TWI772159B - 樹狀兩親分子的合成方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種利用固相連接子方式來用於製備具有樹狀骨架的兩親分子的方法。

Description

樹狀兩親分子的合成方法

本發明係關於一種利用固相連接子方式來用於製備具有樹狀骨架的兩親分子的方法。

具有具備親水性和疏水性特徵之樹狀骨架的兩親分子(簡稱AD)提供一次類之分子。它們的自組裝性質可作為各種化合物(如藥物、顯影劑及基因)的優良載體。此外，亦有助於人工疫苗和防附著材料。在傳統的發散液相方法中，分子構建通常需要多個反應步驟和大量的反應。同時，透過收斂方式來便利製備化合物，於收斂方式中個別設計疏水性和親水性組分並在最終步驟進行偶合。然而，該疏水性和親水性組分不相容的特性限制了可用的溶劑。此外，兩個大分子之間偶合反應緩慢進一步阻礙其合成效率，且通常會消耗許多化合物。另外，這兩種液相中的合成方式都有不完全反應和製備週期更延長的情形，主要是因為複雜的純化。具有結構相似性的副產物常出現在產物混合物中，並導致分離所需產物的困難。同時，兩親性特性也導致在考慮溶解性的困難，其限制了製備和純化中可用的溶劑。此事實進一步降低AD的液相製備的可行性。此外，該最終化合物的純度不適用於臨床應用。而到目前為止，很少有應用於製備AD的固相策略。

本發明提供一種用於合成具有樹狀骨架的兩親分子的固相方式，其中外圍基群(peripheral groups)可以輕易地被廣泛的官能基進行修飾。值得注意的是，該疏水基團是在裂解步驟中引入的。此一事實提高了製備效率和產物的純度。在裂解步驟中，雞尾酒混合溶液對於防止水解副產物並透過改良疏水鏈段的溶解度提供所需化合物是必要的。此外，已確定應用微波以提高產率和縮短反應時間的必要性。簡而言之，本發明提供一種又方便又經濟的方式來製備用於多目的應用之廣效性結合物。

本文使用的術語「一個(a)」或「一個(an)」描述了本發明的要素和成分。該術語僅是為了便於本發明的描述和基本概念。該描述應被理解為包括一個或至少一個，且除非上下文另有說明，單數的術語包括複數形和複數的術語，包括單數形。當在請求項中使用該字詞「包含」時，該術語「一個(a)」或「一個(an)」可以表示一個或多於一個。本文所使用的術語「表面」描述樹狀聚合物(dendrimers)或樹狀分子(dendrons)的末端基群(terminal groups)。

本文所用的術語「兩親分子」描述一同時包含疏水性和親水性殘基的化合物。它們可透過以疏水性殘基攻擊親水性殘基而製備；或相反地，以親水性殘基攻擊疏水性殘基。

本發明提供一種用於合成兩親性樹狀聚合物的方法，包含：(a)將一式(IIb)化合物與至少一具有二個保護基的雙胺基羧基物(diamino carboxylate)反應以取代該式(IIb)化合物上的Y以生成分支骨架並且用官能基團(functional moieties)修飾該分支骨架的末端基群(terminal groups) 以得到一式(IIIb)化合物，

其中M為一固相承載材料(solid support material)：

X為一胺基羧基物(amino carboxylate)；

Y為一保護該X之N端的保護基；

K為一具有支鏈二胺的基團(moiety)；

B及B’為

，其中n為0至5，且Z為一官能基團，其包含H、胺基酸、胜肽、酸、醣、靶向配體、顯影分子、治療劑或擬肽分子；

當B不同於B’時，B中至少一Z、K或n與B’不同；

(b)將該式(IIIb)化合物於一極性溶劑中與亞硝酸鹽反應，以得到一具有苯并三唑(benzotriazole)結構的式(IVb)化合物，

；以及

(c)將該式(IVb)化合物於一含有一親水性溶劑與一疏水性溶劑的混合溶液中與一具有疏水殘基的胺反應，以得到一式(Vb)化合物，

其中R’包含具有疏水性殘基的胺基基群(amino groups)；或是

將至少二個該式(IVb)化合物於一含有一親水性溶劑與一疏水性溶劑的混 合溶液中與對應之具有疏水性殘基的二或多胺反應，以得到一式(Vb’)化合物，

其中R”包含具有疏水性殘基的支鏈二或多胺之胺基基群，且n>1。

在一實施例中，該上述方法在步驟(a)之前進一步包含步驟(pre-a3)，該步驟(pre-a3)包含將一式(IIa)化合物與一具有X-Y的化合物反應，以得到該式(IIb)化合物，

在另一實施例中，該上述方法在步驟(a)之前進一步包含步驟(pre-a2)，該步驟(pre-a2)包含將一式(Ib)化合物固定於一固相承載材料，以得到該式(IIb)化合物，

在一較佳實施例中，該上述方法在步驟(pre-a2)之前進一步包含步驟(pre-a1)，該步驟(pre-a1)包含將一式(Ia)化合物與一具有該X-Y之化合物反應，以得到該式(Ib)化合物，

在一實施例中，該至少一雙胺基羧基物不限於脂肪族雙胺基羧基物(aliphatic diamino carboxylate)、環狀雙胺基羧基物(cyclic diamino carboxylate)、芳香族雙胺基羧基物(aromatic diamino carboxylate)或雜環雙胺基羧基物(heterocyclic diamino carboxylate)。在一較佳實施例中，該脂肪族雙胺基羧基物包括離胺酸、鳥胺酸、高離胺酸(homolysine)、2,7-二胺基庚酸(2,7-diaminoheptanoic acid)、5-胺基-2-胺基-戊酸(5-amino-2-amino-pentanoic acid)、3-(雙(3-胺丙基)胺基)丙酸(3-(bis(3-aminopropyl)amino)propanoic acid)或聚乙二醇。

在另一實施例中，該至少一雙胺基羧基物為胺基酸及/或聚乙二醇。在一較佳實施例中，該至少一雙胺基羧基物包含Fmoc-Lys(Fmoc)-OH、Boc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Lys(Dabcy)-OH、Fmoc-Lys(Caproyl)-OH、Fmoc-Lys(Z)-OH、Fmoc-Lys(Crotonyl)-OH、Fmoc-Lys(Mmt)-OH、Fmoc-Lys(Dansyl)-OH、Fmoc-Lys(ivDde)-OH、Fmoc-Lys(Teoc)-OH、Fmoc-Lys(Mtt)-OH或Fmoc-Lys(2-ClZ)-OH。

在另一實施例中，該固相承載材料包含可控孔徑的玻璃(controlled-pore glass)、磁珠、Rink醯胺樹脂(Rink amide resin)、Tentagel樹脂(Tentagel resin)、Wang樹脂(Wang resin)、Merrifield樹脂(Merrifield resin)、MBHA樹脂(MBHA resin)、PAM樹脂(PAM resin)、PAL樹脂(PAL resin)、Sieber醯胺樹脂(Sieber Amide resin)、三苯甲基樹脂(trityl resin)、氯三苯甲基樹脂(chlorotrityl resin)、聚乙二醇-聚苯乙烯樹脂(polyethylene glycol-polystyrene resin)、Weinreb樹脂(Weinreb resin)、肟樹脂(oxime resin)、 DHP樹脂(DHP resin)或safety-catch樹脂(safety-catch resin)。

如本文所使用，該X包含天然、非天然及罕見胺基酸。該術語「天然胺基酸」包含該天然存在的形式，如L型(除了甘胺酸以外)的甘胺酸(Gly)、丙胺酸(Ala)、纈胺酸(Val)、白胺酸(Leu)、異白胺酸(Ile)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、苯丙胺酸(Phe)、酪胺酸(Tyr)、色胺酸(Trp)、半胱胺酸(Cys)、甲硫胺酸(Met)、脯胺酸(Pro)、羥脯胺酸、天門冬胺酸(Asp)、天門冬醯胺(Asn)、麩醯胺酸(Gln)、麩胺酸(Glu)、組織胺酸(His)、精胺酸(Arg)及離胺酸(Lysine)。該術語「非天然胺基酸」包含上述界定的所有天然胺基酸的D型，且該術語「罕見胺基酸」包含瓜胺酸(Cit)、羥脯胺酸(Hyp)、正白胺酸(Nle)、3-硝基酪胺酸(3-nitrotyrosine)、硝基精胺酸(nitroarginine)、鳥胺酸(Orn)、萘基丙胺酸(Nal)、甲硫胺酸亞碸(methionine sulfoxide)或甲硫胺酸碸(methionine sulfone)。

在另一實施例中，該X包含：

，其中n為一1至10之整數；或

其中R為H、-CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)CH₂CH₃、-CH₂C₆H₅；-CH₂COOH、CH₂CH₂COOH、-CH₂OH、-CH₂CH(CH₃)OH或-CH₂C₆H₄OH之O-PG衍生物；-CH₂SH或-CH₂CH₂SCH₃之S-PG衍生物；-CH₂CH₂CONH₂、 -CH₂CONH₂、-CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂或-CH₂CH₂CH₂NHC(NH)NH₂之N-PG衍生物；或

或

之N-PG衍生物，

其中PG為一保護N、O或S之保護基。此外，該保護基(PG)可被事先移除以得到最終產物。

在一實施例中，該Y包含偶合的天然、非天然及罕見胺基酸之N端的保護基。在一較佳實施例中，該Y包含9-茀甲氧羰基(9-fluorenylmethoxycarbonyl，Fmoc)、第三丁氧羰基(tert-butoxycarbonyl，Boc)、胺甲酸苄酯(benzyl carbamates，Cbz)、苄基(Z)或烯丙氧羰基(alloxycarbonyl，Alloc)基群。

在另一實施例中，該K為衍生自具有相同或正交(orthogonal)保護基之雙胺基羧基物的基團。因此，該方法中的步驟(a)包含兩個反應如下：(1)B=B’：將該式(IIb)化合物與一胺上具有相同保護基的第一K偶合，之後移除胺上的該保護基，然後將第一K的胺基與具有相同保護基的第二K偶合。具體而言，此反應必須在上述步驟中使用具有相同保護基的K。重複脫保護及偶合步驟以在該式(IIb)化合物的該X上形成所需的骨架。之後以官能基團修飾分支骨架的表面以得到該式(IIIb)化合物；及(2)B≠B’：將該式(IIb)化合物與一胺上具有正交或相同保護基的第一K偶合，之後移除胺上的該保護基，然後將第一K的胺基與一具有正交或相同保護基的第二K偶合。因此，用於此反應中的該保護基可為 相同或不同。具體而言，此反應必須在上述步驟中使用至少一具有正交保護基的K。重複脫保護及偶合步驟以在該式(IIb)化合物的該X上形成所需的骨架。然後用官能基團修飾分支骨架的表面，以得到該式(IIIb)化合物。

在一實施例中，該B或B’為一Z基團，其衍生自包含胺基酸、胜肽(包括環狀和支鏈胜肽)、酸(包括烷基和芳族酸)、醣、螢光分子、顯影劑、靶向配體、治療劑或擬肽分子的化合物。

該靶向配體對於給定組織的病理細胞具有高親和力。它能夠辨認目標細胞上的特定抗原或受體。在另一實施例中，該靶向配體包含有機分子、碳水化合物、單株抗體、胜肽、蛋白質、維生素和適體。

在一實施例中，該B或B’之形式為該分支骨架，該分支骨架包含KZ₂、K(KZ₂)₂、K(K(KZ₂)₂)₂、K(K(K(KZ₂)₂)₂)₂或K(K(K(K(KZ₂)₂)₂)₂)₂。因此，該分支骨架形成樹狀聚合物或樹狀分子，且該官能基團Z係用於修飾該樹狀聚合物或樹狀分子的表面。該分支骨架係基於上述方法從逐步合成而獲得。

在另一實施例中，該步驟(c)中的兩個反應的詳細敘述係如下所示：(1)單胺的攻擊策略：攻擊該式(IVb)化合物上的該X，並以一具有疏水性殘基的胺取代其苯并三唑基團。因此，得到具有化學結構R’-XKBB’之該式(Vb)化合物；以及(2)二或多胺的攻擊策略：攻擊該X並以對應的至少一於具有疏水性殘基的二或多胺上的胺基取代至少二個式(IVb)化合物上的苯并三唑基團。因此，得到具有化學結構R”-(XKBB’)_n(n為一整數且>1)之該式(Vb’)化合物。

根據本發明，該R’為具有疏水性殘基的胺基基群。在一實 施例中，該疏水性殘基係包括於單脂族或/及雙脂族化合物、芳烴和環狀胜肽之中。在另一實施例中，R’之該疏水性殘基包含用於一宿主-客體(host-guest)相互作用的基團，其中該R’包含金剛烷(adamantyl)。在另一實施例中，R’之該疏水性殘基為一聚集體，其中該聚集體包含芘。在一實施例中，R’之該疏水性殘基為一金屬螯合劑，其中該金屬螯合劑包含多巴胺、吡唑、咪唑、吡啶、聯吡啶、尿素、硫脲或其他配體。

在另一實施例中，該R’包含：

其中n=0至20，且R₃為一胺基酸之側鏈。

在一實施例中，該R”包含一二胺基或多胺基基團於疏水性骨架上。在一較佳實施例中，該骨架的形式包含脂族骨架，環狀骨架，芳香族骨架或雜環骨架。在一更佳實施例中，該些骨架係衍生自包含樹狀聚合物、二胺基烷(diaminoalkanes)、二胺基環烷(diaminocycloalkane)、二胺基苯(diaminobenzene)或胺甲基哌啶(aminomethyl piperidine)的化合物。

在一實施例中，該亞硝酸鹽包括亞硝酸鈉、亞硝酸鉀、亞硝 酸乙酯、亞硝酸丁酯、亞硝酸第三丁酯、亞硝酸異丁酯、亞硝酸戊酯、亞硝酸異戊酯(isopentyl nitrite)、亞硝酸丁酯(iso-amyl nitrite)、亞硝酸二環己胺(dicyclohexylamine nitrite)或亞硝酸四丁銨(tetrabutylammonium nitrite)。

在一實施例中，一溶劑係用於該步驟(a)之該反應中，其中該溶劑包含二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基乙醯胺(DMAC)或N,N-二甲基甲醯胺(DMF)。

在另一實施例中，該步驟(b)中該極性溶劑包含DCM、DMAC、DMF、N-甲基吡咯啶酮(NMP)、二氯乙烷、三氯乙烷或水。

在另一實施例中，該步驟(c)中該疏水性溶劑包含一極性溶劑。在一較佳實施例中，該極性溶劑包含二甲基亞碸(DMSO)、N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、N,N-二甲基乙醯胺(DMAC)、N-甲基吡咯啶酮(NMP)或N-丁基吡咯啶酮(NBP)。在一更佳實施例中，該極性溶劑包含NMP或NBP。

在一實施例中，該步驟(c)中該疏水性溶劑包含一較少極性的溶劑，該較少極性的溶劑包括二氯甲烷(DCM)、二氯乙烷(DCE)、二氯苯(DCB)、1,1,2-三氯乙烷(TCE)、四氫呋喃(THF)、二氧六環(dioxane)或乙酸乙酯。

在另一實施例中，該混合溶液之反應溫度範圍為1至150℃。在一較佳實施例中，該混合溶液之反應溫度範圍為10至100℃。在一更佳實施例中，該混合溶液之反應溫度範圍為20至65℃。

在一實施例中，該親水性溶劑與該疏水性溶劑之體積比範圍為50：0至1：15。在一較佳實施例中，該親水性溶劑與該疏水性溶劑之體 積比範圍為25：0至1：10。在一更佳實施例中，該親水性溶劑與該疏水性溶劑之體積比範圍為10：0至1：5。

在另一實施例中，該混合溶液的反應是在一微波環境中。

在一實施例中，該微波環境的微波功率範圍為10至250W。在一較佳實施例中，該微波環境的微波功率範圍為50至200W。在一更佳實施例中，該微波環境的微波功率範圍為80至150W。

在另一實施例中，該微波環境的溫度範圍為1至150℃。在一較佳實施例中，該微波環境的溫度範圍為25至100℃。在一更佳實施例中，該微波環境的溫度範圍為40至75℃。

在一實施例中，該微波環境的反應時間範圍為5至40分鐘。在一較佳實施例中，該微波環境的反應時間範圍為6至25分鐘。在一更佳實施例中，該微波環境的反應時間範圍為8至15分鐘。

在上述方法的該步驟(c)中，該式(Vb)或(Vb’)化合物係由具有一親核基團(如胺基)的該式(IVb)或(IVb’)化合物上的該苯并三唑之親核取代(nucleophilic substitution)而獲得。必要時，該式(Vb)或(Vb’)化合物上的該保護基將依據該保護基的類型在具典型的程序下被移除。在另一實施例中，該方法在該步驟(c)之後進一步包含一步驟(d)，該步驟(d)包含移除該式(Vb)或(Vb’)化合物的該保護基。

藉由該組裝過程，該兩親性樹狀聚合物被廣泛用於超分子的構築單元。該兩親性樹狀聚合物的結構造成超分子的各種構造。因此，組裝的超分子具有可程式化的內腔、表面官能性。組裝而成的超分子廣泛用於不同需運送的分子(例如藥物、基因及顯影劑)的遞送載體。此外，可透過混 合多種兩親性樹狀聚合物製造各式各樣的組裝超分子。因此，可以製備出具有各種功能(例如靶向遞送)及多種形式的組裝體。

此外，兩親性樹狀聚合物亦已知具有多種用途，包括增強疫苗的免疫反應及防附著作用。此外，該兩親性樹狀聚合物可形成溶致液晶(lyotropic liquid crystals)，其於目前工業中至關重要。

圖1為本發明中具有樹狀骨架的兩親分子之合成方式概述。

圖2為式(Ib)化合物的合成方式。R為H、胺基酸側鏈或被保護的胺基酸側鏈。PG：保護基。

圖3為固定式(Ib)化合物於樹脂上的方式。M為固相承載材料；X為胺基羧基物；且Y為保護X之N端的保護基。

圖4為第1代(G₁)離胺酸核心的合成流程。M為固相承載材料。

圖5為第2代(G₂)離胺酸核心的合成流程。M為固相承載材料。

圖6為第3代(G₃)離胺酸核心的合成流程。M為固相承載材料。

圖7為第4代(G₄)離胺酸核心的合成流程。M為固相承載材料。

圖8為混合第1代(G₁)樹狀聚合物的合成流程。M為固相承載材料。

圖9為混合第2代(G₂)樹狀聚合物的合成流程。M為固 相承載材料。

圖10為樹脂結合的Dbz胜肽-樹狀分子的珠粒上活化。M為固相承載材料。

圖11為化合物由固相承載脫附之親核取代。圖11(a)為作為親核劑(nucleophile)使用之具有單胺基的化合物。圖11(b)為作為親核劑使用之具有多胺基的化合物。圖11(c)為作為親核劑使用之合成的樹狀分子或樹狀聚合物。

以下實施例為非限制性的，僅代表本發明的各個方面與特徵。

具有樹狀骨架的兩親分子的製備方法之流程

圖1為本發明製備該具有樹狀骨架的兩親分子之流程。圖1中，該化合物中的M為一固相承載材料。此處M代表固相承載樹脂，如氯三苯甲基氯(chlorotrityl chloride，CTC)樹脂、Rink醯胺樹脂、Wang樹脂、Merrifield樹脂等，用於該樹狀核心合成。該化合物中的X為一胺基羧基物。具體而言，X代表來自該式(Ia)或(IIa)化合物與保護的天然、非天然及罕見胺基酸反應形成的該胺基羧基物。該術語「天然胺基酸」意指該天然存在的形式，如L型(除了甘胺酸以外)的甘胺酸(Gly)、丙胺酸(Ala)、纈胺酸(Val)、白胺酸(Leu)、異白胺酸(Ile)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、苯丙胺酸(Phe)、酪胺酸(Tyr)、色胺酸(Trp)、半胱胺酸(Cys)、甲硫胺酸(Met)、脯胺酸(Pro)、天門冬胺酸(Asp)、天門冬醯胺(Asn)、麩醯胺酸(Gln)、麩胺酸(Glu)、組織胺酸(His)、精胺酸(Arg)及離胺酸(Lysine)。 該術語「非天然胺基酸」包含上述界定的所有天然胺基酸的D型，且該術語「罕見胺基酸」即瓜胺酸(Cit)、羥脯胺酸(Hyp)、正白胺酸(Nle)、3-硝基酪胺酸、硝基精胺酸、鳥胺酸(Orn)、萘基丙胺酸(Nal)、甲硫胺酸亞碸或甲硫胺酸碸。該化合物中的Y為一保護X的N端之保護基。具體而言，Y代表偶合的天然、非天然及罕見胺基酸之N端的保護基。例如，Y包含9-茀甲氧羰基(Fmoc)、第三丁氧羰基(Boc)及胺甲酸苄酯(Cbz)基群。該化合物中的K為一來自分支二胺與該式(IIb)化合物反應來移除Y後所得到的一基團。具體而言，K代表樹狀核心之合成的該分支二胺核心。該分支二胺包含離胺酸胺基酸、3-(雙(3-胺丙基)胺基)丙酸、聚乙二醇，且亦包含用於合成混合樹狀分子的兩個不同的一半，在特異性脫保護條件下(正交性)，具有不同保護基的分支二胺核心。例如，該分支二胺包含Fmoc-Lys(ivDde)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH及Fmoc-Lys(Alloc)-OH。該化合物中的B或B’為

(n=0至5)，且Z為一於B或B’上以包含H、胺基酸、胜肽、酸、醣、靶向配體、顯影分子、治療劑或擬肽分子的化合物進行修飾的官能基團。B’為一與B基團之外不同的一半，且至少一Z、K或n與B不同。R’為具有疏水性殘基的各種胺基基群，例如藉由將該式(IVa)或(IVb)化合物與胺基烷(aminoalkanes)、環狀胜肽、宿主-客體(金剛烷基)、聚集體(芘)、金屬螯合劑(多巴胺)、疏水性染劑或顯影劑反應之具有不同鏈長的單或雙烷基鏈。例如，R’包含：

其中n=0至20，且R₃為一胺基酸之側鏈。R”包含藉由將該式(IVa)或(IVb)化合物與脂肪族、環狀、芳香族或雜環反應之各種具有疏水性殘基的二或多胺基基群，或一裝配分支二或多胺的兩親性樹狀聚合物骨架。

具有樹狀骨架的兩親分子之合成方法

縮寫：DMAC：N,N-二甲基乙醯胺；DMF：N,N-二甲基甲醯胺；DCM：二氯甲烷；DMSO：二甲基亞碸；NMM：N-甲基瑪琳(N-methylmorpholine)；NMP：N-甲基吡咯啶酮(N-methyl-pyrrolidone)；NBP：N-丁基吡咯啶酮(N-butylpyrrolidinone)；DCE：二氯乙烷；DCB：二氯苯；TCE：1,1,2-三氯乙烷；THF：四氫呋喃；TEA：三乙胺；DIPEA：N,N-二異丙基乙胺；DBU：1,8-二吖雙環[5.4.0]十一-7-烯(1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene)；DEA：二乙胺；Dbz：3,4-二胺苯甲酸；PG：保護基；HATU：(1-[雙(二甲胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡錠3-氧化六氟磷酸鹽((1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxide hexafluorophosphate)；HBTU：苯并三唑四甲基脲六氟磷酸鹽(hexafluorophosphate benzotriazole tetramethyl uronium)；HCTU：O-(1H-6) -氯苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸鹽(O-(1H-6-chlorobenzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)；TFA：三氟乙酸；ACN：乙腈；ivDde：1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環己-1-亞基)-3-甲丁基(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)-3-methylbutyl)；Boc：第三丁氧羰基(tert-butyloxycarbonyl)；PyBop：苯并三唑-1-基氧基三吡咯啶鏻六氟磷酸鹽(benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate)；Alloc：烯丙氧羰基(allyloxycarbonyl)。

試劑

1. Fmoc脫保護溶液：20%哌啶(v/v)於DMF。

2. 聯胺溶液：2%之N₂H₄.H₂O(純度98%)於DMF。

3. 活化試劑：5%之NMM(v/v)於DMF。

4. 偶合試劑：HBTU(3.5eq.)用於單醯胺鍵。

5. 裂解試劑：95%之TFA(v/v)於去離子水。

自組裝超分子的合成步驟

根據圖1中的合成方法，自組裝分子(具有樹狀骨架的兩親分子)的固相合成開始於PG-胺基酸-Dbz-OH(步驟(a))的基團之合成，該基團固定於固相承載(步驟(b))以得到該式(IIb)化合物。或者，在式(IIa)化合物形成後進行常見的胺基酸偶合以得到式(IIb)化合物(步驟(c))。此外，樹狀基團是以重複固相策略來建構，其透過反覆移除N-保護基並以雙胺基羧基物偶合來達到所需的代數。在步驟(d-1)中，藉由重複使用在二胺基上具有相同N-保護基的羧酸酯以製備該有規則的樹狀分子的構築。在步驟(d-2)中，使用至少一在二胺基上具有不同N-保護基的羧酸 酯，並選擇性地逐一脫保護以建構混合樹狀分子。

建構樹狀分子後，珠粒上Dbz(O-胺基苯胺)基團被活化，以形成樹脂結合的具有亞硝酸烷基酯的醯化苯并三唑(步驟(e))。在珠粒上活化後，以DMF和DCM徹底沖洗樹脂，然後進一步進行親核取代。在步驟(f-1)中，式(IVa)或(IVb)化合物上的苯并三唑連接子被具有疏水性殘基的親核劑取代，以得到親核劑-X結合物，並使該親水性殘基從樹脂上脫附。最後，得到兩親性化合物。或者，使用具有兩個或多個親核官能基團的分子來攻擊兩個式(IVa)或(IVb)化合物，並取代苯并三唑連接子，以得到X-親核劑-X結合物(步驟(f-2))。親核取代之溶劑系統的選擇取決於親核劑的性質。例如，C18疏水性烷和芘需要不同的DCM與DMF雞尾酒混合組合(cocktail combination)；其他溶劑組合或單一溶劑係用於其他親水性基團，如金剛烷與多巴胺基團。

最後，親核取代使該化合物自樹脂脫附，使其呈現在溶液中。移除溶劑得到保護的粗化合物。脫保護條件因使用的每個保護基而不同。根據該化合物的性質進行純化。

合成方法的步驟之詳細描述如下：

步驟(a)：保護基-胺基酸-二胺苯甲酸(PG-胺基酸-Dbz-OH)(式(Ib)化合物)之一般合成步驟

如圖2所示，將PG-胺基酸-OH(1eq.)之溶液加入3,4-二胺苯甲酸(式(Ia)化合物)(1.2eq.)於DMF之溶液中。該反應以偶合試劑(例如HBTU、HCTU、HATU、PyBop)(1eq.)及鹼(TEA、DIPEA、 NMM、DBU)(2eq.)於DMF中活化2-10分鐘。所得混合物在室溫下攪拌6-10小時。移除溶劑後，將所得混合物溶於水中並加入己烷直至出現沉澱。將所得混合物再額外攪拌1-8小時，以得到自由流動的固體，將其過濾並乾燥。根據溶解度，利用二氯甲烷與MeOH的不同組合之快速管柱層析純化固體，以得到具有良好純度和產率(60-85%)的產物。

基於上述步驟，根據PG-胺基酸-OH的種類，利用不同的反應條件合成各種PG-胺基酸-Dbz-OH(式(Ib)化合物)。該條件列於表1中。

表1、式(Ib)化合物之合成條件

步驟(b)：於樹脂上固定PG-胺基酸-Dbz-OH(式(Ib)化合物)

如圖3所示，該式(IIb)化合物係藉由固定PG-胺基酸-Dbz-OH(式(Ib)化合物)(步驟a)基團至該固相承載而得。本方法適用於多種固相承載，如Rink醯胺樹脂、氯三苯甲基氯(CTC)樹脂、Wang樹脂、Merrifield樹脂、PEG胺樹脂和Tentagel樹脂。根據樹脂選擇，Dbz基團的固定條件列於表2中，以得到式(IIb)化合物。

表2、式(Ib)化合物固定於樹脂之條件

步驟(c)：由胺基酸偶合製備該式(IIb)化合物的替代方法

如圖1中步驟(c)所示，該式(IIb)化合物係以固相策略 來建構，以將PG-胺基酸-OH偶合至該式(IIa)化合物上，接著進行一常見固相胜肽合成策略，該式(IIa)化合物的製備被報導於Anand Selvaraj等人(Chem.Sci.2018,9,345-349)。Anand Selvaraj等人的內容併入本申請中。

步驟(d-1)：Dbz偶合樹脂上的樹狀分子建構

如圖1中步驟(d-1)所示，樹狀基團係透過固相策略來建構，其藉由反覆脫保護，然後根據代數與離胺酸、3-(雙(3-胺丙基)胺基)丙酸或其他分支化合物偶合，以於固相承載上得到樹狀核心(式(IIIa)化合物)。

例如，第1代(G₁)離胺酸核心之合成步驟如圖4所示。PG-胺基酸-Dbz-OH固定的樹脂(步驟(b))係使用固相Fmoc策略於離胺酸核心合成。移除Fmoc(10分鐘，2次，6mL)及樹脂沖洗(1分鐘，3次，6mL)後，該Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(3.5eq.)與HBTU(3.5eq.)於活化溶液(8mL)中之混合溶液在室溫下轉移至反應容器1小時。該產物不分離並命名為G₀-Fmoc。Fmoc脫保護後，加入Boc-Lys(Boc)-OH(7eq.)與HBTU(7eq.)並攪拌2小時進行偶合以得到具有Boc基群的G₁離胺酸核心(命名為G₁-Boc)。

例如，第2代(G₂)離胺酸核心之合成步驟如圖5所示。除了使用Fmoc-Lys(Fmoc)-OH取代Boc-Lys(Boc)-OH外，皆與圖4中步驟相同，此步驟可提供出G₁-Fmoc。Fmoc脫保護後，加入Boc-Lys(Boc)-OH(14eq.)與HBTU(14eq.)並反應3小時，然後再次重複相同的偶合條件(雙偶合)以得到G₂-Boc。

例如，第3代(G₃)離胺酸核心之合成步驟如圖6所示。依照圖4及圖5中所記錄的相同步驟，除了使用Fmoc-Lys(Fmoc)-OH取代Boc-Lys(Boc)-OH外，此步驟可提供出G₂-Fmoc。Fmoc脫保護後，加入Boc-Lys(Boc)-OH(28eq.)與HBTU(28eq.)並反應6小時，然後再次重複相同的偶合條件(雙偶合)以得到G₃-Boc。

Dbz偶合樹脂上的樹狀分子或樹狀聚合物可藉由以上程序來合成。樹狀分子表面(樹狀聚合物或樹狀分子之末端基群)係以不同胺基酸來取代離胺酸作為試劑以進行修飾，如表3所列。雙偶合是必要的。

表3、樹狀聚合物或樹狀分子的末端基群之合成條件

除了苯丙胺酸及組胺酸外，N-保護的胺基酸可依照相同的條件使用。此外，線性胜肽、環狀胜肽、支鏈胜肽、烷基酸、芳香酸、醣、螢光分子、顯影劑、靶向分子、治療劑或擬肽分子可以被結合鍵結在表面上。N-保護基為Boc、Fmoc或其他。

例如，第4代(G₄)離胺酸核心之合成步驟如圖7所示。除了使用Fmoc-Lys(Fmoc)-OH取代Boc-Lys(Boc)-OH外，皆與圖4、5及6中步驟相同，此步驟可提供出G₃-Fmoc。Fmoc脫保護後，加入Boc-Lys(Boc)-OH(58eq.)與HBTU(58eq.)並反應24小時，然後再次重複相同的偶合 條件(雙偶合)以得到G₄-Boc。

步驟(d-2)：Dbz偶合樹脂上混合樹狀分子建構之表面

如圖1中步驟(d-2)所示，藉由使用正交保護支鏈雙胺基羧基物可達成表面混合樹狀分子的建構。透過選擇性移除保護基，一種胺用於製備該樹狀分子的一半，而樹狀分子的另一部分則由另一種胺來建構。接著，達成特定的表面修飾。例如，Fmoc-Lys(ivDde)-OH的Fmoc基將被選擇性裂解以製備半樹狀分子，而ivDde保護基將利用聯胺溶液來移除，以製備其他樹狀分子。

例如，混合樹狀分子之建構如圖8所示。在Fmoc-Lys-Dbz-OH固定的樹脂修飾後，進行Fmoc脫保護及Fmoc-Lys(ivDde)-OH偶合，以得到G₀-Fmoc-ivDde。Fmoc移除後，典型的固相胜肽合成係透過連續Fmoc-Lys(Fmoc)-OH偶合、Fmoc脫保護及Boc-Lys(Boc)-OH偶合來進行，以生成半樹狀分子，來提供出名為混合-ivDde-Boc₂之化合物。此後，移除ivDde後，經連續Fmoc-Lys(Fmoc)-OH偶合、Fmoc脫保護及Boc-Phe-OH偶合來製造末端為苯丙胺酸的半樹狀分子，以得到混合-G₂-K₂F₂。

例如，胺基酸修飾的混合樹狀分子如圖9所示。G₀-Fmoc係以與圖4所述相似的步驟來製備。接著，將於利用Fmoc-Lys(Fmoc)-OH取代Boc-Lys(Boc)-OH以提供G₁-Fmoc，而非G₁-Boc後，以合成出G₁產物。依照圖5中相似的條件以合成G₂產物，使用Fmoc-Lys(Boc)-OH取代Boc-Lys(Boc)-OH以得到G₂-Fmoc-Boc，而非G₂-Boc。Fmoc脫保護後，進行Boc-Phe-OH偶合以生成一末端為苯丙胺酸的混合樹狀分子，命名為G₂-(NBoc- F)₄。

步驟(e)：Dbz基團在珠粒上活化成醯化苯并三唑的一般步驟

如圖1中步驟(e)所示，以DMF(5-10mL)及DCM(5-10mL)沖洗樹脂結合的Dbz樹狀分子，然後轉移至玻璃瓶。將樹脂以亞硝酸異戊酯(10eq.)於DMF(5-8mL)在室溫下處理90分鐘以得到珠粒上醯化苯并三唑。以DMF(5-10mL)及DCM(5-10mL)沖洗剩餘試劑。

例如，不同代化合物的珠粒上活化如圖10所示。以DMF(3mL x 3)及DCM(3mL x 3)沖洗樹脂結合的Dbz胜肽-樹狀分子，然後轉移至20mL玻璃瓶。將樹脂以亞硝酸異戊酯(10eq.)於DMF(4mL)處理，並在室溫下搖動90分鐘。以DMF(3mL x 3)及DCM(3mL x 3)沖洗剩餘試劑。圖10中，該化合物中的B係選自：

步驟(f)：樹脂上親核取代的一般步驟

經亞硝酸異戊酯處理後，該樹脂結合的Dbz胜肽-樹狀分子(式(IIIa)或(IIIb)化合物)已被活化以形成具有苯并三唑基團的化合物(式(IVa)或(IVb)化合物)。在圖1之該步驟(f-1)及(f-2)中，將具有單胺的化合物用於攻擊該式(IVa)或(IVb)化合物，以得到脫附的式(Va) 或(Vb)化合。或者，將多胺用於攻擊該式(IVa)或(IVb)化合物兩次，以得到脫附的式(Va’)或(Vb’)化合物。詳細機制如圖11所示。如圖11(a)所示，該單胺攻擊該式(IVa)化合物之三唑環上連接的羰基，並取代該苯并三唑基團以使式(Va)化合物自固相承載脫附。該式(Vb)化合物的製備係依照相似的程序來攻擊該式(IVb)化合物。在圖11(b)中，一二或多胺為親核劑。二或多胺之每一胺基將全部攻擊該式(IVa)化合物上的羰基以生成二或多個取代物(式(Va’)化合物)。該式(Vb’)化合物的製備是依照相似的程序來攻擊該式(IVb)化合物。利用微波輻射觀察到高產率。親核取代係根據各親核劑的溶解度不同之雞尾酒混合組合來進行。例如，以具有芘或C18衍生物的親核劑之取代可於DCM與DMF的組合中完成。以具有金剛烷基團或疏水性環狀胜肽的親核劑之取代可於DMF中完成。或者，具有極性有機分子之取代可於DMSO及DMF組合中完成。依照相似的程序，二或多胺可能攻擊該式(IVa)及(IVb)化合物以得到一混合產物。

如圖11(c)所示，在合成更多代的樹狀聚合物的情況下，該兩親性樹狀分子本身可作為一攜帶多個胺的親核劑，以更有效率的方式產生更多代的樹狀聚合物，而不用一代一代逐步合成目標樹狀分子(步驟(f-2))。

將樹脂上Dbz活化的樹脂以DMF轉移至微波瓶(8mL)。加入DIPEA(8eq.)並攪拌5分鐘。然後加入親核劑(1eq.)於溶劑中之溶液。在50℃，100W下進行微波反應10分鐘。觀察到高產率和純度。

下方表4列出不同的親核劑以及不同的雞尾酒混合組合。

表4、不同的親核劑及其不同的雞尾酒混合組合

最終脫保護及純化之一般步驟

表面保護基係以選擇性雞尾酒混合組合脫保護。例如，於DMF中Boc基係以TFA雞尾酒組合裂解且Fmoc基係以哌啶或二乙胺(DEA)裂解。

一旦，該親核取代完成，在以樹脂濾出後收集保護的粗化合物，並濃縮該溶液。加入裂解溶液(TFA：H₂O/95：5)(2-7mL)並在室溫下搖動(200rpm)該反應混合物1-4h以移除該Boc基。加入裂解溶液(DEA：DCM/1：1)(4-8mL)並在室溫下搖動(200rpm)該反應混合物3-8h以移除Fmoc基。

去除保護後，可利用常見的沉澱收集兩親性產物，以得到高純度的化合物。將該具有不同疏水性親核劑的離胺酸為基礎的樹狀聚合物於冷乙醚中沉澱出，並以高於5500rpm的速度離心5分鐘。透過傾析分離沉澱的化合物。將所得化合物溶於2-5mL之含有0.1%TFA的水和乙腈(1： 1)之混合溶劑中，並使之冷凍乾燥，以得到目標產物。

如果兩親性化合物含有3-(雙(3-胺丙基)胺基)丙酸為基礎的樹狀分子，則需要用3-8%之甲醇於DCM的溶液進行管柱層析純化，以得到目標化合物。

本領域技術人員理解前述概要作為傳達本發明資訊的方法的描述。本領域技術人員將認同這些僅是說明性的並且許多等效物是可能的。

Claims (15)

1. 一種用於合成兩親性樹狀聚合物的方法，包含：

   (a)將一式(IIb)化合物與至少一具有二個保護基的雙胺基羧基物(diamino carboxylate)反應以取代該式(IIb)化合物上的Y以生成分支骨架並且用官能基團(functional moieties)修飾該分支骨架的末端基群(terminal groups)以得到一式(IIIb)化合物，

   

   其中M為一固相承載材料(solid support material)；

   X為一胺基羧基物(amino carboxylate)；

   Y為一保護該X之N端的保護基；

   K為一具有支鏈二胺的基團(moiety)；

   B及B’為

   

   ，其中n為0至5，且Z為一官能基團，其包含H、胺基酸、胜肽、酸、醣、靶向配體、顯影分子、治療劑或擬肽分子；

   當B不同於B’時，B中至少一Z、K或n與B’不同；

   (b)將該式(IIIb)化合物於一極性溶劑中與亞硝酸鹽反應，以得到一具有苯并三唑(benzotriazole)結構的式(IVb)化合物，

   

   ；以及

   (c)將該式(IVb)化合物於一含有一親水性溶劑與一疏水性溶劑的混合溶 液中與一具有疏水殘基的胺反應，以得到一式(Vb)化合物，

   

   其中R’包含具有疏水性殘基的胺基基群；或是

   將至少二個式(IVb)化合物於一含有一親水性溶劑與一疏水性溶劑的混合溶液中與對應之具有疏水性殘基的二或多胺反應，以得到一式(Vb’)化合物，

   

   其中R”包含具有疏水性殘基的支鏈二或多胺之胺基基群，且n>1。
2. 如請求項1所述之方法，其在步驟(a)之前進一步包含步驟(pre-a2)，該步驟(pre-a2)包含將一式(Ib)化合物固定於一固相承載材料，以得到該式(IIb)化合物，

   
3. 如請求項2所述之方法，其在步驟(pre-a2)之前進一步包含步驟(pre-a1)，該步驟(pre-a1)包含將一式(Ia)化合物與一具有該X-Y之化合物反應，以得到該式(Ib)化合物，

   
4. 如請求項1所述之方法，其中該固相承載材料包含可控孔徑的玻璃(controlled-pore glass)、磁珠、Rink醯胺樹脂(Rink amide resin)、Tentagel樹脂(Tentagel resin)、Wang樹脂(Wang resin)、Merrifield樹脂(Merrifield resin)、MBHA樹脂(MBHA resin)、PAM樹脂(PAM resin)、PAL樹脂(PAL resin)、Sieber醯胺樹脂(Sieber Amide resin)、三苯甲基樹脂(trityl resin)、氯三苯甲基樹脂(chlorotrityl resin)、聚乙二醇-聚苯乙烯樹脂(polyethylene glycol-polystyrene resin)、Weinreb樹脂(Weinreb resin)、肟樹脂(oxime resin)、DHP樹脂(DHP resin)或safety-catch樹脂(safety-catch resin)。
5. 如請求項1所述之方法，其中該X包含：

   

   ，其中n為一1至10之整數；或

   

   其中R為H、-CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)CH₂CH₃、-CH₂C₆H₅；-CH₂COOH、CH₂CH₂COOH、-CH₂OH、-CH₂CH(CH₃)OH或-CH₂C₆H₄OH之O-PG衍生物；-CH₂SH或-CH₂CH₂SCH₃之S-PG衍生物；-CH₂CH₂CONH₂、-CH₂CONH₂、-CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂或-CH₂CH₂CH₂NHC(NH)NH₂之N-PG衍生物；或

   

   或

   

   之N-PG衍生物，

   其中PG為一保護N、O或S之保護基。
6. 如請求項1所述之方法，其中該Y包含9-茀甲氧羰基(9-fluorenylmethoxycarbonyl)、第三丁氧羰基(tert-butoxycarbonyl)、胺甲酸苄酯(benzyl carbamates)、苄基或烯丙氧羰基(alloxycarbonyl)基群。
7. 如請求項1所述之方法，其中該B或B’之形式包含該分支骨架，該分支骨架包含KZ₂、K(KZ₂)₂、K(K(KZ₂)₂)₂、K(K(K(KZ₂)₂)₂)₂或K(K(K(K(KZ₂)₂)₂)₂)₂。
8. 如請求項1所述之方法，其中該R’包含：

   

   其中n為0至20，且R₃為一胺基酸之側鏈。
9. 如請求項1所述之方法，其中該亞硝酸鹽包含亞硝酸鈉、亞硝酸鉀、亞硝酸乙酯、亞硝酸丁酯、亞硝酸第三丁酯、亞硝酸異丁酯、亞硝 酸戊酯、亞硝酸異戊酯(isopentyl nitrite)、亞硝酸丁酯(iso-amyl nitrite)、亞硝酸二環己胺(dicyclohexylamine nitrite)或亞硝酸四丁銨(tetrabutylammonium nitrite)。
10. 如請求項1所述之方法，其中該步驟(b)中該極性溶劑包含二氯甲烷、N,N-二甲基乙醯胺、N,N-二甲基甲醯胺、N-甲基吡咯啶酮、二氯乙烷、三氯乙烷或水。
11. 如請求項1所述之方法，其中該步驟(c)中該疏水性溶劑包含二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯啶酮或N-丁基吡咯啶酮。
12. 如請求項1所述之方法，其中該步驟(c)中該親水性溶劑包含二氯甲烷、二氯乙烷、二氯苯、1,1,2-三氯乙烷、四氫呋喃、二氧六環(dioxane)或乙酸乙酯。
13. 如請求項1所述之方法，其中該混合溶液之反應溫度範圍為1至150℃。
14. 如請求項1所述之方法，其中該親水性溶劑與該疏水性溶劑之體積比範圍為50：0至1：15。
15. 如請求項1所述之方法，其在步驟(c)之後進一步包含一步驟(d)，該步驟(d)包含移除該式(Vb)或(Vb’)化合物之該保護基。

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