JP2023012570A - リジンアンモニアリアーゼ活性を有する組換えポリペプチド - Google Patents

Abstract

【課題】良好なリジンアンモニアリアーゼ活性を有する改変型酵素を提供すること。【解決手段】βリジンのアミノ基を脱離して６－アミノ－２－ヘキセン酸へと変換するアミノ基脱離活性を有する、組換えポリペプチド。【選択図】なし

Description

本発明は、リジンアンモニアリアーゼ活性を有する組換えポリペプチド、および、当該ポリペプチドを用いた脂肪族化合物の製造方法に関する。

近年の地球温暖化に伴う災害および気候変動をうけ、地球環境との共生および環境保全を目指したサスティナブルなプロセスの開発が強く求められている。中でも、再生可能原料を利用することができ、且つ、生体反応を利用した物質生産工程であるバイオプロセスに大きな期待が寄せられている。これまでに、さまざまな化成品の発酵生産プロセスが開発されており、たとえば、１，５－ジアミノペンタン、６－アミノカプロン酸およびアジピン酸などの化成品のモノマー原料の発酵生産プロセスが開発されている（特許文献１～４、ならびに、非特許文献１および２）。

例えば、６－アミノヘキサン酸およびヘキサメチレンジアミンの代謝合成経路のアイデアは種々記載されているが（特許文献５）、ｉ）中間体であるリジンの発酵生産菌の開発が進み事業化されていること、および、ｉｉ）中間体からの反応段数が比較的少ないことから、リジンを経由した代謝合成経路が有利であると考えられる。

リジンを経由した６－アミノカプロン酸の合成経路では、αアミノ基脱離反応を必要とする。天然に存在するαアミノ基脱離酵素（以下「アンモニアリアーゼ」とも称する。）が触媒可能な反応の基質は、反応中に生成するエンジオラート中間体の安定化が可能な構造である（非特許文献３）。しかし、基質がリジンの場合、エンジオラート中間体の安定化に寄与する官能基がないため、化学的に高いエネルギーを必要とし、反応の進行が困難であることが予想される。

リジンからのαアミノ基脱離酵素反応を示唆する例も報告されているが（特許文献６）、当該報告では酵素遺伝子が特定されていない。また、複数の遺伝子配列が含まれている例が報告されており、αリジンからのアミノ基脱離酵素反応が確実に進行したとは言い難い。一方で、αリジンを一旦β－リジンへと変換し、β－リジンにアンモニアリアーゼを作用させる経路が報告されている（特許文献７）。しかし、当該報告は、当該経路の酵素反応に関し既存酵素の利用の可能性を記載しているのみで、反応を触媒する酵素の存在を実証していない。

特開２０１２－１８８４０７号公報 特表２０１６－５３８８７０号公報 特表２０１６－５０１０３１号公報 特表２０１７－５３３７３４号公報 特表２０１２－５２５８５６号公報 国際公開第２０１１／０７８６６７号 国際公開第２０１２／０３０１９５０号

Ｙｕ，ｅｔ．ａｌ． Ｄｉｒｅｃｔ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｄｉｐｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ， Ｂｉｏｔｅｃｈｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｗｉｌｅｙ Ｐｅｒｉｏｄｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．， ２０１４， ｖｏｌ． １１１， ｐｐ．２５８０． Ｙｕ Ｚｈｏｕ， ｅｔ． ａｌ． Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｄｉｐｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ－ｆｒｅｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ２０２０， ８， ｐｐ．３１４－３１５ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ａ ＱＭ／ＭＭ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｍｏｎｉａ ｌｙａｓｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ、２０１４、 ５１、 １１３-１１９

本発明の課題は、良好なリジンアンモニアリアーゼ活性を有する改変型酵素（以下、単に「改変型酵素」とも称する。）を提供することにある。また、当該改変型酵素を用いた、脂肪族モノマーの製造方法を提供することにある。

本発明者らは、種々の酵素のスクリーニングを行うことにより、リジンを経由する６－アミノカプロン酸およびヘキサメチレンジアミンの代謝合成経路に基づき、鍵となる反応であるβ－リジンの脱アンモニアを触媒する酵素を見出した。すなわち、βリジンから、αリジンのα位アミノ基脱離化合物である６－アミノ－２－ヘキセン酸を生産することのできる酵素を見出し、本知見に基づき、本発明を成すに至った。

すなわち、本発明は、以下を提供する：
［１］（ａ）βリジンのアミノ基を脱離して６－アミノ－２－ヘキセン酸へと変換するアミノ基脱離活性を有し、
（ｂ）以下：
（ｉ）配列番号１、３、５、１３、１５または１７に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
（ｉｉ）配列番号１、３、５、１３、１５または１７に示すアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
（ｉｉｉ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡによってコードされる、
（ｉｖ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
（ｖ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる、および
（ｖｉ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる
のいずれかである、組換えポリペプチド；
［２］（ａ）βリジンのアミノ基を脱離して６－アミノ－２－ヘキセン酸へと変換するアミノ基脱離活性を有し、
（ｂ）以下：
（ｘｉ）配列番号１、３、５、１３、１５または１７に示すアミノ酸配列からなるか、または、
（ｘｉｉｉ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡによってコードされる、ポリペプチド；
［３］Ｃｌｏａｃｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｈｅｌａｔｉｖｏｒａｎｓ属、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ａｑｕａｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属およびＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属からなる群より選択される生物に由来する、［１］または［２］に記載のポリペプチド；
［４］Ｃｌｏａｃｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｒｃｏｒｕｍ、Ｃｈｅｌａｔｉｖｏｒａｎｓ ｓｐ．Ｊ３２、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｃ１－５０、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｂａｃｕｌａｔｕｍ、Ａｑｕａｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｓｐ． ＬＣ１０３およびＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｎｏｌｉｔｉｃｕｓからなる群より選択される生物に由来する、［１］～［３］のいずれか１項に記載のポリペプチド；
［５］（ａ’）６－アミノ－２－ヘキセン酸にアミノ基を付加してβリジンへと変換する活性をさらに有する、［１］～［４］のいずれか１項に記載のポリペプチド；
［６］［１］～［５］のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ；
［７］［６］に記載のＤＮＡを含む、組換えプラスミド；
［８］［６］に記載のＤＮＡが導入された、組換え微生物；
［９］［１］～［５］のいずれか１項に記載のポリペプチド、または、［８］に記載の組換え微生物の培養物および／または当該培養物の抽出物の存在下、βリジンを６－アミノ－２－ヘキセン酸に変換することを含む、目的化合物の製造方法であって、
前記目的化合物が、６－アミノ－２－ヘキセン酸、６－アミノカプロン酸、６－アミノヘキサナール、１，６－ジアミノヘキサン、６－アミノヘキセナール、１，６－ジアミノ－２－ヘキセン、５－ホルミルペンタン酸、アジポアルデヒド、６－アミノヘキサノール、６－ヒドロキシヘキサン酸、アジピン酸および１，６－ヘキサンジオ－ルからなる群より選択される、製造方法；
［１０］αリジンの２位アミノ基を３位へ転移させてβリジンを生成する反応を触媒する活性を有するポリペプチドの存在下、αリジンをβリジンに変換することを更に含む、［９］に記載の製造方法；
［１１］前記αリジンの２位アミノ基を３位へ転移させてβリジンを生成する反応を触媒する活性を有するポリペプチドが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属からなる群より選択される生物に由来する、［１０］に記載の製造方法；
［１２］前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換することを更に含み、
前記目的化合物が、６－アミノカプロン酸である、［９］～［１１］のいずれか１項に記載の製造方法；
［１３］前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
前記６－アミノカプロン酸を５－ホルミルペンタン酸に変換すること、および
前記５－ホルミルペンタン酸をアジピン酸に変換すること
をさらに含み、
前記目的化合物が、アジピン酸である、［９］～［１１］のいずれか１項に記載の製造方法；
［１４］前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
前記６－アミノカプロン酸を５－ホルミルペンタン酸に変換すること、および
前記５－ホルミルペンタン酸を６－ヒドロキシヘキサン酸に変換すること
をさらに含み、
前記目的化合物が、６－ヒドロキシヘキサン酸である、［９］～［１１］のいずれか１項に記載の製造方法；
［１５］（１）前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
前記６－アミノカプロン酸を６－アミノヘキサナールに変換すること、および
前記６－アミノヘキサナールを１，６－ジアミノヘキサンに変換すること
をさらに含むか、又は、
（２）前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノ－２－ヘキセナールに変換すること、
前記６－アミノ－２－ヘキセナールを１，６－ジアミノ－２－ヘキセンに変換すること、および
前記１，６－ジアミノ－２－ヘキセンを１，６－ジアミノヘキサンに変換すること
をさらに含み、
前記目的化合物が、１，６－ジアミノヘキサンである、［９］～［１１］のいずれか１項に記載の製造方法；
［１６］前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
前記６－アミノカプロン酸を６－アミノヘキサナールに変換すること、および
前記６－アミノヘキサナールを６－アミノヘキサノ－ルに変換すること
をさらに含み、
前記目的化合物が、６－アミノヘキサノールである、［９］～［１１］のいずれか１項に記載の製造方法；
［１７］下記（３）～（６）：
（３）前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
前記６－アミノカプロン酸を５－ホルミルペンタン酸に変換すること、
前記５－ホルミルペンタン酸をアジポアルデヒドに変換すること、
前記アジポアルデヒドを６－ヒドロキシヘキサナールに変換すること、及び
前記６－ヒドロキシヘキサナールを１，６－ヘキサンジオールに変換すること、
（４）前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
前記６－アミノカプロン酸を６－アミノヘキサナ－ルに変換すること、
前記６－アミノヘキサナ－ルをアジポアルデヒドに変換すること、
前記アジポアルデヒドを６－ヒドロキシヘキサナールに変換すること、及び
前記６－ヒドロキシヘキサナールを１，６－ヘキサンジオールに変換すること
（５）前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
前記６－アミノカプロン酸を５－ホルミルペンタン酸に変換すること、
前記５－ホルミルペンタン酸を６－ヒドロキシヘキサン酸に変換すること、
前記６－ヒドロキシヘキサン酸を６－ヒドロキシヘキサナールに変換すること、及び
前記６－ヒドロキシヘキサナールを１，６－ヘキサンジオールに変換すること、
（６）前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
前記６－アミノカプロン酸を６－アミノヘキサナールに変換すること、
前記６－アミノヘキサナールを６－アミノヘキサノ－ルに変換すること、
前記６－アミノヘキサノールを６－ヒドロキシヘキサナールに変換すること、及び
前記６－ヒドロキシヘキサナールを１，６－ヘキサンジオールに変換すること
のうちの１又は２をさらに含み、
前記目的化合物が、１，６－ヘキサンジオールである、［９］～［１１］のいずれか１項に記載の製造方法；
［１８］６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換することが、
・エノイル－ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．３．１．８、ＥＣ １．３．１．３８、およびＥＣ １．３．１．４４）、
・エノイル－［アシル－キャリアタンパク質］レダクターゼ（ＥＣ １．３．１．９、ＥＣ １．３．１．１０、およびＥＣ １．３．１．３９）、
・ブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．２）、
・アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．３）、および
・長鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．１３）
からなる群より選択される酵素によって触媒される、［９］～［１７］のいずれか１項に記載の製造方法；
［１９］・前記６－アミノカプロン酸から５－ホルミルペンタン酸に変換すること、
・前記６－アミノヘキサナールから１，６－ジアミノヘキサンに変換すること、
・前記６－アミノヘキサナールからアジポアルデヒドに変換すること、および
・前記６－アミノヘキサナールから６－ヒドロキシヘキサノールに変換することが、

・４－アミノブタン酸－２－オキソグルタル酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．１９）、
・プトレシン－２－オキソグルタル酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．８２）、
・４－アミノブタン酸－ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．９６）、および
・プトレシン－ピルビン酸トランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．１１３）
からなる群より選択される酵素によって触媒される、［９］～［１７］のいずれか１項に記載の製造方法；
［２０］前記酵素が、Ｖｉｂｒｉｏ属およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属からなる群より選択される生物に由来する、［１９］に記載の製造方法；
［２１］・前記６－アミノカプロン酸から６－アミノヘキサナールに変換すること、
・前記５－ホルミルペンタン酸からアジポアルデヒドに変換すること、
・前記６－アミノ－２－ヘキセン酸から６－アミノ２－ヘキセナールに変換すること、
・前記６－アミノヘキサナールから６－ヒドロキシヘキサナールに変換すること、および、
・前記６－ヒドロキシヘキサン酸から６－ヒドロキシヘキサナールに変換することが、カルボキシレートレダクターゼ（ＥＣ １．２．１．３０）に属する酵素によって触媒される、［９］～［１７］のいずれか１項に記載の製造方法；
［２２］前記カルボキシレートレダクターゼが、Ｍｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｕ属およびＮｏｃａｒｄｉａ属からなる群より選択される生物に由来する、［２１］に記載の製造方法；
［２３］前記５－ホルミルペンタン酸からアジピン酸に変換することが、アルデヒドオキシダーゼ（ＥＣ １．２．３．１）に属する酵素によって触媒される、［９］～［１７］のいずれか１項に記載の製造方法；
［２４］・前記５－ホルミルペンタン酸から６－ヒドロキシヘキサン酸に変換すること、
・前記６－アミノヘキサナールから６－アミノヘキサノールに変換すること、
・前記アジポアルデヒドから６－ヒドロキシヘキサナールに変換すること、および
・前記６－ヒドロキシヘキサナールから１，６－ヘキサンジオールに変換することが、
・アルコ－ルデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１）、および
・アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２）
からなる群より選択される酵素によって触媒される、［９］～［１７］のいずれか１項に記載の製造方法；
［２５］前記アルコールデヒドロゲナーゼが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属およびＢａｃｉｌｌｕｓ属からなる群より選択される生物に由来する、［２４］に記載の方法；
［２６］前記目的化合物を単離および／または精製することをさらに含む、［９］～［２５］のいずれか１項に記載の製造方法；
［２７］βリジンのアミノ基を脱離して６－アミノ－２－ヘキセン酸へと変換するアミノ基脱離活性を有するポリペプチドをコードする外来性遺伝子を含む組換え微生物であって、
前記外来性遺伝子が、
（ｉ）配列番号１、３、５、１３、１５または１７に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号１、３、５、１３、１５または１７に示すアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉｉｉ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
（ｉｖ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｖ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、または
（ｖｉ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
である、組換え微生物。
［２８］前記外来性遺伝子が、
（ｘｉ）配列番号１、３、５、１３、１５または１７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、または、
（ｘｉｉｉ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ
である、［２７］に記載の組換え微生物；
［２９］６－アミノ－２－ヘキセン酸、６－アミノカプロン酸、６－アミノヘキサナール、１，６－ジアミノヘキサン、６－アミノヘキセナール、１，６－ジアミノ－２－ヘキセン、５－ホルミルペンタン酸、アジポアルデヒド、６－アミノヘキサノール、６－ヒドロキシヘキサン酸、アジピン酸および１，６－ヘキサンジオ－ルからなる群より選択される少なくとも１つを産生する経路を有する、［２７］または［２８］に記載の組換え微生物。

良好なリジンアンモニアリアーゼ活性を有する改変型酵素、および、当該改変型酵素を用いた、脂肪族モノマーの製造方法を提供することができる。

図１は、ＡｓｐＡのアミノ酸配列を示す図である。 図２は、ＡｓｐＡの塩基配列を示す図である。 図３は、ＭＡＬ１のアミノ酸配列を示す図である。 図４は、ＭＡＬ１の塩基配列を示す図である。 図５は、ＭＡＬ２のアミノ酸配列を示す図である。 図６は、ＭＡＬ２の塩基配列を示す図である。 図７は、ＡｓｐＢ１のアミノ酸配列を示す図である。 図８は、ＡｓｐＢ１の塩基配列を示す図である。 図９は、ＡｓｐＢ２のアミノ酸配列を示す図である。 図１０は、ＡｓｐＢ２の塩基配列を示す図である。 図１１は、ＡｓｐＢ３のアミノ酸配列を示す図である。 図１２は、ＡｓｐＢ３の塩基配列を示す図である。 図１３は、ＭＡＬ３のアミノ酸配列を示す図である。 図１４は、ＭＡＬ３の塩基配列を示す図である。 図１５は、ＭＡＬ４のアミノ酸配列を示す図である。 図１６は、ＭＡＬ４の塩基配列を示す図である。 図１７は、ＭＡＬ５のアミノ酸配列を示す図である。 図１８は、ＭＡＬ５の塩基配列を示す図である。 図１９は、ｋａｍＡのアミノ酸配列を示す図である。 図２０は、ｋａｍＡの塩基配列を示す図である。 図２１は、ｐＳＫ０００のプラスミドを示す図である。 図２２は、本発明に含まれる代謝経路を示す図である。

以下、本発明を実施するための形態について具体的に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。なお、本明細書において、「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。本明細書に段階的に記載されている数値範囲において、ある段階の数値範囲の上限値又は下限値は、他の段階の数値範囲の上限値又は下限値と任意に組み合わせることができる。

本明細書に記述されているＤＮＡの取得、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２０１２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、遺伝子工学実験ノート （羊土社 田村隆明）等に記載されている方法により行なうことができる。本明細書において特に断りのない限りヌクレオチド配列は５’から３’方向に向けて記載される。

本明細書において、「ポリペプチド」および「タンパク質」の語は、互換可能に使用される。

本明細書において、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）配列解析ソフトウェアを利用し、基準とするアミノ酸配列と、対比するアミノ酸配列を整列させたとき、“Ｉｎｄｅｎｔｉｔｙ”として算出される数値のことを指す。

本明細書において、「内因」または「内因性」の用語は、遺伝子組換えによる改変がなされていない宿主微生物が、言及された遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質（典型的には酵素）を、当該宿主細胞内で優位な生化学的反応を進行させ得る程度に機能的に発現しているかどうかに関わらず、宿主微生物が有していることを意味するために用いられる。「内因性」および「内在性」の用語は、本明細書において互換可能に用いられる。

本明細書において、「外来」または「外来性」の用語は、遺伝子組換えによる改変がなされていない宿主微生物が、言及された遺伝子を有していない場合、またはその遺伝子によりコードされる酵素を実質的に発現しない場合、または異なる遺伝子により当該酵素のアミノ酸配列をコードしているが、形質転換後に匹敵する内因性酵素活性を発現しない場合において、本発明に基づく遺伝子配列を宿主微生物に導入することを意味するために用いられる。「外来性」および「外因性」の用語は、本明細書において互換可能に用いられる。

本発明者らは、αリジンを一旦β－リジンへと変換し、β－リジンにアンモニアリアーゼを作用させる経路に着目した。種々の酵素のスクリーニングを行った結果、βリジンから、αリジンのα位アミノ基脱離化合物である６－アミノ－２－ヘキセン酸を生産することができることを見出した。

本発明にかかる組換えポリペプチドは、３位アミノ基の脱離による２，３位炭素－炭素不飽和結合形成およびその逆反応を触媒する。具体的には、本発明にかかる組換えポリペプチドは、
・βリジンのアミノ基を脱離して６－アミノ－２－ヘキセン酸へと変換するアミノ基脱離活性（活性（ａ））、および、
・６－アミノ－２－ヘキセン酸にアミノ基を付加してβリジンへと変換する活性（活性（ａ’））
の少なくとも１つを有する。活性（ａ’）に関し、「６－アミノ－２－ヘキセン酸にアミノ基を付加してβリジンへと変換する反応」は、上記活性（ａ）に関する、「βリジンのアミノ基を脱離して６－アミノ－２－ヘキセン酸へと変換するアミノ基脱離反応」の逆反応である。

上記活性（ａ）および活性（ａ’）の少なくとも１つを有する酵素は、「βリジンアンモニアリアーゼ」とも称される。また、活性（ａ）および活性（ａ’）の少なくとも１つの酵素活性は、「βリジンアンモニアリアーゼ活性」または「βリジンアンモニアリアーゼ酵素活性」とも称され、これらの語は互換可能に用いられる。

一態様において、本発明にかかる組換えポリペプチドは、βリジンのアミノ基を脱離して６－アミノ－２－ヘキセン酸へと変換するアミノ基脱離活性（活性（ａ））を有する。βリジンのアミノ基を脱離して６－アミノ－２－ヘキセン酸へと変換する反応は、図２２のステップＢに示される。

好ましい態様において、本発明にかかる組換えポリペプチドは、活性（ａ）に加え、６－アミノ－２－ヘキセン酸にアミノ基を付加してβリジンへと変換する活性（活性（ａ’））をさらに有する。すなわち、図２２のステップＢの反応の逆反応である。

配列に関し、本発明にかかる組換えポリペプチドは、以下のいずれかである：
（ｉ）配列番号１、３、５、１３、１５または１７に示すアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
（ｉｉ）配列番号１、３、５、１３、１５または１７に示すアミノ酸配列に対して１～１０個、１～７個、１～５個または１～３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
（ｉｉｉ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列と８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡによってコードされる、
（ｉｖ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１～１０個、１～７個、１～５個または１～３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
（ｖ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる、および
（ｖｉ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる。

本発明にかかる組換えポリペプチドは、好ましくは、以下から選択される：
（ｉ）配列番号１、３、５、１３、１５または１７に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
（ｉｉ）配列番号１、３、５、１３、１５または１７に示すアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
（ｉｉｉ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡによってコードされる、
（ｉｖ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
（ｖ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる、および
（ｖｉ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる。

本発明にかかる組換えポリペプチドは、より好ましくは、以下：
（ｘｉ）配列番号１、３、５、１３、１５または１７に示すアミノ酸配列からなるか、または、
（ｘｉｉｉ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡによってコードされる、
ポリペプチドである。

本発明にかかる上記ポリペプチドは、クロアシバシルス（Ｃｌｏａｃｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シェラティヴォランス（Ｃｈｅｌａｔｉｖｏｒａｎｓ）属、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）属、デスルホミクロビウム（Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、アクアミクロビウム（Ａｑｕａｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属およびシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属からなる群より選択される生物に由来する。

本発明において、「由来する」とは、遺伝子またはそれによりコードされるポリペプチド（典型的には酵素）が、言及する特定の生物種が内因的に有しているものであることを意味する。

好ましい態様において、上記ポリペプチドは、Ｃｌｏａｃｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｒｃｏｒｕｍ、Ｃｈｅｌａｔｉｖｏｒａｎｓ ｓｐ．Ｊ３２、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｃ１－５０、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｂａｃｕｌａｔｕｍ、Ａｑｕａｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｓｐ． ＬＣ１０３およびＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｎｏｌｉｔｉｃｕｓからなる群より選択される生物に由来する。

本発明にかかる上記ポリペプチドは、良好なβリジンアンモニアリアーゼ活性を有する。かかるポリペプチドを用いることにより、目的化合物を製造することができる。目的化合物としては、例えばＣ６化合物が挙げられる。Ｃ６化合物については、後述する。

本発明の第２の側面は、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。また本発明の別の側面は、かかるＤＮＡを含む組換えプラスミド、および、かかるＤＮＡが導入された、組換え微生物に関する。

より詳細には、上記のポリペプチドの外来性遺伝子を導入した遺伝子組換え微生物も本発明の範囲に包含される。ここで、「遺伝子組換え微生物」は、単に「組換え微生物」とも称する。

一態様において、組換え微生物は、βリジンのアミノ基を脱離して６－アミノ－２－ヘキセン酸へと変換するアミノ基脱離活性を有するポリペプチドをコードする外来性遺伝子を含む組換え微生物であって、当該外来性遺伝子が、以下：
（ｉ）配列番号１、３、５、１３、１５または１７に示すアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号１、３、５、１３、１５または１７に示すアミノ酸配列に対して１～１０個、１～７個、１～５個または１～３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉｉｉ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列と８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
（ｉｖ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１～１０個、１～７個、１～５個または１～３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｖ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、または
（ｖｉ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
である。

好ましい態様において、組換え微生物は、βリジンのアミノ基を脱離して６－アミノ－２－ヘキセン酸へと変換するアミノ基脱離活性を有するポリペプチドをコードする外来性遺伝子を含む組換え微生物であって、当該外来性遺伝子が、以下：
（ｉ）配列番号１、３、５、１３、１５または１７に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号１、３、５、１３、１５または１７に示すアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉｉｉ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
（ｉｖ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｖ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、または
（ｖｉ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
である。

より好ましい態様において、前記外来性遺伝子は、
（ｘｉ）配列番号１、３、５、１３、１５または１７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、または、
（ｘｉｉｉ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ
である。

本発明において、目的の外来性遺伝子が導入される宿主微生物は特に限定されず、原核生物および真核生物のいずれであってもよい。既に単離保存されているもの、新たに天然から分離したものおよび遺伝子改変をされたものから任意に選択することができる。

本発明の宿主微生物には、細菌、酵母、真菌などの、発酵プロセスに使用できる様々な微生物が利用可能である。宿主微生物は、例えば、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属、アルカリハロバチルス（Ａｌｋａｌｉｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、カンジタ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する。宿主微生物は、好ましくは、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属し、より好ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。

したがって、上記宿主微生物に外来性遺伝子を導入した本発明にかかる組換え微生物は、例えば、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属、アルカリハロバチルス（Ａｌｋａｌｉｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、カンジタ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する。本発明にかかる組換え微生物は、好ましくは、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属し、より好ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。

本発明において、ある化合物に関し、「生産経路を有する」および「産生する経路を有する」とは、本発明にかかる遺伝子組換え微生物が、その化合物の生産経路の各反応段階が進行するために十分な量の酵素を発現し、その化合物を生合成可能であることを意味する。本発明の組換え微生物は、当該化合物を生産する能力を本来有する宿主微生物を用いたものであってもよく、本来は当該化合物を生産する能力を有さない宿主微生物に対して、その化合物の生産能を有するように改変を行ったものであってもよい。

本発明にかかる組換え微生物は、６－アミノ－２－ヘキセン酸、６－アミノカプロン酸、６－アミノヘキサナール、１，６－ジアミノヘキサン、６－アミノヘキセナール、１，６－ジアミノ－２－ヘキセン、５－ホルミルペンタン酸、アジポアルデヒド、６－アミノヘキサノール、６－ヒドロキシヘキサン酸、アジピン酸および１，６－ヘキサンジオ－ルからなる群より選択される少なくとも１つを産生する経路を有する。

本発明にかかる組換え微生物は、Ｃ６化合物生産経路の反応段階を触媒する酵素をさらに発現することで、Ｃ６化合物生産経路を有する遺伝子組換え微生物となり得る。なお、本発明の遺伝子組換え微生物が、外来遺伝子の導入によらずとも、Ｃ６化合物生産経路の反応段階を触媒する十分な量の酵素を発現する場合は、内因遺伝子にコードされる酵素によって反応が進行してもよい。

本発明の更なる側面は、上記ポリペプチドまたは上記組換え微生物の培養物および／または当該培養物の抽出物の存在下、βリジンを６－アミノ－２－ヘキセン酸に変換することを含む、目的化合物の製造方法に関する。ここで、目的化合物は脂肪族モノマーであってよい。脂肪族モノマーは、例えば、Ｃ６化合物である。

目的化合物は、例えば、６－アミノ－２－ヘキセン酸、６－アミノカプロン酸、６－アミノヘキサナール、１，６－ジアミノヘキサン、６－アミノヘキセナール、１，６－ジアミノ－２－ヘキセン、５－ホルミルペンタン酸、アジポアルデヒド、６－アミノヘキサノール、６－ヒドロキシヘキサン酸、アジピン酸および１，６－ヘキサンジオ－ルからなる群より選択される（図２２）。一態様において、本発明は、６－アミノ－２－ヘキセン酸の製造方法に関する。

別の一態様において、本発明は６－アミノ－２－ヘキセン酸の前駆体の製造方法を提供する。ここで、６－アミノ－２－ヘキセン酸の前駆体としては、例えば、α－リジンおよびβ－リジンが挙げられる。

更なる態様において、本発明は、前記６－アミノ－２－ヘキセン酸から６－アミノカプロン酸、アジピン酸、６－ヒドロキシカプロン酸、１，６－ヘキサンジアミン、６－アミノヘキサン－１－オールまたは１，６－ヘキサンジオールを製造する方法を提供する（図２２）。

本発明にかかる組換え微生物および製造方法に関連して、Ｃ６化合物生産経路の例を図２２に示す。以下、各反応段階を触媒する酵素について図２２を参照しながら説明する。

本発明にかかる製造方法は、酵素の存在下で、βリジンを６－アミノ－２－ヘキセン酸に変換することを含む。βリジンから６－アミノ－２－ヘキセン酸への変換は、βリジンの３位アミノ基を脱離させ、２，３位炭素－炭素不飽和結合を形成する活性を有する酵素の少なくとも１種類を用いて行うことができる（図２２のステップＢの反応）。本変換は、例えば：
・デスルホミクロビウム（Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属（具体的にはＤｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｂａｃｕｌａｔｕｍ）、
・アクアミクロビウム（Ａｑｕａｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属（具体的にはＡｑｕａｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｓｐ． ＬＣ１０３）および
・シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属（具体的にはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｎｏｌｉｔｉｃｕｓ）
・クロアシバシルス（Ｃｌｏａｃｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属（具体的にはＣｌｏａｃｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｒｃｏｒｕｍ）、
・シェラティヴォランス（Ｃｈｅｌａｔｉｖｏｒａｎｓ）属（具体的にはＣｈｅｌａｔｉｖｏｒａｎｓ ＳＰ．Ｊ３２）、
・マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）属（具体的にはＭｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｃ１－５０）
からなる群から選択される生物由来の酵素を選択することができる。好適な酵素は、配列番号１、３、５、１３、１５または１７に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。

αアミノ基の脱離／付加を触媒する天然に存在する酵素は、アンモニアリアーゼ（ＥＣ ４．３．１）の群に分類される。アンモニアリアーゼは、正反応のアミノ基脱離および逆反応のアミノ基付加の双方向の反応を触媒することができる。例えば、Ｌｉ ｅｔ ．ａｌ． Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｒｅｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ ｒｅｇｉｏ－ ａｎｄ ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｙｄｒｏａｍｉｎａｔｉｏｎ， Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ２０１８， １４， ６６４－６７０の文献においては、アスパラギン酸のアミノ基脱離活性を示すポリペプチドを鋳型として改変を行い、所望の基質に対しアミノ基付加を行う酵素を構築している。このことは、本発明にかかるβリジンのアミノ基脱離反応を触媒する酵素が、逆反応である６－アミノヘキセン酸へのアミノ基付加反応をも触媒し得ることを示唆する。

図２２のステップＡでは、αリジンの２位アミノ基が３位へ転移し、βリジンが生成する。αリジンからのβリジンへの変換は、αリジンの２位アミノ基を３位へ転移させる活性を有する酵素の少なくとも１種類を用いて行うことができる。具体的には、アミノムターゼ（ＥＣ ５．４．３）の群に含まれる酵素、より具体的にはリジンアミノムターゼ（ＥＣ ５．４．３．２）から選択することができる。かかる酵素として、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｕｂｔｅｒｍｉｎａｌｅ由来ｋａｍＡ（アクセッションナンバー：Ｑ９ＸＢＱ８．１）、および、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来ｙｊｅＫ（アクセッションナンバー：ＡＰ００９０４８．１）が挙げられる。

したがって、好ましい態様において、本発明にかかる製造方法は、αリジンの２位アミノ基を３位へ転移させてβリジンを生成する反応を触媒する活性を有するポリペプチドの存在下、αリジンをβリジンに変換することを更に含む。

より好ましい態様において、前記αリジンの２位アミノ基を３位へ転移させてβリジンを生成する反応を触媒する活性を有するポリペプチドは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属からなる群より選択される生物に由来する。さらにより好ましい態様において、前記αリジンの２位アミノ基を３位へ転移させてβリジンを生成する反応を触媒する活性を有するポリペプチドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｕｂｔｅｒｍｉｎａｌｅからなる群より選択される生物に由来する。

一態様において、本発明にかかる製造方法によれば、αリジンから６－アミノ－２－ヘキセン酸を調製することができる（図２２のステップＡおよびＢ）。すなわち、一態様において、本発明にかかる製造方法は、
・αリジンをβリジンに変換すること、および、
・βリジンを６－アミノ－２－ヘキセン酸に変換すること
を含む。

図２２のステップＣでは、６－アミノ－２－ヘキセン酸の二重結合が選択的に還元され、６－アミノカプロン酸を生成する。６－アミノ－２－ヘキセン酸から６－アミノカプロン酸への変換は、二重結合を還元する活性を有する酵素の少なくとも１種類を用いて行うことができる。本酵素の例を以下に示す：
・エノイル－ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．３．１．８、ＥＣ １．３．１．３８、およびＥＣ １．３．１．４４）、
・エノイル－［アシル－キャリアタンパク質］レダクターゼ（ＥＣ １．３．１．９、ＥＣ １．３．１．１０、およびＥＣ １．３．１．３９）、
・ブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．２）、
・アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．３）、および
・長鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．１３）。

したがって、一態様において、本発明にかかる製造方法は、前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換することを更に含む。ここで、当該製造法における目的化合物は、６－アミノカプロン酸である。

本発明にかかる製造方法によれば、βリジンから６－アミノカプロン酸を合成することができる（図２２のステップＢの反応およびステップＣの反応）。本製造方法は、βリジンを６－アミノ－２－ヘキセン酸に変換することと、前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換することとを含む。

図２２のステップＤでは、６－アミノカプロン酸の－ＣＨ_２－ＮＨ_２部位がホルミル基へと変換され、５－ホルミルペンタン酸を生成する。アミノカプロン酸から５－ホルミルペンタン酸への変換は、アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素の少なくとも１種類を用いて行うことができる。本酵素の例を以下に示す：
・４－アミノブタン酸－２－オキソグルタル酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．１９）、
・プトレシン－２－オキソグルタル酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．８２）、
・４－アミノブタン酸－ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．９６）、および
・プトレシン－ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．１１３）。

図２２のステップＥでは、５－ホルミルペンタン酸のホルミル基が酸化され、アジピン酸を生成する。５－ホルミルペンタン酸からアジピン酸への変換は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素の少なくとも１種類を用いて行うことができる。本酵素の例を以下に示す：
・アルデヒドオキシダーゼ（ＥＣ １．２．３．１）。

図２２のステップＦでは、５－ホルミルペンタン酸のホルミル基が還元され、６－ヒドロキシヘキサン酸を生成する。５－ホルミルペンタン酸から６－ヒドロキシヘキサン酸への変換は、アルデヒドオキシダーゼ活性を有する酵素の少なくとも１種類を用いて行うことができる。本酵素の例を以下に示す：
・アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１）、および
・アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２）。

図２２のステップＧでは、６－アミノカプロン酸のカルボキシル基が還元され、６－アミノヘキサナールを生成する。６－アミノカプロン酸から６－アミノヘキサナールへの変換は、カルボキシレートレダクターゼ活性を有する酵素の少なくとも１種類を用いて行うことができる。本酵素の例を以下に示す：
・カルボキシレ－トレダクターゼ（ＥＣ １．２．１．３０）。

図２２のステップＨでは、６－アミノヘキサナールのホルミル基がアミノ基転移反応を受け、１，６－ジアミノヘキサンを生成する。６－アミノヘキサナールから１，６－ジアミノヘキサンへの変換は、アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素の少なくとも１種類を用いて行うことができる。本酵素の例を以下に示す：
・４－アミノブタン酸－２－オキソグルタル酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．１９）、
・プトレシン－２－オキソグルタル酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．８２）、
・４－アミノブタン酸－ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．９６）、および
・プトレシン－ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．１１３）。

図２２のステップＲでは、６－アミノヘキサナールの－ＣＨ_２－ＮＨ_２部位がホルミル基へと変換され、アジポアルデヒドを生成する。６－アミノヘキサナールからアジポアルデヒドへの変換は、アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素の少なくとも１種類を用いて行うことができる。本酵素の例を以下に示す：
・４－アミノブタン酸－２－オキソグルタル酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．１９）、
・プトレシン－２－オキソグルタル酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．８２）、
・４－アミノブタン酸－ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．９６）、および
・プトレシン－ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．１１３）。

図２２のステップＩでは、６－アミノヘキサナールのホルミル基が還元され、６－アミノヘキサノ－ルを生成する。６－アミノヘキサナールから６－アミノヘキサノ－ルへの変換は、アルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素の少なくとも１種類を用いて行うことができる。本酵素の例を以下に示す：
・アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１）、および
・アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２）。

図２２のステップＪでは、６－アミノヘキサノ－ルの－ＣＨ_２－ＮＨ_２部位がホルミル基へと変換され、６－ヒドロキシヘキサナールを生成する。６－アミノヘキサノールから６－ヒドロキシヘキサナールへの変換は、アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素の少なくとも１種類を用いて行うことができる。本酵素の例を以下に示す：
・４－アミノブタン酸－２－オキソグルタル酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．１９）、
・プトレシン－２－オキソグルタル酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．８２）、
・４－アミノブタン酸－ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．９６）、および
・プトレシン－ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．１１３）。

図２２のステップＫでは、６－ヒドロキシヘキサン酸のカルボキシル基が還元され、６－ヒドロキシヘキサナールを生成する。６－ヒドロキシヘキサン酸から６－ヒドロキシヘキサナールへの変換は、カルボキシレートレダクターゼ活性を有する酵素の少なくとも１種類を用いて行うことができる。本酵素の例を以下に示す：
・カルボキシレ－トレダクターゼ（ＥＣ １．２．１．３０）。

図２２のステップＬでは、６－ヒドロキシヘキサナールのホルミル基が還元され、１，６－ヘキサンジオールを生成する。６－ヒドロキシヘキサナールから１，６－ヘキサンジオールへの変換は、アルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素の少なくとも１種類を用いて行うことができる。本酵素の例を以下に示す：
・アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１）、および
・アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２）。

図２２のステップＭでは、５－ホルミルペンタン酸のカルボキシル基が還元され、アジポアルデヒドを生成する。５－ホルミルペンタン酸からアジポアルデヒドへの変換は、カルボキシレートレダクターゼ活性を有する酵素の少なくとも１種類を用いて行うことができる。本酵素の例を以下に示す：
・カルボキシレ－トレダクターゼ（ＥＣ １．２．１．３０）。

図２２のステップＮでは、アジポアルデヒドのアルデヒド基が還元され、６－ヒドロキシヘキサナールを生成する。アジポアルデヒドから６－ヒドロキシヘキサナールへの変換は、アルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素の少なくとも１種類を用いて行うことができる。本酵素の例を以下に示す：
・アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１）、および
・アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２）。

図２２のステップＯでは、６－アミノ－２－ヘキセン酸のカルボキシル基が還元され、６－アミノ－２－ヘキセナールを生成する。６－アミノ－２－ヘキセン酸から６－アミノ－２－ヘキセナールへの変換は、カルボキシレートレダクターゼ活性を有する酵素の少なくとも１種類を用いて行うことができる。本酵素の例を以下に示す：
・カルボキシレ－トレダクターゼ（ＥＣ １．２．１．３０）。

図２２のステップＰでは、６－アミノ－２－ヘキセナールのホルミル基がアミノ基転移反応を受け、１，６－ジアミノ－２－ヘキセンを生成する。６－アミノ－２－ヘキセナールから１，６－ジアミノ－２－ヘキセンへの変換は、アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素の少なくとも１種類を用いて行うことができる。本酵素の例を以下に示す：
・４－アミノブタン酸－２－オキソグルタル酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．１９）、
・プトレシン－２－オキソグルタル酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．８２）、
・４－アミノブタン酸－ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．９６）、および
・プトレシン－ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．１１３）。

図２２のステップＱでは、１，６－ジアミノ－２－ヘキセンの炭素－炭素二重結合が還元され、１，６－ジアミノヘキサンを生成する。１，６－ジアミノ－２－ヘキセンから１，６－ジアミノヘキサンへの変換は、炭素－炭素二重結合を還元する活性を有する酵素の少なくとも１種類を用いて行うことができる。本酵素の例を以下に示す：
・エノイル－ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．３．１．８、ＥＣ １．３．１．３８、およびＥＣ １．３．１．４４）、
・エノイル－［アシル－キャリアタンパク質］レダクターゼ（ＥＣ １．３．１．９、ＥＣ １．３．１．１０、およびＥＣ １．３．１．３９）、
・ブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．２）、
・アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．３）、および
・長鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．１３）。

一態様において、本発明にかかる製造方法により、βリジンからアジピン酸を調製することができる（図２２のステップＢ、Ｃ、ＤおよびＥ）。すなわち、一態様において、本発明にかかる製造方法は、
・βリジンを６－アミノ－２－ヘキセン酸に変換すること、
・前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
・前記６－アミノカプロン酸を５－ホルミルペンタン酸に変換すること、および、
・前記５－ホルミルペンタン酸をアジピン酸に変換することを含む。

一態様において、本発明にかかる製造方法により、βリジンから６－ヒドロキシヘキサン酸を調製することができる（図２２のステップＢ、Ｃ、ＤおよびＦ）。すなわち、一態様において、本発明にかかる製造方法は、
・βリジンを６－アミノ－２－ヘキセン酸に変換すること、
・前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
・前記６－アミノカプロン酸を５－ホルミルペンタン酸に変換すること、および、
・前記５－ホルミルペンタン酸を６－ヒドロキシヘキサン酸に変換すること
を含む。ここで、目的化合物は６－ヒドロキシヘキサン酸である。

一態様において、本発明にかかる製造方法により、βリジンから１，６－ジアミノヘキサンを調製することができる（図２２のステップＢ、Ｃ、ＧおよびＨ、またはステップＢ、Ｏ、ＰおよびＱ）。すなわち、一態様において、本発明にかかる製造方法は、
（１）・βリジンを６－アミノ－２－ヘキセン酸に変換すること、
・前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
・前記６－アミノカプロン酸を６－アミノヘキサナールに変換すること、および
・前記６－アミノヘキサナ－ルを１，６－ジアミノヘキサンに変換すること
を含むか、又は、
（２）・βリジンを６－アミノ－２－ヘキセン酸変換すること、
・前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノ２－ヘキセナールに変換すること、
・前記６－アミノ－２－ヘキセナールを１，６－ジアミノ－２－ヘキセンに変換すること、および
・前記１，６－ジアミノ－２－ヘキセンを１，６－ジアミノヘキサンに変換することを含む。ここで、目的化合物は１，６－ジアミノヘキサンである。

一態様において、本発明にかかる製造方法により、βリジンからアジピン酸を調製することができる（図２２のステップＢ、Ｃ、ＧおよびＲ）。すなわち、一態様において、本発明にかかる製造方法は、
・βリジンを６－アミノ－２－ヘキセン酸に変換すること、
・前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
・前記６－アミノカプロン酸を５－ホルミルペンタン酸に変換すること、および
・前記５－ホルミルペンタン酸をアジピン酸に変換すること
を含む。ここで、目的化合物はアジピン酸である。

一態様において、本発明にかかる製造方法により、βリジンから６－アミノ－ヘキサン－１－オールを調製することができる（図２２のステップＢ、Ｃ、ＧおよびＩ）。すなわち、一態様において、本発明にかかる製造方法は、
・βリジンを６－アミノ－２－ヘキセン酸に変換すること、
・前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
・前記６－アミノカプロン酸を６－アミノヘキサナールに変換すること、および
・前記６－アミノヘキサナールを６－アミノヘキサン―１－オールに変換すること
を含む。ここで、目的化合物は、６－アミノヘキサン―１－オールである。

一態様において、本発明にかかる製造方法により、βリジンから１，６－ヘキサンジオールを調製することができる（図２２のステップＢ、Ｃ、Ｄ、Ｍ、ＮおよびＬ、ステップＢ、Ｃ、Ｇ、Ｒ、ＮおよびＬ、ステップＢ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、ＫおよびＫ、ならびに、ステップＢ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、ＪおよびＬ）。すなわち、一態様において、本発明にかかる製造方法は、以下（３）～（６）のうちの１または２を含む。ここにおいて、目的化合物は１，６－ヘキサンジオールである。
（３）・βリジンを６－アミノ－２－ヘキセン酸に変換すること、
・６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
・６－アミノカプロン酸を５－ホルミルペンタン酸に変換すること、
・５－ホルミルペンタン酸をアジポアルデヒドに変換すること、
・アジポアルデヒドを６－ヒドロキシヘキサナールに変換すること、および、
・前記６－ヒドロキシヘキサナールを１，６－ヘキサンジオールに変換すること、
（４）・βリジンを６－アミノ－２－ヘキセン酸に変換すること、
・６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
・６－アミノカプロン酸を６－アミノヘキサナールに変換すること、
・６－アミノヘキサナ－ルをアジポアルデヒドに変換すること、
・アジポアルデヒドを６－ヒドロキシヘキサナールに変換すること、および、
・前記６－ヒドロキシヘキサナールを１，６－ヘキサンジオールに変換すること、
（５）・βリジンを６－アミノ－２－ヘキセン酸に変換すること、
・６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
・６－アミノカプロン酸を５－ホルミルペンタン酸に変換すること、
・５－ホルミルペンタン酸を６－ヒドロキシヘキサン酸に変換すること、
・６－ヒドロキシヘキサン酸を６－ヒドロキシヘキサナールに変換すること、および、
・前記６－ヒドロキシヘキサナールを１，６－ヘキサンジオールに変換すること、
（６）・βリジンを６－アミノ－２－ヘキセン酸に変換すること、
・６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
・６－アミノカプロン酸を６－アミノヘキサナールに変換すること、
・６－アミノヘキサナールを６－アミノヘキサノ－ルに変換すること、
・６－アミノヘキサノールを６－ヒドロキシヘキサナールに変換すること、および、
・前記６－ヒドロキシヘキサナールを１，６－ヘキサンジオールに変換すること。

ここで、６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換する反応（図２２のステップＣ）および１，６－ジアミノ－２－ヘキセンを１，６－ジアミノヘキサンに変換する反応（図２２のステップＱ）は、酵素の存在下、二重結合の選択的水素化により行うことができる。例えば、２－エノエ－トの炭素－炭素二重結合還元を触媒することができる酵素の少なくとも１種類を用いて、上記反応を行うことができる。具体的には、上記反応は、オキシドレダクターゼ（ＥＣ １．３．１およびＥＣ １．３．９９）の群から選択される酵素によって触媒される。上記反応は、より具体的には下記：
・エノイル－ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．３．１．８、ＥＣ １．３．１．３８およびＥＣ １．３．１．４４）、
・エノイル－［アシル－キャリアタンパク質］レダクターゼ（ＥＣ １．３．１．９、ＥＣ １．３．１．１０およびＥＣ １．３．１．３９）、
・ブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．２）、
・アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．３）、および
・長鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．１３）
からなる群より選択される酵素の少なくとも１つによって触媒される。

６－アミノカプロン酸を５－ホルミルペンタン酸へ変換する反応（図２２のステップＤ）、６－アミノヘキサナールを１，６－ジアミノヘキサンへ変換する反応（図２２のステップＨ）、６－アミノヘキサノールをアジポアルデヒドへ変換する反応（図２２のステップＲ）および６－アミノヘキサノールを６－ヒドロキシヘキサナールへ変換する反応（図２２のステップＪ）は、酵素の存在下、実施することができる。例えば、アミノ基転移を触媒することができる酵素を用いて行うことができる。上記反応は、具体的にはアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１）の群から選択される酵素によって触媒される。上記反応は、より具体的には：
・４－アミノブタン酸－２－オキソグルタル酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．１９）、
・プトレシン－２－オキソグルタル酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．８２）、
・４－アミノブタン酸－ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．９６）、および
・プトレシン－ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．１１３）からなる群より選択される酵素の少なくとも１つによって触媒される。また、かかる酵素は、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属およびエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属からなる群より選択される生物に由来する。

６－アミノカプロン酸を６－アミノヘキサナールへ変換する反応（図２２のステップＧ）、５－ホルミルペンタン酸をアジポアルデヒドへ変換する反応（図２２のステップＭ）、６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノ２－ヘキセナールへ変換する反応（図２２のステップＯ）、６－アミノヘキサナールを６－ヒドロキシヘキサナールへ変換する反応（図２２のステップ（Ｉ））、および、６－ヒドロキシヘキサン酸から６－ヒドロキシヘキサナールへ変換する反応（図２２のステップＫ）は、酵素の存在下、実施することができる。上記反応は、具体的にはオキシドレダクターゼ（ＥＣ １．２．１）の群から選択される酵素によって触媒される。上記反応は、より具体的には、カルボキシレ－トレダクターゼ（ＥＣ １．２．１．３０）の群から選択される酵素の少なくとも１つによって触媒される。また、かかる酵素は、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属およびノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属からなる群より選択される生物に由来する。

５－ホルミルペンタン酸をアジピン酸へ変換する反応（図２２のステップＥ）は、酵素の存在下、実施することができる。本反応は、具体的にはオキシドレダクターゼ（ＥＣ １．２．３）の群から選択される酵素によって触媒される。本反応は、具体的には、アルデヒドオキシダーゼ（ＥＣ １．２．３．１）の群から選択される酵素の少なくとも１つによって触媒される。

５－ホルミルペンタン酸を６－ヒドロキシヘキサン酸へ変換する反応（図２２のステップＦ）、６－アミノヘキサナールを６－アミノヘキサノールへ変換する反応（図２２のステップＩ）、アジポアルデヒドを６－ヒドロキシヘキサナールへ変換する反応（図２２のステップＮ）、および、６－ヒドロキシヘキサナールを１，６－ヘキサンジオールへ変換する反応（図２２のステップＬ）は、酵素の存在下、実施することができる。上記反応は、具体的にはオキシドレダクターゼ（ＥＣ １．１．１）の群から選択される酵素によって触媒される。上記反応は、具体的には、
・アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１）、および
・アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２）
からなる群より選択される酵素の少なくとも１つによって触媒される。また、かかる酵素は、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属からなる群より選択される生物に由来する。

本発明に利用することのできる上記の酵素をコードする遺伝子は、例示された生物以外に由来するものであっても、または人工的に合成したものであってもよく、宿主微生物細胞内で実質的な酵素活性を発現できるものであればよい。例えば、本質的に所望の活性または基質特異性を有しない、または、目的反応の推進のために活性が十分でない酵素を、当該技術分野で知られている方法によって、例えば合理的設計または分子進化によって改変し、用いてもよい。

好ましい態様において、本発明にかかる製造方法は、前記目的化合物を単離および／または精製することをさらに含む。

好ましい別の態様において、本発明にかかる製造方法は、先述の組換え微生物を培養し、培養液中に所望の化合物を蓄積させ、単離精製することを含む。

本発明の一態様として、前述の酵素を、微生物体内から、酵素活性を消失しない条件で精製して、水溶液中での反応に供することが可能である。酵素液の調製方法は、本発明にかかる酵素を発現する宿主微生物に対し、例えば、ソニケ－ション破砕、もしくはビ－ズミル破砕、もしくはリゾチームを用いて溶菌を行い、その遠心上清を用いることができる。酵素反応条件については、目的物が生成される条件であればよく、当業者が通常行う方法で、反応液の組成、ｐＨ、反応温度、反応時間等を調整し、設定することができる。例えば、βリジンからのアミノ基脱離反応を進行させる、もしくは６－アミノヘキセン酸へのアミノ基付加反応を進行させる条件については、反応液のｐＨとしてはｐＨ ７－９の緩衝液があげられ、より好適な条件としてｐＨ８～９のＨＥＰＥＳ－ＫＯＨバッファーがあげられる。アミノ基付加反応においては、基質と同モル以上の塩化アンモニウムを含むことが好ましい。反応温度は、通常２０～６０℃であり、より好適な温度として３０～３７℃である。反応時間は、目的物が生成されうる時間であればよく、例えば１５分から４８時間である。

本発明にかかる遺伝子の取得は、一般的な遺伝子工学的手法によって可能である。すなわち、ゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより増幅した遺伝子産物が利用できる。また、有機合成的に調製したポリヌクレオチドも利用可能である。また、宿主微生物細胞内で実質的な酵素活性を発現できるものであれば、同一のアミノ酸に最終的に翻訳されることになる代替コドンを利用してよい。その典型例は、宿主のコドン使用頻度を考慮した遺伝子配列に置き換える手法である。すなわち、遺伝子コードは縮重しているので、ある特定のアミノ酸をコードするのに複数のコドンを使用でき、そのためアミノ酸配列は任意の１セットの類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドでコードされ得る。なお、ほとんどの生物は特定のコドン（最適コドン）のサブセットを優先的に用いることが知られているので（Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ．１０５、ｐｐ．６１－７２、１９９１等）、宿主微生物に応じて「コドン最適化」を行うことは本発明においても有用であり得る。

本発明にかかる遺伝子組換え微生物は、酵素活性を発現できることを条件に、上記酵素遺伝子の塩基配列と、例えば８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み得る。あるいは、上記酵素のアミノ酸配列と、例えば８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。

なお、本明細書において、参照アミノ酸配列に対する比較アミノ酸配列の「配列同一性」の割合（％）は、これら２つの配列間の同一性が最大となるように配列を整列させ、必要であれば２つの配列の一方または双方にギャップが導入されたときの、参照配列中のアミノ酸残基と同一である、比較配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。このとき、保存的置換は配列同一性の一部として考慮しない。配列同一性は、公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することによって決定することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）等のアライメントサーチツールを用いて決定することができる。当業者は、アラインメントにおいて、比較配列の最大のアラインメントを得るために適切なパラメーターを決定することができる。ヌクレオチド配列の「配列同一性」についても、同様の方法によって決定することができる。

本発明の一態様として、前述の反応のいずれかを触媒する１種類または複数種類の酵素を生成する微生物と、その微生物用の炭素源との使用を含む、全細胞生体内変換も利用される。具体的には酵素を含む宿主細胞を発酵性炭素源と接触させることを含み、その炭素源が、本明細に記載の化合物もしくはその中間体へと変換されることを含む。

本発明において、上記のＣ６化合物生合成酵素遺伝子が「発現カセット」として宿主微生物細胞内に導入されてもよい。「発現カセット」として宿主微生物細胞内に導入されることで、より安定的で高レベルの酵素活性を得ることができる。本明細書において、「発現カセット」とは、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子に機能的に結合された転写および翻訳をレギュレートする核酸配列を含むヌクレオチドを意味する。典型的に、本発明の発現カセットは、コード配列から５’上流にプロモーター配列、３’下流にターミネーター配列、場合により更なる通常の調節エレメントを機能的に結合された状態で含み、そのような場合に、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子が宿主微生物に導入される。

本発明において発現カセットは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド、または線状もしくは環状のＤＮＡ等から成るベクターに組み入れて、宿主微生物中に挿入される。本発明ではプラスミドおよびファージが好ましい。これらのベクターは、宿主微生物中で自律複製されるものでもよいし、また染色体に挿入され複製されてもよい。好適なプラスミドは、例えば、大腸菌ではｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９８、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３－３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ－ＩＩＩ１１３－Ｂ１、λｇｔ１１またはｐＢｄＣＩなどが挙げられる。バチルス属などの桿菌ではｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４またはｐＢＤ２１４などが挙げられる。これらの他にも使用可能なプラスミド等は、”Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ＤＮＡ ｎａｌｙｓｉｓ ６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ”、Ｗｉｌｅｙ－Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ２０１６に記載されている。ベクターへの発現カセットの導入は、適当な制限酵素による切り出し、クローニング、及びライゲーションを含む慣用の方法によって可能である。各々の発現カセットは、１つのベクター上に配置されてもよく、２つまたはそれ以上のベクターに配置されてもよい。

本発明の組換えベクターは、例えば、遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列の上流にプロモーター（制御領域）を、また下流にターミネーターをそれぞれ作動可能に連結し、場合によっては、遺伝子マーカー及び／又は他の制御配列を作動可能に連結することにより作製することが可能である。

プロモーターとは、構成発現型プロモーターであるか誘導発現型プロモーターであるかに拘わらず、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列と定義される。強いプロモーターとはｍＲＮＡ合成を高頻度で開始させるプロモーターであり、本発明においても好適に使用される。大腸菌ではｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃまたはｔｒｃ系、λファージの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコ－トタンパク質の制御領域、解糖系酵素（例えば、３－ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素）、グルタミン酸デカルボキシラーゼＡ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼに対するプロモーター等が利用可能である。ターミネーターとしては、ｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーター、ｌａｃターミネーターなどが利用可能である。プロモーターおよびターミネーター配列のほかに、他の調節エレメントの例として挙げられ得るのは、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などである。好適な調節配列については、例えば、”Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５”、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９９０）に記載されている。

本発明において、微生物は、代謝的改変を受けていてもよい。代謝的改変とは、天然に存在する状態から変化した生化学的反応を指す。反応に関与する酵素をコードする遺伝子を、欠損、変異、複数導入、外来遺伝子に置換することが含まれる。そのような例として、リジンの生産能を増強する変異型酵素の導入が挙げられる。これは、目的物の生産量向上のために導入される代謝改変である。たとえばＯｈｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ． Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｅｍｐｏｙｉｎｇ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ｇｅｎｏｍｅ ｉｎｒｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ａ ｎｅｗ Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００２， ５８， ２１７－２２３で記載された、遺伝子変異が利用可能である

本発明にかかる組換え微生物は、宿主微生物において、適宜、任意の遺伝子が破壊されたものであってもよい。標的遺伝子の破壊は、当該分野で公知の方法により行われる。

また、本発明に利用できる上記の酵素のアミノ酸配列、または酵素をコードする遺伝子の塩基配列には、前記宿主微生物細胞で実質的な酵素活性を発現できるものであれば、自然界で発生し得るすべての変異や、人工的に導入された変異及び修飾を有していてよく、例えば、欠失、置換、挿入、付加といった変異が含有され得る。例えば、上記の酵素のアミノ酸配列に対して１又は複数個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～７個、さらにより好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含んでいてよい。

さらに、本発明で利用できる上記の酵素をコードする遺伝子の塩基配列には、前記宿主微生物細胞で実質的な酵素活性を発現できるものであれば、相補的な塩基配列を有するＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡも利用可能である。「緊縮条件」とは、例えば、「１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６８℃」程度の条件である。

本発明のさらなる側面は、先述の組換え微生物を培養する培養工程を含む、目的化合物の製造方法に関する。培養工程では、組換え微生物を、炭素源および窒素源を含有する培地で培養することによって、菌体を含む培養物が得られる。本発明の遺伝子組換え微生物は、Ｃ６化合物生産、及び微生物の生育および／または維持に適した条件下で培養され、好適な培地組成、培養時間、培養条件は当業者により容易に設定できる。

本発明にかかる組換え微生物のための好適な培地組成、培養条件、培養時間は、当業者が通常行う方法により適宜選択できる。培養温度は、通常２０－４０℃であり、より好適な条件は３０～３７℃である。反応時間としては、目的物が生成されうる時間であればよく、例えば２４時間から７日である。

培地は、１つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン、及び場合により微量元素ないしビタミン等の微量成分を含む天然、半合成、合成培地であってよい。使用する培地は、培養すべき形質転換体の栄養要求を適切に満たさなければならない。宿主微生物が好気性の場合、発酵中の適切な酸素濃度を確保するために振盪を行う必要がある。それらの培養条件は、当業者にとって容易に設定可能である。

炭素源としては、Ｄ－グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、オリゴ糖、多糖、でんぷん、セルロース、米ぬか、廃糖蜜、油脂（例えば大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油、ヤシ油など）、脂肪酸（例えばパルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、リノレン酸など）、アルコール（例えばグリセロール、エタノールなど）、有機酸（例えば酢酸、乳酸、コハク酸など）、トウモロコシ分解液、セルロース分解液が挙げられる。好ましくは、Ｄ－グルコース、スクロースまたはグリセロールである。これらの炭素源は、個別にあるいは混合物として使用することができる。

バイオマス由来の原料を用いて製造されたＣ６化合物は、ＩＳＯ１６６２０－２またはＡＳＴＭ Ｄ６８６６に規定されるＣａｒｂｏｎ－１４（放射性炭素）分析に基づくバイオベース炭素含有率の測定により、例えば石油、天然ガス、石炭などを由来とする合成原料と明確に区別することができる。

窒素源としては、含窒素有機化合物（例えば、ペプトン、カザミノ酸、トリプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、コーンスティープリカー、大豆粉、アミノ酸および尿素など）、または無機化合物（例えば、アンモニア水溶液、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウムなど）が挙げられる。これらの窒素源は、個別にあるいは混合物として使用することが出来る。

また、培地は、形質転換体が有用な付加的形質を発現する場合、例えば抗生物質への耐性マーカーを有する場合、対応する抗生物質を含んでいてよい。抗生物質を添加することでプラスミドが安定に保持される。抗生物質としては、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、エリスロマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。

培養は、バッチ式であっても連続式であってもよい。また、いずれの場合にも、培養の適切な時点で追加の前記炭素源等を補給する形式であってもよい。更に、培養は、好適な温度、酸素濃度、ｐＨ等の条件を制御しながら培養されてもよい。一般的な微生物宿主細胞に由来する形質転換体の好適な培養温度は、通常１５℃～５５℃、好ましくは２５℃～４０℃の範囲である。宿主微生物が好気性の場合、発酵中の適切な酸素濃度を確保するために振盪（フラスコ培養等）、攪拌／通気（ジャー・ファーメンター培養等）を行ってもよい。それらの培養条件は、当業者にとって容易に設定可能である。

培養工程において、組換え微生物の培養物および／または培養物の抽出物を得ることを含んでもよい。

本発明にかかる化合物の製造方法は、前記培養物および／または前記培養物の抽出物を、基質化合物と混合して混合液を得る混合工程をさらに含んでもよい。基質化合物は、酵素および目的化合物に応じて適宜選択されてよい。

本発明にかかる化合物の製造方法は、前記培養物および／または前記培養物の抽出物を、基質化合物と混合して混合液を得る混合工程をさらに含んでもよい。基質化合物は、酵素および目的化合物に応じて適宜選択されてよい。

本発明にかかる化合物の製造方法は、目的化合物であるＣ６化合物を分離および／または精製する工程を含んでよい。当該分離および／または精製する工程では、任意の手法、例えば、遠心分離、ろ過、膜分離、晶析、抽出、蒸留、吸着、相分離、イオン交換および各種のクロマトグラフィーなどが挙げられるが、これらに限定されない。分離および／または精製工程では、一種類の方法を選択しても良く、また複数の方法を組み合わせても良い。

以上説明したとおり、本発明によれば、良好なリジンアンモニアリアーゼ活性を有する酵素、および、当該酵素を用いた、脂肪族モノマーの製造方法を提供することができる。また、宿主微生物に前記リジンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を導入することにより、リジンアンモニアリアーゼ活性の良好な組換え微生物を得ることができる。更に、本発明にかかる組換えポリペプチド、組換え微生物または製造方法によれば、リジンを経由して、目的化合物である脂肪族化合物（例えばＣ６化合物）を効率的に製造することができる。また、所望の目的化合物に応じ、追加の酵素を用いて変換を行うことにより、種々の目的化合物を得ることができる。さらに、本発明にかかる組換え微生物および／または製造方法は、良好な目的化合物の生産能を有するので、工業的規模で目的化合物を生産できることが期待される。本発明にかかる組換え微生物および製造方法によって製造される脂肪族化合物は、特に、ポリマー製造のためのモノマー原料として使用することができる。

以上、本発明を実施するための形態を例示したが、上記実施形態はあくまでも例として示されるものであり、発明の範囲を限定することを意図するものではない。上記実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置換、変更を行うことができる。以下、更なる説明の目的として実施例を記載するが、本発明は当該実施例に限定されるものではない。

本実施例に示す全てのＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）を用いて実施した。大腸菌の形質転換は、塩化カルシウム法（羊土社 遺伝子工学実験ノート 上 田村隆明著、参照）を用いた。プラスミドの構築においては、ＬＢ培地を用い、必要な抗生物質を添加して使用した。本実施例で用いた試薬は、特別な記載のない限り、富士フィルム和光純薬社製を使用した。ＰＣＲの際は特別な記載のない限り、タカラバイオ社製ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘを用いた。サーマルサイクラーは、すべてｂｉｏｒａｄ社製Ｃ１０００Ｔｏｕｃｈササーマルサイクラーを用いた。
各実施例で用いた培地の組成は以下のとおりである。

（ＬＢ培地）
組成は次のとおりである：２０ｇ／Ｌ ＬＢ培地、レノックス（ディフコ社製）。１２０℃、２０分間蒸気滅菌を行った。必要に応じて、終濃度１００ｍｇ／Ｌ アンピシリン、１．５％ Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ（ディフコ社製）を加えた。

（ＳＯＣ培地）
作成方法は次のとおりである。まず、２０ｇ／Ｌ ｂａｃｔｏ ｔｏｒｙｐｔｏｎｅ（ディフコ社製）， ５ｇ／Ｌ ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（ディフコ社製）， １Ｍ ＮａＣｌ， １Ｍ ＫＣｌの溶液を１Ｌ作成し、１２０℃、２０分間蒸気滅菌を行って、室温まで冷却した。次に、１Ｍ ＭｇＳＯ４， １Ｍ ＭｇＣｌ２， ２Ｍ Ｇｌｕｃｏｓｅ各１０ｍｌを、フィルトレーションにより殺菌し、前述の混合液へ添加した。

［１］プラスミドの構築
遺伝子発現用ベクターを以下のように作製した。まず、プラスミドｐＮＦＰ－Ａ５１（ＦＥＲＭ Ｐ－２２１８２として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに２０１１年１０月２５日に寄託した。国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ－１１５１５）のマルチクローニングサイトの、ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＶサイトを利用してプロモーター配列を、ＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩサイトを使用してターミネーター配列を挿入し、ｐＳＫ０００を構築した。このときプロモーター配列末端にＥｃｏＲＶ制限酵素認識配列の上流３塩基対を付加しておくことで、プロモーターおよびターミネーター配列間にＥｃｏＲＶ制限酵素サイトが残存するようにし、後述の酵素遺伝子クローニング時に利用した。プロモーター配列およびターミネーター配列を表１に示す。ｐＳＫ０００プラスミド構造を図２１に示す。制限酵素は、タカラ社製を用いた。

（酵素発現プラスミドの作成）
表２および表３に記載の酵素をコードする遺伝子、ならびに、表４に記載のクロストリジウムｋａｍＡ遺伝子は、ユーロフィンジェノミクス株式会社の人工遺伝子合成サービスを利用して合成した。

合成遺伝子配列を鋳型として、各酵素をＰＣＲ増幅した。配列の増幅のために使用したプライマー配列を表５に示す。

反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（１０ｓｅｃ），３０ｃｙｃｌｅとした。

得られたＤＮＡ断片を、Ｍｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｅｔ（Ｔａｋａｒａ社製）にてリン酸化し、クローニングするＤＮＡ断片として用いた。別途、ｐＳＫ０００プラスミドをＥｃｏＲＶ制限酵素で処理し、次いでアルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ， タカラ社製）で処理した。前述のＤＮＡ断片とベクター断片を、Ｍｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｅｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてライゲーションした（１６℃、一晩）。ライゲーション反応液１ｕＬで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。出現コロニーからプラスミドを抽出して配列解析を行い、酵素タンパク質が発現されるように遺伝子が挿入されたプラスミドを作成した。

［２］リジンアミノ基脱離酵素活性の評価
酵素反応基質のうち、６－アミノ－２－ヘキセン酸は、特表２０１０－５１５７６７記載の方法に従い、１－（ＴＥＲＴ－ＢＵＴＯＸＹＣＡＲＢＯＮＹＬ）－２－ＰＹＲＲＯＬＩＤＩＮＯＮＥを原料として合成した。βリジンは、ＦＣＨ社製（カタログＮｏ．ＦＣＨ１４７０４２８２）を購入した。

表２および３に示す遺伝子を含むプラスミドのうちいずれか、または、空ベクターにより、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、寒天培地にて３７℃、１日間培養を行った。出現コロニーを１ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃にて３時間振とう培養した。そのうち１００μＬを、１０ｍＬの新しいＬＢ培地に植菌し、３７℃で振とう培養した。ＯＤ６００値＝０．４～０．６となったところで、ＩＰＴＧ（終濃度０．５ｍＭ）を添加して、さらに一晩振とう培養した（Ｍ・ＢＲ－１２１２ＦＰプレートシェーカー、タイテック社製）。

１００ｕＬを分取して１０倍希釈し、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｋａｎｉｔ マイクロプレートリーダーを用いてＯＤ６００値を測定した。残りの培養液を２ｍＬチューブに移し、エッペンドルフ社製Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５４２４Ｒ卓上微量遠心機にて、８，０００ｒｐｍ ３分遠心した。上清を捨て、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝８．０） にて、ＯＤ６００＝３０となるようペレットを懸濁したのち、超音波破砕機で菌体を破砕した。超音波破砕は、氷上にて、メモリ３の出力で、３０秒発振、３０秒休止、３０秒発振のプロトコルを用いた（トミー社製ＵＲー２１Ｐ）。破砕液を１３，２００ ｒｐｍ で１５分遠心して、その上清を酵素液として使用した。酵素反応液の組成は次のとおりである。
（１）終濃度０．５Ｍ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨバッファーｐＨ＝８．０， ９５ｍＭ ６－アミノ－２－ヘキセン酸， ０．４Ｍ ＮＨ_４Ｃｌ， １ｍＭ ＭｇＣｌ_２。
（２）終濃度０．５Ｍ ＨＥＰＥＳーＫＯＨバッファーｐＨ＝８．０， ０．１５Ｍ βリジン， １ｍＭ ＭｇＣｌ_２。

（１）および（２）の組成に、酵素液５０μＬを加え、全量５００μＬとした。サンプルは、３７℃、１０００ｒｐｍで４時間反応させた（Ｍ・ＢＲ－１２１２ＦＰシェーカー、タイテック社製）。反応液２００μＬをサンプリングして、１００ｍＭギ酸で４倍希釈し、フィルトレーションした。これを表６－１および表６－２または表７－１および表７－２に示す分析条件で分析した。

分析結果を表８および表９に示す。

酵素遺伝子を持たない空ベクターで形質転換した菌体の破砕上清を添加したサンプルに比べ、酵素を添加したサンプルで、βリジンピークの上昇が認められた。

［３］リジンアミノムターゼの酵素活性評価
ｋａｍＡ発現プラスミドもしくは空ベクターにより、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、寒天培地にて３７℃、１日間培養を行った。出現コロニーを１ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃にて３時間振とう培養した。そのうち３０μＬを、３ｍＬのＳＯＣ培地（Ｌ－α－Ｌｙｓ 終濃度２０ｍＭ、ＩＰＴＧ終濃度２０ｕＭを含む）に植菌し、３７℃で一晩振とう培養した（Ｍ・ＢＲ－４０ＦＬシェーカー、タイテック社製）。培養液２ｍＬを２ｍｌチューブに移し、エッペンドルフ社製Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５４２４Ｒ卓上微量遠心機にて、８，０００ｒｐｍ ３分遠心した。上清をサンプリングして、１００ｍＭギ酸で４倍希釈し、フィルトレーションした。これを表４に示す分析方法で分析した。ｋａｍＡ遺伝子を持たない空ベクターで形質転換した菌体の培養上清と比較して、ｋａｍＡ遺伝子を持つ菌体の培養上清で、βリジンを示すピークの増加が観察された。

本発明によれば、リジンを経由した脂肪族モノマーの効率的な製造プロセスを提供することができ、工業的規模での生産への応用が期待される。

Claims (29)

1. （ａ）βリジンのアミノ基を脱離して６－アミノ－２－ヘキセン酸へと変換するアミノ基脱離活性を有し、
   （ｂ）以下：
   （ｉ）配列番号１、３、５、１３、１５または１７に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
   （ｉｉ）配列番号１、３、５、１３、１５または１７に示すアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
   （ｉｉｉ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡによってコードされる、
   （ｉｖ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
   （ｖ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる、および
   （ｖｉ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる
   のいずれかである、組換えポリペプチド。
2. （ａ）βリジンのアミノ基を脱離して６－アミノ－２－ヘキセン酸へと変換するアミノ基脱離活性を有し、
   （ｂ）以下：
   （ｘｉ）配列番号１、３、５、１３、１５または１７に示すアミノ酸配列からなるか、または、
   （ｘｉｉｉ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡによってコードされる、ポリペプチド。
3. Ｃｌｏａｃｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｈｅｌａｔｉｖｏｒａｎｓ属、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ａｑｕａｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属およびＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属からなる群より選択される生物に由来する、請求項１または２に記載のポリペプチド。
4. Ｃｌｏａｃｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｒｃｏｒｕｍ、Ｃｈｅｌａｔｉｖｏｒａｎｓ ｓｐ．Ｊ３２、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｃ１－５０、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｂａｃｕｌａｔｕｍ、Ａｑｕａｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｓｐ． ＬＣ１０３およびＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｎｏｌｉｔｉｃｕｓからなる群より選択される生物に由来する、請求項１～３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
5. （ａ’）６－アミノ－２－ヘキセン酸にアミノ基を付加してβリジンへと変換する活性をさらに有する、請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
6. 請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
7. 請求項６に記載のＤＮＡを含む、組換えプラスミド。
8. 請求項６に記載のＤＮＡが導入された、組換え微生物。
9. 請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチド、または、請求項８に記載の組換え微生物の培養物および／または当該培養物の抽出物の存在下、βリジンを６－アミノ－２－ヘキセン酸に変換することを含む、目的化合物の製造方法であって、
   前記目的化合物が、６－アミノ－２－ヘキセン酸、６－アミノカプロン酸、６－アミノヘキサナール、１，６－ジアミノヘキサン、６－アミノヘキセナール、１，６－ジアミノ－２－ヘキセン、５－ホルミルペンタン酸、アジポアルデヒド、６－アミノヘキサノール、６－ヒドロキシヘキサン酸、アジピン酸および１，６－ヘキサンジオ－ルからなる群より選択される、製造方法。
10. αリジンの２位アミノ基を３位へ転移させてβリジンを生成する反応を触媒する活性を有するポリペプチドの存在下、αリジンをβリジンに変換することを更に含む、請求項９に記載の製造方法。
11. 前記αリジンの２位アミノ基を３位へ転移させてβリジンを生成する反応を触媒する活性を有するポリペプチドが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属からなる群より選択される生物に由来する、請求項１０に記載の製造方法。
12. 前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換することを更に含み、
    前記目的化合物が、６－アミノカプロン酸である、請求項９～１１のいずれか１項に記載の製造方法。
13. 前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
    前記６－アミノカプロン酸を５－ホルミルペンタン酸に変換すること、および
    前記５－ホルミルペンタン酸をアジピン酸に変換すること
    をさらに含み、
    前記目的化合物が、アジピン酸である、請求項９～１１のいずれか１項に記載の製造方法。
14. 前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
    前記６－アミノカプロン酸を５－ホルミルペンタン酸に変換すること、および
    前記５－ホルミルペンタン酸を６－ヒドロキシヘキサン酸に変換すること
    をさらに含み、
    前記目的化合物が、６－ヒドロキシヘキサン酸である、請求項９～１１のいずれか１項に記載の製造方法。
15. （１）前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
    前記６－アミノカプロン酸を６－アミノヘキサナールに変換すること、および
    前記６－アミノヘキサナールを１，６－ジアミノヘキサンに変換すること
    をさらに含むか、又は、
    （２）前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノ－２－ヘキセナールに変換すること、
    前記６－アミノ－２－ヘキセナールを１，６－ジアミノ－２－ヘキセンに変換すること、および
    前記１，６－ジアミノ－２－ヘキセンを１，６－ジアミノヘキサンに変換すること
    をさらに含み、
    前記目的化合物が、１，６－ジアミノヘキサンである、請求項９～１１のいずれか１項に記載の製造方法。
16. 前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
    前記６－アミノカプロン酸を６－アミノヘキサナールに変換すること、および
    前記６－アミノヘキサナールを６－アミノヘキサノ－ルに変換すること
    をさらに含み、
    前記目的化合物が、６－アミノヘキサノールである、請求項９～１１のいずれか１項に記載の製造方法。
17. 下記（３）～（６）：
    （３）前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
    前記６－アミノカプロン酸を５－ホルミルペンタン酸に変換すること、
    前記５－ホルミルペンタン酸をアジポアルデヒドに変換すること、
    前記アジポアルデヒドを６－ヒドロキシヘキサナールに変換すること、及び
    前記６－ヒドロキシヘキサナールを１，６－ヘキサンジオールに変換すること、
    （４）前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
    前記６－アミノカプロン酸を６－アミノヘキサナ－ルに変換すること、
    前記６－アミノヘキサナ－ルをアジポアルデヒドに変換すること、
    前記アジポアルデヒドを６－ヒドロキシヘキサナールに変換すること、及び
    前記６－ヒドロキシヘキサナールを１，６－ヘキサンジオールに変換すること
    （５）前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
    前記６－アミノカプロン酸を５－ホルミルペンタン酸に変換すること、
    前記５－ホルミルペンタン酸を６－ヒドロキシヘキサン酸に変換すること、
    前記６－ヒドロキシヘキサン酸を６－ヒドロキシヘキサナールに変換すること、及び
    前記６－ヒドロキシヘキサナールを１，６－ヘキサンジオールに変換すること、
    （６）前記６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換すること、
    前記６－アミノカプロン酸を６－アミノヘキサナールに変換すること、
    前記６－アミノヘキサナールを６－アミノヘキサノ－ルに変換すること、
    前記６－アミノヘキサノールを６－ヒドロキシヘキサナールに変換すること、及び
    前記６－ヒドロキシヘキサナールを１，６－ヘキサンジオールに変換すること
    のうちの１又は２をさらに含み、
    前記目的化合物が、１，６－ヘキサンジオールである、請求項９～１１のいずれか１項に記載の製造方法。
18. ６－アミノ－２－ヘキセン酸を６－アミノカプロン酸に変換することが、
    ・エノイル－ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．３．１．８、ＥＣ １．３．１．３８、およびＥＣ １．３．１．４４）、
    ・エノイル－［アシル－キャリアタンパク質］レダクターゼ（ＥＣ １．３．１．９、ＥＣ １．３．１．１０、およびＥＣ １．３．１．３９）、
    ・ブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．２）、
    ・アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．３）、および
    ・長鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．１３）
    からなる群より選択される酵素によって触媒される、請求項９～１７のいずれか１項に記載の製造方法。
19. ・前記６－アミノカプロン酸から５－ホルミルペンタン酸に変換すること、
    ・前記６－アミノヘキサナールから１，６－ジアミノヘキサンに変換すること、
    ・前記６－アミノヘキサナールからアジポアルデヒドに変換すること、および
    ・前記６－アミノヘキサナールから６－ヒドロキシヘキサノールに変換することが、
    ・４－アミノブタン酸－２－オキソグルタル酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．１９）、
    ・プトレシン－２－オキソグルタル酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．８２）、
    ・４－アミノブタン酸－ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．９６）、および
    ・プトレシン－ピルビン酸トランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．１１３）
    からなる群より選択される酵素によって触媒される、請求項９～１７のいずれか１項に記載の製造方法。
20. 前記酵素が、Ｖｉｂｒｉｏ属およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属からなる群より選択される生物に由来する、請求項１９に記載の製造方法。
21. ・前記６－アミノカプロン酸から６－アミノヘキサナールに変換すること、
    ・前記５－ホルミルペンタン酸からアジポアルデヒドに変換すること、
    ・前記６－アミノ－２－ヘキセン酸から６－アミノ２－ヘキセナールに変換すること、
    ・前記６－アミノヘキサナールから６－ヒドロキシヘキサナールに変換すること、および、
    ・前記６－ヒドロキシヘキサン酸から６－ヒドロキシヘキサナールに変換することが、カルボキシレートレダクターゼ（ＥＣ １．２．１．３０）に属する酵素によって触媒される、請求項９～１７のいずれか１項に記載の製造方法。
22. 前記カルボキシレートレダクターゼが、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｕ属およびＮｏｃａｒｄｉａ属からなる群より選択される生物に由来する、請求項２１に記載の製造方法。
23. 前記５－ホルミルペンタン酸からアジピン酸に変換することが、アルデヒドオキシダーゼ（ＥＣ １．２．３．１）に属する酵素によって触媒される、請求項９～１７のいずれか１項に記載の製造方法。
24. ・前記５－ホルミルペンタン酸から６－ヒドロキシヘキサン酸に変換すること、
    ・前記６－アミノヘキサナールから６－アミノヘキサノールに変換すること、
    ・前記アジポアルデヒドから６－ヒドロキシヘキサナールに変換すること、および
    ・前記６－ヒドロキシヘキサナールから１，６－ヘキサンジオールに変換することが、
    ・アルコ－ルデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１）、および
    ・アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２）
    からなる群より選択される酵素によって触媒される、請求項９～１７のいずれか１項に記載の製造方法。
25. 前記アルコールデヒドロゲナーゼが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属およびＢａｃｉｌｌｕｓ属からなる群より選択される生物に由来する、請求項２４に記載の方法。
26. 前記目的化合物を単離および／または精製することをさらに含む、請求項９～２５のいずれか１項に記載の製造方法。
27. βリジンのアミノ基を脱離して６－アミノ－２－ヘキセン酸へと変換するアミノ基脱離活性を有するポリペプチドをコードする外来性遺伝子を含む組換え微生物であって、
    前記外来性遺伝子が、
    （ｉ）配列番号１、３、５、１３、１５または１７に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
    （ｉｉ）配列番号１、３、５、１３、１５または１７に示すアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
    （ｉｉｉ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
    （ｉｖ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
    （ｖ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、または
    （ｖｉ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
    である、組換え微生物。
28. 前記外来性遺伝子が、
    （ｘｉ）配列番号１、３、５、１３、１５または１７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、または、
    （ｘｉｉｉ）配列番号２、４、６、１４、１６または１８に示すポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ
    である、請求項２７に記載の組換え微生物。
29. ６－アミノ－２－ヘキセン酸、６－アミノカプロン酸、６－アミノヘキサナール、１，６－ジアミノヘキサン、６－アミノヘキセナール、１，６－ジアミノ－２－ヘキセン、５－ホルミルペンタン酸、アジポアルデヒド、６－アミノヘキサノール、６－ヒドロキシヘキサン酸、アジピン酸および１，６－ヘキサンジオ－ルからなる群より選択される少なくとも１つを産生する経路を有する、請求項２７または２８に記載の組換え微生物。

Images