TWI719019B - Car-t細胞之肝動脈灌注 - Google Patents

Abstract

本發明係揭露用於治療個體中肝轉移的組成物與方法。該方法包含嵌合抗原受體修飾的T細胞(chimeric antigen receptor modified T cell，CAR-T)之肝動脈灌注(hepatic arterial infusion，HAI)，該嵌合抗原受體修飾的T細胞對於腫瘤抗原有高特異性，該腫瘤抗原例如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)。該HAI方法係被優化以最大化該修飾細胞暴露於轉移細胞，同時最小化暴露於健康細胞。該方法包含第二治療劑，例如IL-2，的共同投予。

Description

CAR-T細胞之肝動脈灌注 相關申請案的交叉參考

本申請案主張2015年4月15日申請之案號為62/147,793的美國專利臨時申請案的優先權，其內容全文併入本案作為參考。

關於政府利益之聲明

本發明係接受國家衛生研究院之合約K08CA160662的政府經費。政府當然擁有本發明的權利。

本文所述之標的係關於治療肝臟相關癌症與轉移的方法，其經由肝動脈灌注基因修飾的或嵌合的抗原受體T細胞(例如CAR-T)，其表現受體蛋白質，該受體蛋白質結合腫瘤特異性抗原並且活化修飾的T細胞之活性。

肝轉移(liver metastases，LM)係自身體的一 部分已經轉移至肝臟的癌症腫瘤。大多數肝轉移的例子係來自於結腸或直腸癌，大約百分之60至70之具有大腸直腸癌的人最終會發展成肝腫瘤。肝轉移係胃腸腺癌病人發病率與死亡率的主要原因。對於具有可切除的肝轉移之病患，雖然肝臟切除已經被視為病患的標準照護，然而許多病患並非肝轉移切除的候選人。化療無法治癒肝轉移，因而產生大量為滿足的臨床需求。

腫瘤浸潤淋巴球(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)研究已顯示宿主T細胞對於LM的反應與病患存活具有顯著相關性(Katz et al.，2013，Ann Surg Oncol，20：946-955；Katz et al.，2010，HPB(Oxford)，12：674-683；Katz et al.，Ann Surg Oncol，16：2524-2530；Wagner et al.，2008，Ann Surg Oncol，15：2310-2317；Turcotte et al.，Canc Immunol Res，2：530-537)。雖然對於LM具有效免疫反應的人傾向於具有延長的存活率，然而絕大多數病患死於其內源性免疫失敗所造成的疾病。肝內環境(intrahepatic milieu)的免疫抑制性可促進LM的發展並且貢獻於侵略性疾病生物學(Cantor et al.，1967，Nature，215：744-745；Katz et al.，2005，Hepatol，42：293-300；Katz et al.，2004，J Immunol，173：230-235；Katz et al.，2011，J Immunol，187：1150-1156)。

據此，需要可有助於宿主或是對於肝轉移存在提供免疫反應的治療策略。鑒於強大的肝TIL反應之有 利影響與肝內空間之固有的抑制本質，傳送高特異性的免疫反應細胞用於治療LM係合理的方法。本文所述為用於抗CEA CAR-T之肝動脈灌注(HAI)的組成物與方法，其可限制肝外毒性並且優化肝轉移的治療功效。

以下所述與繪示之態樣及其具體實施例係例示與說明之用而非限制本申請案之範圍。

在一態樣中，提供治療診斷為具有肝轉移之個體中肝轉移的方法，其包括對於該個體的肝動脈灌注一組成物，其包括表現嵌合抗原T細胞受體蛋白質(CAR)之免疫反應細胞，其中該嵌合的T細胞受體蛋白質係結合至肝臟中的轉移細胞所表現的抗原。

在一些具體實施例中，表現CAR的免疫反應細胞係選自於由T細胞、造血幹細胞、自然殺手細胞、自然殺手T細胞、B細胞、以及單核球系細胞所組成的群組。在一特定具體實施例中，該免疫反應細胞為T細胞。

在一些具體實施例中，免疫反應細胞對於該個體為自體細胞。在另一具體實施例中，該免疫反應細胞對於該個體為非自體細胞。

在一些具體實施例中，該免疫反應細胞為T細胞，以及該方法包括自該個體的血液血清中獲取細胞。在其他的具體實施例中，自該個體的血液血清獲取最少為10⁸、10⁹或10¹⁰個細胞。在其他的具體實施例中，該方法 進一步包括自所獲取的細胞，單離且活化周邊血液單核球細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，以產生自體T細胞的族群。

在一些具體實施例中，該方法包括以核酸載體轉染該免疫反應細胞，該核酸載體包括編碼CAR序列的核酸序列，以產生表現CAR蛋白質的免疫反應細胞之族群。在其他的具體實施例中，該方法進一步包括選擇並且增加表現CAR蛋白質之免疫反應細胞的族群。在一些具體實施例中，該免疫反應細胞為自體T細胞的族群。

在一些具體實施例中，該方法進一步包括於一段治療期間，灌注一劑量之表現該CAR蛋白質的該免疫反應細胞至該病患中，該段治療期間之範圍係自約1至8週、2至8週、2至6週、2至4週、1至4週、1至3週、1至2週、3至6週、或4至6週。在其他的實施例中，灌注表現CAR的免疫反應細胞包括在該段治療期間，每週、每2週、每3週、或每4週灌注該細胞。在一較佳具體實施例中，表現CAR之免疫反應細胞的灌注包括每週灌注CEA CAR-T細胞一次，進行3週。

在一些具體實施例中，表現CAR且CAR結合至CEA之免疫反應細胞(CAR-T細胞)係自體的T細胞。在另一具體實施例中，表現CAR且CAR結合至CEA之免疫反應細胞(CAR-T細胞)係非自體的T細胞。

在一些具體實施例中，灌注至病患的免疫反應細胞之劑量係約10⁷-10¹⁰或10⁸-10⁹個CAR-T細胞。 在其他的具體實施例中，灌注至病患的免疫反應細胞之劑量係約10⁷、10⁸、10⁹或10¹⁰個免疫反應細胞。在一較佳具體實施例中，免疫反應細胞係T細胞，並且CAR結合至CEA。

在一些具體實施例中，該方法包括灌注包括免疫反應細胞與醫藥可相容之溶液的組成物，其中該組成物的總體積範圍係自約25ml至125ml、50ml至75ml、75ml至100ml或50ml至100ml。在一較佳具體實施例中，該免疫反應細胞係T細胞，以及該CAR結合至CEA。

在一些具體實施例中，該組成物係藉由手術技術而被投予至肝動脈。在一些其他的具體實施例中，該組成物係藉由經皮穿刺技術(percutaneous technique)而被投予至肝動脈。在其他的具體實施例中，藉由經皮穿刺技術的投予係胃十二指腸動脈(gastroduodenal artery)與/或胃動脈的前栓塞。

在一些具體實施例中，該方法進一步包括使用血管造影，以於灌注程序過程中確認肝內血液動力學完整性。

在一些具體實施例中，該方法包括經由經皮導管(percutaneous catheter)灌注一組成物，其包括免疫反應細胞與一醫藥可相容的溶液，以及進行肝臟體積計算以劃分肝動脈給藥以反應異常的解剖考量(aberrant anatomical considerations)。

在一些具體實施例中，該方法進一步包括灌注一第二治療劑至個體的肝動脈。在其他的具體實施例中，該第二治療劑係介白素(interleukin)-2(IL-2)。在其他的具體實施例中，相較於在未受投予IL-2的病患中免疫反應細胞的抑制，第二治療劑抑制在該個體中的免疫反應細胞的抑制。

在一些具體實施例中，相較於投予IL-2至該個體之前的CEA量，該方法造成血清CEA降低15-50%、20-50%、30-50%、40-50%、或19至48%。在另一具體實施例中，在該灌注之後的1、2、3、4或5天，發生血清CEA降低。

在一些具體實施例中，在CAR-T治療期間過程中，以範圍從約25,000至150,000IU/公斤/天、25,000至75,000IU/公斤/天、50,000至100,000IU/公斤/天之持續系統性劑量投予IL-2。在其他的實施例中，以約25,000、35,000、40,000、50,000、60,000、75,000、85,000或100,000IU/公斤/天之持續系統性劑量投予IL-2。在一較佳實施例中，以約50,000IU/公斤/天之持續系統性劑量投予IL-2。

在一些具體實施例中，在灌注表現嵌合的T細胞受體蛋白質之免疫反應細胞之前、過程中、或之後，進行灌注該第二治療劑。

在一些具體實施例中，該方法進一步包括投予該個體放射治療至該個體的肝動脈。在其他的實施例 中，該放射治療包括含有釔-90(⁹⁰Y)的複數個微球之投予。在其他的實施例中，投予放射治療包括投予約1至4十億貝克(gigabecquerel，GBq)、1至3GBq、2至4GBq、3至4GBq、或2至3GBq的放射性。在其他的具體實施例中，投予放射治療包括投予約1GBq、1.5GBq、2GBq、2.5GBq、3GBq、3.5GBq或4GBq的放射性。

在一些具體實施例中，投予該放射治療包括在最後的CAR-T灌注之後約1週、2週、或3週，投予放射治療。

在一些具體實施例中，該個體係被診斷具有位於肝臟的轉移疾病。在其他的實施例中，轉移疾病係癌症。在其他的具體實施例中，該癌症係自乳房、結腸、直腸、食道、肺、胰臟與/或胃中的原發性腫瘤轉移。在其他的具體實施例中，該個體係經診斷具有無法切除的轉移性肝腫瘤。在其他的具體實施例中，該個體係經診斷具有來自原發性大腸直腸癌之無法切除的轉移性肝腫瘤。在一些具體實施例中，該個體係經診斷具有肝細胞癌。

在一些具體實施例中，該個體係經診斷具有肝轉移，其中該肝轉移的惡性細胞已顯示表現癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)蛋白質。

在一些具體實施例中，該方法造成個體之肝臟中的腫瘤負擔減少。在其他的實施例中，使用正子放射式斷層掃描(positron emission tomography，PET)、核磁共 振造影(MRI)或活檢，量測腫瘤負擔減少。在其他的具體實施例中，其中該腫瘤負擔係在該治療期間之後量測1-8週或約1、2、3、4、5、6、7或8週。在其他的具體實施例中，該減少的量測係相對於灌注CAR-T細胞的劑量之前的腫瘤負擔。

在其他的具體實施例中，在治療期間後1-8週或約1、2、3、4、5、6、7或8週所量測的腫瘤負擔係不超過在CAR-T細胞第一次劑量灌注之前的腫瘤負擔之50%至90%。

在一些具體實施例中，嵌合的T細胞受體蛋白質包括細胞外區，其特異性結合至該肝臟中的轉移細胞之表面上所表現的腫瘤抗原。在其他的具體實施例中，嵌合的T細胞受體蛋白質包括細胞外區，其特異性結合至癌胚抗原(CEA)蛋白質。

在一些具體實施例中，嵌合的T細胞受體蛋白質包括沿N端至C端方向為CEA-結合的IgG免疫球蛋白區、CD8鉸鏈區、CD28細胞外區、CD28穿膜區、CD28細胞質區、以及CD3 ζ(zeta)細胞質區。

在一些具體實施例中，CEA-結合的IgG免疫球蛋白區係包括SEQ ID NO：1。

在一些具體實施例中，CD8鉸鏈區包括一序列，其係12個胺基酸的長度，並且其係與SEQ ID NO：2的殘基169-180之序列有至少75%、83%、91%或100%的相同性。

在一些具體實施例中，CD28細胞外區包括一序列，其係40個胺基酸的長度，並且其係與SEQ ID NO：4的殘基113-152之序列有至少92%、95%、97%或100%的相同性。

在一些具體實施例中，CD28穿膜區包括一序列，其係27個胺基酸的長度，並且係與SEQ ID NO：4的殘基153-179之序列有至少88%、92%、96%或100%的相同性。

在一些具體實施例中，CD28訊號區包括一序列，其係41個胺基酸的長度，並且其係與SEQ ID NO：4的殘基180-220之序列有至少90%、92%、95%、97%或100%的相同性。

在一些具體實施例中，ζ(zeta)細胞質區包括一序列，其係113個胺基酸的長度，並且係與SEQ ID NO：3的殘基52-164之序列有至少90%、95%、97%、98%、99%或100%的相同性。

在一些具體實施例中，嵌合的T細胞受體蛋白質進一步包括一訊號序列於該T細胞受體蛋白質的N端。在其他的具體實施例中，該訊號胜肽係與SEQ ID NO：6有至少84%、89%、94%或100%的相同性。

在一些具體實施例中，該方法係HITM® HEPATIC IMMUNOTHERAPY FOR METASTASES。

圖1係說明在灌注修飾的免疫反應細胞之前，病患的CD3+與CAR+細胞的平均百分比。

圖2係說明測試病患產物殺死CEA+標的細胞(product killing of CEA+ target cell)之分析結果。

圖3係說明測試如本文所述之修飾的免疫反應細胞的治療效果之第1期臨床試驗方案(phase 1 clinical trial protocol)。

圖4係說明根據本文所述之方法所治療病患的血清CEA量(CEA level)。

圖5A至5B係說明根據本文所述之方法所治療病患的LM纖維化(fibrosis)(圖5A)與LM壞死(necrosis)(圖5B)。

圖6係說明根據本文所述之方法所治療病患的IFNγ量(IFNγ level)。

圖7係說明根據本文所述之方法所治療病患的峰值與平均IFNγ量(IFNγ level)。

將各種態樣更完全說明如下。然而，此等態樣可修飾為許多不同的形式，並以不應被解讀為限制本文所提供的實施例；再者，這些實施例的提供使得本揭露更全面與完整，並且完全傳達其範圍予該技藝的技術人士。

I. 定義

如本說明書所使用，除非內文清楚表示，否則單數形式「一」與「該」包含複數個參考對象。因此，例如，參照一「聚合物」包含單一聚合物以及二多更多個相同或不同的聚合物，參照一「賦形劑」包含單一賦形劑以及二或更多個相同或不同的賦形劑等。

當提供值的範圍時，其係意指在該範圍的上限與下線之間的每一個中間值，以及在該所稱範圍中的任何其他所稱或中間值係包含於本揭露內。例如，若聲明範圍為1mL至8mL，則其意指亦明確揭露2mL、3mL、4mL、5mL、6mL與7mL以及大於或等於1mL的值之範圍與小於或等於8mL的值之範圍。

「病患」、「個體」、「個人」以及類似語詞在本文中係可互換使用，並且係指無論體外(in vitro)或原位(in situ)之任何動物或其細胞，適合於本文所述的方法。在一些非限制的實施例中，該病患、個體、或個人係人類。

本文所使用之「治療」一詞係指治療與/或預防。藉由疾病狀態的抑制、緩解、或根除，而得到治療效果。

本文所使用的「治療」疾病係指降低個體所經歷之疾病或病症的至少一症候或症狀的頻率或嚴重性。本文所使用的「轉染的(transfected)」或「轉形的(transformed)」或「轉導的(transduced)」係指外源的核酸被轉移或導入至宿主細胞的程序。轉染的(transfected)」 或「轉形的(transformed)」或「轉導的(transduced)」細胞係已經用外源核酸所轉染、轉形、或轉導。該細胞包含初級個體細胞(primary subject cell)及其子代。

本文所使用之「治療有效性」一詞應用於劑量或量係指化合物或醫藥組成物(例如，包括免疫細胞之組成物，該免疫細胞例如T淋巴細胞與/或NK細胞)的量在投予至有需要的個體之後造成所想要的活性，該醫藥組成物包括本揭露之嵌合受體，以及進一步包括耐藥性多胜肽。在本揭露的內容中，「治療有效性」一詞係指化合物或醫藥組成物的量足以延遲表現、制止進展、減輕或減緩本揭露的方法所治療之病症的至少一症狀。注意，當投予活性成分的組合時，該組合的有效量可包含或可不包含每一成分若單獨投予為有效的量。

如本文所使用，「腫瘤負載(tumor load)」或「腫瘤負擔(tumor burden)」係指個體之身體中癌症細胞的數目、腫瘤的大小、或是癌症數量。

本文所使用的「嵌合的受體(chimeric receptor)」一詞係定義為細胞表面受體，其包括細胞外配體結合區、穿膜區、以及一或多個細胞質的共刺激訊號區於一組合中，其非一起天然存在於單一蛋白質上。這特別係包含受體，其中該細胞外區與細胞質區並非一起天然存在於單一受體蛋白質上。本揭露的嵌合受體主要係與T細胞及自然殺手(NK)細胞一起使用。本文所述之嵌合受體在本文中亦可指嵌合的抗原受體(chimeric antigen receptor， CAR)、嵌合的配體受體、或是嵌合的T細胞受體。

如本文所述，關於嵌合的T細胞受體，「特異性結合(specifically bind)」之表述係指嵌合的T細胞係以較大親和性結合至其目標蛋白質，親和性係針對結構不同的蛋白質。

II. CAR-T細胞之肝動脈灌注

研究已顯示具有巨大T細胞反應的肝轉移(LM)病患已顯著改良結果，然而，大多數LM病患無法展現有效的肝內抗腫瘤免疫性(Katz et al.，2003，Ann Surg Onc，20：946-955)。嵌合抗原受體修飾的T細胞(CAR-T)，高特異性免疫治療產物設計以針對特定腫瘤抗源，希望提供所需要的抗腫瘤免疫性，特別是對於被診斷具有無法切除之腫瘤的病患。雖然抗原特異性CAR-T細胞的投予已顯示在白血病的早期臨床試驗有鼓舞人心的結果，然而尚未達到成功適應CAR-T技術用於表現CEA的腺癌LM，其係具有腸胃癌症的病患之主要死亡原因。據此，設計且進行第I期臨床試驗，如本文所述，顯示CAR-T技術對於LM的治療係可行的選擇。再者，臨床研究經由系統性的灌注而對付CAR-T之無效率的肝內傳送，其可限制對於LM的CAR-T治療的有效性。以下的說明係測試CAR-T肝動脈灌注(HAI)的研究，顯示CAR-T的直接區域性傳送係安全的並且有效治療LM。綜上所述，數據說明CAR-T HAI係耐受性良好的，並且與殺死腫瘤細胞 的證據有關，顯示CAR-T的肝動脈灌注至LM可確實有效治療有需要之病人的LM。

嵌合抗原受體T細胞

經遺傳工程處理而具有嵌合抗原受體(CAR)的T細胞，使能高特異性的腫瘤辨識與殺死，在以下大有希望的臨床結果之後已經得到相當多的關注(Grupp et al.，2013，Eng J Med，368：1509-1518；Porter et al.，2011，N Eng J Med，365：725-733；Sadelain et al.，2009，Curr Opin Immunol，21：215-223)。以CAR基因重新編程(reprogram)T細胞提供與MHC無關的機制，用於與腫瘤細胞對接(docking)並且溶解(lysing)腫瘤細胞。此修飾的T細胞又稱為「設計者T細胞(designer T cell)」、「T體(T-body)」或「CAR-T細胞」(Ma et al.，2002，Cancer Chemotherapy & Biological Response Modifiers：Elsevier Science，pp.319-345；Park et al.，2011，Trends Biotech，29：550-557；Ma et al.，2014，Prostate，74：286-296)。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)係腺癌LM的CAR-T治療之有吸引力的目標，給定高量的CEA表現與能力以量測血清中的CEA(Blumenthal et al.，2007，BMC Cancer，7：2；Midiri et al.，1985，Cancer，55：2624-2629)。在抗原辨識之後，抗CEA CAR-T增生、產生細胞激素、並且殺死目標細胞(Emtage et al.，Clin Canc Res，14：8112- 8122)。

嵌合抗原受體(CAR)蛋白質與表現這些蛋白質的免疫細胞(例如免疫反應或T細胞)之產生係該技藝中已知的，並且結合標靶功能(targeting function)以及配體或抗體或其片段的特異性與免疫細胞的抗腫瘤活性。請見例如Sadelain et al.，2013，Cancer Discovery，3：388-398。嵌合抗原受體蛋白質通常包括於N端往C端方向：目標結合區，其特異性結合表現在疾病的目標細胞之表面上的蛋白質(例如，癌症細胞或是存在於腹腔的惡性細胞)、鉸鏈區(hinge domain)、穿膜區、以及免疫調節訊號區。

在一較佳的實施例中，CAR蛋白質的目標結合區結合至CEA蛋白質。此CEA結合蛋白質係自擬人化的單株抗體(humanized monoclonal antibody)產生(U.S.Pat.No.6,676,924；Akamatsu et al.，1998，Clin Cancer Res，4：2825-2832；Nolan et al.，1999，Clin Cancer Res，5：3928-3941)。在產生抗CEA CAR建構(construct)中，使用該技藝中常規方法，自重與輕鏈變化區(heavy and light chain variable domain)產生scFV建構，而後scFV片段(本文揭露為SEQ ID NO：1)融合至其他受體區，產生CAR，用於本文所述的治療方法。

每一個鉸鏈區、穿膜區、以及訊號區的較佳實施例係如以下表1所提供。在一些實施例中，CAR建構包括於N端往C端方向，CEA結合區、CD8鉸鏈區、 CD3 ζ鏈穿膜區(CD3 zeta chain transmembrane domain)、以及CD3 ζ鏈細胞質區(CD3 zeta chain cytoplasmic domain)。在較佳的實施例中，CAR建構包括N端往C端方向，CEA結合區、CD8鉸鏈區、CD28細胞外區、CD28穿膜區、CD28訊號區、以及CD3 ζ(zeta)鏈細胞質區。在一些實施例中，該建構進一步包括融合至該目標結合區之N端的訊號胜肽。可理解該信號胜肽未存在於所投予的免疫反應細胞上所表現的CAR蛋白質中，這是由於其在體內(in vivo)已經被切割。

在一些實施例中，嵌合受體蛋白質的目標結合區包括免疫球蛋白的抗原結合部分，其中免疫球蛋白結合疾病細胞之表面上的蛋白質。抗原結合區可為結合至細胞表面抗原的任何區，其包含但不限於配體對受體或是免 疫球蛋白蛋白質，例如單株抗體、多株抗體、合成抗體、人類抗體、擬人化抗體、以及其片段。在較佳的實施例中，CAR的抗體結合區係自抗體的變化區而建構，抗體的變化區可特異性結合抗原，當為CAR建構的部分時。在一些例子中，抗原結合區得自於相同物種是有益的，其中最終將使用CAR。例如，關於用於人類，CAR的抗原結合區包括人類或擬人化抗體的片段可為有益的。據此，在一些實施例中，CAR的抗原結合區包括人類或擬人化抗體的腫瘤抗原結合片段。在這些實施例的每一個實施例中，抗體的抗原結合區，例如單鏈變異片段(single-chain variable fragment，scFV)或是Fab片段，或融合至T細胞受體的穿膜區與訊號細胞內區(內源區(endodomain))。通常，在該細胞外抗原結合區與穿膜區之間導入間隔物(spacer)或鉸鏈(hinge)，以提供可撓性(flexibility)，其使得抗體結合區朝向不同方向，便於抗原辨識與結合。

在一些實施例中，嵌合抗原T細胞受體的抗原結合區部分(antigen binding moiety portion)係針對CEA抗原，並且包括抗體的CEA結合區，其已顯示結合細胞表面上所表現的CEA。可根據具有通常技術者以之的方法與組成物，產生嵌合受體建構。例如，以下實施例中所使用的CEA CAR-T建構係包括擬人化MN14抗體的變化區之部分(描述於U.S.Patent No.5,874,540，其內容全文併入本案作為參考)。根據Nolan et al.(1999，Clinical Canc Res，5：3928-3941)的方法，可自CEA抗體展胜Fab或 scFv建構，以包含CEA抗體的CEA結合區。在一些實施例中，CEA CAR-T建構包括胺基酸序列，其係與SEQ ID NO：1具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性，如下所示：

(SEQ ID NO：1)

在一些實施例中，CEA CAR-T建構進一步包括在SEQ ID NO：1之N端的單一胜肽，其係在CEA CAR-T建構之體內表現後自該建構切除。訊號序列對於通常技術者而言是已知的並且作為導引所轉譯的蛋白質至細胞表面。在CAR蛋白質改變位置至細胞表面的過程中，訊號序列在從內質網通行之後被切割。在其他的實施例中，訊號胜肽的序列為MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO：6)。在其他的實施例中，包括1、2、3、4、5或6個胺基酸的連結分子(linker)序列係在訊號胜肽與CEA結合區之間。

而後，Fab或scFv區可經由胜肽鍵結於其C端融合至鉸鏈區，例如自CD8鉸鏈區(請參閱SwissProt/GenBank Acc.No.P01732；SEQ ID NO：2)。在一較佳實施例中，鉸鏈區包括一序列，其係12個胺基酸的長度，並且與SEQ ID NO：2的殘基(residue)169-180的 序列有至少83%、91%或100%的相同性。在其他的實施例中，鉸鏈區包括一序列，其係與SEQ ID NO：2的殘基(residue)111-190中存在的10-20、10-30、10-40或10-50個殘基的連續序列(continguous sequence)有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的相同性。

而後，鉸鏈區可於其C端融合至一穿膜區。在一些實施例中，該穿膜區包括一序列，其係來自CD3 ζ(zeta)鏈(GenBank/SwissProt Acc.No.P20963；SEQ ID NO：3)。在此實施例中，該穿膜區包括一序列，其係20-30個胺基酸或是20、21、22、23個胺基酸的長度，並且係與SEQ ID NO：3的殘基(residue)31-51中存在的15-25或20-30個殘基的連續序列(continguous sequence)有至少85%、90%、95%或100%的相同性。在一些實施例中，來自CD3 ζ(zeta)鏈的穿膜區包括SEQ ID NO：3的位置31-51的胺基酸序列。在一較佳實施例中，CAR的穿膜區係來自於CD25蛋白質(例如，GenBank/SwissProt Acc.No.P10747；SEQ ID NO：4)。穿膜區可包括一序列，其係27個胺基酸長度，並且係與SEQ ID NO：4的殘基153-179的序列有至少88%、92%或100%的相同性。在其他的實施例中，穿膜區包括一序列，其係與SEQ ID NO：4的殘基150-190中存在的20-30、20-40或20-50個殘基的連續序列(continguous sequence)有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的相同性。當CAR穿膜區係如上所述之CD28穿膜區時，CAR可進一步包括CD28細胞外區， 其中該細胞外區係位於CD8鉸鏈區與CD28穿膜區之間。CD28細胞外區係35-45或是約38、39、40、41或42個胺基酸長度，並且係與SEQ ID NO：4的殘基110-160中存在的35-45個殘基的連續序列(continguous sequence)有至少92%、95%、97%或100%的相同性。

CD3 ζ(zeta)鏈細胞質區係存在於CAR建構的C端，並且包括一序列，其係與SEQ ID NO：3的殘基40-164序列中存在的100-120個胺基酸的連續序列(continguous sequence)有至少90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的相同性。在一較佳實施例中，該ζ(zeta)鏈區包括一序列，其係與SEQ ID NO：3的殘基52-164有至少97%、98%、99%或100的相同性。

在一較佳實施例中，CAR進一步包括CD28訊號區C端至穿膜區，以及N端至CD3 ζ(zeta)鏈細胞質區。在一些實施例中，CD28訊號區包括一序列，其係與SEQ ID NO：4的殘基175-220序列中存在的35-45個胺基酸的連續序列(continguous sequence)有至少92%、95%或100%的相同性。在一較佳實施例中，CD28訊號區包括一序列，其係與SEQ ID NO：4的殘基180-220有至少92%、95%或100的相同性。

在一較佳實施例中，CAR多胜肽序列包括N端往C端方向：包括SEQ ID NO：1的CEA結合區、如上所述之CD8鉸鏈區、如上所述之CD28細胞外區、如上所述之CD28穿膜區、如上所述之CD28訊號區、以及如 上所述之CD3 ζ(zeta)細胞質區。在一實施例中，此CAR序列包括N端至C端區各自為以下片段：SEQ ID NO：1(CEA結合區)、SEQ ID NO：2(CD8鉸鏈)的殘基169-180、SEQ ID NO：4(CD28細胞外區)的殘基113-152、SEQ ID NO：4(CD28穿膜區)的殘基153-179、SEQ ID NO：4(CD28細胞質區)的殘基180-220、以及SEQ ID NO：3(CD3 ζ(zeta)鏈細胞質區)(在本文中又稱為“抗CEA scfv-CD8α-CD28/CD3ζ”)的殘基52-164。使用常規方法建構CAR建構可涉及使用以限制內核酶位置的導入之全長基因序列的PCR放大，其使得不同區的消化切割(digestion)與連接(ligation)而產生所想要的融合建構，但其亦可在該嵌合建構的各區之間編碼一或多個胺基酸。據此，在一些實施例中，CAR序列包括1、2或3個胺基酸的連接分子序列，其係位於接合與CD8鉸鏈區之間、鉸鏈與CD28細胞外區之間、細胞外區與穿膜區之間、穿膜與訊號區之間、穿膜與ζ(zeta)細胞質區之間、以及/或CD28訊號與ζ(zeta)細胞質區之間。

CAR-T細胞的製備

在擴增(expansion)與遺傳修飾(genetic modification)之前，T細胞的來源係得自於需要治療肝轉移的個體。T細胞可得自於一些來源，包含周邊血液單核球細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染位置的組織、腹水、肋膜積液(pleural effusion)、脾臟 組織、以及腫瘤。在本揭露的一些態樣中，可使用該技藝中可得到的任何數目的T細胞株。可使用技術人士所知的任何數目的技術，例如Ficoll^TM分離，從個體收集的血液單位獲得T細胞。在一較佳實施例中，藉由血球分離(apheresis)，獲得來自個體之循環血液的細胞。該血球分離產物典型包含淋巴細胞，含有T細胞、單核球細胞、顆粒細胞、B細胞、其他有核的白血球細胞、紅血球細胞、以及血小板。可清洗血球分離所收集的細胞，以移除血漿部分，並且將細胞至於適當的緩衝液或媒介中以進行後續處理步驟。該技藝中具有通常技術者可輕易理解可藉由該技藝中技術人士所知的方法完成清洗步驟，例如根據製造商的操作指南，藉由使用半自動流通離心(flow-through centrifuge)而完成。在清洗之後，可將細胞重新懸浮於多種生物可相容的緩衝液，例如無Ca、無Mg的PBS，或是有或沒有緩衝液的其他鹽溶液。或者，可移除細胞分離樣品之不想要的成分，並且將細胞直接重新懸浮於培養液中。

藉由正或副選擇技術，可分離與/或增加特定的T細胞次族群(subpopulation of T cell)，例如CD3+、CD28+、CD4、CD8+、CD45RA+與CD45RO+ T細胞。例如，在一些實施例中，用抗CD+3/抗CD28接合的珠粒(bead)培養足以正分離所想要的T細胞之一段時間以分離T細胞。該技藝之技術人士可理解在本揭露的內容中亦可使用多回選擇。在一些態樣中，可能希望進行選擇程序， 並且在活化與擴增製程中使用未經選擇的細胞。未經選擇的細胞液可用於進一步的選擇。

在一些實施例中，可選擇表現IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、顆粒酶(granzyme)B、以及穿孔素(perforin)、或其他適合的分子，例如其他細胞激素(cytokine)中之一或多種的T細胞族群。例如，可藉由PCT公開案案號WO 2013/126712所描述的方法，決定用於篩選細胞表現的方法。例如，通常可使用美國專利第6,352,694號、第7,232,566號、第6,797,514號、第6,867,041號以及美國專利申請案公開案第20060121005號所述之內容，活化且擴增T細胞。

關於用於治療經診斷為肝轉移之病患的CAR-T細胞的製備，病患進行白血球分離(leukapheresis)，以獲取至少4×10⁹個T細胞，理想目標為約6×10⁹個T細胞。可在2小時進行白血球分離產物中的T細胞數目初始評估，並且而後是需要重複進行。純化細胞以擷取周邊血液單核球細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，本文中或稱富含淋巴細胞(lymphocyte-rich，PBL)。藉由暴露至50ng/ml OKT3與3000IU/mL IL-2，活化該淋巴細胞(Walker et al.，1993，4：659-680)。如上所述，用10μg/mL魚精蛋白(protamine)，以含有重組嵌合CAR之反轉錄病毒的高感染力價(high titer)上清液，轉導(transduce)經活化的細胞(Cornetta et al.， 1989，23：187-194)。在隔天，重複該程序以增加受轉導細胞的比例。轉導之後兩天，以流式細胞儀分析小量細胞之轉殖基因的表現。若轉導的細胞之比例小於10%，則該等細胞可再進行兩回合的轉導並且再次以流式細胞儀分析受轉導的細胞之比例。當以有充足數量的T細胞受到轉導(例如，>10%)時，在活化條件(以上)下，以例如1.2-1.5×10⁶/mL培養該細胞。保留剩餘之受活化的細胞直到知道轉染結果，若需要，則再次嘗試剩餘之受活化的細胞。在培養中擴增受轉導的T細胞並且監看該受轉導的T細胞之生長/轉導參數(倍增時間、總細胞數、%轉導、T細胞活化指示)。在冷凍儲存該細胞之前，加入10% DMSO、20%人類血清以及3000IU/ml的IL-2。何時獲取細胞的決定係基於存在足夠之總細胞，因而在獲取之後維持足夠的細胞以待擴增用於未來的灌注(infusion)。典型地，從T細胞活化至劑量獲取間隔範圍係自2-3週。在擴增過程中，進行流式細胞儀以記錄存檔表現嵌合受體之T細胞的存在。其他測試包含存活率、不孕性(sterility)、以及針對CEA+與CEA-目標之標準細胞毒性分析。以病患T細胞進行達三次嘗試，以達到足夠的轉導效率與細胞數目，以構成劑量。在一些實施例中，集合來自不同轉導所擴增的細胞以構成該劑量。

藉由以編碼CAR建構之表現載體，轉染淋巴球細胞的族群，可對治療性CAR-T細胞進行遺傳工程以使其表現CAR核酸建構。製備表現經選擇的CAR建構之 受轉導的淋巴細胞族群之適當手段係該技藝之技術人士已知的，並且包含但不限於反轉錄病毒、MFG載體、腺病毒為基礎的載體、腺相關病毒(AAV)為基礎的載體、反轉錄病毒載體、反轉錄病毒-腺病毒載體、以及得自於單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)之載體。以下實施例1描述所使用的方法以產生投予至病患的CAR-T細胞。

在一較佳實施例中，以攜帶所想要的CAR建構的反轉錄病毒，轉染T細胞。MFG反轉錄病毒及其使用於轉染真核細胞為具有該技藝之通常技術的人士所已知的。關於CAR-T細胞的產生，可在MFG反轉錄病毒載體主鏈(backbone)的NcoI-BamHI位置之間插入編碼CEA CAR的表現匣(expression cassette)。所插入的序列之起始密碼子(initiation codon)係精準位於病毒env起始密碼子的位置。可使用稱為MPSV/PBSQ的MFG載體，其中MoMLV LTR已經被骨髓增生病毒(myeloproliferative virus)的同源序列取代，以及5’引子結合位置已經被使用tRANglu而非tRANpro的變異之同源序列取代作為正股引子(positive strand primer)。在一些實施例中，反轉錄病毒載體不包含可選擇的標記基因。可使用PG13包裝細胞株(PG13 packaging cell line)，生產來自受轉染細胞之反轉錄病毒載體上清液。藉由穩定導入長臂猿白血病毒(gibbon ape leukemia virus，GALV)協助者包裹者系統(helper wrapper system)至老鼠3T3細胞中，而產生PG13 細胞株。藉由兩步驟程序，形成載體生產者細胞(vector producer cell，VPC)株。首先，CAR-MFG載體被轉染至GP+E86外生性包裝細胞株(GP+E86 ecotropic packaging cell line)中。收集來自受轉染液胞的暫態病毒上清液，並且用於感染PG13細胞。在感染之後，藉由流式細胞儀分析該PG13細胞之CAR轉殖基因(transgene)的表現。而後，藉由FACS歸類穩定表現CAR轉殖基因的細胞，以建立主要工作細胞庫(master working cell bank)，而後測試安全性、不孕性、相同性、以及複製能力反轉錄病毒(replication competent retrovirus，RCR)之不存在。受轉導的細胞被冷凍成量以形成病患劑量。在一些實施例中，適當量的CAR-T細胞儲存為液態氮氣相，一袋中含有約50-100mL、75-100mL、75-125mL或約50mL、75mL、100mL或135mL的溶液，其係等張(isotonic)且醫藥可接受的。在一些實施例中，該溶液含有約15-25%、15%、20%或25%的白蛋白。在其他的實施例中，該溶液包含約5-15%、5%、10%或15%的二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide，DMSO)。在一較佳的實施例中，該溶液體積係約100mL，並且包含適當數目的細胞、約20%的白蛋白以及約10%的DMSO。在一些實施例中，在冷凍之前，加入約400,000-500,000IU或約450,000IU IL-2至該袋，以於投予之前維持細胞存活率。在投予之前，解凍該溶液。

CAR-T細胞的肝動脈灌注(Hepatic Artery Infusion，HAI)

本文所揭露的研究與結果顯示經由肝動脈灌注表現CAR的免疫反應細胞可對於治療以轉移至肝臟的癌症提供治療效果。相較於灌注例如小分子化學療劑，針對肝轉移，特別是表現CEA的轉移性細胞，投予如本文所述之細胞係顯著更複雜的程序。正常細胞，例如在結腸的細胞，表現CEA。重要的是最小化或是排除修飾的CAR-T細胞接觸正常細胞，以最小化或是防止破壞健康的細胞。CAR-T細胞係免疫細胞，其可分泌各種細胞激素，造成不良的副作用。以下所述係解決此問題的方法，具體而言，最小化修飾的免疫反應細胞暴露於健康細胞的手段，同時優化該修飾的細胞與疾病細胞的接觸。

在一較佳的實施例中，表現CAR的免疫反應細胞係抗CEA CAR-T細胞，其係使用從待以該遺傳工程處理之細胞治療的個體所得之T細胞。當修飾的細胞被有效率地導引至存在轉移性細胞的肝臟時，CAR-T細胞之HAI治療經診斷具有肝轉移之病患將最為有效。亦選擇CAR-T的HAI，用以將表現CEA的肝外組織受到免疫媒介的破壞最小化。最可能受惠於CAR-T治療的病患係經診斷具有肝轉移的病患，例如大腸直腸癌肝轉移。然而，可理解本文所揭露之治療方法可有效治療肝臟腫瘤細胞或肝轉移細胞表現可被遺傳工程處理且投予的CAR-T細胞所辨識之一或多種蛋白質之病患。此腫瘤抗原包含但不限於醣類抗原(carbohydrate antigen，CA)19-9、醣類抗原(carbohydrate antigen，CA)125、以及胸腺嘧啶核苷激 酶(thymidine kinase)。在一較佳的實施例中，表現在CAR-T細胞之表面上的嵌合受體辨識且結合至已知的癌症抗原癌胚抗原(cancer antigen carcinoembryonic antigen)。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)係由許多惡性細胞型所表現的癌胚細胞表面醣蛋白質(oncofetal cell surface glycoprotein)，該惡性細胞型包含但於限於結腸直腸的、胃的、胰臟的、肺、乳房、以及甲狀腺髓質癌細胞。轉移至另一器官的此惡性細胞，例如肝臟，維持其表現型(phenotype)，包含CEA的表現，因而成為抗CEA免疫治療的目標。CEA具有多個同功異形體(isoform)，其結構與序列係已知的且已被定性(例如，GenBank Accession Numbers NP_001171742、NP_001171744、NP_001020083以及SwissProt Accession Number P13688)。本揭露之方法利用免疫反應細胞的使用，其係被遺傳工程處理，以表現嵌合受體蛋白質，其特異性辨識CEA蛋白質，如該技藝中已知者。在一些實施例中，該嵌合受體蛋白質特異性結合至CEA蛋白質，其包括與SEQ ID NO：5有至少90%、95%、98%或99%相同性的胺基酸序列。

以CAR-T細胞治療的病患已被診斷為肝臟中有癌症。在一些實施例中，該等病患具有可偵測之無法切除的具CEA(CEA-positive)的肝轉移或是可偵測的血清CEA量。在其他的實施例中，該等病患為一或多線的習知系統性治療或化療無效。在CAR-T治療之前，進行肝臟MRI與PET檢查，以判定癌症或轉移之位置與程度。

雖然直接灌注修飾的細胞至肝動脈中會導入大多數之該修飾的細胞至肝臟，然而在多達40-45%的人中發現許多細胞會因肝動脈解剖的變異而轉向。在該族群中約80-85%中可見適當肝動脈分支為右與左肝動脈以供應整個肝臟。在該族群的剩餘部分中，例如，肝動脈可僅分支為右或是僅分支為左肝動脈(分別送入(feeding)肝臟的右或左葉(lobe))，或是適當的肝動脈可被迷走血管(aberrant vessel)取代，使得一些血液流動轉向至其他非肝臟的器官。據此，重要的是在進行HAI之前，映射(map)引領至肝臟之右與左葉的血管，以及當需要時，堵塞未引領至肝臟的血管(vessel)。在一些實施例中，在灌注之前，經由一共同的股動脈(femoral artery)途徑，病患進行映射血管造影(mapping angiogram)。

映射血管的方法對於該技藝之通常技術人士係已知的。在治療之前，一旦完成此映射，從業人員可判定堵塞哪個血管。例如，經由使用微線圈栓塞術(microcoil embolization)達到堵塞(occlusion)，這使得從業人員可阻斷目標動脈或血管，藉以優化修飾細胞遞送至肝臟。在投予第一劑量的CAR-T細胞之前，視需要可進行微線圈栓塞術，以便於最佳灌注包括CAR-T細胞的醫藥組成物。

所述之方法涉及經由導管(catheter)投予治療性CAR-T細胞，該導管係直接放置於肝動脈內。例如，將包括治療性CAR-T細胞的醫藥組成物經由針筒以手注 入肝動脈，注入速度為<1mL/秒、<2mL/秒或是速度為約1至2mL/秒、1至3mL/秒、1至5mL/秒、1mL/秒、2mL/秒或3mL/秒。或者，使用該技藝中已知的灌注幫浦注射該細胞，注射速度係與以手注射之速度相同。包括治療性CAR-T細胞(例如，約10⁸、10⁹或10¹⁰個細胞)之劑量的醫藥組成物具有總體積為約25至100mL、25至75mL、40至60mL、50至75mL或50至100mL，或是具有總體積為約25mL、40mL、50mL、60mL、75mL或100mL。本文所述之方法可進一步包括進行肝臟體積計算，以確保投予至病患的修飾細胞之劑量係被引導至右與左肝動脈，藉以於整個肝臟提供治療有效劑量。根據該技藝之通常技術者已知的標準方法，進行肝臟體積計算，該肝臟體積計算包含但不限於閃爍造影術(scintigraphy)、超音波、單光子發射電腦斷層(single-photon emission computed tomography)、電腦斷層(computed tomography，CT)、以及核磁共振造影(magnetic resonance imaging)。一旦完成病患的體積計算，修飾細胞的劑量或數目分為灌注至右與左肝動脈，因而遞送至右與左葉的修飾細胞之數目係分別與右及左葉的體積成正比。

在一些實施例中，總體積的50%係灌注至病患中，攪拌CAR-T溶液以確保完全細胞懸浮，而後總體積的最後50%係灌注至病患中。可使用18號針頭進行灌注。

IL-2的共同投予(Co-Administration of IL-2)

在CAR-T治療期間，病患每週或是每2週接受CAR-T灌注。CAR-T治療期間可為2、3、4、5、6、7、8、9或10週，或是可持續2-10、4-9、2-8、2-6、2-4、3-6、4-8或4-6週。CAR-T治療期間的開始(第0天)係自待治療病患(或是從非待治療病患的個體)獲取血液細胞的那天。接受CAR-T細胞灌注的病患亦可被投予IL-2。IL-2有助於CAR-T細胞在灌注之後的存活率，然而，較佳係IL-2的劑量不會造成或促進不良副作用，例如發燒、乾嘔(nausea)、嘔吐(emesis)與/或心跳過速(tachycardia)。在一些實施例中，在CAR-T治療期間的全程過程，持續投予IL-2。可使用幫浦儲存器(pump reservoir)完成此持續灌注，並且經由中心靜脈導管或使病患非臥床(ambulatory)的其他方法投予此持續灌注。在CAR-T灌注開始之前的1、2或3小時內、在開始第一次CAR-T灌注之時或期間、或是在完成第一次CAR-T灌注之後的1、2或3小時內，可開始IL-2灌注。

CEA CAR-T HAI的第I期試驗(Phase I Trial for CEA CAR-T HAI)

進行第1期臨床試驗，其中初期招收(enroll)8位具有肝轉移(LM)的病患，並且如本文所述，以抗CEA CAR-T細胞治療。該等病患中的六位完成此方案(protocol)。該等病患分為第1組(Cohort 1)與第2組 (Cohort 2)。在第0天自所有病患獲取細胞並且用於產生抗CEA CAR-T細胞(抗CEA scfv-CD8α-CD28/CD3ζ CAR-T細胞)。在第14、28與42天，第1組的每一個病患接受10⁸個細胞的灌注於第14天，10⁹個細胞的灌注於第28天、以及10¹⁰個細胞的灌注於第42天。關於第2組，在第14、28與42天，每一個病患接受10¹⁰個細胞的灌注。第2組的病患在第14天開始亦接受持續灌注劑量為75,000IU/公斤/天的IL-2，於第55天或第56天結束。在約第56天。在第56天完成第1組與第2組的MRI與PET分析。完成方案的6個病患的數據顯示抗CEA CAR-T的灌注對於有與沒有系統性IL-2灌注有良好的耐受性。發現無論有或沒有系統IL-2(請參閱圖6)，所有病患在劑量之後的24至48小時，發生IFNγ高峰(spike in IFNγ)。雖然沒有放射線攝影的部分或全部反應，然而6個病患其中之一有穩定疾病並且而後存活至少24個月。

本文所述的研究建立無論有或無系統性IL-2支持之抗CEA CAR-T HAI的安全性，達到最大計畫劑量為10¹⁰個細胞。據此，關於CAR-T HAI的安全性與有效性，研究結果支持使用CAR T HAI用於治療LM。在研究對象中，有限的系統性暴露CAR-T可能說明有利的不良情況概況(favorable adverse event profile)。在更嚴重的花費(expense)但可管理的不良情況，系統性的IL-2支持係與增加的血清IFNγ量有關並且改良CEA反應。如實施例4所示，相較於正常肝臟與周邊血液，在6個病患其中5 個中，HAI造成CAR-T偏好累積於肝臟轉移內。6個病患其中4個中，周邊血液中未偵測到CAR-T並且僅短暫偵測到在病患7與8中。重要的是在CAR-T HAI之後，在大多數的個體中看見增加的LM壞死與纖維化的組織學證據(請參閱圖5)。這些數據皆說明有效遞送CEA CAR-T細胞至CEA+腫瘤堆積(deposit)係與殺死腫瘤與血清細胞激素激增有良好的關聯性，支持經由肝動脈灌注治療肝轉移之CAR-T細胞的治療效果(例如，抗CEA scfv-CD8α-CD28/CD3ζ CAR-T細胞)。

相較於正常肝臟與周邊血液，在6個HITM病患的其中5個中，HAI造成CAR-T偏好累積在LM中。6個病患其中4個中，周邊血液中未偵測到CAR-T並且僅短暫偵測到在病患7與8中。肝功能測試值的適度增加(例如，鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)、總膽紅素(bilirubin)以及天門冬胺酸轉胺酶(aspartate aminotransferase)量的短暫增加)可能係與CAR-T HAI有關，但不會造成臨床顯著的結果。先前已報導過表現抗CEA CAR-T的T細胞系統性灌注造成劑量限制性毒性(dose-limiting toxicity)(Parkhurst et al.，2011，Mol Ther，19：620-626)。在本研究的抗CEA CAR-T與當特別係有IL-2支持(未圖示)的系統性灌注時，可見到類似的毒性。IL-2之持續非臥床(ambulatory)灌注劑量75,000IU/公斤/天係比其他方案(Rosenberg et al.，1999，J Clin Oncol，17：968-975)所給的劑量低數倍。儘管在此 研究中的IL-2的每日劑量是低的，然而有兩個病患經歷第3級情況(grade 3 event)，需要降低IL-2劑量。這些不良情況，包含嚴重發燒(pyrexia)與結腸炎(colitis)，可歸因於IL-2，這是基於IL-2劑量降低之後症狀立即解除之事實。在一個體中，可能是IL-2活化小量的系統循環抗CEA CAR-T，其媒介發燒與結腸炎。整體而言，IL-2灌注投予有良好的耐受性，並且藉由劑量降低而輕易管理不良情況。

在本揭露的一態樣中，每一個病患的CEA CAR-T細胞劑量係每週一次經由HAI投予10¹⁰個細胞。藉由本文所揭露之第1期試驗之血清肝臟化學與細胞激素數據，支持每週一次細胞灌注的治療效果。在第1期研究中，大部分病患在CEA CAR-T HAI之後，顯示暫時但臨床非顯著增加的血清鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)、總膽紅素(bilirubin)以及天門冬胺酸轉胺酶(aspartate aminotransferase)量(請參閱實施例7)。幾乎在所有的例子中，量在3-4天內恢復正常(normalized)。同樣地，病患顯示在CAR-T HAI之後，血清IFNγ與IL-6量激增，其在1週之內回復到基線或是接近基線的量。這些數據推測一週間隔足以使得對於CAR-T HAI的急性發炎反應解除，並且允許安全重複CAR-T。將CAR-T間隔從2週改為1週亦會將病患的IL-2暴露最小化，並且使得更快速返回到系統性治療，對於那些人，這是臨床指標。在一較佳的實施例中，每週一次投予CEA CAR-T細胞灌注的病 患接受持續的IL-2系統性灌注，IL-2劑量為50,000IU/公斤/天。在一些實施例中，經診斷為具有無發切除的肝轉移之病患在CAR-T灌注治療期間，被投予劑量為50,000IU/公斤/天的IL-2達28天，包括最終CAR-T灌注後的14天。

可藉由例行的影像技術，例如核磁共振造影(MRI)、正子放射式斷層掃描(positron emission tomography，PET)或是超音波，判定肝轉移之CAR-T治療的治療效果。此造影程序可在治療之前、治療過程中、以及治療之後，量測肝臟中的腫瘤負擔或是腫瘤的程度。相對於第一次細胞灌注之前的腫瘤負擔，CAR-T細胞之HAI的治療有效性的劑量療法可相對地縮小腫瘤負擔約10%至100%、10%至80%、10%至60%、10%至40%、20%至40%、20%至60%、20%至80%。

CAR-T HAI與選擇性內部放射治療(Selective Internal Radiation Therapy，SIRT)

選擇性內部放射治療(Selective Internal Radiation Therapy，SIRT)係一種放射治療形式，通常用於經診斷具有無法切除之癌症的病患。SIRT係投予為放射性微球(radioactive microsphere)至標的，例如器官、組織、或腫瘤，以有效遞送治療性劑量的游離輻射(ionizing radiation)至該目標，造成目標器官、組織或腫瘤的破壞或死亡。

作為治療性應用的放射性微球典型包括一基質材料，其可作為放射性核種(radionuclide)材料的載體，該放射性核種材料發射游離輻射。特別地，先前已經顯示一些貝塔輻射發射放射性核種(beta radiation emitting radionuclide)，例如磷-32、鈥-166(Holmium-166)或釔-90(Yttrium-90)可附接至基質微球，例如聚合樹脂或是玻璃微球，用於注射至癌症病患的血流中，具治療效果。

通常經由目標組織或腫瘤的動脈血液供應，遞送放射性微球。為此，導管被導引至血管的分支，其送入(feed)目標組織或腫瘤，以將微球灌注至循環中。藉由注射放射性微球至肝動脈、肝門靜脈、或是這些血管的分支，放射性微球可被導入至整個肝臟的動脈血液供應中、肝臟的區段、或是至含有待治療之腫瘤的肝臟部分之動脈血液供應中。該放射性微球變得堵塞在目標組織或腫瘤的毛細血管床(capillary bed)中，提供選性遞送輻射劑量至目標組織或腫瘤。

可用於肝癌之SIRT的兩種市售可取得的產品包含TheraSphere®(MDS Nordion,Inc.)與SIR-Spheres®(SIRTeX® Medical Ltd.)。兩種產品皆為標示釔-90(Yttrium-90)的微球：TheraSpheres®是直徑為25±10μm的玻璃微球；以及SIR-Spheres®是以樹脂為基底的微球，其直徑為32±2.5μm。

儘管本文所揭露之第1期試驗的良好結果與CEA CAR-T HAI的治療效果，最佳總是盡可能優化治療 效果與便利性。結合的策略通常可將對於經診斷具有無法治癒疾病之病患的效益最大化。放射治療經由抗原釋放與招來反應T細胞而誘導免疫原性腫瘤細胞死亡。單獨放射治療很少可產生有效的抗腫瘤免疫性。然而，當結合標的免疫治療劑時，放射治療顯著增加治療有效性的抗腫瘤免疫反應。已經設計「HITM-SIR」試驗以測試安全性，並且在CAR-T HAI之後，藉由使用SIR-Spheres®而可能增加殺死腫瘤。HITM-SIR係已建立的原則與與方法之新的迭代(novel iteration)，具有已證實的安全性。此新的試驗具有潛力產生用於LM管理之範例變化的數據(paradigm-changing data)。

在一態樣中，提供治療經診斷具有肝轉移之個體的方法，其中該個體係以CAR-T HAI治療，如上所述，有或沒有系統性IL-2投予，接著投予SIRT。基於腫瘤的體積，投予相當於2GBq、2.5GBq或3GBq的⁹⁰Y活性之SIR-Sphere至病患。在一些實施例中，具有腫瘤體積小於約25%、約25%-5%或是大於約50%的總肝臟體積的餅面係分別給予相當於2GBq、2.5GBq或3GBq的⁹⁰Y活性之SIR-Sphere。在最終CAR-T HAI灌注之後約1週、2週或3週，投予SIR-Sphere的劑量至病患。在一較佳的實施例中，在最終CAR-T HAI灌注之後約1週，投予SIR-Sphere的劑量。

免疫抑制劑

嵌合抗原受體T細胞灌注的治療效果可能受到造成免疫抑制之因子的影響，例如抑制殺死腫瘤細胞或是減少抗腫瘤細胞激素的表現。重要的是考量在癌存在的腹腔空間之免疫環境的影響，並且據以治療進行嵌合受體T細胞治療的病患。

在腫瘤環境中的免疫抑制調節T細胞(Tregs)與骨髓衍生的抑制細胞(myeloid derived suppressor cells，MDSC)的累積代表發展有效抗腫瘤免疫治療之潛在主要的障礙(Weiss et al.，2014，J Immunol.，192：5821-5829)。去除MDSC已經在具有腫瘤的老鼠與癌症病患中顯示顯著改良免疫反應(Ostrong-Rosenberg et al.，2009，J Immunol，182：4499-4506；Talmadge，2007，Clin Cancer Rres，13：5243-5248)。本文提供藉由進行嵌合受體T細胞治療至病患中的例如Treg與MDSC而抑制免疫抑制的方法，其中該病患亦被投予一劑，其抑制免疫抑制細胞的功能。MDSC與Treg已經被描述為內生T細胞與CAR-T抗腫瘤反應的抑制劑(Khaled et al.，2013，Immunol Cell Biol，91：493-502；Burkholder et al.，2014，Biochim，Biophys Acta，1845：182-201)。IP MDSC亦表現高量的PD-L1(計畫性死亡-1受體配體(programmed death-1 receptor ligand))，其先前顯示係CAR-T一至的重要媒介物(Burga et al.，2015，64：817-829)。據此，在本揭露的一態樣中，接受CAR-T HAI的病患亦被投予免疫抑制劑，其抑制抑制T細胞的活性，例 如MDSCs或Treg。在一些實施例中，免疫抑制劑係MDSC消耗抗體，其結合Gr1(顆粒性骨髓標記蛋白質(granulocytic myeloid marker protein))或PD-L1阻擋抗體(PD-L1 blocking antibody)。

在一些實施例中，免疫抑制劑係結合IL-10、PD-1(計畫性死亡-1受體(programmed death-1 receptor))、PD-L1(計畫性死亡-1受體配體1(programed death-1 receptor ligand 1))、PD-L2(計畫性死亡-1受體配體2(programed death-1 receptor ligand 2))、STAT3(轉錄之訊號轉導子與活化子3(signal transducer and activator of transcription 3))、GM-CSF、CD25、GITR(糖皮質激素誘導的TNFR相關蛋白質(glucocorticoid-induced TNFR-related protein))、TGF-β或CTLA4的抗體。在其他的實施例中，在灌注CAR-T細胞之前，將免疫抑制劑投予至個體。在其他的實施例中，在灌注CAR-T細胞之後，將免疫抑制劑投予至個體。可多次投予免疫抑制劑，例如在CAR-T HIA之後的每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天或是每週(每7天)一次。免疫抑制劑之投予可和灌注同天，或是可在第一次CAR-T肝動脈關注之前的1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、或更多天投予免疫抑制劑。可對病患投予超過一種免疫抑制劑，例如個體可同時投予或是連續投予結合CD25的抗體以及結合GR1的抗體。

相關技藝之前述實施例以及與其相關的限制 係用於說明而非限制本發明。對於該技藝之技術人士而言，在讀取說明書與研究圖式之後，相關技藝的其他限制變得明顯。

IV. 實施例

以下的實施例本質係用以說明而非用於限制本揭露之內容。

實施例1 人類CAR-T細胞生產

如下之詳細說明，六個病患(在本文係指病患編號1、4、5、6、7與8)以肝灌注CAR-T細胞進行治療，特異性針對在其表面上表現CEA抗原的轉移細胞。抗CEA scfv-CD8α-CD28/CD3ζ(串列(Tandem))嵌合抗原受體係被轉殖至MFG反轉錄病毒主鏈中，如前所述(FDA BB IND 10791)(Emtage et al.，Clin Canc Res，14：8112-8122，其全文併入本案作為參考)。簡言之，藉由以N端至C端方向分子融合單株抗體的hMN14 sFv(SEQ ID NO：6)，其特異性結合CEA，CD8鉸鏈片段、CD28細胞外區、穿膜區與細胞質區、以及ζ細胞質區，以產生串列分子(tandem molecule)。將所得到的嵌合建構轉殖至反轉錄病毒載體，並且以限制酶切割(restriction digestion)與定序確認。使用PG13細胞生產臨床的反轉錄病毒載體上清液，以產生入長臂猿白血病毒(gibbon ape leukemia virus)假型病毒顆粒，如前所述(Beaudoin et al.，2008，J Virol Methods，148：253-259)。在Indiana University載體生產場所(Indianapolis，IN)製備所有的臨床批次，並且儲存在-80℃直到使用。

在Roger Williams Medical Center(RWMC，Providence，RI)，Rhode Island Blood Center人員進行白血球分離(leukapheresis)。在RWMC Cell Immunotherapy and Gene Therapy(CITGT)Good Manufacturing Practice(GMP)Facility，以標準操作程序(SOP)，處理、製造、擴增、劑量獲取、標示、儲存、與分佈，製備抗CEA CAR-T。簡言之，使用Ficoll(Sigma，St；Louis，MO)，從白血球分離產物分離病患周邊血液單核球細胞(PBMC)。而後，我們在含有AIM V培養液(Life Technologies，Grand Island，NY)補充5%無菌人類AB血清(Valley Biomedical，Winchester，VA)、50ng/mL的抗CD3單株抗體(OKT3；Ortho Biotech，Horsham，PA)與3000U/mL的IL-2(Prometheus，San Diego，CA)的組織培養燒瓶(BD Falcon，Franklin Lakes，NJ)中，活化PBMC達48-72小時。

使用旋轉接種(spinoculation)方法(Quintas-Cardama et al.，2007，Hum Gene Ther，18：1253-1260)，在塗覆retronectin(Takara Bio Inc，Japan)的6槽盤中，將得自於病患的7.2-14.4×10⁸個T細胞轉導(transduced)於AIM V培養液與5%人類AB血清、3000U/ mL的IL-2以及硫酸魚精蛋白(protamine sulfate)(MP Biomedicals)於室溫以低速離心1小時。轉導步驟於24小時共進行3次。在轉導之後，細胞以培養液清洗並且於37℃培養48-72小時。CAR-T進一步於Lifecell組織培養袋(Baxter，Deerfield，IL)內擴增10-14天。週期性檢查CAR-T生長曲線與細胞存活率，並且視需要更換細胞生長培養液。以針對CD3(UCHT1，Invitrogen，Frederick，MD)、CD4(SK3，BD Biosciences，San Jose，CA)、CD8(3B5，Invitrogen)以及CAR表現(WI2 antibody，Immunomedics，Norris Plains，NJ)的螢光標示抗體，藉由流式細胞儀分析，檢測CAR-T。WI2抗體製備為APC共軛物(APC conjugate)(WI2-APC；Molecular Probes)。在CyAn(Beckman Coulter，Brea，CA)或LSR-II(BD Biosciences，San Jose，CA)機器上，進行流式細胞儀分析。藉由生物螢光細胞毒性分析，量測病患產物的體外活性。在96槽圓底盤中以不同比例混合表現螢光酵素(luciferase)的CEA+腫瘤細胞與抗CEA CAR-T，並且量測每一槽的生物螢光損失(Karimi et al.，2014，PLoS One，9：e89357)。在IL-2(500IU/mL)存在中，培養且擴增轉導的T細胞，並且在轉導之後的48小時，檢測CAR表現量。

為了評估CAR-T細胞，在轉導抗CEA CAR建構之前與之後，藉由流式細胞儀分析來自每一個病患的白血球分離產物。關於病患1、4、5、6、7與8，白血球 分離之後的CD3+細胞之平均比例為55%(範圍係12.0-82.0)，並且在活化與轉導之後增加製91%(範圍係72-97)(圖1)。在白血球分離樣品中，平均的CD4：CD8比例為2.4(範圍係1.4-4.7)，在最終產物(未圖示)中為0.8(0.2-2.2)。轉導效率(CAR+)範圍係自10%至64%，平均為45%(圖1)。在灌注之前，在CAR+ T細胞之間偵測可忽略的FoxP3染色(未圖示)。在灌注之前，最終產物中的細胞為85%(範圍係71-95)存活。進行體外細胞毒性分析，以測試病患產物殺死CEA+目標細胞。抗CEA CAR-T細胞與CEA+ MC38大腸直腸癌目標細胞一起培養。藉由加入螢光素(luciferin)之後的生物螢光損失，定量目標細胞殺死(target cell killing)。基於殘留的光子計數，計算特定的細胞溶解(lysis)。這些分析確認病患產物特異性溶解(lysed)CEA+目標細胞(圖2)。

使用Fenwal細胞獲取系統(Baxter，Deerfield，IL)，製備臨床劑量於含有PlasmaLyte(Baxter)、20%人牛白蛋白(human bovine albumin)(Valley Biomedicals)、10% DMSO(Bioniche Pharma，Lake Forrest，IL)與IL-2的冷凍培養液。分別監看細菌與真菌培養14天與28天。使用LAL內毒素分析套組(Endotoxin assay kit)(Lonza，Walkersville，MD)，進行細菌內毒素的分析。臨床劑量儲存於液態氮中，並且在灌注之前立即解凍。

實施例2 臨床研究設計

進行第I期臨床研究(NCT01373047，RWH 11-335-99)。研究登記8位具有無法切除之CEA+腺癌LM的病患，其歷經平均2.5(範圍係2-4)線的習知系統性治療(表1)。

DFI=從原發性至肝轉移診斷的無病間隔(disease free interval from diagnosis of primary to liver metastases)；LM=肝轉移；SIZE=在CAR-T治療之前的最大LM；IL-2=持續灌注IL-2與CAR-T；RPN=腹膜後的節點(retroperitoneal nodes)；*=壺腹癌的胰膽管子型(pancreatobiliary subtype of ampullary carcinoma)；^=因肝外進展而在兩次劑量之後退出；^^=因不相關的醫 藥條件而退出；**=藉由免疫組織化學確認腫瘤樣本中的CEA表現。

六個病患完成方案(protocol)(第3圖)，一個病患在治療之前因不相關的感染而退出，以及另一個病患在其第三次CAR-T HAI之前因肝外疾病進展而退出。完成該方案的病患中，四位係男性，兩位係女性。五位病患具有第四期大腸直腸癌，以及一位病患具有胰膽管壺腹癌(pancreatobiliary ampullary carcinoma)。平均年齡為57(範圍係51-66)。病患呈現大量的疾病負擔，最大LM的平均尺寸為8.4公分(範圍係1.7-14.4)，並且五位病患具有超過10個LM。在登記(enrollment)之後，平均CEA量為807ng/ml(範圍係2-3265)。八位病患中的五位具有同步的大腸直腸LM，以及具有轉移性LM病患平均無疾病間隔為27.3個月(範圍係9至37)。所有進一步分析僅包含六位完成研究的病患。

在此研究中，兩組各三位病患係以抗CEA CAR-T HAI治療，分別無或有系統性IL-2支持(第3圖)。第1組(病患1、4與5)係以治療劑量逐步增加的方式(10⁸、10⁹與10¹⁰個細胞)，用CAR-T HAI治療且無IL-2。具體而言，在第0天，自各個病患收集T細胞，在第14天第一次灌注，灌注10⁸個細胞，在第28天第二次灌注，灌注10⁹個細胞，以及在第44天第三次灌注，灌注10¹⁰個細胞。第二組的病患(病患6、7與8)，除了在第 14天第一次灌注時開始經由非臥床式灌注幫浦持續系統性IL-2灌注75,000U/公斤/天達6週之外，在第14天、第28天與第44天，接受3次HAI的10¹⁰個CAR-T。

符合條件的患者具有可量測之無法切除的具CEA之LM或是可偵測的血清CEA量，並且失敗於一或多線的習知系統性治療。允許在肺或腹部的最小肝外疾病。在基線(baseline)、灌注日、以及灌注之後的第1、2、4與7天，進行臨床評估。在第一次灌注之前一個月，而後在第三次CAR-T HAI之後的一個月內，以肝MRI與PET檢測進行計畫性的影像評估。該研究的放射科醫師(BS)根據修改的RECIST(mRECIST)以及免疫相關的反應評估準則(criteria)，將反應分級(Wolchok et al.，2009，Clin Cancer Res，15：7412-7420)。不知情的(blinded)病理學家對於治療之前以及第二劑量之後的兩週進行的經皮穿刺活檢(percutaneous biopsies)之載玻片上的腫瘤壞死與纖維化進行給分。按照方案(protocol)進行安全性評估。使用Adverse Events version 3.0的國家癌症機構共同術語評估準則(National Cancer Institute Common Terminology Criteria)，將不良情況(adverse events)的嚴重性分級。

實施例3 CAR-T細胞肝動脈灌注

在基線，經由右共同的股動脈(femoral artery) 途徑，進行映射血管造影(mapping angiogram)。除了肝外灌注之其他潛在來源之外，用微線圈栓塞胃與十二指腸(gastroduodenal)及右胃動脈。關於CAR-T灌注，進行相同的動脈接入程序(arterial access procedure)，以及用60cc針管以手注入細胞，注射速度<2cc/秒，總體積為100cc。在開始的50cc以及在CAR-T灌注完成時，以計算的相對速度進行血管造影術(angiography)，以確認保留的動脈血流。可能時，灌注係遞送至適當得肝動脈。在異常該動脈解剖的情況下，右側或左側肝動脈並非從適當得肝動脈出現，劑量係基於葉體積(lobar volume)計算而分裂。在此種情況中，分裂的劑量係分別遞送至右與左肝動脈中，以確保適當的CAR-T遞送至兩葉(both lobes)。

以下用於實施例中的抗CEA scfv-CD8α-CD28/CD3ζ(串列)嵌合抗原受體係被轉殖至MFG反轉錄病毒得主鏈中，如前所述(FDA BB IND 10791)(Nolan，et al.，1999，Clin Cancer Res，5：3928-394；Emtage et al.，2008，Clin Cancer Res，14：8112-8122；請見上述實施例1)。簡言之，藉由分子融合編碼hMN14 sFv-CD8鉸鏈段之片段與混合(hybrid)CD28/CD3ζ分子於MFG反轉錄病毒主鏈以產生串列分子(tandem molecule)。藉由限制酶切割與定序，確認該建構。使用PG13細胞生產臨床反轉錄病毒載體上清液，以產生入長臂猿白血病毒(gibbon ape leukemia virus)假型病毒顆粒，如前所述(Beaudoin et al.，2008，J Virol Methods，148：253-259)。在Indiana University載體生產場所(Indianapolis，IN)製備所有的臨床批次，並且儲存在-80℃直到使用。

實施例4 在灌注之後的CAR-T細胞移動(CAR-T Cell Trafficking Following Infusion)

在第一次CAR-T HAI與最終的HAI之時，為了取樣LM與正常肝臟，取得CT導引的經皮穿刺活檢(percutaneous biopsies)。藉由流式細胞儀分析，判定在LM活檢、正常肝臟活檢、以及周邊血液樣品中的CAR-T比例(CAR+/總淋巴細胞%)。例如，來自病患7的樣品顯示在CAR-T的HAI之後，正常肝臟淋巴細胞的1.8%係CAR+，以及腫瘤內淋巴細胞的7.6%係CAR+。經確認灌注後的LM活檢樣本中的CAR+細胞係CD3+。對於所有病患，判定周邊血液、正常肝臟、以及LM中的CAR-T族群數據(CAR-T population data)。在6位病患中的5位中，相較於正常肝臟，CAR-T較大量存在於LM中。在病患5中，在他的最終CAR-T灌注之後的12週，在微波消磨程序(microwave ablation procedure)過程中所得之樣品中，發現CAR-T包括1.4%的LM淋巴細胞。在4位病患中，周邊血液中無法偵測到CAR-T，但在最終灌注之時，CAR-T短暫存在於病患7與8，並且3天之後量降到可偵測程度之下。對於最終灌注之後的2天所得之周邊血液樣本，進行定量PCR；相對於基線，僅病患7具有可量測到 的CAR DNA之增加(1.1倍)。在CAR-T灌注之後，在病患血清中，未偵測到抗CAR抗體。

實施例5 治療活性

最後隨訪(At last follow-up)，完成試驗的6位多次治療的病患(heavily pre-treated patient)之中的5位因疾病進展而死亡(表1)。

^在第2次活檢或IL-2灌注中段時自基線的倍數變化；SAE：嚴重的不良情況；DOD：疾病的死亡(dead of disease)；AWD：帶病存活(alive with disease)；PD：疾病進展(progressive disease)；SD：穩定

病患2因肝外進展而在2 CAR-T劑量之後退出，並且在第2次CAR-T灌注之後23天DOD。病患3因不相關的醫藥 狀態而在細胞收集之後退出。

在基線以及第三次CAR-T HAI之後，對6位病患中的5位進行MRI與PET。病患8返回他的祖國且最後死於疾病僅展因而未獲得最終影像。除了病患5之外，藉由mRECIST及評估準則，判定所有病患具有放射疾病進展(radiographic disease progression)。藉由MRI與PER，發現病患5具有穩定的疾病。病患7發展新的器官損害(lesion)並且呈現一些預先存在的器官損害之尺寸增加而其他器官損害尺寸縮小。病患7的背部(posterior sector)中的器官損害在MRI中係尺寸縮小，在PET則不可見。在MRI的尺寸縮小之更多的內側疾病(medial disease)被發現在病患7灌注後的PET變成低代謝。

由於在CAR-T灌注後之短追蹤習知造影的效用有限，我們對於每位病患在三次HAI的每一次之後，在多個時間點，量測血清CEA量。在第1組的病患之中，在每一次CAR-T HAI之後，有兩位病患顯示血清CEA暫時降低(圖4，病患1與5)。CEA動力學(kinetics)接近平行於血清CA19-9量的變化(未繪示)。具有肝膽子型壺腹癌(hepatobiliary subtype ampullary carcinoma)的病患4係唯一在試驗過程之任何時點沒有CEA減少的病患，並且他亦具有最短的存活時間。

接受系統性IL-2與抗CEA CAR-T的第2組病患對於治療具有較有利的CEA反應。當第2組中的三位病患之每一位需要IL-2中斷或是劑量降低，這可能會 影響CAR-T灌注，我們比較在基線與在IL-2劑量改變之前的時間點之CEA量(由圖4中的箭號所指)。當使用這些時間點時，第2組的所有病患之血清CEA濃度降低(圖4與表3)。在IL-2劑量中斷或降低之前，病患7與8的血清CEA濃度分別降低48%與43%。完成試驗的6位病患之平均整體存活時間為30週，中位數為15週(範圍係8-73)。病患5在他的最後一次CAR-T HAI之後，與疾病存活24個月。在完成HITM試驗之後，病患5被判定為具有穩定疾病，我們進行殘留非可切除之腫瘤的微波消磨(microwave ablation)。

在具有晚期轉移疾病(advanced metastatic disease)之多次治療病患(heavily pre-treated patient)中偵測放射反應是具挑戰性，使用免疫治療更是如此，其中腫瘤內發炎與水腫(edema)可將標準RECIST評估準則的相關性最小化(Wolchok et al.，2009，Clin Canc Res，1：57412-7420)。因此，在CAR-T HAI之前與之後，我們獲得LM活檢，以評估腫瘤內壞死與纖維化的程度。在基線以及在第三次CAR-T HAI之時，於超聲導引(sonographic guidance)之下，獲得正常肝臟與肝轉移核心針(core needle)(16號針)活檢。得到正常肝臟與肝轉移的三次核心(core)，各自藉由細胞學(cytology)確認。對於每一個例子，以蘇木紫-伊紅(hematoxylin and eosin，H&E)染色4至5mm區域，並且以抗CEA抗體(TF 3H8-1；Ventana)染色其他未染色的載玻片。在Our Lady of Fatima Hospital (Providence，RI)的Ventana Medical System，進行所有免疫組織化學染色。以不知情的(blinded)方式重新檢閱(review)所有的載玻片並且分類壞死與纖維化。將纖維化評分如下：0%，第0級；5%至10%，第1級；11%至50%，第2級；>50%，第3級。將壞死評分如下：0%，第0級；0%至10%，第1級；11%至50%，第2級；>50%，第3級。在新鮮的活檢組織針對CAR-T細胞與周邊血液進行流式細胞儀分析，如上所述。再不知情的病理學家進行重新檢閱之後，4位病患具有腫瘤內纖維化增加，以及3位病患被評為在他們的LM內有增加壞死(圖5)。對於每一個病患，基線與灌注後分數(scores)係於圖5由左至右所示。病患1、4、7與8顯示纖維化增加，而病患4與5顯示壞死增加。

實施例6 血清IFNγ濃度及CEA反應與IL-2投予相關

在多個時間點，以ELISA量測血清IFNγ量。發現IFNγ高峰發生在所有病患給藥之後的24-48小時，無論沒有或有系統性的IL-2(圖6；垂直虛線表示CAR-T灌注時間點，以及第一數據點代表在CAR-T灌注之前的基線值)。比較每一位病患的血清CEA變化與IFNγ高峰變化(圖7，頂部)。高峰IFNγ量與CEA變化的逆相關性(inverse correlation)係顯著的(R=-0.94，p=0.02)。所有病患HAI CAR-T劑量含有IL-2的量(600,000IU)。三位病患 (病患編號6、7與8)具有持續性的系統性IL-2暴露，並且最大的CAR-T劑量具有最佳的CEA反應與最高的平均IFNγ量(P=0.03，圖7，底部)。

實施例7 安全性數據

在完成試驗的所有病患中，觀察到可歸因於任何原因之任何等級的不良情況(adverse event，AE)(表2)。第1組的劑量達到計畫的最大HAI CAR-T灌注量10¹⁰個細胞。第1組不需要CAR-T劑量降低，因此，第2組中的所有病患接受3次劑量為10¹⁰量與IL-2支持(support)。沒有第4級或第5級不良情況。發現4位病患有發熱AE。病患7經歷第3級發燒與心跳過速(tachycardia)，最高溫為104℉。在病患7的系統性IL-2灌注中降低50%劑量，她的發燒與心跳過速(tachycardia)解除。注意，病患7亦經歷她的外周嗜酸性白血球數(peripheral eosinophil count)高峰值為20%以及絕對數為3,740/ml。鑒於IL-2灌注與具有Loeffler症候群(Loeffler’s syndrome)的心血栓形成(cardiac thrombosis)之間經報導的關聯性(Junghans et al.，2001，New Eng J Med，34：859-860)，我們獲得正常的心臟超音波影像(echocardiogram)與心電圖(electrocardiogram)。無特別干預，她的嗜酸性白血球數回到正常範圍。

*在28天第三次灌注之後，由於疾病進展而死亡。

^導致IL-2劑量降低。

病患#2經歷第3級腹痛與脫水；在第2次HAI之後，他退出方案，並互在23天後死於疾病進展。病患#3因不相關的醫藥狀況而在CAR-T灌注之間退出。

肝功能測試不良情況反應值在正常範圍之外並且不需要自基線改變。

在CAR-T HAI之後，良好保留正常的肝臟薄壁細胞(parenchyma)與膽(biliary)結構。無論有無系統性IL-2的投予，在CAR-T HAI之後，來自正常肝臟的活檢不呈現發炎或纖維化的程度增加。雖然所有病患經歷鹼性磷酸酶(alk phos)、總膽紅素以及天門冬胺酸轉胺酶(aspartate aminotransferase)量(AST)的短暫增加，然而僅病患1經歷第3級增加，並且大部分的值並未顯著偏離基線的量。由於沒有病患變得血小板減少(thrombocytopenic)或凝血障礙(coagulopathic)，因而門脈壓力(Portal pressure)與肝臟合成功能並未受到CAR-T HAI之不良影響。

實施例8 安全性數據

進行第I期臨床研究，其中經由HAI投予各個病患10¹⁰個抗CEA scfv-CD8α-CD28/CD3ζ CAR-T細胞(如以上之實施例所述)。在第0天，自各個病患分離T細胞，經轉染與選擇以表現抗CEA scfv-CD8α-CD28/CD3ζ建構。而後，在第14、21與28天，對每位病患投予10¹⁰個細胞。在第44天(最後細胞灌注之後的2週休息時間後)，對於每位病患灌注含有SIR-Spheres®的劑量。

關於SIR-Spheres®給藥，病患將接受預定量的SIR-Spheres®，其依照相對於正常肝臟體積之腫瘤體積大小而變化。對於具有總肝臟體積之<25%、25%-50%或 >50%的腫瘤之病患，給藥SIR-Spheres®相當於2十億貝克(gigabecquerel，GBq)、2.5GBq、或3GBq的⁹⁰Y活性。針對病患的規定是肺-肝通過呼吸掃描(lung-liver breaththrough scan)表示超過10%的微球通過肝臟並且卡在(lodged)肺中。肺-肝通過呼吸比例超過10%，每超過1%，所要投予的⁹⁰Y活性量降低2%。在SIR-Spheres®治療的當天或隔天，患者出院。

在最後灌注之後的一個月，藉由適當的臨床與放射研究，將患者評估為具有完全反應、部分反應、穩定的疾病、或進展的疾病。藉由流式細胞儀分析偵測抗-CEA scfv-CD8α-CD28/CD3ζ與CD4/CD8以及藉由PCR，監看修飾的T細胞之循環量。LM與正常肝臟活檢樣本係用於判定CAR-T腫瘤浸潤(tumor infiltration)的程度。藉由流式細胞儀分析與/或免疫組織化學分析活檢樣本以定量抗CEA scfv-CD8α-CD28/CD3ζ CAR-T之存在。為了正常肝臟T細胞族群中的血清細胞激素量與變化，抽取樣本。進行ELISA分析，以量測血清IL-2、IFNγ、IL6、IL17與IL10。自CBC相同時間點，判定嗜中性白血球(Neutrophil)：淋巴細胞的比例，以及藉由流式細胞儀分析肝臟與周邊T細胞族群的詳細評估。以對於CD3、CD4、CD8、FOXP3、PD-1、CD25、CTLA4與CD69具特異性的抗體，染色肝內與周邊T細胞。

雖然以上已說明一些例示態樣與實施例，然而該技藝中的技術人士可理解一些修飾、變更、增加、及 其次組合(sub-combination)。因此，以下所附之申請專利範圍與之後所加入的申請專利範圍係被解讀為包含所有該等修飾、變更、增加與次組合，這些皆在申請專利範圍的真實精神與範圍內。

<110> 美商展望憑照看護公司亦以羅傑威廉斯醫療中心名稱營業(Prospect Chartercare RWMC,LLC D/B/A Roger Williams Medical Center)

<120> CAR-T細胞之肝動脈灌注

<130> 096201-0120/8001.US00

<140> 105111666

<141> 2016-04-14

<150> US 62/147,793

<151> 2015-04-15

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 1

<210> 2

<211> 235

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 384

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

<210> 4

<211> 220

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

<210> 5

<211> 526

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

<210> 6

<211> 19

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Claims (15)

1. 一種通過經皮灌注到個體肝動脈來治療肝轉移之藥劑，包括：表現嵌合抗原受體蛋白質之嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T cell)，其中該嵌合抗原受體蛋白質結合至該肝臟中的轉移細胞上所表現的抗原，且其中該嵌合抗原受體蛋白質包括SEQ ID NO：1。
2. 如申請專利範圍第1項之藥劑，其係用於進行血管造影(angiography)以映射(map)肝動脈與附近的血管之後。
3. 如申請專利範圍第2項之藥劑，其係用於堵塞未送入(feed into)該肝臟中的血管之後。
4. 如申請專利範圍第1項之藥劑，其係用於通過經皮灌注到個體肝動脈來治療肝轉移，同時在該經皮灌注過程中進行血管造影，其中該血管造影監看該經皮灌注過程中的肝內血液動力學的完整性(hemodynamic integrity)。
5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之藥劑，進一步包括第二治療劑。
6. 如申請專利範圍第5項之藥劑，其中該第二治療劑係IL-2。
7. 如申請專利範圍第6項之藥劑，其係用於在包括該免疫反應細胞之該組成物的該經皮灌注之前、過程中、或之後，投予該第二治療劑。
8. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之藥劑，其 係用於將包括該CAR-T細胞的該組成物每週一次、每2週一次、每3週一次、或每4週一次，經皮灌注至該肝動脈中。
9. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之藥劑，其係用於經皮灌注包括10⁸至10¹⁰個CAR-T細胞的該組成物至該肝動脈中。
10. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之藥劑，其中相較於在該灌注之前的血清中的癌胚抗原(CEA)的量，該灌注該組成物造成血清癌胚抗原(CEA)的40%至50%降低。
11. 一種治療肝轉移之藥劑，包括：表現嵌合抗原受體(CAR)蛋白質之CAR-T細胞，其中該CAR蛋白質係結合至癌胚抗原(CEA)，且其中該嵌合抗原受體蛋白質包括SEQ ID NO：1。
12. 如申請專利範圍第11項之藥劑，其中該CAR沿N端至C端方向包括：結合癌胚抗原(CEA)之scFv、CD8鉸鏈區、CD28細胞外區、CD28穿膜區、CD28細胞質區、以及CD3 ζ(zeta)細胞質區。
13. 如申請專利範圍第12項之藥劑，其係用於經皮灌注10⁸至10¹⁰個CAR-T細胞至肝動脈中。
14. 如申請專利範圍第12項之藥劑，進一步包括包含第二治療劑的組成物。
15. 如申請專利範圍第14項之藥劑，其中該第二治療劑係IL-2或釔-90。

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