha給藥後食蟹猴低密度脂蛋白(LDL-C)之變化百分率。圖22A顯示單次注射3mg/kg之結果，圖22B顯示單次注射10mg/kg之結果。 圖23顯示抗體15.14.2、19.3.8、17.72.3、18.136.7及Repatha給藥後食蟹猴高密度脂蛋白(HDL-C)之變化百分率。圖23A顯示單次注射3mg/kg之結果，圖23B顯示單次注射10mg/kg之結果。 圖24顯示ELISA法測定的食蟹猴血清中給藥前後的抗體18.156.8、40409或BMK.115濃度。圖24A顯示單次注射10mg/kg之結果，圖24B顯示單次注射30mg/kg之結果。 圖25顯示ELISA法測定的食蟹猴血清中給藥前後的抗體15.14.2(hIgG4)、19.3.8(hIgG4)、17.72.3(hIgG4)、18.136.7(hIgG4)或Repatha濃度。圖25A顯示單次注射10mg/kg之結果，圖25B顯示單次注射30mg/kg之結果。 圖26顯示食蟹猴血清中給藥前後針對抗體18.156.8(hIgG4)、40409(hIgG4)或BMK.115的抗抗體(ADA)濃度。圖26A、26C及26E顯示單次注射10mg/kg之結果，圖26B、26D及26F顯示單次注射30mg/kg之結果。 圖27顯示食蟹猴血清中給藥前後針對抗體15.14.2、19.3.8、17.72.3、18.136.7或Repatha的抗抗體(ADA)濃度。圖27A、27C、27E、27G及27I顯示單次注射3mg/kg之結果，圖27B、27D、27F、27H及27J顯示單次注射10mg/kg之結果。 圖28A、28B及28C顯示參照抗體12H11.1及24B9.1之生成結果。圖28A展示了12H11.1.uIgG4K及24B9.1.uIgG4L之SDS-PAGE結果。M:蛋白質分子量標記; Lane1: 24B9.1.uIgG4L，還原條件; Lane2: 12H11.1.uIgG4K，還原條件; Lane3: 24B9.1.uIgG4L，非還原條件; Lane4: 12H11.1.uIgG4K，非還原條件。圖28B及28C顯示對24B9.1.uIgG4L及12H11.1.uIgG4K之HPLC-SEC偵測。 圖29表示ELISA法測定的，抗體18.156.8以及參照抗體24B9.1、12H11.1及BMK.115與人PCSK9結合的情況之比較。 圖30顯示ELISA法測定的，抗體18.156.8以及參照抗體24B9.1, 12H11.1及BMK.115阻斷PCSK9與LDLR的結合的情況之比較結果。 圖31顯示抗體18.156.8 以及參照抗體12H11.1及BMK.115在HepG2細胞中恢復LDL吸收之能力。

<110> 中國大陸商上海藥明生物技術有限公司(WUXI BIOLOGICS(SHANGHAI)CO.,LTD.)

<120> 新型抗-PCSK9抗體

<130> 053674-8009TW01

<140> TW 106131295

<141> 2017-09-12

<150> CN 201610836152.4

<151> 2016-09-20

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<170> PatentIn 3.5版

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Claims (18)

1. 一種分離的抗體或其抗原結合片段，其包括：重鏈可變區，其包括如SEQ ID NO：13所示的HCDR1、如SEQ ID NO：15所示的HCDR2及如SEQ ID NO：17所示的HCDR3；及輕鏈可變區，其包括如SEQ ID NO：19所示的LCDR1、如SEQ ID NO：21所示的LCDR2及如SEQ ID NO：23所示的LCDR3；以及其中該分離的抗體或其抗原結合片段與前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶Kexin 9型(PCSK9)特異性結合。
2. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其包括：重鏈可變區，其如SEQ ID NO：77所示；及輕鏈可變區，其如SEQ ID NO：79所示。
3. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其為全人源單株抗體。
4. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其為雙功能抗體(diabody)、scFv、scFv二聚體、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、ds雙功能抗體(ds diabody)、域抗體或雙價域抗體。
5. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其進一步包括免疫球蛋白恆定區。
6. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其進一步包括綴合物。
7. 一種分離的多核苷酸，其編碼如請求項1至6中任一項之抗體或其抗原結合片段。
8. 一種載體，其包括如請求項7之分離的多核苷酸。
9. 一種宿主細胞，其包括如請求項8之載體。
10. 一種表現如請求項1至6中任一項之抗體或其抗原結合片段之方法，其包括在表現如請求項7之分離的多核苷酸的條件下培養如請求項9之宿主細胞。
11. 一種套組，其包括如請求項1至6中任一項之抗體或其抗原結合片段。
12. 一種如請求項1至6中任一項之抗體或其抗原結合片段之用途，其係用於製備在個體中阻斷PCSK9與LDL-R結合之醫藥品。
13. 如請求項12之用途，其中該個體經鑑定為患有可能對PCSK9抑制劑有反應之病症或病況。
14. 如請求項13之用途，其中該個體經鑑定為在來自該個體的待測生物 樣品中血清LDL膽固醇、總膽固醇及/或非-HDL膽固醇含量上調。
15. 一種醫藥組合物，其包括如請求項1至6中任一項之抗體或其抗原結合片段以及一或多種醫藥學上可接受之載體。
16. 如請求項12之用途，其中該個體具有上調的血清LDL膽固醇、總膽固醇及/或非-HDL膽固醇含量。
17. 如請求項12之用途，其中該醫藥品用於治療心血管疾病、發炎性疾病及感染性疾病。
18. 如請求項17之用途，其中該感染性疾病為敗血症。

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