TWI775115B

TWI775115B - 基因重組微生物及二胺化合物的製造方法

Info

Publication number: TWI775115B
Application number: TW109124773A
Authority: TW
Inventors: 山田祐太朗; 米田久成
Original assignee: 日商旭化成股份有限公司
Priority date: 2019-07-22
Filing date: 2020-07-22
Publication date: 2022-08-21
Also published as: EP4006162A4; CN114555779A; KR20220032084A; US20220396800A1; EP4006162A1; JPWO2021015242A1; JP7440519B2; WO2021015242A1; TW202115242A

Abstract

本發明之課題，為提供生產二胺化合物之微生物，及二胺化合物之製造方法。

本發明之解決手段，為一種基因重組微生物，其為表現參與二胺化合物合成之酵素的微生物，其中該二胺化合物係以式：H₂N-R-NH₂(式中，R為由選自包含C、H、O、N、S之群組中之1個以上原子構成的鏈狀或環狀有機基)表示；該微生物以使醇脫氫酶之活性與非降低株比較為降低的方式進行改變。

Description

基因重組微生物及二胺化合物的製造方法

本發明係關於生產二胺化合物的基因重組微生物及二胺化合物之製造方法。

二胺化合物被廣泛地利用作為以聚醯胺樹脂為主之高分子的原料等。就工業上所利用的二胺化合物而言，代表性化合物可列舉六亞甲基二胺(1,6-二胺基己烷)、七亞甲基二胺(1,7-二胺基庚烷)、八亞甲基二胺(1,8-二胺基辛烷)、十亞甲基二胺(1,10-二胺基癸烷)、十二亞甲基二胺(1,12-二胺基十二烷)等。

例如，六亞甲基二胺可藉由丁二烯之氫氰化(hydrocyanation)、丙烯腈之電解二聚化，或藉由己二酸之腈化，得到己二腈，然後以鎳等作為觸媒，加氫而合成(非專利文獻1)。依照本方法，六亞甲基二胺可工業上生產，然而一旦進行己二腈之合成後，即進行加氫反應。又，已知癸二胺、辛二胺、十二碳二胺等，可藉由與上述己二酸原料同樣之方式得到對應之二腈，再藉由加氫而合成的方法。(專利文獻1、2)

近年，在化學產品製造程序中，期望將從有枯竭之虞，且為地球暖化原因之一之石化燃料而來的原料，轉換為源自生物質(biomass)等之可再生原料。在本課題方面，關於1,3-二胺基丙烷(非專利文獻2)、1,4-二胺基丁烷、1,5-二胺基戊烷(非專利文獻3)、4-胺基苯基乙基胺(非專利文獻4)等二胺化合物，已公開使用藉由基因重組而改變代謝之微生物的製造方法。

其中，報導使用基因重組微生物，從細胞內之二羧酸或胺基羧酸、二醛等，將外來酵素，例如將羧酸脫碳酸酵素與胺基轉移酶組合，生產二胺的方法，成為基質之化合物的適用性廣，例如六亞甲基二胺(專利文獻3、4)、七亞甲基二胺(專利文獻5)。

專利文獻3中、例示在以具有六亞甲基二胺生產途徑之方式改變的微生物宿主中，根據電腦中的代謝模擬，預測、例示藉由刪除或破壞而預測收率提高之酵素基因。然而，關於源自六亞甲基二胺生產途徑中之中間體的副產物或其抑制方法，均無任何述及。

專利文獻4記載藉著經由6-羥基己酸之酵素反應途徑之六亞甲基二胺的生產方法。然而，關於藉由基因重組而新構築之六亞甲基二胺生產途徑中，從中間體而來的副產物之生成及其抑制方法，均未述及。

專利文獻5記載利用經由庚二酸等之酵素反應途徑之七亞甲基二胺的生產方法。然而，關於從反應途徑中之中間體而來的副產物之生成，及其抑制方法，均未述及。

因此，先前技術中，有關起因於成為二胺化合物之變換途徑的副產物之生成及其抑制方法，均無任何揭示。故而尋求在藉由基因重組微生物之二胺化合物生產中，更有效地抑制副產物且能有效率地生產二胺化合物的技術。

[先前技術文獻]

[專利文獻]

[專利文獻1]日本特開昭57-70842號公報

[專利文獻2]日本特公昭49-24446號公報

[專利文獻3]日本特開2015-146810號公報

[專利文獻4]日本特開2017-544854號公報

[專利文獻5]日本特表2014-525741號公報

[非專利文獻]

[非專利文獻1] Process Economics Program Report 31B (IHSmarket)

[非專利文獻2] Chae, T. et al.，「生產1,3-二胺基丙烷(一種三碳二胺)用之大腸桿菌的代謝改造」(Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of 1,3-diaminopropane, a three carbon diamine)., Sci Rep. 2015 Aug 11; 5: 13040

[非專利文獻3] Tsuge, Y. et al.，「製造合成生物聚合物用之建構組元化學品的改造細胞工廠」(Engineering cell factories for producing building block chemicals for bio-polymer synthesis)., Microb. Cell Fact., Vol., 15, 19 (2016)

[非專利文獻4] Masuo, S., et al，「生產人造芳香胺之細菌發酵平台」(Bacterial fermentation platform for producing artificial aromatic amines)., Scientific Reports volume 6, Article number：25764(2016)

本發明之課題，係提供生產二胺化合物的微生物，及二胺化合物之製造方法。

在本發明人等進行檢討中，發現於具有二胺化合物生產途徑之微生物中，藉由內因性之醇脫氫酶活性，副產出源自二胺生合成途徑中間體的醇體。本發明人等進行專心檢討的結果，發現藉由進行改變，降低宿主微生物之醇脫氫酶活性，可抑制為副生成物之醇體的生成，及/或使二胺化合物之生成量提升，於是達成本發明。

亦即，本發明提供以下事項。

[1]一種基因重組微生物，其為表現參與二胺化合物合成之酵素的微生物，

其中該二胺化合物係以式：H₂N-R-NH₂

(式中，R為由選自包含C、H、O、N、S之群組中之1個以上原子構成的鏈狀或環狀有機基)表示，

該微生物係以醇脫氫酶之活性與非降低株比較為降低的方式進行改變；

[2]如[1]記載之基因重組微生物，其中醇脫氫酶之活性與非降低株比較為降低的改變為：

編碼醇脫氫酶之基因之表現受到抑制的改變，或

編碼醇脫氫酶之基因之表現受到抑制，且醇脫氫酶之活性受到抑制的改變；

[3]如[1]或[2]記載之重組微生物，其中前述醇脫氫酶係由下述DNA編碼的蛋白質：

‧由選自序列編號2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98及100之鹼基序列構成的DNA，

‧由與選自序列編號2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98及100之鹼基序列具有85%以上之序列相同性的鹼基序列構成，且編碼具有醇脫氫酶活性之蛋白質的DNA，

‧為編碼相對於由選自序列編號2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98及100之鹼基序列編碼的蛋白質之胺基酸序列，1至10個胺基酸經刪除、置換、插入及/或附加之胺基酸序列所構成之蛋白質的鹼基序列，且編碼具有醇脫氫酶酵素活性之蛋白質的DNA，或

‧由選自序列編號2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98及100之鹼基序列之縮聚異構物構成的DNA；

[4]如[1]至[3]中任一項記載之重組微生物，其中該醇脫氫酶為具有與選自序列編號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97及99之胺基酸序列具有80%以上之序列相同性的胺基酸序列，且具有醇脫氫酶活性的蛋白質；

[5]如[1]至[4]中任一項記載之基因重組微生物，其中該醇脫氫酶為由選自yqhD、fucO、adhP、ybbO、eutG、ahr、yahK、adhE、ybdR、dkgA、yiaY、frmA、dkgB、yghA、ydjG、gldA、yohF、yeaE、ADH1、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7、SFA1、AAD3、AAD4、AAD10、AAD14、AAD15、YPR1、NCgl0324、NCgl0313、NCgl0219、NCgl2709、NCgl1112、NCgl2382、NCgl0186、NCgl0099、NCgl2952、NCgl1459、yogA、bdhK、bdhJ、akrN、yqkF、yccK、iolS及yrpG所構成之群組中之至少一個基因編碼的蛋白質；

[6]如[1]至[5]中任一項記載之基因重組微生物，其中該醇脫氫酶為由選自yqhD、fucO、adhP、eutG、ybbO、ahr、yahK所構成之群組中之至少一個基因編碼的蛋白質；

[7]如[1]至[6]中任一項記載之基因重組微生物，其中該醇脫氫酶為由選自yqhD及adhP所構成之群組中之至少一個基因編碼的蛋白質；

[8]如[7]記載之基因重組微生物，其中該醇脫氫酶為由adhP基因編碼的蛋白質；

[9]如[1]至[6]中任一項記載之基因重組微生物，其中該醇脫氫酶為由選自yqhD、fucO、eutG、ybbO、ahr、及yahK所構成之群組中之至少一個基因編碼的蛋白質；

[10]如[9]記載之基因重組微生物，其中該醇脫氫酶為由選自eutG、ybbO、ahr、及yahK所構成之群組中之至少一個基因編碼的蛋白質；

[11]如[1]至[6]中任一項記載之基因重組微生物，其中該醇脫氫酶為由選自yqhD、fucO、adhP、eutG、ybbO、ahr及yahK所構成之群組中之2個以上之基因編碼的蛋白質；

[12]如[1]至[6]中任一項記載之基因重組微生物，其中該醇脫氫酶為由選自yqhD及fucO，

yqhD及adhP，

yqhD及eutG，

yqhD及ybbO，

yqhD及ahr，

yqhD及yahK，

yqhD、fucO及adhP，

yqhD、fucO、adhP及eutG，

yqhD、fucO、adhP、eutG及ybbO，

yqhD、fucO、adhP、eutG、ybbO及ahr，以及，

yqhD、fucO、adhP、eutG、ybbO、ahr及yahK

所構成之群組中之1種組合之相關基因編碼的蛋白質；

[13]如[1]至[12]中任一項記載之重組微生物，其中該醇脫氫酶之活性與非降低株比較變得降低的改變，為藉由選自下列所構成之群組中的1種以上而進行：

使該微生物內之編碼該醇脫氫酶之基因的轉錄量及/或轉譯量降低，以及

破壞該微生物內之編碼該醇脫氫酶之基因；

[14]如[1]至[13]中任一項記載之基因重組微生物，其中該基因重組微生物屬於埃希氏菌(Escherichia)屬、棒狀桿菌(Corynebacterium)屬、芽孢桿菌(Bacillus)屬、不動桿菌(Acinetobacter)屬、伯克氏菌(Burkholderia)屬、假單胞菌(Pseudomonas)屬、梭菌(Clostridium)屬、酵母菌(Saccaromyces)屬、裂殖酵母菌(Schizosaccaromyces)屬、耶氏酵母菌(Yarrowia)屬、念珠菌(Candida)屬、畢赤酵母菌(Pichia)屬及麴菌(Aspergillus)屬所構成之群組中的屬；

[15]如[1]至[14]中任一項記載之基因重組微生物，其中該基因重組微生物為大腸桿菌(Escherichia coli)；

[16]如[1]至[15]中任一項記載之基因重組微生物，其表現作為參與前述二胺化合物合成之酵素的胺基轉移酵素；

[17]如[1]至[16]中任一項記載之基因重組微生物，其表現作為參與前述二胺化合物合成之酵素的羧酸還原酵素；

[18]如[17]記載之基因重組微生物，其中該羧酸還原酵素具有將羧酸半醛、二羧酸、或胺基羧酸之羧基變換為醛的活性；

[19]如[1]至[18]中任一項記載之基因重組微生物，其具有產生二羧酸、羧酸半醛、或胺基羧酸之能力，

且進一步表現胺基轉移酵素、及羧酸還原酵素；

[20]如[1]至[19]中任一項記載之基因重組微生物，其具有產生己二酸、己二酸半醛、或6-胺基己酸之能力，

且進一步表現胺基轉移酵素、及羧酸還原酵素；

[21]如[11]至[20]中任一項記載之基因重組微生物，其進一步進行使磷酸泛醯巰基乙胺基(phosphopantetheinyl)轉移酵素之活性增加的改變；

[22]如[16]至[21]中任一項記載之基因重組微生物，其中編碼前述胺基轉移酵素的基因為ygjG；

[23]如[17]至[22]中任一項記載之基因重組微生物，其中編碼前述羧酸還原酵素的基因為MaCar；

[24]如[21]至[23]中任一項記載之基因重組微生物，其中編碼前述磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酵素的基因為Npt；

[25]如[1]至[24]中任一項記載之重組微生物，其包含與序列編號115所示之鹼基序列具有85%以上之序列相同性，且編碼具有胺基轉移酵素活性之蛋白質的鹼基序列，或者

包含與編碼序列編號110至114中任一者所示之胺基酸序列的鹼基序列具有85%以上之序列相同性，且編碼具有胺基轉移酵素活性之蛋白質的鹼基序列；

[26]如[1]至[25]中任一項記載之重組微生物，其包含與序列編號105所示之鹼基序列具有85%以上之序列相同性，且編碼具有羧酸還原酵素活性之蛋白質的鹼基序列，或者

包含與編碼序列編號101至104中任一者所示之胺基酸序列的鹼基序列具有85%以上之序列相同性，且編碼具有羧酸還原酵素活性之蛋白質的鹼基序列；

[27]如[21]至[26]中任一項記載之重組微生物，其包含與序列編號109所示之鹼基序列具有85%以上之序列相同性，且編碼具有磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酵素活性之蛋白質的鹼基序列，或者

包含與編碼序列編號106至108中任一者所示之胺基酸序列的鹼基序列具有80%以上之序列相同性，且編碼具有磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酵素活性之蛋白質的鹼基序列；

[28]如[1]至[27]中任一項記載之基因重組微生物，其表現選自下列酵素構成之群組中的1種以上之酵素：

醯基-(醯基輸送蛋白質(ACP))還原酵素(AAR)、

從醯基CoA生產醛之酵素、

從醯基磷酸生成醛之酵素；

[29]一種二胺化合物之製造方法，其使用如[1]至[28]中任一項記載之基因重組微生物；

[30]一種二胺化合物之製造方法，其包含將如[1]至[28]記載之基因重組微生物在含有碳源及氮源之培養基中培養，得到包含菌體之培養液的培養步驟；

[31]如[30]記載之二胺化合物之製造方法，其中前述培養基進一步包含二胺化合物之前驅體，或

在前述培養步驟中，包含於前述培養基中添加前述前驅體；

[32]如[30]或[31]記載之二胺化合物之製造方法，其包含使前述培養液及/或前述菌體，與含有二胺化合物之前驅體的水溶液接觸，得到包含二胺化合物之反應液的反應步驟；

[33]如[31]或[32]記載之二胺化合物之製造方法，其中前述前驅體係選自二羧酸、羧酸半醛、胺基羧酸、胺基醛、二醛、醯基-ACP、醯基-CoA及醯基磷酸構成之群組。

依照本發明，可生產二胺化合物。

圖1係就本發明之基因重組微生物中的二胺化合物之生產途徑例而言，以模式表示從各種前驅體成為胺的官能基變換。

圖2表示將破壞ADH基因之大腸菌株，於含有1,6-己二醇之培養基中培養48小時後的培養上清液中之1,6-己二醇濃度。

圖3為pDA56之質體圖譜。圖中，分別以「lacI」表示lacI基因，「T7 Promoter」表示T7啟動子，「T7 Terminator」表示T7終止子，「ygjG」表示源自大腸桿菌(Escherichia coli)之ygjG基因，「MaCar」表示源自膿腫分枝桿菌(Mycobacterium abcessus)之羧酸還原酵素基因，「Npt」表示源自艾阿華諾卡氏菌(Nocardia iowensis)之磷酸泛醯巰基乙胺轉移酵素基因，「CAT」表示氯黴素(chloramphenicol)乙醯基轉移酶基因，「P15Aori」表示複製起點。

以下，關於本發明之實施型態詳細地說明。

根據本發明之基因重組微生物，為具有二胺化合物生產途徑，進一步以醇脫氫酶活性為降低之方式進行改變的基因重組微生物。其中，改變方面包含鹼基之置換、刪除、插入及/或附加。以下，亦將「基因重組微生物」簡單稱為「重組微生物」。

上述重組微生物，表現參與二胺化合物合成之酵素或參與二胺化合物合成之酵素群。就參與二胺化合物合成之酵素而言，例如，可列舉羧酸還原酵素及胺基轉移酵素。羧酸還原酵素如圖1所示，例如，具有將羧酸半醛、二羧酸、或胺基羧酸之羧基變換為醛的活性。胺基轉移酵素如圖1所示，具有將醛變換為胺的活性。在本發明中，關於微生物，「表現參與二胺化合物合成之酵素或參與二胺化合物合成之酵素群」，意指宿主微生物本身可具有表現相關酵素或酵素群的能力，或者，亦可對宿主微生物，以表現相關之酵素或酵素群的方式進行改變。

本發明中的「二胺化合物」(以下，亦簡單稱為「二胺」)係以式：H₂N-R-NH₂表示。式中，R為由選自C、H、O、N、S構成之群組的1個以上之原子構成的鏈狀或環狀之2價有機基。鏈狀之有機基方面，包含直鏈之有機基及分枝之有機基。環狀之有機基方面，包含脂環式之有機基、雜環式之有機基、多環式之有機基、及芳香族之有機基。

就構成R之有機基而言，例如，可列舉亞甲基、伸乙基、伸乙烯基、三亞甲基、伸丙基、伸丙烯基、四亞甲基、伸異丁基、五亞甲基、六亞甲基、八亞甲基等脂肪族烴基；伸環丁基、伸環戊基、伸環己基、伸環庚基、伸環辛基、亞環己烯基、環己二烯基等脂環式烴基；鄰伸苯基、間伸苯基、對伸苯基、二伸苯基、伸萘基、1,2-伸苯基二亞甲基、1,3-伸苯基二亞甲基、1,4-伸苯基二亞甲基、1,4-伸苯基二伸乙基、亞甲基二伸苯基、伸乙基二伸苯基等芳香族烴基；氧基、羰基等含氧特性基；亞甲基二氧基、伸乙基二氧基等醚基；草醯基、丙二醯基、琥珀醯基、戊二醯基、己二醯基、辛二醯基、鄰酞醯基、間酞醯基、對酞醯基等醯基；硫基、硫羰基等含硫特性基；亞胺基、偶氮基等含氮特性基；藉由將彼等進一步組合而形成者，然而不以此等為限。

又，R中亦可包含1個以上之取代基。就R中可含之取代基而言，例如，可列舉胺基、羧基、氰基、硝基、羥基、巰基等，然而不以此等為限。

在一型態中，R為鏈狀及環狀烴，在鏈狀烴方面，包含直鏈及分枝的飽和及不飽和烴。在較佳之一型態中，R為碳數3至20之烴基。更佳而言，R為以式：CH₂(CH₂)_nCH₂表示的直鏈飽和烴基，式中，n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。進一步更佳而言，n為2、3、4、5、6、7或8，特佳而言，n為4、5、6、7或8。

就典型之二胺化合物而言，可列舉1,3-二胺基丙烷(三亞甲基二胺)、1,4-二胺基丁烷(四亞甲基二胺、腐胺(putrescine))、1,5-二胺基戊烷(五亞甲基二胺、屍胺(cadaverine))、1,6-二胺基己烷(六亞甲基二胺)、1,7-二胺基庚烷(七亞甲基二胺)、1,8-二胺基辛烷(八亞甲基二胺)、1,9-二胺基壬烷(九亞甲基二胺)、1,10-二胺基癸烷(十亞甲基二胺)、1,11-二胺基十一烷(十一亞甲基二胺)、1,12-二胺基十二烷(十二亞甲基二胺)、3-胺基苄基胺、4-胺基苄基胺、2-甲基五亞甲基二胺、2-甲基五亞甲基二胺、2,2,4-三甲基六亞甲基二胺、2,4,4-三甲基六亞甲基二胺、1,3-雙(胺基甲基)環己烷、1,4-雙(胺基甲基)環己烷、間二甲苯二胺、對二甲苯二胺、1-胺基-3-胺基甲基-3,5,5-三甲基環己烷、雙(4-胺基環己基)甲烷、雙(4-胺基-3-甲基環己基)甲烷、1,4-雙(胺基丙基)哌

、1,3-二胺基環己烷、1,4-二胺基環己烷、1,3-伸苯基二胺、1,4-伸苯基二胺、N-(3-胺基丙基)1,4-丁二胺(精三胺(spermidine))、3,3’-二胺基二丙基胺、N,N-雙(3-胺基丙基)甲基胺、N,N’-雙(3-胺基丙基)伸乙基二胺、N,N’-雙(2-胺基乙基)-1,3-丙二胺、N,N’-雙(3-胺基丙基)-1,4-丁二胺(精四胺(spermine))、2,2’-二硫雙(乙基胺)、二伸丙基三胺等，然而不以此等為限。二胺可採取包含任何鹽型態之中性或電離型之型態，本型態係依賴於pH，本技術領域人士應能理解。

本說明書中的「二羧酸」意指具有化學式HOOC-R-COOH(式中，R如先前說明)所示之構造的化合物。二羧酸方面，包含脂肪族二羧酸及芳香族羧酸。就典型之二羧酸而言，可列舉草酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、衣康酸、戊二酸、己二酸、黏康酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、十二碳二酸、蘋果酸、2,5-呋喃二羧酸、酞酸、間苯二甲酸、對苯二甲酸、馬來酸、酒石酸、黏康酸等，然而不以此等為限。二羧酸可採取包含任何鹽型態之中性或電離型之型態，本型態係依賴於pH，本技術領域人士應能理解。

本說明書中的「羧酸半醛」，意指具有化學式HOOC-R-CHO(式中，R如先前說明)所示之構造的化合物。就典型之羧酸半醛而言，可列舉琥珀酸半醛、戊二酸半醛、己二酸半醛、庚二酸半醛、辛二酸半醛、壬二酸半醛、癸二酸半醛等，然而不以此等為限。羧酸半醛可採取包含任何鹽型態之中性或電離型之型態，本型態係依賴於pH，本技術領域人士應能理解。

本說明書中的「胺基羧酸」，意指具有化學式H₂N-R-COOH(式中，R如先前說明)所示之構造的化合物。就典型之胺基羧酸而言，可列舉甘胺酸、β-丙胺酸、4-胺基丁酸、5-胺基戊酸、6-胺基己酸、7-胺基庚酸、8-胺基辛酸、9-胺基壬酸、10-胺基癸酸、12-胺基十二酸等，然而不以此等為限。胺基羧酸可採取包含任何鹽型態之中性或電離型之型態，本型態係依賴於pH，本技術領域人士應能理解。

本說明書中，「內因」或「內因性」之術語，係意指未藉基因重組而改變的宿主微生物，不論是否於該宿主細胞內，可將所述之基因或藉由其編碼之蛋白質(典型而言為酵素)以可進行優位生化學反應的程度功能性地表現，皆為宿主微生物所具有者。

本說明書中，「外來」或「外來性」之術語，係意指在基因重組前之宿主微生物不具有可藉由本發明導入之基因的情況、實質上未表現藉由該基因所編碼之酵素的情況、及雖藉由相異基因編碼該酵素之胺基酸序列，但基因重組後未表現等同於內因性酵素活性的情況，依照本發明，將基因或核酸序列導入宿主。「外來性」及「外因性」之術語，在本說明書中可交換使用。

圖1展示本發明中的二胺化合物之合成途徑的官能基變換之例。以可衍生為醛之化合物及/或醛作為前驅體，合成二胺。醛係藉由胺基轉移酵素變換為胺。本發明之基因重組微生物，以使醇脫氫酶之活性為降低的方式改變，抑制途徑中之中間體，即醛，變換為醇。其中，醇脫氫酶包含1種或複數種之具有醇脫氫酶活性的蛋白質。

本發明中所用的宿主微生物無特別限定，可為原核生物、真核生物之任一者。可任意選擇已經被單離保存者，亦可選擇新近從天然界分離者、基因已改變者，經改變可代謝上述化合物之微生物等任一種。例如，可列舉大腸菌(大腸桿菌(Escherichia coli))等埃希氏菌屬、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)等假單胞菌屬、枯草桿菌(Bacillus subtilis)等芽孢桿菌屬、麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)等棒狀桿菌屬、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)等梭菌屬、不動桿菌屬、伯克氏菌屬之細菌；或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等酵母菌屬、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等裂殖酵母菌屬、巴斯德畢赤酵母 (Pichia pastoris)等畢赤酵母菌屬、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)等耶氏酵母菌屬之酵母、米麴菌(Aspergillus oryzae)等麴菌屬之絲狀菌等，然而不以此等為限。在本發明中，以使用大腸菌作為宿主微生物為較佳。

本發明中的基因重組微生物，與非降低株比較，進一步以使內因性之醇脫氫酶(Alcohol Dehydrogenase；ADH)活性為降低的方式進行改變。本發明人等，在具有二胺化合物生產途徑的宿主微生物中，發現藉由內因性之醇脫氫酶活性，副產出源自二胺生合成途徑中間體的醇體，然而進一步專心檢討之結果，發現藉由使醇脫氫酶之活性與非降低株比較，變得降低的方式，對宿主微生物進行改變，可抑制為副生成物的醇體之生成，及/或使二胺化合物之生成量提高，而可有效率地生產二胺化合物。

醇脫氫酶為於電子供體存在下，具有將醛、酮還原，變換成醇之活性的酵素。其中，醇脫氫酶，為包含在該酵素之胺基酸序列中1個或複數個胺基酸經刪除、置換、插入及/或附加之胺基酸序列的蛋白質，亦包含與該酵素功能上同等之蛋白質。其中「功能上同等之蛋白質」，意指具備與該酵素之活性同樣之活性的蛋白質。例如，「功能上同等之蛋白質」中，包含與該酵素之胺基酸序列具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%以上之序列相同性的蛋白質。具體而言，「醇脫氫酶」之術語，包含與下述特定之序列編號所示的胺基酸序列具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%以上之序列相同性的胺基酸序列，且具有醇脫氫酶酵素活性之蛋白質。

編碼醇脫氫酶之基因，包含：

‧下述特定之序列編號所示之鹼基序列構成的DNA，

‧與具有和下述特定之序列編號所示的鹼基序列互補之鹼基序列的DNA於嚴苛條件下雜交，且編碼具有醇脫氫酶酵素活性之蛋白質的DNA，

‧由與下述特定之序列編號所示的鹼基序列具有85%、90%、95%、97%、98%或99%以上之序列相同性的鹼基序列構成，且編碼具有醇脫氫酶酵素活性之蛋白質的DNA，

‧為編碼由下述特定之序列編號所示的鹼基序列編碼之蛋白質的胺基酸序列中1個或複數個(例如1至10個，較佳為1至7個，更佳為1至5個，進一步更佳為1至3個，再進一步更佳為1個或2個)之胺基酸經刪除、置換、插入及/或附加之胺基酸序列構成之蛋白質的鹼基序列，且編碼具有醇脫氫酶酵素活性之蛋白質的DNA，及

‧由下述特定之序列編號所示之鹼基序列之縮聚異構物構成的DNA。

「嚴苛條件」意指例如，為「1xSSC、0.1%SDS、60℃」程度之條件，就更嚴苛之條件而言，為「0.1xSSC、0.1%SDS、60℃」程度之條件，就進一步更嚴苛之條件而言，為「0.1xSSC、0.1%SDS、68℃」程度之條件。

在本發明之一較佳型態中，醇脫氫酶方面，包含以EC1.1.1.m(其中，m為1以上之整數)表記之酵素。就醇脫氫酶而言，例如，可列舉分類為EC1.1.1.1、EC1.1.1.2、EC1.1.1.71之酵素，然而不以此等為限。

就醇脫氫酶而言，例如若為大腸菌，可列舉由yqhD、fucO、adhP、ybbO、eutG、ahr、yahK、adhE、ybdR、dkgA、yiaY、frmA、dkgB、yghA、ydjG、gldA、yohF、及yeaE基因編碼的蛋白質。

若為出芽酵母(釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))，可列舉由ADH1、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7、SFA1、AAD3、AAD4、AAD10、AAD14、AAD15、及YPR1基因編碼的蛋白質，若為麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)，可列舉由NCgl0324、NCgl0313、NCgl0219、NCgl2709、NCgl1112、NCgl2382、NCgl0186、NCgl0099、NCgl2952、及NCgl1459基因編碼的蛋白質，若為枯草桿菌(Bachillus subtilis)，可列舉由yogA、bdhK、bdhJ、akrN、yqkF、yccK、iolS、及yrpG基因編碼的蛋白質，然而只要具有醇脫氫酶活性，不以此等為限定。

醇脫氫酶為例如，藉由選自yqhD、fucO、adhP、eutG、ybbO、ahr、及yahK構成之群組中之至少一個基因編碼的蛋白質。關於選自上述基因構成之群組中的至少一個基因，藉由以使醇脫氫酶之活性與非降低株比較，變得降低的方式進行改變，可抑制為副生成物之醇體的生成，及/或使二胺化合物之生成量提高，而有效率地生產二胺化合物。

醇脫氫酶較佳為由選自yqhD、fucO、adhP、ybbO、eutG、ahr、及yahK基因構成之群組中的至少一個基因編碼，更佳為由選自yqhD、ahr、及yahK基因構成之群組中的至少一個基因編碼，進一步更佳為由選自ahr、及yahK基因構成之群組中的至少一個基因編碼。

醇脫氫酶較佳由選自yqhD及adhP構成之群組中的至少一個基因編碼，更佳由adhP基因編碼。對於此等基因之至少一個，以使活性降低之方式進行改變，基因重組微生物，在二胺化合物之製造中，可使二胺化合物之生成量增加。

醇脫氫酶較佳為由選自yqhD、fucO、eutG、ybbO、ahr、及yahK構成之群組中的至少一個基因編碼，更佳為由選自eutG、ybbO、ahr、及yahK構成之群組中的至少一個基因編碼。對於此等基因之至少一個，以使活性降低的方式進行改變，基因重組微生物可在二胺化合物之製造中，抑制為副生成物之醇體的生成。

前述醇脫氫酶較佳為由選自yqhD、fucO、adhP、eutG、ybbO、ahr及yahK構成之群組中的2種以上之基因編碼，更佳而言，為由yqhD基因與選自fucO、adhP、eutG、ybbO、ahr及yahK構成之群組中的1種以上之基因編碼。藉由使此等基因之2種以上活性降低的方式進行改變，基因重組微生物可在二胺化合物之製造中，使二胺化合物之生成量顯著地提高，同時抑制為副生成物之醇體的生成。

醇脫氫酶較佳為由選自

‧yqhD及fucO、

‧yqhD及adhP、

‧yqhD及eutG、

‧yqhD及ybbO、

‧yqhD及ahr、

‧yqhD及yahK、

‧yqhD、fucO及adhP、

‧yqhD、fucO、adhP及eutG、

‧yqhD、fucO、adhP、eutG及ybbO、

‧yqhD、fucO、adhP、eutG、ybbO及ahr、以及、

‧yqhD、fucO、adhP、eutG、ybbO、ahr及yahK

構成之群組中之1種組合基因編碼。以此種方式，藉由使2種以上之基因之活性降低的方式進行改變，基因重組微生物在二胺化合物之製造中，可使二胺化合物之生成量更顯著地提高，同時顯著地抑制為副生成物之醇體的生成。

將被上述之醇脫氫酶基因編碼的典型蛋白質之胺基酸序列、及編碼區域之鹼基序列示於下述表1-1至1-50。再者，各表之第1行，展示基因及蛋白質名稱、登錄(Accession)編號、來源。

[表1-1]

[表1-2]

[表1-3]

[表1-4]

[表1-5]

[表1-6]

[表1-7]

[表1-8]

[表1-9]

[表1-10]

[表1-11]

[表1-12]

[表1-13]

[表1-14]

[表1-15]

[表1-16]

[表1-17]

[表1-18]

[表1-19]

[表1-20]

[表1-21]

[表1-22]

[表1-23]

[表1-24]

[表1-25]

[表1-26]

[表1-27]

[表1-28]

[表1-29]

[表1-30]

[表1-31]

[表1-32]

[表1-33]

[表1-34]

[表1-35]

[表1-36]

[表1-37]

[表1-38]

[表1-39]

[表1-40]

[表1-41]

[表1-42]

[表1-43]

[表1-44]

[表1-45]

[表1-46]

[表1-47]

[表1-48]

[表1-49]

[表1-50]

在本發明中，可使1種ADH之活性降低，亦可使2種以上之ADH活性降低。從可使醇體之副產更為減低的觀點，以使2種以上之ADH活性降低為較佳。

在本發明中，「ADH非降低株」(或亦簡稱為「非降低株」)意指不施加ADH活性為降低之改變的菌株。就ADH非降低株而言，例如，可列舉各微生物株之野生型株或基準株，包含藉由育種所得到之株的衍生株等，然而不以此等為限。大腸菌株方面，例如，可列舉K-12株、B株、C株、W株或彼等株之衍生株，例如，BL21(DE3)株、W3110株、MG1655株、JM109株、DH5α株、HB101株等，然而不以此等為限。

關於基因重組微生物，「以使醇脫氫酶之活性為降低的方式進行改變」意指至少進行編碼醇脫氫酶之基因之表現受到抑制的改變。「以使醇脫氫酶之活性為降低的方式的改變」，除包含編碼醇脫氫酶之基因之表現受到抑制的改變外，亦包含以該酵素之活性受到抑制之方式的改變。亦即，本發明之重組微生物，相較於非降低株(例如宿主微生物)，編碼醇脫氫酶之基因的表現受到抑制，或者以該酵素之活性受到抑制的方式進行改變。更詳細而言，「以使醇脫氫酶之活性為降低的方式進行改變」意指至少進行編碼醇脫氫酶之基因之表現受到抑制的改變，較佳為進行編碼醇脫氫酶之基因之表現受到抑制，且醇脫氫酶之活性受到抑制的改變。宿主微生物由於具有複數個編碼醇脫氫酶之基因，對相同基質顯示活性之醇脫氫酶以複數種存在，即使為「以醇脫氫酶之活性為降低的方式進行改變」之情況，與非降低株比較，在醇類之分解活性方面仍維持醇脫氫酶之活性；所謂「以使醇脫氫酶之活性為降低之方式進行改變」，儘管如此進行以活性之降低為目的之改變，仍包含與非降低株比較，維持醇脫氫酶之活性的情況。在本發明中，關於編碼酵素之基因，「表現之抑制」包含「表現之降低」。又，關於酵素，「活性之抑制」係與「功能之抑制」、「功能之降低」及「活性之降低」同義，可互換使用。

本發明之基因重組微生物，以進行2個以上編碼醇脫氫酶之基因之表現受到抑制的改變為較佳。藉由抑制複數種基因之表現，基因重組微生物在二胺化合物之製造中，可使二胺化合物之生成量顯著地提升，同時可抑制為副生成物之醇體的生成。

ADH之活性降低的改變，例如，可藉由使編碼ADH之基因的表現降低而達成。基因之表現降低，更具體而言，可意指基因之轉錄量(mRNA量)降低，及/或基因之轉譯量(蛋白質量)降低。基因之表現降低，亦包含基因完全不表現的情況。

基因之表現的降低，例如，可為轉錄量之降低，亦可為轉譯量之降低，亦可為彼等之組合。轉錄量之降低，例如，可藉由改變ADH基因之啟動子區域或核糖體結合部位(RBS)等表現調節區域的方法而達成。基因之轉錄量的降低，於本技術領域人士，可藉由周知之方法評價，例如，可列舉定量RT-PCR法、北方墨點轉漬法。基因之轉錄量，例如與ADH非降低株比較，可降低至50%以下、20%以下、10%以下、5%以下、或0%。

轉譯量之降低，例如，可列舉藉由將核糖開關(riboswitch)區域插入基因上游，抑制轉譯的方法。核糖開關意指與特定之低分子化合物選擇性地結合的RNA，該低分子化合物被稱為配體(ligand)。在配體不存在下，藉由RNA鹼基對形成二次構造，而影響核糖開關周邊之核酸。尤其，在核糖開關之下游包含核糖體結合部位的情況，藉由妨礙核糖體之對核糖體結合部位的接近，進一步妨礙位於下游的基因之mRNA的轉譯。另一方面，在配體存在下，通過伴隨配體結合之二次構造消解，核糖體可向核糖體結合部位接近。因此，在未添加配體時，基因之mRNA無法轉譯，而目的基因之表現受到抑制。基因之轉譯量的降低，於本技術領域人士可藉由周知之方法評價，例如，可列舉西方墨點轉漬法。基因之轉譯量，例如與ADH非降低株相較，可降低至50%以下、20%以下、10%以下、5%以下、或0%。

又，ADH之活性為降低之方式的改變，亦可藉由破壞編碼ADH之基因而達成。ADH基因之破壞，意指使具有ADH活性之蛋白質不表現的基因改變，包含完全不產生蛋白質的情況，或產生ADH活性為降低或消失之蛋白質的情況。例如，可藉由使染色體上之基因之編碼區域的一部分或全部缺損而達成。再者，亦可只包含染色體上基因前後的序列，而將基因全部刪除。只要可達成ADH活性之降低，刪除之區域可為N末端區域、內部區域、C末端區域之任一區域。

又，ADH基因之破壞，亦可藉由在染色體上之ADH基因之編碼區域導入胺基酸置換(誤義突變)的方法，導入終止密碼子(無意義突變)的方法，或者附加或刪除1至2個鹼基的框移突變(frameshift mutation)而達成。

再者，ADH基因之破壞，亦可藉由在染色體上之基因的編碼區域插入其他序列而達成。就其他序列而言，可列舉抗生素耐性基因或轉位子(transposon)，不過只要能使ADH活性降低者，無特別限定。

ADH基因之破壞，可採取利用相同重組的方法，例如可列舉使用λ-噬菌體之Red重組酶(recombinase)的方法(Datsenko,Kirill A.,and Barry L.Wanner.「在大腸桿菌K-12中的染色體基因藉由使用PCR產物之單一步驟失活(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.)」,Proceedings of the National Academy of Sciences 97.12(2000)：6640-6645.)，或使用包含溫度敏感性複製起點之自殺載體的方法(Blomfield et al.,Molecular microbiology 5.6(1991)：1447-1457.)，使用CRISPR-Cas9系統的方法(Jiang,Yu,et al.「經由CRISPR-Cas9系統在大腸桿菌之基因組中進行多基因編輯(Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9 system)」Appl.Environ.Microbiol.81.7(2015)：2506-2514.)等，然而不以此等手法為限。

又，ADH基因之破壞亦可藉由突變處理而進行。就突變處理而言，可列舉例如X射線處理、紫外線處理、γ射線處理等物理性處理；或N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍、甲磺酸乙酯、甲磺酸甲酯等變異劑的化學性處理，不過只要可使ADH活性降低者，無特別限定。

ADH活性可依照本技術領域人士，藉由周知之方法評價。例如，可列舉藉由基質(醛或酮)及NAD(P)H一起培育，測定340nm之吸光度，監測NAD(P)H之氧化的方法(Pick,et al.,Applied microbiology and biotechnology 97.13(2013)：5815-5824.)。ADH活性，例如與ADH非降低株之ADH比較，可降低至50%以下、20%以下、10%以下、5%以下、或0%。

根據本發明之基因重組微生物中，參與二胺化合物合成之酵素，可為內因性，亦可為外因性，亦可為此等之組合。

根據本發明之基因重組微生物，就參與二胺化合物合成之酵素基因而言，以表現羧酸還原酵素為較佳。羧酸還原酵素(Carboxylic Acid Reductase；CAR)，一般而言，意指具有還原羧酸而變換成醛之活性的任何蛋白質。在本發明中，羧酸還原酵素具有例如將羧酸半醛、二羧酸、或胺基羧酸之羧基變換成醛的活性。就羧酸還原酵素而言，例如，可列舉被分類為EC1.2.1.30、EC1.2.1.31、EC1.2.1.95、EC1.2.99.6等之酵素，然而不以此等為限。

就編碼該酵素的基因來源之例而言，只要具有羧酸還原活性，無特別限定，然而就典型之例而言，可列舉艾阿華諾卡氏菌(Nocardia iowensis)、星狀諾卡氏菌(Nocardia asteroids)、巴西諾卡氏菌(Nocardia brasiliensis)、皮疽諾卡氏菌(Nocardia farcinica)、皺褶脂肪酸慢出菌(Segniliparus rugosus)、圓形脂肪酸慢出菌(Segniliparus rotundus)、漸變態束村氏菌(Tsukamurella paurometabola)、海洋分枝桿菌(Mycobacterium marinum)、新分枝桿菌(Mycobacterium neoaurum)、膿腫分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)、鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)、惡臭分枝桿菌(Mycobacterium chelonae)、免疫原分枝桿菌(Mycobacterium immunogenum)、包皮垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)、伏果乾腐菌(Serpula lacrymans)、多年異擔子菌(Heterobasidion annosum)、灰蓋鬼傘菇(Coprinopsis cinereal)、黃麴菌(Aspergillus flavus)、土麴菌(Aspergillus terreus)、紅麵包黴菌(Neurospora crassa)、釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)，然而不以此等為限。在本發明中，例如，可使用編碼序列編號101至104之任一者所記載的胺基酸序列構成之蛋白質的基因。較佳可使用編碼源自膿腫分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)之羧酸還原酵素MaCar的基因。將MaCar基因之編碼區域之鹼基序列示於序列編號105，將MaCar之胺基酸序列示於序列編號103。

[表2-1]

[表2-2]

羧酸還原酵素之活性，藉由本技術領域人士，可依照周知之方法評價，例如可列舉藉由ATP及NADPH存在下，培育基質(羧酸)及酵素，測定340nm之吸光度，監測NADPH之氧化的方法，或定量基質之消耗量及/或生成物(醛)之生成量的方法(Venkitasubramanian et al.,Journal of Biological Chemistry,Vol.282,No.1,478-485(2007))。

又，羧酸還原酵素可藉由磷酸泛醯巰基乙胺基(phosphopantetheinyl)化，變換成活性型之全酵素(holoenzyme)(Venkitasubramanian et al.,Journal of Biological Chemistry,Vol.282,No.1,478-485(2007))。磷酸泛醯巰基乙胺基化係藉由磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酵素(Phosphopantetheinyl Transferase；PT)催化(例如，可列舉分類為EC2.7.8.7之酵素等)。因此，本發明之微生物可進一步以使磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酵素之活性增大的方式進行改變。就增大磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酵素之活性的方法而言，可列舉導入外來之磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酵素基因的方法，或強化內因性之磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酵素基因之表現的方法，然而不以此等為限。就磷酸泛醯巰基乙胺基之供體而言，可列舉輔酶A(CoA)。

就PT基因之來源而言，只要具有磷酸泛醯巰基乙胺基轉移活性，無特別限定，然而就典型之編碼磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酵素的基因而言，例如，可列舉枯草桿菌(Bacillus subtilis)之Sfp、或艾阿華諾卡氏菌(Nocardia iowensis)之Npt(Venkitasubramanian et al.,Journal of Biological Chemistry,Vol.282,No.1,478-485(2007))、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)之Lys5(Ehmann et al.,Biochemistry 38.19 (1999)：6171-6177.)。在本發明中，例如，可使用編碼序列編號106至108之任一者記載的胺基酸序列所構成之蛋白質的基因。較佳為使用源自艾阿華諾卡氏菌(Nocardia iowensis)的艾阿華諾卡氏菌(Nocardia iowensis)之Npt基因。將Npt基因之編碼區域的鹼基序列示於序列編號109，將Npt之胺基酸序列示於序列編號107。

[表3-1]

[表3-2]

就生成醛之其他型態而言，本發明之基因重組微生物亦可表現醯基-(醯基輸送蛋白質(ACP))還原酵素(AAR)。AAR為負責從醯基ACP變換成醛的酵素。編碼AAR之基因無特別限定，就典型之AAR基因而言，例如，可列舉細長聚球藍細菌(Synechococcus elongatus)之AAR(Schirmer,Andreas,et al.,Science 329.5991(2010)：559-562.)等。

又，就其他型態而言，亦可表現從醯基CoA生產醛之酵素。就編碼催化本反應之酵素的基因而言，例如可列舉編碼脂肪酸醯基-CoA脫氫酶的貝氏不動桿菌(Acinetobacter baylyi)之acr1(ZHENG,Yan-Ning,et al.,Microbial cell factories,2012,11.1：65.)，或編碼克魯維爾梭菌(Clostridium kluyveri)之琥珀酸半醛脫氫酶的sucD基因(Söhling,B.,and Gerhard Gottschalk.,Journal of bacteriology 178.3(1996)：871-880.)，然而不以此等為限。

再者，亦可表現從醯基磷酸生成醛之酵素，例如NADPH依賴性之催化從4-天冬胺醯基磷酸變換成天冬胺酸半醛之反應的天冬胺酸半醛脫氫酶(ASD；EC1.2.1.11)催化同樣之反應，可利用大腸菌之asd基因等。

根據本發明之基因重組微生物，就參與二胺化合物合成之酵素基因而言，表現胺基轉移酵素。

胺基轉移酵素意指在胺基供體及受體存在下，催化胺基轉移反應的任何酵素。就胺基轉移酵素而言，例如，可列舉被分類為EC2.6.1.p(其中，p為1以上之整數)的酵素。就胺基供體而言，可列舉L-麩胺酸、L-丙胺酸、甘胺酸，然而不以此等為限。

就編碼胺基轉移酵素的基因而言，只要具有胺基轉移活性，無特別限定，然而較佳可利用腐胺(putrescine)胺基轉移酶或其他二胺轉移酶。例如，可列舉大腸菌之編碼腐胺(putrescine)胺基轉移酶(該酶被報導可使屍胺(cadaverine)或精三胺(spermidine)進行胺基轉移)的ygjG基因(Samsonova.,et al.,BMC microbiology 3.1(2003)：2.)，或假單胞菌屬之編碼腐胺(putrescine)胺基轉移酶的SpuC基因(Lu et al.,Journal of bacteriology 184.14(2002)：3765-3773.、Galman et al.,Green Chemistry 19.2(2017)：361-366.)，或大腸菌之編碼GABA胺基轉移酶的gabT基因、puuE基因等。再者，亦報導源自波氏魯杰氏菌(Ruegeria pomeroyi)、紫色產色桿菌(Chromobacterium violaceum)、檸檬節桿菌(Arthrobacter citreus)、嗜熱球桿菌(Sphaerobacter thermophilus)、費氏曲黴(Aspergillus fischeri)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、百脈中間根瘤菌(Mesorhizobium loti)等之ω-轉胺酶，亦具有可變換成1,8-二胺基辛烷或1,10-二胺基癸烷等二胺化合物的胺基轉移活性，而適合利用(Sung et al.,Green Chemistry 20.20(2018)：4591-4595.、Sattler et al.,Angewandte Chemie 124.36(2012)：9290-9293.)。

就編碼胺基轉移酵素的基因而言，在本發明中，例如，可使用編碼序列編號110至114之任一者記載的胺基酸序列所構成之蛋白質的基因。較佳可使用源自大腸菌之腐胺(putrescine)胺基轉移酶ygjG基因。將ygjG基因之編碼區域的鹼基序列，示於序列編號115，將ygjG之胺基酸序列示於序列編號110。

[表4-1]

[表4-2]

可利用於本發明的編碼上述之酵素的基因，可為源自例示之生物以外者，或為以人工方式合成者，只要能在宿主微生物細胞內表現實質之酵素活性者即可。

又，可利用於本發明之目的之上述酵素基因，若為能於前述宿主微生物細胞內表現實質之酵素活性者，可具有於自然界可能發生的所有變異，或以人工方式導入的變異及修飾。例如，已知編碼特定胺基酸的各種密碼子中存在多餘之密碼子。因此在本發明中亦可利用最後能被轉譯成相同胺基酸的代替密碼子。總之，由於基因密碼縮聚，可使用複數個編碼某特定胺基酸用的密碼子，因此胺基酸序列可藉由任何1組之類似DNA寡核苷酸來編碼。與天然型酵素之基因序列相同者不是該組之唯一成員，即使為錯配(mismatch)之DNA寡核苷酸，於適當之嚴苛條件下(例如，以3xSSC、68℃雜交，以2xSSC、0.1%SDS及68℃洗淨)可與天然型序列雜交，可鑑定、單離編碼天然型序列之DNA，進一步亦可將此種基因利用於本發明中。尤其，已知幾乎所有生物均會優先使用特定密碼子(最佳密碼子)之亞組(subset)(Gene，Vol.105,pp.61-72,1991等)，故依據宿主微生物，進行「密碼子最佳化」，在本發明中亦有用。

因此，根據本發明之基因重組微生物，在可表現實質之酵素活性的條件下，可包含與上述酵素基因之鹼基序列具有例如80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%以上之序列相同性的鹼基序列。或者，根據本發明之基因重組微生物，可包含與編碼上述酵素之胺基酸序列的鹼基序列，具有例如80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%以上之序列相同性的鹼基序列。

在本發明中，藉由以上述之二胺化合物合成酵素基因群，作為「表現卡匣(expression cassette)」，導入宿主微生物細胞內，可得到更安定、高程度之酵素活性。本說明書中，「表現卡匣」意指包含被功能性地結合於表現對象之核酸或表現對象之基因調節轉錄及轉譯之核酸序列的核苷酸。典型而言，本發明之表現卡匣(expression cassette)，在編碼序列之5’上游的啟動子序列，在3’下游的終止子序列，視情況進一步以功能性地結合通常之調節元件的狀態被包含，在此種情況中，表現對象之核酸或表現對象之基因被導入宿主微生物中。

啟動子不管為構成表現型啟動子，或為誘導表現型啟動子，皆被定義為使RNA聚合酶與DNA結合，啟動RNA合成的DNA序列。強的啟動子意指以高頻率使mRNA合成開始的啟動子，在本發明中亦適合使用。大腸菌方面，可利用lac系、trp系、tac或trc系、λ噬菌體之主要操縱子(operator)及啟動子區域；fd外殼蛋白質之控制區域；針對解糖系酵素(例如，3-磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酵素)、麩胺酸脫羧酶A、絲胺酸羥基甲基轉移酶之啟動子；源自T7噬菌體之RNA聚合酶之啟動子區域等。麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)方面，可利用HCE(高程度組成表現(high-level constitutive expression))啟動子、cspB啟動子、sodA啟動子、伸長因子(EF-Tu)啟動子等。就終止子而言，可利用T7終止子、rrnBT1T2終止子、lac終止子等。除啟動子及終止子序列之外，可列舉作為其他調節元件之例者，如選擇標記、擴增信號、複製起點等。關於較佳之調節序列，例如，被記載於「基因表現技術：酵素學之方法185 (Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185)」，Academic Press(1990)中。

上述所說明之表現卡匣(expression cassette)，例如，組入質體、噬菌體、轉位子(transposon)、IS元件、F型黏接質體(fosmid)、黏粒(cosmid)、或線狀或環狀之DNA等構成的載體，插入宿主微生物中。以質體及噬菌體為較佳。此等載體可為宿主微生物中自主複製者，又亦可藉由染色體複製。較佳之質體，例如，大腸菌之pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI；桿菌之pUB110、pC194或pBD214；棒狀桿菌屬之pSA77或pAJ667等。此等之外，其他亦可使用之質體等，被記載於「選殖載體(Cloning Vectors)」,Elsevier,1985。表現卡匣(expression cassette)對載體之導入，可用適當之限制酵素切出，藉由包含選殖(cloning)、及連接(ligation)的慣用之方法而達成。各種表現卡匣，可配置於1個載體上，亦可配置於2個或其以上之載體。

以上述之方式，構築具有本發明之表現卡匣(expression cassette)的載體後，將該載體導入宿主微生物時可適用的手法，可使用慣用之方法。例如，可列舉氯化鈣法、電穿孔(electroporation)法、接合傳遞法、原生質體(protoplast)融合法等，然而不以此等為限，可選擇適於宿主微生物的方法。

如上述之作法所得到的重組微生物，為了本發明之二胺化合物生產，係於適合前述重組微生物之生育及/或維持的條件下培養及維持。用於源自各種宿主微生物之重組微生物的較佳培養基組成、培養條件、培養時間，可依照本技術領域人士容易地設定。

本發明之其他實施型態，關於使用前述之重組微生物，製造二胺化合物的方法。製造二胺之方法方面，例如，包含以下之步驟。

(a)培養步驟

二胺化合物之製造方法方面，包含培養前述之實施型態相關的重組微生物之培養步驟。例如，藉由將重組微生物於含有碳源及氮源之培養基中培養，可得到包含菌體的培養液。

本製造方法亦可包含使基因重組微生物與二胺化合物之前驅體接觸。就對重組微生物供給二胺化合物前驅體的方法而言，可列舉在重組微生物體內生產二胺化合物前驅體之方法，或不依靠重組微生物體，而從細胞外供給二胺化合物前驅體的方法。

在培養步驟中，於使重組微生物與二胺化合物之前驅體接觸的情況，前述培養基可進一步包含前驅體，或者亦可在培養步驟之途中，於培養基中添加前驅體。

培養基為包含1個以上之碳源、氮源、無機鹽、維生素，及視情況包含微量元素或維生素等微量成分的天然、半合成、合成培養基。然而，所使用之培養基，必須適當地滿足所要培養的微生物之營養要求，自不待言。

碳源可列舉D-葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、寡糖、多糖、澱粉、纖維素、米糠、廢糖蜜、油脂(例如大豆油、葵花籽油、花生油、椰子油等)、脂肪酸(例如棕櫚酸、亞麻油酸、油酸、次亞麻油酸等)、醇(例如甘油、乙醇等)、有機酸(例如醋酸、乳酸、琥珀酸等)。再者，可為含有D-葡萄糖之生物質(biomass)。就較佳之生物質而言，可例示玉米分解液或纖維素分解液。此等碳源可個別地使用，或者作為混合物使用。

使用源自生物質之原料所製造的二胺化合物，藉由基於ISO16620-2或ASTM D6866所規定之碳-14(放射性碳)分析的生物基質碳含有率之測定，可與例如源自石油、天然氣、煤碳等的合成原料明確地區別。

氮源可列舉含氮有機化合物(例如，蛋白腖、酪蛋白胺基酸、胰化蛋白、酵母萃取物、肉萃取物、麥芽萃取物、玉米漿、大豆粉、胺基酸及尿素等)、或無機化合物(例如，氨水溶液、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨、硝酸鈉、硝酸銨等)。此等氮源可個別地使用，或者作為混合物使用。

又，培養基，在重組微生物表現有用的附加特徵之情況，例如具有對抗生素之耐性標記之情況，亦可包含對應的抗生素。藉此，可減低因培養時之雜菌所造成的污染風險。就抗生素而言，可列舉安比西林(ampicillin)等β-內醯胺系抗生素、康黴素(kanamycin)等胺基糖苷系抗生素、紅黴素等巨環內酯(macrolide)系抗生素、四環素系抗生素、氯黴素等，然而不以此等為限。

二胺化合物之「前驅體」意指藉由本發明之參與二胺化合物合成的酵素，可衍生成二胺化合物的化合物。就前驅體而言，可列舉二羧酸、羧酸半醛、二醛、胺基羧酸、胺基醛、醯基-ACP、醯基-CoA、醯基磷酸，然而不以此等為限。

例如，就可衍生六亞甲基二胺之具體前驅體而言，可使用己二酸、己二酸半醛、己二醛、6-胺基己烷酸、6-胺基己醛、己二醯基-CoA、己二醯基磷酸等。

例如，在二胺化合物為六亞甲基二胺的情況，藉由使重組微生物與為前驅體之己二酸接觸，藉由重組微生物所生產的羧酸還原酵素及胺基轉移酵素，己二酸可變換為六亞甲基二胺。

又例如，在二胺化合物為1,10-癸二胺之情況，藉由使重組微生物與為前驅體之癸二酸接觸，藉由重組微生物所生產的羧酸還原酵素及胺基轉移酵素，癸二酸可變換為1,10-癸二胺。

前驅體可使用1種前驅體，亦可將2種或其以上之前驅體組合。又，在取得鹽之型態之化合物的情況，前驅體能以鹽使用，亦可作為游離體使用，亦可使用彼等之混合物。

前驅體之製造方法無特別限定，例如，可藉由化學合成法、酵素法、生物變換法、發酵法或彼等之組合而製造。

在培養步驟中，藉由使本發明之基因重組微生物與二胺化合物之前驅體接觸，使二胺化合物於培養基中生成並累積，可製造二胺化合物。又，如以下說明，在反應步驟中，於含有二胺化合物前驅體之水溶液中，藉由使本發明之基因重組微生物作用，可在該反應液中使二胺化合物生成並累積。

(b)反應步驟

本步驟為使二胺化合物之前驅體與重組微生物接觸的步驟，以從二胺化合物前驅體生成為目的之二胺化合物。與二胺之前驅體之接觸，例如，可於如前述之前述培養步驟中進行，或者於培養步驟之後進行。在將本反應步驟於培養步驟之後進行的情況，可使培養步驟中所得到之培養液及/或菌體，與含有二胺化合物之前驅體的水溶液接觸，得到包含二胺化合物之反應液。藉由以此種方式與前驅體接觸，可使二胺化合物於反應液中生成並累積。

在一型態中，本步驟係使包含培養步驟所得到之菌體的培養液，及/或從培養步驟所得到之培養液藉由離心等除去上清液的菌體，與含有前驅體之水溶液接觸，得到反應液。

又，在另一型態中，可將藉由發酵生產前驅體之菌，與上述本發明相關之重組微生物進行共培養。藉由將此等共培養，可將藉由前述菌生產之前驅體，藉由本發明相關之重組組成物生產的酵素，將前驅體有效率地變換為目的之二胺化合物。

再者，在其他型態中，藉由使根據本發明之基因重組微生物具有二胺化合物前驅體生產能力，亦可從培養基中之成分生成並累積二胺化合物。

就藉由基因重組微生物的前驅體生產途徑之例而言，揭示以葡萄糖作為起始原料的6-胺基己酸之製造法(Turk et al.,ACS synthetic biology 5.1(2015)：65-73.)，或以葡萄糖或甘油作為起始原料的己二酸之製造法(Zhao et al.,Metabolic engineering 47(2018)：254-262.)，然而只要能生產前驅體，不以此等手法為限。

例如，重組微生物藉由具備產生二羧酸、羧酸半醛、或胺基羧酸之能力，進一步表現胺基轉移酵素、及羧酸還原酵素，可生產二胺化合物。

又，例如，重組微生物藉由具有產生己二酸、己二酸半醛、或6-胺基己酸之能力，進一步表現胺基轉移酵素、及羧酸還原酵素，可生產六亞甲基二胺。

若藉由根據本發明之基因重組微生物及使用該微生物的二胺化合物之製造方法，可抑制副生成物之生成，效率良好地製造二胺化合物。具體而言，例如，藉由在表現二胺化合物之生產所必要之酵素的微生物中，以醇脫氫酶之活性與非降低株比較，變得降低的方式改變，可抑制為副生成物之醇體的生成，效率良好地製造二胺化合物。

以下，僅為更進一步說明之目的而提供實施例，因此，本發明並不限定於該實施例。再者，在本說明書中，除非特別聲明，否則核苷酸序列係以從5’至3’方向記載。

[實施例]

以下根據實施例說明本發明，然而本發明並不限定於此等實施例。

1：ADH基因破壞株之構築

<1-a基因破壞用質體之構築>

ADH基因之破壞，係藉由使用pHAK1(受託編號NITE P-02919，獨立行政法人製品評價技術基盤機構生物技術中心特許微生物寄託中心(NPMD)(地址：日本國千葉縣木更津市上總鎌足2-5-8 122號室)，於2019 年3月18日寄託)之相同重組法進行。pHAK1包含溫度感受性變異型repA基因、康黴素耐性基因、源自枯草桿菌(Bacillus subtilis)之左聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因SacB。左聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因係於蔗糖存在下，對宿主微生物進行致死性的作用。PCR片段之擴增，係使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase(製品名，Takara Bio製)，質體調製係使用大腸菌HST08株進行。以大腸菌BL21(DE3)株之基因組DNA作為模板，得到包含破壞標的基因之上游區域、編碼區域、及下游區域的PCR產物。將標的基因與引子序列之組合示於下述表中。

[表5]

繼而將本PCR產物，使用In-Fusion HD cloning kit(製品名，Clontech公司製)，插入用序列編號130及131之引子擴增的pHAK1質體片段中，進行環化。

[表6]

以所得到之插入破壞標的基因之上游區域、編碼區域、及下游區域之DNA片段的pHAK1質體作為模板，使用下述表中記載之引子，進行PCR，得到破壞標的基因之編碼區域之一部區域或全區域被除去的質體片段。

[表7]

將所得到之質體片段進行末端磷酸化，藉由自體連接(self-ligation)進行環化，得到基因破壞用質體。

<1-b ADH基因破壞大腸菌株之構築>

藉由氯化鈣法(參照羊土社「基因工學實驗摘記」田村隆明著)，以破壞期望基因用的質體轉形大腸菌BL21(DE3)株後，塗布於含有康黴素硫酸鹽100mg/L之LB瓊脂培養基(胰化蛋白10g/L、酵母萃取物5g/L、氯化鈉5g/L、瓊脂粉末15g/L)，在30℃培養一晚，取得單一純系(clone)，得到轉形體。將本轉形體於1mL之含有康黴素硫酸鹽100mg/L的LB液體培養基(胰化蛋白10g/L、酵母萃取物5g/L、氯化鈉5g/L)中，以一白金耳植菌，在30℃進行振盪培養。將所得到之培養液，塗布於含有100mg/L康黴素硫酸鹽的LB瓊脂培養基，在42℃培養一晚。所得到之純系，藉由單交叉(single crossover)，將質體插入基因組中。將純系以一白金耳植菌於1mL之LB液體培養基中，於30℃進行振盪培養。將所得到之培養液，塗布於含有10%蔗糖的LB瓊脂培養基中，培養一晚。對於所得到之純系，使用表8所示的引子組，藉由CloneDirect PCR確認期望之基因被破壞。將構築之ADH基因破壞大腸菌株示於表9。表中，△表示該酵素基因缺損。

[表8]

[表9]

<1-c 1,6-己二醇之分解活性降低試驗>

藉由1,6-己二醇之氧化反應的進行，確認所構築之ADH基因破壞大腸菌株之1,6-己二醇的分解活性降低。1,6-己二醇為伴隨六亞甲基二胺之生產反應而副產的醇體之一。在本試驗中，基於圖1所示的ADH催化之醛與醇之間的反應為可逆反應，著眼於從醇(其中如1,6-己二醇)變換成醛之反應，以1,6-己二醇之消耗作為藉由ADH催化之1,6-己二醇之分解活性的指標。在本試驗中，就前培養而言，將ADH基因破壞大腸菌各株之菌體，以一白金耳植菌於2mL之LB液體培養基中，於37℃振盪培養一晚。將所得到之前培養液，於2mL之包含10mM 1,6-己二醇的LB液體培養基中，以1%相當量植菌，就本培養而言，於37℃進行48小時振盪培養。將培養液藉由離心，分開為菌體及上清液，分析上清液中之1,6-己二醇濃度。

1,6-己二醇濃度之分析係使用氣體層析進行。

條件如以下所述。

GC系統：GC-2010(島津製作所製)

檢測器：氫焰離子化型檢測器

管柱：DB-WAX(Agilent公司製，管柱長30m，內徑0.25mm，膜厚0.25mm)

載流氣體：He

氣體壓力：100kPa

管柱溫度：50℃-(25℃/min)-230℃-(保持20min)

檢測器溫度：250℃

注入口溫度：250℃

注入量：1μL

注入方法：分裂(split)注入法(分裂比36.3)

將本培養48小時後之培養上清液中的1,6-己二醇濃度示於圖2。相對於未破壞ADH基因之野生型株(BL21(DE3)株，WT係WildType之簡稱，表示野生型)藉由ADH之作用消耗1,6-己二醇，ADH基因破壞株，尤其ahr基因、yahK基因這二種基因，藉由單獨之基因破壞，抑制1,6- 己二醇之消耗。從本結果，可確認在ADH基因破壞株中，1,6-己二醇之分解活性的降低。

2：藉由ADH基因破壞株之二胺化合物生產

<2-a MaCar基因、Npt基因、ygjG基因表現質體之構築>

PCR片段之擴增係使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase(製品名，Takara Bio製)，質體之調製係使用大腸菌JM109株。以大腸桿菌(Eshcherichia coli)W3110株(NBRC12713)之基因組DNA作為模板，以序列編號160及161之寡核苷酸作為引子，進行PCR，得到包含ygjG基因之編碼區域的PCR產物。繼而將本PCR產物使用In-Fusion HD cloning kit(製品名，Clontech公司製)，插入質體pACYCDuet(商標)-1(製品名，Merck公司製)之限制酵素NcoI及HindIII切斷部位間，命名為「pDA50」。

[表10]

以膿腫分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)JCM13569株(經由日本國文部科學省/國立研究開發法人日本醫療研究開發機構國家生物資源計畫，由理研BRC提供)之基因組DNA作為模板，以序列編號162及163之寡核苷酸作為引子，進行PCR，得到包含MaCar基因之編碼區域的PCR產物。繼而將本PCR產物，使用In-Fusion HD cloning kit(製品名，Clontech公司製)，插入pDA50之限制酵素NdeI及AvrII切斷部位間，命名為「pDA52」。

[表11]

以艾阿華諾卡氏菌(Nocardia iowensis)JCM18299株(經由日本國文部科學省國家生物資源計畫，由理研BRC提供)之基因組DNA作為模板，以序列編號164及165之寡核苷酸作為引子，進行PCR，得到包含Npt基因之編碼區域的PCR產物。繼而以pDA52作為模板，以序列編號166及167之寡核苷酸作為引子，進行PCR，得到pDA52片段。使用In-Fusion HD cloning kit(製品名，Clontech公司製)將PCR產物彼此連接。從所得到之轉形體，萃取質體，將插入Npt基因者命名為「pDA56」。將pDA56之質體圖譜示於圖3。

[表12]

<2-b轉形體之製作>

藉由氯化鈣法(參照羊土社「基因工學實驗摘記」田村隆明著)，將pDA56導入ADH基因非破壞大腸菌株或ADH基因破壞株中，於含有氯黴素34mg/L的LB瓊脂培養基中培養一晚，得到轉形體。所取得之轉形體如下表所示，分別被命名為轉形體A至S。如表中所示，轉形體A為ADH 基因未破壞株，轉形體B至H，為編碼ADH之基因的任何一個被破壞之株，轉形體I至S，為編碼ADH之基因中至少2個被破壞(多重破壞)之株。

[表13]

<2-c來自己二酸之六亞甲基二胺生產(比較例1、實施例1至18)>

就前培養而言，將轉形體A至S之菌體以一白金耳植菌在2mL之包含氯黴素34mg/L之LB液體培養基中，於37℃進行一晚振盪培養。將所得到之前培養液，以1%相當量植菌在1mL之含有己二酸二銨50mM、氯黴素34mg/L、葡萄糖2%之SOB液體培養基(胰化蛋白20g/L、酵母萃取物5g/L、氯化鈉0.5g/L、氯化鉀2.5mM、硫酸鎂10mM、氯化鎂10mM)中，並於37℃振盪培養。培養2小時後，以使終濃度成為0.2mM之方式添加異丙基-β-硫代半乳糖基吡喃糖苷(IPTG)，並在30℃進行48小時振盪培養。藉由將培養液離心，分離菌體及上清液，分析上清液中之六亞甲基二胺濃度及1,6-己二醇濃度。

六亞甲基二胺濃度之分析係使用離子層析進行。條件如以下所述。

裝置：ICS-3000(Dionex公司製)

檢測器：電傳導度檢測器

管柱：IonPac CG19(2×50mm)/CS19(2×250mm)(Thermo Scientific公司製)

烘箱溫度：30℃

移動相：8mM甲磺酸水溶液(A)、70mM甲磺酸水溶液(B)

梯度條件：(A：100%、B：0%)-(10min)-(A：0%、B：100%)-(1min保持)

流速：0.35mL/min

注入量：20μL

1,6-己二醇之濃度分析係依照與(1-c)同樣之條件，使用氣體層析進行。

表14中，展示各培養液中之六亞甲基二胺濃度、1,6-己二醇濃度。首先，關於六亞甲基二胺濃度，與ADH基因非破壞株(比較例1)比較，在實施例1、3及8至18之ADH基因破壞株中，可見到六亞甲基二胺生成量之增加。又，在實施例1、2及4至18之ADH基因破壞株中，1,6-己二醇生成量減低。又，藉由ADH基因之多重破壞(實施例8至18)，六亞甲基二胺生成量進一步增加，關於1,6-己二醇濃度，與ADH基因非破壞株(比較例1)比較，可見到生成之抑制。

[表14]

<2-d來自癸二酸之1,10-癸烷二胺生產(比較例2、實施例19、20)>

就前培養而言，將轉形體A至S之菌體以一白金耳植菌在2ml之包含氯黴素34mg/L之LB液體培養基中，並於37℃進行一晚振盪培養。將所得到之前培養液，以1%相當量植菌於1mL之含有癸二酸鈉50mM、氯黴素34mg/L、葡萄糖2%之SOB液體培養基中，並在37℃進行振盪培養。培養2小時後，以成為終濃度0.2mM之方式添加IPTG，並在30℃進行48小時振盪培養。將培養液藉由離心，分離為菌體及上清液，分析上清液中之1,10-癸二胺濃度及1,10-癸二醇濃度。

1,10-癸二胺濃度之分析，係以與(2-c)同樣之條件，藉由離子層析進行。表15中展示各培養液中之1,10-癸二胺濃度。與ADH基因非破壞株(比較例2)比較，在實施例19及20之ADH基因破壞株中，可見到1,10-二胺基癸烷生成量之增加。

1,10-癸二醇之濃度之分析係以與(1-c)同樣之條件，使用氣體層析進行。表15中展示各培養液中之1,10-癸二胺濃度。與ADH基因非破壞株(比較例2)比較，實施例19及20之ADH基因破壞株中，可見到1,10-癸二醇生成量之抑制。

[表15]

生物學材料之寄託

質體pHAK1係於2020年7月21日，在日本國獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許生物寄託中心(NPMD)(地址：日本國千葉縣木更津市上總鎌足2-5-8 122號室)，以「NITE ABP-02919(收據編號)」寄託(根據布達佩斯條約，從NITEP-02919移管至寄託)。

[產業上之可利用性]

本發明之基因重組微生物，適合利用於二胺化合物製造。

Claims

一種基因重組微生物，其為表現參與二胺化合物合成之酵素且1,6-己二醇的生成受到抑制的微生物，其中該二胺化合物係以式：H₂N-R-NH₂表示，式中，R為由選自包含C、H、O、N、S之群組中之1個以上原子構成的鏈狀或環狀有機基，該微生物係以醇脫氫酶之活性與非降低株比較為降低的方式進行改變，前述基因重組微生物為大腸桿菌(Escherichia coli)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)或枯草桿菌(Bacillus subtilis)，該醇脫氫酶為因應前述基因重組微生物的種類而由下列DNA編碼的蛋白質：‧由選自序列編號2、4、8、10、12及14中之至少一者；序列編號2、4、8、10、12及14中之至少一者與序列編號6、18、20、22、24、26、28、30、32、34及36中之至少一者；序列編號38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62及64中之至少兩者；序列編號66、68、70、72、74、76、78、80、82及84中之至少兩者；序列編號86、88、90、92、94、96、98及100中之至少兩者之鹼基序列構成的DNA，‧由與選自序列編號2、4、8、10、12及14中之至少一者；序列編號2、4、8、10、12及14中之至少一者與序列編號6、18、20、22、24、26、28、30、32、34及36中之至少一者；序列編號38、40、42、44、46、48、 50、52、54、56、58、60、62及64中之至少兩者；序列編號66、68、70、72、74、76、78、80、82及84中之至少兩者；序列編號86、88、90、92、94、96、98及100中之至少兩者之鹼基序列具有85%以上之序列相同性的鹼基序列構成，且編碼具有醇脫氫酶活性之蛋白質的DNA，‧為編碼相對於由選自序列編號2、4、8、10、12及14中之至少一者；序列編號2、4、8、10、12及14中之至少一者與序列編號6、18、20、22、24、26、28、30、32、34及36中之至少一者；序列編號38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62及64中之至少兩者；序列編號66、68、70、72、74、76、78、80、82及84中之至少兩者；序列編號86、88、90、92、94、96、98及100中之至少兩者之鹼基序列所編碼之蛋白質的胺基酸序列，1至10個胺基酸經刪除、置換、插入及/或附加的胺基酸序列所構成之蛋白質的鹼基序列，且編碼具有醇脫氫酶酵素活性之蛋白質的DNA，或‧由選自序列編號2、4、8、10、12及14中之至少一者；序列編號2、4、8、10、12及14中之至少一者與序列編號6、18、20、22、24、26、28、30、32、34及36中之至少一者；序列編號38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62及64中之至少兩者；序列編號66、68、70、72、74、76、78、80、82及84中之至少兩者；序列編號86、88、90、92、94、96、98及100中之至少兩者的鹼基序列之縮聚異構物構成的DNA。
如請求項1所述之基因重組微生物，其中醇脫氫酶之活性與非降低株比較為降低的改變為：編碼醇脫氫酶之基因之表現受到抑制的改變，或編碼醇脫氫酶之基因的表現受到抑制，且醇脫氫酶之活性受到抑制的改變。
一種基因重組微生物，其為表現參與二胺化合物合成之酵素且1,6-己二醇的生成受到抑制的微生物，其中該二胺化合物係以式：H₂N-R-NH₂表示，式中，R為由選自包含C、H、O、N、S之群組中之1個以上原子構成的鏈狀或環狀有機基，該微生物係以醇脫氫酶之活性與非降低株比較為降低的方式進行改變，前述基因重組微生物為大腸桿菌(Escherichia coli)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)或枯草桿菌(Bacillus subtilis)，該醇脫氫酶為因應前述基因重組微生物的種類而具有與選自序列編號1、3、7、9、11及13中之至少一者；序列編號1、3、7、9、11及13中之至少一者與序列編號5、17、19、21、23、25、27、29、31、33及35中之至少一者；序列編號37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61及63中之至少兩者；序列編號65、67、69、71、73、75、77、79、81及83中之至少兩者；序列編號85、87、89、91、93、95、97及99中之至少兩者之胺基酸序列具有80%以上之序列相同性的胺基酸序列，且具有醇脫氫酶活性之蛋白質。
如請求項3所述之基因重組微生物，其中醇脫氫酶之活性與非降低株比較為降低的改變為：編碼醇脫氫酶之基因之表現受到抑制的改變，或編碼醇脫氫酶之基因的表現受到抑制，且醇脫氫酶之活性受到抑制的改變。
一種基因重組微生物，其為表現參與二胺化合物合成之酵素且1,6-己二醇的生成受到抑制的微生物，其中該二胺化合物係以式：H₂N-R-NH₂表示，式中，R為由選自包含C、H、O、N、S之群組中之1個以上原子構成的鏈狀或環狀有機基，該微生物係以醇脫氫酶之活性與非降低株比較為降低的方式進行改變，前述基因重組微生物為大腸桿菌(Escherichia coli)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)或枯草桿菌(Bacillus subtilis)，該大腸桿菌的醇脫氫酶為藉由選自yqhD、fucO、ybbO、eutG、ahr及yahK構成之群組中之至少一個基因編碼的蛋白質，或藉由選自yqhD、fucO、ybbO、eutG、ahr及yahK構成之群組中之至少一個基因與選自adhP、ybdR、dkgA、yiaY、frmA、dkgB、yghA、ydjG、gldA、yohF及yeaE構成之群組中之至少一個基因編碼的蛋白質，該釀酒酵母的醇脫氫酶為藉由選自ADH1、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7、SFA1、AAD3、AAD4、AAD10、AAD14、AAD15及YPR1構成之群組中之至少兩個基因編碼的蛋白質，該麩胺酸棒狀桿菌的醇脫氫酶為藉由選自NCgl0324、NCgl0313、NCgl0219、NCgl2709、NCg11112、NCgl2382、NCgl0186、NCgl0099、NCgl2952及NCgl1459構成之群組中之至少兩個基因編碼的蛋白質，該枯草桿菌的醇脫氫酶為藉由選自yogA、bdhK、bdhJ、akrN、yqkF、yccK、iolS及yrpG構成之群組中之至少兩個基因編碼的蛋白質。
如請求項5所述之基因重組微生物，其中醇脫氫酶之活性與非降低株比較為降低的改變為：編碼醇脫氫酶之基因之表現受到抑制的改變，或編碼醇脫氫酶之基因的表現受到抑制，且醇脫氫酶之活性受到抑制的改變。
如請求項5或6所述之基因重組微生物，其中該醇脫氫酶為藉由選自yqhD、fucO、eutG、ybbO、ahr、及yahK構成之群組中之至少一個基因與adhP編碼的蛋白質。
如請求項5或6所述之基因重組微生物，其中該醇脫氫酶為藉由yqhD及adhP編碼的蛋白質。
如請求項5或6所述之基因重組微生物，其中該醇脫氫酶為藉由選自yqhD、fucO、eutG、ybbO、ahr、及yahK構成之群組中之至少一個基因編碼的蛋白質。
如請求項9所述之基因重組微生物，其中該醇脫氫酶為藉由選自eutG、ybbO、ahr、及yahK構成之群組中之至少一個基因編碼的蛋白質。
如請求項5或6所述之基因重組微生物，其中該醇脫氫酶為藉由選自yqhD、fucO、adhP、eutG、ybbO、ahr及yahK構成之群組的2個以上之基因編碼的蛋白質。
如請求項5或6所述之基因重組微生物，其中該醇脫氫酶為藉由選自下列組合所構成之群組中之1種組合之相關基因所編碼的蛋白質：yqhD及fucO，yqhD及adhP，yqhD及eutG，yqhD及ybbO，yqhD及ahr，yqhD及yahK，yqhD、fucO及adhP，yqhD、fucO、adhP及eutG，yqhD、fucO、adhP、eutG及ybbO，yqhD、fucO、adhP、eutG、ybbO及ahr，以及，yqhD、fucO、adhP、eutG、ybbO、ahr及yahK。
如請求項1至6中任一項所述之重組微生物，其中該以醇脫氫酶之活性與非降低株比較為降低之方式的改變，為藉由選自下列所構成之群組中的1種以上方式進行：使該微生物內之編碼該醇脫氫酶之基因的轉錄量及/或轉譯量降低，以及破壞該微生物內之編碼該醇脫氫酶之基因。
如請求項1至6中任一項所述之基因重組微生物，其中該基因重組微生物為大腸桿菌(Escherichia coli)。
如請求項1至6中任一項所述之基因重組微生物，其表現胺基轉移酵素，作為參與前述二胺化合物合成之酵素。
如請求項1至6中任一項所述之基因重組微生物，其表現羧酸還原酵素，作為參與前述二胺化合物合成之酵素。
如請求項16所述之基因重組微生物，其中該羧酸還原酵素具有將羧酸半醛、二羧酸、或胺基羧酸之羧基變換為醛的活性。
如請求項1至6中任一項所述之基因重組微生物，其具有產生二羧酸、羧酸半醛、或胺基羧酸之能力，且進一步表現胺基轉移酵素、及羧酸還原酵素。
如請求項1至6中任一項所述之基因重組微生物，其具有產生已二酸、己二酸半醛、或6-胺基己烷酸之能力，且進一步表現胺基轉移酵素、及羧酸還原酵素。
如請求項16所述之基因重組微生物，其進一步進行使磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酵素之活性增大的改變。
如請求項15所述之基因重組微生物，其中編碼該胺基轉移酵素之基因為ygjG。
如請求項16所述之基因重組微生物，其中編碼該羧酸還原酵素之基因為MaCar。
如請求項20所述之基因重組微生物，其中編碼該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酵素之基因為Npt。
如請求項1至6中任一項所述之重組微生物，其包含與序列編號115所示之鹼基序列具有85%以上之序列相同性，且編碼具有胺基轉移酵素活性之蛋白質的鹼基序列，或者包含與編碼序列編號110至114中任一者所示之胺基酸序列的鹼基序列具有85%以上之序列相同性，且編碼具有胺基轉移酵素活性之蛋白質的鹼基序列。
如請求項1至6中任一項所述之重組微生物，其包含與序列編號105所示之鹼基序列具有85%以上之序列相同性，且編碼具有羧酸還原酵素活性之蛋白質的鹼基序列，或者包含與編碼序列編號101至104中任一者所示之胺基酸序列的鹼基序列具有85%以上之序列相同性，且編碼具有羧酸還原酵素活性之蛋白質的鹼基序列。
如請求項20所述之重組微生物，其包含與序列編號109所示之鹼基序列具有85%以上之序列相同性，且編碼具有磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酵素活性之蛋白質的鹼基序列，或者與編碼序列編號106至108中任一者所示之胺基酸序列的鹼基序列具有80%以上之序列相同性，且編碼具有磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酵素活性之蛋白質的鹼基序列。
如請求項1至6中任一項所述之基因重組微生物，其表現選自下列序列構成之群組中的1種以上之酵素：醯基-(醯基輸送蛋白質(ACP))還原酵素(AAR)、從醯基CoA生產醛之酵素、從醯基磷酸生成醛之酵素。
一種二胺化合物之製造方法，其使用如請求項1至27中任一項所述之基因重組微生物。
一種二胺化合物之製造方法，其包含將如請求項1至27中任一項所述之基因重組微生物，於含有碳源及氮源的培養基中培養，得到包含菌體之培養液的培養步驟。
如請求項29所述之二胺化合物之製造方法，其中該培養基進一步包含二胺化合物之前驅體，或在該培養步驟中，包含於該培養基中添加該前驅體。
如請求項29或30所述之二胺化合物之製造方法，其包含使該培養液及/或前述菌體，與含有二胺化合物之前驅體的水溶液接觸，得到包含二胺化合物之反應液的反應步驟。
如請求項30所述之二胺化合物之製造方法，其中該前驅體係選自二羧酸、羧酸半醛、胺基羧酸、胺基醛、二醛、醯基-ACP、醯基-CoA及醯基磷酸構成之群組。