TWI723220B

TWI723220B - 一種新的pd-1單株抗體

Info

Publication number: TWI723220B
Application number: TW106131841A
Authority: TW
Inventors: 鄭勇; 竟李; 根納迪戈洛洛波夫; 李棟; 徐建清; 卓智王
Original assignee: 中國大陸商基石藥業（蘇州）有限公司; 中國大陸商拓石藥業（上海）有限公司; 英商基石藥業
Priority date: 2016-09-21
Filing date: 2017-09-15
Publication date: 2021-04-01
Also published as: CN107840887A; TW201825516A; CN114456269A; CN107840887B

Abstract

本發明提供PD-1之單株抗體，特別係PD-1人單株抗體，該抗體以高親和力特異性結合於PD-1並且包括重鏈及輕鏈。本發明亦提供了編碼本發明抗體之核酸序列、選殖或表現載體、宿主細胞、用於表現或分離抗體的方法、包含本發明之抗體的免疫共軛物及治療組合物。本發明進一步提供PD-1抗體治療各種癌症的用途。

Description

一種新的PD-1單株抗體

本發明主要係關於PD-1單株抗體及其組合物，以及使用抗PD-1抗體對人類疾病的免疫治療。

愈來愈多的臨床前及臨床結果的證據表明，靶向免疫核查點正在成為最有希望治療癌症患者的方法。程序性細胞死亡分子1 (PD-1)其為與CD28具有同源性的免疫球蛋白超家族的抑制性成員，在活化的B細胞、T細胞及骨髓細胞中表現(Agata et al, supra; Okazaki et al (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8 )並在調節免疫系統中的激活及抑制信號中發揮重要作用(Okazaki, Taku et al. 2007 International Immunology 19:813-824 )。事實上，PD-1係在凋亡細胞的差異表現篩選中被發現的(Ishida et al (1992) EMBO J 11:3887-95 )。 PD-1的結構為單體I型跨膜蛋白，屬於Ig基因超家族(Agata et al. (1996) bit Immunol 8:765-72 )，其由一個免疫球蛋白可變區樣細胞外結構域及含有免疫受體酪胺酸抑制基序(ITIM)及免疫受體酪胺酸轉換基序(ITSM)的細胞質結構域組成。儘管與CTLA-4的結構相似，但PD-1缺少與B7-1及B7-2結合的MYPPPY基序。PD-1有兩個已知的配體，PD-L1 (B7-H1、CD274)及PD-L2 (B7-DC、CD273)，該兩個配體係表現在細胞表面的B7家族成員(Freeman et al (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al (2002) Eur J Immunol 32:634-43 )。與B7同源的PD-Ll及PD-L2結合於PD-1，但卻不結合其他的CD28家族成員。 PD-1，作為免疫核查點蛋白之一，係CD28具有同源性的免疫球蛋白超家族的抑制性成員，在活化的B細胞、T細胞及骨髓細胞中表現(Agata et al, supra; Okazaki et al. (2002) Curr Opin Immunol 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8 )，並且在限制T細胞激活中發揮重要作用，其為腫瘤細胞逃脫免疫監視提供了重要的免疫抗病機制。PD-1的誘導T細胞無反應性或無反應的狀態，從而導致在細胞內暫時無法產生最佳水平的效應細胞因子。PD-1亦可藉由其抑制生存信號的能力誘導T細胞的細胞凋亡。PD-1缺陷動物形成各種自身免疫表型，包括自身免疫性心肌病及關節炎及腎炎狼瘡樣綜合症(Nishimura et al. (1999) Immunity 11:141-51; Nishimura et al. (2001) Science 291:319-22 )。此外，已經發現PD-1在自身免疫性腦脊髓炎、全身性紅斑狼瘡、移植物抗宿主病(GVHD)、I型糖尿病及類風濕性關節炎中具有重要作用(Salama et al. (2003) J Exp Med 198:71-78: Prokunina and Alarcon-Riquelme (2004) Hum MoI Genet 13:R143; Nielsen et al. (2004) Lupus 11:510) 。在小鼠的B細胞腫瘤系，PD-1的ITSM被證明對於阻斷BCR介導的Ca²⁺ -flux及酪胺酸下游效應分子的磷酸化係必不可少的(Okazaki et al. (2001) PNAS 98: 13866-71 )。表現在活化的T細胞上PD-1及表現在腫瘤細胞上的PD-L1之間的相互作用，會負調節免疫反應並減少抗腫瘤免疫力。PD-L1表現在多種人類癌症中(Dong et al (2002) Nat. Med 8:787-9 )。在食管癌、胰腺癌及其他類型的癌症中，PD-L1在腫瘤中的表現與生存期降低相關，突出說明該途徑係腫瘤免疫治療中有希望的新靶點。一些研究組已表明，PD-1-PD-L相互作用會惡化疾病，導致腫瘤浸潤淋巴細胞的減少、T細胞受體介導的增殖的減少及癌性細胞的免疫逃避(Dong et al. (2003) J. MoI. Med. 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100 )。藉由抑制PD-L1及PD-1的局部相互作用可使免疫抑制逆轉，PD-1與PD-L2的相互作用被阻斷時，其效果累積。製藥公司已經開發了多種針對PD-1/PD-L1通路的藥物，如百時美施貴寶公司(BMS)、默克公司、羅氏公司及葛蘭素史克公司(GSK)等。臨床試驗的數據顯示了在各種腫瘤類型的患者中持久的臨床活性及良好的安全性的早期證據。目前，國際上已批准了3個針對PD-1/PD-L1通路的抗體藥物，分別係BMS的Nivolumab、默克的Pembrolizumab以及羅氏的Atezolizumab。Nivolumab係BMS開發的抗PD-1藥物，其正在被投入至下一代領域的中心階段。目前在6個後期研究中，在研究的5個癌症組中的3個中，治療促使了腫瘤的縮小，其中包括72例肺癌患者中的18%、98例黑色素瘤患者中的接近三分之一及33例腎癌患者中的27%。由默克公司研製的Pembrolizumab係全人源單株IgG4抗體，其作用於PD-1，其在針對皮膚癌獲得的令人印象深刻的IB數據達到了FDA的新突破指標。階段性IB研究的結果顯示在85例癌症患者中有51%的抗腫瘤反應，9%得到完全響應。同時，Pembrolizumab在頭頸癌、胃癌及尿路上皮癌患者中的總反應率分別為21.4%、22.2%及27.6%。羅氏的Atezolizumab係作用於PD-L1的全人源單株IgG1抗體，研究證明其在140例攜帶各種大小的腫瘤的晚期癌症患者中縮小了29例(21%)患者的腫瘤，且在腫瘤細胞表面高表現PD-L1的晚期尿路上皮癌患者中顯示出了較高的腫瘤抑制效果(27%)。現有的治療方法並非均係盡如人意的。大部分PD-1抗體藥物與小鼠PD-1蛋白並無結合，其限制了抗體藥物在臨床前的動物實驗中的應用，而且由於其抗體序列大多來源於對小鼠的免疫，嚴重的免疫原性反應降低了抗體藥物用於人體的治療效果。與小鼠PD-1具有交叉反應性的人源化抗體克服了此等缺點，並且在活體內表現更好的耐受性及更高的有效性。因此，仍需要新型抗PD-1的抗體。

本發明提供了分離的抗體，特別係單株抗體或人單株抗體。在一態樣中，本發明提供了一種抗體或其抗原結合片段，其結合於PD-1的一個表位，該表位包含：SEQ ID NO﹕24上第128、129、130、131及132位點胺基酸及第35、64、82、83位中至少一個胺基酸。本發明亦提供了一種抗體或其抗原結合片段，其結合於人PD-1及鼠PD-1的一個表位，其中，該表位包括SEQ ID NO﹕24上第128、129、130、131及132位點胺基酸。如上之抗體或其抗原結合片段，其中鼠PD-1係小鼠或大鼠PD-1。在一些實施中，在上述抗體或其抗原結合片段中，該抗體 a)結合於人PD-1，K_D 為2.15E-10 M以下；及 b)結合於鼠PD-1，K_D 為1.67E-08 M以下。在一些實施中，上述抗體具有下列性質中的至少一種： a)結合於人PD-1，K_D 為4.32E-10 M至2.15E-10 M，並且結合於小鼠PD-1，K_D 為5.39E-08 M至1.67E-08 M； b)實質上不結合於人CD28、CTLA-4； c)增加T細胞的增殖； d)增加干擾素-γ的產生；或 e)增加白細胞介素-2的分泌。本發明提供了一種抗體或其抗原結合片段，其包含一個胺基酸序列，該胺基酸序列與選自由SEQ ID NO﹕1、SEQ ID NO﹕2、SEQ ID NO﹕3、SEQ ID NO﹕4、SEQ ID NO﹕5、SEQ ID NO﹕6、SEQ ID NO﹕7、SEQ ID NO﹕8及SEQ ID NO﹕9所組成的群組中的序列具有至少70%、80%、90%或95%的同源性，其中該抗體特異性結合PD-1。本發明提供了一種抗體或其抗原結合片段，其包含一個胺基酸序列，該胺基酸序列選自由SEQ ID NO﹕1、SEQ ID NO﹕2、SEQ ID NO﹕3、SEQ ID NO﹕4、SEQ ID NO﹕5、SEQ ID NO﹕6、SEQ ID NO﹕7、SEQ ID NO﹕8及SEQ ID NO﹕9所組成的群組中的序列，其中該抗體特異性結合PD-1。本發明提供了一種抗體，或其抗原結合片段，包含： a)重鏈可變區，其胺基酸序列與選自由SEQ ID NO﹕1及SEQ ID NO﹕2所組成的群組中的序列具有至少70%、80%、90%或95%的同源性；以及 b)輕鏈可變區，其胺基酸序列與選自由SEQ ID NO﹕3、SEQ ID NO﹕4、SEQ ID NO﹕5、SEQ ID NO﹕6、SEQ ID NO﹕7、SEQ ID NO﹕8及SEQ ID NO﹕9所組成的群組中的序列具有至少70%、80%、90%或95%的同源性，其中該抗體特異性結合PD-1。本發明提供了一種抗體或其抗原結合片段，包含： a)重鏈可變區，其胺基酸序列選自由SEQ ID NO﹕1及SEQ ID NO﹕2組成的組中的序列；以及 b)輕鏈可變區，其胺基酸序列選自由SEQ ID NO﹕3、SEQ ID NO﹕4、SEQ ID NO﹕5、SEQ ID NO﹕6、SEQ ID NO﹕7、SEQ ID NO﹕8及SEQ ID NO﹕9所組成的群組中的序列，其中該抗體特異性結合PD-1。在一些具體實施中，該抗體包含： a)重鏈可變區，其胺基酸序列選自SEQ ID NO﹕1所示的序列；以及 b)輕鏈可變區，其胺基酸序列選自SEQ ID NO﹕3所示的序列，其中該抗體特異性結合PD-1。或在一些具體實施中，該抗體包含： a)重鏈可變區，其胺基酸序列選自SEQ ID NO﹕2所示的序列；以及 b)輕鏈可變區，其胺基酸序列選自SEQ ID NO﹕3所示的序列，其中該抗體特異性結合PD-1。或在一些具體實施中，該抗體其包含： a)重鏈可變區，其胺基酸序列選自SEQ ID NO﹕2所示的序列；以及 b)輕鏈可變區，其胺基酸序列選自SEQ ID NO﹕4所示的序列，其中該抗體特異性結合PD-1。或在一些具體實施中，該抗體包含： a)重鏈可變區，其胺基酸序列選自SEQ ID NO﹕2所示的序列；以及 b)輕鏈可變區，其胺基酸序列選自SEQ ID NO﹕5所示的序列，其中該抗體特異性結合PD-1。或在一些具體實施中，該抗體包含： a)重鏈可變區，其胺基酸序列選自SEQ ID NO﹕1所示的序列；以及 b)輕鏈可變區，其胺基酸序列選自SEQ ID NO﹕6所示的序列，其中該抗體特異性結合PD-1。或在一些具體實施中，該抗體包含： a)重鏈可變區，其胺基酸序列選自SEQ ID NO﹕1所示的序列；以及 b)輕鏈可變區，其胺基酸序列選自SEQ ID NO﹕5所示的序列，其中該抗體特異性結合PD-1。或在一些具體實施中，該抗體包含： a)重鏈可變區，其胺基酸序列選自SEQ ID NO﹕2所示的序列；以及 b)輕鏈可變區，其胺基酸序列選自SEQ ID NO﹕6所示的序列，其中該抗體特異性結合PD-1。或在一些具體實施中，該抗體包含： a)重鏈可變區，其胺基酸序列選自SEQ ID NO﹕2所示的序列；以及 b)輕鏈可變區，其胺基酸序列選自SEQ ID NO﹕7所示的序列，其中該抗體特異性結合PD-1。或在一些具體實施中，該抗體包含： a)重鏈可變區，其胺基酸序列選自SEQ ID NO﹕1所示的序列；以及 b)輕鏈可變區，其胺基酸序列選自SEQ ID NO﹕8所示的序列，其中該抗體特異性結合PD-1。或在一些具體實施中，該抗體包含： a)重鏈可變區，其胺基酸序列選自SEQ ID NO﹕2所示的序列；以及 b)輕鏈可變區，其胺基酸序列選自SEQ ID NO﹕9所示的序列，其中該抗體特異性結合PD-1。具體序列詳見表1及序清單資訊：表1 抗體的重鏈、輕鏈具體序列

在另一態樣中，本發明提供了一種抗體或其抗原結合片段，包含互補決定區(CDR)，其胺基酸序列選自由SEQ ID NO﹕10至SEQ ID NO﹕23所組成的群組中的序列，其中該抗體特異性結合PD-1。在另一態樣中，本發明提供了一種抗體或其抗原結合片段，其包含：包含CDR1，CDR2及CDR3序列的重鏈可變區；以及包含CDR1，CDR2及CDR3序列的輕鏈可變區，其中重鏈可變區CDR3序列包含選自由SEQ ID NO﹕12及SEQ ID NO﹕13所組成的群組中的胺基酸序列及其保守性修飾，其中該抗體特異性結合PD-1。上述抗體的輕鏈可變區CDR3序列較佳包含選自由SEQ ID NO﹕20、SEQ ID NO﹕21、SEQ ID NO﹕22及SEQ ID NO﹕23所組成的群組中的胺基酸序列及其保守性修飾。上述抗體的重鏈可變區CDR2序列較佳包含選自由SEQ ID NO﹕11所組成的群組中的胺基酸序列及其保守性修飾。上述抗體的輕鏈可變區CDR2序列較佳包含選自由SEQ ID NO﹕19所組成的群組中的胺基酸序列及其保守性修飾。上述抗體的重鏈可變區CDR1序列較佳包含選自由SEQ ID NO﹕10所組成的群組中的胺基酸序列及其保守性修飾。上述抗體的輕鏈可變區CDR1序列較佳包含選自由SEQ ID NO﹕14、SEQ ID NO﹕15、SEQ ID NO﹕16、SEQ ID NO﹕17及SEQ ID NO﹕18所組成的群組中的胺基酸序列及其保守性修飾。在一些具體實施中，該抗體或其抗原結合片段包含：包含CDR1、CDR2及CDR3序列的重鏈可變區；以及包含CDR1、CDR2及CDR3序列的輕鏈可變區，其中 a)重鏈可變區CDR1，其序列包含選自SEQ ID NO﹕10所示的胺基酸序列， b)重鏈可變區CDR2，其序列包含選自SEQ ID NO﹕11所示的胺基酸序列， c)重鏈可變區CDR3，其序列包含選自由SEQ ID NO﹕12及SEQ ID NO﹕13所組成的群組中所示的胺基酸序列， d)輕鏈可變區CDR1，其序列包含選自由SEQ ID NO﹕14至SEQ ID NO﹕18所組成的群組中所示的胺基酸序列， e)輕鏈可變區CDR2，其序列包含選自SEQ ID NO﹕19所示的胺基酸序列， f)輕鏈可變區CDR3，其序列包含選自由SEQ ID NO﹕20至SEQ ID NO﹕23所組成的群組中所示的胺基酸序列，其中該抗體特異性結合PD-1。在一些具體實施中，該抗體包含： a)重鏈可變區CDR1，其序列包含選自SEQ ID NO﹕10所示的胺基酸序列， b)重鏈可變區CDR2，其序列包含選自SEQ ID NO﹕11所示的胺基酸序列， c)重鏈可變區CDR3，其序列包含選自SEQ ID NO﹕12所示的胺基酸序列， d)輕鏈可變區CDR1，其序列包含選自SEQ ID NO﹕14所示的胺基酸序列， e)輕鏈可變區CDR2，其序列包含選自SEQ ID NO﹕19所示的胺基酸序列， f)輕鏈可變區CDR3，其序列包含選自SEQ ID NO﹕20所示的胺基酸序列，其中該抗體特異性結合PD-1。在一些具體實施中，該抗體包含： a)重鏈可變區CDR1，其序列包含選自SEQ ID NO﹕10所示的胺基酸序列， b)重鏈可變區CDR2，其序列包含選自SEQ ID NO﹕11所示的胺基酸序列， c)重鏈可變區CDR3，其序列包含選自SEQ ID NO﹕13所示的胺基酸序列， d)輕鏈可變區CDR1，其序列包含選自SEQ ID NO﹕14所示的胺基酸序列， e)輕鏈可變區CDR2，其序列包含選自SEQ ID NO﹕19所示的胺基酸序列， f)輕鏈可變區CDR3，其序列包含選自SEQ ID NO﹕21所示的胺基酸序列，其中該抗體特異性結合PD-1。在一些具體實施中，該抗體包含： a)重鏈可變區CDR1，其序列包含選自SEQ ID NO﹕10所示的胺基酸序列， b)重鏈可變區CDR2，其序列包含選自SEQ ID NO﹕11所示的胺基酸序列， c)重鏈可變區CDR3，其序列包含選自SEQ ID NO﹕13所示的胺基酸序列， d)輕鏈可變區CDR1，其序列包含選自SEQ ID NO﹕15所示的胺基酸序列， e)輕鏈可變區CDR2，其序列包含選自SEQ ID NO﹕19所示的胺基酸序列， f)輕鏈可變區CDR3，其序列包含選自SEQ ID NO﹕21所示的胺基酸序列，其中該抗體特異性結合PD-1。在一些具體實施中，該抗體包含： a)重鏈可變區CDR1，其序列包含選自SEQ ID NO﹕10所示的胺基酸序列， b)重鏈可變區CDR2，其序列包含選自SEQ ID NO﹕11所示的胺基酸序列， c)重鏈可變區CDR3，其序列包含選自SEQ ID NO﹕13所示的胺基酸序列， d)輕鏈可變區CDR1，其序列包含選自SEQ ID NO﹕16所示的胺基酸序列， e)輕鏈可變區CDR2，其序列包含選自SEQ ID NO﹕19所示的胺基酸序列， f)輕鏈可變區CDR3，其序列包含選自SEQ ID NO﹕21所示的胺基酸序列，其中該抗體特異性結合PD-1。在一些具體實施中，該抗體包含： a)重鏈可變區CDR1，其序列包含選自SEQ ID NO﹕10所示的胺基酸序列， b)重鏈可變區CDR2，其序列包含選自SEQ ID NO﹕11所示的胺基酸序列， c)重鏈可變區CDR3，其序列包含選自SEQ ID NO﹕12所示的胺基酸序列， d)輕鏈可變區CDR1，其序列包含選自SEQ ID NO﹕17所示的胺基酸序列， e)輕鏈可變區CDR2，其序列包含選自SEQ ID NO﹕19所示的胺基酸序列， f)輕鏈可變區CDR3，其序列包含選自SEQ ID NO﹕21所示的胺基酸序列，其中該抗體特異性結合PD-1。在一些具體實施中，該抗體包含： a)重鏈可變區CDR1，其序列包含選自SEQ ID NO﹕10所示的胺基酸序列， b)重鏈可變區CDR2，其序列包含選自SEQ ID NO﹕11所示的胺基酸序列， c)重鏈可變區CDR3，其序列包含選自SEQ ID NO﹕12所示的胺基酸序列， d)輕鏈可變區CDR1，其序列包含選自SEQ ID NO﹕16所示的胺基酸序列， e)輕鏈可變區CDR2，其序列包含選自SEQ ID NO﹕19所示的胺基酸序列， f)輕鏈可變區CDR3，其序列包含選自SEQ ID NO﹕21所示的胺基酸序列，其中該抗體特異性結合PD-1。在一些具體實施中，該抗體包含： a)重鏈可變區CDR1，其序列包含選自SEQ ID NO﹕10所示的胺基酸序列， b)重鏈可變區CDR2，其序列包含選自SEQ ID NO﹕11所示的胺基酸序列， c)重鏈可變區CDR3，其序列包含選自SEQ ID NO﹕13所示的胺基酸序列， d)輕鏈可變區CDR1，其序列包含選自SEQ ID NO﹕17所示的胺基酸序列， e)輕鏈可變區CDR2，其序列包含選自SEQ ID NO﹕19所示的胺基酸序列， f)輕鏈可變區CDR3，其序列包含選自SEQ ID NO﹕21所示的胺基酸序列，其中該抗體特異性結合PD-1。在一些具體實施中，該抗體包含： a)重鏈可變區CDR1，其序列包含選自SEQ ID NO﹕10所示的胺基酸序列， b)重鏈可變區CDR2，其序列包含選自SEQ ID NO﹕11所示的胺基酸序列， c)重鏈可變區CDR3，其序列包含選自SEQ ID NO﹕13所示的胺基酸序列， d)輕鏈可變區CDR1，其序列包含選自SEQ ID NO﹕17所示的胺基酸序列， e)輕鏈可變區CDR2，其序列包含選自SEQ ID NO﹕19所示的胺基酸序列， f)輕鏈可變區CDR3，其序列包含選自SEQ ID NO﹕22所示的胺基酸序列，其中該抗體特異性結合PD-1。在一些具體實施中，該抗體包含： a)重鏈可變區CDR1，其序列包含選自SEQ ID NO﹕10所示的胺基酸序列， b)重鏈可變區CDR2，其序列包含選自SEQ ID NO﹕11所示的胺基酸序列， c)重鏈可變區CDR3，其序列包含選自SEQ ID NO﹕12所示的胺基酸序列， d)輕鏈可變區CDR1，其序列包含選自SEQ ID NO﹕18所示的胺基酸序列， e)輕鏈可變區CDR2，其序列包含選自SEQ ID NO﹕19所示的胺基酸序列， f)輕鏈可變區CDR3，其序列包含選自SEQ ID NO﹕23所示的胺基酸序列，其中該抗體特異性結合PD-1。在一些具體實施中，該抗體包含： a)重鏈可變區CDR1，其序列包含選自SEQ ID NO﹕10所示的胺基酸序列， b)重鏈可變區CDR2，其序列包含選自SEQ ID NO﹕11所示的胺基酸序列， c)重鏈可變區CDR3，其序列包含選自SEQ ID NO﹕12所示的胺基酸序列， d)輕鏈可變區CDR1，其序列包含選自SEQ ID NO﹕18所示的胺基酸序列， e)輕鏈可變區CDR2，其序列包含選自SEQ ID NO﹕19所示的胺基酸序列， f)輕鏈可變區CDR3，其序列包含選自SEQ ID NO﹕20所示的胺基酸序列，其中該抗體特異性結合PD-1。具體CDR序列詳見表2及序清單資訊：表2抗體的重鏈、輕鏈具體序列

在一些實施中，該抗體係嵌合抗體或人源化抗體或人抗體。在一些實施中，其中該抗體顯示下列性質中的至少一種： a)結合人PD-1的K_D 為2.15E-10 M以下，且結合小鼠PD-1的K_D 為1.67E-08 M以下； b)實質上不結合人CD28、CTLA-4； c)增加T細胞增殖； d)增加干擾素-γ的產生；或 e)增加白細胞介素-2的分泌。在再一態樣中，本發明提供了一種核酸分子，其編碼如本發明中所描述之抗體或其抗原結合片段。本發明提供了一種選殖或表現載體，其包含本發明所描述的編碼抗體或其抗原結合片段的核酸分子。本發明提供了一種宿主細胞，其包含如超過一個上述選殖或表現載體。在另一個態樣中，本發明提供了一種用於生產本發明中任一種抗體的程序，包括培養本發明中所述的宿主細胞及分離抗體。上述抗體，其製備方法係藉由將人類PD-1的細胞外結構域及小鼠PD-1的細胞外結構域免疫接種至SD大鼠而實現的。本發明提供了一種轉基因大鼠，包含人免疫球蛋白重鏈及輕鏈轉基因，其中該大鼠表現本發明中所描述的任一種抗體。本發明提供了一種自上述大鼠中獲得的雜交瘤，其中該雜交瘤產生抗體。在再一態樣中，本發明亦提供了一種藥物組合物，其包含本發明中所述的任一抗體或其抗原結合片段，以及超過一種醫藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。本發明亦提供了一種免疫共軛物，包含連接至治療劑的本發明中所述的任一抗體或其抗原結合片段。本發明亦提供了一種藥物組合物，其包含上述免疫共軛物及醫藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。本發明亦提供了一種用於製備抗PD-1抗體或其抗原結合片段的方法，包括： (a)提供： (i)包含重鏈可變區抗體序列，其包含選自SEQ ID NO﹕10的CDR1序列，選自SEQ ID NO﹕11的CDR2序列以及選自SEQ ID NO﹕12或SEQ ID NO﹕13的CDR3序列；及/或 (ii)包含輕鏈可變區抗體序列，其包含選自由SEQ ID NO﹕14、SEQ ID NO﹕15、SEQ ID NO﹕16、SEQ ID NO﹕17及SEQ ID NO﹕18所組成的群組中的CDR1序列，選自SEQ ID﹕19的CDR2序列以及選自由SEQ ID NO﹕20、SEQ ID NO﹕21、SEQ ID NO﹕22及SEQ ID NO﹕23所組成的群組中的CDR3序列；及 (b)表現改變抗體序列成為蛋白質。本發明亦提供了一種調節個體的免疫反應的方法，包括向個體投與本發明中所述的任一抗體或其抗原結合片段。本發明亦提供了如本發明中所描述的任一種抗體在製備治療或預防免疫病症或癌症的藥物中的應用。本發明亦提供了一種抑制個體中腫瘤細胞的生長的方法，包括向該個體投與治療有效量的本發明中所述的任一抗體或其抗原結合片段，以抑制腫瘤細胞生長。在本發明中，上述腫瘤細胞選自由黑素瘤、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭部或頸部癌、皮膚或眼內惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌及直腸癌所組成的群組中的癌症。在本發明中，上述抗體係嵌合抗體或人源化抗體。發明的有益效果本發明的有益效果在藉由專有的雜交瘤技術產生抗PD-1的人源化抗體。在本發明報導的抗體具有高結合親和力；特異性結合人及小鼠PD-1蛋白，沒有家族交叉反應；有效調節免疫反應，包括增強T細胞增殖及增加細胞因子IFN-γ及IL-2的產生。新型抗PD-1的抗體來源於對大鼠的免疫，其與小鼠PD-1蛋白的結合克服了臨床前實驗不能用於小鼠動物模型的不足；且抗體序列經過人源化改造之後，其人源化程度接近100%，大大降低了藥物用於人體的不良反應。

下文藉由詳細描述及實驗數據對本發明作進一步說明。儘管為了清楚的目的，在下文中使用了專用術語，但此等術語並不意謂定義或限制本發明之範疇。如本文中所使用，術語「程序性死亡1」、「程序性細胞死亡1」、「蛋白PD-1」、「PD-1」、「PD1」、「PDCD1」、「hPD-1」及「hPD-F」可互換使用，並且包括變體、同種型、人PD-1的物種同源物及具有PD-1的至少一個共同表位的類似物。如本文中所使用，術語「抗體」包括完整抗體及任何抗原結合片段(亦即「抗原結合部分」)或其單鏈。「抗體」係指包含至少兩條重鏈(H)及兩條輕鏈(L)並藉由二硫鍵相互連接的，或其抗原結合部分的蛋白質。每條重鏈由重鏈可變區(本文縮寫為VH)及重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由三個結構域，CH1，CH2及CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文縮寫為VL)及輕鏈恆定區的。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH及VL區可以進一步細分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，與更保守的稱為構架區(FR)的區域散佈。每個VH及VL由三個CDR及四個FR組成，從胺基末端至羧基末端以下面的順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈的可變區包含與抗原相互作用的結合結構域。如在本申請案中所使用，術語「抗體」係指免疫球蛋白或其片段或其衍生物，並且包括其包含的抗原結合位點的任何多肽，而不管其係在活體外抑或活體內產生。該術語包括但不限於，多株、單株、單特異性的、多特異性的、非特異性的、人源化、單鏈的、嵌合的、合成的、重組的、雜合的、突變的、嫁接的抗體。術語「抗體」亦包括抗體片段，例如Fab、F(ab')2、FV、scFv、Fd、dAb及其他保留抗原結合功能的抗體片段，亦即，能夠與PD-1的特異性結合。通常情況下，此類片段將包括抗原結合片段。術語「抗原結合片段」、「抗原結合結構域」及「結合片段」係指一種抗體分子，其包含負責具體的抗體及抗原之間的結合的胺基酸。例如，其中的抗原係大的，抗原結合片段只結合抗原的一部分。亦即，抗原分子中負責與抗原結合片段特異性相互作用的部分被稱為「表位」或「抗原決定子」。抗原結合片段通常包括抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)，然而，其不一定必須包括兩者。例如，一個所謂的Fd抗體片段僅由VH結構域組成，但仍保留了完整抗體的一些抗原結合功能。上述術語「表位」定義為抗原決定子，其特異性結合/識別結合片段。結合片段可以特異性與針對靶結構獨特的構象或連續表位進行結合/反應，例如人類PD-1及鼠PD-1 (小鼠或大鼠)。構象或不連續表位的特徵在於多肽抗原在一級序列中係分離的兩個或超過兩個離散的胺基酸殘基，但多肽摺疊成天然蛋白/抗原時一起聚集在在分子的表面上。表位的兩個或超過兩個離散的胺基酸殘基存在於一個或多個多肽鏈的獨立部分。當多肽鏈摺疊成三維結構，此等殘基聚集在分子表面以構成表位。與此相反，由兩個或超過兩個離散的胺基酸殘基組成的連續或線性表位，其存在於多肽鏈的單個線性區段。術語「結合PD-1的表位」係指抗體特異性結合PD-1的特定表位，其可藉由直鏈胺基酸序列或PD-1的部分三維結構來定義結合。結合係指，對於PD-1的部分中的抗體的親和力比其對其他相關多肽的親和力顯著更大。術語「基本上更大的親和力」係指與其他相關多肽的親和力相比，在對PD-1的部分的親和性呈可量測的增加。較佳地，對PD-的特定部分的親和力相比其他蛋白質至少為1.5倍，2倍，5倍，10倍，100倍，10³ 倍，10⁴ 倍，10⁵ 倍，10⁶ 倍或更大。較佳地，結合親和力係藉由酶聯免疫吸附測定(ELISA)，或藉由螢光激活細胞分選(FACS)分析或表面電漿共振(SPR)測定的。更佳地，結合特異性由螢光激活細胞分選(FACS)分析得到。本文中所描述的術語「交叉反應性」係指對人類及鼠相同靶分子的抗原片段的結合。因此，「交叉反應性」應被理解為與在不同物種中表現的相同分子X之間的種屬間反應。識別人PD-1、鼠PD-1 (小鼠或大鼠)的單株抗體的交叉反應特異性可藉由FACS分析確定。如本文所用，術語「個體」包括任何人或非人動物。術語「非人動物」包括所有脊椎動物，例如，哺乳動物及非哺乳動物，如非人靈長類動物、羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。除非指出，否則術語「患者」或「個體」可互換使用。術語「治療」及「治療方法」係指治療性治療及預防性/預防措施。彼等需要治療的個體包括已具有特定醫學病症，以及彼等可能最終獲得該病症的個體。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。實施例：實施例 1 實驗材料準備 1. 抗原製備 合成編碼PD-1及PD-L1全長或胞外區的DNA，分別將其插入表現載體pcDNA3.3中。在大量抽提質粒DNA後測序驗證插入DNA片段序列。融合蛋白PD-1胞外區及PD-L1胞外區含有不同標籤，包括人源Fc，鼠源Fc及His標籤等，藉由將PD-1胞外區基因序列轉染至CHO-S或HEK293細胞中表現得到。細胞瞬時轉染5天後，收集細胞培養基上清液，純化及量化融合蛋白以用作免疫接種及篩選。2. 穩定細胞株的建立 為獲得抗體篩選驗證工具，製備了PD-1及PD-L1轉染細胞株。簡言之，利用Lipofectamine 2000轉染試劑根據生產商提供的實驗步驟將包含PD-1或PD-L1全長的pcDNA3.3載體表現質粒轉染進CHO-K1或293F細胞內。轉染48-72小時後，將轉染細胞培養在含有殺稻瘟菌素或G418的培養基內對染色體內插入PD-1或PD-L1基因的細胞進行篩選。同時，對細胞進行PD-1及PD-L1表現檢驗。一旦表現得到驗證，即藉由有限稀釋法挑選單株並進行擴大化培養。建立的單株細胞株隨後維持培養在含有較低劑量殺稻瘟菌素或G418抗生素的培養基內。實施例 2 抗體雜交瘤的產生 1. 免疫 6至8週齡的雌性SD大鼠每隻經由足底注射在10 μg人PD-1胞外區蛋白及10 μg小鼠PD-1胞外區(TiterMax中)蛋白致敏，隨後每週分別用在磷酸鋁凝膠佐劑中的人PD-1胞外區蛋白或小鼠PD-1胞外區蛋白經足底各免疫一次直至適合融合。免疫期間，每兩週藉由ELISA或FACS方法檢測抗PD-1抗體的血清滴度。2. 細胞融合 當抗體滴度達到足夠高時，對大鼠給予最後的不含佐劑的免疫原(人PD-1胞外區蛋白及小鼠PD-1胞外區蛋白)激發(用等體積磷酸鹽緩衝液(PBS)代替佐劑)。在融合前一週復蘇SP2/0細胞，融合前以1:2傳代至融合前一天，並保持細胞的指數生長。融合當天，在無菌條件下取出SD大鼠的淋巴結，並儘快將淋巴結處理成單細胞懸液，與骨髓瘤細胞SP2/0按1:1的比例混勻，用蛋白酶溶液處理後用胎牛血清終止反應，並用ECF溶液替換原溶液。細胞混合液經ECF溶液洗滌重懸，ECF中細胞密度為2×10⁶ 個細胞/毫升。用BTX 2000電融合儀電融合後，立刻將細胞懸液自融合艙室中轉移至含有更多溶媒的無菌試管中，在37℃孵育箱中孵育至少24小時。然後混合細胞懸液並按照1×10⁴ 個細胞每孔的密度進行96孔板鋪板。將融合後的細胞在37℃、5% CO₂ 條件下進行培養。當純系培養7-14天後，選殖長至足夠大時，從96孔板每孔轉移100 μL上清液用於抗體篩選測試。3. 雜交瘤上清液的第一次及第二次以及競爭確認篩選 使用ELISA方法作為第一輪篩選方法以測試雜交瘤上清液與人PD-1蛋白或小鼠PD-1蛋白的結合。簡言之，用1 μg/mL的人PD-1胞外區蛋白或小鼠PD-1胞外區蛋白在4℃包被酶標板(Nunc)過夜。在封閉及洗滌後，將該雜交瘤上清液轉移至所述包被的酶標板並在室溫下孵育1小時。之後洗滌所述酶標板並隨後用山羊抗大鼠IgG Fc HRP(Bethyl)的二抗孵育1小時。洗滌後，加入TMB基質顯色後用2M HCl終止反應。使用酶標儀(Molecular Device)讀取450 nm處的吸收光值。為了確認PD-1抗體與在細胞膜上表現的構象PD-1分子的天然結合，在人PD-1轉染的CHO-S細胞株或小鼠PD-1轉染的293F細胞株上進行FACS分析作為第二輪篩選。以1×10⁵ 細胞每孔的密度將表現人PD-1的CHO-S細胞或表現小鼠PD-1的293F細胞轉移至96孔U形底平板(Corning)，隨後將所述雜交瘤上清液轉移至所述平板並在4℃條件下孵育1小時。用1×PBS/1%BSA洗液洗滌後，加入山羊抗大鼠FITC二抗(Jackson Immunoresearch Lab)並在4℃條件下與細胞避光孵育1小時。之後洗滌細胞並在1×PBS/1%BSA中重懸或在4%福爾馬林中固定細胞，並以流式細胞儀(BD)及FlowJo軟體進行結果分析。使用相同方法分別進行雜交瘤上清液與母本CHO-S細胞株或293F細胞株的結合。測試抗體對人PD-1/PD-L1結合阻斷活性，作為確認篩選以選擇潛在的目標抗體。藉由FACS分析，測試所選擇的雜交瘤上清液對配體PD-L1與轉染人PD-1的CHO-S細胞的結合的阻斷能力。以1×10⁵ 細胞每孔的密度將表現人PD-1的CHO-S細胞轉移至96孔U形底平板(Corning)中。隨後將所述雜交瘤上清液轉移至所述平板並在4℃條件下孵育1小時。用1×PBS/1%BSA洗液洗滌後，加入小鼠Fc融合的人PD-L1胞外區蛋白或小鼠Fc融合的小鼠PD-L1胞外區蛋白並在4℃條件下孵育1小時。洗滌後，加入山羊抗小鼠Fc FITC二抗(與大鼠IgG Fc沒有交叉反應性，Jackson Immunoresearch Lab)並在4℃條件下與細胞避光孵育1小時。之後洗滌細胞並在1×PBS/1%BSA中重懸或在4%福爾馬林中固定細胞，並以流式細胞儀(BD)及FlowJo軟體進行結果分析。圖1顯示了16個雜交瘤抗體與細胞表面人PD-1或小鼠PD-1的結合，圖1A顯示了16個雜交瘤抗體與細胞表面人PD-1的結合；圖1B顯示雜交瘤抗體與細胞表面小鼠PD-1的結合。4. 雜交瘤次選殖 一旦藉由第一輪、第二輪及競爭確認篩選驗證了特異性結合及阻斷之後，挑選陽性雜交瘤細胞株進行次選殖。簡言之，對於每個雜交瘤細胞株，將細胞計數並在純系培養基中稀釋至5細胞每孔、1細胞每孔及0.5細胞每孔。96孔板每孔加入200 μL稀釋後的純系培養基，一個平板為5細胞每孔，一個平板為1細胞每孔，四個平板為0.5細胞每孔。將所有平板置於37℃、5% CO₂ 的條件下培養，直至所有細胞可以藉由ELISA或FACS方法進行檢測。檢測方法同上所述，挑選陽性單株進行擴大培養，純化的抗體進行下一步表徵分析。5. 亞型測試 用50 μL每孔的山羊抗大鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG或IgM抗體以1 μg/mL的濃度分別包被酶標板(Nunc)過夜。封閉後，將50 μL的雜交瘤上清液樣品加入至每孔，室溫孵育2小時。使用山羊抗大鼠IgG kappa或lambda輕鏈-HRP(Bethyl)的二抗作為檢測抗體。使用TMB基質進行顯色，用2M的HCl終止反應。用酶標儀(Molecular Device)讀取450nM處的吸收光值。表3顯示16個雜交瘤抗體的亞型結果，其中7個抗體為多株，其餘9個抗體均為IgG2a kappa亞型。考慮到抗PD-1抗體需要避免在活體內的ADCC及CDC作用，在人源化之後將抗體建構為人IgG4 kappa亞型。表3雜交瘤抗體的亞型

實施例 3 抗體雜交瘤細胞測序、抗體的人源化建構及親和力成熟 1. 雜交瘤細胞抗體測序 利用Trizol試劑分離單株雜交瘤細胞RNA。PD-1嵌合抗體的VH及VL段藉由下述方法擴增：首先利用反轉錄酶藉由如下方法將RNA反轉錄為cDNA，反應體系(20 μL) 10×RT 緩衝液 2.0 μL 25×dNTP 混合物(100 mM) 0.8 μL 10×RT隨機引物/oligo dT/特異性引物 2.0 μL MultiScribe™ 反轉錄酶 1.0 μL RNA酶抑制劑 1.0 μL RNA 2 μg 去核酸酶的水加至 20.0 μL 反應條件

所得cDNA作為模板，利用感興趣基因的特異性引物進行以下PCR擴增。PCR反應操作如下： cDNA 1 μL Ex PCR 緩衝液 5 μL dNTP 2 μL ExTaq 0.5 μL P1(25 pM) 0.5 μL P2(25 pM)0.5 μL ddH₂ O 40.5 μL 反應條件：

連接所得PCR反應產物(10 μL)至pMD18-T載體。10 μL連接產物轉化至Top10感受態細胞內。利用M13-48及M13-47引物，採用PCR驗證陽性選殖後測序。2. 人源化抗體分子建構 根據與PD-1結合的高親和性及特異性選擇來自雜交瘤的大鼠抗人PD-1抗體進行人源化，用於提高大鼠來源的抗體序列與人的抗體序列的同源程度。所述人源化使用稱為CDR移植的技術進行。利用KABAT系統及IMGT系統進行抗體可變區基因的FR區及CDR區的劃分。在抗體數據庫中，結合序列同源性及結構相似性的比對結果，選擇相近的人源的抗體可變區的FR1-3區基因對鼠源的FR1-3區基因進行置換，選擇結構最相近的人源的JH及JK基因對鼠源的FR4區基因進行置換。在驗證模板序列及優化密碼子後，將重鏈可變區及輕鏈可變區擴增並選殖進表現載體，進而表現人源化抗體。根據雜交瘤抗體與人及小鼠PD-1蛋白的結合能力的強弱，挑選W3052_r16.88.9及W3052_r16.81.3兩個抗體進行人源化。經過人源化改造之後，綜合不同抗體的人源化程度以及與人及小鼠PD-1蛋白的結合能力的強弱，挑選來源於親本雜交瘤抗體W3052_r16.88.9的人源化抗體W3052_r16.88-z9-IgG4(42720)進行親和力成熟(表4)。表4

3. 親和力成熟 藉由雜交突變的方法將人源化抗體的重鏈CDR3區、輕鏈CDR1區及CDR3區的每一個胺基酸分別突變為其他20個胺基酸。用含有編碼20個胺基酸的NNS密碼子的DNA引物向每個目標的CDR的位置引入突變。在雜交突變反應使用單個簡併引物。簡要地說，各個簡併引物係磷酸化的，然後以10:1的比例與尿苷化(uridinylated)的ssDNA使用。將混合物加熱至85℃、5分鐘，然後在1小時內冷卻至55℃。此後，加入T4連接酶及T4 DNA聚合酶，並將混合物在37℃孵育1.5小時。VH及VL的CDR的合成產品，分別合併。通常情況下，將200 ng合併庫DNA電轉化入BL21，以形成BL21菌苔或生產scFv片段的菌斑。主要篩選包括使用生長在96孔板(深孔)的細菌的周質提取物(PE)的單點ELISA(SPE)測定的。簡言之，該捕獲ELISA包括用pH 9.2包被緩衝液(200毫莫耳碳酸鈉/碳酸氫鈉)中的抗c-myc的抗體包被96孔Maxisorp免疫板的各孔4℃過夜。第二天，用酪蛋白將板在室溫下封閉1小時。然後scFv的PE加入至板中並在室溫下溫育1小時。洗滌後，將生物素化的抗原蛋白被加入至孔中，並將該混合物溫育在室溫下1小時。隨後用鏈黴親和素-HRP偶合物在室溫下溫育1小時。用TMB基質檢測HRP活性，並用2 M鹽酸終止反應。用酶標儀(Molecular Device)讀取450 nm處的吸收光值。挑取在450 nm呈現的吸光度值高於母本抗體的純系再次進行ELISA檢測進行確認，結果為陽性。對重複表現比親本抗體信號更大的純系進行測序。有CDR改變的純系的scFv蛋白質濃度然後藉由定量scFv ELISA方法確定，其中用已知的濃度的scFv作為參照。所述scFv蛋白質濃度用ELISA信號與參照的scFv產生的信號進行比較來確定。為了確定突變的scFv與親本抗體的相對結合親和力，再重複一次標準化的scFv濃度下的所有陽性變體的結合測定法。確定對結合抗原係有利的VH及VL的點突變進一步結合以獲得另外的結合協同作用。該組合突變體表現為scFv，並使用捕捉ELISA篩選。挑選吸光度值高於母本抗體的純系進行測序並進一步藉由ELISA方法確定其親和力。圖2係第一輪突變庫篩選的結果。經親和力成熟第二輪篩選後獲得2E5、2G4、1G10、2C2、2B1、8C10、1H6、5C4、A6W及L1I共10個人源化抗體，其與人、食蟹猴及小鼠的親和力數據及具體CDR序列如表5所示。表5係第二輪突變庫篩選結果。其中綜合此等抗體與人、食蟹猴及小鼠的PD-1的親和力結果，挑選1H6、2E5、2G4及2C2四個抗體進行進一步表徵。表5

4. 抗體純化 使用含有親和力成熟的人源化抗體的DNA載體轉染293F細胞，用於抗體的表現及生產。在293F細胞培養上清液中的抗體使用蛋白A親及層析柱純化。實施例 4 人源化抗體的表徵 1. 與人、小鼠、食蟹猴 PD-1 的結合實驗 1.1 FACS測定的結合實驗為了檢驗抗體與細胞表面PD-1蛋白的結合能力，將不同濃度的抗體與表現人PD-1的CHO-S細胞或表現小鼠PD-1的293F細胞或活化的食蟹猴PBMC在4℃條件下孵育1小時。洗滌後，使用FITC標記的山羊抗人IgG Fc二抗(Jackson Immunoresearch Lab)檢測抗體與細胞的結合。隨後用流式細胞儀(BD)及FlowJo軟體進行結果分析。具體實驗步驟見實施例2的第3部分。圖3A顯示人源化抗體與細胞表面人PD-1的結合曲線，抗體以2.20~2.78 nM的EC50特異性地與人PD-1結合。圖3B顯示人源化抗體與細胞表面小鼠PD-1的結合曲線，抗體以11.8~15.1 nM的EC50特異性地與小鼠PD-1結合。圖3C顯示人源化抗體與活化的食蟹猴PBMC的結合具有劑量依賴的關係。同型對照係人IgG4 kappa。下同。1.2 與人、小鼠、食蟹猴 PD-1 的物種交叉反應試驗 用ELISA方法測定抗體對食蟹猴及小鼠PD-1蛋白的交叉反應。將1μg/mL的人、食蟹猴及小鼠的PD-1胞外區蛋白(Sino Bioligical)分別包被酶標板(Nunc)於4℃過夜。封閉後，將人源化抗體加入板中並在室溫孵育1小時。用山羊抗人IgG Fc-HRP(Bethyl)作為二抗檢測抗體與包被的抗原的結合。使用TMB基質進行顯色，用2M HCl終止反應。用酶標儀(Molecular Device)讀取450 nm處的吸收光值。圖4示出了抗體與人、小鼠、食蟹猴PD-1的物種交叉反應試驗ELISA的結果，人源化PD-1抗體與人、食蟹猴及小鼠的PD-1蛋白以劑量依賴的形式結合。圖4A係人源化PD-1抗體與人PD-1蛋白的結合；圖4B係人源化PD-1抗體與小鼠PD-1蛋白的結合；圖4C係人源化PD-1抗體與食蟹猴PD-1蛋白的結合。2 與 PD-1 家族 CD28 、 CTLA4 的交叉反應試驗 用FACS方法檢測人源化抗體與PD-1同家族的CD28及CTLA-4蛋白的交叉反應。簡言之，將建構好的表現人PD-1的CHO-S細胞、表現人CD28的CHO-K1細胞或表現人CTLA-4的293F細胞接種於96孔U型底的板(BD)中，細胞密度為每孔2×10⁵ 個細胞。將測試抗體稀釋至洗滌液(1×PBS/1%BSA)並與表現人PD-1的CHO-S細胞、表現人CD28的CHO-K1細胞或表現人CTLA-4的293F細胞在4℃下分別孵育1小時。洗滌細胞後，加入FITC標記的山羊抗人IgG Fc(Jackson Immunoresearch Lab)二抗，4℃下避光孵育1小時。然後洗滌細胞一次，用1×PBS/1%BSA重懸細胞，用流式細胞儀(BD)及FlowJo軟體進行結果分析。圖5顯示了人源化抗體與PD-1同家族的CD28及CTLA-4蛋白的交叉反應結果。結果顯示，抗體特異性結合PD-1，但不與PD-1同家族的CD28及CTLA-4結合。3. 競爭實驗 3.1 用 FACS 檢測 PD-1 抗體封閉 PD-L1 結合 PD-1 的能力 為了檢驗人源化抗體是否能夠阻斷PD-L1與PD-1的結合，將表現人PD-1的CHO-S細胞或表現小鼠PD-1的293F細胞在4℃下與不同濃度的抗體孵育1小時。將未結合的抗體洗掉，然後分別加入小鼠Fc標記的人或小鼠PD-L1蛋白。4℃孵育1小時後，使用FITC標記的山羊抗小鼠IgG Fc二抗(Jackson Immunoresearch Lab)檢測配體PD-L1與表現PD-1的細胞的結合，隨後用流式細胞儀(BD)及FlowJo軟體進行結果分析。3.2 用 ELISA 方法檢測人源化抗體是否能夠阻斷 PD-L2 與 PD-1 的結合 簡言之，用1μg/ml的人PD-1胞外區蛋白在4℃包被酶標板(Nunc)過夜。在封閉及洗滌後，稀釋不同濃度的人源化抗體與恆定濃度的His標籤的PD-L2胞外區蛋白預先混合後加入至所述包被的酶標板並在室溫下孵育1小時。之後洗滌所述酶標板並隨後加入山羊抗His HRP(GenScript)的二抗孵育1小時。洗滌後，加入TMB基質顯色後用2M HCl終止反應。使用酶標儀(Molecular Device)讀取450 nm處的吸收光值。圖6A顯示了人源化抗體阻斷人PD-L1與CHO-S細胞表面的人PD-1的結合，圖6B顯示了人源化抗體阻斷小鼠PD-L1與293F細胞表面的小鼠PD-1的結合。圖7顯示了人源化抗體阻斷人PD-L2與PD-1蛋白的結合，且阻斷作用具有劑量依賴性。4. 表面電漿共振 (SPR) 測定的親和力試驗 藉由SPR 法使用ProteOn XPR36(Bio-Rad)對抗體與PD-1的親和性及結合動力學進行表徵。將蛋白A蛋白(Sigma)藉由胺偶聯固定於GLM 傳感晶片上(Bio-Rad)。使純化的抗體流過感測器晶片並被蛋白A捕獲。將晶片旋轉90°並用電泳緩衝液洗滌(1×PBS/0.01% Tween20，Bio-Rad)直至基線穩定。使7個濃度的人PD-1蛋白及電泳緩衝液以流速30 μL/分鐘流經該抗體流動單元，先為結合相流動180 s，隨後解離相300 s。在每次運行後用pH 1.5的H₃ PO₄ 再生所述晶片。使用ProteOn軟體將結合及解離曲線擬合至1:1的Langmiur結合模型。抗體與小鼠PD-1蛋白的親和力測試方法同上。表6顯示表面電漿共振檢測的人源化PD-1抗體對重組人或重組小鼠PD-1的親和力的結果。對照抗體1(WBP305BMK1)根據BMS專利US9084776B2中的5C4序列合成，即BMS公司已上市抗PD-1藥物Opdivo；對照抗體2 (Keytruda)為Merck公司已上市抗PD-1藥物Keytruda。下同。如表6A所示，藉由使用表面電漿共振檢測的人源化PD-1抗體對重組人PD-1的親和力為自1.43E-8至5.64E-9 mol/L。與WBP305BMK1及Keytruda相比，本申請案中的抗體的K_D 值更小，說明2E5、2G4、2C2有更好的結合人PD-1的能力。如表6B所示，藉由使用表面電漿共振檢測的人源化PD-1抗體對重組小鼠PD-1 的親和力自從9.37E-9至3.89E-9 mol/L。表 6A

表 6B

5. FACS 測定抗 PD-1 抗體與細胞表面 PD-1 分子的親和力試驗 將表現人PD-1的CHO-S細胞或表現小鼠PD-1的293F細胞以每孔1×10⁵ 個細胞密度接種於96孔U型底的板(BD)中。將測試抗體用洗滌液(1×PBS/1%BSA)以1:2系列稀釋，並與細胞在4℃下孵育1小時。加入山羊抗人IgG Fc-FITC二抗(每莫耳IgG中3.0莫耳FITC，Jackson Immunoresearch Lab)並在4℃下避光孵育1小時。隨後洗滌一次細胞並在1×PBS/1%BSA中重懸，使用流式細胞術(BD)分析。基於quantitative beads Quantum^TM MESF Kit(Bangs Laboratories，Inc.)，螢光強度將被轉換為相關分子/細胞。使用Graphpad Prism5計算K_D 。如表7A-7B所示，藉由使用FACS方法檢測的人源化PD-1抗體對CHO-S細胞表面人PD-1的親和力，結果顯示人源化PD-1抗體對CHO-S細胞表面人PD-1的親和力從3.80E-10至2.15E-10 mol/L。人源化PD-1抗體對293F細胞表面小鼠PD-1的親和力為從5.39E-08至1.74E-08 mol/L。表 7A

表 7B

6. 抗原表位測試 FACS測定抗原表位競爭試驗：該實驗主要係為了找出該抗體是否結合相同、相近或完全不同的抗原表位。為了檢查人源化抗體與對照抗體是否結合相同的抗原表位，將表現人PD-1的CHO-S細胞與測試抗體(用洗滌緩衝液系列稀釋)及生物素標記的對照抗體A或B (1 μg/mL)的混合液在4℃下孵育1小時。洗滌細胞，加入PE連接的鏈黴親和素作為二抗，4℃下孵育30分鐘。洗滌細胞一次並用1×PBS/1%BSA重懸細胞，隨後用流式細胞儀(BD)及FlowJo軟體進行結果分析。圖8A至8B結果顯示抗原表位測試結果顯示人源化PD-1抗體與對照抗體結合於相同或相近的抗原表位。圖8A顯示與對照抗體1(WBP305BMK1)競爭的表位，圖8B顯示與對照抗體2(Keytruda)競爭的表位。此外，亦進一步對人源PD-1 (hPD-1)進行了丙胺酸掃描實驗以評測其對抗體結合的影響。將hPD-1中的丙胺酸殘基突變成甘胺酸密碼子，並將其餘殘基突變成為丙胺酸。利用兩步連續PCR法對hPD-1胞外域每個殘基進行點突變替換。第一步PCR以含有hPD-1胞外域及C-端His標籤編碼序列的pcDNA3.3-hPD-1_ECD.His質粒為模板，使用了QuikChange lightning多點突變套組(Agilent technologies, Palo Alto, CA)及突變引物。在突變鏈合成反應後，利用DpnI核酸內切酶酶解母版。第二步PCR擴增了包含有CMV啟動子、PD-1胞外結構域(ECD)、His標籤及單純疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(TK)聚腺苷酸化的線性DNA並將其在HEK293F細胞中瞬時表現(Life Technologies，Gaithersburg，MD)。用單株抗體W3052_r16.88.9及Keytruda包被的板進行免疫酶聯吸附(ELISA)結合試驗。在與含有定量的PD-1突變體或人源/鼠源His-標籤PD-1胞外結構域蛋白(Sino Biological，中國)的上清結合後，加入HRP耦聯的抗His抗體作為檢測抗體。將吸光度根據對照突變體的平均吸光度進行標準化。在對結合改變倍數設定了額外的臨界值(＜0.55)後，發現最終決定子的抗原表位殘基。針對抗體W3052_r16.88.9及Keytruda對人源及鼠源PD-1的結合作用進行了檢測(圖9)。吾人的首位抗體W3052_r16.88.9被發現可同時結合hPD-1及鼠源PD-1 (mPD-1)，而Keytruda僅結合hPD-1 (圖9)。該W3052_r16.88.9特有的功能性交叉反應可幫助在藥物安全性評估的臨床前研究中提供更多動物模型的選擇。為探究上述觀察到的結合行為的成因，吾人進行了抗原表位圖譜鑑定。表8顯示了30個點替換的hPD-1突變體顯著降低了及抗體的結合。藉由對在hPD-1晶體結構(PDB碼3RRQ及4ZQK)上所有此等殘基的位置檢驗，發現一些胺基酸(如Val144、Leu142、Val110、Met108、Cys123 等)被完全包埋在蛋白質內，不可能與抗體形成直接接觸。所發現的結合性降低極有可能係由丙胺酸替代後引起的hPD-1結構不穩定，甚至係結構坍塌導致。根據抗原結構分析，一些殘基並不參與結合作用，但預計會回應hPD-1的結構穩定性，如V144及L142。此外可同時影響兩個抗體的突變被認為係假熱點，並自清單中移除。在對結合改變倍數設定了額外的臨界值(＜0.55)後，最終確定的抗原殘基列於表9。其中，9個位置對應W3052_r16.88.9，5個對應Keytruda。表9中W3052_r16.88.9及Keytruda的抗原胺基酸比較顯示僅有兩個殘基熱點存在重合，其餘的看上去非常分散，顯示兩抗體在hPD-1結合及hPD-L1封閉上採用了不同機制。讀取圖8中的殘基ID並不能直接闡釋該機制。因此，為更好的進行顯示及比較，所有表9中的數據及hPD-L1結合位點均在hPD-1晶體結構中進行了映射比對(圖10)。表8. PD-1點突變對抗體結合的影響

^a 結合作用改變倍數為多個丙胺酸沉默替代的相對值表 9. 潛在抗原表位的發現

^* mPD-1中觀察到的C''鏈不存在於hPD-1結構中。此β-摺疊片層結構在hPD-1中被一個無結構環狀區替代。為更便於跟mPD-1進行比對，吾人仍用C''標記該區域。雖然均具有hPD-1結合及hPD-L1封閉功能，兩個研究的抗體W3052_r16.88.9及Keytruda有明顯相異的抗原表位(圖10B，10C)。Keytruda抗原表位主要由C'D環狀區所貢獻(對應mPD-1 C''鏈)，與PD-L1結合位點完全不相交。其提示Keytruda的hPD-L1封閉功能更依賴於其抗體大小造成的空間位阻效應。相對而言，表面圖譜結果顯示W3052_r16.88.9的抗原表位由多區域分佈的熱點組成，並與hPD-L1的結合位點有直接重疊(圖10A、圖10B)。W3052_r16.88.9藉由與hPD-L1競爭其共有結合位點封閉hPD-L1。此外，W3052_r16.88.9不與C'D靈活性環狀區(或mPD-1對應的C''鏈)相互作用，該區在人源及鼠源PD-1中顯示出很大結構偏差(圖11)。其主要作用點在FG環狀區(Lin et al. (2008) PNAS 105: 3011-3016 )上。其解釋了為何W3052_r16.88.9可以結合兩種來源PD-1，而Keytruda僅能結合人源PD-1 (圖9)。由於該特有的功能性交叉反應，W3052_r16.88.9的臨床前安全評估可在小鼠模型中開展，從而極大的簡化及加速其開發過程。總而言之，W3052_r16.88.9預測會比Keytruda更具功能性及開發性。7. 藉由細胞實驗測定 PD-1 抗體的活體外功能 為了估測人源化抗體調節T細胞響應(包括細胞因子產生及細胞增殖)的能力，使用經親和力成熟的人源化PD-1抗體以及對照抗體進行了以下三個實驗。7.1 同種異體混合淋巴細胞反應 MLR 用於檢測抗體對 T 細胞功能的作用 人DC細胞、CD4⁺ T細胞、CD8⁺ T細胞及全部T細胞的分離：使用Ficoll-Paque PLUS(GE)梯度離心從健康供體新鮮分離人PBMC細胞。使用人單核細胞富集套組(StemCell)，根據說明書自健康供體中分離單核細胞。在包含rhGM-CSF及rhIL-4的培養基培養細胞5-7天以誘導成樹突細胞(DC)。MLR之前18至24小時，添加1 µg/mL LPS至培養基以誘導DC細胞的成熟。使用人CD4⁺ T細胞富集套組(StemCell)，根據說明書分離人CD4⁺ T細胞。使用小鼠CD4⁺ T細胞富集套組(StemCell)，根據說明書自Balb/c小鼠的脾臟分離小鼠CD4⁺ T細胞。來自C57BL/6小鼠的骨髓細胞經過包含rmGM-CSF及rmIL-4的培養基培養5-7天誘導為DC細胞。MLR之前18至24小時，添加1 µg/mL LPS至培養基以誘導DC細胞的成熟。簡言之，主要的樹突細胞(DC)刺激MLR在含有10%FCS及1%的抗生素的200微升RPMI1640的96-孔U形底組織培養板中進行。在存在或不存在測試抗體或基準的抗體的條件下，DC細胞及1×10⁵ 個CD4⁺ T細胞混合，DC細胞與T細胞比例在1:10及1:200之間(自166.75 nM以下至0.00667 nM，通常共六個濃度)。要確定抗PD-1對T細胞功能的效果時，測定細胞因子的產生及T細胞增殖。所示結果代表至少進行了五次實驗。因子檢測 ：藉由使用匹配的抗體採用酶聯免疫吸附測定(ELISA)測定人IFN-γ及IL-2。將平板分別預包被有特異於人IFN-γ的捕獲抗體(cat# Pierce-M700A)或IL-2(cat# R&D-MAB602)。生物素偶聯的抗IFN-γ抗體(cat# Pierce-M701B)或抗IL-2抗體(cat# R&D-BAF202)用作檢測抗體。如圖12A所示，所有待測的抗PD-1抗體以劑量依賴的方式增加了IL-2的分泌。圖12B示出了抗PD-1抗體以劑量依賴的方式增加了IFN-γ的分泌。增殖實驗 ：3H胸苷(cat# PerkinElmer- NET027001MC)用0.9% NaCl溶液1:20進行稀釋，以每孔0.5 uCi加入至細胞培養板中。3H-胸苷摻入增殖細胞測定之前，該板在5%CO₂ ，在37℃條件下培養16至18小時。如圖12C所示，所有待測的抗PD-1抗體均以劑量依賴的方式提高T細胞的增殖水平。為了檢測該人源化抗PD-1抗體對MLR中的小鼠T細胞增殖的作用，人源化抗體對MLR中的小鼠IL-2及IFN-γ的產生以及小鼠T細胞增殖的作用檢測方法同上所述。如圖13A所示，所有待測的抗PD-1抗體以劑量依賴的方式增加了IL-2的分泌。圖13B示出了抗PD-1抗體以劑量依賴的方式增加了IFN-γ的分泌。圖13C所示，所有待測的抗PD-1抗體均以劑量依賴的方式提高T細胞的增殖水平。7.2 自體抗原特異性免疫反應下 PD-1 抗體對細胞增殖及因子產生的作用 自相同的CMV+供體中分離CD4⁺ T細胞及DC細胞。簡言之，CD4⁺ T細胞從PBMC中純化，並在CMV pp65多肽及低劑量IL-2(20 U/mL)存在下培養。同時依照前述方法藉由培養單核細胞獲得DC。5天後，用pp65多肽加入DC細胞中於37℃預孵育1小時，隨後在人源化抗體或對照抗體存在或不存在條件下，將DC 加入至CD4⁺ T細胞。在第5天用ELISA方法測定培養上清液中的IFN-γ水平。CMVpp65特異性CD4⁺ T細胞的增殖藉由如前所述的3H胸苷摻入法測定。圖14A至圖14B顯示了人同種混合淋巴細胞反應(MLR)的結果，證明PD-1抗體可以增強人CD4⁺ T細胞的功能。圖14A顯示了人源化PD-1抗體提高了在特異性T細胞響應中IFN-γ的產生。圖14B顯示了人源化PD-1抗體增加了使用CMV pp65多肽負載的自體DC濃度依賴的CMV+ CD4⁺ T細胞的增殖。7.3 人抗 PD-1 抗體對 調節性T細胞(Treg) 的抑制功能 調節性T細胞(Treg)為T細胞的一類亞群，係關鍵免疫調節因子，在維持自身耐受中起到重要作用。CD4⁺ CD25⁺ Treg細胞與腫瘤相關，此係由於在多發性癌症患者中發現Treg數量增加，並與較差的預後相關。為了直接估測PD-1人源化抗體在抑制Treg抑制功能中的作用，在人源化抗體或對照抗體存在或不存在條件下，比較Treg的功能。簡言之，CD4⁺ CD25⁺ Treg細胞及CD4⁺ CD25^- T細胞藉由抗CD25特異性微磁珠(StemCell)方法及產品說明書分離，用2000個DC細胞、1×10⁵ 個CD4⁺ CD25⁺ Treg細胞及1×10⁵ 個CD4⁺ CD25^- T細胞、PD-1抗體在96孔板中共培養。平板在37℃、5% CO₂ 條件下共培養5天。用前述方法量測IFN-γ細胞因子的產生及T細胞增殖。圖15證明了PD-1抗體可以逆轉Treg的抑制功能。圖15A顯示PD-1抗體恢復了IFN-γ的分泌。圖15A顯示PD-1抗體恢復了效應T細胞的增殖。8. ADCC/CDC 測試由於人PD-1表現於多種細胞類型，為了將對健康PD-1陽性免疫細胞的不需要的毒性減小至最低，驗證了選擇的人源化PD-1抗體沒有ADCC及CDC功能。8.1 ADCC 檢測將靶細胞(活化的CD4⁺ T細胞)及不同濃度的人源化抗體在96孔板中預孵育30分鐘，隨後以效應細胞/靶細胞50﹕1的比例加入PBMC(效應細胞)。將所述96孔板在37℃、5% CO2培養箱中孵育6小時。藉由細胞LDH毒性檢測套組(羅氏)測定靶細胞的裂解。使用酶標儀(Molecular Device)讀取492 nm處的吸收光值。赫賽汀(羅氏)及人乳腺癌細胞株SK-Br-3(HER2陽性)作為陽性對照。圖16顯示，利用PBMC作為天然殺傷細胞(NK)的來源並將表現高水平PD-1的活化的CD4⁺ T細胞作為靶細胞，人源化PD-1抗體不介導ADCC作用。8.2 CDC 檢測將靶細胞(活化的CD4⁺ T細胞)、稀釋的人血清補體(Quidel-A112)及不同濃度的人源化抗體在96孔板中混合。將所述96孔板在37℃、5% CO2培養箱中孵育4小時。使用CellTiterGlo (Promega-G7573)測定靶細胞裂解。利妥昔單抗(羅氏)及人CD20陽性細胞株Ramos作為陽性對照。圖17顯示了靶細胞(活化的CD4+T細胞)、稀釋的人血清補體(Quidel-A112)及不同濃度的人源化PD-1抗體混合孵育4小時後，使用CellTiterGlo(Promega-G7573)測定靶細胞的裂解。數據顯示人源化PD-1抗體不介導CDC作用。實施例 5 人 PD-1 單株抗體在活體內腫瘤模型中的治療 1. 實驗設計 表10. 2E5活體內藥效實驗動物分組及給藥方案

註： 1.N: 每組小鼠數目 2.給藥容積：根據小鼠體重10 mL/g。若體重下降超過15%，給藥方案應做出相應調整。2. 實驗方法與步驟 2.1 細胞培養 細胞培養：鼠黑色素瘤CloudmanS91細胞(ATCC-CCL-53.1)活體外單層培養，培養條件為F-12K培養基中加2.5%胎牛血清及15%馬血清，100 U/mL青黴素及100 μg/mL鏈黴素，37℃、5% CO₂ 培養培養。一週兩次用胰酶-EDTA進行常規消化處理傳代。當細胞飽和度為80%-90%，數量到達要求時，收取細胞、計數、接種。2.2 腫瘤細胞接種 將0.1 mL(5×10⁵ 個) CloudmanS91細胞皮下接種於每隻小鼠的右後背，腫瘤平均體積達到約64 mm³ 時開始分組給藥。實驗分組及給藥方案見表10。2.3 腫瘤量測及實驗指標 實驗指標係考察腫瘤生長是否被抑制、延緩或治癒。每週三次用游標卡尺量測腫瘤直徑。腫瘤體積的計算公式為：V = 0.5a × b ² ，a及b分別表示腫瘤的長徑及短徑。化合物的抑瘤療效用TGI (%)或相對腫瘤增殖率T/C (%)評價。TGI (%)，反映腫瘤生長抑制率。TGI (%)的計算：TGI (%)=[(1-(某處理組給藥結束時平均瘤體積－該處理組開始給藥時平均瘤體積))/(溶劑對照組治療結束時平均瘤體積－溶劑對照組開始治療時平均瘤體積)]×100%。相對腫瘤增殖率T/C (%)：計算公式如下：T/C % = T_RTV / C_RTV × 100 % (T_RTV ：治療組RTV；C_RTV ：陰性對照組RTV)。根據腫瘤量測的結果計算出相對腫瘤體積(relative tumor volume，RTV)，計算公式為RTV= Vt/V0，其中V0係分組給藥時(即d0)量測所得平均腫瘤體積，Vt為某一次量測時的平均腫瘤體積，T_RTV 與C_RTV 取同一天數據。 T-C (天)反映腫瘤生長延遲指標，T表示用藥組腫瘤達到預先設定體積時(如300 mm³ )所用的平均天數，C表示對照組腫瘤達到相同體積時所用的平均天數。繪製生存曲線，動物生存時間定義為從給藥至動物死亡的時間或自給藥至腫瘤體積達到2000 mm³ 的時間，滿足其中一點即認定動物死亡。計算每組動物的中位生存期(天)。藉由比較治療組及模型對照組的中位生存期，計算生存期的延長(ILS)，表示為超過模型對照組生存期的百分比。2.4 統計分析 統計分析，包括每個組的每個時間點的腫瘤體積的平均值及標準誤(SEM) (具體數據見表11)。整個實驗在給藥後37天結束，各組動物在給藥後第13天開始陸續安樂死，因此以開始給藥後第13天的腫瘤體積進行統計學分析評估組間差異。兩組間比較用T-test進行分析，三組或多組間比較用one-way ANOVA進行分析，若F值有顯著性差異，應用Games-Howell法進行檢驗。若F值無顯著性差異，應用Dunnet (2-sided)法進行分析。用SPSS 17.0進行所有數據分析。p ＜ 0.05認為有顯著性差異。採用Kaplan-Meier方法Log-rank檢驗對動物生存時間進行分析。3. 實驗結果 3.1 死亡率、發病率及體重變化情況 實驗動物的體重作為間接測定藥物毒性的參考指標。2E5對CloudmanS91細胞皮下同系移植腫瘤雌性DBA/2小鼠模型的體重影響如圖18及圖19所示。在此模型中所有給藥組均未顯示有顯著性體重下降 (圖18)。因此，2E5在小鼠黑色素瘤CloudmanS91模型中無明顯毒性。3.2 腫瘤體積 給予CloudmanS91細胞皮下同系移植腫瘤雌性DBA/2小鼠模型2E5治療後各組腫瘤體積變化如表11所示。表11. 各組不同時間點的瘤體積

註: a. 平均值 ± SEM， b. 給藥後天數。3.3 腫瘤生長曲線 腫瘤生長曲線如圖20所示。3.4 抗腫瘤藥效評價指標 表12. 2E5對CloudmanS91同系移植瘤模型的抑瘤藥效評價 (基於給藥後第13天腫瘤體積計算得出)

註： a. 平均值 ± SEM。 b. 腫瘤生長抑制由T/C及 TGI (TGI (%) = [1-(T13-T0)/ (V13-V0)] ×100) 計算。 c.p 值根據腫瘤體積計算。3.5 生存曲線 各組動物的生存曲線如圖21所示。3.6 生存時間 表13. 2E5對CloudmanS91同系移植瘤模型動物生存期的影響

註：a. p值表示每個給藥組與溶媒對照組比較。 b. 實驗結束時，2E5 3mg/kg組動物存活率為66.7%。4. 實驗結果及討論 在本實驗中，吾人評價了2E5在CloudmanS91同系移植瘤模型中的活體內藥效。各組在不同時間點的瘤體積如表11、表12及圖20所示，生存期如圖21及表13所示。開始給藥後13天，溶劑對照組荷瘤鼠的瘤體積達到1,626 mm³ 。受試物2E5的1 mg/kg組與溶劑對照組相比有微弱的抑瘤作用，瘤體積為1,089 mm³ (T/C = 68.1%，TGI = 34.4 %，p = 0.367)，腫瘤延遲生長天數為0天。2E5的3 mg/kg組與溶劑對照組相比具有顯著的抑瘤作用，瘤體積為361 mm³ (T/C = 22.9 %, TGI = 81.0 %, p = 0.008)，腫瘤延遲生長天數為5天。2E5的10 mg/kg組與溶劑對照組相比也具有顯著的抑瘤作用，瘤體積為614 mm³ (T/C= 39.4 %，TGI = 64.7 %，p = 0.036)，腫瘤延遲生長天數為5天。整個實驗過程中，溶劑對照組荷瘤鼠的中位生存期為16天。與溶媒對照組相比，受試物2E5的1 mg/kg組荷瘤鼠的中位生存期為20天，生存期延長了25% (p=0.077)；受試物2E5的3 mg/kg組荷瘤鼠的存活率為66.7 % (p=0.001)。受試物2E5的10 mg/kg組荷瘤鼠的中位生存期為32天，生存期延長了100% (p=0.022)。 2E5受試物對荷瘤鼠的體重變化影響如圖19。荷瘤鼠對受試藥物2E5在所有劑量下都顯示出良好的耐受性，所有治療組均無明顯體重下降。歸納以上所述，本實驗中，受試物2E5的3 mg/k組及10 mg/kg組對CloudmanS91皮下同系移植瘤模型均有顯著的抗腫瘤作用，但沒有劑量依賴性，3 mg/kg劑量組抗腫瘤作用好於10 mg/kg劑量組。以上，基於本發明的實施方式進行了說明，但本發明不限定於此，熟習此項技術者應明白，在本發明之主旨的範疇內能夠以進行變形及變更的方式實施，此類變形及變更的方式，理應屬於本發明的保護範疇。

圖1為示出16個雜交瘤抗體與細胞表面人PD-1或小鼠PD-1的結合的圖。圖1A顯示了16個雜交瘤抗體與細胞表面人PD-1的結合；圖1B顯示雜交瘤抗體與細胞表面小鼠PD-1的結合。圖2為示出第一輪突變庫篩選的結果。高親和性選殖的序列及分析突變用於第二輪突變。圖3A示出了人源化抗體與細胞表面人PD-1的結合曲線圖，抗體以2.20~2.78 nM的EC50特異性地與人PD-1結合。圖3B示出人源化抗體與細胞表面小鼠PD-1的結合曲線圖，抗體以11.8~15.1 nM的EC50特異性地與小鼠PD-1結合。圖3C示出人源化抗體與活化的食蟹猴PBMC的結合曲線圖。同型對照為人IgG4 kappa。下同。圖4示出了抗體與人、小鼠、食蟹猴PD-1的物種交叉反應試驗ELISA的結果，人源化PD-1抗體與人、食蟹猴及小鼠的PD-1蛋白以劑量依賴的形式結合。圖4A為人源化PD-1抗體與人PD-1蛋白的結合；圖4B為人源化PD-1抗體與小鼠PD-1蛋白的結合；圖4C為人源化PD-1抗體與食蟹猴PD-1蛋白的結合。圖5顯示了人源化抗體與PD-1同家族的CD28及CTLA-4蛋白的交叉反應結果。結果顯示，抗體特異性結合PD-1，但不與PD-1同家族的CD28及CTLA-4結合。圖6A示出人源化抗體阻斷人PD-L1與CHO-S細胞表面的人PD-1的結合，圖6B示出人源化抗體阻斷小鼠PD-L1與293F細胞表面的小鼠PD-1的結合。圖7示出人源化抗體阻斷人PD-L2與PD-1蛋白的結合，且阻斷作用具有劑量依賴性。圖8A-8B示出抗原表位測試結果顯示人源化PD-1抗體與對照抗體結合於相同或相近的抗原表位。圖8A示出與對照抗體1(WBP305BMK1)競爭的表位，圖8B示出與對照抗體2 (Keytruda)競爭的表位。圖9示出抗PD-1抗體與人/小鼠PD-1的交叉反應性；2 μg/mL的每種抗體在96孔平板中包被過夜，並用hPD-1/mPD-1-His蛋白孵育，然後加入HRP-抗His抗體進行檢測。圖10示出了映射在HPD-1結構的熱點殘基。(A) hPD-L1結合位點，自文獻Zak et al. 2015獲得的數據；(B-C)抗體W3052_r16.88.9及Keytruda分別的結合表位，數據來自表8；圖片的顏色用於幫助區分表位之間的差異。圖11示出人及鼠的PD-1之間的比較。其明顯的結構差異(BC環及C'D環(或MPD-1的C"鏈))被標記為橙色。(A) hPD-1 (PDB碼4ZQK)的結構。根據其NMR結構 (PDB碼2M2D)缺少的循環(Asp85-Asp92)而重塑。(B) mPD-1 (PDB碼3BIK)的結構。圖12示出人同種混合淋巴細胞反應(allo-MLR)的結果，表明抗PD-1抗體能夠增強人CD4⁺ T細胞的功能。圖12A所示，所有待測的抗PD-1抗體以劑量依賴的方式增加了人IL-2的分泌。圖12B示出了抗PD-1抗體以劑量依賴的方式增加了人IFN-γ的分泌。圖12C所示，所有待測的抗PD-1抗體均以劑量依賴的方式提高人CD4⁺ T細胞的增殖水平。圖13示出小鼠同種混合淋巴細胞反應的結果，表明抗PD-1抗體能夠增強小鼠CD4⁺ T細胞的功能。圖13A示出所有待測的抗PD-1抗體以劑量依賴的方式增加了小鼠IL-2的分泌。圖13B示出了抗PD-1抗體以劑量依賴的方式增加了小鼠IFN-γ的分泌。圖13C所示，所有待測的抗PD-1抗體均以劑量依賴的方式提高小鼠CD4⁺ T細胞的增殖水平。圖14示出人同種混合淋巴細胞反應的結果，表明PD-1抗體能夠增強人CD4⁺ T細胞的功能。圖14A顯示了人源化PD-1抗體提高了在特異性T細胞響應中IFN-γ的產生。圖14B顯示了人源化PD-1抗體增加了CD4⁺ T細胞的增殖。圖15證明了PD-1抗體可以逆轉Treg的抑制功能。圖15A顯示PD-1抗體恢復了IFN-γ的分泌。圖15B顯示PD-1抗體恢復了效應T細胞的增殖。圖16示出的ADCC試驗結果，證明了抗PD-1抗體不介導活化CD4⁺ T細胞的ADCC活性。圖17示出的CDC試驗結果，證明了抗PD-1抗體不介導活化CD4⁺ T細胞的CDC活性。圖18示出不同組別的老鼠體重變化。CloudmanS91同系移植瘤模型荷瘤鼠在給予2E5後的體重變化。數據點代表組內平均體重，誤差線代表標準誤(SEM)。圖19示出相對體重變化(%)。相對體重變化基於開始給藥時動物體重計算得出。數據點代表組內平均體重變化百分比，誤差線代表標準誤(SEM)。圖20示出CloudmanS91同系移植瘤模型荷瘤鼠在給予2E5後的腫瘤生長曲線。數據點代表組內平均腫瘤體積，誤差線代表標準誤(SEM)。圖21示出CloudmanS91同系移植瘤模型荷瘤鼠在給予2E5後的生存曲線。

Claims

一種抗體或其抗原結合片段，其包含：包含CDR1、CDR2及CDR3序列的重鏈可變區；以及包含CDR1、CDR2及CDR3序列的輕鏈可變區，其中重鏈可變區CDR3序列包含選自由SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13所組成的群組中的胺基酸序列；其中抗體輕鏈可變區CDR3序列包含選自由SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：23所組成的群組中的胺基酸序列；其中該重鏈可變區CDR2序列包含選自由SEQ ID NO：11所組成的群組中的胺基酸序列；其中該輕鏈可變區CDR2序列包含選自由SEQ ID NO：19所組成的群組中的胺基酸序列；其中該重鏈可變區CDR1序列包含選自由SEQ ID NO：10所組成的群組中的胺基酸序列；其中該輕鏈可變區CDR1序列包含選自由SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18所組成的群組中的胺基酸序列，該抗體或其抗原結合片段結合於人PD-1及鼠PD-1。
如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其結合於人PD-1及鼠PD-1的一個表位，該表位包含：SEQ ID NO：24上第35、64、82、83、128、 129、130、131及132位點胺基酸。
如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其中鼠PD-1為小鼠或大鼠PD-1。
如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體a)結合於人PD-1，K_D為2.15E-10M以下；及b)結合於鼠PD-1，K_D為1.67E-08M以下。
如請求項3之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體a)結合於人PD-1，K_D為2.15E-10M以下；及b)結合於鼠PD-1，K_D為1.67E-08M以下。
如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體具有下列性質中的至少一種：a)結合於人PD-1，K_D為4.32E-10M至2.15E-10M，且結合於小鼠PD-1，K_D為5.39E-08M至1.67E-08M；b)不結合於人CD28、CTLA-4；c)增加T細胞的增殖；d)增加干擾素-γ的產生；或e)增加白細胞介素-2的分泌。
如請求項3之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體具有下列性質中的至少一種：a)結合於人PD-1，K_D為4.32E-10M至2.15E-10M，且結合於小鼠PD-1，K_D為5.39E-08M至1.67E-08M；b)不結合於人CD28、CTLA-4；c)增加T細胞的增殖；d)增加干擾素-γ的產生；或e)增加白細胞介素-2的分泌。
如請求項4之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體具有下列性質中的至少一種：a)結合於人PD-1，K_D為4.32E-10M至2.15E-10M，且結合於小鼠PD-1，K_D為5.39E-08M至1.67E-08M；b)不結合於人CD28、CTLA-4；c)增加T細胞的增殖；d)增加干擾素-γ的產生；或e)增加白細胞介素-2的分泌。
如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為嵌合抗體或人源化抗體或人抗體。
一種核酸分子，其編碼如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段。
一種選殖或表現載體，其包含如請求項10之核酸分子。
一種宿主細胞，其包含超過一個以上如請求項11之選殖或表現載體。
一種用於生產如請求項1至9中任一項之抗體的方法，其包括培養如請求項12之宿主細胞及分離該抗體。
如請求項13之方法，其中該抗體係藉由將人類PD-1之細胞外結構域及小鼠PD-1之細胞外結構域免疫接種至SD大鼠而製備的。
一種從包含人免疫球蛋白重鏈及輕鏈轉基因的轉基因大鼠製備的雜交瘤，其中該大鼠表現請求項1至9中任一項之抗體，該雜交瘤產生該抗體。
一種藥物組合物，其包含如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段，以及超過一種醫藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。
一種免疫共軛物，其包含連接至治療劑的如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段。
一種藥物組合物，其包含請求項17之免疫共軛物及醫藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。
一種用於製備抗PD-1抗體或其抗原結合片段的方法，包括：(a)提供：(i)一個重鏈可變區的抗體序列，其包含選自由SEQ ID NO：10所組成的群組中的CDR1序列，選自由SEQ ID NO：11所組成的群組中的CDR2序列以及選自由SEQ ID NO：12及13所組成的群組中的CDR3序列；及(ii)一個輕鏈可變區的抗體序列，其包含選自由SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18所組成的群組中的CDR1序列，選自由SEQ ID：19所組成的群組中的CDR2序列以及選自由SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：23所組成的群組中的CDR3序列；及(b)表現抗體序列成為蛋白質。
一種如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段的用途，其係用於製備調節個體之免疫反應的藥物。
一種如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段的用途，其係用於製備治療免疫病症或癌症的藥物。
一種如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段的用途，其係用於製備抑制腫瘤細胞生長的藥物。
如請求項22之用途，其中該腫瘤細胞選自由黑素瘤、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭部或頸部癌、皮膚或眼內惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌及直腸癌所組成的群組中的癌症。
如請求項22或23之用途，其中該抗體為嵌合抗體或人源化抗體。