TWI723482B - 促進富含血小板血漿釋放生長因子之方法 - Google Patents
促進富含血小板血漿釋放生長因子之方法 Download PDFInfo
- Publication number
- TWI723482B TWI723482B TW108127201A TW108127201A TWI723482B TW I723482 B TWI723482 B TW I723482B TW 108127201 A TW108127201 A TW 108127201A TW 108127201 A TW108127201 A TW 108127201A TW I723482 B TWI723482 B TW I723482B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- platelet
- rich plasma
- growth factors
- prp
- tetrahydropyrimidine
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一種促進富含血小板血漿(PRP)釋放生長因子之方法，其中該活化試劑為一四氫嘧啶(Ectoine)，係可刺激提高富含血小板血漿(PRP)釋放生長因子，並且維持生長因子的功能。
Description
本發明有關一促進富含血小板血漿(PRP)釋放生長因子之方法，其中該活化試劑為四氫嘧啶(Ectoine)，可提高富含血小板血漿(PRP)所釋放的生長因子。
血小板(platelet)具有凝血、止血等功能，當血管受創時，血小板特有的胞器α顆粒(α granule)，會被活化釋放出內含物，如凝血因子(von Willebrand factor)及纖維蛋白原(fibrinogen)等。這些內含物可促使血小板附著在血管壁上並且聚集，達成初步的止血。
富含血小板血漿(Platelet-Rich Plasma，簡稱PRP)，又被稱為高濃度血漿，是將血液經由離心與純化之後，取出高濃度的血小板，再加入如氯化鈣(CaCl2)等活化試劑來激發，在pH值為6.5~6.7的環境下，可刺激生成大量且高濃度的生長因數(PDGF、TGF-β、FGF、VEGF、EGF等)，可幫助人體組織加速恢復。因為是抽取自自己本身血液，所以沒有排斥、過敏、感染、或是激發自身腫瘤等問題。是各種抗衰老、創口癒合等以組織再生為目的的療法中的尖端療法。
習知添加到富含血小板血漿(PRP)中的活化試劑，除了氯化鈣外，還有膠原蛋白(Collagen)、凝血酶(Thrombin)以及海藻醣(Trehalose)。
其中氯化鈣為該等活化試劑中，刺激富含血小板血漿(PRP)釋放生長因子活化率最低且功率不佳的一種活化試劑；反觀膠原蛋白、凝血酶與海藻醣雖然活化率與功率都高於氯化鈣，但是該等活化試劑分子量大、分子成分不明、結構以及提煉方式複雜，所須價格昂貴。
四氫嘧啶(Ectoine，1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylic acid)是一種可從發酵產得之天然分子，在高濃度的嗜鹽性微生物中發現，在水中的溶解度很高。其化學結構上屬於一環狀胺基酸，與水1：1鍵結時，四氫嘧啶以COO基團的氧原子和NH基的氫原子與水形成氫鍵，研究証實四氫嘧啶(Ectoine)可以與四個以上的水分子水解溶化。四氫嘧啶是可作為一種相容性溶質(compatible solute)，其具調節微生物於高鹽環境以平衡細胞內外滲透壓之能力，為極佳之滲透壓調解因子(osmotic pressure regulator)，並賦予對鹽和溫度應力。具有保護及穩定細胞的功能，為公認之相容性溶質和微生物應力防護劑(stress protectant)，由於其對細胞的保護功能使之被廣泛應用於各種工業生產中。
申請人有鑑於對於習知添加至富含血小板血漿(PRP)中的活化試劑之缺失，乃發明一種價格實惠，分子結構明確，而且可有效提高釋放生長因子活化率及功率之活化試劑，用以改善習用之缺失。
本發明之目的，在於提供一種促進富含血小板血漿(PRP)釋放生長因子之活化試劑，可取代現有活化試劑，又可維持生長因子的功能。
為達上述之目的，本發明之技術手段在於：在萃取出的富含血小板血漿(PRP)中添加一天然分子活化試劑之四氫嘧啶(Ectoine)進行活化，以刺激富含血小板血漿(PRP)釋放生長因子，產生並維持該等因子的生理活性，進一步可將其生長因子應用於細胞培養、醫療或美容等行業。
FBS:胎牛血清
EGF:表皮細胞生長因子
bFGF:成纖維細胞生長因子
TGF-β:乙型轉化生長因子
α-MHC:α-黑色素細胞刺激素
PRP:被四氫嘧啶活化的富含血小板血漿
第1圖為添加本發明之活化試劑四氫嘧啶在不同添加量，其富含血小板血漿(PRP)生長因子活化率。
第2圖為本發明之活化試劑四氫嘧啶與習知活化試劑比較圖。
第3A-3B圖為實施例一中添加本發明之活化試劑四氫嘧啶所產生的生長因子功能測試。
第4圖為實施例二中添加本發明之活化試劑四氫嘧啶所產生的生長因子功能測試。
第5圖為實施例三中添加本發明之活化試劑四氫嘧啶所產生的生長因子功能測試。
第6圖為實施例四中添加本發明之活化試劑四氫嘧啶所產生的生長因子功能測試。
為便於 貴審查委員對本案有更進一步的認識與瞭解，茲舉實施例配合圖式，詳細說明如下。
首先，取得富含血小板血漿(PRP)，取得富含血小板血漿(PRP)的方法為習知技術，不限於本實施例所述之方式。步驟如下：將一全血樣本(本發明使用的是豬的血液)，以10：1加入抗凝血劑(檸檬酸葡萄糖(ACDA)溶液)，進行抗凝血。接著以1700g轉速離心10分鐘。離心後的全血樣本會分為上層：血漿以及下層：紅血球、白血球等。分離紅血球及白血球，收取上層的血漿後，以每分鐘2,000~5,000g的轉速離心10分鐘，經過前述步驟後，前述產物上層液會成為層狀樣態，其中間層主要包含富含血小板血漿(PRP)。根據測量，以前述步驟所取得之中間層所包含的血小板濃度可達500k/μl以上。
活化富含血小板血漿(PRP)：在富含血小板血漿(PRP)中以1：1加入活化試劑進行混和，在37℃水浴中震盪30分鐘，接著在56℃加熱30分鐘，最後離心15000g，10分鐘後收集上清液，並通過0.22μm過濾消毒。接著將過濾後的產物在減壓下進行冷凍乾燥，去除任何水分進行保存。該活化試劑可造成中層液裡的血小板破裂，並釋出α顆粒。這些α顆粒內含多樣的生長因子，例如，但不限於乙型轉化生長因子(Transforming Growth Factor Beta，簡稱TGF-β)、血小板衍生生長因子-AB(latelet-derived growth factor，簡稱PDGF-AB)、表皮細胞生長因子(Epidermal growth factor，簡稱EGF)、血管內皮生長因子(英文：vascular endothelial growth factor，簡稱VEGF)、角質細胞生長因子(Keratinocyte Growth Factor，簡稱KGF)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factors -1，
簡稱IGF)等，以及多樣的細胞貼附性因子，例如，但不限於纖維蛋白(fibrin)、纖維結合素(fibronectin)、玻連蛋白(vitronectin)等。其中生長因子TGF-β、PDGF-AB、EGF、VEGF、KGF及IGF為富含血小板血漿(PRP)所釋放的生長因子中含量最多的成分，因此做為本發明之活化試劑的功效測試基準，並進行與習知試劑的效能比較。
請參閱第1圖所示，本發明之活化試劑四氫嘧啶(Ectoine)添加量從0.1g/L~5.0g/L，其中到1g/L時，生長因子含量皆非常豐富。
接著將四氫嘧啶(Ectoine)(1g/L)與其他習知活化試劑進行比較，比較在該等活化劑刺激下前述6種生長因子釋放的程度。其中習知活化試劑為膠原蛋白(1mg/ml)、氯化鈣(1g/l)、凝血酶(10U/ml)以及海藻醣(100mM)。
請參閱第2圖所示，相比本發明之四氫嘧啶(Ectoine)活化試劑在功率上皆優於最常使用的氯化鈣，對於生長因子PDGF-AB、EGF、VEGF、KGF及IGF的產生量也高於其他活化試劑。顯示四氫嘧啶(Ectoine)確實可做為刺激富含血小板血漿(PRP)的活化試劑，並且提高誘導大量生長因子的釋放量。
接下來，該等實施例係利用被四氫嘧啶(Ectoine)活化的富含血小板血漿(PRP)培養不同細胞取代培養基中的動物血清(胎牛血清，FBS)，並測試在不同添加劑量下培養後，該等細胞是否具有正常生理機能。其中被四氫嘧啶(Ectoine)活化的富含血小板血漿(PRP)的添加量為體積百分比1%至25%，最佳為1.25%至20%，本發明係以在3ml培養基或去離子水中添加40mg被四氫嘧啶(Ectoine)活化的富含血小板血漿(PRP)的比例進行後續實驗。
實施例一、纖維母細胞
本實施例中對照組為傳統添加了10%胎牛血清以及100μg/ml表面生長因子(EGF)的培養基。請參閱第3A圖所示，被四氫嘧啶(Ectoine)活化的富含血小板血漿(PRP)取代動物血清所培養出來的纖維細胞生長狀況優於對照組。
請參閱第3B圖所示，分析纖維母細胞所分泌的膠原蛋白以及纖連蛋白的量，其結果顯示，被四氫嘧啶(Ectoine)活化的富含血小板血漿(PRP)取代動物血清組別膠原蛋白與纖連蛋白量都高於對照組，或是添加表皮生長因子卻無添加動物血清的培養基。由此顯示，被四氫嘧啶(Ectoine)活化的富含血小板血漿(PRP)取代動物血清，不會破壞細胞的生長以及正常功能。
實施例二、毛囊細胞
本實施例使用的是毛囊細胞，對照組為添加10%胎牛血清以及1ng/ml的成纖維細胞生長因子(bFGF)，請參閱第4圖所示，隨著被四氫嘧啶(Ectoine)活化的富含血小板血漿(PRP)量增加，細胞生長狀況越佳。
實施例三、角質細胞
TGF-β會抑制角質細胞的生長，被四氫嘧啶(Ectoine)活化的富含血小板血漿(PRP)中有TGF-β產生；而對照組為添加10ng/ml TGF-β的培養基。請參閱第5圖所示，隨著被四氫嘧啶(Ectoine)活化的富含血小板血漿(PRP)量的增加，角質細胞生長下降。
實施例四、黑色素細胞
α-黑色素細胞刺激素(melanocyte-stimulating hormones,melanotropins,intermedins，簡稱α-MSH)是一種會刺激黑色素生成的激素，本實施例在2x104的黑色素細胞中添加100ng/ml的α-MSH，刺激黑色素生成。對照組
為添加0.5mg/ml的麴酸(kojic acid)，其中酪胺酸酶(tyrosinase)是形成黑色素的酵素，其作用需要銅離子協助。麴酸可螯合銅離子，所以可抑制酪胺酸酶的作用，進而阻斷黑色素的形成，所以具有皮膚美白的效果，而麴酸也是一種習知美白成分。
請參閱圖6所示，隨著濃度增加，被四氫嘧啶(Ectoine)活化的富含血小板血漿(PRP)可以有效抑制黑色素的生成。
綜上所述，被四氫嘧啶(Ectoine)活化的富含血小板血漿(PRP)作為替代動物血清的培養基不會影響細胞生長、活性及其功能。
藉由以上較佳具體實施例之詳述，係希望能更加清楚描述本發明之特徵與精神，而並非以上述所揭露的較佳具體實施例來對本發明之範疇加以限制。相反地，其目的是希望能涵蓋各種改變及具相等性的安排於本發明所欲申請之專利範圍的範疇內。
Claims (2)
- 一種促進富含血小板血漿釋放生長因子之方法，包含下列步驟：(a)取一全血樣本，並且將該全血樣本離心；(b)收集經步驟(a)離心後之一上層液，並將該上層液離心；(c)收集經步驟(b)離心後之一中層液，將一活化試劑與該中層液混合形成一混合液，並將該混合液離心；(d)收集經步驟(c)離心後之一上清液，並過濾該上清液，以獲得含有該富含血小板血漿；其特徵在於，該活化試劑為一天然分子之四氫嘧啶(Ectoine)，濃度為0.1g/L至5.0g/L。
- 如請求項1所述之促進富含血小板血漿(PRP)釋放生長因子之方法，其中該四氫嘧啶(Ectoine)添加的濃度最佳為1g/L。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW108127201A TWI723482B (zh) | 2019-07-31 | 2019-07-31 | 促進富含血小板血漿釋放生長因子之方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW108127201A TWI723482B (zh) | 2019-07-31 | 2019-07-31 | 促進富含血小板血漿釋放生長因子之方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW202106331A TW202106331A (zh) | 2021-02-16 |
| TWI723482B true TWI723482B (zh) | 2021-04-01 |
Family
ID=75745219
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW108127201A TWI723482B (zh) | 2019-07-31 | 2019-07-31 | 促進富含血小板血漿釋放生長因子之方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| TW (1) | TWI723482B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107252427A (zh) * | 2012-07-09 | 2017-10-17 | 比托普股份公司 | 用于促进损伤的身体组织再生的包含活性物质的组合物 |
-
2019
- 2019-07-31 TW TW108127201A patent/TWI723482B/zh active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107252427A (zh) * | 2012-07-09 | 2017-10-17 | 比托普股份公司 | 用于促进损伤的身体组织再生的包含活性物质的组合物 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Yao, Chao-Ling, et al. "Inhibitory effect of ectoine on melanogenesis in B16-F0 and A2058 melanoma cell lines." Biochemical engineering journal 78 (2013): 163-169. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW202106331A (zh) | 2021-02-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11957733B2 (en) | Treatment of collagen defects using protein solutions | |
| US20180099026A1 (en) | Treatment of peripheral vascular disease using protein solutions | |
| US10143725B2 (en) | Treatment of pain using protein solutions | |
| US9011846B2 (en) | Thrombin isolated from blood and blood fractions | |
| CN112111451B (zh) | 提高干细胞细胞因子产量的方法 | |
| US20190290690A1 (en) | Compositions comprising adjustable concentrations of growth factors derived from blood serum and clot hypoxia-conditioned medium and methods of their production | |
| US9663761B2 (en) | Use of annelid haemoglobin for maintaining stem cells in the undifferentiated state | |
| TWI723482B (zh) | 促進富含血小板血漿釋放生長因子之方法 | |
| CN112409456B (zh) | 干细胞细胞因子在制备化妆品或药物中的用途 | |
| CN110042139A (zh) | 一种动物血活性复合肽的制备方法及其应用 | |
| EP2279014B1 (en) | Extracellular matrix comprising platelet factors | |
| JP4832515B2 (ja) | 創傷治癒用の組成物及びその使用 | |
| KR101313755B1 (ko) | 상피조직 또는 피하조직 재생용 자가혈장의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물 | |
| WO2013039411A1 (en) | Autologous and allogenic fibrin carrier, method of obtaining thereof and use of a fibrin carrier for transplantation of cells, particularly human cells | |
| WO2004024198A1 (en) | Activator for forming platelet gel, platelet poor plasma gel or platelet rich plasma gel | |
| CN114887123B (zh) | 水蛭素接枝纳米纤维血管支架材料、制备方法与应用 | |
| Kalra et al. | Platelet-rich plasma (PRP) for hair | |
| JP2008109866A (ja) | 培地添加剤、この培地添加剤を含む培地、及びこの培地を用いた細胞の培養方法 | |
| CN114099544A (zh) | 一种自体静脉血细胞激活剂的制备方法 | |
| TWI399212B (zh) | 一種治療傷口的組合物及其用途 | |
| CN113573718A (zh) | 用于获得和保存高纯度生长因子的方法及其用途 | |
| CN112618409A (zh) | 一种基于端粒酶技术的细胞活化再生营养素 | |
| CN113893330A (zh) | 启动细胞基因血清因子用于修复器官皮肤 |