JP2022154337A - 組換え微生物及びアジピン酸又はその誘導体の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】アジピン酸またはアジピン酸誘導体を効率的に生産することのできる組換え微生物、及び、アジピン酸またはアジピン酸誘導体の製造方法を提供すること。【解決手段】３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼをコードする外来性遺伝子および２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼをコードする外来性遺伝子のうちの少なくとも１つを含む、組換え微生物。【選択図】図１

Description

本発明は、組換え微生物及びアジピン酸又はその誘導体の製造方法に関する。

近年、化学品製造プロセスにおいて従来使用されている化石燃料由来の原料の枯渇が危惧され、かつ、地球温暖化の一因とされていることから、化石燃料由来の原料から、バイオマス由来の再生可能原料への転換が望まれている。

アジピン酸（ＣＡＳ Ｎｏ．１２４－０４－９）は、ナイロン－６６などに代表されるポリアミド原料、ウレタン、および可塑剤原料として使用されるモノマー化合物である。アジピン酸の現在の一般的な製造方法は、化学合成法、例えば、シクロヘキサノール単独、または、シクロヘキサノールとシクロヘキサノンとの混合物（Ｋ／Ａオイル）を硝酸で酸化する方法である。

バイオマス由来原料を用いたアジピン酸の製造方法としては、遺伝子組換え微生物を用いてバイオマス由来炭素源をｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸に変換した後、得られたｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸を水素化してアジピン酸を生産する方法が提案されている（特許文献１）。また、遺伝子組み換え体を用いてα－ケトグルタル酸からアジピン酸を生産する方法も提案されている（特許文献２）。

さらに、バイオマス由来原料からの直接的なアジピン酸の発酵生産方法についても提案されている（特許文献３）。この方法では、アジピン酸を生産することのできる天然に存在しない微生物として、スクシニル－ＣｏＡおよびアセチル－ＣｏＡを３－オキソアジピル－ＣｏＡに変換する「スクシニル－ＣｏＡ：アセチル－ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ」；３－オキソアジピル－ＣｏＡを３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡに変換する「３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」；３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを５－カルボキシ―２－ペンテノイル－ＣｏＡに変換する「３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡデヒドラターゼ」；５－カルボキシ―２－ペンテノイル－ＣｏＡをアジピル－ＣｏＡに変換する「５－カルボキシ－２－ペンテノイル－ＣｏＡレダクターゼ」；およびアジピル－ＣｏＡをアジペートに変換する「ホスホトランスアジピラーゼ」／「アジピン酸キナーゼ」を含む天然に存在しない微生物が挙げられているが、各酵素に関し、反応を進める可能性がある酵素をコードする遺伝子を示しているに留まり、これらの遺伝子を用いることによってバイオマス由来炭素原料からアジピン酸を良好な収率で生産できることについては実証されていない。

国際公開第１９９５／００７９９６号 国際公開第２０１０／１０４３９１号 特開２０１１－５１５１１１号公報

本発明の目的は、アジピン酸またはアジピン酸誘導体を効率よく生産することのできる組換え微生物、及び、アジピン酸またはアジピン酸誘導体の製造方法を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、新たに自然界より単離された微生物であるバークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３３３４）が有する所定の酵素を発現させた遺伝子組換え微生物物を培養することで効率的にアジピン酸類を生産できることを見出し、本発明に至った。

すなわち、本発明は、以下のとおりである：
［１］３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼをコードする外来性遺伝子および２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼをコードする外来性遺伝子のうちの少なくとも１つを含む、組換え微生物；
［２］前記３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼおよび２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼの少なくとも１つが、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）ＬＥＢＰ－３株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３３３４）に由来する、［１］に記載の組換え微生物；
［３］前記３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼが、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
（１ａ）配列番号５に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
（１ｂ）配列番号５に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列を含むヌクレオチド
をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物と配列同一性が８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるＤＮＡにコードされ、
当該ＤＮＡは、６２６～９４０ｂｐを有する、［１］または［２］に記載の組換え微生物；
［４］前記２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼが、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
（２ａ）配列番号７に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
（２ｂ）配列番号７に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列を含むヌクレオチド
をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物と配列同一性が８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるＤＮＡにコードされ、
当該ＤＮＡは、９２４～１３８６ｂｐを有する、［１］～［３］のいずれか１項に記載の組換え微生物；
［５］前記３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼが、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
（１ａ）配列番号５に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
（１ｂ）配列番号５に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列を含むヌクレオチド
をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であるＤＮＡにコードされ、
当該ＤＮＡは、７８３または７８４ｂｐを有する、［１］または［２］に記載の組換え微生物；
［６］前記２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼが、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
（２ａ）配列番号７に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
（２ｂ）配列番号７に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列を含むヌクレオチド
をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であるＤＮＡにコードされ、
当該ＤＮＡは、１１５５または１１５６ｂｐを有する、［１］～［３］のいずれか１項に記載の組換え微生物；
［７］上記組換え微生物が、エッセリシア属、コリネバクテリウム属、バチルス属、アシネトバクター属、バークホルデリア属、シュードモナス属、クロストリジウム属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ヤロウィア属、カンジタ属、ピキア属およびアスペルギルス属からなる群より選択される属に属する、［１］～［６］のいずれか１項に記載の組換え微生物；
［８］アジピン酸生産経路を有する、［１］～［７］のいずれか一項に記載の組換え微生物；
［９］ヘキサメチレンジアミン生産経路を有する、［１］～［８］のいずれか一項に記載の組換え微生物；
［１０］１，６－ヘキサンジオール生産経路を有する、［１］～［８］のいずれか一項に記載の組換え微生物；
［１１］６－アミノ－１－ヘキサノール生産経路を有する、［１］～［８］のいずれか一項に記載の組換え微生物；
［１２］［１］～［７］のいずれか１項に記載の組換え微生物を培養する培養工程を含む、目的化合物の製造方法であって、
前記目的化合物が、アジピン酸、アジピン酸誘導体、ヘキサメチレンジアミン、１，６－ヘキサンジオールおよび６－アミノ－１－ヘキサノールからなる群より選択され、
前記アジピン酸誘導体が、オキソアジピン酸、レブリン酸、３－ヒドロキシアジピン酸および２，３－デヒドロアジピン酸からなる群より選択される、製造方法；
［１３］［８］に記載の組換え微生物を培養する培養工程を含む、アジピン酸の製造方法；
［１４］［９］に記載の組換え微生物を培養する培養工程を含む、ヘキサメチレンジアミンの製造方法；
［１５］［１０］に記載の組換え微生物を培養する培養工程を含む、１，６－ヘキサンジオールの製造方法；
［１６］［１１］に記載の組換え微生物を培養する培養工程を含む、６－アミノ－１－ヘキサノールの製造方法；
［１７］（Ａ－１）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
（ａ１）配列番号５に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
（ａ２）配列番号５に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列を含むヌクレオチド
をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物と配列同一性が８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドであって、
３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼ活性を有し、
前記ＤＮＡは、６２６～９４０ｂｐを有する、組換えポリペプチド；
（Ａ－２）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
（ａ１）配列番号５に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
（ａ２）配列番号５に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列を含むヌクレオチド
をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であるＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる組換えポリペプチドであって、
３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼ活性を有し、
前記ＤＮＡは、６２６～９４０ｂｐを有する、組換えポリペプチド；
または
（Ａ－３）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
（ａ１）配列番号５に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
（ａ２）配列番号５に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列を含むヌクレオチド
をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物の縮重異性体からなるＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドであって、
３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼ活性を有し、
前記ＤＮＡは、６２６～９４０ｂｐを有する、組換えポリペプチド；
［１８］（Ｂ－１）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
（ｂ１）配列番号７に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
（ｂ２）配列番号７に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列を含むヌクレオチド
をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物と配列同一性が８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドであって、
２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ活性を有し、
前記ＤＮＡは、９２４～１３８６ｂｐを有する、組換えポリペプチド；
（Ｂ－２）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
（ｂ１）配列番号７に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
（ｂ２）配列番号７に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列を含むヌクレオチド
をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であるＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる組換えポリペプチドであって、
２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ活性を有し、
前記ＤＮＡは、９２４～１３８６ｂｐを有する、組換えポリペプチド；
または
（Ｂ－３）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
（ｂ１）配列番号７に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
（ｂ２）配列番号７に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列を含むヌクレオチド
をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物の縮重異性体からなるＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドであって、
２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ活性を有し、
前記ＤＮＡは、９２４～１３８６ｂｐを有する、組換えポリペプチド。

本発明により、アジピン酸またはアジピン酸誘導体を効率的に生産することのできる組換え微生物、及び、アジピン酸またはアジピン酸誘導体の製造方法が提供される。

図１は、本発明に係る組換え微生物が有するアジピン酸、アジピン酸誘導体、ヘキサメチレンジアミン、１，６－ヘキサンジオールおよび６－アミノ－１－ヘキサノール生産経路の例を示す。 図２は、ＰＣＲにおける増幅対象の遺伝子および用いたプライマーを示す。 図３は、各酵素のアミノ酸配列を示す。 図４Ａは、各酵素をコードする塩基配列を示す。 図４Ｂは、各酵素をコードする塩基配列を示す。 図５Ａは、ＰＣＲにおける増幅対象および用いたプライマーを示す。 図５Ｂは、ＰＣＲにおける増幅対象および用いたプライマーを示す。 図６は、酵素のアミノ酸配列を示す。 図７Ａは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図７Ｂは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図７Ｃは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図７Ｄは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図７Ｅは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図８Ａは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図８Ｂは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図８Ｃは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図８Ｄは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図９Ａは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図９Ｂは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図９Ｃは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図９Ｄは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図９Ｅは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図１０は、酵素のアミノ酸配列を示す。

以下に本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。また、本明細書に記述されているＤＮＡの取得、ベクターの調製および形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２０１２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、遺伝子工学実験ノート（羊土社 田村隆明）等に記載されている公知の方法により行うことができる。本明細書において特に断りのない限りヌクレオチド配列は５’方向から３’方向に向けて記載される。本明細書において、「ポリペプチド」および「タンパク質」の語は、互換可能に使用される。

本明細書において、「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。本明細書に段階的に記載されている数値範囲において、ある段階の数値範囲の上限値又は下限値は、他の段階の数値範囲の上限値又は下限値と任意に組み合わせることができる。

本発明にかかる組換え微生物は、アジピン酸（Ａｄｉｐｉｃ ａｃｉｄ；ＡＤＡ）（ＣＡＳ Ｎｏ．１２４－０４－９）またはアジピン酸誘導体を効率よく生産することができるよう、宿主微生物に対して遺伝子の改変が行われた微生物である。

本明細書において、「アジピン酸誘導体」は、炭素数３～５の脂肪族炭化水素基と、１または複数のカルボキシル基とを有する、脂肪族カルボン酸である。アジピン酸誘導体の有する脂肪族炭化水素基は、飽和または不飽和である。脂肪族炭化水素基において、炭素は、例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ケトン基、アミノ基等の置換基によって置換されていても良い。「アジピン酸誘導体」の有する脂肪族炭化水素基の炭素数は、好ましくは、３または４である。「アジピン酸誘導体」の有するカルボキシル基は、好ましくは、１または２である。「アジピン酸誘導体」の具体例としては、炭素数４の脂肪族炭化水素基と２つのカルボン酸とを有する３－オキソアジピン酸（３－Ｏｘｏａｄｉｐｉｃ ａｃｉｄ；３－ＯＡ）、炭素数３の脂肪族炭化水素基と１つのカルボン酸とを有するレブリン酸（Ｌｅｖｕｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ；ＬＥＶ）、炭素数４の脂肪族炭化水素基と２つのカルボン酸とを有する３－ヒドロキシアジピン酸（３－Ｈｙｄｒｏｘｙａｄｉｐｉｃ ａｃｉｄ；３ＨＡ）および炭素数４の脂肪族炭化水素基と２つのカルボン酸とを有する２，３－デヒドロアジピン酸（２，３－Ｄｅｈｙｄｒｏａｄｉｐｉｃ ａｃｉｄ；２３ＤＡ）が挙げられる（図１参照）。

本明細書中におけるアジピン酸およびアジピン酸誘導体は、任意の塩形態を含めた中性または電離形態を取り得ることや、本形態がｐＨに依存することは当業者により理解される。したがって、「アジピン酸」および「アジピン酸誘導体」には、遊離酸の形態のほか、任意の塩形態および電離形態が包含される。本明細書において、アジピン酸およびアジピン酸誘導体をまとめて、「アジピン酸類」または「アジピン酸類縁体」と総称することがある。

本発明にかかる組換え微生物によって生産されたアジピン酸を原料として、６－アミノカプロン酸、ヘキサメチレンジアミン、１，６－ヘキサンジオールおよび６－アミノ－１－ヘキサノールを合成することも可能である。合成方法は化学合成法や酵素や酵素を内在する微生物を利用する生物学的合成法などを問わない。また、アジピン酸を上記化合物に変換するための代謝経路を含む微生物であれば、細胞内でアジピン酸を中間体として使用する原料からの代謝変換も可能である。

本発明にかかる遺伝子組換え微生物は、具体的に、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼをコードする外来性遺伝子および２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼをコードする外来性遺伝子のうちの少なくとも１つを含む。このような外来性遺伝子の少なくとも１つを含むことにより、組換え微生物は、アジピン酸生産経路を有することとなり、アジピン酸またはアジピン酸誘導体を製造することができる。本明細書において、「遺伝子組換え微生物」は、単に「組換え微生物」とも称する。

本明細書において、「内因」ないし「内因性」という用語は、本願で言及している遺伝子組換えによる改変がなされていない宿主微生物が、言及している遺伝子ないしはそれによりコードされるタンパク質（典型的には酵素）を、当該宿主細胞内で優位な生化学的反応を進行させ得る程度に機能的に発現しているかどうかに関わらず、宿主微生物が有していることを意味するために用いられる。

本明細書において、「外来」ないし「外来性」という用語は、遺伝子組換え前の宿主微生物が本発明により導入されるべき遺伝子がコードする酵素を実質的に発現していない場合、及び異なる遺伝子により当該酵素のアミノ酸配列をコードしているが、遺伝子組換え後に匹敵する内因性酵素活性を発現しない場合において、本発明に基づく遺伝子ないし核酸配列を宿主に導入することを意味するために用いられる。

３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼおよび２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼの少なくとも１つは、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）ＬＥＢＰ－３株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３３３４）に由来する。好ましくは、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼおよび２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼの両方が、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）ＬＥＢＰ－３株に由来する。

３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼをコードする外来性遺伝子および２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼをコードする外来性遺伝子の少なくとも１つは、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）ＬＥＢＰ－３株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３３３４）に由来する。好ましくは、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼをコードする外来性遺伝子および２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼをコードする外来性遺伝子の両方が、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）ＬＥＢＰ－３株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３３３４）に由来する。

本発明の遺伝子組換え微生物は、上記酵素をコードする外来遺伝子のうちの少なくとも１つが導入されていればよい。本発明の遺伝子組換え微生物は、好ましくは、アジピン酸生産経路の各反応段階を触媒する酵素をコードする外来遺伝子のうち少なくとも１つが導入され、外来性酵素を発現する。また、本発明の遺伝子組換え微生物が、外来遺伝子の導入によらずとも、アジピン酸生産経路の反応段階を触媒する十分な量の酵素を発現する場合は、内因遺伝子にコードされる酵素によって反応が進行してもよい。本発明において、ある化合物に関し、「生産経路を有する」とは、本発明にかかる遺伝子組換え微生物が、その化合物の生産経路の各反応段階が進行するために十分な量の酵素を発現し、その化合物を生合成可能であることを意味する。

本発明にかかる組換え微生物は、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼおよび２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼの少なくとも１つを発現していることが好ましい。本発明にかかる組換え微生物が、これら酵素の少なくとも一方を発現していることにより、アジピン酸生産経路の反応段階が進行し、目的化合物を生産することができる。

より好ましくは、本発明にかかる組換え微生物は、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼおよび２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼの双方を発現する。本発明にかかる組換え微生物が、これら酵素を発現していることにより、アジピン酸生産経路の反応段階の各々が進行し、目的化合物を生産することができる。

さらにより好ましくは、本発明にかかる組換え微生物は、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼおよび２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼに加えて、オキシドレダクターゼおよび／またはβ－ケトチオラーゼを発現する。本発明にかかる組換え微生物が、これら酵素を発現していることにより、アジピン酸生産経路の反応段階の各々が進行し、目的化合物を効率よく生産することができる（図１参照）。

以下、本発明にかかる組換え微生物が含む遺伝子がコードする酵素の各々について詳述する。

＜３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼ＞
３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼは、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡへと変換する反応を触媒する酵素である（図１のステップＣ）。

一態様において、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼは、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、所定のヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物と配列同一性が６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるＤＮＡにコードされる。ここで、当該ＤＮＡは、例えば６２６～９４０ｂｐ、好ましくは７４０～８６２ｂｐ、より好ましくは７４３～８２３ｂｐ、さらにより好ましくは７６７～７９９ｂｐ、特により好ましくは７７５～７９１ｂｐ、最も好ましくは７７８～７８８ｂｐを有する。ＰＣＲに用いるプライマーについては後述する。

好ましい一態様において、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼは、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、所定のヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であるＤＮＡにコードされる。当該ＤＮＡは、例えば６２６～９４０ｂｐ、好ましくは７４０～８６２ｂｐ、より好ましくは７４３～８２３ｂｐ、さらにより好ましくは７６７～７９９ｂｐ、特により好ましくは７７５～７９１ｂｐ、最も好ましくは７７８～７８８ｂｐを有する。

更なる態様において、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼは、以下から選択される：
（Ａ－１）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、所定のヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物と配列同一性が６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドであって、
３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼ活性を有し、
前記ＤＮＡは、先述の塩基対数（ｂｐ）を有する、組換えポリペプチド；
（Ａ－２）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、所定のヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であるＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して例えば１～１０個、好ましくは１～７個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる組換えポリペプチドであって、
３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼ活性を有し、
前記ＤＮＡは、先述の塩基対数（ｂｐ）を有する、組換えポリペプチド；
および
（Ａ－３）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、所定のヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物の縮重異性体からなるＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドであって、
３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼ活性を有し、
前記ＤＮＡは、先述の塩基対数（ｂｐ）を有する、組換えポリペプチド。

更なる好ましい態様において、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼは、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、所定のヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物にコードされる組換えポリペプチドであり、当該増幅物の塩基対数は７８３または７８４ｂｐである。

３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼに関し、ＰＣＲに用いられるプライマー（フォワードおよびリバース）としては、以下が挙げられる（図２参照）。
（１ａ）配列番号５に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列からなるヌクレオチド、
（１ｂ）配列番号５に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列を含むヌクレオチド、
（１ｃ）配列番号５に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列からなるヌクレオチド、
（１ｄ）配列番号５に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列を含むヌクレオチド。

前記（１ｂ）の「配列番号５に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列を含むヌクレオチド」は、それぞれ、「配列番号５に示す塩基配列」および「配列番号６に示す塩基配列」に加えて、例えば１～２０ｂｐ、好ましくは１～１５ｂｐ、より好ましくは５～１５ｂｐ、さらに好ましくは１０～１５ｂｐがさらに追加されたヌクレオチド長を有する。

前記（１ｄ）の「配列番号５に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列を含むヌクレオチド」は、それぞれ、「配列番号５に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列」および「配列番号６に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列」に加えて、ベクター末端との相同配列を含み、例えば１～２０ｂｐ、好ましくは１～１５ｂｐ、より好ましくは５～１５ｂｐ、さらに好ましくは１０～１５ｂｐがさらに追加されたヌクレオチド長を有する。前記（１ｄ）の「配列番号５に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列を含むヌクレオチド、および、配列番号６に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列を含むヌクレオチド」の例としては、
（１ｄ’）配列番号３５に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号３６に示す塩基配列からなるヌクレオチド
が挙げられる（図５Ａ）。

３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼに関し、好ましいプライマーは、
（１ａ）配列番号５に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列からなるヌクレオチド、および
（１ｂ）配列番号５に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列を含むヌクレオチド
である。

上記ヌクレオチドをプライマーとして用いた、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅物であるＤＮＡは、好ましくは７８３または７８４ｂｐを有する。ここで、ＰＣＲで用いるＤＮＡポリメラーゼとしては当該分野で既知のものが用いられ、例えばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ホットスタート調整されたＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼ活性とは別に３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有するプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。

＜２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ＞
２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼは、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡをアジピル－ＣｏＡへと変換する反応を触媒する酵素である（図１のステップＤ参照）。

一態様において、２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼは、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、所定のヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物と配列同一性が６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるＤＮＡにコードされる。当該ＤＮＡは、例えば９２４～１３８６ｂｐ、好ましくは１０３９～１２４９ｂｐ、より好ましくは１０９７～１２１３ｂｐ、さらにより好ましくは１１３１～１１７９ｂｐ、特により好ましくは１１４３～１１６７ｂｐ、さらに特により好ましくは１１４５～１１６５ｂｐ、最も好ましくは１１５０～１１６０ｂｐを有する。

好ましい一態様において、２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼは、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、所定のヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であるＤＮＡにコードされる。当該ＤＮＡは、例えば９２４～１３８６ｂｐ、好ましくは１０３９～１２４９ｂｐ、より好ましくは１０９７～１２１３ｂｐ、さらにより好ましくは１１３１～１１７９ｂｐ、特により好ましくは１１４３～１１６７ｂｐ、さらに特により好ましくは１１４５～１１６５ｂｐ、最も好ましくは１１５０～１１６０ｂｐを有する。

更なる態様において、２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼは、以下から選択される：
（Ｂ－１）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、所定のヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物と配列同一性が６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドであって、
２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ活性を有し、
前記ＤＮＡは、先述の塩基対数（ｂｐ）を有する、組換えポリペプチド；
（Ｂ－２）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、所定のヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であるＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して、例えば１～１０個、好ましくは１～７個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる組換えポリペプチドであって、
２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ活性を有し、
前記ＤＮＡは、先述の塩基対数（ｂｐ）を有する、組換えポリペプチド；
および
（Ｂ－３）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、所定のヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物の縮重異性体からなるＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドであって、
２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ活性を有し、
前記ＤＮＡは、先述の塩基対数（ｂｐ）を有する、組換えポリペプチド。

更なる好ましい態様において、外来性の２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼは、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、所定のヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であり、当該増幅物の塩基対数は１１５５または１１５６ｂｐである。

２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼに関し、ＰＣＲに用いられるプライマー（フォワードおよびリバース）としては、以下が挙げられる（図２参照）。
（２ａ）配列番号７に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列からなるヌクレオチド、
（２ｂ）配列番号７に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列を含むヌクレオチド、
（２ｃ）配列番号７に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列からなるヌクレオチド、
（２ｄ）配列番号７に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列を含むヌクレオチド。

前記（２ｂ）の「配列番号７に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列を含むヌクレオチド」は、それぞれ、「配列番号７に示す塩基配列」および「配列番号８に示す塩基配列」に加えて、例えば１～２０ｂｐ、好ましくは１～１５ｂｐ、より好ましくは５～１５ｂｐ、さらに好ましくは１０～１５ｂｐがさらに追加されたヌクレオチド長を有する。

前記（２ｄ）の「配列番号７に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列を含むヌクレオチド」は、それぞれ、「配列番号７に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列」および「配列番号８に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列」に加えて、ベクター末端との相同配列を含み、例えば１～２０ｂｐ、好ましくは１～１５ｂｐ、より好ましくは５～１５ｂｐ、さらに好ましくは１０～１５ｂｐがさらに追加されたヌクレオチド長を有する。前記（２ｄ）の「配列番号７に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列を含むヌクレオチド」の例としては、
（２ｄ’）配列番号４７に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号４８に示す塩基配列からなるヌクレオチド
が挙げられる（図５Ａ）。

２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼに関し、好ましいプライマーは、
（２ａ）配列番号７に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列からなるヌクレオチド、および、
（２ｂ）配列番号７に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列を含むヌクレオチド
である。

上記ヌクレオチドをプライマーとして用いた、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅物であるＤＮＡは、好ましくは１１５５または１１５６ｂｐを有する。ここで、ＰＣＲで用いるＤＮＡポリメラーゼとしては当該分野で既知のものが用いられ、例えばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ホットスタート調整されたＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼ活性とは別に３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有するプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。

本明細書において、「ＰＣＲ増幅物」とは、特定のヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った結果得られた産物をいう。なお、特段示さない限り、本明細書において、ＰＣＲ増幅では、特定のヌクレオチドを１μＭずつ、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとして用い、且つ、酵素としてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（製品名、タカラバイオ製）を用いて、２５μＬ液の量で熱処理９８℃１０秒、アニーリング５５℃１５秒、伸長７２℃５秒／ｋｂの条件での処理を３０サイクル実施する。

本発明において、目的の外来性遺伝子が導入される宿主微生物は特に限定されず、原核生物および真核生物のいずれであってもよい。既に単離保存されているもの、新たに天然から分離したものおよび遺伝子改変をされたものから任意に選択することができる。宿主微生物は、例えば、エッセリシア属、コリネバクテリウム属、バチルス属、アシネトバクター属、バークホルデリア属、シュードモナス属、クロストリジウム属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ヤロウィア属、カンジタ属、ピキア属、アスペルギルス属、クレブシエラ属、グルコノバクター属、ザイモモナス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属およびストレプトマイセス属からなる群より選択される属に属する。本発明の宿主微生物は、好ましくは、エッセリシア属、コリネバクテリウム属、バチルス属、アシネトバクター属、バークホルデリア属、シュードモナス属、クロストリジウム属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ヤロウィア属、カンジタ属、ピキア属およびアスペルギルス属からなる群より選択される属に属する。宿主微生物は、より好ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。

したがって、上記宿主微生物に外来性遺伝子を導入した本発明にかかる組換え微生物は、例えば、エッセリシア属、コリネバクテリウム属、バチルス属、アシネトバクター属、バークホルデリア属、シュードモナス属、クロストリジウム属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ヤロウィア属、カンジタ属、ピキア属、アスペルギルス属、クレブシエラ属、グルコノバクター属、ザイモモナス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属およびストレプトマイセス属からなる群より選択される属に属し、好ましくは、エッセリシア属、コリネバクテリウム属、バチルス属、アシネトバクター属、バークホルデリア属、シュードモナス属、クロストリジウム属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ヤロウィア属、カンジタ属、ピキア属およびアスペルギルス属からなる群より選択される属に属する。本発明にかかる組換え微生物は、より好ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。

本発明にかかる遺伝子組換え微生物が有するアジピン酸、アジピン酸誘導体、ヘキサメチレンジアミン、１，６－ヘキサンジオールおよび６－アミノ－１－ヘキサノール生産経路および当該経路の各反応段階を触媒する酵素について、図１を参照しながら以下に説明する。

図１のステップＡの変換では、例えば、スクシニルＣｏＡ：アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、または３－オキソアジピルＣｏＡチオラーゼが関与し、スクシニル－ＣｏＡとアセチル－ＣｏＡとが縮合し、３－オキソアジピル－ＣｏＡへと変換される。本変換を触媒し得る酵素他の例としては、β－ケトチオラーゼが挙げられる。更には、例えば、ＥＣ ２．３．１．９（アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ）、ＥＣ ２．３．１．１６（３－ケトアシル－ＣｏＡチオラーゼ）およびＥＣ ２．３．１．１７４（３－オキソアジピル－ＣｏＡチオラーゼ）などの群に分類される酵素も、本変換に対して活性を有し得る酵素として例示することができる。本発明で使用される酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、一態様において、配列番号９に示すアミノ酸配列からなる大腸菌由来のＰａａＪが使用される。好ましい一態様において、当該酵素は、配列番号１に示すヌクレオチドおよび配列番号２に示すヌクレオチドをプライマーとして使用した、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅物であるＤＮＡ配列（１２０３ｂｐ）にコードされるスクシニルＣｏＡ：アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼである。

図１のステップＢの変換では、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドロゲナーゼが関与し、３－オキソアジピル－ＣｏＡが、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへと変換される。本変換を触媒し得る他の酵素の例としては、ＥＣ １．１．１．ｍ（ｍは整数である）に分類されるオキシドレダクターゼが挙げられる。具体的に、例えば、ＥＣ １．１．１．３５（３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）、ＥＣ １．１．１．３６（アセトアセチル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）、ＥＣ １．１．１．１５７（３－ヒドロキシブタノイル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）、ＥＣ １．１．１．２１１（長鎖３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）およびＥＣ １．１．１．２５９（３－ヒドロキシピメロイル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）などの群に分類される酵素が、本変換に対して活性を有し得る酵素として例示することができる。本発明で使用される酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、例えば配列番号１０に示すアミノ酸配列からなる大腸菌由来のＰａａＨが使用される（図３）。好ましい一態様において、当該酵素は、配列番号３に示すヌクレオチドおよび配列番号４に示すヌクレオチドをプライマーとして使用した、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅物のＤＮＡ配列（１５２１ｂｐ）にコードされる３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドロゲナーゼである。

図１のステップＣの変換では、例えば、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼが関与し、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡが、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡへと変換される。本変換を触媒し得る他の酵素の例としては、ＥＣ ４．２．１．ｎ（ｎは整数である）に分類されるヒドロリアーゼが挙げられる。具体的に、例えば、ＥＣ ４．２．１．１７（エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ）、ＥＣ ４．２．１．５５（３－ヒドロキシブタノイル－ＣｏＡデヒドラターゼ）およびＥＣ ４．２．１．７４（長鎖エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ）などの群に分類される酵素は、本変換に対して活性を有し得る酵素として例示することができる。好ましい一態様において、当該酵素は、先述の３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼである。

図１のステップＤの変換では、例えば２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼが関与し、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡが、アジピル－ＣｏＡへと変換される。本変換を触媒し得る酵素の他の例としては、ＥＣ １．３．１．ｏ（ｏは整数である）に分類されるオキシドレダクターゼが挙げられる。具体的に、例えば、ＥＣ １．３．１．８（アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ^＋））や、ＥＣ １．３．１．９（エノイル－ＡＣＰレダクターゼ（ＮＡＤＨ））、ＥＣ １．３．１．３８（トランス－２－エノイル－ＣｏＡレダクターゼ（ＮＡＤＰ^＋））、ＥＣ １．３．１．４４（トランス－２－エノイル－ＣｏＡレダクターゼ（ＮＡＤ^＋））、ＥＣ １．３．１．８６（クロトニル－ＣｏＡレダクターゼ）、ＥＣ １．３．１．９３（長鎖アシル－ＣｏＡレダクターゼ）およびＥＣ １．３．１．１０４（エノイル－ＡＣＰレダクターゼ（ＮＡＤＰＨ））などの群に分類される酵素は、本変換に対して活性を有し得る酵素として例示することができる。好ましい一態様において、当該酵素は、先述の２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼである。

図１のステップＥの変換では、アジピル－ＣｏＡがアジピン酸へと変換される。本変換を触媒し得る酵素の例としては、ＥＣ ３．１．２．ｐ（ｐは整数である）に分類されるチオエステルヒドラターゼが挙げられる。例えば、ＥＣ ３．１．２．１（アセチル－ＣｏＡヒドラターゼ）およびＥＣ ３．１．２．２０（アシル－ＣｏＡヒドラターゼ）などの群に分類される酵素は、本変換に対して活性を有し得る酵素として例示することができる。好ましい一態様において、当該酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、配列番号１６に示す、アシネトバクターＡＤＰ１株由来のｔｅｓＢ（Ａｂ）が使用される。使用する酵素の基質特異性に応じて、３－オキソアジピル－ＣｏＡ、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡおよび２，３－デヒドロアジピルＣｏＡのＣｏＡが脱離され、それぞれ３－オキソアジピン酸、３－ヒドロキシアジピン酸、２，３－デヒドロアジピン酸を生成する。

また、図１のステップＥの変換を触媒し得る別の酵素の例として、ＥＣ ２．８．３．ｑ（ｑは整数である）に分類されるＣｏＡ－トランスフェラーゼも挙げることができる。例えば、ＥＣ ２．８．３．５（３－オキソ酸 ＣｏＡ－トランスフェラーゼ）や、ＥＣ ２．８．３．６（３－オキソアジピン酸 ＣｏＡ－トランスフェラーゼ）、ＥＣ ２．８．３．１８（スクシニル－ＣｏＡ：酢酸 ＣｏＡ－トランスフェラーゼ）といった群に分類される酵素は、本変換に対して活性を有し得る酵素として例示することができる。

さらには、図１のステップＥの変換を触媒し得る別の酵素変換の例として、ＥＣ ２．３．１．ｒ（ｒは整数である）に分類されるアシルトランスフェラーゼによって、アジピル－ＣｏＡのアジピル基をリン酸に転移してアジピルリン酸を生成した後、ＥＣ ２．７．２．ｓ（ｓは整数である）に分類されるホスホトランスフェラーゼによる脱リン酸化を経る経路も例示することができる。例えば、アシルトランスフェラーゼとしては、ＥＣ ２．３．１．８（リン酸アセチルトランスフェラーゼ）や、ＥＣ ２．３．１．１９（リン酸ブチリルトランスフェラーゼ）、ホスホトランスフェラーゼについては、ＥＣ ２．７．２．１（酢酸キナーゼ）や、ＥＣ ２．７．２．７（ブタン酸キナーゼ）といった群に分類される酵素は、本変換に対して活性を有し得る酵素として例示することができる。

図１のステップＴでは、３－オキソアジピン酸がレブリン酸へと変換される。本変換は、酵素（３－オキソアジピン酸デカルボキシラーゼ）によって触媒されるか、または、自然発生的に起こる。

図１のステップＦの変換では、アジピル－ＣｏＡからアジピン酸セミアルデヒドへと変換される。本変換を触媒し得る酵素の例としては、ＥＣ １．２．１．ｔ（ｔは整数である）に分類される酵素が挙げられる。例えば、ＥＣ １．２．１．１０（アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化））、ＥＣ １．２．１．１７（グリオキシル酸デヒドロゲナーゼ（アシル化））、ＥＣ １．２．１．４２（ヘキサデカナールデヒドロゲナーゼ（アシル化））、ＥＣ １．２．１．４４（シナモイル－ＣｏＡレダクターゼ（アシル化））、ＥＣ １．２．１．７５（マロニル－ＣｏＡレダクターゼ（マロン酸セミアルデヒド形成））、ＥＣ １．２．１．７６（コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アシル化））といった群に分類される酵素は、本変換と同様に、ＣｏＡを脱離しアルデヒドを生成する変換反応を触媒することから、本変換に対しても活性を有し得る酵素として例示することができる。本発明で使用される酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、例えば、配列番号７３に記載されるアミノ酸配列からなるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来のｓｕｃＤが使用される（図６）。

図１のステップＧ、Ｊ、Ｑの変換では、カルボキシル基がアルデヒドへと変換される。本変換を触媒し得る酵素としては、例えば、カルボン酸レダクターゼ（Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ；ＣＡＲ）が挙げられる。例えば、ＥＣ １．２．１．３０（カルボン酸レダクターゼ（ＮＡＤＰ＋））、ＥＣ １．２．１．３１（Ｌ－アミノアジピン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ）、ＥＣ １．２．１．９５（Ｌ－２－アミノアジピン酸レダクターゼ）、ＥＣ １．２．９９．６（カルボン酸レダクターゼ）といった群に分類される酵素が、本変換と同様に、カルボン酸からアルデヒドを生成する変換反応を触媒することから、本変換に対しても活性を有し得る酵素として例示することができる。酵素の由来となる生物種の典型的な例としては、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｉｏｗｅｎｓｉｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａ、Ｓｅｇｎｉｌｉｐａｒｕｓ ｒｕｇｏｓｕｓ、Ｓｅｇｎｉｌｉｐａｒｕｓ ｒｏｔｕｎｄｕｓ、Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｏａｕｒｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｓｅｒｐｕｌａ ｌａｃｒｙｍａｎｓ、Ｈｅｔｅｒｏｂａｓｉｄｉｏｎ ａｎｎｏｓｕｍ、Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが挙げられるが、これらに限定されない。本発明で使用される酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、例えば、配列番号７４～７８のいずれかに記載されるアミノ酸配列からなる酵素の少なくとも一種が使用されてもよく（図７Ａ～図７Ｅ）、好ましくは、配列番号７６に記載されるアミノ酸配列からなるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ由来の酵素ＭａＣａｒ、配列番号７８に記載されるアミノ酸配列からなるＭａＣａｒの変異体であるＭａＣａｒ（ｍ）の少なくとも一方が使用され、より好ましくは配列番号７８に記載されるアミノ酸配列からなるＭａＣａｒ（ｍ）が使用される。

また、カルボン酸レダクターゼは、ホスホパンテテイニル化されることにより活性型のホロ酵素に変換され得る（Ｖｅｎｋｉｔａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２８２，Ｎｏ．１，４７８－４８５（２００７））。ホスホパンテテイニル化はホスホパンテテイニル基転移酵素（Ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＰＴ）により触媒される。本反応を触媒し得る酵素としては、例えば、ＥＣ ２．７．８．７に分類される酵素が挙げられる。したがって、本発明の微生物は更に、ホスホパンテテイニル基転移酵素の活性が増大するように改変されていて良い。ホスホパンテテイニル基転移酵素の活性を増大する方法としては、外来のホスホパンテテイニル基転移酵素遺伝子を導入する方法や、内因性のホスホパンテテイニル基転移酵素遺伝子の発現を強化する方法が挙げられるが、これらに限定されない。本発明で使用される酵素は、ホスホパンテテイニル基転移活性を有する限り、これらに限定されないが、典型的な酵素としては、例えば、大腸菌のＥｎｔＤや、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのＳｆｐ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｉｏｗｅｎｓｉｓのＮｐｔ（Ｖｅｎｋｉｔａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２８２，Ｎｏ．１，４７８－４８５（２００７））、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＬｙｓ５（Ｅｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８．１９ （１９９９）： ６１７１－６１７７．）が挙げられる。本発明で使用される酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、例えば、配列番号７９～８２に記載されるアミノ酸配列からなる酵素の少なくともいずれか一種が使用されてもよく（図８Ａ～図８Ｄ）、好ましくは、配列番号８０に記載されるアミノ酸配列からなるＮｏｃａｒｄｉａ ｉｏｗｅｎｓｉｓ由来のＮｏｃａｒｄｉａ ｉｏｗｅｎｓｉｓのＮｐｔが使用される。

図１のステップＭ、Ｎ、Ｓの変換は、アミノ基転移反応である。この変換を触媒し得る酵素の例としては、ＥＣ ２．６．１．ｕ（ｕは整数である）に分類されるトランスアミナーゼ（アミノトランスフェラーゼ）が挙げられる。例えば、ＥＣ ２．６．１．１９（４－アミノブタン酸－２－オキソグルタル酸トランスアミナーゼ）や、ＥＣ ２．６．１．２９（ジアミントランスアミナーゼ）、ＥＣ ２．６．１．４８（５－アミノ吉草酸トランスアミナーゼ）といった群に分類される酵素は、本変換に対しても活性を有し得る酵素として例示することができる。本発明で使用される酵素は、各ステップの変換活性を有するものであれば、特に限定されないが、例えば、カダベリンやスペルミジンをアミノ基転移することが報告されている大腸菌のプトレシンアミノトランスフェラーゼであるＹｇｊＧ（Ｓａｍｓｏｎｏｖａ．， ｅｔ ａｌ．， ＢＭＣ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３．１ （２００３）： ２．）や、シュードモナス属のプトレシンアミノトランスフェラーゼであるＳｐｕＣ（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８４．１４ （２００２）： ３７６５－３７７３．、Ｇａｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９．２ （２０１７）： ３６１－３６６．）、大腸菌のＧＡＢＡアミノトランスフェラーゼＧａｂＴや、ＰｕｕＥが使用されてもよい。さらには、Ｒｕｅｇｅｒｉａ ｐｏｍｅｒｏｙｉ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ、Ｓｐｈａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ等の生物種由来のω－トランスアミナーゼも、１，８－ジアミノオクタンや１，１０－ジアミノデカンなどのジアミン化合物へのアミノ基転移活性を有することが報告されており、本発明で使用されてもよい（Ｓｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０．２０ （２０１８）： ４５９１－４５９５．、Ｓａｔｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ １２４．３６ （２０１２）： ９２９０－９２９３．）。本発明で使用される酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、例えば、配列番号８３～８７に記載されるアミノ酸配列からなる酵素の少なくともいずれか一種が使用されてもよい（図９Ａ～図９Ｅ）。典型的なアミノ基供与体としては、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－アラニン、グリシンが挙げられるが、これらには限定されない。

図１のステップＨ、Ｌ、Ｒの変換では、アルデヒドがアルコールに変換される。本変換を触媒し得る酵素の例としては、ＥＣ １．１．１．ｖ（ｖは整数である）に分類されるオキシドレダクターゼが挙げられる。例えば、ＥＣ １．１．１．１（アルコールデヒドロゲナーゼ）や、ＥＣ １．１．１．２（アルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋））、ＥＣ １．１．１．７１（アルコールデヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ（Ｐ）＋］）といった群に分類される酵素は、本変換と同様に、アルデヒドからアルコールへの変換反応を触媒することから、本変換に対しても活性を有し得る酵素として例示することができる。本発明で使用される酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、例えば、配列番号８８に記載される大腸菌由来のＡｈｒが使用される（図１０）。

図１のステップＩ、Ｏの変換では、カルボキシル基にＣｏＡが付加される。本変換を触媒し得る酵素の例としてはＥＣ ２．８．３．ｗ（ｗは整数である）に分類されるＣｏＡトランスフェラーゼ、ＥＣ ６．２．１．ｘ（ｘは整数である）に分類される酸チオールリガーゼが挙げられる。本発明で使用される酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されない。

本発明に利用できる上記の酵素をコードする遺伝子は、例示された生物以外に由来するものであっても、または人工的に合成したものであってもよく、宿主微生物細胞内で実質的な酵素活性を発現できるものであればよい。

本発明にかかる遺伝子組換え微生物は、先述の３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼおよび／または２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼをコードする外来性遺伝子に加え、スクシニルＣｏＡ：アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼおよび３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドロゲナーゼからなる群より選択される少なくとも１つの酵素をコードする外来性遺伝子が導入されていることが好ましい。

すなわち、本発明にかかる組換え微生物は、好ましくは、スクシニルＣｏＡ：アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼをコードする外来性遺伝子および３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする外来性遺伝子のうちの少なくとも１つをさらに含む。

本発明にかかる組換え微生物は、上記外来性遺伝子、すなわち、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼ、２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ、スクシニルＣｏＡ：アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼおよび３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドロゲナーゼ以外にも、更なる外来性遺伝子が導入されていてもよい。

本発明にかかる組換え微生物は、宿主微生物において、適宜、任意の遺伝子が破壊されたものであってもよい。標的遺伝子の破壊は、当該分野で既知の方法に従って行われてよい。

また、本発明の目的に利用できる上記酵素遺伝子は、前記宿主微生物細胞内で実質的な酵素活性を発現できるものであれば、自然界で発生し得るすべての変異や、人工的に導入された変異及び修飾を有していてもよい。例えば、特定のアミノ酸をコードする種々のコドンには余分のコドンが存在することが知られている。そのため本発明においても同一のアミノ酸に最終的に翻訳されることになる代替コドンを利用してよい。つまり、遺伝子コードは縮重しているので、ある特定のアミノ酸をコードするのに複数のコドンを使用でき、そのためアミノ酸配列は任意の１セットの類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドでコードされ得る。そのセットの唯一のメンバーだけが天然型酵素の遺伝子配列に同一であるが、ミスマッチのあるＤＮＡオリゴヌクレオチドでさえ適切な緊縮条件下（例えば、３ｘＳＳＣ、６８℃でハイブリダイズし、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ及び６８℃で洗浄）で天然型配列にハイブリダイズでき、天然型配列をコードするＤＮＡを同定、単離でき、更にそのような遺伝子も本発明において利用できる。特に、ほとんどの生物は特定のコドン（最適コドン）のサブセットを優先的に用いることが知られているので（Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ．１０５、ｐｐ．６１－７２、１９９１等）、宿主微生物に応じて「コドン最適化」を行うことは本発明においても有用であり得る。

したがって、本発明にかかる遺伝子組換え微生物は、実質的な酵素活性を発現できることを条件に、上記酵素遺伝子の塩基配列と、例えば６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み得る。あるいは、本発明にかかる遺伝子組換え微生物は、上記酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、例えば６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み得る。

本発明において、上記の生合成酵素遺伝子が「発現カセット」として宿主微生物細胞内に導入されることで、より安定的で高レベルの酵素活性を得ることができる。本明細書において、「発現カセット」とは、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子に機能的に結合された転写および翻訳をレギュレートする核酸配列を含むヌクレオチドを意味する。典型的に、本発明の発現カセットは、コード配列から５’上流にプロモーター配列、３’下流にターミネーター配列、場合により更なる通常の調節エレメントを機能的に結合された状態で含み、そのような場合に、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子が宿主微生物に導入される。

本明細書において、プロモーターとは、構成発現型プロモーターであるか誘導発現型プロモーターであるかに拘わらず、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列と定義される。強いプロモーターとはｍＲＮＡ合成を高頻度で開始させるプロモーターであり、本発明においても好適に使用される。大腸菌ではｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃまたはｔｒｃ系、λファージの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、解糖系酵素（例えば、３－ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド‐３－リン酸脱水素酵素）、グルタミン酸デカルボキシラーゼＡ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼに対するプロモーター、Ｔ７ファージ由来ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域等が利用可能である。コリネ菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ではＨＣＥ（ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）プロモーター、ｃｓｐＢプロモーター、ｓｏｄＡプロモーターおよび伸長因子（ＥＦ－Ｔｕ）プロモーターなどが利用可能である。

ターミネーターとしては、Ｔ７ターミネーター、ｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーター、ｌａｃターミネーターなどが利用可能である。

プロモーターおよびターミネーター配列のほかに、他の調節エレメントとしては、例えば、選択マーカー、増幅シグナルおよび複製起点などが挙げられる。好適な調節エレメントについては、例えば、”Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５”、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９９０）に記載されている。

本発明で用いる宿主微生物は、当該微生物が本来有する酵素をコードする遺伝子が破壊された微生物であってもよい。当該酵素をコードする遺伝子としては、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼをコードするｌｄｈ遺伝子、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼをコードするａｔｏＢ遺伝子、およびスクシニルＣｏＡシンセターゼαサブユニットをコードするｓｕｃＤ遺伝子が挙げられる。このように、宿主微生物が本来有する酵素の遺伝子のうちの一部を破壊した宿主微生物を用いることで、不純物の混入を避け、目的外の反応の進行を抑制することができる。具体的には、乳酸デヒドロゲナーゼをコードするｌｄｈ遺伝子を破壊することで、不純物である乳酸の生成を低減することができる。アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼをコードするａｔｏＢ遺伝子、およびスクシニルＣｏＡシンセターゼαサブユニットをコードするｓｕｃＤ遺伝子を破壊することで、アジピン酸の収率を改善することができる。

上記で説明した発現カセットは、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、ＩＳエレメント、フォスミド、コスミド、又は線状もしくは環状のＤＮＡ等から成るベクターに組み入れて、宿主微生物中に挿入される。プラスミドおよびファージが好ましい。これらのベクターは、宿主微生物中で自律複製されるものでもよいし、また染色体により複製されてもよい。好適なプラスミドは、例えば、大腸菌のｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３－３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ－ＩＩＩ１１３－Ｂ１、λｇｔ１１又はｐＢｄＣＩ；桿菌のｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４又はｐＢＤ２１４；コリネバクテリウム属のｐＳＡ７７又はｐＡＪ６６７などである。バチルス属などの桿菌ではｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４またはｐＢＤ２１４などが挙げられる。これらの他にも使用可能なプラスミド等は、”Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ＤＮＡ ｎａｌｙｓｉｓ ６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ”、Ｗｉｌｅｙ－Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（２０１６）に記載されている。ベクターへの発現カセットの導入は、適当な制限酵素による切り出し、クローニング、及びライゲーションを含む慣用の方法によって可能である。各々の発現カセットは、１つのベクター上に配置されてもよく、２つまたはそれ以上のベクターに配置されてもよい。

上記のようにして本発明の発現カセットを有するベクターが構築された後、該ベクターを宿主微生物に導入する際に適用できる手法は慣用の方法を用いることができる。例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、接合伝達法、プロトプラスト融合法などが挙げられるが、これらに限定されず、宿主微生物に好適な方法が選択可能である。

本発明の別の側面は、前記組換え微生物を用いた、目的化合物の製造方法に関する。より具体的には、前記組換え微生物を培養する培養工程を含む、目的化合物の製造方法に関する。

ここで、目的化合物は、アジピン酸、アジピン酸誘導体、ヘキサメチレンジアミン、１，６－ヘキサンジオールおよび６－アミノ－１－ヘキサノールからなる群より選択される。アジピン酸誘導体としては、上記のとおり、例えば、３－オキソアジピン酸（３－ＯＡ）、レブリン酸（ＬＥＶ）、３－ヒドロキシアジピン酸（３ＨＡ）および２，３－デヒドロアジピン酸（２３ＤＡ）が挙げられる。

一態様において、本発明にかかる組換え微生物は、アジピン酸生産経路を有する。この場合、本発明は、当該組換え微生物を培養する培養工程を含む、アジピン酸の製造方法にも関する。

一態様において、本発明にかかる組換え微生物は、ヘキサメチレンジアミン生産経路を有する。この場合、本発明は、当該組換え微生物を培養する培養工程を含む、ヘキサメチレンジアミンの製造方法にも関する。

一態様において、本発明にかかる組換え微生物は、１，６－ヘキサンジオール生産経路を有する。この場合、本発明は、当該組換え微生物を培養する培養工程を含む、１，６－ヘキサンジオールの製造方法にも関する。

一態様において、本発明にかかる組換え微生物は、６－アミノ－１－ヘキサノール生産経路を有する。この場合、本発明は、当該組換え微生物を培養する培養工程を含む、６－アミノ－１－ヘキサノールの製造方法にも関する。

培養工程では、組換え微生物を、炭素源および窒素源を含有する培地で培養することによって、菌体を含む培養物が得られる。本発明の遺伝子組換え微生物は、アジピン酸生産、ならびに、微生物の生育および維持に適した条件下で培養され、好適な培地組成、培養時間および培養条件は当業者により容易に設定できる。

炭素源は、Ｄ－グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、オリゴ糖、多糖、でんぷん、セルロース、米ぬか、廃糖密、油脂（例えば大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油、ヤシ油など）、脂肪酸（例えばパルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、リノレン酸など）、アルコール（例えばグリセロール、エタノールなど）、有機酸（例えば酢酸、乳酸、コハク酸など）、トウモロコシ分解液、セルロース分解液、二酸化炭素、一酸化炭素などが挙げられる。好ましくは、Ｄ－グルコース、スクロースまたはグリセロールである。これらの炭素源は、個別にあるいは混合物として使用することが出来る。

バイオマス由来の原料を用いて製造されたアジピン酸は、ＩＳＯ１６６２０－２またはＡＳＴＭ Ｄ６８６６に規定されるＣａｒｂｏｎ－１４（放射性炭素）分析に基づくバイオベース炭素含有率の測定により、例えば石油、天然ガス、石炭などを由来とする合成原料と明確に区別することができる。

窒素源は、含窒素有機化合物（例えば、ペプトン、カザミノ酸、トリプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、コーンスティープリカー、大豆粉、アミノ酸および尿素など）、または無機化合物（例えば、アンモニア水溶液、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウムなど）が挙げられる。これらの窒素源は、個別にあるいは混合物として使用することが出来る。

また、培地は、組換え微生物が有用な付加的形質を発現する場合、例えば抗生物質への耐性マーカーを有する場合、対応する抗生物質を含んでいてよい。それにより、培養時の雑菌による汚染リスクが低減される。抗生物質としては、アンピシリンなどのβ－ラクタム系抗生物質、カナマイシンなどのアミノグリコシド系抗生物質、エリスロマイシンなどのマクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、クロラムフェニコールなどが挙げられるが、これらに限定されない。

培養は、バッチ式であっても連続式であってもよい。また、いずれの場合にも、培養の適切な時点で追加の前記炭素源等を補給する形式であってもよい。更に、培養は、好適な温度、酸素濃度、ｐＨ等の条件を制御しながら培養されてもよい。一般的な微生物宿主細胞に由来する形質転換体の好適な培養温度は、通常１５℃～４５℃、好ましくは２５℃～３７℃の範囲である。宿主微生物が好気性の場合、発酵中の適切な酸素濃度を確保するために振盪（フラスコ培養等）、攪拌／通気（ジャー・ファーメンター培養等）を行ってもよい。それらの培養条件は、当業者にとって容易に設定可能である。

本発明にかかる目的化合物の製造方法は、培養物から生産化合物を分離精製する分離精製工程を含んでもよい。当該工程では、任意の手法を、例えば、遠心分離、膜ろ過、膜分離、晶析、抽出、蒸留、吸着、相分離および各種のクロマトグラフィーといった手法を用いることができるが、これらに限定されない。分離精製工程は、一種類の工程からなっても良く、また複数の工程の組み合わせからなってもよい。

以上の説明を与えられた当業者は、本発明を十分に実施できる。以下、更なる説明の目的として実施例を与え、従って、本発明は当該実施例に限定されるものではない。

以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

＜バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の単離と同定＞
日本国内の活性汚泥より、アジピン酸を唯一の炭素源及びエネルギー源とする培地を用いて、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株を分離した。バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター ＮＰＭＤ）に２０２０年１２月４日（原寄託日）付けで寄託申請し（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＢＰ－０３３３４）、「受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３３３４」として国際寄託されている。

Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＬＥＢＰ－３株の分類的性状は以下に示す通りである。
＜ＬＥＢＰ－３株の菌学的諸性質＞
培養温度：３７℃、
細胞形態：桿菌（０．７ｘ１．７－３．０μｍ）、
グラム染色性：－、
芽胞の有無：－、
運動性：＋、
ＬＢ寒天培地４８ｈ培養時のコロニー形態：直径１．９～２．５ｍｍ、淡黄色、円形、レンズ状、全縁、平滑、不透明、バター様、
３０℃生育：＋、
４５℃生育：＋、
カタラーゼ反応：＋、
オキシダーゼ反応：＋、
グルコースからの酸／ガス産生：＋／－、
Ｏ／Ｆテスト（酸化／発酵）：＋／－、
硝酸塩還元性：－、
インドール産生性：－、
ブドウ糖酸性化性：－、
ウレアーゼ：持たない、
エスクリン分解性：＋、
ブドウ糖、Ｌ－アラビノース、Ｄ－マンノース、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、グルコン酸、ｎ－カプリン酸、アジピン酸、リンゴ酸、クエン酸および酢酸フェニル：資化できる、
マルトース：資化できない。

＜ＬＥＢＰ－３株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列相同性による系統解析＞
１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列解析を行うことにより同定を行った。１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列をＰＣＲにて増幅し、シーケンス解析を行った。ＢＬＡＳＴ相同性検索のデータベースはＤＢ－ＢＡ１１．０（テクノスルガ・ラボ社）および国際塩基配列データベースを使用した。その結果、ＬＥＢＰ－３株はＢｕｒｋｈｌｄｅｒｉａ属で構成されるクラスター内に含まれたが、何れの既知種とも異なる分子系統学的位置を示したことから、種名の同定に至らなかった。

＜ＰＣＲ増幅による酵素遺伝子の取得と相同性評価＞
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＬＥＢＰ－３株の全ゲノムドラフト解析を実施した。ＬＥＢＰ－３株を２ｍＬのＬＢ培地(トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ)で３７℃振とう培養を実施した。培養終了後、培養液から菌体を回収し、Ｎｕｃｌｅｏ Ｓｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ（製品名、ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ社製）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＬＥＢＰ－３株の全ゲノムドラフト解析およびアノテーションを実施し、７６７９個のオープンリーディングフレーム（Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ；ＯＲＦ）を同定した。この情報を元に、スクシニルＣｏＡ：アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼとしてｐａａＪ（Ｌ３）を、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドロゲナーゼとしてｐａａＨ（Ｌ３）を、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼとしてｐａａＦ（Ｌ３）を、２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼとしてｍｍｇＣ（Ｌ３）を同定した。

ＰａａＪ（Ｌ３）配列をクエリとしてＢＬＡＳＴ検索を実施した結果を表１に、ＰａａＨ（Ｌ３）配列をクエリとしてＢＬＡＳＴ検索を実施した結果を表２に、
ＰａａＦ（Ｌ３）配列をクエリとしてＢＬＡＳＴ検索を実施した結果を表３に、ＭｍｇＣ（Ｌ３）配列をクエリとしてＢＬＡＳＴ検索を実施した結果を表４に示す。なお、配列検索時のデータベースは「Ｒｅｆｓｅｑ＿Ｐｒｏｔｅｉｎ」を指定した。

以上の結果より、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＬＥＢＰ－３株の持つ上記酵素は新規配列として同定された。ｐａａＪ（Ｌ３）遺伝子は配列番号１に示すヌクレオチドおよび配列番号２に示すヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ増幅を行うことができる。ｐａａＨ（Ｌ３）遺伝子は配列番号３に示すヌクレオチドおよび配列番号４に示すヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ増幅を行うことができる。ｐａａＦ（Ｌ３）遺伝子は配列番号５に示すヌクレオチドおよび配列番号６に示すヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ増幅を行うことができる。ｍｍｇＣ（Ｌ３）遺伝子は配列番号７に示すヌクレオチドおよび配列番号８に示すヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ増幅を行うことができる。ＰＣＲに用いたプライマー、各酵素および酵素をコードする塩基配列を、図２～５に示す。

ＰＣＲ増幅条件の一例を下記に示す。酵素はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（製品名、タカラバイオ製）を用いた。熱処理９８℃ １０秒、アニーリング５５℃ １５秒、伸長７２℃ ５秒／ｋｂを３０サイクル実施した。プライマーとして使用するオリゴヌクレオチドは各１μＭ添加した。液量は２５μＬで実施した。

＜取得酵素遺伝子を発現する組換え大腸菌の構築＞
ＰＣＲ断片の増幅にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（製品名、タカラバイオ製）、プラスミドの調製には大腸菌ＪＭ１０９株を用いた。塩基配列のコドン最適化には、ＧｅｎｅＡｒｔ ＧｅｎｅＯｐｔｉｎｉｚｅｒ（ソフトウェア名、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、または、ユーロフィンジェノミクス社の人工遺伝子合成サービスを用いた。

Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＰａａＪ（Ｅｃ）をコードするポリヌクレオチドは、Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株（ＮＢＲＣ１２７１３）ゲノムＤＮＡからクローニングを行った。配列番号２５および２６のオリゴヌクレオチド（図５Ａ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐａａＪ（Ｅｃ）遺伝子のコード領域（配列番号１７）（図４Ａ）を含むＰＣＲ増幅物を得た。次に、ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１（製品名、Ｍｅｒｃｋ社製）を鋳型として、配列番号２７および２８に示すヌクレオチド（図５Ａ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１断片を得た。遺伝子コード領域を含むＤＮＡ断片とｐＲＳＦＤｕｅｔ－１断片とを、をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（製品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて接続した。大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。ＰａａＪ（Ｅｃ）発現プラスミドとして「ｐｒｍ２０３」を得た。

Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＰａａＨ（Ｅｃ）をコードするポリヌクレオチドは、Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株（ＮＢＲＣ１２７１３）のゲノムＤＮＡからクローニングを行った。配列番号２９および３０に示すヌクレオチド（図５Ａ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐａａＨ（Ｅｃ）遺伝子のコード領域（配列番号１８）（図４Ａ）を含むＰＣＲ増幅物を得た。次に、ｐｒｍ２０３を鋳型とし、配列番号３１および３２に示すヌクレオチド（図５Ａ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐｒｍ２０３断片を得た。各遺伝子コード領域を含むＤＮＡ断片とｐｒｍ２０３断片とを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（製品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて接続した。大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、得られた形質転換体より、プラスミドを抽出した。ＰａａＪ（Ｅｃ）－ＰａａＨ（Ｅｃ）発現プラスミドとして「ｐｒｍ６９」を得た。

Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＰａａＦ（Ｅｃ）をコードするポリヌクレオチドは、Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株（ＮＢＲＣ１２７１３）ゲノムＤＮＡからクローニングを行った。配列番号３３および３４に示すヌクレオチド（図５Ａ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐａａＦ（Ｅｃ）遺伝子のコード領域（配列番号１９）（図４Ａ）を含むＰＣＲ増幅物を得た。Ｌ３株のＰａａＦ（Ｌ３）をコードするポリヌクレオチドは、大腸菌発現用に塩基配列の最適化を行い、ユーロフィンジェノミクス社の人工遺伝子合成サービスを利用して取得した。配列番号３５および３６に示すヌクレオチド（図５Ａ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐａａＦ（Ｌ３）遺伝子のコード領域を含むＰＣＲ増幅物を得た。ｐＥＴＤｕｅｔ－１（製品名、Ｍｅｒｃｋ社製）を鋳型として、配列番号４１および４２に示すヌクレオチド（図５Ａ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐＥＴＤｕｅｔ－１断片を得た。各遺伝子のコード領域を含むＤＮＡ断片とｐＥＴＤｕｅｔ－１断片とを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（製品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて接続した。大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。ＰａａＦ（Ｅｃ）発現プラスミドとして「ｐｒｍ７４」を、ＰａａＦ（Ｌ３）発現プラスミドとして「ｐｒｍ１９４」を得た。

Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｙｉのｄｃａＡ（Ａｂ）、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａのＴｆｕ１６４７、Ｌ３株のＭｍｇＣ（Ｌ３）をコードするポリヌクレオチドは、大腸菌発現用に塩基配列の最適化を行い、ユーロフィンジェノミクス社の人工遺伝子合成サービスを利用して取得した。ｄｃａＡ（Ａｂ）遺伝子（配列番号２２）（図４Ｂ）は、配列番号４３および４４に示すヌクレオチド（図５Ａ）をプライマーとして、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａのＴｆｕ１６４７遺伝子（配列番号２３）（図４Ｂ）は配列番号４５および４６に示すヌクレオチド（図５Ａ）をプライマーとして、ｍｍｇＣ５（Ｌ３）遺伝子は配列番号４７および４８（図５Ａ）に示すヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、ｄｃａＡ（Ａｂ）、Ｔｆｕ１６４７、ｍｍｇＣ５（Ｌ３）各遺伝子のコード領域を含むＰＣＲ増幅物をそれぞれ得た。ｐｒｍ７４およびｐｒｍ１９４を鋳型とし、配列番号４９および５０に示すヌクレオチド（図５Ａ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐｒｍ７４断片およびｐｒｍ１９４断片をそれぞれ得た。各遺伝子のコード領域を含むＤＮＡ断片と、ｐｒｍ７４断片およびｐｒｍ１９４断片とをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（製品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて接続した。大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、得られた形質転換体より、プラスミドを抽出した。ＰａａＦ（Ｅｃ）－ｄｃａＡ（Ａｂ）発現プラスミドとして「ｐｒｍ１２７」を、ＰａａＦ（Ｅｃ）－ｍｍｇＣ（Ｌ３）発現プラスミドとして「ｐｒｍ２３４」を、ＰａａＦ（Ｌ３）－ｍｍｇＣ（Ｌ３）発現プラスミドとして「ｐｒｍ１６６」を、それぞれ得た。

Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｙｉのｔｅｓＢ（Ａｂ）をコードするポリヌクレオチドは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｙｉの染色体ＤＮＡから配列番号５１および５２に示すヌクレオチド（図５Ａ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｔｅｓＢ（Ａｂ）遺伝子のコード領域を含むＰＣＲ増幅物をそれぞれ得た。ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１を鋳型とし、配列番号５３および５４に示すヌクレオチド（図５Ａ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１断片を得た。各ｔｅｓＢ（Ａｂ）遺伝子コード領域を含むＤＮＡ断片と、ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１断片とをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（製品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて接続した。大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、得られた形質転換体より、プラスミドを抽出した。ＴｅｓＢ（Ａｂ）発現プラスミドとして「ｐｒｍ９２」を得た。

大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の遺伝子破壊株を下記の通りに作製した。乳酸デヒドロゲナーゼをコードするｌｄｈ遺伝子、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼをコードするａｔｏＢ遺伝子、およびスクシニルＣｏＡシンセターゼαサブユニットをコードするｓｕｃＤ遺伝子の破壊は、ｐＨＡＫ１（受領番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２９１９として、独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に２０１９年３月１８日に寄託した。国際寄託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０２９１９）を用いた相同組換え法により行った。ｐＨＡＫ１は温度感受性変異型ｒｅｐＡ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来レバンスクラーゼ遺伝子ＳａｃＢを含む。レバンスクラーゼ遺伝子は、スクロース存在下において宿主微生物に対して致死的に作用する。ＰＣＲ断片の増幅にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（製品名、タカラバイオ製）、プラスミド調製は大腸菌ＨＳＴ０８株を用いて行った。

大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、破壊標的遺伝子の上流領域、コード領域、および下流領域を含むＰＣＲ増幅物を得た。ｌｄｈ遺伝子周辺領域は配列番号５５および５６に示すヌクレオチド（図５Ｂ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ａｔｏＢ遺伝子周辺領域は配列番号５７および５８に示すヌクレオチド（図５Ｂ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｓｕｃＤ遺伝子周辺領域は配列番号５９および６０に示すヌクレオチド（図５Ｂ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、それぞれの断片を得た。

次に本ＰＣＲ増幅物をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（製品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、配列番号６１及び６２に示すプライマーを（図５Ｂ）用いて増幅したｐＨＡＫ１プラスミド断片に挿入し、環状化した。

得られた破壊標的遺伝子の上流領域、コード領域、および下流領域のＤＮＡ断片が挿入されたｐＨＡＫ１プラスミドを鋳型として、ｌｄｈ遺伝子周辺領域は配列番号６３および６４に示すヌクレオチド（図５Ｂ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ａｔｏＢ遺伝子周辺領域は配列番号６５および６６に示すヌクレオチド（図５Ｂ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｓｕｃＤ遺伝子周辺領域は配列番号６７および６８に示すヌクレオチドをプライマー（図５Ｂ）としてＰＣＲを行い、破壊標的遺伝子のコード領域の一部領域または全領域が除かれたプラスミド断片を得た。

得られたプラスミド断片を末端リン酸化、セルフライゲーションにより環状化し、遺伝子破壊用プラスミドを得た。

塩化カルシウム法（羊土社 遺伝子工学実験ノート 田村隆明著、参照）により、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に所望の遺伝子の破壊のためのプラスミドを形質転換した後、カナマイシン硫酸塩１００ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ寒天培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、寒天末１５ｇ／Ｌ）に塗布し、３０℃で一晩培養してシングルコロニーを取得し、形質転換体を得た。本形質転換体をカナマイシン硫酸塩１００ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ液体培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）１ｍＬに一白金耳植菌し、３０℃で振盪培養を行った。得られた培養液を、カナマイシン硫酸塩１００ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ寒天培地に塗布し、４２℃で一晩培養した。得られるコロニーはシングルクロスオーバーにより、プラスミドがゲノム中に挿入されている。コロニーをＬＢ液体培地１ｍＬに一白金耳植菌し、３０℃で振盪培養を行った。得られた培養液を、スクロース１０％を含有するＬＢ寒天培地に塗布し、一晩培養した。得られたコロニーについて、所望の遺伝子が破壊されていることをコロニーダイレクトＰＣＲにより確認した。まず、ｌｄｈ遺伝子破壊株を構築し、本ｌｄｈ遺伝子破壊株を元にａｔｏＢ遺伝子破壊株を構築し、さらにｌｄｈ、ａｔｏＢ二重破壊株を元にｓｕｃＤ遺伝子破壊株を構築した。作製したｌｄｈ、ａｔｏＢ、ｓｕｃＤ遺伝子の三重破壊株をＡＳＬ０００株とした。

構築したプラスミドをＡＳＬ０００株に形質転換し、アンピシリンナトリウム５０ｍｇ／Ｌ、カナマイシン硫酸塩３０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン硫酸塩５０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ寒天培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、寒天末１５ｇ／Ｌ）に塗布し、３７℃で２４時間インキュベートして形質転換体のシングルコロニーを得た。取得した形質転換体を表５に示す。

＜取得酵素遺伝子を発現する組換え大腸菌によるアジピン酸生産試験＞
表５に示す菌株を、アンピシリンナトリウム５０ｍｇ／Ｌ、カナマイシン硫酸塩３０ｍｇ／Ｌ、およびストレプトマイシン硫酸塩５０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）２ｍＬ（１４ｍＬ容ラウンドボトムチューブ）に一白金耳植菌し、３７℃で２４時間振盪培養を行い、前培養液を得た。前得られた前培養液１０μＬを、アンピシリンナトリウム５０ｍｇ／Ｌ、カナマイシン硫酸塩３０ｍｇ／Ｌ、およびストレプトマイシン硫酸塩５０ｍｇ／Ｌを含むＭＭ培地１ｍＬ（９６穴ディープウェルプレート）に植菌し、３７℃で４８時間振盪培養を行った。ＭＭ培地の組成を表６に示す。

培養終了後、培養液中のアジピン酸およびアジピン酸類縁体の濃度を分析した。分析は、トリメチルシリル誘導体化を用いたＧＣ／ＭＳ分析によって行った。培養液遠心上清４０μＬ（内部標準としてセバシン酸二ナトリウムを終濃度１０ｍＭとなるように添加）に水：メタノール：クロロホルム＝５：２：２（ｖ／ｖ／ｖ）で混合した抽出液を３６０μＬ添加し、よく混合した。遠心分離（１６，０００×ｇ、５分）後、上清１００μＬを別のマイクロチューブに採取し、遠心エバポレータで１時間遠心濃縮した。得られた乾固物にメトキシアミン塩酸塩２０ｍｇ／ｍＬピリジン溶液１００μＬを添加し、３０℃で９０分振盪した。Ｎ－メチル－Ｎ－トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド５０μＬを添加し、３７℃で３０分振盪した。反応溶液をＧＣ／ＭＳ測定試料とし、下記の条件で分析を行った。

ＧＣ／ＭＳ分析条件
装置：ＧＣＭＳ－ＱＰ－２０２０ＮＸ（島津製作所製）
カラム：フューズドシリカキャピラリーチューブ 不活性処理チューブ（長さ１ｍ、外径０．３５ｍｍ、内径０．２５ｍｍ、ＧＬサイエンス社製）、ＩｎｅｒｔＣａｐ ５ＭＳ／ＮＰ（長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍ、ＧＬサイエンス社製）
試料注入量：１μＬ
試料導入法：スプリット（スプリット比２５：１）
気化室温度：２３０℃
キャリアガス：ヘリウム
キャリアガス線速度：３９．０ｃｍ／秒
オーブン温度：８０℃、２分保持→１５℃／分昇温→３２５℃、１３分保持
イオン化法：電子イオン化法（ＥＩ）
イオン化エネルギー：７０ｅＶ
イオン源温度：２３０℃
スキャン範囲：ｍ／ｚ＝５０～５００
注入量：１μＬ

結果を表７に示す。表中、「３ＯＡ」は３－オキソアジピン酸を、「ＬＥＶ」はレブリン酸を、「３ＨＡ」は３－ヒドロキシアジピン酸を、「２３ＤＡ」は２，３－デヒドロアジピン酸を、「ＡＤＡ」はアジピン酸を示す。

Ｌ３株由来のＰａａＦ（Ｌ３）およびｍｍｇＣ（Ｌ３）の双方を発現させた発明株、すなわち、ＡＤＡ５００株およびＡＤＡ４９６株では、３－オキソアジピン酸(３－ＯＡ)、レブリン酸（ＬＥＶ）、３－ヒドロキシアジピン酸（３ＨＡ）、２，３－デヒドロアジピン酸（２３ＤＡ）、およびアジピン酸（ＡＤＡ）が対照株に比べ多く生成し、これらの合算値としてそれぞれ、３５５ｍｇ／Ｌおよび６１３ｍｇ／Ｌ生成した。以上の結果より、これらの遺伝子にコードされる酵素はアジピン酸経路反応を進行させる高い活性を有しており、アジピン酸およびアジピン酸誘導体の生成量を向上させることが示された。

本発明にかかる遺伝子組換え微生物は、バイオマス原料からの直接的なアジピン酸類の発酵生産において好適に利用できる。

Claims (18)

1. ３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼをコードする外来性遺伝子および２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼをコードする外来性遺伝子のうちの少なくとも１つを含む、組換え微生物。
2. 前記３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼおよび２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼの少なくとも１つが、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）ＬＥＢＰ－３株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３３３４）に由来する、請求項１に記載の組換え微生物。
3. 前記３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼが、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
   （１ａ）配列番号５に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
   （１ｂ）配列番号５に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列を含むヌクレオチド
   をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物と配列同一性が８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるＤＮＡにコードされ、
   当該ＤＮＡは、６２６～９４０ｂｐを有する、請求項１または２に記載の組換え微生物。
4. 前記２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼが、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
   （２ａ）配列番号７に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
   （２ｂ）配列番号７に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列を含むヌクレオチド
   をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物と配列同一性が８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるＤＮＡにコードされ、
   当該ＤＮＡは、９２４～１３８６ｂｐを有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の組換え微生物。
5. 前記３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼが、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
   （１ａ）配列番号５に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
   （１ｂ）配列番号５に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列を含むヌクレオチド
   をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であるＤＮＡにコードされ、
   当該ＤＮＡは、７８３または７８４ｂｐを有する、請求項１または２に記載の組換え微生物。
6. 前記２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼが、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
   （２ａ）配列番号７に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
   （２ｂ）配列番号７に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列を含むヌクレオチド
   をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であるＤＮＡにコードされ、
   当該ＤＮＡは、１１５５または１１５６ｂｐを有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の組換え微生物。
7. 上記組換え微生物が、エッセリシア属、コリネバクテリウム属、バチルス属、アシネトバクター属、バークホルデリア属、シュードモナス属、クロストリジウム属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ヤロウィア属、カンジタ属、ピキア属およびアスペルギルス属からなる群より選択される属に属する、請求項１～６のいずれか１項に記載の組換え微生物。
8. アジピン酸生産経路を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換え微生物。
9. ヘキサメチレンジアミン生産経路を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の組換え微生物。
10. １，６－ヘキサンジオール生産経路を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の組換え微生物。
11. ６－アミノ－１－ヘキサノール生産経路を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の組換え微生物。
12. 請求項１～７のいずれか１項に記載の組換え微生物を培養する培養工程を含む、目的化合物の製造方法であって、
    前記目的化合物が、アジピン酸、アジピン酸誘導体、ヘキサメチレンジアミン、１，６－ヘキサンジオールおよび６－アミノ－１－ヘキサノールからなる群より選択され、
    前記アジピン酸誘導体が、オキソアジピン酸、レブリン酸、３－ヒドロキシアジピン酸および２，３－デヒドロアジピン酸からなる群より選択される、製造方法。
13. 請求項８に記載の組換え微生物を培養する培養工程を含む、アジピン酸の製造方法。
14. 請求項９に記載の組換え微生物を培養する培養工程を含む、ヘキサメチレンジアミンの製造方法。
15. 請求項１０に記載の組換え微生物を培養する培養工程を含む、１，６－ヘキサンジオールの製造方法。
16. 請求項１１に記載の組換え微生物を培養する培養工程を含む、６－アミノ－１－ヘキサノールの製造方法。
17. （Ａ－１）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
    （ａ１）配列番号５に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
    （ａ２）配列番号５に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列を含むヌクレオチド
    をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物と配列同一性が８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドであって、
    ３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼ活性を有し、
    前記ＤＮＡは、６２６～９４０ｂｐを有する、組換えポリペプチド；
    （Ａ－２）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
    （ａ１）配列番号５に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
    （ａ２）配列番号５に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列を含むヌクレオチド
    をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であるＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる組換えポリペプチドであって、
    ３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼ活性を有し、
    前記ＤＮＡは、６２６～９４０ｂｐを有する、組換えポリペプチド；
    または
    （Ａ－３）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
    （ａ１）配列番号５に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
    （ａ２）配列番号５に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号６に示す塩基配列を含むヌクレオチド
    をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物の縮重異性体からなるＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドであって、
    ３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼ活性を有し、
    前記ＤＮＡは、６２６～９４０ｂｐを有する、組換えポリペプチド。
18. （Ｂ－１）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
    （ｂ１）配列番号７に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
    （ｂ２）配列番号７に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列を含むヌクレオチド
    をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物と配列同一性が８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドであって、
    ２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ活性を有し、
    前記ＤＮＡは、９２４～１３８６ｂｐを有する、組換えポリペプチド；
    （Ｂ－２）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
    （ｂ１）配列番号７に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
    （ｂ２）配列番号７に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列を含むヌクレオチド
    をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であるＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる組換えポリペプチドであって、
    ２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ活性を有し、
    前記ＤＮＡは、９２４～１３８６ｂｐを有する、組換えポリペプチド；
    または
    （Ｂ－３）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
    （ｂ１）配列番号７に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
    （ｂ２）配列番号７に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号８に示す塩基配列を含むヌクレオチド
    をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物の縮重異性体からなるＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドであって、
    ２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ活性を有し、
    前記ＤＮＡは、９２４～１３８６ｂｐを有する、組換えポリペプチド。

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