TWI775588B - 雞乳桿菌nfu206菌株及乳酸菌用於製備抑制口腔病原菌之組成物之用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種雞乳桿菌NFU206菌株及其用於製備抑制口腔病原菌之組成物之用途，其中該乳酸菌係包含雞乳桿菌（
Lactobacillus gallinarum），其寄存編號為BCRC 911067，其中，該口腔病原菌為轉糖鏈球菌（
Streptococcus mutans），藉此，可達到抑制齲齒等口腔疾病之功效。
Description
本發明係有關於一種雞乳桿菌菌株，以及一種乳酸菌之用途，特別是一種乳酸菌用於製備抑制口腔病原菌之組成物之用途。
按，齲齒等口腔疾病多是由細菌所引起，特別是轉糖鏈球菌（
Streptococcus mutans）與乳酸鏈球菌（
Lactococcus garvieae），為齲齒之主要病原菌。
為了防止齲齒的發生，需要抑制病原菌之生長。一般而言，最為常見之手段係於牙膏或漱口水內添加氟化物，或是直接於牙齒上塗上氟化物，來達到抑制轉糖鏈球菌生長之目的；此外，木糖醇（Xylitol）亦常用於防止齲齒，其原理在於，於食品中以木糖醇取代糖分，由於木糖醇無法為細菌所分解，可抑制細菌產酸，另一方面，木糖醇常使用於口香糖內，口香糖經咀嚼可促進唾液分泌，有助於中和口中酸性，故對齲齒之防止有利。
然而，要有效抑制口腔疾病，最直接的方式仍是抑制病原菌之生長，含氟牙膏等方式持久性有待商榷，且難以添加於食品中，增添攝取之困難，又，轉糖鏈球菌不僅會造成齲齒，亦是感染性心內膜炎的發生原因之一，如何提供易於攝取、成本較低、又能有效抑制轉糖鏈球菌生長之組合物，對醫藥界而言十分重要。
本發明之其中一目的係提供一種具有抑制口腔病原菌功效之乳酸菌，以及乳酸菌用於製備抑制口腔病原菌之組成物之用途，能利用乳酸菌之組合物達到抑制口腔病原菌之功效。
為達成上述目的，本發明提供一種雞乳桿菌NFU206（
Lactobacillus gallinarumNFU206）菌株，寄存於財團法人食品工業發展研究所，其寄存編號為BCRC 911067。
為達成上述目的，本發明提供一種乳酸菌用於製備抑制口腔病原菌之組成物之用途，其中該乳酸菌係包含雞乳桿菌（
Lactobacillus gallinarum），其寄存編號為BCRC 911067。
其中，該抑制口腔病原菌之組成物係用以抑制轉糖鏈球菌（
Streptococcus mutans）之生長。
在某些情況下，該抑制口腔病原菌之組成物可為食品、飲品或保健食品，亦或是牙膏、漱口水、口內用藥膏或口含錠等。
藉此，本發明能藉由雞乳桿菌製成之組成物達到抑制口腔病原菌之效果，防止齲齒等疾病之發生，增進人體健康。
本發明係提供一種雞乳桿菌NFU206（
Lactobacillus gallinarumNFU206）菌株，以及乳酸菌用於製備抑制口腔病原菌之組成物之用途，其中該乳酸菌係包含雞乳桿菌（
Lactobacillus gallinarumNFU206），其寄存編號為BCRC 911067，其中該抑制口腔病原菌之組成物係用以抑制轉糖鏈球菌（
Streptococcus mutans）之生長，該抑制口腔病原菌之組成物可為食品、飲品或保健食品等，亦或是牙膏、漱口水、口內用藥膏、口含錠等。
以下為說明本發明之實際功效，以本發明之指標菌種轉糖鏈球菌與自行分離出之雞乳桿菌進行數種試驗。
實施例一：菌液製備與抑菌能力篩選
關於本實施例中使用之指標菌種轉糖鏈球菌（寄存編號 BCRC 10793），係購自財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心（Bioresource Collection and Research Center, BCRC）。將轉糖鏈球菌菌液取100μL至BHI液體培養基中，於37℃好氧環境中培養二天。之後將菌液進行離心（1500g / 10分鐘 / 25℃），去除上清液後加入0.85%之生理食鹽水，震盪混勻後再次離心（1500 g / 10分鐘 / 25℃），並去除上清液。之後重複一次加入0.85%之生理食鹽水、震盪混勻後再次離心（1500 g / 10分鐘 / 25℃）、並去除上清液之步驟，以獲得菌塊。接著將滅菌完成之甘油與BHI液態培養基以1:1之比例混合，加入至上述菌塊中混合均勻後取1.5 mL至冷凍小管中，保存於-80℃下。欲進行實驗時，則自冷凍櫃取出冷凍小管，置於37℃水浴槽中回溫，自冷凍小管中取出100 μL之菌液加入至裝有10 mL BHI液態培養基之試管中，於37℃好氧環境下培養24小時。之後吸取菌液100 μL加入至裝有50 mL BHI液態培養基之錐形瓶中，在37℃好氧環境下培養24小時，以獲得供實驗使用之轉糖鏈球菌菌液。
關於本實施例中使用之乳酸菌係自發酵食品中分離而出，以16S rRNA基因序列鑑定菌種名，如以下所列表一所示。將乳酸菌液取100 μL加至MRS液態培養基中，於37℃厭氧環境下培養二天。之後將菌液進行離心（1500 g / 10分鐘 / 25℃）後去除上清液，並加入0.85 %之生理食鹽水，震盪混勻後再次離心（1500 g / 10分鐘 / 25℃），並去除上清液。之後重複進行一次加入0.85%之生理食鹽水、震盪混勻後再次離心（1500 g / 10 分鐘 / 25℃）、並去除上清液之步驟，以獲得菌塊。將已滅菌之甘油與MRS液態培養基以1:1之比例混合，加入至菌塊中混合均勻，之後取1.5 mL菌液至冷凍小管中，於-80℃下保存。欲進行實驗時，自冷凍櫃中取出冷凍小管，放入37℃水浴槽中回溫，自冷凍小管中取100 μL菌液加入裝有10 mL MRS液態培養基之試管中，於37℃厭氧環境下培養24小時。接著吸取100 μL培養好的菌液加入裝有50 mL MRS液態培養基之三角瓶中，於37℃厭氧環境下培養24小時，以獲得供實驗使用之乳酸菌菌液。
表一：乳酸菌菌液編號與以16S rRNA鑑定菌名之對照表
| 編號 | 16S rRNA鑑定菌名 |
| A2-2 | Lactobacillus plantarum |
| A2-5 | Lactobacillus plantarum |
| A2-10 | Lactobacillus plantarum |
| G1-1 | Lactobacillus gallinarum |
| L1-3 | Lactobacillus gallinarum |
| F3-4 | Lactobacillus paraplantarum |
| B-1 | Lactobacillus acidophilus |
| D-1 | Lactobacillus rhamnosus |
| S2-1 | Lactobacillus rhamnosus |
將所培養完成之轉糖鏈球菌菌液進行離心（1500 g / 10分鐘），加入10 mL無菌生理食鹽水進行回溶；另一方面，將所培養為成之乳酸菌菌液進行離心（1500 g / 10分鐘），留下上清液。之後，將回溶之轉糖鏈球菌菌液取100 μL與10 mL之乳酸菌菌液上清液加入至100 mL之BHI液態培養基中，於37℃下培養，於第0、2、4、6、8、10小時分別測量細胞懸液於光波長600 nm下之O.D.值（Optical Density），其中，正控制組不加入乳酸菌菌液上清液，結果如圖1所示，可以看出在第10小時時，添加L1-3乳酸菌菌液上清液者對轉糖鏈球菌之生長有明顯的抑制效果，混濁度自0.5353降至0.1140，可判斷其具有抗菌活性，故以下試驗皆僅以L1-3乳酸菌菌液上清液（
Lactobacillus gallinarum，雞乳桿菌，寄存編號BCRC 911067）進行。
以下試驗所使用之L1-3乳酸菌菌液上清液，係製備自將前述經24小時培養之L1-3乳酸菌菌液進行離心（8000g / 10分鐘 / 4℃）、取其上清液以0.22 μm過濾膜進行過濾後，以60℃之水浴加熱20分鐘，冷卻後於-80℃冷凍櫃中預冷48小時，進行冷凍乾燥後之物。
實施例二：抑菌圈試驗
取1 mL之轉糖鏈球菌菌液與20 mL之MHA培養基均勻混合，待其凝固後，以直徑7 mm之無菌牛津杯挖出複數孔洞，於孔洞內分別加入60 μL濃度分別為6 mg/mL、18 mg/mL、36 mg/mL、54 mg/mL之L1-3乳酸菌菌液上清液，於37℃下培養24小時，待抑菌圈出現後，測量抑菌圈之直徑，若有抑菌圈之產生，代表具有抗菌活性，如圖2所示，不同L1-3乳酸菌菌液上清液濃度與抑菌圈直徑之關係則見以下所列之表二，可以看出當L1-3乳酸菌菌液上清液濃度越高，抑菌圈範圍越大，顯示抑菌能力越好（各濃度皆以三重複平均值±標準差，A-D之不同字母表示不同濃度之間存在的顯著差異）。
表二：L1-3乳酸菌菌液上清液濃度與抑菌圈直徑之關係
| L1-3乳酸菌菌液上清液濃度 (mg/mL) | 抑菌圈直徑(mm) |
| 6 | 1.1 ± 0.12D |
| 18 | 1.6 ± 0.06C |
| 36 | 2.0 ± 0.06B |
| 54 | 2.7 ± 0.06A |
實施例三：抑菌濃度測試
將實施例一所製備之轉糖鏈球菌菌液進行離心（8000 g / 10分鐘 / 4℃），將上清液移除後加入MHB培養基進行回溶，每組取回溶後之菌液500 μL加入至4.5 mL之MHB培養基中，並加入濃度分別為50 mg/mL與100 mg/mL之L1-3乳酸菌菌液上清液，作用1小時後取出1 mL混合液進行序列稀釋及3重複之塗抹培養，在37℃好氧環境下培養二天，計算菌數。其中，正控制組不加入L1-3乳酸菌菌液上清液，而為了與一般含氟牙膏及常用於防止齲齒之木糖醇產品比較，負控制組以0.05%之NaF與10%木糖醇（Xylitol）取代L1-3乳酸菌菌液上清液。
由圖3可以看出，作用1小時後，正控制組的菌數達到3.5x10
7CFU/mL，負控制組為1.6x10
7CFU/mL、1.3x10
7CFU/mL而和正控制組並無顯著差異，相對於此，添加100 mg/mL L1-3乳酸菌菌液上清液之菌數下降至 3.1x10
4CFU/mL，明顯下降了3 LOG 值，顯見L1-3乳酸菌菌液上清液對轉糖鏈球菌的生長有良好的抑制效果（A-C之不同字母表示不同樣品之間存在之顯著差異）。
實施例四：抑制生物膜能力測試
於12孔盤內，在2 mL之BHI液態培養基中加入3%蔗糖，並接種實施例一所培養之轉糖鏈球菌菌液200 μL，再分別加入濃度為50 mg/mL、100mg/mL、300 mg/mL之L1-3乳酸菌菌液上清液，放置於37℃好氧環境下培養48小時。將上清液移除後，以無菌水潤洗二次後待自然風乾，之後加入0.1% 500 μL之結晶紫水溶液染色15分鐘，再以無菌水洗去多餘之染劑，之後加1 mL之95%酒精進行脫色，經放置二小時後，將上清液移至新的12孔盤內，測定結晶紫水溶液波長595 nm之吸光值（O.D.值，Optical Density）。其中，正控制組為不加入L1-3乳酸菌菌液上清液者，負控制組則分別以0.05% NaF與10% 木糖醇（Xylitol）取代L1-3乳酸菌菌液上清液。
實驗的結果請見圖4(a)與圖4(b)，圖4(a)為實驗結果之照片，其中(A)為染色前，(B)為染色後，圖4(b)則為各組於波長595 nm之O.D.值（Optical Density）比較圖，其中，A-D之不同字母表示不同樣品之間存在顯著差異（p＜0.05）。由圖4(b)可以看出，正控制組之O.D.值為1.76，加入NaF、木糖醇及300 mg/mL L1-3乳酸菌菌液上清液之各組O.D.值分別為0.53、0.28與0.08，顯示生物膜之產量顯著下降，代表轉糖鏈球菌之生長受到了抑制。
實施例五：抑制轉糖鏈球菌產酸能力試驗
將L1-3乳酸菌菌液上清液加入等量之乙酸乙酯與5M NaCl中，以震盪器震盪（200 rpm / 24小時），將萃取液倒入分液漏斗中，靜待分層後，取出上層之有機層，再加入二倍體積之乙醚，混合均勻後離心（8000 g / 10分鐘 / 4℃），取出上清液，再加入二倍體積之乙醚，震盪後離心（8000 g / 10分鐘 / 4℃），取出上清液，即為粗萃取液。由於粗萃取液仍含有些許水分，故將粗萃取液倒入瓶底平鋪無水硫酸納之錐形瓶中，靜置15分鐘後以濾紙進行過濾，將濾液進行減壓濃縮以去除溶劑，即可得到萃取物。之後取實施例一之轉糖鏈球菌菌液10mL進行離心（8000 g / 10分鐘 / 4℃），將上清液移除，再加入10 mL之MHB培養基（pH 7.3 ± 0.2）進行回溶，取其200 μL至8 mL之BHI液態培養基中，再加入3%之蔗糖與5 mg/mL之萃取物，於37℃下培養24小時，於第0、24小時測定pH值。其中，正控制組為不加入萃取物，副控制組則分別以0.05% NaF與10%木糖醇取代萃取物。
實驗結果請見圖5，可以看出正控制組經24小時培養後，pH值自7.41降至5.49，加入萃取物者之pH值則自5.95變為5.99，並無下降之趨勢，顯示萃取物能抑制轉糖鏈球菌之生長與生物膜的形成，使產酸量減少，抑制pH值之下降。
由上述各實施例可了解，本發明所使用之雞乳桿菌（
Lactobacillus gallinarum，寄存編號BCRC 911067）對於造成齲齒等口腔疾病的轉糖鏈球菌之生長具有良好的抑制效果，其效果甚至優於含氟牙膏或木糖醇產品，製成各式組合物供人體內服或外用時，具有抑制齲齒等口腔疾病發生之良好效果。
綜上所述，本發明提供之乳酸菌用於製備抑制口腔病原菌之組成物之用途能有效抑制口腔疾病的發生或進展，實為醫藥界與一般民眾所企盼，惟以上實施例僅在於說明並闡述本發明的技術內容，本專利的專利範圍應以後述的申請專利範圍為準。
無
圖1係本發明之實施例一之轉糖鏈球菌添加不同乳酸菌菌液上清液後之生長曲線變化圖。
圖2係本發明之實施例二之轉糖鏈球菌添加不同濃度雞乳桿菌菌液上清液後之抑菌圈試驗照片。
圖3係本發明之實施例三之轉糖鏈球菌添加不同濃度雞乳桿菌菌液上清液後之菌數與正、負控制組之菌數比較圖。
圖4(a)係本發明之實施例四之轉糖鏈球菌添加不同濃度雞乳桿菌菌液上清液後與正、負控制組之生物膜照片比較圖。
圖4(b)係本發明之實施例四之轉糖鏈球菌添加不同濃度雞乳桿菌菌液上清液後與正、負控制組之生物膜O.D.值比較圖。
圖5係本發明之實施例五之轉糖鏈球菌添加不同濃度雞乳桿菌菌液上清液前後與正、負控制組之pH值比較圖。
國內寄存資訊
財團法人食品工業發展研究所、2021年7月7日、BCRC 911067
Claims (5)
- 一種雞乳桿菌NFU206（ Lactobacillus gallinarumNFU206）菌株，寄存於財團法人食品工業發展研究所，其寄存編號為BCRC 911067。
- 一種乳酸菌用於製備抑制口腔病原菌之組成物之用途，其中該乳酸菌係包含雞乳桿菌（ Lactobacillus gallinarumNFU206），寄存於財團法人食品工業發展研究所，其寄存編號為BCRC 911067。
- 如請求項2所述之乳酸菌用於製備抑制口腔病原菌之組成物之用途，其中該抑制口腔病原菌之組成物係用以抑制轉糖鏈球菌（ Streptococcus mutans）之生長。
- 如請求項2所述之乳酸菌用於製備抑制口腔病原菌之組成物之用途，其中該抑制口腔病原菌之組成物係選自由食品、飲品、保健食品所組成之群組。
- 如請求項2所述之乳酸菌用於製備抑制口腔病原菌之組成物之用途，其中該抑制口腔病原菌之組成物係選自由牙膏、漱口水、口內用藥膏、口含錠所組成之群組。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW110132588A TWI775588B (zh) | 2021-09-02 | 2021-09-02 | 雞乳桿菌nfu206菌株及乳酸菌用於製備抑制口腔病原菌之組成物之用途 |
Applications Claiming Priority (1)
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| TW110132588A TWI775588B (zh) | 2021-09-02 | 2021-09-02 | 雞乳桿菌nfu206菌株及乳酸菌用於製備抑制口腔病原菌之組成物之用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TWI775588B true TWI775588B (zh) | 2022-08-21 |
| TW202311524A TW202311524A (zh) | 2023-03-16 |
Family
ID=83807256
Family Applications (1)
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Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| TW (1) | TWI775588B (zh) |
-
2021
- 2021-09-02 TW TW110132588A patent/TWI775588B/zh active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 網路文獻 林小龍， 五種乳酸桿菌益生菌株對變形鏈球菌生長及生物膜形成影響的研究， 浙江大學碩士論文 ，2014/05/01 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW202311524A (zh) | 2023-03-16 |
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Legal Events
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