TWI749362B - 蟬花子實體萃取物、其製造方法及其用於降低眼壓之用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種蟬花子實體萃取物、其製造方法與其用於降低眼壓之用途。前述製造方法包含子實體培養步驟與萃取步驟，其中子實體培養步驟包括對蟬花菌絲體進行多階段培養步驟，藉由控制光暗週期與空氣對流與否之條件，獲取子實體。前述子實體經萃取後的蟬花子實體萃取物具有降低眼壓之功效。

Description

蟬花子實體萃取物、其製造方法及其用 於降低眼壓之用途

本發明提供一種蟬花萃取物，特別是有關於一種蟬花子實體萃取物、其製造方法及其用於降低眼壓的用途。

近年來因為人類用眼習慣與生活型態的改變，眼睛相關疾病之盛行率有上升的趨勢。這些疾病之中，青光眼(glaucoma)是一種視神經受到壓迫導致病變的疾病，具有高度致盲風險。青光眼的成因與眼壓過高呈高度相關。眼壓又稱作眼內壓(intraocular pressure，IOP)，係眼球內容物對眼球內壁的壓力，藉由房水(aqueous humor)生成和排出的動態平衡維持一定的壓力。若房水的生成的速度過快、排出受到阻塞，易使房水滯留，而造成眼壓異常升高。

臨床上治療青光眼的藥物主要作用於降低房水的生成與提高房水的排出，前者可例如乙種腎上腺阻斷劑 (β-Adrenergic blockers)、α 2-腎上腺素致效劑(α 2-Adrenergic agonists)、碳酸酐酶抑制劑(carbonic anhydrase inhibitors)等，後者可例如膽鹼性致效劑(cholinergic agonists)、前列腺素類似物(prostaglandin analogues)等藥物，或使用含兩種以上上述藥物之複方製劑。然而這些藥物皆具有副作用，例如：使眼睛產生刺痛、灼熱、搔癢、畏光，甚至可能引起角膜炎、結膜炎、視力模糊。更甚者，可能引起心律不整、眩暈、氣喘、疲倦、腎結石等症狀。故實有必要提出一種副作用較低而可有效降低眼壓的物質。

蟬花是一種蟲草屬(Cordyceps)真菌，寄生在蟬蛹或蟬科山蟬(Cicada flammate)及竹蟬(Platylomia pieli)等幼蟲，吸取寄主的養分而長出花蕾狀子實體，形成菌蟲複合體。古籍中記載蟬花具有明目、退翳障之功效。然而，由於蟬的生活史較長，又常受到其他蟲生真菌感染，使得野生蟬花子實體的量非常稀少，限制其應用。另外，對於蟬花子實體是否具有其他效果，目前相關研究闕如。

有鑑於此，亟須提供一種蟬花子實體的人工培養方法，並評估蟬花子實體萃取物的功效，以提升其價值。

因此，本發明之一態樣是提供一種蟬花子實體萃取物的製造方法，以利於人工培養蟬花子實體並獲得其萃取物。

本發明之另一態樣係提供一種蟬花子實體萃取物，其係以上述製造方法獲得。

本發明之又一態樣係提供一種蟬花子實體萃取物用於製備降低眼壓之組成物的用途，其係以上述蟬花子實體萃取物作為有效成分。

根據本發明之一態樣，提供一種蟬花子實體萃取物的製造方法，其可包含對蟬花進行子實體培養步驟及萃取步驟。在一實施例中，上述蟬花可例如源自於2013年11月25日寄存於台灣新竹食品路331號財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC)，寄存編號為BCRC MU 30106之菌株。上述子實體培養步驟包含醱酵培養步驟及多階段培養步驟。上述醱酵培養步驟可例如將蟬花之菌絲體接種於醱酵培養液中培養3至7天，以獲得菌絲體醱酵液。上述多階段培養步驟可例如將上述菌絲體醱酵液接種於子實體培養基後，依序進行第一培養步驟、第二培養步驟及第三培養步驟，以獲得子實體，其中第一培養步驟係於密閉空間避光培養達3至7天，第二培養步驟係於密閉空間以至少一光暗週期培養達7至40天，第三培養步驟係於開放空間以上述至少一光暗週期培養達7至14天，而上述至少一光暗週期之一者可例如交替循環之12小時照光處理與12小時避光處理。

在本發明的一實施例中，前述菌絲體醱酵液與前述子實體培養基之重量比可例如0.2：1至2：1。

在本發明的一實施例中，前述子實體培養基包 含重量體積比(g/mL)2：3至3：2之固形份與培養液。前述固形份可包含第一碳氮源，且前述培養液可包含第二碳氮源、醣類、無機鹽及水。

在上述實施例中，前述第一碳氮源包含大麥仁及燕麥，前述第二碳氮源包含酵母萃取物、鹼性胺基酸及/或黃豆粉，且前述醣類包含葡萄糖、果糖、麥芽糖及/或蔗糖。

在本發明的一實施例中，前述萃取步驟可例如利用水及/或低級醇進行。

在本發明的一實施例中，前述蟬花子實體萃取物包含蟬花子實體萃取液及/或由蟬花子實體萃取液衍生之乾燥物。

根據本發明之另一態樣，提供一種蟬花子實體萃取物用於製備降低眼壓之組成物的用途，其係以前述蟬花子實體萃取物作為有效成分。

在本發明的一實施例中，前述組成物之受試對象可例如為哺乳類動物。

在本發明的一實施例中，前述哺乳類動物可例如為人類。

在本發明的一實施例中，蟬花子實體萃取物的有效劑量可例如為500mg/70kgw/天至600mg/70kgw/天。

在本發明的一實施例中，組成物可例如為口服組成物，且口服組成物可進一步包含食品組成物及醫藥組成 物。

應用本發明之蟬花子實體萃取物的製造方法及其獲得的萃取物，可顯著降低受試對象的眼內壓變化量，進而用於製備降低眼壓之組成物的用途。

101/103/210/230/231/233/235:步驟

401/403/405/407/501/503/505/507/601/603/605/607:折線

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：〔圖1〕係顯示根據本發明一實施例之蟬花子實體萃取物的製造方法之部分流程圖。

〔圖2A〕和〔圖2B〕係顯示根據本發明一實施例之蟬花子實體萃取物的製造方法之部分流程圖。

〔圖3A〕和〔圖3B〕係顯示根據本發明一實施例之蟬花子實體萃取物〔圖3A〕與蟬花菌絲體萃取物〔圖3B〕之HPLC指紋圖譜。

〔圖4〕係顯示根據本發明一實施例之兔子經投予蟬花子實體萃取物後的眼壓對時間之折線圖。

〔圖5〕係顯示根據本發明一實施例之兔子經投予蟬花子實體萃取物後的相對眼壓變化量對時間之折線圖。

〔圖6〕係顯示根據本發明一實施例之兔子經投予蟬花子實體萃取物後的相對眼壓變化百分比對時間之折線圖。

本發明所提到的單數形式“一”、“一個”和“所 述”包含複數引用，除非上下文另有明確規定。數值範圍(如10%~11%的A)若無特定說明皆包含上、下限值(即10%≦A≦11%)；數值範圍若未界定下限值(如低於0.2%的B，或0.2%以下的B)，則皆指其下限值可能為0(即0%≦B≦0.2%)。上述用語是用以說明及理解本發明，而非用以限制本發明。

本發明提供一種蟬花子實體萃取物的製造方法，以獲得蟬花子實體萃取物，並應用於製備降低眼壓之組成物的用途。於一實施例中，蟬花可例如源自於2013年11月25日寄存於台灣新竹食品路331號財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC)，寄存編號為BCRC MU 30106之菌株。前述菌株亦於2015年05月04日寄存於中國北京的中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，寄存編號為CGMCC 10486。應理解，本發明所述之蟬花菌絲體及其子實體萃取物不限於由此菌種所得。

請參閱圖1，其係顯示根據本發明一實施例之蟬花子實體萃取物的製造方法之部分流程圖。如步驟101所示，進行子實體培養步驟。

前述子實體培養步驟的詳細步驟如圖2A所示。圖2A其係顯示根據本發明一實施例之蟬花子實體萃取物的製造方法之部分流程圖。首先，如步驟210所示，進行醱酵培養步驟，可例如將該蟬花之菌絲體接種於醱酵培養液中培養3至7天，以獲得菌絲體醱酵液。在一實施例中，醱酵培養步驟之培養條件不拘，可採用習知培養條件進行。在 一些具體例中，上述醱酵培養步驟可例如於酸鹼值pH 2至8之醱酵培養液中，以15至35℃之溫度、並以每分鐘轉速(rpm)60至120rpm進行培養。

接著，如步驟230所示，進行多階段培養步驟，可例如將前述菌絲體醱酵液接種於子實體培養基培養後，依序進行第一培養步驟、第二培養步驟及第三培養步驟，以獲得子實體。前述菌絲體醱酵液與前述子實體培養基之重量比為0.2：1至2：1，其中子實體培養基可包含重量體積比(g/mL)2：3至3：2之固形份與培養液，固形分可包含第一碳氮源，培養液可包含第二碳氮源、醣類、無機鹽及水。在一例示中，前述第一碳氮源可包含但不限於如麥、稻米等穀物，然而以大麥仁及燕麥較佳。在一例示中，前述第二碳氮源可包含但不限於酵母萃取物、鹼性胺基酸及/或黃豆粉。在一例示中，前述醣類可例如葡萄糖、果糖、麥芽糖及/或蔗糖等。在一例示中，前述無機鹽可例如硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀及/或硫酸鐵等。

請參閱圖2B，其係顯示根據本發明一實施例之蟬花子實體萃取物的製造方法之部分流程圖。如步驟231所示，進行第一培養步驟，可例如將前述菌絲體醱酵液培養於前述子實體培養基上，在密閉空間避光培養達3至7天。接著，如步驟233所示，進行第二培養步驟，可例如於密閉空間以至少一光暗週期培養達7至40天，較佳為25至35天。前述至少一光暗週期之一者可例如交替循環之12小時照光處理與12小時避光處理。接下來，如步驟235所示，進行第三 培養步驟，可例如於開放空間以前述至少一光暗週期培養達7至14天，以獲得蟬花子實體。前述密閉空間與開放空間分別係指空氣不對流與空氣對流之培養環境。

本發明之技術特徵之一在於上述多階段培養步驟具有特定的光暗週期與空氣對流與否，以克服蟬花子實體不易以非動物性培養基進行人工培養的問題。在此說明的是，若未使用上述特定菌株之蟬花輔以上述條件進行多階段培養步驟，將無法在不需要動物性來源寄主的前提下，以人工培養方式獲得蟬花子實體。

在一實施例中，前述多階段培養步驟的環境之溫度與相對溼度及培養基酸鹼值不拘，可採用習知條件。在一具體實施例中，環境溫度可例如為15至35。℃，相對溼度可例如為60至100%，且培養基酸鹼值可例如為pH 2至8。

復請參閱圖1，在獲得蟬花子實體後，進行萃取步驟，以獲得蟬花子實體萃取物，如步驟103所示。前述蟬花子實體係指子實體培養基固形份之上的棒狀或花束狀的部分。前述萃取步驟可例如利用水及/或如碳數為1至3的低級醇(甲醇、乙醇、丙醇及異丙醇)，以習知方法，如：浸泡、攪拌、震盪、超音波、加熱、微波或上述任意組合等方法進行。在一實施例中，在萃取步驟之前，可選擇性對蟬花子實體進行第一乾燥及/或研磨處理，以提升萃取的效率。在一實施例中，於萃取步驟後，可選擇性對蟬花子實體萃取液進行第二乾燥及/或研磨處理，以由蟬花子實體萃取液獲得衍生之乾燥物，例如：乾燥粉、凍乾粉等。在一實施例中，前 述蟬花子實體萃取物包含蟬花子實體萃取液及/或由蟬花子實體萃取液衍生之乾燥物。

請參閱圖3A與圖3B分別顯示根據本發明一實施例之蟬花子實體萃取物(圖3A)與蟬花菌絲體萃取物(圖3B)之HPLC指紋圖譜，其中橫軸表示滯留時間，縱軸表示吸光強度(mAU)。上述HPLC誠屬本發明所屬技術領域具有通常知識者所熟知，在此不另贅述。如圖3A和圖3B所示，在此實施例中，蟬花子實體萃取物經分析後，其所含的成分實不同於蟬花菌絲體。上述蟬花子實體萃取物經動物實驗評估後，具有降低眼壓的功效，故可用於製備降低眼壓之組成物的用途。

在應用時，前述蟬花子實體萃取物可添加於組成物中作為有效成分。在一實施例中，前述組成物之受試對象可例如哺乳類動物。在一實施例中，前述蟬花子實體萃取物之有效劑量並無特別限制，惟在一些具體例中，當受試對象為人類時，蟬花子實體萃取物之有效劑量可例如500mg/70kgw/天至600mg/70kgw/天，較佳為520mg/70kgw/天至530mg/70kgw/天。在其他具體例中，當受試對象為兔子時，蟬花子實體萃取物之有效劑量可例如25mg/體重(kgw)/天。

在應用時，前述組成物可例如食品組成物及醫藥組成物等口服組成物。當組合物為醫藥組合物時，可包含但不限於載劑、賦形劑、稀釋劑或輔劑。

以下利用數個實施例以說明本發明之應用，然 其並非用以限定本發明，本發明技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。

實施例一、製備蟬花子實體萃取物 1.培養蟬花子實體

本實施例選用之蟬花(Cordyceps cicadae)係源自於2013年11月25日寄存於台灣新竹食品路331號財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC)，寄存編號為BCRC MU 30106之菌株。

將蟬花菌絲體接種於馬鈴薯糊精培養基(Potato Dextrose Agar,PDA)上，以25℃培養5天，以恢復菌絲體之活性。

將上述菌絲體接種於如表1所示之醱酵培養液中，在25。℃以轉速120rpm進行醱酵培養步驟達3天，以獲得菌絲體醱酵液。

取20mL(約20g)之菌絲體醱酵液接種於20g、pH 5.0之子實體培養基中，培養於相對濕度75%、溫度18℃環境中。首先，於密閉空間避光培養3天，再於密閉空間以至少一光暗週期培養30天，使菌絲體長滿實體培養 基。接著，在開放空間以上述至少一光暗週期培養7天，使菌絲體形成子實體。上述至少一光暗週期之一者為交替循環之12小時照光處理與12小時避光處理。

本實施例係以表2所列製備例1至3之配方進行培養。

2.獲得蟬花子實體萃取物

在此實施例中，取下蟬花子實體並利用冷凍乾燥及研磨處理後，獲得第一凍乾粉。接著，以第一凍乾粉重量之20倍的蒸餾水回溶第一凍乾粉，並加熱至100℃達30分鐘以進行萃取，經過濾、離心後取得之上清液即為蟬花子實體萃取物。將蟬花子實體萃取物進行冷凍乾燥及研磨處理後，獲得第二凍乾粉。

實施例二、評估蟬花子實體萃取物降低眼壓之效果 1.建立實驗動物模型

本實施例使用之實驗動物為8至12周齡的雌性紐西蘭白兔(New Zealand white(NZW)rabbit)。將紐西蘭白兔飼養於溫度23±2℃，濕度40%至70%，循環光照12小時照光及12小時黑暗之環境，且提供充足飼料及無菌逆滲透水予紐西蘭白兔自由取食。經1週馴養適應後，進行評估實驗。

將白兔依體重隨機分成4組，使各組平均體重與體重分布趨勢相近。組別分別為對照組、第一實驗組、第二實驗組與第三實驗組，每組各5隻。

2.評估各製備例降低眼壓之效果

將由製備例1、製備例2和製備例3所獲得之第二凍乾粉回溶於食鹽水中，分別配置成第一試樣、第二試樣、第三試樣等式樣。將這些試樣以管餵的方式分別餵食第一實驗組、第二實驗組與第三實驗組的紐西蘭白兔。對照組則以等量之食鹽水餵食之。每日餵食一次，每次劑量為25mg/體重(kgw)。

在本實施例中，使用回彈式眼壓計TonoVet Tonometer測量紐西蘭白兔之右眼眼壓以進行評估，並以毫米汞柱(mm Hg)作為單位。在餵食試樣的前一小時(t=-1)、後一小時(t=1)及後三小時(t=3)分別進行測量，並分析各組紐西蘭白兔的眼壓、眼壓變化量與眼壓變化百分比。前述眼壓變化量(△IOP)係各時間點眼壓(IOP_t)對比餵食試樣的前一小時(IOP_t=-1)之眼壓差異，如式(I)所示。前述眼壓變化百分比(△IOP%)係眼壓變化量與前一小時之眼 壓之比例，如式(II)所示。

△IOP=IOP_t-IOP_t=-1 (I)

△IOP%=(IOP_t-IOP_t=-1)/IOP_t=-1% (II)

眼壓、眼壓變化量與眼壓變化百分比之結果以平均值(Mean)±標準差(standard error of mean,S.E.M.)表示於表3至表5及圖4至圖6。

請同時參閱表3及圖4，其中圖4係根據表3的結 果繪製之折線圖，其中縱軸表示眼壓(mm Hg)，橫軸表示測量眼壓的時間(小時)，折線401、403、405與407分別表示第一實驗組、第二實驗組、第三實驗組與對照組之結果。「＊」係表示經t-test分析後，IOP_t與IOP_t=-1存在顯著差異(p<0.05)。

如表3及圖4之結果所示，對照組407、第二實驗組403與第三實驗組405之白兔在餵食試樣後，眼壓並沒有明顯變化，然而第一實驗組401的紐西蘭白兔的眼壓在餵食一小時後，眼壓顯著低於餵食一小時前之眼壓，顯示第一試樣，意即以製備例1所得的蟬花子實體萃取物具有降低眼壓之功效。

請同時參閱表4及圖5，其中圖5係根據表4的結果繪製之折線圖，其中縱軸表示眼壓(mm Hg)，橫軸表示測量眼壓的時間(小時)，折線501、503、505與507分別表示第一實驗組、第二實驗組、第三實驗組與對照組之結果。「＊＊」係表示經t-test分析後，同一時間的眼壓變化量在實驗組與對照組之間存在顯著差異(p<0.01)。

如表4及圖5之結果所示，第二實驗組與第三實驗組和對照組相比，紐西蘭白兔之眼壓變化量無顯著變化。然而，第一實驗組的紐西蘭白兔的眼壓變化量在餵食一小時後，顯著低於對照組，顯示第一試樣，意即從製備例1所獲得的蟬花子實體，其萃取物具有降低眼壓之功效。

請同時參閱表5及圖6，其中圖6係根據表5的結果繪製之折線圖，其中縱軸表示眼壓(mm Hg)，橫軸表示 測量眼壓的時間(小時)，折線601、603、605與607分別表示第一實驗組、第二實驗組、第三實驗組與對照組之結果。「＊＊」係表示經t-test分析後，同一時間的眼壓變化百分比在實驗組與對照組之間存在顯著差異(p<0.01)。

如表5及圖6之結果所示，第二實驗組與第三實驗組和對照組相比，紐西蘭白兔之眼壓變化百分比無顯著變化。然而，第一實驗組的紐西蘭白兔的眼壓變化百分比在餵食一小時後，顯著低於對照組，顯示第一試樣，意即從製備例1所獲得的蟬花子實體，其萃取物經口服後，可顯著降低眼壓。

3.推估人類之有效劑量

本實施例依據美國食品藥物管理局2005年所公告之實驗初期估算方法，以本實施例中對兔子使用的有效劑量推估人類之有效劑量。此方法係以兔子每公斤體重的有效劑量除以換算係數3.1，即為人類每公斤體重之有效劑量。依據本實施例中對兔子施予之劑量25mg/體重(kgw)推估，人類之有效劑量為564.5mg/70kgw/天(以人類之體重為70kgw計算)。

由上述實施例可知，應用本發明之蟬花子實體萃取物的製造方法，可人工培養出蟬花子實體，且所獲得的蟬花子實體萃取物，經動物實驗評估後可有效降低眼壓，進而可用於製備降低眼壓之組成物的用途。

需補充的是，本發明雖以特定的製程及/或特定的分析方法作為例示，說明本發明之蟬花子實體萃取物用於 製備降低眼壓之組成物的用途，惟本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者可知，本發明並不限於此，在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明蟬花子實體萃取物亦可使用其他製程或其他的分析方法進行。

雖然本發明已以數個實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

601/603/605/607‧‧‧折線

Claims (10)

1. 一種蟬花子實體萃取物的製造方法，包含：對蟬花(Cordyceps cicadae)進行一子實體培養步驟，其中該蟬花係源自於2013年11月25日寄存於台灣新竹食品路331號財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC)，寄存編號為BCRC MU 30106之菌株，且該子實體培養步驟包含：進行一醱酵培養步驟，其係將該蟬花之一菌絲體接種於一醱酵培養液中培養3至7天，以獲得一菌絲體醱酵液；進行一多階段培養步驟，其係將該菌絲體醱酵液接種於一子實體培養基後，依序進行一第一培養步驟、一第二培養步驟及一第三培養步驟，以獲得一子實體，該子實體培養基是非動物性培養基，該子實體培養基是由一固形份與一培養液組成，該固形份與該培養液之一重量體積比(g/mL)為1：1，該固形份是由大麥仁及燕麥所組成，該培養液是由酵母萃取物、組胺酸、黃豆粉、蔗糖、硫酸鎂及水所組成，其中：該第一培養步驟係於一密閉空間避光培養達3至7天；該第二培養步驟係於該密閉空間以至少一光暗週期培養達7至40天，其中該至少一光暗週期之一者為交替循環之12小時照光處理與12小時避光處理；以及該第三培養步驟係於一開放空間以該至少一光 暗週期培養達7至14天；以及對該子實體進行一萃取步驟，以獲得該蟬花子實體萃取物，且該蟬花子實體萃取物係作為降低眼壓之一組成物的一有效成分。
2. 如請求項1所述之蟬花子實體萃取物的製造方法，其中在該多階段培養步驟中，該菌絲體醱酵液與該子實體培養基之一重量比為0.2：1至2：1。
3. 如請求項1所述之蟬花子實體萃取物的製造方法，其中該萃取步驟係利用水及/或低級醇進行。
4. 如請求項1所述之蟬花子實體萃取物的製造方法，其中該蟬花子實體萃取物包含一蟬花子實體萃取液及/或由該蟬花子實體萃取液衍生之乾燥物。
5. 一種蟬花子實體萃取物，其係由如請求項1至4任一項所述之方法所製得，且該蟬花子實體萃取物係作為降低眼壓之一組成物的一有效成分。
6. 一種蟬花子實體萃取物用於製備降低眼壓之組成物的用途，其中該組成物係以如請求項5所述之蟬花子實體萃取物作為一有效成分。
7. 如請求項6所述之蟬花子實體萃取物用於製備降低眼壓之組成物的用途，其中該組成物之一受試對象為哺乳類動物。
8. 如請求項6所述之蟬花子實體萃取物用於製備降低眼壓之組成物的用途，其中該哺乳類動物為人類。
9. 如請求項8所述之蟬花子實體萃取物用於 製備降低眼壓之組成物的用途，其中該蟬花子實體萃取物的一有效劑量係500mg/70kgw/天至600mg/70kgw/天。
10. 如請求項6所述之蟬花子實體萃取物用於製備降低眼壓之組成物的用途，其中該組成物係一口服組成物，且該口服組成物包含一食品組成物及一醫藥組成物。

Images