JP2017533734A - ６−炭素モノマーを産生するための方法および材料 - Google Patents

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Abstract

本明細書は、3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoA中間体を形成するためのβ-ケトチオラーゼ活性を有するポリペプチドを用いて6-ヒドロキシヘキサン酸を産生するための、生化学的経路を記載する。6-ヒドロキシヘキサン酸は、アジピン酸、カプロラクタム、6-アミノヘキサン酸、ヘキサメチレンジアミン、または1,6-ヘキサンジオールに酵素的に変換され得る。本明細書はまた、6-ヒドロキシヘキサン酸、ならびにアジピン酸、カプロラクタム、6-アミノヘキサン酸、ヘキサメチレンジアミン、および1,6-ヘキサンジオールを産生する組換え宿主を記載する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照として本明細書にその全体が組み入れられる開示である2014年11月14日に出願された米国特許出願第62/079,903号および2015年11月13日に出願された米国特許出願第62/255,276号の恩典を主張する。
技術分野
本発明は、6-炭素モノマーを産生するための非天然の方法を提供する。本発明は、β-ケトチオラーゼ活性を有するポリペプチドを用いて、3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAを生合成すること、ならびに3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、3-オキソアシル-CoAレダクターゼ活性を有するポリペプチド、エノイル-CoAヒドラターゼを有するポリペプチド、トランス-2-エノイル-CoAレダクターゼを有するポリペプチド、およびチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドの1つもしくは複数を用いて、またはそのような酵素の1つもしくは複数を発現する組換え宿主細胞を用いて、3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAを6-ヒドロキシヘキサン酸に酵素的に変換することを提供する。本発明はまた、デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、レダクターゼ活性を有するポリペプチド、ヒドラターゼ活性を有するポリペプチド、チオエステラーゼ活性を有するポリペプチド、モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチド、トランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドなどの1つもしくは複数の単離された酵素を用いて、または1つもしくは複数のそのような酵素を発現する組換え宿主細胞を用いて、6-ヒドロキシヘキサン酸を、アジピン酸、6-アミノヘキサン酸、ヘキサメチレンジアミン、カプロラクタム、および1,6-ヘキサンジオールの1つまたは複数に変換するための方法に関する。
背景
ナイロンは、ジアミンのジカルボン酸との縮合重合によって一般に合成されるポリアミドである。同様に、ナイロンはまた、ラクタムの縮合重合によって産生され得る。遍在的なナイロンにナイロン6,6があり、これはヘキサメチレンジアミン（HMD）およびアジピン酸の反応によって産生される。ナイロン6は、カプロラクタムの開環重合によって産生され得る。したがって、アジピン酸、ヘキサメチレンジアミン、およびカプロラクタムは、ナイロンの製造において重要な中間体である（Anton & Baird, Polyamides Fibers, Encyclopedia of Polymer Science and Technology, 2001（非特許文献1））。
工業的に、アジピン酸およびカプロラクタムは、シクロヘキサンの空気酸化を介して産生される。シクロヘキサンの空気酸化は、一連の段階において、シクロヘキサノン（K）およびシクロヘキサノール（A）の混合物を産生し、これは、KAオイルと呼ばれる。KAオイルの硝酸酸化は、アジピン酸を産生する（Musser, Adipic acid, Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 2000（非特許文献2））。カプロラクタムは、そのオキシムおよび後の酸転位を介して、シクロヘキサノンから産生される（Fuchs, Kieczka and Moran, Caprolactam, Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 2000（非特許文献3））。
工業的に、ヘキサメチレンジアミン（HMD）は、アジポニトリルへのC6ビルディングブロックのヒドロシアン化（hydrocyanation）の後、HMDへの水素付加によって産生される（Herzog and Smiley, Hexamethylenediamine, Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 2012（非特許文献4））。
石油化学フィードストックへの依存を考慮し、バイオテクノロジーにより、生体触媒作用を介した代替的なアプローチが提供される。生体触媒作用は、有機化合物の生化学的トランスフォーメーションを行うための、酵素などの生物学的触媒の使用である。
生物由来のフィードストックおよび石油化学フィードストックはいずれも、生体触媒プロセスのための実行可能な出発材料である。
Anton & Baird, Polyamides Fibers, Encyclopedia of Polymer Science and Technology, 2001 Musser, Adipic acid, Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 2000 Fuchs, Kieczka and Moran, Caprolactam, Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 2000 Herzog and Smiley, Hexamethylenediamine, Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 2012
概要
したがって、この背景に対して、アジピン酸、カプロラクタム、6-アミノヘキサン酸、6-ヒドロキシヘキサン酸、ヘキサメチレンジアミン、および1,6-ヘキサンジオールの1つまたは複数を産生するための、生体触媒ベースの持続可能な方法の必要性が存在することは明らかである。
本明細書は、少なくとも一部は、1つまたは複数の酵素的段階で、アジピン酸、6-アミノヘキサン酸、ヘキサメチレンジアミン、カプロラクタム、または1,6-ヘキサンジオールに変換され得る、6-ヒドロキシヘキサノエートを産生するために、特にβ-ケトチオラーゼを使用するための生化学的経路を構築することが可能であるという発見に基づく。アジピン酸およびアジペート、6-ヒドロキシヘキサン酸および6-ヒドロキシヘキサノエート、ならびに6-アミノヘキサン酸および6-アミノヘキサノエートは、それらの任意の塩形態を含む中性もしくは電離型の化合物を呼ぶために、本明細書において互換的に使用される。特定の形態がpHに依存するであろうことは、当業者によって理解される。
最適原理に直面して、適切な非天然の経路、フィードストック、宿主微生物、宿主の生化学的ネットワークに対する減弱ストラテジー、および培養ストラテジーを組み合わせて、C6ビルディングブロックとして6-ヒドロキシヘキサノエートを効率的に産生し得ること、または6-ヒドロキシヘキサノエートを、アジピン酸、6-アミノヘキサン酸、ヘキサメチレンジアミン、カプロラクタム、もしくは1,6-ヘキサンジオールなどの他のC6ビルディングブロックに変換し得ることが、驚くべきことに発見された。
いくつかの態様において、末端カルボキシル基は、チオエステラーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、6-オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、7-オキソヘプタン酸デヒドロゲナーゼ、またはモノオキシゲナーゼ（例えば、オキシドレダクターゼおよびフェレドキシンを組み合わせて）を用いて、酵素的に形成され得る。図1および図2参照。
いくつかの態様において、末端アミノ基は、ω-トランスアミナーゼまたはデアシラーゼを用いて、酵素的に形成され得る。図4参照。ω-トランスアミナーゼは、SEQ ID NO：7〜12に示されるアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも70％の配列同一性を有し得る。
いくつかの態様において、末端ヒドロキシル基は、アルコールデヒドロゲナーゼ用いて、酵素的に形成され得る。図1および図5参照。
1つの局面において、本明細書は、3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAを産生する方法を特徴とする。本方法は、EC. 2.3.1.-に分類されるβ-ケトチオラーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、EC 2.3.1.16またはEC 2.3.1.174）を用いて、4-ヒドロキシブチリル-CoAを3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAに酵素的に変換することを含む。β-ケトチオラーゼ活性を有するポリペプチドは、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：13、またはSEQ ID NO：14に示されるアミノ酸配列と少なくとも70％の配列同一性を有し得る。本方法は、3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼまたは3-オキソアシル-CoAレダクターゼ、エノイル-CoAヒドラターゼ、トランス-2-エノイル-CoAレダクターゼ、およびチオエステラーゼまたはCoAトランスフェラーゼを用いて、3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAを6-ヒドロキシヘキサノエートに酵素的に変換することを含み得る。3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼまたは3-オキソアシル-CoAレダクターゼは、EC 1.1.1.35、EC 1.1.1.36、EC 1.1.1.100、またはEC 1.1.1.157に分類され得る。エノイル-CoAヒドラターゼは、EC 4.2.1.17またはEC 4.2.1.119に分類され得る。トランス-2-エノイル-CoAレダクターゼは、EC 1.3.1.38、EC 1.3.1.44、またはEC 1.3.1.8に分類され得る。トランス-エノイル-CoAレダクターゼは、SEQ ID NO：15またはSEQ ID NO：16に示されるアミノ酸配列と少なくとも70％の配列同一性を有し得る。
1つの局面において、本明細書は、6-ヒドロキシヘキサノエートを生合成するための方法を特徴とする。本方法は、EC. 2.3.1.-に分類されるβ-ケトチオラーゼ（例えば、EC 2.3.1.16またはEC 2.3.1.174）を用いて、4-ヒドロキシブチリル-CoAから3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAを酵素的に合成すること、および3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAを6-ヒドロキシヘキサノエートに酵素的に変換することを含む。β-ケトチオラーゼは、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：13、またはSEQ ID NO：14に示されるアミノ酸配列と少なくとも70％の配列同一性を有し得る。3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAは、3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼまたは3-オキソアシル-CoAレダクターゼを用いて、3-ヒドロキシ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAに変換され得、3-ヒドロキシ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAは、エノイル-CoAヒドラターゼを用いて、2,3-デヒドロ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAに変換され得、2,3-デヒドロ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAは、トランス-2-エノイル-CoAレダクターゼを用いて、6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAに変換され得、および6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAは、チオエステラーゼまたはCoAトランスフェラーゼを用いて、6-ヒドロキシヘキサノエートに変換され得る。
本方法のいずれかは、6-ヒドロキシヘキサノエートを、1つまたは複数の段階で、アジピン酸、6-アミノヘキサノエート、カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン、または1,6-ヘキサンジオールに酵素的に変換することをさらに含み得る。
例えば、6-ヒドロキシヘキサノエートは、モノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブタン酸デヒドロゲナーゼ、5-ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼ、6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、7-オキソヘプタン酸デヒドロゲナーゼ、6-オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、5-オキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、またはアルデヒドデヒドロゲナーゼの1つもしくは複数を用いて、アジピン酸に酵素的に変換され得る。
例えば、6-ヒドロキシヘキサノエートは、アルコールデヒドロゲナーゼ、6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、5-ヒドロキシペンタン酸デヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、およびω-トランスアミナーゼの1つもしくは複数を用いて、6-アミノヘキサノエートに変換され得る。ω-トランスアミナーゼは、SEQ ID NO：7〜12に示されるアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも70％の配列同一性を有し得る。
例えば、6-ヒドロキシヘキサノエートは、アルコールデヒドロゲナーゼ、6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、5-ヒドロキシペンタン酸デヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、ω-トランスアミナーゼ、およびアミドヒドロラーゼの1つもしくは複数を用いて、カプロラクタムに変換され得る。ω-トランスアミナーゼは、SEQ ID NO：7〜12に示されるアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも70％の配列同一性を有し得る。
例えば、6-ヒドロキシヘキサノエートは、カルボン酸レダクターゼ、ω-トランスアミナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、N-アセチルトランスフェラーゼ、およびアセチルプトレシンデアシラーゼの1つもしくは複数を用いて、ヘキサメチレンジアミンに変換され得る。ω-トランスアミナーゼは、SEQ ID NO：7〜12に示されるアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも70％の配列同一性を有し得る。
例えば、6-ヒドロキシヘキサノエートは、カルボン酸レダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼを用いて、1,6-ヘキサンジオールに変換され得る。カルボン酸レダクターゼは、SEQ ID NO：2〜6に示されるアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも70％の配列同一性を有し得る。
方法のいずれかにおいて、4-ヒドロキシブチリル-CoAは、2-オキソグルタレートから酵素的に産生され得る。例えば、4-ヒドロキシブチリル-CoAは、グルタミン酸シンターゼ；2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ；分枝鎖デカルボキシラーゼ；グルタミン酸デカルボキシラーゼ；ω-トランスアミナーゼ；CoAトランスフェラーゼ、CoAリガーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼの1つもしくは複数を用いて、2-オキソグルタレートから酵素的に産生され得る。
本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、アジピン酸は、（i）EC 1.2.1.3に分類されるアルデヒドデヒドロゲナーゼ、（ii）ChnEによってコードされるものなどの、EC 1.2.1.63に分類される6-オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼもしくはEC 1.2.1.-に分類される7-オキソヘプタン酸デヒドロゲナーゼ（例えば、ThnGの遺伝子産物）、または（iii）シトクロムP450ファミリーにおけるモノオキシゲナーゼを用いて、アジピン酸セミアルデヒド（6-オキソヘキアノエートとしても知られる）における第2の末端官能基を形成することによって産生され得る。
本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、6-アミノヘキサン酸は、EC 2.61.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48、またはEC 2.6.1.82に分類されるω-トランスアミナーゼを用いて、アジピン酸セミアルデヒドにおける第2の末端官能基を形成することによって産生され得る。
本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、カプロラクタムは、EC 3.5.2.-に分類されるアミドヒドロラーゼを用いて、6-アミノヘキサン酸から産生され得る。カプロラクタムと結合するアミド結合は、6-アミノヘキサノエートの末端カルボキシル基および末端アミノ基から産生される。
本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、ヘキサメチレンジアミンは、（i）EC 2.61.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48、もしくはEC 2.6.1.82に分類されるω-トランスアミナーゼを用いて、6-アミノヘキサナールにおける第2の末端官能基、または（ii）例えば、EC 3.5.1.17に分類されるデアシラーゼを用いて、N6-アセチル-1,6-ジアミノヘキサンにおける第2の末端官能基を形成することによって産生され得る。
本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、1,6-ヘキサンジオールは、YMR318C、YqhD、またはCAA81612.1によってコードされるものなどの、EC 1.1.1.-に分類されるアルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、EC 1.1.1.1、1.1.1.2、1.1.1.21、または1.1.1.184）を用いて、6-ヒドロキシヘキサナールにおける第2の末端官能基を形成することによって産生され得る。
いくつかの態様において、生物学的フィードストックは、単糖、二糖、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、リグニン、レブリン酸およびギ酸、トリグリセリド、グリセロール、脂肪酸、農業廃棄物、濃縮された蒸留可溶分、もしくは一般廃棄物であり得るか、またはそれらに由来し得る。
いくつかの態様において、非生物学的フィードストックは、天然ガス、合成ガス、CO2/H2、メタノール、エタノール、ベンゾエート、シクロヘキサン酸化プロセスからの不揮発性残留物（NVR）もしくは腐食性洗浄廃棄物ストリーム、もしくはテレフタル酸／イソフタル酸混合物の廃棄物ストリームであり得るか、またはそれらに由来し得る。
いくつかの態様において、高濃度の1つまたは複数のC6ビルディングブロックに対する宿主微生物の耐性は、選択的環境における連続培養を介して改良される。
いくつかの態様において、宿主微生物の生化学的ネットワークは、（1）アセチル-CoAおよび4-ヒドロキシブチリル-CoAの細胞内利用能を保証するため、（2）1つまたは複数のC6ビルディングブロックの形成を介してのみ均衡され得るNADHまたはNADPHの不均衡を形成するため、（3）C6ビルディングブロックを生じ、およびそれを含む、中心的代謝物、中心的前駆体の分解を妨げるため、ならびに（4）細胞からの効率的な流出を保証するため、減弱または増強される。
いくつかの態様において、培養ストラテジーは、嫌気性、微好気性、または好気性の培養条件を達成するために使用される。
いくつかの態様において、培養ストラテジーは、制限窒素、リン酸、または酸素などの制限栄養を含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC6ビルディングブロックは、例えば、発酵ストラテジーを用いて、例えば、1つまたは複数の外因性核酸を含む組換え宿主などの単一型の微生物によって産生される。
別の局面において、本明細書は、（i）β-ケトチオラーゼ、（ii）チオエステラーゼまたはCoAトランスフェラーゼ、および（iii）3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼまたは3-オキソアシル-CoAレダクターゼの1つまたは複数、（iv）エノイル-CoAヒドラターゼ、および（v）トランス-2-エノイル-CoAレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸を含み、6-ヒドロキシヘキサノエートを産生する、組換え宿主を特徴とする。
6-ヒドロキシヘキサノエートを産生する宿主は、以下の外因性酵素：モノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブタン酸デヒドロゲナーゼ、5-ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼ、6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、7-オキソヘプタン酸デヒドロゲナーゼ、6-オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、5-オキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、またはアルデヒドデヒドロゲナーゼの1つもしくは複数をさらに含み得、アジピン酸をさらに産生し得る。
6-ヒドロキシヘキサノエートを産生する宿主は、以下の外因性酵素：モノオキシゲナーゼ、トランスアミナーゼ、6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、5-ヒドロキシペンタン酸デヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼの1つもしくは複数をさらに含み得、6-アミノヘキサノエートをさらに産生し得る。そのような宿主は、外因性アミドヒドロラーゼを含み得、カプロラクタムをさらに産生し得る。
6-ヒドロキシヘキサノエートを産生する宿主は、以下の外因性酵素：カルボン酸レダクターゼ、ω-トランスアミナーゼ、デアシラーゼ、N-アセチルトランスフェラーゼ、またはアルコールデヒドロゲナーゼの1つもしくは複数をさらに含み得、ヘキサメチレンジアミンをさらに産生し得る。
6-ヒドロキシヘキサノエートを産生する宿主は、外因性カルボン酸レダクターゼおよび外因性アルコールデヒドロゲナーゼをさらに含み得、1,6-ヘキサンジオールをさらに産生し得る。
本明細書に記載される組換え宿主のいずれかは、以下の外因性酵素：グルタミン酸シンターゼ；2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ；分枝鎖デカルボキシラーゼ；グルタミン酸デカルボキシラーゼ；ω-トランスアミナーゼ；CoA-リガーゼ；CoA-トランスフェラーゼ；およびアルコールデヒドロゲナーゼの1つもしくは複数をさらに含み得る。
組換え宿主のいずれかは、大腸菌属（Escherichia）；クロストリジウム属（Clostridia）；コリネバクテリウム属（Corynebacteria）；カプリアビダス属（Cupriavidus）；シュードモナス属（Pseudomonas）；デルフチア属（Delftia）；バチルス属（Bacilluss）；ラクトバチルス属（Lactobacillus）；ラクトコックス属（Lactococcus）；およびロドコッカス属（Rhodococcus）からなる群より選択される属に由来する原核生物などの原核生物であり得る。例えば、原核生物は、大腸菌（Escherichia coli）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）、クロストリジウム・クライベリ（Clostridium kluyveri）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）、カプリアビダス・メタリデュランス（Cupriavidus metallidurans）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleavorans）、デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtillis）、ラクトバチルス・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、およびロドコッカス・エクイ（Rhodococcus equi）からなる群れより選択され得る。そのような原核生物はまた、C6ビルディングブロックを産生可能な、本明細書に記載される組換え宿主細胞を構築するための遺伝子の起源となり得る。
組換え宿主のいずれかは、アスペルギルス属（Aspergillus）、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、ピキア属（Pichia）、ヤロウイア属（Yarrowia）、イサチェンキア属（Issatchenkia）、デバリオマイセス属（Debaryomyces）、アルクスラ属（Arxula）、およびクリベロマイセス属（Kluyveromyces）からなる群より選択される属に由来する真核生物などの真核生物であり得る。例えば、真核生物は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、イサチェンキア・オリエンタリス（Issathenkia orientalis）、デバリオマイセス・ハンセニ（Debaryomyces hansenii）、アルクスラ・アデニニボランス（Arxula adenoinivorans）、およびクリベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）からなる群より選択され得る。そのような真核生物はまた、C6ビルディングブロックを産生可能な、本明細書に記載される組換え宿主細胞を構築するための遺伝子の起源となり得る。
本明細書に記載される組換え宿主のいずれかは、以下の酵素：ポリヒドロキシアルカン酸シンターゼ、アセチル-CoAチオエステラーゼ、アセテートを形成するホスホトランスアセチラーゼ、酢酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、メナキノール-フマル酸オキシドレダクターゼ、エタノールを形成するアルコールデヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、NADH消費トランスヒドロゲナーゼ、NADH特異的グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、NADH／NADPH利用グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ピメロイル-CoAデヒドロゲナーゼ；基質として中心的前駆体およびC6ビルディングブロックを受容するアシル-CoAデヒドロゲナーゼ；ブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ；またはアジピル-CoAシンセターゼの1つもしくは複数の減弱化をさらに含み得る。
本明細書に記載される組換え宿主のいずれかは、アセチル-CoAシンセターゼ；6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ；トランスケトラーゼ；プリジン（puridine）ヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ；グリセルアルデヒド-3P-デヒドロゲナーゼ；リンゴ酸酵素；グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ；グルコースデヒドロゲナーゼ；フルクトース1,6ジホスファターゼ；L-アラニンデヒドロゲナーゼ；L-グルタミン酸デヒドロゲナーゼ；ギ酸デヒドロゲナーゼ；L-グルタミンシンセターゼ；ジアミントランスポーター；ジカルボン酸トランスポーター；および／または多剤トランスポーターをコードする、1つもしくは複数の遺伝子をさらに過剰発現し得る。
本明細書に記載される酵素の多くは、可逆反応を触媒し、関心対象の反応は、記載される反応の逆向きのものであり得る。図1〜図5に示される模式的な経路は、中間体の各々のための関心対象の反応を説明する。
いくつかの局面において、本明細書は、（a）β-ケトチオラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが、ポリペプチドの産生を指示する1つまたは複数の異種制御配列（heterologous control sequence）と機能的に結合され、且つβ-ケトチオラーゼ活性を有するポリペプチドが、（a）SEQ ID NO：1、13、または14のポリペプチドと少なくとも70％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される、前記ポリヌクレオチド；（b）ω-トランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが、ポリペプチドの産生を指示する1つまたは複数の異種制御配列と機能的に結合され、且つω-トランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドが、（a）SEQ ID NO：7〜12のポリペプチドと少なくとも70％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される、前記ポリヌクレオチド；カルボン酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが、ポリペプチドの産生を指示する1つまたは複数の異種制御配列と機能的に結合され、且つカルボン酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドが、（a）SEQ ID NO：2〜6のポリペプチドと少なくとも70％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される、前記ポリヌクレオチド；または（d）3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼ、3-オキソアシル-CoAレダクターゼ、エノイル-CoAヒドラターゼ、トランス-2-エノイル-CoAレダクターゼ、チオエステラーゼCoAトランスフェラーゼ、モノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブタン酸デヒドロゲナーゼ、5-ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼ、6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、7-オキソヘプタン酸デヒドロゲナーゼ、6-オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、5-オキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、5-ヒドロキシペンタン酸デヒドロゲナーゼ、ω-トランスアミナーゼ、アミドヒドロラーゼ、グルタミン酸シンターゼ；2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ；分枝鎖デカルボキシラーゼ；グルタミン酸デカルボキシラーゼ；ω-トランスアミナーゼ；CoAトランスフェラーゼ、CoAリガーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、核酸構築物および／または発現ベクターを特徴とする。いくつかの態様において、本開示は、上記の核酸構築物または発現ベクターを含む組成物を提供する。
1つの局面において、本明細書は、生物由来の6炭素化合物を産生するための方法を特徴とする。生物由来の6炭素化合物を産生するための方法は、生物由来の6炭素化合物の産生のための条件下でそのための十分な期間にわたり、本明細書に記載されるような組換え宿主を培養することまたは増殖させることを含み得、任意で、生物由来の6炭素化合物は、アジピン酸、6-アミノヘキサン酸、ヘキサメチレンジアミン、カプロラクタム、または1,6-ヘキサンジオール、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
1つの局面において、本明細書は、本明細書に記載される生物由来の6炭素化合物および生物由来の6炭素化合物以外の化合物を含む、組成物であって、生物由来の6炭素化合物が、アジピン酸、6-アミノヘキサン酸、ヘキサメチレンジアミン、カプロラクタム、または1,6-ヘキサンジオール、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、組成物を特徴とする。例えば、生物由来の6炭素化合物は、宿主細胞または生物の細胞性部分である。
本明細書はまた、生物由来のアジピン酸、6-アミノヘキサン酸、ヘキサメチレンジアミン、カプロラクタム、または1,6-ヘキサンジオール、およびそれらの組み合わせを含む、生物ベースのポリマーを特徴とする。
本明細書はまた、生物由来のアジピン酸、6-アミノヘキサン酸、ヘキサメチレンジアミン、カプロラクタム、または1,6-ヘキサンジオール、およびそれらの組み合わせを含む、生物ベースの樹脂、ならびに生物ベースの樹脂を成形することによって得られた成形産物を特徴とする。
別の局面において、本明細書は、生物由来のアジピン酸、6-アミノヘキサン酸、ヘキサメチレンジアミン、カプロラクタム、または1,6-ヘキサンジオールを、ポリマー産生反応において、それ自身または別の化合物と共に化学的に反応させることを含む、生物ベースのポリマーを産生するためのプロセスを特徴とする。
別の局面において、本明細書は、生物由来のアジピン酸、6-アミノヘキサン酸、ヘキサメチレンジアミン、カプロラクタム、または1,6-ヘキサンジオールを、樹脂産生反応において、それ自身または別の化合物と共に化学的に反応させることを含む、生物ベースの樹脂を産生するためのプロセスを特徴とする。
また、本明細書には、β-ケトチオラーゼ活性を有するポリペプチドを含む生化学的ネットワークであって、β-ケトチオラーゼ活性を有するポリペプチドが、4-ヒドロキシブチリル-CoAを3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAに酵素的に変換する、生化学的ネットワークが記載される。
生化学的ネットワークは、3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAを6-ヒドロキシヘキサノエートに酵素的に変換するための、3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、または3-オキソアシル-CoAレダクターゼ活性を有するポリペプチド、エノイル-CoAヒドラターゼ活性を有するポリペプチド、トランス-2-エノイル-CoAレダクターゼ活性を有するポリペプチド、およびチオエステラーゼまたはCoAトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをさらに含み得る。
生化学的ネットワークは、6-ヒドロキシヘキサノエートをアジピン酸に酵素的に変換するための、モノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブタン酸デヒドロゲナーゼ、5-ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼ、6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、7-オキソヘプタン酸デヒドロゲナーゼ、6-オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、5-オキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する1つもしくは複数のポリペプチドをさらに含み得る。
生化学的ネットワークは、6-ヒドロキシヘキサノエートを6-アミノヘキサン酸に酵素的に変換するための、ω-トランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをさらに含み得る。
生化学的ネットワークは、6-アミノヘキサン酸をカプロラクタムに酵素的に変換するための、アミドヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをさらに含み得る。
生化学的ネットワークは、6-ヒドロキシヘキサノエートをヘキサメチレンジアミンに酵素的に変換するための、ω-トランスアミナーゼまたはデアシラーゼ活性を有する1つもしくは複数のポリペプチドをさらに含み得る。
生化学的ネットワークは、6-ヒドロキシヘキサナールにおける第2の末端官能基を形成することによって、アルコールデヒドロゲナーゼ活性 1,6-ヘキサンジオールを有する1つもしくは複数のポリペプチドをさらに含み得る。
1つの局面において、生化学的ネットワークは、図1〜図5の少なくとも1つの基質、図1〜図5の少なくとも1つの酵素の活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの外因性核酸、および図1〜図5の少なくとも1つの産物を含む、非天然の生化学的ネットワークである。
本発明の1つの局面において、図1〜図5の少なくとも1つの化合物を形成するための段階が記載される。本発明の1つの局面において、図1〜図5の少なくとも1つの化合物を形成するための手段が記載される。また、本明細書には、β-ケトチオラーゼ、3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼ、3-オキソアシル-CoAレダクターゼ、エノイル-CoAヒドラターゼ、トランス-2-エノイル-CoAレダクターゼ、チオエステラーゼもしくはCoAトランスフェラーゼ、モノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブタン酸デヒドロゲナーゼ、5-ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼ、6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、7-オキソヘプタン酸デヒドロゲナーゼ、6-オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、5-オキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ω-トランスアミナーゼ、アミドヒドロラーゼ、ω-トランスアミナーゼ、またはデアシラーゼ活性を有する1つもしくは複数のポリペプチドを用いて、アジピン酸、6-アミノヘキサン酸、ヘキサメチレンジアミン、カプロラクタム、または1,6-ヘキサンジオールを得るための手段が記載される。
別の局面において、本明細書は、β-ケトチオラーゼ、3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼ、3-オキソアシル-CoAレダクターゼ、エノイル-CoAヒドラターゼ、トランス-2-エノイル-CoAレダクターゼ、チオエステラーゼもしくはCoAトランスフェラーゼ、モノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブタン酸デヒドロゲナーゼ、5-ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼ、6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、7-オキソヘプタン酸デヒドロゲナーゼ、6-オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、5-オキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ω-トランスアミナーゼ、アミドヒドロラーゼ、ω-トランスアミナーゼ、またはデアシラーゼ活性を有する1つもしくは複数のポリペプチド、およびアジピン酸、6-アミノヘキサン酸、ヘキサメチレンジアミン、カプロラクタム、または1,6-ヘキサンジオールの少なくとも1つを含む、組成物を特徴とする。組成物は細胞性であり得る。
当業者は、カルボン酸基を含む化合物（有機一酸、ヒドロキシ酸、アミノ酸、およびジカルボン酸を含むが、これらに限定されない）が、形成されるか、または親化合物に酸性プロトンが存在する場合に、いずれかが、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、もしくはアルミニウムイオンなどの金属イオンによって置き換えられるか；または有機塩基と配位する、それらのイオン性塩形態に変換されることを理解する。許容される有機塩基は、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、N-メチルグルカミンなどを含むが、これらに限定されない。許容される無機塩基は、水酸化アルミニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムなどを含むが、これらに限定されない。本発明の塩は、塩として単離されるか、または酸の添加もしくは酸性イオン交換樹脂を用いた処置を介して、pKaより低い値までpHを減少させることによって遊離酸に変換される。
当業者は、アミン基を含む化合物（有機アミン、アミノ酸、およびジアミンを含むが、これらに限定されない）が、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸と共に形成されるか；または酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、3-（4-ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、1,2-エタンジスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、2-ナフタレンスルホン酸、4-メチルビシクロ-[2.2.2]オクト-2-エン-1-カルボン酸、グルコヘプトン酸、4,4'-メチレンビス-（3-ヒドロキシ-2-エン-1-カルボン酸）、3-フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、三級ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸などを含むが、これらに限定されない有機酸と共に形成される、例えば、アンモニウム塩を形成するためにアミンに酸性プロトンを添加することによって、形成されるか、またはそれらのイオン性塩形態に変換されることを理解する。許容される無機塩基は、水酸化アルミニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムなどを含むが、これらに限定されない。本発明の塩は、塩として単離されるか、または塩基の添加もしくは塩基性イオン交換樹脂を用いた処置を介して、pKbより高い値までpHを増加させることによって遊離アミンに変換される。
当業者は、アミン基およびカルボン酸基の両方を含む化合物（アミノ酸を含むが、これに限定されない）が、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などを含むが、これらに限定されない無機酸と共に形成されるか；または酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、3-（4-ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、1,2-エタンジスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、2-ナフタレンスルホン酸、4-メチルビシクロ-[2.2.2]オクト-2-エン-1-カルボン酸、グルコヘプトン酸、4,4'-メチレンビス-（3-ヒドロキシ-2-エン-1-カルボン酸）、3-フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、三級ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸などを含むが、これらに限定されない有機酸と共に形成される、いずれかの1）酸添加塩によって、形成されるか、またはそれらのイオン性塩形態に変換されることを理解する。許容される無機塩基は、水酸化アルミニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムなどを含むが、これらに限定されず、または、2）親化合物に酸性プロトンが存在する場合に、いずれかが、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、もしくはアルミニウムイオンなどの金属イオンによって置き換えられるか；または有機塩基と配位する。許容される有機塩基は、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、N-メチルグルカミンなどを含むが、これらに限定されない。許容される無機塩基は、水酸化アルミニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムなどを含むが、これらに限定されない。本発明の塩は、塩として単離されるか、または酸の添加もしくは酸性イオン交換樹脂を用いた処置を介して、pKaより低い値までpHを減少させることによって遊離酸に変換される。
定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料が、本発明を実施するために使用され得るが、適切な方法および材料が以下に記載される。本明細書に記載される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の文献は、参照によりその全体が組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が制御する。加えて、材料、方法、および例は、説明のみのためのものであり、限定することを意図してはいない。
本発明の1つまたは複数の態様の詳細は、添付の図面および以下の説明に示される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、記載される説明および図面を含む明細書、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。特許請求の範囲における「を含む（comprising）」の用語は、特許法の通常のプラクティスに従い、「から本質的になる（consisting essentially of）」または「からなる（consisting of）」によって置き換えられ得る。
図1は、中心的代謝物として2-オキソグルタレートを用いて、6-ヒドロキシヘキサノエートを生じる、例示的な生化学的経路の図である。 図2は、中心的前駆体として6-ヒドロキシヘキサノエートを用いて、アジピン酸を生じる、例示的な生化学的経路の図である。 図3は、中心的前駆体として6-ヒドロキシヘキサノエートを用いて、6-アミノヘキサノエートを生じる、例示的な生化学的経路の図、および6-アミノヘキサノエートからカプロラクタムを生じる、例示的な生化学的経路の図である。 図4は、中心的前駆体として6-アミノヘキサノエート、6-ヒドロキシヘキサノエート、アジピン酸セミアルデヒド、または1,6-ヘキサンジオールを用いて、ヘキサメチレンジアミンを生じる、例示的な生化学的経路の図である。 図5は、中心的前駆体として6-ヒドロキシヘキサノエートを用いて、1,6-ヘキサンジオールを生じる、例示的な生化学的経路の図である。 カプリアビダス・ネカトールβ-ケトチオラーゼ（GenBank Accession No. AAC38322.1、SEQ ID NO：1参照）のアミノ酸配列を含む。 マイコバクテリウム・マリヌム（Mycobacterium marinum）カルボン酸レダクターゼ（Genbank Accession No. ACC40567.1、SEQ ID NO：2参照）のアミノ酸配列を含む。 マイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）カルボン酸レダクターゼ（Genbank Accession No. ABK71854.1、SEQ ID NO：3参照）のアミノ酸配列を含む。 セグニリパルス・ルゴサス（Segniliparus rugosus）カルボン酸レダクターゼ（Genbank Accession No. EFV11917.1、SEQ ID NO：4参照）のアミノ酸配列を含む。 マイコバクテリウム・マシリエンス（Mycobacterium massiliense）カルボン酸レダクターゼ（Genbank Accession No. EIV11143.1、SEQ ID NO：5参照）のアミノ酸配列を含む。 セグニリパルス・ロツンダス（Segniliparus rotundus）カルボン酸レダクターゼ（Genbank Accession No. ADG98140.1、SEQ ID NO：6参照）のアミノ酸配列を含む。 クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）ω-トランスアミナーゼ（Genbank Accession No. AAQ59697.1、SEQ ID NO：7参照）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）ω-トランスアミナーゼ（Genbank Accession No. AAG08191.1、SEQ ID NO：8参照）のアミノ酸配列を含む。 シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）ω-トランスアミナーゼ（Genbank Accession No. AAY39893.1、SEQ ID NO：9参照）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）ω-トランスアミナーゼ（Genbank Accession No. ABA81135.1、SEQ ID NO：10参照）のアミノ酸配列を含む。 大腸菌ω-トランスアミナーゼ（Genbank Accession No. AAA57874.1、SEQ ID NO：11参照）、ビブリオ・フルビアリス（Vibrio fluvialis）ω-トランスアミナーゼ（Genbank Accession No. AEA39183.1、SEQ ID NO：12参照）のアミノ酸配列を含む。 大腸菌β-ケトチオラーゼ（GenBank Accession No. AAC74479.1、SEQ ID NO：13参照）、クロストリジウム・アミノブチリカム（Clostridium aminobutyricum）CoA-トランスフェラーゼ（GenBank Accession No. CAB60036.2、SEQ ID NO：14参照）のアミノ酸配列を含む。 トレポネーマ・デンチコラ（Treponema denticola）エノイル-CoAレダクターゼ（GenBank Accession No. AAS11092.1、SEQ ID NO：15参照）、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）エノイル-CoAレダクターゼ（GenBank Accession No. AAW66853.1、SEQ ID NO：16参照）のアミノ酸配列を含む。 サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）デカルボキシラーゼ（GenBank Accession No. CAC48239.1、SEQ ID NO：17参照）のアミノ酸配列を含む。 図7は、酵素のみの対照（基質なし）におけるNADPHの消費およびカルボン酸レダクターゼの活性の測定である、20分後の340 nmでの吸光度の変化の概要を示す棒グラフである。 図8は、空ベクターの対照と比較した6-ヒドロキシヘキサノエートを6-ヒドロキシヘキサナールに変換するためのNADPHの消費およびカルボン酸レダクターゼの活性の測定である、20分後の340 nmでの吸光度の変化の棒グラフである。 図9は、空ベクターの対照と比較したN6-アセチル-6-アミノヘキサノエートをN6-アセチル-6-アミノヘキサナールに変換するためのNADPHの消費およびカルボン酸レダクターゼの活性の測定である、20分後の340 nmでの吸光度の変化の棒グラフである。 図10は、空ベクターの対照と比較したアジピン酸セミアルデヒドをヘキサンジアールに変換するためのNADPHの消費およびカルボン酸レダクターゼの活性の測定である、20分後の340 nmでの吸光度の変化の棒グラフである。 図11は、酵素のみの対照（基質なし）におけるω-トランスアミナーゼ活性の測定として、ピルベートからL-アラニン（mol/mol）への4時間後の変換％の概要を示す棒グラフである。 図12は、空ベクターの対照と比較した6-アミノヘキサノエートをアジピン酸セミアルデヒドに変換するためのω-トランスアミナーゼ活性の測定として、ピルベートからL-アラニン（mol/mol）への24時間後の変換％の棒グラフである。 図13は、空ベクターの対照と比較したアジピン酸セミアルデヒドを6-アミノヘキサノエートに変換するためのω-トランスアミナーゼの測定として、L-アラニンからピルベート（mol/mol）への4時間後の変換％の棒グラフである。 図14は、空ベクターの対照と比較したヘキサメチレンジアミンを6-アミノヘキサナールに変換するためのω-トランスアミナーゼ活性の測定として、ピルベートからL-アラニン（mol/mol）への4時間後の変換％の棒グラフである。 図15は、空ベクターの対照と比較したN6-アセチル-1,6-ジアミノヘキサンをN6-アセチル-6-アミノヘキサナールに変換するためのω-トランスアミナーゼ活性の測定として、ピルベートからL-アラニン（mol/mol）への4時間後の変換％の棒グラフである。 図16は、空ベクターの対照と比較した6-アミノヘキサノールを6-オキソヘキサノールに変換するためのω-トランスアミナーゼ活性の測定として、ピルベートからL-アラニン（mol/mol）への4時間後の変換％の棒グラフである。
詳細な説明
一般に、本明細書は、6-ヒドロキシヘキサノエート、または本明細書においてその全てがC6ビルディングブロックとして呼ばれる、アジピン酸、カプロラクタム、6-アミノヘキサン酸、ヘキサメチレンジアミン、もしくは1,6-ヘキサンジオールの1つもしくは複数を産生するための、酵素、非天然の経路、培養ストラテジー、フィードストック、宿主微生物、および宿主の生化学的ネットワークの減弱化を提供する。本明細書において使用されるように、用語「中心的前駆体（central precursor）」は、C6ビルディングブロックの合成を生じる、本明細書に示される任意の代謝経路における任意の代謝物を示すために使用される。本明細書において、用語「中心的代謝物（central metabolite）」は、増殖をサポートするために全ての微生物において産生される代謝物を示すために使用される。
本明細書に記載される宿主微生物は、6-ヒドロキシヘキサノエートまたは1つもしくは複数の他のC6ビルディングブロックが産生され得るように操作され得る、内因性経路を含み得る。内因性経路において、宿主微生物は、経路内の反応を触媒する酵素の全てを天然に発現する。操作された経路を含む宿主微生物は、経路内の反応を触媒する酵素の全てを天然に発現しないが、経路内の酵素の全てが宿主において発現されるように操作されている。
核酸（またはタンパク質）および宿主に関して、本明細書において使用される用語「外因性」は、それが天然に見出されるようなその特定の型の細胞内には生じない（およびその細胞からは得られ得ない）核酸、またはそのような核酸によってコードされるタンパク質を意味する。したがって、非天然の核酸は、宿主内にある場合、宿主に対して外因性であると考慮される。非天然の核酸は、核酸が全体として天然に存在しないという条件で、天然に見出される核酸サブ配列または核酸配列断片を含み得ることに注意することが重要である。例えば、発現ベクター内のゲノムDNA配列を含む核酸分子は、非天然の核酸であり、したがって、宿主に導入された場合、核酸分子は全体（ゲノムDNA＋ベクターDNA）として天然に存在しないことから、宿主細胞に対して外因性である。したがって、全体として天然に存在しない任意のベクター、自己複製プラスミド、またはウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）は、非天然の核酸であると考慮される。PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって産生されるゲノムDNA断片およびcDNAは、それらが、天然に見出されない別々の分子として存在することから、非天然の核酸であると考慮されることになる。また、天然に見られない配置でプロモーター配列およびポリペプチドコード配列を含む任意の核酸（例えば、cDNAまたはゲノムDNA）は、非天然の核酸であると考慮されることになる。天然に生じる核酸は、特定の宿主微生物に対して外因性であり得る。例えば、酵母xの細胞から単離された全体の染色体は、一旦染色体が酵母yの細胞中に導入された場合、酵母yの細胞に関して外因性の核酸である。
対照的に、核酸（例えば、遺伝子）（またはタンパク質）および宿主に関して、本明細書において使用される用語「内因性」は、それが天然に見出されるようなその特定の宿主内に生じる（およびその宿主から得られ得る）核酸（またはタンパク質）を意味する。さらに、核酸（またはタンパク質）を「内因性に発現する」細胞は、それが天然に見出されるように同じ特定の型の宿主のように、核酸（またはタンパク質）を発現する。さらに、核酸、タンパク質、もしくは他の化合物を「内因性に産生する（endogenously producing）」または「内因性に産生する（endogenously produces）」宿主は、それが天然に見出されるように同じ特定の型の宿主のように、その核酸、タンパク質、もしくは化合物を産生する。
例えば、宿主および宿主によって産生される化合物に応じて、以下の酵素：3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼ、3-オキソアシル-CoAレダクターゼ、エノイル-CoAヒドラターゼ、トランス-2-エノイル-CoAレダクターゼ、チオエステラーゼ、CoAトランスフェラーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、モノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、6-オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、7-オキソヘプタン酸デヒドロゲナーゼ、ωトランスアミナーゼ、6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、5-ヒドロキシペンタン酸デヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、カルボン酸レダクターゼ、デアシラーゼ、N-アセチルトランスフェラーゼ、ω-トランスアミナーゼ、またはアミドヒドロラーゼの1つもしくは複数が、β-ケトチオラーゼに加えて、宿主内で発現され得る。カルボン酸レダクターゼを発現する組換え宿主において、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼはまた、それがカルボン酸レダクターゼの活性を増強するように発現され得る。モノオキシゲナーゼを発現する組換え宿主において、オキシドレダクターゼおよびフェレドキシンポリペプチドなどの電子伝達鎖タンパク質もまた、発現され得る。
例えば、組換え宿主は、外因性β-ケトチオラーゼを含み得、6-ヒドロキシヘキサノエートに変換され得る3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAを産生し得る。
例えば、組換え宿主は、外因性β-ケトチオラーゼおよび外因性チオエステラーゼもしくはCoA-トランスフェラーゼ、ならびに以下の外因性酵素：3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼもしくは3-オキソアシル-CoAレダクターゼ、エノイル-CoAヒドラターゼ、およびトランス-2-エノイル-CoAレダクターゼの1つもしくは複数を含み得、6-ヒドロキシヘキサノエートを産生し得る。例えば、組換え宿主は、外因性β-ケトチオラーゼ、外因性チオエステラーゼもしくはCoA-トランスフェラーゼ、エノイル-CoAヒドラターゼ、外因性トランス-2-エノイル-CoAレダクターゼ、および外因性3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼもしくは外因性3-オキソアシル-CoAレダクターゼを含み得、6-ヒドロキシヘキサノエートを産生し得る。
例えば、6-ヒドロキシヘキサノエートを産生する組換え宿主は、以下の外因性酵素:モノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、5-ヒドロキシペンタン酸デヒドロゲナーゼ、6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、7-オキソヘプタン酸デヒドロゲナーゼ、5-オキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、6-オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、またはアルデヒドデヒドロゲナーゼの1つもしくは複数を含み得、アジピン酸をさらに産生し得る。例えば、6-ヒドロキシヘキサノエートを産生する組換え宿主は、外因性モノオキシゲナーゼを含み得、アジピン酸を産生し得る。例えば、6-ヒドロキシヘキサノエートを産生する組換え宿主は、外因性6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼを含み得、アジピン酸を産生し得る。例えば、6-ヒドロキシヘキサノエートを産生する組換え宿主は、外因性アルコールデヒドロゲナーゼ、および以下の外因性酵素:5-オキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、6-オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、または7-オキソヘプタン酸デヒドロゲナーゼの1つを含み得、アジピン酸を産生し得る。
例えば、6-ヒドロキシヘキサノエートを産生する組換え宿主は、以下の外因性酵素:アルコールデヒドロゲナーゼ、6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、またはトランスアミナーゼの1つもしくは複数を含み得、6-アミノヘキサノエートをさらに産生し得る。例えば、6-ヒドロキシヘキサノエートを産生する組換え宿主は、外因性アルコールデヒドロゲナーゼおよび外因性トランスアミナーゼを含み得、6-アミノヘキサノエートを産生し得る。例えば、6-ヒドロキシヘキサノエートを産生する組換え宿主は、外因性 6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼおよび外因性トランスアミナーゼを含み得、6-アミノヘキサノエートを産生し得る。そのような任意の宿主は、外因性アミドヒドロラーゼをさらに含み得、カプロラクタムをさらに産生し得る。
例えば、6-ヒドロキシヘキサノエートを産生する組換え宿主は、以下の外因性酵素：カルボン酸レダクターゼ、ω-トランスアミナーゼ、デアシラーゼ、N-アセチルトランスフェラーゼ、またはアルコールデヒドロゲナーゼの1つもしくは複数を含み得、ヘキサメチレンジアミンを産生し得る。例えば、6-ヒドロキシヘキサノエートを産生する組換え宿主は、外因性カルボン酸レダクターゼ、外因性アルコールデヒドロゲナーゼ、および1つもしくは複数の外因性トランスアミナーゼ（例えば、1つのトランスアミナーゼまたは2つの異なるトランスアミナーゼ）を含み得、ヘキサメチレンジアミンを産生し得る。例えば、6-ヒドロキシヘキサノエートを産生する組換え宿主は、外因性カルボン酸レダクターゼおよび1つもしくは複数の外因性トランスアミナーゼ（例えば、1つのトランスアミナーゼまたは2つの異なるトランスアミナーゼ）を含み得、ヘキサメチレンジアミンを産生し得る。例えば、6-ヒドロキシヘキサノエートを産生する組換え宿主は、外因性アルコールデヒドロゲナーゼ、外因性カルボン酸レダクターゼ、および1つもしくは複数の外因性トランスアミナーゼ（例えば、1つのトランスアミナーゼ、または2つもしくは3つの異なるトランスアミナーゼ）を含み得、ヘキサメチレンジアミンを産生し得る。例えば、6-ヒドロキシヘキサノエートを産生する組換え宿主は、外因性アルコールデヒドロゲナーゼ、外因性N-アセチルトランスフェラーゼ、カルボン酸レダクターゼ、デアシラーゼ、および1つもしくは複数の外因性トランスアミナーゼ（例えば、1つのトランスアミナーゼまたは2つの異なるトランスアミナーゼ）を含み得、ヘキサメチレンジアミンを産生し得る。
例えば、6-ヒドロキシヘキサノエートを産生する組換え宿主は、以下の外因性酵素：カルボン酸レダクターゼおよび外因性アルコールデヒドロゲナーゼの1つもしくは複数を含み得、1,6-ヘキサンジオールをさらに産生し得る。
任意の組換え宿主において、組換え宿主はまた、2-オキソグルタレートを4-ヒドロキシブチリル-CoAに変換するために使用される以下の外因性酵素：グルタミン酸シンターゼ；2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ；分枝鎖デカルボキシラーゼ；グルタミン酸デカルボキシラーゼ；CoA-リガーゼ；CoA-トランスフェラーゼ；ω-トランスアミナーゼ；およびアルコールデヒドロゲナーゼの1つもしくは複数（例えば、1つ、2つ、3つ、または4つ）を含み得る。例えば、組換え宿主は、外因性グルタミン酸シンターゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ；CoA-リガーゼもしくはCoA-トランスフェラーゼ；ω-トランスアミナーゼ；およびアルコールデヒドロゲナーゼを含み得る。例えば、組換え宿主は、外因性2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼもしくは分枝鎖デカルボキシラーゼ；CoA-リガーゼ；CoA-トランスフェラーゼ；およびアルコールデヒドロゲナーゼを含み得る。
操作された経路内で、酵素は、単一の起源、すなわち、1つの種もしくは属に由来し得、または複数の起源、すなわち、異なる種もしくは属に由来し得る。本明細書に記載される酵素をコードする核酸は、様々な生物から単離されており、GenBankまたはEMBLなどの公的に入手可能なデータベースにおいて容易に入手可能である。
本明細書において使用されるように、特定の酵素（例えば、β-ケトチオラーゼ）への言及は、特定の酵素の活性を有するポリペプチド（例えば、β-ケトチオラーゼ活性を有するポリペプチド）を意味する。
1つまたは複数のC6ビルディングブロックの産生のために使用され得る、本明細書に記載される任意の酵素は、対応する野生型酵素のアミノ酸配列に対して、少なくとも70％の配列同一性（相同性）（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％）を有し得る。配列同一性は、成熟酵素（例えば、任意のシグナル配列が除去されたもの）に基づき、または未成熟酵素（例えば、任意のシグナル配列が導入されたもの）に基づき、決定され得る。また、最初のメチオニン残基は、本明細書に記載される任意の酵素配列に存在しても、または存在しなくてもよい。
例えば、本明細書に記載されるβ-ケトチオラーゼ活性を有するポリペプチドは、カプリアビダス・ネカトール（GenBank Accession No. AAC38322.1、SEQ ID NO：1参照）、大腸菌（GenBank Accession No. AAC74479.1、SEQ ID NO：13参照）β-ケトチオラーゼ、またはクロストリジウム・アミノブチリカム（GenBank Accession No. CAB60036.2、SEQ ID NO：14参照）のアミノ酸配列に対して、少なくとも70％の配列同一性（相同性）（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％）を有し得る。図6参照。
例えば、本明細書に記載されるカルボン酸レダクターゼは、マイコバクテリウム・マリヌム（Genbank Accession No. ACC40567.1、SEQ ID NO：2参照）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Genbank Accession No. ABK71854.1、SEQ ID NO：3参照）、セグニリパルス・ルゴサス（Genbank Accession No. EFV11917.1、SEQ ID NO：4参照）、マイコバクテリウム・マシリエンス（Genbank Accession No. EIV11143.1、SEQ ID NO：5参照）、またはセグニリパルス・ロツンダス（Genbank Accession No. ADG98140.1、SEQ ID NO：6参照）カルボン酸レダクターゼのアミノ酸配列に対して、少なくとも70％の配列同一性（相同性）（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％）を有し得る。図6参照。
例えば、本明細書に記載されるω-トランスアミナーゼは、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Genbank Accession No. AAQ59697.1、SEQ ID NO：7参照）、シュードモナス・エルギノーサ（Genbank Accession No. AAG08191.1、SEQ ID NO：8参照）、シュードモナス・シリンゲ（Genbank Accession No. AAY39893.1、SEQ ID NO：9参照）、ロドバクター・スフェロイデス（Genbank Accession No. ABA81135.1、SEQ ID NO：10参照）、大腸菌（Genbank Accession No. AAA57874.1、SEQ ID NO：11参照）、またはビブリオ・フルビアリス（Genbank Accession No. AEA39183.1、SEQ ID NO：12参照）ω-トランスアミナーゼのアミノ酸配列に対して、少なくとも70％の配列同一性（相同性）（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％）を有し得る。これらのω-トランスアミナーゼのいくつかは、ジアミンω-トランスアミナーゼである。図6参照。
例えば、本明細書に記載されるエノイル-CoAレダクターゼは、トレポネーマ・デンチコラ（Genbank Accession No. AAS11092.1、SEQ ID NO：15参照）、またはユーグレナ・グラシリス（Genbank Accession No. AAW66853.1、SEQ ID NO：16参照）のアミノ酸配列に対して、少なくとも70％の配列同一性（相同性）（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％）を有し得る。図6参照。
例えば、本明細書に記載されるデカルボキシラーゼは、サルモネラ・チフィムリウム（Genbank Accession No. CAC48239.1、SEQ ID NO：17参照）のアミノ酸配列に対して、少なくとも70％の配列同一性（相同性）（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％）を有し得る。図6参照。
2つのアミノ酸配列間の同一性（相同性）％は、以下のように決定され得る。第一に、アミノ酸配列は、BLASTPバージョン2.0.14を含むBLASTZのスタンドアローンバージョンからのBLAST 2 Sequences（Bl2seq）プログラムを用いて整列される。このBLASTZのスタンドアローンバージョンは、Fish & Richardsonのウェブサイト（例えば、ワールドワイドウェブアドレスfr.com/blast/）または米国政府の全米バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）のウェブサイト（ワールドワイドウェブアドレスncbi.nlm.nih.gov）から入手され得る。Bl2seqプログラムの使用方法を説明する説明書は、BLASTZに添付されるリードミーファイルに見出され得る。Bl2seqは、BLASTPアルゴリズムを用いて、2つのアミノ酸配列間の比較を行う。2つのアミノ酸配列を比較するために、Bl2seqのオプションが、以下のようにセットされる：-iは、比較される第1のアミノ酸配列を含むファイルに設定され（例えば、C:＼seq1.txt）；-jは、比較される第2のアミノ酸配列を含むファイルに設定され（例えば、C:＼seq2.txt）；-pは、blastpに設定され；-oは、任意の所望のファイル名に設定され（例えば、C:＼output.txt）；および全ての他のオプションは、それらのデフォルト設定のままにされる。例えば、以下のコマンドは、2つのアミノ酸配列間の比較を含む出力ファイルを生成するために使用され得る：C:＼Bl2seq -i c:＼seq1.txt -j c:＼seq2.txt -p blastp -o c:＼output.txt。2つの比較された配列が相同性（同一性）を有する場合、その後、指定された出力ファイルは、整列された配列としてそれらの相同性の領域を存在するであろう。2つの比較された配列が相同性（同一性）を有しない場合、その後、指定された出力ファイルは、整列された配列を存在しないであろう。同様の処理は、blastnが使用されることを除き、核酸配列に対して以下であり得る。
整列されると、一致の数が、同一のアミノ酸残基が両方の配列に提示される位置の数を数えることによって決定される。同一性（相同性）％は、一致の数を、完全長のポリペプチドアミノ酸の長さで割り、その後、得られた値に100を掛けることによって決定される。同一性（相同性）％の値を小数第1位に丸めることに注意する。例えば、78.11、78.12、78.13、および78.14は、78.1に丸められ、78.15、78.16、78.17、78.18、および78.19は、78.2に丸められる。長さの値は、いつも整数であることにも注意する。
多数の核酸は、特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得ると考えられる。遺伝子コードの縮重は、当技術分野において周知であり；すなわち、多くのアミノ酸のために、そのアミノ酸のコドンとして作用する複数のヌクレオチドトリプレットが存在する。例えば、所与の酵素のためのコード配列におけるコドンは、特定の種（例えば、細菌または真菌）において最適な発現が得られるように、その種のための適切なコドンバイアスの表を用いて改変され得る。
本明細書に記載される任意の酵素の機能的断片はまた、本明細書の方法において使用され得る。本明細書において使用されるように、用語「機能的断片」は、対応する成熟、完全長、野生型タンパク質の活性の少なくとも25％（例えば、少なくとも30％；40％；50％；60％；70％；75％；80％；85％；90％；95％；98％；99％；100％；または100％さえ超える）を有するタンパク質のペプチド断片を意味する。機能的断片は、一般に、しかしいつもではないが、タンパク質の、機能的活性を有する連続領域を含み得る。
本明細書はまた、（i）本明細書の方法において使用される酵素の機能的変異体、および（ii）上記の機能的断片の機能的変異体を提供する。酵素および機能的断片の機能的変異体は、対応する野生型配列に対して追加、欠失、または置換を含み得る。置換を有する酵素は、一般に、最大で50個（例えば、最大で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、または50個）のアミノ酸置換（例えば、保存的置換）を有するであろう。これは、本明細書に記載される任意の酵素および機能的断片に適用される。保存的置換は、類似の特徴を有する別のものへの1つのアミノ酸の置換である。保存的置換は、以下の群：バリン、アラニン、およびグリシン；ロイシン、バリン、およびイソロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリン、システイン、およびトレオニン；リジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン内の置換を含む。非極性疎水性アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含む。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む。正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンを含む。負に荷電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。上記の極性、塩基性、または酸性群の1つのメンバーから同群の他のメンバーへの任意の置換は、保存的置換であると考えられ得る。対照的に、非保存的置換は、類似しない特徴を有する別のものへの1つのアミノ酸の置換である。
欠失変異体は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20個の（2もしくはそれ以上のアミノ酸の）アミノ酸セグメント、または非連続性の単一のアミノ酸を欠失し得る。付加（付加変異体）は、（a）本明細書に記載される任意の酵素またはその断片；および（b）内部または末端（CまたはN）の無関係または異種のアミノ酸配列を含む、融合タンパク質を含む。そのような融合タンパク質に関連して、用語「異種アミノ酸配列」は、（a）以外のアミノ酸配列を意味する。異種配列は、例えば、組換えタンパク質（例えば、FLAG、ポリヒスチジン（例えば、ヘキサヒスチジン）、ヘマグルチニン（HA）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、またはマルトース結合タンパク質（MBP））の精製のために使用される配列であり得る。異種配列はまた、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）などの検出可能マーカーとして有用なタンパク質であり得る。いくつかの態様において、融合タンパク質は、別のタンパク質に由来するシグナル配列を含む。特定の宿主細胞（例えば、酵母宿主細胞）において、標的タンパク質の発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を介して増加され得る。いくつかの態様において、融合タンパク質は、例えば、抗体産生のための免疫反応の誘導に有用な担体（例えば、KLH）、またはERもしくはゴルジ装置保留シグナルを含み得る。異種配列は、様々な長さであり得、いくつかの場合、異種配列が付けられた完全長の標的タンパク質より長い配列であり得る。
操作された宿主は、本明細書に記載される経路の酵素を全く天然に発現しないか、またはいくつか（例えば、1個もしくはそれ以上、2個もしくはそれ以上、3個もしくはそれ以上、4個もしくはそれ以上、5個もしくはそれ以上、または6個もしくはそれ以上）を天然に発現し得る。したがって、操作された宿主内の経路は、全ての外因性酵素を含み得、または内因性酵素および外因性酵素の両方を含み得る。操作された宿主の内因性遺伝子はまた、経路内の中間体において作用する他の酵素を介して、望ましくない代謝物の形成を妨げるために、または経路内の中間体の損失を妨げるために、破壊され得る。操作された宿主は、組換え宿主または組換え宿主細胞と呼ばれ得る。本明細書に記載されるように、組換え宿主は、本明細書に記載されるβ-ケトチオラーゼ、デヒドロゲナーゼ、シンターゼ、デカルボキシラーゼ、レダクターゼ、ヒドラターゼ、チオエステラーゼ、モノオキシゲナーゼ、チオエステラーゼ、アミドヒドロラーゼ、およびトランスアミナーゼの1つまたは複数をコードする核酸を含み得る。
加えて、C6ビルディングブロックの産生は、本明細書に記載される単離された酵素を用いて、酵素の起源として宿主微生物に由来する溶解物（例えば、細胞溶解物）を用いて、または酵素の起源として異なる宿主微生物に由来する複数の溶解物を用いて、インビトロで実施され得る。
本明細書に記載される経路の反応は、（a）1つもしくは複数の関連酵素を天然に発現する、（b）1つもしくは複数の関連酵素を発現するために遺伝的に操作された、または（c）1つもしくは複数の関連酵素を天然に発現し、且つ1つもしくは複数の関連酵素を発現するために遺伝的に操作された、1つもしくは複数の宿主株において実施され得る。または、関連酵素は、上記の型の宿主細胞から単離、精製、または抽出され得、精製または半精製された形態で使用され得る。さらに、そのような抽出物は、関連酵素の起源として使用され得る溶解物（例えば、細胞溶解物）を含む。本明細書に提供される方法において、全ての段階は、宿主細胞内で実施され得、全ての段階は、抽出された酵素を用いて実施され得、またはいくつかの段階が細胞内で実施され得、他の段階が抽出された酵素を用いて実施され得る。
6-ヒドロキシヘキサノエートを生成する酵素
図1に示されるように、6-ヒドロキシヘキサノエートは、β-ケトチオラーゼを用いて4-ヒドロキシブチリル-CoAから産生され得る、中間体3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAを介して、2-オキソグルタレートから生合成され得る。3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAは、3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼまたは3-オキソアシル-CoAデヒドロゲナーゼ、エノイル-CoAヒドラターゼ、トランス-2-エノイル-CoAレダクターゼ、およびチオエステラーゼまたはCoAトランスフェラーゼを用いて、6-ヒドロキシヘキサノエートに変換され得る。
いくつかの態様において、β-ケトチオラーゼは、bktBの遺伝子産物などのEC 2.3.1.16に分類され得、またはpaaJの遺伝子産物などのEC 2.3.1.174に分類され得る。カプリアビダス・ネカトール由来のbktBによってコードされるβ-ケトチオラーゼは、基質としてアセチル-CoAおよびブタノイル-CoAを受容し、CoA-活性化C6脂肪族骨格を形成する（例えば、Haywood et al., FEMS Microbiology Letters, 1988, 52:91-96；Slater et al., J. Bacteriol., 1998, 180（8）: 1979-1987参照）。大腸菌由来のpaaJによってコードされるβ-ケトチオラーゼは、基質としてスクシニル-CoAおよびアセチル-CoAを受容し、CoA-活性化骨格を形成する（Nogales et al., Microbiology, 2007, 153, 357-365）。例えば、図6におけるSEQ ID NO：1およびSEQ ID NO：13参照。
いくつかの態様において、3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼまたは3-オキソアシル-CoAデヒドロゲナーゼは、EC 1.1.1.-に分類され得る。例えば、3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼは、fadBの遺伝子産物などのEC 1.1.1.35に分類され得；hbdの遺伝子産物（3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼとも呼ばれ得る）などのEC 1.1.1.157に分類され得；またはphaBのアセチル-CoAレダクターゼ遺伝子産物などのEC 1.1.1.36に分類され得る（Liu & Chen, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2007, 76（5）: 1153-1159；Shen et al., Appl. Environ. Microbiol., 2011, 77（9）:2905-2915；Budde et al., J. Bacteriol., 2010, 192（20）:5319-5328）。
いくつかの態様において、3-オキソアシル-CoAレダクターゼは、fabGの遺伝子産物などのEC 1.1.1.100に分類され得る（Budde et al., J. Bacteriol., 2010, 192（20）:5319-5328；Nomura et al., Appl. Environ. Microbiol., 2005, 71（8）:4297-4306）。
いくつかの態様において、エノイル-CoAヒドラターゼは、crtの遺伝子産物などのEC 4.2.1.17に分類され得、またはphaJの遺伝子産物などのEC 4.2.1.119に分類され得る（Shen et al., 2011, 上記；Fukui et al., J. Bacteriol., 1998, 180（3）:667-673）。
いくつかの態様において、トランス-2-エノイル-CoAレダクターゼは、Egter（Nishimaki et al., J. Biochem., 1984, 95: 1315-1321；Shen et al., 2011, 上記）もしくはtdter（Bond-Watts et al., Biochemistry, 2012, 51 :6827-6837）の遺伝子産物などのEC 1.3.1.38もしくはEC 1.3.1.44、またはEC 1.3.1.8（Inui et al., Eur. J. Biochem., 1984, 142, 121-126）に分類され得る。
いくつかの態様において、6-ヒドロキシヘキサノエートの合成を生じる末端カルボキシル基は、EC 3.1.2.-に分類されるチオエステラーゼによって、6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAで酵素的に形成され、6-ヒドロキシヘキサノエートの産生を生じる。チオエステラーゼは、YciAまたはAcot13の遺伝子産物であり得る（Cantu et al., Protein Science, 2010, 19, 1281-1295；Zhuang et al., Biochemistry, 2008, 47（9）:2789-2796；Naggert et al., J. Biol. Chem., 1991, 266（17）: 11044-11050）。
いくつかの態様において、6-ヒドロキシヘキサノエートの合成を生じる末端カルボキシル基は、クロストリジウム・クライベリ由来のcat2の遺伝子産物、クロストリジウム・アミノブチリカム由来のabfTの遺伝子産物、またはクロストリジウム・ビリデ（Clostridium viride）由来の5-ヒドロキシペンタノエートCoA-トランスフェラーゼなどの、例えば、EC 2.8.3-に分類されるCoA-トランスフェラーゼによって、6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAで酵素的に形成される。
アジピン酸の生合成において末端カルボキシル基を生じる酵素
図2に示されるように、アジピン酸の産生を生じる末端カルボキシル基は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、5-オキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、6-オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、7-オキソヘプタン酸デヒドロゲナーゼ、またはモノオキシゲナーゼを用いて、酵素的に形成され得る。
いくつかの態様において、アジピン酸の合成を生じる第2の末端カルボキシル基は、EC 1.2.1.3に分類されるアルデヒドデヒドロゲナーゼによって、アジピン酸セミアルデヒドで酵素的に形成され得る（Guerrillot & Vandecasteele, Eur. J. Biochem., 1977, 81, 185-192）。図2参照。
いくつかの態様において、アジピン酸の合成を生じる第2の末端カルボキシル基は、CpnEの遺伝子産物などの、例えば、EC 1.2.1.20に分類される5-オキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、アシネトバクター属由来のChnEの遺伝子産物などの、例えば、EC 1.2.1.63に分類される6-オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、またはスフィンゴモナス・マクロゴリタビダ（Sphingomonas macrogolitabida）由来のThnGの遺伝子産物などの7-オキソヘプタン酸デヒドロゲナーゼなどの、EC 1.2.1.-によって、アジピン酸セミアルデヒドで酵素的に形成される（Iwaki et al., Appl. Environ. Microbiol., 1999, 65（11）, 5158-5162；Lopez-Sanchez et al., Appl. Environ. Microbiol., 2010, 76（1）, 110-118））。図2参照。
いくつかの態様において、アジピン酸の合成を生じる第2の末端カルボキシル基は、CYP4F3BなどのシトクロムP450ファミリーのモノオキシゲナーゼによって、アジピン酸セミアルデヒドで酵素的に形成される（例えば、Sanders et al., J. Lipid Research, 2005, 46（5）: 1001-1008；Sanders et al., The FASEB Journal, 2008, 22（6）:2064-2071参照）。図2参照。
ヘキサメチレンジアミンまたは6-アミノヘキサノエートの生合成において末端アミノ基を生じる酵素
図3および図4に示されるように、末端アミノ基は、ω-トランスアミナーゼまたはデアシラーゼを用いて、酵素的に形成され得る。
いくつかの態様において、6-アミノヘキサン酸の合成を生じる末端アミノ基は、例えば、EC 2.6.1.-、例えば、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Genbank Accession No. AAQ59697.1、SEQ ID NO：7）、シュードモナス・エルギノーサ（Genbank Accession No. AAG08191.1、SEQ ID NO：8）、シュードモナス・シリンゲ（Genbank Accession No. AAY39893.1、SEQ ID NO：9）、ロドバクター・スフェロイデス（Genbank Accession No. ABA81135.1、SEQ ID NO：10）、ビブリオ・フルビアリス（Genbank Accession No. AEA39183.1、SEQ ID NO：12）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、またはクロストリジウム・ビリデから得られるものなどの、EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48、またはEC 2.6.1.82に分類される、ω-トランスアミナーゼによって、アジピン酸セミアルデヒドで酵素的に形成される。図3参照。
本明細書に記載される方法および宿主において使用され得る、追加のω-トランスアミナーゼは、大腸菌に由来する（Genbank Accession No. AAA57874.1、SEQ ID NO：11）。例えば、EC 2.6.1.29またはEC 2.6.1.82に分類されるいくつかのω-トランスアミナーゼは、ジアミンω-トランスアミナーゼである（例えば、SEQ ID NO：11）。
クロモバクテリウム・ビオラセウム由来の可逆性ω-トランスアミナーゼ（Genbank Accession No. AAQ59697.1、SEQ ID NO：7）は、アミノ酸ドナーとして6-アミノヘキサン酸を受容する類似活性を示し、したがって、アジピン酸セミアルデヒドで第1の末端アミノ基を形成した（Kaulmann et al., Enzyme and Microbial Technology, 2007, 41, 628-637）。
ストレプトマイセス・グリセウス由来の可逆性4-アミノブビレート（4-aminobubyrate）：2-オキソグルタル酸トランスアミナーゼは、6-アミノヘキサノエートからアジピン酸セミアルデヒドへの変換のための活性を示した（Yonaha et al., Eur. J. Biochem., 1985, 146, 101-106）。
クロストリジウム・ビリデ由来の可逆性5-アミノ吉草酸トランスアミナーゼは、6-アミノヘキサノエートからアジピン酸セミアルデヒドへの変換のための活性を示した（Barker et al., J. Biol. Chem., 1987, 262（19）, 8994-9003）。
いくつかの態様において、ヘキサメチレンジアミンの合成を生じる第2の末端アミノ基は、例えば、EC 2.6.1.29に分類されるジアミントランスアミナーゼ、または大腸菌由来のYgjGの遺伝子産物などの、例えば、EC 2.6.1.82に分類されるジアミントランスアミナーゼ（Genbank Accession No. AAA57874.1、SEQ ID NO：12）によって、6-アミノヘキサナールで酵素的に形成される。SEQ ID NO：7〜10および11に示されるトランスアミナーゼはまた、ヘキサメチレンジアミンを産生するために使用され得る。図4参照。
ygjGの遺伝子産物は、プトレシン、カダベリン、およびスペルミジンなどの広範囲のジアミン炭素鎖長基質を受容する（Samsonova et al., BMC Microbiology, 2003, 3:2）。
大腸菌株B由来のジアミントランスアミナーゼは、1,7ジアミノヘプタンのための活性を示した（Kim, The Journal of Chemistry, 1964, 239（3）, 783-786）。
いくつかの態様において、ヘプタメチレンジアミンの合成を生じる第2の末端アミノ基は、アシルリジンデアシラーゼなどの、例えば、EC 3.5.1.17に分類されるデアシラーゼによって、N6-アセチル-1,6-ジアミノヘキサンで酵素的に形成される。
1,6-ヘキサンジオールの生合成において末端ヒドロキシル基を産生する酵素
図5に示されるように、末端ヒドロキシル基は、アルコールデヒドロゲナーゼを用いて、酵素的に形成され得る。例えば、1,6-ヘキサンジオールの合成を生じる第2の末端ヒドロキシル基は、YMR318CもしくはYqhDの遺伝子産物（Liu et al., Microbiology, 2009, 155, 2078-2085；Larroy et al., 2002, Biochem J., 361（Pt 1）, 163-172；Jarboe, 201 1, Appl. Microbiol. Biotechnol., 89（2）, 249-257）、またはGenBank Accession No. CAA81612.1を有するタンパク質などの、EC 1.1.1.-（例えば、EC 1.1.1.1、1.1.1.2、1.1.1.21、または1.1.1.184）に分類されるアルコールデヒドロゲナーゼによって、6-ヒドロキシヘキサナールで酵素的に形成され得る。
生化学的経路
6-ヒドロキシヘキサノエートへの経路
いくつかの態様において、6-ヒドロキシヘキサノエートは、例えば、EC 1.4.1.13に分類されるグルタミン酸シンターゼ、または例えば、EC 2.6.1.39などのEC 2.6.1.-に分類されるα-アミノトランスフェラーゼによる、2-オキソグルタレートからL-グルタメートへの変換；その後、例えば、EC 4.1.1.15またはEC 4.1.1.18に分類されるグルタミン酸デカルボキシラーゼによる、L-グルタメートから4-アミノブチレートへの変換；その後、大腸菌由来のgabTの遺伝子産物（Bartsch et al., J. Bacteriol., 1990, 172（12）, 7035）などの、例えば、EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.48、またはEC 2.6.1.96に分類されるω-トランスアミナーゼによる、4-アミノブチレートからコハク酸セミアルデヒドへの変換；その後、gbdの遺伝子産物（例えば、ソランギウム・セルロサム（Sorangium cellulosum）由来）、gabDの遺伝子産物（Bartsch et al., J. Bacteriol., 1990, 172（12）, 7035）、もしくはYihUの遺伝子産物（Saito et al., J. Biol. Chem., 2009, 284（24）, 16442-16452）などの、例えば、EC 1.1.1.61に分類されるアルコールデヒドロゲナーゼ、またはcpnDの遺伝子産物（例えば、Iwaki et al., 2002, Appl. Environ. Microbiol., 68（11）:5671-5684参照）などの5-ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼによる、コハク酸セミアルデヒドから4-ヒドロキシブチレートへの変換；その後、例えば、EC 6.2.1-（例えば、EC 6.2.1.40）に分類されるCoA-リガーゼ、またはクロストリジウム・クライベリ由来のcat2の遺伝子産物、クロストリジウム・アミノブチリカム由来のabfTの遺伝子産物などの、例えば、EC 2.8.3.-に分類されるCoA-トランスフェラーゼ、またはクロストリジウム・ビリデ由来の5-ヒドロキシペンタノエートCoA-トランスフェラーゼなどを用いた、4-ヒドロキシブチレートから4-ヒドロキシブチリル-CoAへの変換；その後、bktBもしくはpaaJの遺伝子産物（例えば、SEQ ID NO：1もしくは13）などの、例えば、EC 2.3.1.16もしくはEC 2.3.1.174に分類されるβ-ケトチオラーゼ、またはCAB60036.2（例えば、SEQ ID NO：14）によってコードされるβ-ケトチオラーゼ活性を用いた、4-ヒドロキシブチリル-CoAから3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAへの変換；その後、EC 1.1.1.35（例えば、fadBの遺伝子産物）、EC 1.1.1.36（例えば、phaBの遺伝子産物）、もしくはEC 1.1.1.157（例えば、hbdの遺伝子産物）などの、例えば、EC 1.1.1.-に分類される3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼ、またはfabGの遺伝子産物などの、例えば、EC 1.1.1.100に分類される3-オキソアシル-CoAレダクターゼを用いた、3-ヒドロキシ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAへの変換；その後、例えば、crtの遺伝子産物などの、例えば、EC 4.2.1.17に分類される、またはphaJの遺伝子産物などのEC 4.2.1.119に分類される、エノイル-CoAヒドラターゼを用いた、3-ヒドロキシ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAから2,3 -デヒドロ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAへの変換；その後、Egterもしくはtdterの遺伝子産物などの、例えば、EC 1.3.1.38、EC 1.3.1.44、またはEC 1.3.1.8に分類されるトランス-2-エノイル-CoAレダクターゼによる、2,3-デヒドロ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAから6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAへの変換；その後、YciAもしくはAcot13の遺伝子産物などの、例えば、EC 3.1.2.-に分類されるチオエステラーゼ、または例えば、EC 2.8.3.-に分類されるCoA-トランスフェラーゼによる、6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAから6-ヒドロキシヘキサノエートへの変換によって、中心的代謝物、2-オキソグルタレートから合成される。図1参照。
いくつかの態様において、2-オキソグルタレートは、例えば、EC 4.1.1.71に分類される2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ、またはkdcAもしくはkivDの遺伝子産物などの、例えば、EC 4.1.1.72に分類される分枝鎖デカルボキシラーゼ、または例えば、EC 4.1.1.74に分類されるインドールピルビン酸デカルボキシラーゼ、または例えば、EC 4.1.1.43に分類されるフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼなどの、例えば、EC. 4.1.1.-に分類されるカルボキシリアーゼを用いて、コハク酸セミアルデヒドに変換される。この様式において産生されるコハク酸セミアルデヒドは、上記のように6-ヒドロキシヘキサノエートに変換され得る。図1参照。
中心的前駆体として6-ヒドロキシヘキサノエートを用いたアジピン酸への経路
いくつかの態様において、アジピン酸は、YMR318Cの遺伝子産物（例えば、EC 1.1.1.2に分類され、Genbank Accession No. CAA90836.1参照）（Larroy et al., 2002, Biochem J., 361（Pt 1）, 163-172）、cpnDの遺伝子産物（Iwaki et al., 2002, Appl. Environ. Microbiol., 68（11）:5671-5684）、またはgabDの遺伝子産物（Lutke-Eversloh & Steinbuchel, 1999, FEMS Microbiology Letters, 181（1）:63-71）などの、EC 1.1.1.-に分類されるアルコールデヒドロゲナーゼ、またはChnDの遺伝子産物（Iwaki et al. Appl. Environ. Microbiol., 1999, 65（11）:5158-5162）などの、例えば、EC 1.1.1.258に分類される6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼによる、6-ヒドロキシヘキサノエートからアジピン酸セミアルデヒドへの変換；その後の、7-オキソヘプタン酸デヒドロゲナーゼ（例えば、ThnGの遺伝子産物）、6-オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ（例えば、ChnEの遺伝子産物）、例えば、EC 1.2.1.20に分類されるグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、CpnEの遺伝子産物などの5-オキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、またはEC 1.2.1.3に分類されるアルデヒドデヒドロゲナーゼなどの、例えば、EC 1.2.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼによる、アジピン酸セミアルデヒドからアジピン酸への変換によって、6-ヒドロキシヘキサノエートから合成される。図2参照。YMR318Cによってコードされるアルコールデヒドロゲナーゼは、C6アルコールの酸化を含む、広い基質特異性を有する。
いくつかの態様において、アジピン酸は、シトクロムP450（Sanders et al., J. Lipid Research, 2005, 46（5）, 1001-1008；Sanders et al., The FASEB Journal, 2008, 22（6）, 2064-2071）による、6-ヒドロキシヘキサノエートからアジピン酸セミアルデヒドへの変換；その後の、CYP4F3BなどのシトクロムP450ファミリーのモノオキシゲナーゼによる、アジピン酸セミアルデヒドからアジピン酸への変換によって、中心的前駆体、6-ヒドロキシヘキサノエートから合成される。図2参照。
中心的前駆体として6-ヒドロキシヘキサノエートを用いた6-アミノヘキサノエートおよびε-カプロラクタムへの経路
いくつかの態様において、6-アミノヘキサノエートは、YMR318Cの遺伝子産物などの、例えば、EC 1.1.1.2に分類されるアルコールデヒドロゲナーゼ、例えば、EC 1.1.1.258に分類される6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、cpnDの遺伝子産物などの、例えば、EC 1.1.1.-に分類される5-ヒドロキシペンタン酸デヒドロゲナーゼ、またはgabDの遺伝子産物などの、例えば、EC 1.1.1.-に分類される4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼによる、6-ヒドロキシヘキサノエートからアジピン酸セミアルデヒドへの変換；その後の、ω-トランスアミナーゼ（SEQ ID NO：7〜10または12の1つなどの、EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48、またはEC 2.6.1.82、上記参照）による、アジピン酸セミアルデヒドから6-アミノヘキサノエートへの変換によって、中心的前駆体、6-ヒドロキシヘキサノエートから合成される。図3参照。
いくつかの態様において、ε-カプロラクタムは、YMR318Cの遺伝子産物などの、例えば、EC 1.1.1.2に分類されるアルコールデヒドロゲナーゼ、例えば、EC 1.1.1.258に分類される6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、cpnDの遺伝子産物などの、例えば、EC 1.1.1.-に分類される5-ヒドロキシペンタン酸デヒドロゲナーゼ、またはgabDの遺伝子産物などの、例えば、EC 1.1.1.-に分類される4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼによる、6-ヒドロキシヘキサノエートからアジピン酸セミアルデヒドへの変換；その後の、ω-トランスアミナーゼ（EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48、またはEC 2.6.1.82）による、アジピン酸セミアルデヒドから6-アミノヘキサノエートへの変換；その後の、アミドヒドロラーゼ（EC 3.5.2.-）による、6-アミノヘキサノエートからε-カプロラクタムへの変換によって、中心的前駆体、6-ヒドロキシヘキサノエートから合成される。図3参照。
いくつかの態様において、ε-カプロラクタムは、上記の最終段階によって（すなわち、EC. 3.5.2.-の1つなどのアミドヒドロラーゼを用いた変換によって）、中心的前駆体、6-アミノヘキサノエートから合成される。図3参照。
中心的前駆体として6-アミノヘキサノエート、6-ヒドロキシヘキサノエート、アジピン酸セミアルデヒド、または1,6-ヘキサンジオールを用いたヘキサメチレンジアミンへの経路
いくつかの態様において、ヘキサメチレンジアミンは、ホスホパンテテイントランスフェラーゼエンハンサー（例えば、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）由来のsfp遺伝子またはノカルジア（Nocardia）由来のnpt遺伝子によってコードされる）と組み合わせたcarの遺伝子産物、またはストレプトマイセス・グリセウス由来のGriCおよびGriDの遺伝子産物（Suzuki et al. , J. Antibiot., 2007, 60（6）, 380-387）などの、例えば、EC 1.2.99.6に分類されるカルボン酸レダクターゼによる、6-アミノヘキサノエートから6-アミノヘキサナールへの変換；その後の、EC 2.6.1.-（例えば、SEQ ID NO：7〜12などのEC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.48、EC 2.6.1.82）のω-トランスアミナーゼなどの、ω-トランスアミナーゼによる、6-アミノヘキサナールからヘキサメチレンジアミンへの変換によって、中心的前駆体、6-アミノヘキサノエートから合成される。カルボン酸レダクターゼは、例えば、マイコバクテリウム・マリヌム（Genbank Accession No. ACC40567.1、SEQ ID NO：2）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Genbank Accession No. ABK71854.1、SEQ ID NO：3）、セグニリパルス・ルゴサス（Genbank Accession No. EFV11917.1、SEQ ID NO：4）、マイコバクテリウム・マシリエンス （Genbank Accession No. EIV11143.1、SEQ ID NO：5）、またはセグニリパルス・ロツンダス（Genbank Accession No. ADG98140.1、SEQ ID NO：6）から、入手され得る。図4参照。
carの遺伝子産物、およびエンハンサーnptまたはsfpによってコードされるカルボン酸レダクターゼは、末端二官能性C4およびC5カルボン酸を含む、広い基質特異性を有する（Venkitasubramanian et al., Enzyme and Microbial Technology, 2008, 42, 130-137）。
いくつかの態様において、ヘキサメチレンジアミンは、ホスホパンテテイントランスフェラーゼエンハンサー（例えば、バチルス・スブチリス由来のsfp遺伝子またはノカルジア由来のnpt遺伝子によってコードされる）と組み合わせたcarの遺伝子産物（上記参照）、またはGriCおよびGriDの遺伝子産物（Suzuki et al., 2001, 上記）などの、例えば、EC 1.2.99.6に分類されるカルボン酸レダクターゼによる、6-ヒドロキシヘキサノエートから6-ヒドロキシヘキサナールへの変換；その後の、SEQ ID NO：7〜12などの、例えば、EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48、またはEC 2.6.1.82、上記参照、に分類されるω-トランスアミナーゼによる、6-アミノヘキサナールから6-アミノヘキサノールへの変換；その後の、YMR318CまたはYqhDの遺伝子産物（Liu et al., Microbiology, 2009, 155, 2078-2085；Larroy et al., 2002, Biochem J., 361（Pt 1）, 163-172；Jarboe, 2011, Appl. Microbiol. Biotechnol., 89（2）, 249-257）、またはGenBank Accession No. CAA81612.1を有するタンパク質などの、例えば、EC 1.1.1.-（例えば、EC 1.1.1.1、EC 1.1.1.2、EC 1.1.1.21、またはEC 1.1.1.184）に分類されるアルコールデヒドロゲナーゼによる、7-アミノヘプタナールへの変換；その後の、SEQ ID NO：7〜12などの、例えば、EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48、またはEC 2.6.1.82、上記参照、に分類されるω-トランスアミナーゼによる、ヘプタメチレンジアミンへの変換によって、中心的前駆体、6-ヒドロキシヘキサノエート（これは図1に記載されるように産生され得る）から合成される。図4参照。
いくつかの態様において、ヘキサメチレンジアミンは、例えば、EC 2.3.1.32に分類されるリジンN-アセチルトランスフェラーゼなどのN-アセチルトランスフェラーゼによる、6-アミノヘキサノエートからN6-アセチル-6-アミノヘキサノエートへの変換；その後の、ホスホパンテテイントランスフェラーゼエンハンサー（例えば、バチルス・スブチリス由来のsfp遺伝子またはノカルジア由来のnpt遺伝子によってコードされる）と組み合わせたcarの遺伝子産物（上記参照、例えば、SEQ ID NO：4、5、または6）、またはGriCおよびGriDの遺伝子産物などの、例えば、EC 1.2.99.6に分類されるカルボン酸レダクターゼによる、N6-アセチル-6-アミノヘキサナールへの変換；その後の、SEQ ID NO：7〜12などの、例えば、EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48、またはEC 2.6.1.82、上記参照、に分類されるω-トランスアミナーゼによる、N6-アセチル-1,6-ジアミノヘキサンへの変換；その後の、例えば、EC 3.5.1.17に分類されるアシルリジンデアシラーゼによる、ヘプタメチレンジアミンへの変換によって、中心的前駆体、6-アミノヘキサノエートから合成される。図4参照。
いくつかの態様において、ヘキサメチレンジアミンは、ホスホパンテテイントランスフェラーゼエンハンサー（例えば、バチルス・スブチリス由来のsfp遺伝子またはノカルジア由来のnpt遺伝子によってコードされる）と組み合わせたcarの遺伝子産物（上記参照、例えば、SEQ ID NO:6）、またはGriCおよびGriDの遺伝子産物などの、例えば、EC 1.2.99.6に分類されるカルボン酸レダクターゼによる、アジピン酸セミアルデヒドからヘキサンジアールへの変換；その後の、例えば、EC 2.6.1.18, EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48、またはEC 2.6.1.82に分類されるω-トランスアミナーゼによる、6-アミノヘキサナールへの変換；その後の、SEQ ID NO：7〜12などの、例えば、EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48、またはEC 2.6.1.82に分類されるω-トランスアミナーゼによる、ヘキサメチレンジアミンへの変換によって、中心的前駆体、アジピン酸セミアルデヒドから合成される。図4参照。
いくつかの態様において、ヘキサメチレンジアミンは、YMR318CもしくはYqhDの遺伝子産物、またはGenBank Accession No. CAA81612.1を有するタンパク質などの、例えば、EC 1.1.1.-（例えば、EC 1.1.1.1、EC 1.1.1.2、EC 1.1.1.21、またはEC 1.1.1.184）に分類されるアルコールデヒドロゲナーゼを用いた、1,6-ヘキサンジオンから6-ヒドロキシヘキサナールへの変換；その後の、SEQ ID NO：7〜12などの、例えば、EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48、またはEC 2.6.1.82に分類されるω-トランスアミナーゼによる、6-アミノヘキサノールへの変換、その後の、YMR318CもしくはYqhDの遺伝子産物、またはGenBank Accession No. CAA81612.1を有するタンパク質などの、例えば、EC 1.1.1.-（例えば、EC 1.1.1.1、EC 1.1.1.2、EC 1.1.1.21、またはEC 1.1.1.184）に分類されるアルコールデヒドロゲナーゼによる、6-アミノヘキサナールへの変換、その後の、SEQ ID NO：7〜12などの、例えば、EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48、またはEC 2.6.1.82に分類されるω-トランスアミナーゼによる、ヘキサメチレンジアミンへの変換によって、1,6-ヘキサンジオールから合成される。図4参照。
中心的前駆体として6-ヒドロキシヘキサノエートを用いた1,6-ヘキサンジオールへの経路
いくつかの態様において、1,6ヘキサンジオールは、ホスホパンテテイントランスフェラーゼエンハンサー（例えば、バチルス・スブチリス由来のsfp遺伝子またはノカルジア由来のnpt遺伝子によってコードされる）と組み合わせたcarの遺伝子産物（上記参照、例えば、SEQ ID NO：2、3、4、5、もしくは6）、またはストレプトマイセス・グリセウス由来のGriCおよびGriDの遺伝子産物（Suzuki et al., J. Antibiot., 2007, 60（6）, 380-387）などの、例えば、EC 1.2.99.6に分類されるカルボン酸レダクターゼによる、6-ヒドロキシヘキサノエートから6-ヒドロキシヘキサナールへの変換；その後の、YMR318CもしくはYqhDの遺伝子産物（大腸菌、GenBank Accession No. AAA69178.1に由来する）（例えば、Liu et al., Microbiology, 2009, 155, 2078-2085；Larroy et al., 2002, Biochem J., 361（Pt 1）, 163-172；またはJarboe, 2011, Appl. Microbiol. Biotechnol., 89（2）, 249-257参照）、またはGenBank Accession No. CAA81612.1を有するタンパク質（ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）に由来する）などの、アルコールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.1、EC 1.1.1.2、EC 1.1.1.21、またはEC 1.1.1.184などの、例えば、EC 1.1.1.-に分類される）による、6-ヒドロキシヘキサナールから1,6ヘキサンジオールへの変換によって、中心的前駆体、6-ヒドロキシヘキサノエートから合成される。図5参照。
培養ストラテジー
いくつかの態様において、1つまたは複数のC6ビルディングブロックは、嫌気性、好気性、または微好気性の培養条件を用いて、組換え宿主において生合成される。いくつかの態様において、培養ストラテジーは、窒素、リン酸、または酸素制限などの栄養制限を伴う。
いくつかの態様において、例えば、セラミック膜を用いる細胞保持ストラテジーは、流加培養または連続発酵のいずれかの間、高細胞密度を達成および維持するために使用され得る。
いくつかの態様において、1つまたは複数のC6ビルディングブロックの合成における発酵に供給される主要な炭素源は、生物学的フィードストックまたは非生物学的フィードストックに由来し得る。
いくつかの態様において、生物学的フィードストックは、単糖、二糖、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、リグニン、レブリン酸およびギ酸、トリグリセリド、グリセロール、脂肪酸、農業廃棄物、濃縮された蒸留可溶分、もしくは一般廃棄物であり得るか、またはそれらに由来し得る。
バイオディーゼルの産生に起因する未精製グリセロールの効率的な異化作用は、大腸菌、カプリアビダス・ネカトール、シュードモナス・オレオボランス、シュードモナス・プチダ、およびヤロウイア・リポリティカなどのいくつかの微生物において示された（Lee et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 2012, 166:1801-1813；Yang et al., Biotechnology for Biofuels, 2012, 5:13；Meijnen et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011, 90:885-893）。
リグノセルロース由来のレブリン酸の効率的な異化作用は、前駆体、プロパノイル-CoAを介して、3-ヒドロキシバレレートの合成におけるカプリアビダス・ネカトールおよびシュードモナス・プチダなどのいくつかの生物において示された（Jaremko and Yu, 2011, 上記；Martin and Prather, J. Biotechnol., 2009, 139:61-67）。
安息香酸類似体などのリグニン由来の芳香族化合物の効率的な異化作用は、シュードモナス・プチダ、カプリアビダス・ネカトールなどのいくつかの微生物において示された（Bugg et al. , Current Opinion in Biotechnology, 2011, 22, 394-400；Perez-Pantoja et al., FEMS Microbiol. Rev., 2008, 32, 736-794）。
オリーブミル廃水などの農業廃棄物の効率的な利用は、ヤロウイア・リポリティカを含むいくつかの微生物において示された（Papanikolaou et al., Bioresour. Technol., 2008, 99（7）:2419-2428）。
セルロース、ヘミセルロース、サトウキビ糖およびビート糖、キャッサバ、トウモロコシ、および他の農業的起源に由来する単糖および二糖などの発酵性糖の効率的な利用は、大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミクム、ラクトバチルス・デルブリュッキ、およびラクトコッカス・ラクティスなどのいくつかの微生物に対して示された（例えば、Hermann et al, J. Biotechnol., 2003, 104:155-172；Wee et al., Food Technol. Biotechnol., 2006, 44（2）:163-172；Ohashi et al., J. Bioscience and Bioengineering, 1999, 87（5）:647-654参照）。
様々な農業的リグノセルロース源に由来するフルフラールの効率的な利用は、カプリアビダス・ネカトールに対して示された（Li et al., Biodegradation, 2011, 22:1215-1225）。
いくつかの態様において、非生物学的フィードストックは、天然ガス、合成ガス、CO2/H2、メタノール、エタノール、ベンゾエート、シクロヘキサン酸化プロセスからの不揮発性残留物（NVR）もしくは腐食性洗浄廃棄物ストリーム、もしくはテレフタル酸／イソフタル酸混合物の廃棄物ストリームであり得るか、またはそれらに由来し得る。
メタノールの効率的な異化作用は、メチロトローフ酵母、ピキア・パストリスに対して示された。
エタノールの効率的な異化作用は、クロストリジウム・クライベリに対して示された（Seedorf et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 2008, 105（6）2128-2133）。
天然ガスならびに他の化学および石油化学起源に由来し得るCO2およびH2の効率的な異化作用は、カプリアビダス・ネカトールに対して示された（Prybylski et al., Energy, Sustainability and Society, 2012, 2:11）。
合成ガスの効率的な異化作用は、クロストリジウム・リュングダリイおよびクロストリジウム・オートエタノゲナムなどの多数の微生物に対して示された（Kopke et al., Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77（15）:5467-5475）。
シクロヘキサンプロセス由来の不揮発性残留物廃棄物ストリームの効率的な異化作用は、デルフチア・アシドボランスおよびカプリアビダス・ネカトールなどの多数の微生物に対して示された（Ramsay et al., Applied and Environmental Microbiology, 1986, 52（1）: 152-156）。
いくつかの態様において、宿主微生物は原核生物である。例えば、原核生物は、大腸菌などのエシェリキア（Escherichia）属；クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・オートエタノゲナム、またはクロストリジウム・クライベリなどのクロストリジウム属；コリネバクテリウム・グルタミクムなどのコリネバクテリウム属；カプリアビダス・ネカトールまたはカプリアビダス・メタリデュランスなどのカプリアビダス属；シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・プチダ、またはシュードモナス・オレオボランスなどのシュードモナス属；デルフチア・アシドボランスなどのデルフチア属；バチルス・スブチリスなどのバチルス属；ラクトバチルス・デルブリュッキなどのラクトバチルス属；またはラクトコッカス・ラクティスなどのラクトコッカス属に由来する細菌であり得る。そのような原核生物はまた、1つまたは複数のC6ビルディングブロックを産生し得る、本明細書に記載される組換え宿主細胞を構築するための遺伝子の起源であり得る。
いくつかの態様において、宿主微生物は真核生物である。例えば、真核生物は、例えば、アスペルギルス・ニガーなどのアスペルギルス属に由来するものなど、糸状菌であり得る。または、真核生物は、例えば、サッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属；ピキア・パストリスなどのピキア属；ヤロウイア・リポリティカなどのヤロウイア属；イサチェンキア・オリエンタリスなどのイサチェンキア属；デバリオマイセス・ハンセニなどのデバリオマイセス属；アルクスラ・アデニニボランスなどのアルクスラ属；またはクリベロマイセス・ラクティスなどのクリベロマイセス属に由来するものなど、酵母であり得る。そのような真核生物はまた、1つまたは複数のC6ビルディングブロックを産生し得る、本明細書に記載される組換え宿主細胞を構築するための遺伝子の起源であり得る。
代謝的操作
本明細書は、全ての上記経路に対して記載される段階の全てではない段階を含む方法を提供する。そのような方法は、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、またはそれ以上のそのような段階を含み得る。全てではない段階がそのような方法に含まれる場合、第1の、且ついくつかの態様のみにおける段階は、列挙された段階のいずれか1つであり得る。
さらに、本明細書に記載される組換え宿主は、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上のそのような段階などの1つまたは複数の段階が、組換え宿主内で実施され得るように、上記酵素の任意の組み合わせを含み得る。本明細書は、本明細書に記載される任意の酵素の1つまたは複数（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、またはそれ以上）の組換え形態を発現するように、記載され且つ遺伝的に操作された任意の属および種の宿主細胞を提供する。したがって、例えば、宿主細胞は、本明細書に記載される任意の経路の1つまたは複数の段階を触媒する酵素をコードする外因性核酸を含み得る。
加えて、本明細書は、酵素がCoA活性化基質を受容すると記載されている場合に、必ずしも同じ酵素クラスにはない、[acp]-結合基質と結合した類似の酵素活性が存在することを認める。
また、本明細書は、酵素が基質の（R）-鏡像異性体を受容すると記載されている場合に、必ずしも同じ酵素クラスにはない、（S）-鏡像異性体基質と結合した類似の酵素活性が存在することを認める。
本明細書はまた、酵素が、NADPHなどの特定のコファクター、またはアセチル-CoAなどのco-基質を受容することが示される場合に、多くの酵素は、特定の酵素活性の触媒において、多くの異なるコファクターまたはco-基質を受容することに関して、入り交じった状態であることを認める。また、本明細書は、酵素が、例えば、NADHなどの特定のコファクターに対して高い特異性を有する場合に、コファクターNADPHに対して高い特異性を有する類似または同一の活性を有する酵素が、異なる酵素クラスに存在し得ることを認める。
いくつかの態様において、本明細書に概説する経路における酵素は、活性を改良する目的、特異性を改良する目的、フィードバック阻害を減少させる目的、抑制を減少させる目的、酵素溶解性を改良する目的、立体特異性を変更する目的、またはコファクター特異性を変更する目的での、非直接的または合理的酵素設計アプローチを介する酵素操作の結果である。
いくつかの態様において、本明細書に概説する経路における酵素は、エピソームまたは染色体組み込みアプローチを介して生じる遺伝的に改変された生物に、遺伝子を投与、すなわち、過剰発現され得る。
いくつかの態様において、Flux Balance Analysisなどのゲノムスケールシステムバイオロジー技術は、炭素フラックスをC6ビルディングブロックに向かわせるための、ゲノムスケールの減弱化またはノックアウトストラテジーを考案するために利用され得る。
減弱化ストラテジーは、トランスポゾン、相同組換え（ダブルクロスオーバーアプローチ）、突然変異誘発、酵素阻害剤、およびRNAi干渉の使用を含むが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、フラックスの、メタボロームの、およびトランスクリプトームのデータは、ゲノムスケールシステムバイオロジー技術を伝え、またはサポートし、それにより、炭素フラックスをC6ビルディングブロックへ向かわせる際におけるゲノムスケールの減弱化またはノックアウトストラテジーを考案するために利用され得る。
いくつかの態様において、高濃度のC6ビルディングブロックに対する宿主微生物の耐性は、選択的環境における連続培養を介して改良され得る。
いくつかの態様において、宿主微生物の内因性生化学的ネットワークは、（1）アセチル-CoAおよび4-ヒドロキシブチリル-CoAの細胞内利用能を保証するため、（2）1つもしくは複数のC6ビルディングブロックの形成を介してのみ均衡され得るNADHもしくはNADPHの不均衡を形成するため、（3）1つもしくは複数のC6ビルディングブロックを生じ、およびそれを含む、中心的代謝物、中心的前駆体の分解を妨げるため、ならびに／または（4）細胞からの効果的な流出を保証するため、減弱または増強され得る。
C6ビルディングブロック合成のためのアセチル-CoAの細胞内利用能を必要とするいくつかの態様において、短鎖長チオエステラーゼなどのアセチル-CoAの加水分解を触媒する内因性酵素は、宿主生物において減弱され得る。
C6ビルディングブロック合成のためのアセチル-CoAの細胞内利用能を必要とするいくつかの態様において、ptaなどのアセテートを生成する内因性ホスホトランスアセチラーゼは、減弱され得る（Shen et al., Appl. Environ. Microbiol., 2011, 77（9）:2905-2915）。
C6ビルディングブロック合成のためのアセチル-CoAの細胞内利用能を必要とするいくつかの態様において、ackなどの酢酸キナーゼをコードするアセテート合成経路における内因性遺伝子は、減弱され得る。
C6ビルディングブロック合成のためのアセチル-CoAおよびNADHの細胞内利用能を必要とするいくつかの態様において、ldhAによってコードされる乳酸デヒドロゲナーゼなどの、ピルベートからラクテートへの分解を触媒する酵素をコードする内因性遺伝子は、減弱され得る（Shen et al., 2011, 上記）。
いくつかの態様において、PEPカルボキシラーゼおよび／またはピルビン酸カルボキシラーゼなどの補充反応を触媒する酵素は、宿主生物において過剰発現され得る。
C6ビルディングブロック合成のためのアセチル-CoAおよびNADHの細胞内利用能を必要とするいくつかの態様において、frdBCなどの、ホスホエノールピルベートからスクシネートへの分解を触媒するメナキノール-フマル酸オキシドレダクターゼなどの酵素をコードする内因性遺伝子は、減弱され得る（例えば、Shen et al., 2011, 上記参照）。
C6ビルディングブロック合成のためのアセチル-CoAおよびNADHの細胞内利用能を必要とするいくつかの態様において、adhEによってコードされるアルコールデヒドロゲナーゼなどのアセチル-CoAからエタノールへの分解を触媒する酵素をコードする内因性遺伝子は、減弱され得る（Shen et al., 2011, 上記）。
いくつかの態様において、経路がC6ビルディングブロック合成のための過剰なNADHコファクターを要求する場合に、組換えギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、宿主生物において過剰発現され得る（Shen et al., 2011, 上記）。
いくつかの態様において、経路がC6ビルディングブロック合成のための過剰なNADHコファクターを要求する場合に、組換えNADH消費トランスヒドロゲナーゼは、減弱され得る。
いくつかの態様において、ピルビン酸デカルボキシラーゼなどのピルベートからエタノールへの分解を触媒する酵素をコードする内因性遺伝子は、減弱され得る。
C6ビルディングブロック合成のためのアセチル-CoAの細胞内利用能を必要とするいくつかの態様において、acsの遺伝子産物などの組換えアセチル-CoAシンセターゼは、微生物において過剰発現され得る（Satoh et al., J. Bioscience and Bioengineering, 2003, 95（4）:335-341）。
いくつかの態様において、炭素フラックスは、内因性グルコース-6-リン酸イソメラーゼ（EC 5.3.1.9）を減弱することによって、NADPHの供給を増加させるために、ペントースリン酸回路に向かわせ得る。
いくつかの態様において、炭素フラックスは、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼおよび／またはトランスケトラーゼの過剰発現によって、NADPHの供給を増加させるために、ペントースリン酸回路に再び向かわせ得る（Lee et al., 2003, Biotechnology Progress, 19（5）, 1444-1449）。
いくつかの態様において、経路がC6ビルディングブロックの合成において過剰なNADPHコファクターを要求する場合に、プリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードするUdhAなどの遺伝子が、宿主生物において過剰発現され得る（Brigham et al., Advanced Biofuels and Bioproducts, 2012, Chapter 39, 1065-1090）。
いくつかの態様において、経路がC6ビルディングブロックの合成において過剰なNADPHコファクターを要求する場合に、GapNなどの組換えグリセルアルデヒド-3-リン酸-デヒドロゲナーゼ遺伝子が、宿主生物において過剰発現され得る（Brigham et al., 2012, 上記）。
いくつかの態様において、経路がC6ビルディングブロックの合成において過剰なNADPHコファクターを要求する場合に、maeAまたはmaeBなどの組換えリンゴ酸酵素遺伝子が、宿主生物において過剰発現され得る（Brigham et al., 2012, 上記）。
いくつかの態様において、経路がC6ビルディングブロックの合成において過剰なNADPHコファクターを要求する場合に、zwfなどの組換えグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、宿主生物において過剰発現され得る（Lim et al., J. Bioscience and Bioengineering, 2002, 93（6）, 543-549）。
いくつかの態様において、経路がC6ビルディングブロックの合成において過剰なNADPHコファクターを要求する場合に、fbpなどの組換えフルクトース1,6ジホスファターゼ遺伝子が、宿主生物において過剰発現され得る（Becker et al., J. Biotechnol., 2007, 132:99-109）。
いくつかの態様において、経路がC6ビルディングブロックの合成において過剰なNADPHコファクターを要求する場合に、内因性トリオースリン酸イソメラーゼ（EC 5.3.1.1）が、減弱され得る。
いくつかの態様において、経路がC6ビルディングブロックの合成において過剰なNADPHコファクターを要求する場合に、gdhの遺伝子産物などの組換えグルコースデヒドロゲナーゼが、宿主生物において過剰発現され得る（Satoh et al., J. Bioscience and Bioengineering, 2003, 95（4）:335-341）。
いくつかの態様において、EC 1.4.1.2（NADH特異的）およびEC 1.4.1.4（NADPH特異的）に分類されるグルタミン酸デヒドロゲナーゼの相互変換を介して生成され得るNADH生成サイクルなどの、NADPHからNADHへの変換を促進する内因性酵素は、減弱され得る。
いくつかの態様において、コファクターとしてNADHおよびNADPHの両方を利用する内因性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.4.1.3）が、減弱され得る。
いくつかの態様において、CYP4F3Bなどの膜結合シトクロムP450は、細胞質ドメインのみを発現し、P450を小胞体に固定するN末端領域を発現しないことによって、可溶化され得る（Scheller et al., J. Biol. Chem., 1994, 269（17）: 12779-12783）。
いくつかの態様において、エノイル-CoAレダクターゼは、例えば、マルトース結合タンパク質などの小型の可溶性タンパク質との融合タンパク質としての発現を介して、可溶化され得る（Gloerich et al., FEBS Letters, 2006, 580, 2092-2096）。
ポリヒドロキシアルカノエートを天然に蓄積する宿主を用いるいくつかの態様において、内因性ポリマーシンターゼ酵素は、宿主株において減弱され得る。
いくつかの態様において、L-アラニンデヒドロゲナーゼは、ω-トランスアミナーゼ反応のためのアミノ酸ドナーとして、ピルベートからL-アラニンを再生するために、宿主において過剰発現され得る。
いくつかの態様において、L-グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、L-グルタミンシンセターゼ、またはグルタミン酸シンターゼは、ω-トランスアミナーゼ反応のためのアミノ酸ドナーとして、2-オキソグルタレートからL-グルタメートを再生するために、宿主において過剰発現され得る。
いくつかの態様において、C6ビルディングブロックを生じ、およびそれを含む、中心的代謝物および中心的前駆体を分解する、EC 1.3.1.62に分類されるピメロイル-CoAデヒドロゲナーゼ；例えば、EC 1.3.8.7、EC 1.3.8.1、またはEC 1.3.99.-に分類されるアシル-CoAデヒドロゲナーゼ；および／または例えば、EC 1.3.8.6に分類されるブチリル-CoAデヒドロゲナーゼなどの酵素は、減弱され得る。
いくつかの態様において、例えば、EC 6.2.1.-に分類されるCoA-リガーゼ（例えば、アジピル-CoAシンセターゼ）などのコエンザイムAエステル化を介してC6ビルディングブロックを活性化する内因性酵素は、減弱され得る。
いくつかの態様において、細胞膜を越えた細胞外培地へのC6ビルディングブロックの流出は、細胞膜への構造的改変を遺伝的に操作することによって、またはC6ビルディングブロックのための任意の関連するトランスポーター活性を増加させることによって、増強または増幅され得る。
ヘキサメチレンジアミンの流出は、バチルス・スブチリス由来のBlt（Woolridge et al., 1997, J. Biol. Chem., 272（14）:8864-8866）；大腸菌由来のAcrBおよびAcrD（Elkins & Nikaido, 2002, J. Bacteriol., 184（23）, 6490-6499）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aereus）由来のNorA（Ng et al., 1994, Antimicrob Agents Chemother, 38（6）, 1345-1355）、またはバチルス・スブチリス由来のBmr（Neyfakh, 1992, Antimicrob Agents Chemother, 36（2）, 484-485）などの、広範囲の基質の多剤トランスポーターを過剰発現することによって、増強または増幅され得る。
6-アミノヘキサノエートおよびヘプタメチレンジアミンの流出は、コリネバクテリウム・グルタミクム由来のlysEトランスポーターなどの溶質トランスポーターを過剰発現することによって、増強または増幅され得る（Bellmann et al., 2001, Microbiology, 147, 1765-1774）。
アジピン酸の流出は、コリネバクテリウム・グルタミクム由来のSucEトランスポーターなどのジカルボン酸トランスポーターを過剰発現することによって、増強または増幅され得る（Huhn et al., Appl. Microbiol & Biotech., 89（2）, 327-335）。
組換え宿主を用いたC6ビルディングブロックの産生
典型的には、1つまたは複数のC6ビルディングブロックは、宿主微生物を提供すること、および提供された微生物を、上記のような適当な炭素源を含む培養培地と共に培養することによって、産生され得る。一般に、培養培地および／または培養条件は、微生物が十分な密度まで増殖し、C6ビルディングブロックを効率的に産生するようなものであり得る。大規模の産生プロセスのために、他に記載されたものなどの任意の方法が使用され得る（Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2nd Edition, Editors: A. L. Demain and J. E. Davies, ASM Press；およびPrinciples of Fermentation Technology, P. F. Stanbury and A. Whitaker, Pergamon）。簡単に述べると、適した培養培地を含む大きなタンク（例えば、100ガロン、200ガロン、500ガロン、またはそれ以上のタンク）は、特定の微生物を接種される。接種の後、微生物は、バイオマスを産生させるようにインキュベートされる。所望のバイオマスが達成されたら、微生物を含むブロスは、第2のタンクに移動され得る。この第2のタンクは、任意のサイズであり得る。例えば、第2のタンクは、第1のタンクより大きい、小さい、または同サイズであり得る。典型的には、第2のタンクは、追加の培養培地が第1のタンクからのブロスに添加され得るように、第1のタンクより大きい。加えて、この第2のタンク内の培養培地は、第1のタンク中で使用されるものと同じであっても、または異なっていてもよい。
移動されたら、微生物は、C6ビルディングブロックの産生を可能にするために、インキュベートされ得る。産生されたら、任意の方法が、C6ビルディングブロックを単離するために使用され得る。例えば、C6ビルディングブロックは、吸着プロセスを介して、発酵ブロスから選択的に回収され得る。アジピン酸および6-アミノヘプタン酸の場合、得られた溶出液は、蒸発を介してさらに濃縮され得、蒸発および／または冷却による結晶化を介して結晶化され得、ならびに遠心分離を介して結晶が回収され得る。ヘキサメチレンジアミンおよび1,6-ヘキサンジオールの場合、蒸留は、所望の産物純度を達成するために使用され得る。
本発明は、以下の実施例においてさらに記載されるが、これらは特許請求の範囲に記載される発明の範囲を限定するものではない。
実施例1
基質としてアジピン酸セミアルデヒドを用い、6-アミノヘキサノエートを形成する、ω-トランスアミナーゼの酵素活性
Hisタグをコードするヌクレオチド配列を、N末端HISタグ付けω-トランスアミナーゼが産生され得るように、それぞれSEQ ID NO：7、8、9、10、および12のω-トランスアミナーゼをコードする、クロモバクテリウム・ビオラセウム、シュードモナス・エルギノーサ、シュードモナス・シリンゲ、ロドバクター・スフェロイデス、およびビブリオ・フルビアリス由来の核酸配列（図6参照）に加えた。得られた各修飾遺伝子は、T7プロモーターの制御下で、pET21a発現ベクター中にクローン化され、各発現ベクターは、BL21 [DE3]大腸菌宿主中に形質転換された。得られた組換え大腸菌株は、50 mL LB培地および抗生物質選択圧を含み、230 rpmで振盪される250 mL振盪フラスコ培養において37℃で培養された。各培養物は、1 mM IPTGを用いて16℃で一晩誘導された。
誘導された各振盪フラスコ培養物からのペレットは、遠心分離を介して回収された。各ペレットは、超音波処理を介して再懸濁および溶解された。細胞片は、遠心分離を介して上清から分離され、無細胞抽出液は、酵素活性アッセイにおいて直ちに使用された。
逆方向での酵素活性（すなわち、6-アミノヘキサノエートからアジピン酸セミアルデヒド）アッセイは、50 mM HEPES緩衝液（pH＝7.5）、10 mM 6-アミノヘキサノエート、10 mMピルベート、および100μMピリドキシル5'ホスフェートの終濃度で構成される緩衝液中で実施された。各酵素活性アッセイ反応は、ω-トランスアミナーゼ遺伝子産物の無細胞抽出液または空ベクターの対照を、6-アミノヘキサノエートを含むアッセイ緩衝液に添加することによって開始され、25℃で24時間、250 rpmで振盪され、インキュベートされた。ピルベートからのL-アラニンの形成は、RP-HPLCを介して定量化された。
6-アミノヘプタノエートを含まない各酵素のみの対照は、ピルベートからL-アラニンへの低いベースラインの変換を示した。図11参照。SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、およびSEQ ID NO：12の遺伝子産物は、空ベクターの対照に対して確認されるように、基質として6-アミノヘキサノエートを受容した。図12参照。
順方向での酵素活性（すなわち、アジピン酸セミアルデヒドから6-アミノヘキサノエート）は、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、およびSEQ ID NO：12のトランスアミナーゼに対して確認された。酵素活性アッセイは、50 mM HEPES緩衝液（pH＝7.5）、10 mMアジピン酸セミアルデヒド、10 mM L-アラニン、および100μMピリドキシル5'ホスフェートの終濃度で構成される緩衝液中で実施された。各酵素活性アッセイ反応は、ω-トランスアミナーゼ遺伝子産物の無細胞抽出液または空ベクターの対照を、アジピン酸セミアルデヒドを含むアッセイ緩衝液に添加することによって開始され、25℃で4時間、250 rpmで振盪され、インキュベートされた。ピルベートの形成は、RP-HPLCを介して定量化された。
SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、およびSEQ ID NO：12の遺伝子産物は、空ベクターの対照に対して確認されるように、基質としてアジピン酸セミアルデヒドを受容した。図13参照。ω-トランスアミナーゼ活性の可逆性は、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、およびSEQ ID NO：12のω-トランスアミナーゼが、基質としてアジピン酸セミアルデヒドを受容し、反応産物として6-アミノヘキサノエートを合成したことを示し、確認された。
実施例2
基質として6-ヒドロキシヘキサノエートを用い、6-ヒドロキシヘキサナールを形成する、カルボン酸レダクターゼの酵素活性
Hisタグをコードするヌクレオチド配列を、N末端HISタグ付けカルボン酸レダクターゼが産生され得るように、それぞれSEQ ID NO：2〜6のカルボン酸レダクターゼをコードする、マイコバクテリウム・マリヌム、マイコバクテリウム・スメグマチス、マイコバクテリウム・スメグマチス、セグニリパルス・ルゴサス、マイコバクテリウム・マシリエンス、およびセグニリパルス・ロツンダス由来の核酸配列（図6参照）に加えた。修飾された各遺伝子は、いずれもT7プロモーターの制御下で、バチルス・スブチリス由来のHisタグ付けホスホパンテテイントランスフェラーゼをコードするsfp遺伝子と共に、pET Duet発現ベクター中にクローン化された。各発現ベクターは、実施例3の発現ベクターと同様に、BL21 [DE3]大腸菌宿主中に形質転換された。得られた各組換え大腸菌株は、50 mL LB培地および抗生物質選択圧を含み、230 rpmで振盪される250 mL振盪フラスコ培養において37℃で培養された。各培養物は、自己誘導培地を用いて37℃で一晩誘導された。
誘導された各振盪フラスコ培養物からのペレットは、遠心分離を介して回収された。各ペレットは、超音波処理を介して再懸濁および溶解された。細胞片は、遠心分離を介して上清から分離された。カルボン酸レダクターゼおよびホスホパンテテイントランスフェラーゼは、Ni-アフィニティクロマトグラフィーを用いて、上清から精製され、50 mM HEPES緩衝液（pH＝7.5）中で10倍に希釈され、限外濾過を介して濃縮された。
酵素活性（すなわち、6-ヒドロキシヘキサノエートから6-ヒドロキシヘキサナール）アッセイは、50 mM HEPES緩衝液（pH＝7.5）、2 mM 6-ヒドロキシヘキサナール、10 mM MgCl2、1 mM ATP、および1 mM NADPHの終濃度で構成される緩衝液中で、三つ組で実施された。各酵素活性アッセイ反応は、精製されたカルボン酸レダクターゼおよびホスホパンテテイントランスフェラーゼまたは空ベクターの対照を、6-ヒドロキシヘキサノエートを含むアッセイ緩衝液に添加することによって開始され、その後、室温で20分間、インキュベートされた。NADPHの消費は、340 nmの吸光度によってモニターされた。6-ヒドロキシヘキサノエートを含まない各酵素のみの対照は、低いベースラインのNADPHの消費を示した。図7参照。
SEQ ID NO：2〜6の遺伝子産物は、sfpの遺伝子産物によって増強され、空ベクターの対照に対して確認されるように、基質として6-ヒドロキシヘキサノエートを受容し（図8参照）、6-ヒドロキシヘキサナールを合成した。
実施例3
6-オキソヘキサノールを形成する、6-アミノヘキサノールのためのω-トランスアミナーゼの酵素活性
N末端Hisタグをコードするヌクレオチド配列を、N末端HISタグ付けω-トランスアミナーゼが産生され得るように、それぞれSEQ ID NO：7〜12のω-トランスアミナーゼをコードする、クロモバクテリウム・ビオラセウム、シュードモナス・エルギノーサ、シュードモナス・シリンゲ、ロドバクター・スフェロイデス、大腸菌、およびビブリオ・フルビアリスの核酸配列（図6参照）に加えた。修飾遺伝子は、T7プロモーター下で、pET21a発現ベクター中にクローン化された。各発現ベクターは、BL21 [DE3]大腸菌宿主中に形質転換された。得られた各組換え大腸菌株は、50 mL LB培地および抗生物質選択圧を含み、230 rpmで振盪される250 mL振盪フラスコ培養において37℃で培養された。各培養物は、1 mM IPTGを用いて16℃で一晩誘導された。
誘導された各振盪フラスコ培養物からのペレットは、遠心分離を介して回収された。各ペレットは、超音波処理を介して再懸濁および溶解された。細胞片は、遠心分離を介して上清から分離され、無細胞抽出液は、酵素活性アッセイにおいて直ちに使用された。
逆方向での酵素活性（すなわち、6-アミノヘキサノールから6-オキソヘキサノール）アッセイは、50 mM HEPES緩衝液（pH＝7.5）、10 mM 6-アミノヘキサノール、10 mMピルベート、および100μMピリドキシル5'ホスフェートの終濃度で構成される緩衝液中で実施された。各酵素活性アッセイ反応は、ω-トランスアミナーゼ遺伝子産物の無細胞抽出液または空ベクターの対照を、6-アミノヘキサノールを含むアッセイ緩衝液に添加することによって開始され、その後、25℃で4時間、250 rpmで振盪され、インキュベートされた。L-アラニンの形成は、RP-HPLCを介して定量化された。
6-アミノヘキサノールを含まない各酵素のみの対照は、ピルベートからL-アラニンへの低いベースラインの変換を有した。図11参照。
SEQ ID NO：7〜12の遺伝子産物は、空ベクターの対照に対して確認されるように、基質として6-アミノヘキサノールを受容し（図16参照）、反応産物として6-オキソヘキサノールを合成した。ω-トランスアミナーゼ活性の可逆性を考慮すると（実施例1参照）、SEQ ID NO：7〜12の遺伝子産物は、基質として6-アミノヘキサノールを受容し、6-オキソヘキサノールを形成することが結論され得る。
実施例4
基質としてヘキサメチレンジアミンを用い、6-アミノヘキサナールを形成する、ω-トランスアミナーゼの酵素活性
N末端Hisタグをコードするヌクレオチド配列を、N末端HISタグ付けω-トランスアミナーゼが産生され得るように、それぞれSEQ ID NO：7〜12のω-トランスアミナーゼをコードする、クロモバクテリウム・ビオラセウム、シュードモナス・エルギノーサ、シュードモナス・シリンゲ、ロドバクター・スフェロイデス、大腸菌、およびビブリオ・フルビアリスの核酸配列（図6参照）に加えた。修飾遺伝子は、T7プロモーター下で、pET21a発現ベクター中にクローン化された。各発現ベクターは、BL21 [DE3]大腸菌宿主中に形質転換された。得られた各組換え大腸菌株は、50 mL LB培地および抗生物質選択圧を含み、230 rpmで振盪される250 mL振盪フラスコ培養において37℃で培養された。各培養物は、1 mM IPTGを用いて16℃で一晩誘導された。
誘導された各振盪フラスコ培養物からのペレットは、遠心分離を介して回収された。各ペレットは、超音波処理を介して再懸濁および溶解された。細胞片は、遠心分離を介して上清から分離され、無細胞抽出液は、酵素活性アッセイにおいて直ちに使用された。
逆方向での酵素活性（すなわち、ヘキサメチレンジアミンから6-アミノヘキサナール）アッセイは、50 mM HEPES緩衝液（pH＝7.5）、10 mMヘキサメチレンジアミン、10 mMピルベート、および100μMピリドキシル5'ホスフェートの終濃度で構成される緩衝液中で実施された。各酵素活性アッセイ反応は、ω-トランスアミナーゼ遺伝子産物の無細胞抽出液または空ベクターの対照を、ヘキサメチレンジアミンを含むアッセイ緩衝液に添加することによって開始され、その後、25℃で4時間、250 rpmで振盪され、インキュベートされた。L-アラニンの形成は、RP-HPLCを介して定量化された。
ヘキサメチレンジアミンを含まない各酵素のみの対照は、ピルベートからL-アラニンへの低いベースラインの変換を有した。図11参照。
SEQ ID NO：7〜12の遺伝子産物は、空ベクターの対照に対して確認されるように、基質としてヘキサメチレンジアミンを受容し、反応産物として6-アミノヘキサナールを合成した。ω-トランスアミナーゼ活性の可逆性を考慮すると（実施例1参照）、SEQ ID NO：7〜12の遺伝子産物は、基質として6-アミノヘキサナールを受容し、ヘキサメチレンジアミンを形成することが結論され得る。
実施例5
N6-アセチル-6-アミノヘキサナールを形成する、N6-アセチル-6-アミノヘキサノエートのためのカルボン酸レダクターゼの酵素活性
N6-アセチル-6-アミノヘキサノエートからN6-アセチル-6-アミノヘキサナールへの変換のための、各SEQ ID NO：4〜6のN末端Hisタグ付けカルボン酸レダクターゼ（実施例2および図6参照）の活性は、50 mM HEPES緩衝液（pH＝7.5）、2 mM N6-アセチル-6-アミノヘキサノエート、10 mM MgCl2、1 mM ATP、および1 mM NADPHの終濃度で構成される緩衝液中で、三つ組でアッセイされた。アッセイは、精製されたカルボン酸レダクターゼおよびホスホパンテテイントランスフェラーゼまたは空ベクターの対照を、N6-アセチル-6-アミノヘキサノエートを含むアッセイ緩衝液に添加することによって開始され、その後、室温で20分間、インキュベートされた。NADPHの消費は、340 nmの吸光度によってモニターされた。N6-アセチル-6-アミノヘキサノエートを含まない各酵素のみの対照は、低いベースラインのNADPHの消費を示した。図7参照。
SEQ ID NO：4〜6の遺伝子産物は、sfpの遺伝子産物によって増強され、空ベクターの対照に対して確認されるように、基質としてN6-アセチル-6-アミノヘキサノエートを受容し（図9参照）、N6-アセチル-6-アミノヘキサナールを合成した。
実施例6
N6-アセチル-1,6-ジアミノヘキサンを用い、N6-アセチル-6-アミノヘキサナールを形成する、ω-トランスアミナーゼの酵素活性
N6-アセチル-1,6-ジアミノヘキサンからN6-アセチル-6-アミノヘキサナールへの変換のための、SEQ ID NO：7〜12のN末端Hisタグ付けω-トランスアミナーゼ（実施例4および図6参照）の活性は、50 mM HEPES緩衝液（pH＝7.5）、10 mM N6-アセチル-1,6-ジアミノヘキサン、10 mMピルベート、および100μMピリドキシル5'ホスフェートの終濃度で構成される緩衝液を用いてアッセイされた。各酵素活性アッセイ反応は、ω-トランスアミナーゼの無細胞抽出液または空ベクターの対照を、N6-アセチル-1,6-ジアミノヘキサンを含むアッセイ緩衝液に添加することによって開始され、その後、25℃で4時間、250 rpmで振盪され、インキュベートされた。L-アラニンの形成は、RP-HPLCを介して定量化された。
N6-アセチル-1,6-ジアミノヘキサンを含まない各酵素のみの対照は、ピルベートからL-アラニンへの低いベースラインの変換を示した。図11参照。
SEQ ID NO：7〜12の遺伝子産物は、空ベクターの対照に対して確認されるように、基質としてN6-アセチル-1,6-ジアミノヘキサンを受容し（図15参照）、反応産物としてN6-アセチル-6-アミノヘキサナールを合成した。
ω-トランスアミナーゼ活性の可逆性を考慮すると（実施例1参照）、SEQ ID NO：7〜12の遺伝子産物は、基質としてN6-アセチル-6-アミノヘキサナールを受容し、N6-アセチル-1,6-ジアミノヘキサンを形成する。
実施例7
基質としてアジピン酸セミアルデヒドを用い、ヘキサンジアールを形成する、カルボン酸レダクターゼの酵素活性
SEQ ID NO：6のN末端Hisタグ付けカルボン酸レダクターゼ（実施例2および図6参照）は、基質としてアジピン酸セミアルデヒドを用いてアッセイされた。酵素活性アッセイは、50 mM HEPES緩衝液（pH＝7.5）、2 mMアジピン酸セミアルデヒド、10 mM MgCl2、1 mM ATP、および1 mM NADPHの終濃度で構成される緩衝液中で、三つ組で実施された。酵素活性アッセイ反応は、精製されたカルボン酸レダクターゼおよびホスホパンテテイントランスフェラーゼまたは空ベクターの対照を、アジピン酸セミアルデヒドを含むアッセイ緩衝液に添加することによって開始され、その後、室温で20分間、インキュベートされた。NADPHの消費は、340 nmの吸光度によってモニターされた。アジピン酸セミアルデヒドを含まない酵素のみの対照は、低いベースラインのNADPHの消費を示した。図7参照。
SEQ ID NO：6の遺伝子産物は、sfpの遺伝子産物によって増強され、空ベクターの対照に対して確認されるように、基質としてアジピン酸セミアルデヒドを受容し（図10参照）、ヘキサンジアールを合成した。
実施例8
基質として4-ヒドロキシブチリル-CoAおよびアセチル-CoAを用い、3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAを形成する、β-ケトチオラーゼの活性
N末端Hisタグをコードするヌクレオチド配列を、N末端HISタグ付け酵素が産生され得るように、SEQ ID NO：14のβ-ケトチオラーゼ活性をコードするクロストリジウム・アミノブチリカム由来の遺伝子（図6参照）に加えた。得られた修飾遺伝子は、T7プロモーターの制御下で、pET15b発現ベクター中にクローン化され、発現ベクターは、BL21 [DE3]大腸菌宿主中に形質転換された。得られた組換え大腸菌株は、350 mL LB培地およびアンピシリン抗生物質選択圧を含み、230 rpmで振盪される1 L振盪フラスコ培養において37℃で培養された。各培養物は、1 mM IPTGを用いて25℃で一晩誘導された。
誘導された各振盪フラスコ培養物からのペレットは、遠心分離を介して回収された。各ペレットは、超音波処理を介して再懸濁および溶解された。細胞片は、遠心分離を介して上清から分離された。酵素は、Ni-アフィニティクロマトグラフィーを用いて、上清から精製され、緩衝液は変更され、50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH＝6.8）中で限外濾過を介して濃縮された。
4-ヒドロキシブチリル-CoAおよびアセチル-CoAを3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAに変換する酵素活性アッセイは、50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH＝6.8）、75μM ZnCl2、10 mM γ-ブチロラクトン、および5 mMアセチル-CoAの終濃度で構成される緩衝液中で、三つ組で実施された。酵素活性アッセイ反応は、SEQ ID NO：14およびアシネトバクター属由来のChnCによってコードされるラクトナーゼを、10 mM γ-ブチロラクトンおよび5 mMアセチル-CoAを含むアッセイ緩衝液にそれぞれ5[μM]の終濃度で添加することによって開始され、30℃で3時間、180 rpmで振盪され、インキュベートされた。3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAの形成は、LC-MSを介して決定された。
1つの基質または1つの酵素を除外する陰性対照は、3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAへの変換を示さなかった。SEQ ID NO：14は、基質として4-ヒドロキシブチリル-CoAおよびアセチル-CoAを受容し、LC-MSを介して確認されるように、反応産物として3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAを合成した。
他の態様
本発明はその詳細な説明と共に記載されるが、先の記載は説明することを意図しており、特許請求の範囲によって定義される発明の範囲を制限するものではない。他の局面、利点、および改変は、特許請求の範囲の範囲内である。

Claims (49)

  1. EC. 2.3.1.-に分類されるβ-ケトチオラーゼ活性を有するポリペプチドを用いて、4-ヒドロキシブチリル-CoAを3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAに酵素的に変換する段階を含む、3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAまたはその塩を産生する方法。
  2. 前記β-ケトチオラーゼ活性を有するポリペプチドが、EC 2.3.1.16に分類される、請求項1記載の方法。
  3. 前記β-ケトチオラーゼ活性を有するポリペプチドが、EC 2.3.1.174に分類される、請求項1記載の方法。
  4. 前記β-ケトチオラーゼ活性を有するポリペプチドが、SEQ ID NO：1、13、または14に示されるアミノ酸配列と少なくとも70％の配列同一性を有する、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
  5. 3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼまたは3-オキソアシル-CoAレダクターゼ、エノイル-CoAヒドラターゼ、トランス-2-エノイル-CoAレダクターゼ、およびチオエステラーゼまたはCoAトランスフェラーゼを用いて、3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAを6-ヒドロキシヘキサノエートに酵素的に変換する段階をさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
  6. 3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼまたは3-オキソアシル-CoAレダクターゼが、EC 1.1.1.35、EC 1.1.1.36、EC 1.1.1.100、またはEC 1.1.1.157に分類される、請求項5記載の方法。
  7. エノイル-CoAヒドラターゼが、EC 4.2.1.17またはEC 4.2.1.119に分類される、請求項5または6記載の方法。
  8. トランス-2-エノイル-CoAレダクターゼが、EC 1.3.1.38、EC 1.3.1.44、またはEC 1.3.1.8に分類される、請求項5〜7のいずれか一項記載の方法。
  9. EC.2.3.1.-に分類されるβ-ケトチオラーゼ活性を有するポリペプチドを用いて、4-ヒドロキシブチリル-CoAから3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAを酵素的に合成する段階、および3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAを6-ヒドロキシヘキサノエートに酵素的に変換する段階を含む、6-ヒドロキシヘキサノエートを生合成するための方法。
  10. 3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAが、3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼまたは3-オキソアシル-CoAレダクターゼを用いて3-ヒドロキシ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAに変換され、3-ヒドロキシ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAが、エノイル-CoAヒドラターゼを用いて2,3-デヒドロ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAに変換され、2,3-デヒドロ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAが、トランス-2-エノイル-CoAレダクターゼを用いて6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAに変換され、且つ6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAが、チオエステラーゼまたはCoAトランスフェラーゼを用いて6-ヒドロキシヘキサノエートに変換される、請求項9記載の方法。
  11. 1つまたは複数の段階で、6-ヒドロキシヘキサノエートを、アジピン酸、6-アミノヘキサノエート、カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン、または1,6-ヘキサンジオールに酵素的に変換することをさらに含む、請求項5〜10のいずれか一項記載の方法。
  12. 6-ヒドロキシヘキサノエートが、モノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブタン酸デヒドロゲナーゼ、5-ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼ、6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、7-オキソヘプタン酸デヒドロゲナーゼ、6-オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、5-オキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、またはアルデヒドデヒドロゲナーゼの1つまたは複数を用いてアジピン酸に変換される、請求項11記載の方法。
  13. 6-ヒドロキシヘキサノエートが、アルコールデヒドロゲナーゼ、6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、5-ヒドロキシペンタン酸デヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、およびω-トランスアミナーゼの1つまたは複数を用いて、6-アミノヘキサノエートに変換される、請求項11記載の方法。
  14. 6-ヒドロキシヘキサノエートが、アルコールデヒドロゲナーゼ、6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、5-ヒドロキシペンタン酸デヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、ω-トランスアミナーゼ、およびアミドヒドロラーゼの1つまたは複数を用いて、カプロラクタムに変換される、請求項11記載の方法。
  15. 6-ヒドロキシヘキサノエートが、カルボン酸レダクターゼ、ω-トランスアミナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、N-アセチルトランスフェラーゼ、およびアセチルプトレシンデアシラーゼの1つまたは複数を用いて、ヘキサメチレンジアミンに変換される、請求項11記載の方法。
  16. ω-トランスアミナーゼが、SEQ ID NO：7〜12に示されるアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも70％の配列同一性を有する、請求項13、14、または15記載の方法。
  17. 6-ヒドロキシヘキサノエートが、カルボン酸レダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼを用いて、1,6-ヘキサンジオールに変換される、請求項11記載の方法。
  18. カルボン酸レダクターゼが、SEQ ID NO：2〜6に示されるアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも70％の配列同一性を有する、請求項15〜17のいずれか一項記載の方法。
  19. 4-ヒドロキシブチリル-CoAが、2-オキソグルタレートから酵素的に産生される、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
  20. 4-ヒドロキシブチリル-CoAが、グルタミン酸シンターゼ；2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ；分枝鎖デカルボキシラーゼ；グルタミン酸デカルボキシラーゼ；ω-トランスアミナーゼ；CoAトランスフェラーゼ、CoAリガーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼの1つまたは複数を用いて、2-オキソグルタレートから酵素的に産生される、請求項19記載の方法。
  21. 組換え宿主において実施される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  22. 前記宿主が、好気性、嫌気性、または微好気性の培養条件下で培養ストラテジーに供される、請求項21記載の方法。
  23. 前記宿主が、栄養制限条件下で培養される、請求項21または22記載の方法。
  24. 前記宿主が、発酵の間、高細胞密度を維持するために、セラミック膜を用いて保持される、請求項21〜23のいずれか一項記載の方法。
  25. 発酵に供給される主要な炭素源が、生物学的フィードストックに由来する、請求項21〜24のいずれか一項記載の方法。
  26. 生物学的フィードストックが、単糖、二糖、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、リグニン、レブリン酸、ギ酸、トリグリセリド、グリセロール、脂肪酸、農業廃棄物、濃縮された蒸留可溶分、もしくは一般廃棄物であるか、またはそれらに由来する、請求項25記載の方法。
  27. 発酵に供給される主要な炭素源が、非生物学的フィードストックに由来する、請求項21〜24のいずれか一項記載の方法。
  28. 非生物学的フィードストックが、天然ガス、合成ガス、CO2/H2、メタノール、エタノール、ベンゾエート、シクロヘキサン酸化プロセスからの不揮発性残留物（NVR）腐食性洗浄廃棄物ストリーム、もしくはテレフタル酸／イソフタル酸混合物の廃棄物ストリームであるか、またはそれらに由来する、請求項27記載の方法。
  29. 前記宿主が原核生物である、請求項21〜28のいずれか一項記載の方法。
  30. 前記原核生物が、大腸菌属（Escherichia）；クロストリジウム属（Clostridia）；コリネバクテリウム属（Corynebacteria）；カプリアビダス属（Cupriavidus）；シュードモナス属（Pseudomonas）；デルフチア属（Delftia）；バチルス属（Bacilluss）；ラクトバチルス属（Lactobacillus）；ラクトコックス属（Lactococcus）；およびロドコッカス属（Rhodococcus）からなる群より選択される属に由来する、請求項29記載の方法。
  31. 前記原核生物が、大腸菌（Escherichia coli）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）、クロストリジウム・クライベリ（Clostridium kluyveri）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）、カプリアビダス・メタリデュランス（Cupriavidus metallidurans）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleavorans）、デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtillis）、ラクトバチルス・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、およびロドコッカス・エクイ（Rhodococcus equi）からなる群より選択される、請求項30記載の方法。
  32. 前記宿主が真核生物である、請求項21〜28のいずれか一項記載の方法。
  33. 前記真核生物が、アスペルギルス属（Aspergillus）、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、ピキア属（Pichia）、ヤロウイア属（Yarrowia）、イサチェンキア属（Issatchenkia）、デバリオマイセス属（Debaryomyces）、アルクスラ属（Arxula）、およびクリベロマイセス属（Kluyveromyces）からなる群より選択される属に由来する、請求項32記載の方法。
  34. 前記真核生物が、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、イサチェンキア・オリエンタリス（Issathenkia orientalis）、デバリオマイセス・ハンセニ（Debaryomyces hansenii）、アルクスラ・アデニニボランス（Arxula adenoinivorans）、およびクリベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）からなる群より選択される、請求項33記載の方法。
  35. 高濃度のC6ビルディングブロックに対する前記宿主の耐性が、選択的環境における連続培養を介して改良される、請求項21記載の方法。
  36. 前記宿主が、以下の酵素：
    ポリヒドロキシアルカン酸シンターゼ、アセチル-CoAチオエステラーゼ、アセテートを形成するホスホトランスアセチラーゼ、酢酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、メナキノール-フマル酸オキシドレダクターゼ、エタノールを形成するアルコールデヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、NADH消費トランスヒドロゲナーゼ、NADH特異的グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、NADH/NADPH利用グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ピメロイル-CoAデヒドロゲナーゼ；基質として中心的前駆体およびC6ビルディングブロックを受容するアシル-CoAデヒドロゲナーゼ；ブタリル-CoAデヒドロゲナーゼ；またはアジピル-CoAシンセターゼ
    の1つもしくは複数の減弱化を含む、請求項21〜35のいずれか一項記載の方法。
  37. 前記宿主が、アセチル-CoAシンセターゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ；トランスケトラーゼ；プリジン（puridine）ヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ；グリセルアルデヒド-3P-デヒドロゲナーゼ；リンゴ酸酵素；グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ；グルコースデヒドロゲナーゼ；フルクトース1,6ジホスファターゼ；L-アラニンデヒドロゲナーゼ；L-グルタミン酸デヒドロゲナーゼ；ギ酸デヒドロゲナーゼ；L-グルタミンシンセターゼ；ジアミントランスポーター；ジカルボン酸トランスポーター；および／または多剤トランスポーターをコードする1つもしくは複数の遺伝子を過剰発現する、請求項21〜36のいずれか一項記載の方法。
  38. （i）β-ケトチオラーゼ、（ii）チオエステラーゼまたはCoAトランスフェラーゼ、および（iii）3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼまたは3-オキソアシル-CoAレダクターゼの1つまたは複数、（iv）エノイル-CoAヒドラターゼ、および（v）トランス-2-エノイル-CoAレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸を含み、6-ヒドロキシヘキサノエートを産生する、組換え宿主。
  39. 以下の外因性酵素：
    モノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブタン酸デヒドロゲナーゼ、5-ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼ、6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、7-オキソヘプタン酸デヒドロゲナーゼ、6-オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、5-オキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ
    の1つもしくは複数をさらに含み、アジピン酸をさらに産生する、請求項38記載の組換え宿主。
  40. 以下の外因性酵素：
    モノオキシゲナーゼ、トランスアミナーゼ、6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、5-ヒドロキシペンタン酸デヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼ
    の1つもしくは複数をさらに含み、6-アミノヘキサノエートをさらに産生する、請求項38記載の組換え宿主。
  41. 外因性アミドヒドロラーゼをさらに含み、カプロラクタムをさらに産生する、請求項40記載の組換え宿主。
  42. 以下の外因性酵素：
    カルボン酸レダクターゼ、ω-トランスアミナーゼ、デアシラーゼ、N-アセチルトランスフェラーゼ、またはアルコールデヒドロゲナーゼ
    の1つもしくは複数をさらに含み、ヘキサメチレンジアミンをさらに産生する、請求項38記載の組換え宿主。
  43. 外因性カルボン酸レダクターゼおよび外因性アルコールデヒドロゲナーゼをさらに含み、1,6-ヘキサンジオールをさらに産生する、請求項38記載の組換え宿主。
  44. 以下の外因性酵素：
    グルタミン酸シンターゼ；2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ；分枝鎖デカルボキシラーゼ；グルタミン酸デカルボキシラーゼ；ω-トランスアミナーゼ；CoA-リガーゼ；CoA-トランスフェラーゼ；およびアルコールデヒドロゲナーゼ
    の1つもしくは複数をさらに含む、請求項38〜43のいずれか一項記載の組換え宿主。
  45. i．請求項1〜44のいずれか一項または図1〜5のいずれか1つに記載される、少なくとも1つの生物由来の、生物ベースのもしくは発酵由来の化合物またはそれらの塩、またはそれらの任意の組み合わせを含む、組成物；
    ii．上記iに記載される、生物由来の、生物ベースのもしくは発酵由来の組成物または化合物、またはそれらの任意の組み合わせを含む、生物由来の、生物ベースのもしくは発酵由来のポリマー；
    iii．上記iに記載される、生物由来の、生物ベースのもしくは発酵由来の化合物、または生物由来の、生物ベースのもしくは発酵由来の組成物、またはそれらの任意の組み合わせ、または上記iiに記載される、生物由来の、生物ベースのもしくは発酵由来のポリマー、またはそれらの任意の組み合わせを含む、生物由来の、生物ベースのもしくは発酵由来の樹脂；
    iv．上記iiに記載される、生物由来の、生物ベースのもしくは発酵由来のポリマー、または上記iiiに記載される、生物由来の、生物ベースのもしくは発酵由来の樹脂、またはそれらの任意の組み合わせを成形することによって得られた成形物質；
    v．上記iに記載される、生物由来の、生物ベースのもしくは発酵由来の組成物、上記iに記載される、生物由来の、生物ベースのもしくは発酵由来の化合物、上記iiに記載される、生物由来の、生物ベースのもしくは発酵由来のポリマー、上記iiiに記載される、生物由来の、生物ベースのもしくは発酵由来の樹脂、上記ivに記載される、生物由来の、生物ベースのもしくは発酵由来の成形物質、またはそれらの任意の組み合わせを含む、生物由来の、生物ベースのもしくは発酵由来の配合物；または
    vi．上記iに記載される、生物由来の、生物ベースのもしくは発酵由来の組成物、上記iに記載される、生物由来の、生物ベースのもしくは発酵由来の化合物、上記iiに記載される、生物由来の、生物ベースのもしくは発酵由来のポリマー、上記iiiに記載される、生物由来の、生物ベースのもしくは発酵由来の樹脂、上記vに記載される、生物由来の、生物ベースのもしくは発酵由来の配合物、上記ivに記載される、生物由来の、生物ベースのもしくは発酵由来の成形物質、またはそれらの任意の組み合わせを含む、生物由来の、生物ベースのもしくは発酵由来の半固体または非半固体のストリーム
    を含む、生物由来の産物、生物ベースの産物、または発酵由来の産物。
  46. 図1〜5のいずれか1つに記載の少なくとも1つの酵素の活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む、非天然の生物。
  47. 4-ヒドロキシブチリル-CoA、EC. 2.3.1に分類されるβ-ケトチオラーゼの活性を有するポリペプチドをコードする外因性の核酸、および3-オキソ-6-ヒドロキシヘキサノイル-CoAを含む、非天然の生化学的ネットワーク。
  48. （a）β-ケトチオラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、該ポリペプチドの産生を指示する1つまたは複数の異種制御配列（heterologous control sequence）と機能的に結合され、且つ該β-ケトチオラーゼ活性を有するポリペプチドが、（a）SEQ ID NO：1、13、または14のポリペプチドと少なくとも70％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される、前記ポリヌクレオチド；
    （b）ω-トランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、該ポリペプチドの産生を指示する1つまたは複数の異種制御配列と機能的に結合され、且つ該ω-トランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドが、（a）SEQ ID NO：7〜12のポリペプチドと少なくとも70％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される、前記ポリヌクレオチド；
    （c）カルボン酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、該ポリペプチドの産生を指示する1つまたは複数の異種制御配列と機能的に結合され、且つ該カルボン酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドが、（a）SEQ ID NO：2〜6のポリペプチドと少なくとも70％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される、前記ポリヌクレオチド；または
    （d）3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼ、3-オキソアシル-CoAレダクターゼ、エノイル-CoAヒドラターゼ、トランス-2-エノイル-CoAレダクターゼ、チオエステラーゼCoAトランスフェラーゼ、モノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブタン酸デヒドロゲナーゼ、5-ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼ、6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、7-オキソヘプタン酸デヒドロゲナーゼ、6-オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、5-オキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、6-ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、5-ヒドロキシペンタン酸デヒドロゲナーゼ、ω-トランスアミナーゼ、アミドヒドロラーゼ、グルタミン酸シンターゼ；2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ；分枝鎖デカルボキシラーゼ；グルタミン酸デカルボキシラーゼ；ω-トランスアミナーゼ；CoAトランスフェラーゼ、CoAリガーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
    を含む、核酸構築物または発現ベクター。
  49. 請求項48記載の核酸構築物または発現ベクターを含む、組成物。
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