TWI742540B

TWI742540B - 治療發炎性疾病之方法

Info

Publication number: TWI742540B
Application number: TW109105932A
Authority: TW
Inventors: 王學孝; 葉宏一; 張恒雄
Original assignee: 台灣基督長老教會馬偕醫療財團法人馬偕紀念醫院; 紅嬰生物科技股份有限公司
Priority date: 2019-02-25
Filing date: 2020-02-24
Publication date: 2021-10-11
Also published as: EP3698787A1; CN111603481A; US20200268792A1; US11285172B2; TW202031251A

Abstract

本揭示內容提供一種用於治療個體之發炎性疾病的方法，包含對該個體投予一有效量之粒徑為約0.1至20nm的二氫硫辛酸(dihydrolipoic acid，DHLA)塗覆之金量子團簇。本揭示內容還提供一種用於在培養細胞減低促發炎分子之表現的方法，包含將培養細胞與所述DHLA塗覆之金量子團簇接觸。本揭示內容還額外提供包含DHLA塗覆之金量子團簇的藥學組合物，其可用於治療個體的發炎性疾病。

Description

治療發炎性疾病之方法

相關申請案之交互參照

本發明主張美國專利臨時申請案於2019年2月25日申請之第62/809,762之優先權，該申請案之完整內容納入本發明專利說明書的一部份以供參照。

本揭示內容是關於治療發炎性疾病的相關領域。具體地，本揭示內容是關於一種透過二氫硫辛酸(dihydrolipoic acid，DHLA)塗覆之金量子團簇，用以治療發炎性疾病的方法，其可調降(downregulate)發炎相關因子之表現量。

心血管疾病(cardiovascular disease，CCD)是涉及心臟或血管數種關聯病理的總稱，且為全球性死亡主因。動脈粥樣硬化(atherosclerosis)是當斑塊堆積在動脈壁上所形成的疾病，其為造成某些心血管疾病的潛在機制，例如冠狀動脈心臟病(coronary heart disease，CHD)、腦血管疾病(cerebrovascular disease)、周邊動脈疾病(peripheral arterial disease，PAD)以及中風。

近期研究表明，發炎在所有的動脈粥樣硬化階段均扮演重要角色。通常，在動脈腔表面之內皮細胞促發炎分子的表現會將發炎細胞從循環吸引到血管壁並啟動後續發炎反應。相關的發炎因子及免疫反應可協同地加速動脈重構，藉以導致內皮功能異常並促使發生動脈粥樣硬化。臨床上廣泛使用非類固醇抗發炎藥物來減輕動脈粥樣硬化，然而該藥物在治療心血管疾病之結果並不一致，遑論近年來被報導的諸多副作用。

鑑於上述、相關領域亟需一種有效降低發炎性分子及/或發炎細胞之表現及/或功能，藉以治療各種發炎性疾病(例如：CCD)改良方法。

為了給讀者提供基本的理解，以下提供本揭示內容的簡要發明內容。此發明內容不是本揭示內容的廣泛概述，同時非用來識別本發明的關鍵/必需元件或勾勒本發明的範圍。其唯一目的是以簡化的概念形式呈現本揭示內容的一些概念，以作為呈現於後文中更詳細描述的序言。

如本文具體實施及廣泛描述地，本揭示內容的一個態樣是關於一種用以對一個體治療發炎性疾病的方法。前述方法包含對該個體投予一有效量之二氫硫辛酸(DHLA)塗覆之金量子團簇。所述DHLA塗覆之金量子團簇係由複數個金奈米粒子所形成之一金量子團簇以及塗覆在該些金奈米粒子上的複數個DHLA所組成。根據本揭示內容之實施方式，DHLA塗覆之金量子團簇降低個體中血管內皮生長因子1(vascular endothelial growth factor-1，VEGF-1)、細胞間黏著分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管細胞黏著蛋白-1(vascular cell adhesion protein-1，VCAM-1)、P-選滯蛋白(P-selectin)、血漿蛋白原活化因子抑制物第一型(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)、馮威里氏因子(von Willebrand factor，vWF)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、介白素-8(interleukin-8，IL-8)及/或介白素-1β(interleukin-1β，IL-1β)之表現量。

本揭示內容也關於一種DHLA塗覆之金量子團簇用於製備一藥物或一藥學組合物之用途，用以治療及/或預防發炎性疾病。

根據本揭示內容一些實施方式，DHLA塗覆之金量子團簇之直徑約為0.1至20nm；較佳地，約1至2nm之直徑。

可以本發明之方法、藥物或藥學組合物治療的發炎性疾病之非限制性實例包含：心血管疾病、炎症性腸病、器官移植排斥、狼瘡、自體免疫疾病、輻射誘導損傷、癌症、燒傷、創傷、風濕性疾病、腎臟疾病、過敏疾病、傳染病、眼科疾病、皮膚疾病、胃腸病、肝疾病、腦水腫、類肉瘤病、血小板減少症以及脊髓損傷。根據本揭示內容一具體實施例，發炎性疾病是心血管疾病。

通常，心血管疾病可以是心絞痛(angina pectoris)、動脈粥狀瘤(atheroma)、動脈粥樣硬化(atherosclerosis)、動脈硬化(arteriosclerosis)、鬱血性心衰竭(congestive heart failure)、冠狀動脈心臟病(coronary heart disease)、心肌病(cardiomyopathy)、心肌梗塞(myocardial infarction)、中風、缺血性病症(ischemic condition)、缺血性心肌病(ischemic cardiomyopathy)、開放性動脈導管(patent ductus arteriosus)、高血壓、肺臟高血壓(pulmonary hypertension)、周邊動脈疾病、冠狀動脈疾病、冠狀動脈痙攣或心包炎(pericarditis)任一種。

較佳地，所述個體是人類。

在一些實施方式中，所述有效量之DHLA塗覆之金量子團簇為每日約1至15nM；較佳為每日約3至12nM；更佳為每日約6至10nM。

在一些實施例中，本發明之方法更包含在投予DHLA塗覆之金量子團簇之同時或之前，投予一胞吞作用抑制劑。

本揭示內容之另一態樣是關於降低培養細胞中促發炎分子之表現的方法。前述方法包含將培養細胞與約1至1000nM之濃度的二氫硫辛酸(DHLA)塗覆之金量子團簇接觸。所述DHLA塗覆之金量子團簇係由複數個金奈米粒子所形成之一金量子團簇以及塗覆在該些金奈米粒子上的複數個DHLA所組成。根據本揭示內容之實施方式，促發炎分子可選自由血管內皮生長因子1(VEGF-1)、細胞間黏著分子1(ICAM-1)、血管細胞黏著蛋白-1(vascular cell adhesion protein-1，VCAM-1)、P-選滯蛋白(P-selectin)、血漿蛋白原活化因子抑制物第一型(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)、馮威里氏因子(von Willebrand factor，vWF)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、介白素-8(interleukin-8，IL-8)及介白素-1β(interleukin-1β，IL-1β)所組成之群組。

根據本揭示內容之實施方式、DHLA塗覆之金量子團簇之直徑約為0.1至20nm；較佳地是約1至2nm之直徑。

培養細胞可以是人類主動脈內皮細胞(human aortic endothelial cell，HAEC)、人類上皮細胞、人類冠狀動脈內皮細胞(human coronary artery endothelial cell，HCAEC)或人類內皮前驅細胞(human endothelial progenitor cell，HEPC)。

培養細胞也可非必要地或選擇性地以一胞吞作用抑制劑進一步處理。

藉由前述特徵，在特定心血管細胞株透過格形蛋白介導的胞吞作用中，本發明DHLA塗覆之金量子團簇具有高度生物相容性。此外，由於DHLA塗覆之金量子團簇之長期培養可降低某些促發炎分子(例如血管生成因子、黏著性分子、凝血因子以及甚至是發炎細胞介素)之表現，因此透過投予DHLA塗覆之金量子團簇之治療具有抗發炎、抗動脈血栓生成以及抗動脈粥樣硬化之效果。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1A圖至第1D圖繪示胞吞作用抑制劑對DHLA塗覆之金量子團簇(圖式中簡稱為FANC)內化作用之影響再經抑制劑預處理之特定培養基後，以含有FANC之培養基替換該些培養基並額外培養80分鐘，接著進行流式細胞測量分析(第1A圖至第1C圖)。注意鹽酸氯丙嗪僅可在低血清或無血清補充劑之培養環境下以劑量依賴性方式降低FANC的內化作用。第1D圖則呈現經胞吞作用抑制劑處理後，攝取FANC的代表性照片。Chlor表示鹽酸氯丙嗪。*：P<0.05；**：P<0.01，相較於純FANC控制組。比例尺：10μm。

第2A圖至第2B圖繪示長時間以FANC處理之HAEC的mRNA表現譜。第2A圖呈現21天之期間；第2B圖則呈現28天之期間。數值是來自3個獨立實驗的三次重複所測定的平均值±SD。*：P<0.05，相較於控制組。

第3A圖至第3B圖分別繪示短時間(3日)以FANC處理，接著以100ng/ml之脂多醣隔夜處理(LPS，取自於大腸桿菌菌株：0111：B4)活化之HAEC的黏著分子mRNA表現量，其中第3A圖為ICAM-1，第3B圖是VCAM-1。數值是來自3個獨立實驗的三次重複所測定的平均值±SD。**：P<0.01；***：P<0.001，與控制組相比。

第4A圖至第4B圖繪示HAEC與THP-1細胞共培養的細胞黏著測定之結果。第4A圖：THP-1細胞貼附於HAEC的代表性共軛焦影像。第4B圖為各實驗組的定量結果。數值是來自3個獨立實驗的三次重複所測定的平均值±SD。*：P<0.05。

第5A圖至第5C圖繪示經3日FANC處理，接著以LPS(100ng/ml)處理隔夜的HAEC中，發炎性細胞介素：IL-1β(第5A圖)、IL-8(第5B圖)以及TNF-α(第5C圖)的mRNA表現量結果。數值是來自3個獨立實驗的三次重複所測定的平均值±SD。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。

第6圖繪示FANC對小鼠之發炎作用的減輕效果。小鼠分別以腹膜內注射PBS、FANC(100nM)、LPS(10mg/Kg)以及FANC+LPS兩小時。每組N=3。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

I.定義

為了便於說明，此處統整性地說明本說明書、實施例以及後附的申請專利範圍中所記載的特定術語。除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。具體而言，除非上下文另有明確說明，本文和後附的申請專利範圍所使用的單數形式「一」(a及an)包含複數形式。此外，在本說明書與申請專利範圍中，「至少一」(at least one)與「一或更多」(one or more)等表述方式的意義相同，兩者都代表包含了一、二、三或更多。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約(about)」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。

本文使用的「一有效量」一詞是指足以產生預期反應之金量子團簇的量。對於體外應用，例如在培養細胞中降低發炎反應時，具體的有效量可隨著各因素變化，例如與金量子團簇接觸之特定細胞種類或是該細胞經過繼代的次數。舉例來說，可以將有效量表示成施用的金量子團簇濃度、金量子團簇之總質量(例如以克、毫克或微克來表示；以莫耳、毫莫耳、微莫耳或奈米莫耳來表示)、或是表示成金量子團簇之總質量相對於培養基總體積的比例(例如：每公斤培養基多少毫克(mg/kg)或是每公升培養基多少奈米莫耳(nM))。較佳地，以約1至1,000nM之濃度施用金量子團簇；更佳為10至500nM之濃度；更佳為30至150nM之濃度。至於體內之應用，例如降低個體之發炎反應及/或治療個體之發炎性疾病，具體有效量可隨各種因素變化，諸如治療的特定病症、個體的生理狀況(例如該個體的體重、年紀或性別)、所治療哺乳類或動物種類、治療時間、並行療程的性質(如果有的話)、以及使用的具體製劑等。較佳地，可用於一個體(例如：人類)之有效量金量子團簇約為1至15nM之奈莫耳濃度；較佳為約3至12nM之奈莫耳濃度；而更佳為6至10nM之奈莫耳濃度。

本文使用的「發炎性疾病(inflammatory disease)」、「發炎性病症(inflammatory disorder)」或「發炎狀況(inflammatory condition)」指稱任何以發炎反應為表徵的疾病，其可被多種包含輻射、機械、化學、感染及免疫性刺激等引發事件所誘導。發炎性病症可透過臨床和病理特徵、以及/或是由組織及 /或細胞分泌之本領域習知發炎相關分子之表現來鑑定。發炎性疾病可指有發炎狀況存在的任意疾病。發炎性疾病的實例包含但不限於：心血管疾病、關節炎、炎症性腸病、氣喘、乾癬、器官移植排斥、輻射誘導損傷、癌症、狼瘡、燒傷、創傷、風濕性疾病、腎臟疾病、過敏疾病、傳染病、眼科疾病、皮膚疾病、胃腸疾病、肝疾病、腦水腫、類肉瘤病、血小板減少症、脊髓損傷以及自體免疫疾病。

本文使用之「心血管疾病(cardiovascular disease)」或「心血管發炎相關疾病(cardiovascular inflammation-related disease)」術語是指心臟或血管(即動脈及靜脈)之疾病或病症或其任何症狀，特別包含發炎狀況。所述疾病之實例包含但不限於：包含手術或其他創傷導致之急性及慢性心血管發炎、心血管疾病、心絞痛、動脈粥狀瘤、動脈粥樣硬化、動脈硬化、鬱血性心衰竭、冠狀動脈心臟病、心肌病、心肌梗塞、中風、缺血性病症、缺血性心肌病、高三酸甘油脂血症、高膽固醇血症、開放性動脈導管、高血壓、心肌梗塞、肺臟高血壓、周邊動脈疾病、冠狀動脈疾病、冠狀動脈痙攣、心包炎、華格納氏肉芽病、Takayasu氏動脈炎、川崎病、抗第八凝血因子自體免疫疾病(anti-factor VIII autoimmune disease)、壞死性小血管血管炎(necrotizing small vessel vasculitis)、顯微多血管炎(microscopic polyangiitis)以及Churg-Strauss二氏症候群(Churg-Strauss syndrome)。

本文使用之「促發炎分子(pro-inflammatory molecules)」一詞是指在器官及/或培養細胞株中促進發炎反應之分子。通常，促發炎分子包含生長因子、黏著分子、凝血因子以及發炎細胞介素。在許多實例中，黏著分子在內皮細胞壁上表現以刺激單核球浸潤，藉此在發炎反應中扮演關鍵角色。另一方面，免疫系統之淋巴球可藉由產生抗發炎分子來參與促發炎分子(例如：細胞介素)之調節。在具有抗發炎能力之物質或藥劑的存在下，促發炎分子展現調降作用(down-regulation)。

本文使用之「胞吞作用抑制劑(endocytosis inhibitor)」一詞是指不論介導胞吞作用之機制為何，可抑制胞吞路徑之分子。胞吞作用通常包含可由格形蛋白介導之胞飲作用(pinocytosis)以及涉及內化經膨脹充滿液體之胞內體的吞噬作用。所述胞吞作用抑制劑之實例包含但不限於：格形蛋白(clathrin)依賴性抑制劑，例如鹽酸氯丙嗪(chlorpromazine hydrochloride)以及阿米洛利(amiloride)；以及非格形蛋白抑制劑，例如金雀異黃酮(genistein)以及菲律平(filipin)。

所述「凝血因子(coagulation factor)」係指任何涉及凝血過程中的分子或蛋白質，透過該過程血液從液體變成膠體，最終形成一血凝塊。

II.具體實施方式

本揭示內容至少部分基於對DHLA塗覆之金量子團簇可用於降低數種發炎相關分子表現之研究，藉以提出可預防及/或治療發炎性疾病的潛在手段。

每一DHLA塗覆之金量子團簇在結構上是由複數個金奈米粒子所形成之金量子團簇以及塗覆在該些金奈米粒子上的複數個DHLA所組成。本揭示內容使用的DHLA塗覆之金量子團簇以及其生產過程是本領域具有通常知識者已知的(Lin et al.,ACS Nano 2009,3(2),pp 395-401)；因此為了簡潔起見將不贅述細節。DHLA塗覆之金量子團簇在激發波長約為420nm之條件下，可發射650nm之螢光，因此其發射波長是在紅光至近紅外光之範圍內。每個DHLA塗覆之金量子團簇具有0.1至20nm的粒徑，較佳是1至15nm之粒徑，更佳為1.3至3.4nm之粒徑。前述本揭示內容之金量子團簇的直徑是在乾燥狀態下，然而，如果用於本揭示內容的金量子團簇是水溶性或至少可分散於液體培養基及/或水中，則更好；由於可以與周邊溶劑分子(例如水)耦合，因此本揭示內容之金量子團簇之流體動力學尺寸會明顯大於乾燥狀態下的尺寸。在一特定實施方式中，金量子團簇具有流體動力學粒徑(hydrodynamic size)相當於標準粒徑之聚乙二醇(PEG)的1至30kDa(Lin et al.,ACS Nano 2009,3(2),pp 395-401)。

根據一態樣，DHLA塗覆之金量子團簇可於培養細胞中降低至少一促發炎分子的表現量。在特定實施方式中，是將培養細胞與濃度為約1至1,000nM的DHLA塗覆之金量子團簇接觸一段時間，例如1至10小時，較佳是3至7小時，更佳是4至6小時。根據本揭示內容之實施方式，可被本揭示內容DHLA塗覆之金量子團簇抑制的促發炎分子包含但不限於，生長因子、黏著分子以及凝血因子。

生長因子的非限制性實例包含血管內皮生長因子(VEGF)、纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、轉形生長因子-α(transforming growth factor-α，TGF-α)、鹼性及酸性纖維母細胞生長因子、結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)及/或肝素-結合類EGF生長因子(Heparin-binding EGF-like growth factor，HB-EGF)。在特定實施方式中，生長因子是VEGF。

黏著分子的實例包含但不限於：細胞間黏著分子1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)、血管細胞黏著蛋白-1(vascular cell adhesion protein-1，VCAM-1)、E-選滯蛋白(E-selectin)及/或P-選滯蛋白。在特定實施方式中，所述黏著分子係選自由ICAM-1、VCAM-1、及P-選滯蛋白所組成之群組。

凝血因子之實例包含但不限於：第一至第十三凝血因子(coagulation factors I to XIII)、馮威里氏因子(vWF)、肝素第二輔因子(heparin cofactor II)、血漿蛋白原活化因子抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)及/或血漿蛋白原活化因子抑制物-2(plasminogen activator inhibitor-2，PAI2)。在特定實施方式中，凝血因子包含vWF及PAI-1。

在一些非必要性或替代實施方式中，DHLA塗覆之金量子團簇也可降低發炎性細胞介素之表現。在一些實施方式中，所述發炎性細胞介素包含介白素-1家族(IL-1)、IL-12、及IL-18、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、干擾素(interferon γ，IFN-γ)及/或顆粒性白血球-巨噬細胞群落刺激因子在特定實施方式中，DHLA塗覆之金量子團簇抑制IL-1家族及TNF家族的過表現。

可以本揭示內容DHLA塗覆之金量子團簇處理的培養細胞包含但不限於人類主動脈內皮細胞(HAEC)、人類上皮細胞、人類冠狀動脈內皮細胞(HCAEC)以及人類內皮前驅細胞(HEPC)。在一些實施方式中，培養細胞是HAEC。

本揭示內容的另一態樣是關於DHLA塗覆之金量子團簇於製備用以治療一個體發炎性疾病的藥物及/或藥學組合物之用途。本揭示內容之藥學組合物或藥物包含一有效量DHLA塗覆之金量子團簇，還非必要性地包含一藥學上可接受的賦形劑。合適的藥學上可接受的賦形劑包含注射用水、0.9%鹽水及/或5%葡萄糖溶液，但不限於此。

可以本揭示內容之藥物組合物或藥物治療的發炎性疾病之非限制性實例包含(但不限於)心血管疾病、炎症性腸病、器官移植排斥、狼瘡、自體免疫疾病、輻射誘導損傷、癌症、燒傷、創傷、風濕性疾病、腎臟性疾病、過敏疾病、傳染病、眼科疾病、皮膚疾病、胃腸疾病、肝疾病、腦水腫、類肉瘤病、血小板減少症以及脊髓損傷。

本揭示內容之藥學組合物或藥物可用於降低個體之促發炎分子(像是VEGF、ICAM-1、VCAM-1、P-選滯蛋白、PAI-1及vWF)之表現，藉此可用於治療發炎性疾病以及/或是改善或緩和與發炎性疾病相關之症狀。本揭示內容之藥學組合物或所述藥物還可額外或非必要性地降低發炎性細胞介素，例如IL-1家族及TNF家族的過表現。

在特定實施方式中，藥學組合物包含一有效量之本揭示內容DHLA塗覆之金量子團簇。在特定實施方式中，有效量是一治療有效量(例如，可有效治療發炎反應及/或降低促發炎分子之表現的量)。在特定實施方式中，有效量是預防性有效量(例如，可有效預防亟需之個體產生發炎症狀的量)。

可以任何已知藥學方法來配製本發明藥學組合物。為了實施本發明，本揭示內容的DHLA塗覆金量子團簇可製備成合適的製劑，例如錠劑、糖衣錠劑、丸劑、顆粒劑、氣霧劑、糖漿劑、乳劑、懸浮劑、溶液劑、軟膏劑、霜劑或凝膠劑或任何形式，特別是藉由惰性、本質上無毒並且為藥學上可接受之載體或溶劑來製造。依據欲投予治療之病患個體、體型及/或生理狀況，以及投予組成物之路徑的不同，可調整本發明藥學組合物中活性成分、藥學上可接受之賦形劑，及/或任何其他成分的的相對劑量。所述組合物可包含介於重量百分比0.1至100之間的活性成分(例如：DHLA塗覆之金量子團簇)。

在某些實施方式中，組合物是一藥學組合物。在某些實施方式中，組合物是一營養組合物。在某些實施方式中，組合物是一保健食品。在一些實施方式中，本揭示內容之組合物可以是保健食品或保健食品產物，其可為任何滋補人類及動物的液體及固體/半固體材料，藉以治療治療發炎性疾病以及/或是改善或緩和與發炎性疾病相關之症狀。保健食品產物可為食品產物(例如：茶基底的飲料、果汁、軟性飲料、咖啡、奶類、果凍、餅乾、穀物、巧克力、營養棒、草藥萃取物、乳製品(例如冰淇淋和優格))、食品/飲食補充品、或營養製劑。

通常是以劑量單位形式配製本發明之DHLA塗覆之金量子團簇，以方便給藥及使劑量具有一致性。然而，當可想見，醫護人員可在合理的醫學判斷範圍內，決定本揭示內容所述之組合物的總每日用量。對特定個體或生物的特定治療有效量將依不同因素而有所調整，包含欲治療的疾病；疾病的嚴重程度；所使用特定活性成分的活性；使用的組成物；個體的年齡、體重、一般健康狀況、性別及飲食習慣；給藥時間、給藥路徑及活性成分的排出速度；治療的持續時間；與活性成分合併或共同使用的藥物；以及醫藥領域習知的其他因素。

本揭示內容的另一態樣是治療一個體之發炎性疾病的方法。所述方法包含對一個體投予以一有效量之DHLA塗覆之金量子團簇或是一包含前述DHLA塗覆之金量子團簇之組合物。

在一些實施方式中，可以DHLA塗覆之金量子團簇治療的發炎性疾病包含但不限於：心血管疾病、炎症性腸病、器官移植排斥、狼瘡、自體免疫疾病、輻射誘導損傷、癌症、燒傷、創傷、風濕性疾病、腎臟疾病、過敏疾病、傳染病、眼科疾病、皮膚疾病、胃腸疾病、肝疾病、腦水腫、類肉瘤病、血小板減少症以及脊髓損傷。

在一些實施方式中，發炎性病症是與涉及發炎反應之心血管疾病的進程有關。所述心血關疾病之實例包含但不限於，心絞痛、動脈粥狀瘤、動脈粥樣硬化、動脈硬化、鬱血性心衰竭、冠狀心臟病、心肌病、心肌梗塞、中風、缺血性條件、缺血性心肌病、開放性動脈導管、高血壓、肺臟高血壓、周邊動脈疾病、冠狀動脈疾病、冠狀動脈痙攣以及心包炎。

在其他實施方式中，投予DHLA塗覆之金量子團簇可降低本文所述之發炎相關黏著分子(例如VEGF、ICAM、VCAM-1、P-選滯蛋白、PAI-1及vWF)的表現。在一些非必要或額外實施方式中，可對個體投予DHLA塗覆之金量子團簇，以降低發炎性細胞介素之表現，所述發炎性細胞介素包含但不限於：IL-1、IL-12、IL-18、TNF、IFN-γ、及/或顆粒性白血球-巨噬細胞群落刺激因子。

本揭示內容之DHLA塗覆之金量子團簇及其組合物可經由任何合適路徑投予或給藥，合適投予或給藥路徑包含腸內(例如：口服)、不經腸胃道、靜脈內、肌內、動脈內、髓內、鞘內、皮下的、心室內、經皮、皮內、皮下的、皮內、直腸的、陰道內、腹腔、局部(以粉末、軟膏劑、霜劑及/或滴劑)。具體而言，較佳的路徑是口服投予、靜脈投予(例如：全身靜脈注射)、透過血液及/或淋巴供給的局部投予、以及/或直接投予於受影響的位置。通常最合適的給藥路徑會隨著各種因素而有所改變，像是藥劑的本質(例如其在胃腸道環境中的穩定性)、及/或個體的生理條件(例如該個體是否對於口服給藥有耐受性)。

達到有效量所需的DHLA塗覆之金量子團簇的精確量隨著不同個體而有所差異，舉例來說，其取決於人種、年紀、以及個體的一般狀況、副作用或疾病的嚴重程度、給藥的模式等。有效量可被包含在單一劑量中(例如單一口服劑量)或多劑量(例如口服多劑量)。在特定實施方式中，當對個體、生物檢體、組織或細胞投予多劑量時，任二劑可包含不同或大致相同劑量之本發明DHLA塗覆之金量子團簇。在特定實施方式中，當對個體、生物檢體、組織或細胞投予多劑量時，多劑量的投予或施用頻率可以是每天3劑、每天2劑、每天1劑、每隔一天1劑、每三天1劑、每週1劑、每兩週1劑、每個月1劑或每隔一個月1劑。在特定實施方式中，對個體、組織或細胞投予多劑量的頻率是每天一劑。在特定實施方式中，對個體、組織或細胞投予多劑量的頻率是每天2劑。在特定實施方式中，本揭示內容所述之一劑(例如：單一劑量或多劑量之任一劑)可分別包含每日每公斤體重約1至15nM，特別是包含每日每公斤體重3至12nM，較佳是每日每公斤體重約6至10nM之本發明DHLA塗覆之金量子團簇。在一較佳實施方式中，包含有效量的劑量為每日每公斤體重約8.1nM。

本揭示內容所述之劑量範圍提供了對成人投予本發明藥學組成物的導引。舉例來說，相較於成人的投予劑量，醫護從業人員或本發明所屬領域具有通常知識者可對孩童或青少年投予較少或相同的劑量。

本揭示內容之DHLA塗覆之金量子團簇或其組合物可與一或多種額外藥劑(例如：治療及/或預防活性劑)合併投予，該種藥劑可用以治療、減少罹患本揭示內容任一發炎性疾病/病症的風險、或延遲該發炎性疾病/病症的進程。所述DHLA塗覆之金量子團簇或其組合物可與其他額外藥劑共同投予，藉以改善其活性(例如對亟需之個體治療發炎性病症及/或減少發炎性病症之風險的活性)、改善生物利用性、改善安全性、減少藥物抗性、減少及/或改變代謝、抑制排出及/或改善個體、生物檢體、組織或細胞中的分佈。當可想見，採用的治療可對相同疾病達到期望的功效，及/或可產生不同的功效。在一些實施方式中，相較於僅包含DHLA塗覆之金量子團簇或僅包含一額外藥劑的藥學組合物，包含本發明DHLA塗覆之金量子團簇及額外藥劑的藥學組合物可產生協同功效(synergistic effect)。

在一些實施方式中，額外藥劑可以是胞吞作用抑制劑，其包含鹽酸氯丙嗪(chlorpromazine hydrochloride)、菲律平(filipin)、阿米洛利(amiloride)以及金雀異黃酮(genistein)。在一些實施方式中，可以在投予DHLA塗覆之金量子團簇之前，投予胞吞作用抑制劑。在其他實施方式中，可同時投予胞吞作用抑制劑以及DHLA塗覆之金量子團簇。

在一些實施方式中，個體為哺乳動物，較佳為人類。

下文提出多個實施例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明。不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。無須進一步說明，據信所屬技術領域中具有通常知識者可根據本文的描述，最大限度地利用本發明。本文引用的所有公開文獻均透過引用其整體併入本文。

實施例

材料與方法

合成DHLA塗覆之金量子團簇(FANC)及製備培養細胞

將人類主動脈內皮細胞(以下以HAEC稱之)培養在含有5%胎牛血清(FBS)及內皮細胞生長補充液(以下簡稱為完全培養基；購自PromoCell,Heidelberg，德國)的內皮細胞生長培養基(MV)中。於37℃下，在具有5%之CO₂/95%之空氣的加濕培養箱中，將HAEC在完全培養基中培養，並每周繼代兩次。本實驗中使用的DHLA塗覆之金量子團簇是基於前驅物誘導的金(Au)奈米粒子(NP)蝕刻來製備(Lin et al.,ACS Nano,2009,3(2),pp 395-401)。簡言之，首先在甲苯(tolune)中透過將0.8毫升之金前驅物(在100毫莫耳/公升之雙十二基二甲基溴化銨(didodecyldimethyl ammonium bromide，DDAB)溶液中製得的AuCl₃，7.5毫克/毫升)添加至含有1毫升之新鮮配製之硼氫化溴化四丁銨(tetrabutylammonium borohydride，TBAB)(100毫莫耳/升之DDAB溶液)及0.675毫升之癸酸(100毫莫耳/升之甲苯溶液)之還原劑中，合成以DDAB穩定的6nm金奈米粒子。

逐漸逐滴加入額外金前驅物，直到顏色變成透明黃色，從而產生非等離子體金量子團簇。接著將前述製備之金量子團簇加入還原態二硫辛酸(α-lipoic acid)液態，以交換配位基。通過在DDAB溶液中加入5毫升之TABA(50毫莫耳/L)，將二硫辛酸(0.206g,Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri,USA)還原成二硫辛酸(DHLA)。透過將等量的金前驅物以及DHLA混合以形成DHLA塗覆之金量子團簇，接著經UV光(302nm)退火30分鐘，從而可在活細胞中產生穩定螢光訊號。以下本文與圖式中，均以「FANC」簡稱DHLA塗覆之金量子團簇，以節省篇幅。

離心除去上清液之後，透過甲醇/氯仿洗滌步驟將FANC進一步純化，並將其重沉澱於硼酸鹽緩衝液(pH 9)中，於55℃之溫度放置至隔夜，並以30-100kDa之離心過濾器(EMD Millipore)收集及緩衝液交換。

抑制胞吞路徑

在某些實驗中，HAEC已經胞吞作用抑制劑處理，以抑制其胞吞路徑。胞吞作用抑制劑是鹽酸氯丙嗪(10μg/ml，C8138)、菲律平(10μg/ml，F9765)、阿米洛利(10μmol/L，A7410)以及金雀異黃酮(50μmol/L，G6649；均購自Sigma-Aldrich)。

免疫螢光法

將細胞種在2%之明膠塗層之玻璃蓋玻片上放置24小時後，用於FANC處理。將細胞固定在含有1%之聚甲醛中，以PBS洗滌，接著以5%之牛血清蛋白(BSA)進行阻斷30分鐘。接著將細胞與初級抗VE-鈣黏蛋白抗體於37℃下培養2小時，接著以FITC-共軛之二級抗體(Chemicon,Temecula,California,USA)於室溫下反應50分鐘。經上述胞吞作用抑制劑預處理一小時之後，將HAEC與 FANC共培養80分鐘，接著以PBS洗滌並以1%之聚甲醛固定。隨後，以雙苯甲醯胺(18.7μmol/L)染色細胞15分鐘，接著以PBS緩衝液洗滌。接著，使用60%之甘油(v/v)固定細胞，並使用具有40×油鏡/1.25孔徑的共軛焦顯微鏡(Leica TCS SP5,Leica,Germany)檢查。在室溫下擷取影像。

即時聚合酶連鎖反應(Real-time PCR)

在以DHLA塗覆之金量子團簇處理之後，將被汙染的培養基替換為新鮮的培養基。使用RNeasy Plus mini kit(Qiagen,Hilden,Germany)於特定時間點萃取細胞的總RNA。使用First-Strand Synthesis System試劑盒(BioRad,Hercules,California,USA)，取用2μg的RNA用於反轉錄反應中。將cDNA產物(0.5μl)配合針對血管內皮生長因子(VEGF)、血管內皮生長因子受體1(Flt-1)、血管內皮生長因子受體2(KDR)、血管細胞黏著分子1(VCAM-1)、細胞間細胞黏著分子1(ICAM-1)、P-選滯蛋白、血漿蛋白原活化因子抑制物-1(PAI-1)、馮威里氏因子(vWF)、內皮氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、去乙醯化酶(sirtuin 1，SirT1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、介白素-8(IL-8)、介白素-1β(IL-1β)以及β-肌動蛋白之特定引子一同用於定量PCR擴增反應中，引子之序列分別列於表1。為了進行即時PCR，使用iQTM SYBR® Green Supermix試劑以及MyiQ Single-Color Real-Time PCR偵測系統(兩者均購自Bio-Rad,California,USA)。相對mRNA表現量是以β-肌動蛋白的相應量來標準化。為了分析，至少進行3次獨立實驗。

細胞貼附測定

於37℃下將HAEC(7.5×104細胞)種植於6孔盤中。於37℃下以不同濃度的FANC(50及100nM)處理HAEC 72小時，接著以LPS(100ng/ml)處理隔夜。在進行細胞貼附測定之前，以含有0.1% BSA之Hank's平衡鹽溶液(HBSS)洗滌三次。將THP-1細胞以1.0×106細胞/毫升之密度懸浮於0.1%之BSA/HBSS溶液中，並以濃度為1μM之Calcein-AM(Biotium,Hayward,CA)於37℃下反應60分鐘，接著以0.1%之BSA/HBSS洗滌三次。接著於37℃下，將經標記的THP-1細胞與HAEC一起培養兩小時。以0.1%之BSA/HBSS仔細地將非貼附細胞洗去，進行三次。以螢光顯微鏡(DM IRBE；Leica)手動定量標記有Calcein-AM並貼附於HAEC上的THP-1細胞。

動物及其處理

將雄性成年C57B/6小鼠(12周齡)以腹膜內注射FANC(100nM)及/或LPS(10mg/Kg)(每一組之個體數，N=3)。經過2小時處理後，犧牲動物並收取其血清。從每隻個體取等量血清(35μL)，並將其匯集在一起，並與預先印好的抗體膜(Mouse Cytokine Array Panel A,ARY006,R&D systems,USA)共培養。檢測並定量出現在顯影膜上的正訊號。比較不同陣列上的相應訊號，以測定每組之間細胞介素的相對變化。

電子顯微鏡

針對薄片電子顯微鏡，用2.5%之戊二醛之0.1mol/L磷酸鹽緩衝液(pH 7.2)將培養細胞固定1小時。將標本放在PBS緩衝液中潤洗，後置於經磷酸鹽緩衝的氧化鋨(VIII)(1%)，以乙醇脫水並以Spurr樹脂包埋。以乙酸氧鈾 (uranyl acetate)及檸檬酸鉛(lead citrate)對薄片進行染色，接著以穿透式電子顯微鏡(型號：JEM-1200EXII,JEOL,Massachusetts,USA)檢查。

資料分析

使用單向ANOVA檢定或司徒頓的t檢定分析，並以平均值±SD表示實驗結果。當P值<0.05，則認為數據具有統計上顯著差異。

實驗例1：格形蛋白介導之胞吞作用對FANC內化作用之影響

在抑制劑預處理45分鐘(除了菲律平是處理30分鐘之外)之後，添加FANC並再繼續培養80分鐘。接著，細胞經過流式細胞儀。1A-1D圖)。在完全培養基中，鹽酸氯丙嗪以及阿米洛利，其分別抑制格形蛋白依賴性胞吞作用及巨胞飲作用，以及對FANC內化作用輕微效應之非格形蛋白胞吞作用抑制劑(包含金雀異黃酮及菲律平)(第1A圖)。然而，在血清或無血清培養基中，FANC內化作用則被鹽酸氯丙嗪阻斷(相較於FANC控制組，1%之FBS培養基下降60%，而無血清培養基下降51%；第1B圖及第1C圖)。1B and 1C).共軛焦顯微鏡顯示鹽酸氯丙嗪處理可調降點狀的螢光訊號(第1D圖之c至d小圖)。短期監測顯示，當HAEC以FANC處理15分鐘之後，FANC與格形蛋白重鏈(格形蛋白HC)發生共定位(colocalization)。在1小時之FANC培養之後，經放大及z維度影像則顯示點狀的FANC訊號增加且被格形蛋白HC訊號包覆。額外的穿透式顯微鏡則證實，FANC培養30分鐘後(500nmol/L)，在頂膜上存在被覆小窪(coated pit)結構(未示出)，這表示FANC的內化作用可由格形蛋白所介導。

實驗例2：FANC對體外發炎反應之有益效果

為了檢查可受FANC影響的細胞標記，將維持在補充有FANC之完整培養基中的細胞進行培養長達四周，且於特定時間點(第21天及第28天)以即時PCR對細胞進行評估。檢查涉及血管生成、發炎、凝血、黏著、生長以及血管舒張之內皮活性的轉錄本。結果顯示，對生長因子、黏著分子及凝血因子之調降是呈現劑量依賴形式(第2A圖及第2B圖)。可以觀察到相比於控制組(無FANC處理)，以FANC補充液(150nmol/L)培養經21天之後，減量的分子分別為VEGF，88%；ICAM-1(圖式為ICAM)：64%；VCAM-1(圖式為VCAM)：74%；P-選滯蛋白：88%；PAI-1：64%；及vWF：75%(第2A圖；*：P<0.05)。再者，以FANC補充液(150nmol/L)培養經28天之後，減量的分子分別為：VEGF：87%；ICAM-1：62%；VCAM-1：76%；P-選滯蛋白(圖式為：P-Sel)：87%；PAI-1：42%；以及vWF：62%(第2B圖；*：P<0.05)。相反地，FANC對VEGF受體、eNOS及SirT1的表現量則僅有最小的影響。

為了確定是否在發炎狀態下，FANC對黏著分子仍有如前述的影響力，以FANC處理HAEC細胞3天，接著以LPS活化隔夜，最後測量黏著分子的轉錄本表現量。可以觀察到，除了在長期處理下的衰減效應之外，FANC也可以扭轉短期以LPS誘導而過表現的黏著分子(ICAM-1及VCAM-1)之表現量(第3A圖及第3B圖)。

還進行細胞黏著測定來評估ICAM-1及VCAM-1之表現降低是否反應在白血球對內皮細胞較弱的黏著表現上。將HAEC以FANC處理3天，並以LPS隔夜活化，接著與THP-1細胞共培養1小時。THP-1細胞黏著HAEC的定量數據顯示FANC處理可導致黏著的THP-1細胞明顯減少。

除了黏著分子之外還研究FANC在內皮細胞中對發炎性細胞介素之表現的影響。為了此目的，將HAEC以FANC處理3天，然後以LPS活化處理至隔夜。培養之後分析發炎性細胞介素(IL-1β、IL-8及TNF-α)的表現量。結果顯示，前述三種分子均可顯著地被LPS調升，然而FANC處理則使此表現增量減弱(第5A圖至第5C圖)。

實驗例3：FANC對體內發炎反應之有益效果

為了闡明FANC於活體內抗發炎作用，而進行動物實驗。將成年雄性小鼠分成四組，每一組分別以腹膜內投予磷酸鹽緩衝溶液(PBS)、FANC(100nM)、LPS及FANC加上LPS(10mg/Kg)兩小時。收取每一組等量血清並加以匯集，並以抗體微陣列(ARY006,R&D systems,USA)測定促發炎及/或發炎性分子，其包含IL-1β、IL-6、IL-10、CXCL9、CXCL10、CCL3、CCL4、CCL5、CCL12、TIMP-1及TNF-α。可以觀察到，與單獨投予LPS而明顯增加的促發炎及/或發炎性分子相比，前述分子的增加，特別是IL-1β、IL-10、CCL4、CCL5及TNF-α，在小鼠中可被LPS及FANC的共同處理而減弱(第6圖)。

總結上述，本揭示內容證明DHLA塗覆之金量子團簇在體內和體外均可降低特定一些促發炎分子(例如黏著分子、凝血因子甚至發炎性細胞介素)之表現。據此，本發明包含投予DHLA塗覆之金量子團簇及/或其藥學組合物之方法可提供有效防止或治療個體免於發炎相關疾病的潛在手段。

應當理解的是，前述對實施方式的描述僅是以實施例的方式給出，且本領域所屬技術領域中具有通常知識者可進行各種修改。以上說明書、實施例及實驗結果提供本發明之例示性實施方式之結構與用途的完整描述。雖然上文實施方式中揭露了本發明的各種具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

Claims

一種粒徑為約0.1至20nm的二氫硫辛酸塗覆之金量子團簇以及一胞吞作用抑制劑用於製備用以治療經脂多醣(Lipopolysaccharides，LPS)誘導之發炎性疾病之一藥物的用途，其中，該二氫硫辛酸塗覆之金量子團簇係由複數個金奈米粒子所形成之一金量子團簇及塗覆在該複數個金奈米粒子上的複數個二氫硫辛酸所組成；該胞吞抑制劑係選自由鹽酸氯丙嗪、阿米洛利、金雀異黃酮及菲律平所組成之群組；以及該二氫硫辛酸塗覆之金量子團簇可降低個體中血管內皮生長因子1(vascular endothelial growth factor-1，VEGF-1)、細胞間黏著分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管細胞黏著蛋白-1(vascular cell adhesion protein-1，VCAM-1)、P-選滯蛋白(P-selectin)、血漿蛋白原活化因子抑制物第一型(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)、馮威里氏因子(von Willebrand factor，vWF)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、介白素-8(interleukin-8，IL-8)及/或介白素-1β(interleukin-1β，IL-1β)之表現量。
如請求項1所述之用途，其中該二氫硫辛酸塗覆之金量子團簇之粒徑為約1至2nm。
如請求項1所述之用途，其中該發炎性疾病為心血管疾病、炎症性腸病、器官移植排斥、狼瘡、自體免疫疾病、輻射誘導損傷、癌症、燒傷、創傷、風濕性疾病、腎臟疾病、過敏疾病、傳染病、眼科疾病、皮膚疾病、胃腸病、肝疾病、腦水腫、類肉瘤病、血小板減少症或脊髓損傷。
如請求項3所述之用途，其中該發炎性疾病為該心血管疾病。
如請求項4所述之用途，其中該心血管疾病為心絞痛(angina pectoris)、動脈粥狀瘤(atheroma)、動脈硬化(arteriosclerosis)、鬱血性心衰竭(congestive heart failure)、冠狀動脈心臟病(coronary heart disease)、心肌病(cardiomyopathy)、心肌梗塞(myocardial infarction)、中風、缺血性病症(ischemic condition)、缺血性心肌病(ischemic cardiomyopathy)、開放性動脈導管(patent ductus arteriosus)、高血壓、肺臟高血壓(pulmonary hypertension)、周邊動脈疾病、冠狀動脈疾病或心包炎(pericarditis)。
一種用以降低一培養細胞之一促發炎分子表現量的方法，其包含將該培養細胞與一粒徑為約0.1至20nm，且濃度為約1至1000nM之二氫硫辛酸塗覆之金量子團簇以及一胞吞作用抑制劑接觸，其中，該二氫硫辛酸塗覆之金量子團簇係由複數個金奈米粒子所形成之一金量子團簇及塗覆在該複數個金奈米粒子上的複數個二氫硫辛酸所組成；該胞吞作用抑制劑係選自由鹽酸氯丙嗪、阿米洛利、金雀異黃酮及菲律平所組成之群組；以及該促發炎分子係選自由血管內皮生長因子1、細胞間黏著分子1、血管細胞黏著蛋白-1、P-選滯蛋白、血漿蛋白原活化因子抑制物第一型、馮威里氏因子、腫瘤壞死因子α、介白素-8及介白素-1β所組成之群組。
如請求項6所述之方法，其中該二氫硫辛酸塗覆之金量子團簇之粒徑為約1至2nm。
如請求項6所述之方法，其中該培養細胞係選自由人類主動脈內皮細胞(human aortic endothelial cell，HAEC)、人類上皮細胞、人類冠狀動脈內皮細胞(human coronary artery endothelial cell，HCAEC)以及人類內皮前驅細胞(human endothelial progenitor cell，HEPC)所組成之群組。