TWI717036B - 非藥物幽門桿菌殺菌組合物 - Google Patents

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TWI717036B TW108135302A TW108135302A TWI717036B TW I717036 B TWI717036 B TW I717036B TW 108135302 A TW108135302 A TW 108135302A TW 108135302 A TW108135302 A TW 108135302A TW I717036 B TWI717036 B TW I717036B
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Abstract

本發明為一種非藥物幽門桿菌殺菌組合物，包括：一第一日常食用成分，其中該第一日常食用成分於一溶液狀態下，具有一分子態及一解離態、該分子態第一日常食用成分用以在pH值小於5之環境下，執行殺除一幽門桿菌及抑制該幽門桿菌之一抗壞血酸氧化酶之功能、且該第一日常食用成分係為檸檬酸、蘋果酸或其組合；以及一第二日常食用成分，係一鹽類，用以與該第一日常食用成分構成一緩衝組合，並用以中和一碳酸氫鹽，以利該第一日常食用成分持續有效進行殺除該幽門桿菌及抑制該幽門桿菌抗壞血酸氧化酶之功能，其中該鹽類係為檸檬酸鹽、蘋果酸鹽或其組合。

Description

非藥物幽門桿菌殺菌組合物
本發明有關一種非藥物幽門桿菌殺菌組合物。更詳細而言，本發明關於一種在pH值小於5之環境下，執行殺除一幽門桿菌及抑制該幽門桿菌之一抗壞血酸氧化酶之功能之非藥物幽門桿菌殺菌組合物。
全球幽門螺旋桿菌感染率超過50%，且感染者的10-15%會發展為胃潰瘍。95%十二指腸潰瘍和80%胃潰瘍和幽門螺旋桿菌有關。有1-3%感染者會發展成胃癌。因此，世界衛生組織(WHO)將幽門螺旋桿菌列為1級致癌物(請參照參考文獻D(1))。
最近幾年對幽門螺旋桿菌在胃黏膜的存活和致病研究，正是醫學界藉以觀察微生物在黏膜致病(慢性傳染(chronic infections))機轉之重點。醫學界希望藉由黏膜中消滅幽門螺旋桿菌來找黏膜中消滅其他有毒害致病微生物之解決方案。因腸道微生物失調(dysbiosis)常是一些慢性病，如肥胖(obesity)、糖尿病(diabetes)及發炎性疾病(inflammatory diseases)的致病原(請參照參考文獻D(1))。
幽門螺旋桿菌是在人類消化道生存的最有趣微生物之一，且和胃十二指腸黏膜(gastroduodenal mucosa)內之活躍的炎症變化(active inflammatory changes)有關(胃部約50-65%相關；十二指腸約95%相關)。據 研究顯示，幽門螺旋桿菌感染者應完全消滅幽門螺旋桿菌以避免胃潰瘍之復發(ulcer recurrence)和併發症(ulcer complications)(請參照參考文獻D(2))。
幽門螺旋桿菌是一種聰明的細菌，一旦住進人體胃部，便可以安然地和人體共生。臨床發現，幽門螺旋桿菌感染者有80%到90%會有慢性胃炎問題，但僅20%會出現症狀，感染者中有15%到20%會引發胃潰瘍或十二指腸潰瘍，1%到3%帶菌者會演變為胃癌，千分之一到萬分之一會有胃淋巴癌問題，相較於未感染幽門螺旋桿菌者，罹患胃癌的風險增加6倍之多(請詳參考文獻D(22))。
有研究報告顯示，幽門螺旋桿菌長期寄生在胃黏膜內會導致慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis)且後續引發腺癌(adenocarcinoma)(請參照參考文獻D(2))。
關於幽門螺旋桿菌感染療法之未來趨勢展望重點可以下列(1)至(3)點來探討(請參照參考文獻D(3))：
(1)現今療法之瓶頸
●日益嚴重之抗藥性
●長期服用之健康顧慮！(一個療程10-14天；每天3-4次)
●抗藥性造成單次劑量過高，增加毒副作用！！！(單一抗生素500-1000mg)
●日益嚴重之復發性
●抗生素誘發其它病症包括
a.肥胖
b.脂肪肝病
c.第二型糖尿病
●抗生素主要受胃黏膜阻礙而顯著影響藥效，反而傷肝腎胃！
●抗生素的毒副作用造成就醫病患的不適與身體額外負擔*單一幽門螺旋桿菌感染導致癌症之病患(78萬)約占全球每年致癌病患的6.2%-非常高的占比！
(2)傳統三合一療法之進階版：
●加鉍劑為“四合一”：提升療效(“鉍劑”主在“尿素酶活性抑制”)
●N-acetylcysteine(NAC)替代加入“三合一”或單劑使用
●NAC之主要副作用：
a.具高毒副作用且需高劑量
b.有效降低胃黏膜黏度，但易造成潰瘍惡化！
(3)最新幽門螺旋桿菌感染療法之研發方向：
●窄譜(narrow-spectrum)
●非抗生素(non-antibiotic)
幽門螺旋桿菌主要寄生在人類胃部的胃竇黏膜內的上皮細胞之頂部(請參照參考文獻D(1)第1圖)。胃黏膜內的pH為階梯式(pH-gradient)，主因是上皮細胞頂部會分泌碳酸氫鹽(HCO3 -)進入黏膜抗酸並形成胃黏膜內的pH梯度(pH-gradient)(請參照參考文獻D(4)摘要)。所以，本案組合物要能有效完全消滅在胃部寄生的幽門螺旋桿菌，必須要在胃黏膜內能抗鹼(即抗碳酸氫鹽(HCO3 -))且在酸性環境滅菌。再者，胃液(gastric juice)含尿素，幽門螺旋桿菌具尿素酶可將尿素水解來提升微環境的pH，以對抗酸(即氫離子)攻擊。一般抗生素的活性多在pH5-8之間，反而需要制酸 劑或氫離子幫浦阻斷劑(Proton Pump Inhibitor,PPI)來抑制胃酸分泌，避免胃部pH過低而不利抗生素的殺菌作用(請參照參考文獻D(5)第3圖)。總而言之，胃黏膜內的碳酸氫鹽(HCO3 -)對幽門螺旋桿菌能夠寄生在胃黏膜內的上皮細胞之頂部極為重要。另外，尿素酶也是幽門螺旋桿菌能夠寄生在胃黏膜內的重要關鍵之一。
以下說明胃竇黏膜內的“碳酸氫鹽障壁(bicarbonate barrier)”：幽門桿菌在胃竇黏膜(mucus)內上皮細胞(epithelial cell)頂部寄生(colonization)請參照參考文獻D(1)第1圖。
關於胃竇黏膜內的pH梯度(pH-gradient)請參照參考文獻D(4)摘要。根據參考文獻D(4)，有關消化道黏膜的“碳酸氫鹽障壁(bicarbonate barrier)”特性包括pH梯度(pH-gradient)(從腔體到上皮細胞頂部，pH是由低而高)、抗酸(against acid)、抗胃蛋白酶(against pepsin)。第C6頁第2圖(小鼠活體實驗)中A組刺激胃壁細胞分泌胃液-使用五肽胃泌素(pentagastrin)、B組抑制胃酸分泌-使用雷尼替丁(ranitidine)。關於在黏膜和上皮細胞頂部之間(mucoepithelial interface)的pH變化，在B組(抑制胃酸分泌)，可觀察到pH從7顯著快速下降到2-3，經過約20分鐘，再快速回升到6-7。第C6頁之右欄第4-20行，明確說明分子量(Da)小於400的物質包括離子(ions)和小分子物質(small-sized molecules)經活體實驗證實皆能自由穿越黏膜。所以，對分子量小於400的物質包括檸檬酸和抗壞血酸在黏膜內進行滅菌之主要干擾因子應該是碳酸氫鹽(bicarbonate,HCO3 -)。
因此，找到一種能在胃黏膜內抗碳酸氫鹽(HCO3 -)且在酸性環境滅菌的組合物對於有效消滅在胃部寄生的幽門螺旋桿菌至關緊要！(請參照有機酸殺格蘭氏陰性菌-A review of the effects of dietary organic acids fed to swine(2015)之第1圖和第4/11頁右欄第8~20行)(格蘭氏陰性菌包括幽門螺旋桿菌)
本發明之一面向係提供一種非藥物幽門桿菌殺菌組合物，包括：一第一日常食用成分，其中該第一日常食用成分於一溶液狀態下，具有一分子態及一解離態、該分子態第一日常食用成分用以在pH值小於5之環境下，執行殺除一幽門桿菌及抑制該幽門桿菌之一抗壞血酸氧化酶之功能、且該第一日常食用成分係為檸檬酸、蘋果酸或其組合；一第二日常食用成分，用以中和一碳酸氫鹽，且該有機酸係為檸檬酸、蘋果酸或其組合；一鹽類，用以與該檸檬酸、蘋果酸或其組合構成一緩衝組合，其中該鹽類係為檸檬酸鹽、蘋果酸鹽或其組合；以及一第三日常食用成分，用以在第一及第二日常食用成分存在條件下，更徹底執行殺除該幽門桿菌，其中該第三日常食用成分為一抗壞血酸。
本發明之另一面向係提供一種非藥物幽門桿菌殺菌組合物，包括：一第一日常食用成分，其中該第一日常食用成分係由一有機酸及其鹽類所組成之一緩衝組合、該第一日常食用成分用以中和一碳酸氫鹽，且用以在pH值小於5之環境下，執行殺除一幽門桿菌及抑制該幽門桿菌之一抗壞血酸氧化酶之功能、且該有機酸係為係為檸檬酸、蘋果酸或其組合；以及一第二日常食用成分，用以在該第一日常食用成分存在條件下，更徹底執行殺除該幽門桿菌，其中該第二日常食用成分為一抗壞血酸。
本發明之另一面向係提供一種非藥物幽門桿菌殺菌組合物，包括：一第一日常食用成分，其中該第一日常食用成分於一溶液狀態下，具有一分子態及一解離態、該分子態第一日常食用成分用以在pH值小於5之環境下，執行殺除一幽門桿菌及抑制該幽門桿菌之一抗壞血酸氧化酶之功能、且該第一日常食用成分係為檸檬酸、蘋果酸或其組合；以及一第二日常食用成分，係一鹽類，用以與該第一日常食用成分構成一緩衝組合，並用以中和一碳酸氫鹽，以利該第一日常食用成分持續有效進行殺除該幽門桿菌及抑制該幽門桿菌抗壞血酸氧化酶之功能，其中該鹽類係為檸檬酸鹽、蘋果酸鹽或其組合。
本發明的上述目的及優點在參閱以下詳細說明及所附圖式之後對所屬技術領域中具有通常知識者將變得更顯而易見。
第一圖顯示pH3.0、4.0、5.0之檸檬酸緩衝組合加/不加抗壞血酸以及磷酸緩衝組合加/不加抗壞血酸之幽門螺旋桿菌抗菌實驗。
第二圖顯示pH3.0之檸檬酸緩衝組合加抗壞血酸之幽門螺旋桿菌抗菌實驗。
第三圖顯示pH3.0、4.0、5.0之蘋果酸緩衝組合、乳酸緩衝組合、檸檬酸緩衝組合以及磷酸緩衝組合之幽門螺旋桿菌抗菌實驗。
第四圖顯示pH3.0、4.0、5.0之蘋果酸緩衝組合加抗壞血酸、乳酸緩衝組合加抗壞血酸、檸檬酸緩衝組合加抗壞血酸以及磷酸緩衝組合加抗壞血酸之幽門螺旋桿菌抗菌實驗。
以下為本發明的實施例
(一)實驗儀器
滅菌釜Autoclave(FD50R,Zealway,USA)
微量離心機Microcentrifuge(SpectrafugeTM 24D,Labnet,USA)
電子微量天平Electronic Microbalance(XR 205SM-DR,Precisa,Switzerland)
電子天平Electronic Balance(PB1502-S,Mettler Toledo,USA)
pH計pH Meter(Delta 320,Mettler Toledo,USA)
恆溫震盪培養箱Orbital Shaker Incubator(721 SR,HIPOINT,Taiwan)
生物安全櫃Biological Safety Cabinets(Ever Win Technology,Taiwan)無認證台製
多孔盤光譜分析儀Microplate reader(SPECTROstar® Nano,BMG Labtech,Germany)
純水機Water Purification system(Polycon DIU-3,Scienpak Enterprise,Taiwan)
定量吸管Pipette 10-100μL(Acura ® manual 825,Socorex,Switzerland)
定量吸管Pipette 20-200μL(Acura ® manual 825,Socorex,Switzerland)
定量吸管Pipette 100-1000μL(Acura ® manual 825,Socorex,Switzerland)
血清瓶Serum Bottle 1000mL(Schott,Germany)
血清瓶Serum Bottle 500mL(Schott,Germany)
血清瓶Serum Bottle 50mL(Schott,Germany)
燒杯Beaker 1000mL(Kimax,USA)
燒杯Beaker 500mL(Kimax,USA)
燒杯Beaker 100mL(Kimax,USA)
攪拌子Stirrer(Dogger,Taiwan)
△型玻璃塗抹棒Glass Triangle-headed Cell Spreader(Dogger,Taiwan)
酒精燈Alcohol Burner(Dogger,Taiwan)
厭氧缸AnaeroPack Jar(MGC AnaeroPack®,Mitsubishi Gas Chemical,Japan)
(二)實驗耗材
分注吸管尖Pipetmen tips 10-200μL(Vertex®,USA)
分注吸管尖Pipetmen tips 100-1000μL(Vertex®,USA)
微量離心管Microcentrifuge Tubes 1.5mL(Jet Biofil®,China)
離心管Centrifuge Tubes 15mL(Jet Biofil®,China)
離心管Centrifuge Tubes 50mL(Jet Biofil®,China)
培養皿Cell and Tissue Culture Dishes 9.0cm(Jet Biofil®,China)
細胞培養多孔盤Cell and Tissue Culture Plates 48well(Jet Biofil®,China)
細胞培養多孔盤Cell and Tissue Culture Plates 96well(Jet Biofil®,China)
針筒過濾器Syringe Driven Filter 0.22μm(PVDF membrane,Jet Biofil®,China)
注射針筒Disposable Syringe 1mL(Terumo,Japan)
微好氧包Genbox Microaer(Ref.96125,bioMérieux,France)
(三)實驗藥品
尿素Urea(Nihon Shiyaku,Taiwan)
檸檬酸Citric Acid(Nihon Shiyaku,Taiwan)
檸檬酸鈉Sodium Citrate(Nihon Shiyaku,Taiwan)
磷酸二氫鉀Potassium Dihydrogen Phosphate(Nihon Shiyaku,Taiwan)
磷酸一氫鈉Sodium Hydrogen Phosphate(Nihon Shiyaku,Taiwan)
蘋果酸DL-Malic acid(Shun Ching Raw Material,Taiwan)
蘋果酸鈉Sodium DL-Malate(Gemfont,Taiwan)
乳酸Lactic acid(Alfa Aesar,USA)
乳酸鈉Sodium Lactate(Hsin Eing,Taiwan)
碳酸氫鈉Sodium hydrogen carbonate(Shimakyu yakuhin,Japan)
氯化鈉Sodium Chloride(Nihon Shiyaku,Taiwan)
鹽酸Hydrogen Chloride(Nihon Shiyaku,Taiwan)
氫氧化鈉Sodium Hydroxide(Nihon Shiyaku,Taiwan)
布魯氏菌培養基BBLTM Brucella broth(BD Biosciences,USA)
瓊脂BactoTM Agar(BD Biosciences,USA)
特級馬血清Donor Equine Serum(Hyclone,USA)
抗壞血酸L-Ascorbic acid(Sigma,USA)
(四)實驗方法
實施例一
幽門螺旋桿菌抗菌實驗(檢測時間點：0/20/40/60分鐘，三重複)：檸檬酸緩衝組合加/不加抗壞血酸以及磷酸緩衝組合加/不加抗壞血酸
菌種及培養方法
實驗使用菌株為Helicobacter pylori strain 26695(ATCC700392)，繼代培養使用Brucella固體培養基(Brucella broth 28g/L,Agar 15g/L and 10%(v/v)Horse serum,pH7.0)，以畫線法種菌後在潮濕的厭氧箱中以37℃靜置培養72小時，使用微好氧包(Genbox microaer,BioMérieux,96125)。
將0.22μm注射型過濾器過濾之各培養液備用。將含10mg/mL NaHCO3之Brucella broth加入繼代培養72小時後的幽門螺旋桿菌，細菌濃度調至107-108CFU/mL作為菌液，將菌液與各培養液以1：1混合置於潮濕的厭氧箱中以37℃靜置培養，使用微好氧包(Genbox microaer, BioMérieux,96125)。
檸檬酸緩衝溶液以檸檬酸和檸檬酸鈉依照pH值以不同比例混合而成，無法調製的部分則用HCl和NaOH調製固定pH值。磷酸緩衝溶液以KH2PO4和Na2HPO4依照pH值以不同比例混合而成，無法調製的部分則用HCl和NaOH調製固定pH值。純培養液的pH值用HCl和NaOH調製。各培養液以上述方法調至固定pH值後，額外添加抗壞血酸至固定濃度，菌液與各培養液組成如下：菌液：(Brucella broth 28g/L,NaHCO3 10g/L and 10mM Urea)。
第一組：N3(Brucella broth 28g/L and 10mM Urea,pH3.0)。
第二組：N3V3000(Brucella broth 28g/L and 10mM Urea,pH3.0)+(6000mg/L Vitamin C)。
第三組：N4(Brucella broth 28g/L and 10mM Urea,pH4.0)。
第四組：N4V3000(Brucella broth 28g/L and 10mM Urea,pH4.0)+(6000mg/L Vitamin C)。
第五組：N5(Brucella broth 28g/L and 10mM Urea,pH5.0)。
第六組：N5V3000(Brucella broth 28g/L and 10mM Urea,pH5.0)+(6000mg/L Vitamin C)。
第七組：P3(Brucella broth 28g/L,0.1M Phosphate buffered saline(PBS)and 10mM Urea,pH3.0)。
第八組：P3V3000(Brucella broth 28g/L,0.1M Phosphate buffered saline(PBS)and 10mM Urea,pH3.0)+(6000mg/L Vitamin C)。
第九組：P4(Brucella broth 28g/L,0.1M Phosphate buffered saline(PBS) and 10mM Urea,pH4.0)。
第十組：P4V3000(Brucella broth 28g/L,0.1M Phosphate buffered saline(PBS)and 10mM Urea,pH4.0)+(6000mg/L Vitamin C)。
第十一組：P5(Brucella broth 28g/L,0.1M Phosphate buffered saline(PBS)and 10mM Urea,pH5.0)。
第十二組：P5V3000(Brucella broth 28g/L,0.1M Phosphate buffered saline(PBS)and 10mM Urea,pH5.0)+(6000mg/L Vitamin C)。
第十三組：C3(Brucella broth 28g/L,0.1M Citrate buffer and 10mM Urea,pH3.0)。
第十四組：C3V3000(Brucella broth 28g/L,0.1M Citrate buffer and 10mM Urea,pH3.0)+(6000mg/L Vitamin C)。
第十五組：C4(Brucella broth 28g/L,0.1M Citrate buffer and 10mM Urea,pH4.0)。
第十六組：C4V3000(Brucella broth 28g/L,0.1M Citrate buffer and 10mM Urea,pH4.0)+(6000mg/L Vitamin C)。
第十七組：C5(Brucella broth 28g/L,0.1M Citrate buffer and 10mM Urea,pH5.0)。
第十八組：C5V3000(Brucella broth 28g/L,0.1M Citrate buffer and 10mM Urea,pH5.0)+(6000mg/L Vitamin C)。
將依檢測時間培養後的各培養液分別以生理食鹽水做10倍率連續稀釋後，將各倍率菌液以塗盤法塗至繼代培養用的Brucella固體培養基中，在潮濕的厭氧箱中以37℃靜置培養72小時，使用微好氧包(Genbox microaer,BioMérieux,96125)，最後計算各培養液之活菌數。
實施例二
幽門螺旋桿菌抗菌實驗(檢測時間點：0/20/40/60分鐘，三重複)：檸檬酸緩衝組合加抗壞血酸
菌種及培養方法
實驗使用菌株為Helicobacter pylori strain 26695(ATCC700392)，繼代培養使用Brucella固體培養基(Brucella broth 28g/L,Agar 15g/L and 10%(v/v)Horse serum,pH7.0)，以畫線法種菌後在潮濕的厭氧箱中以37℃靜置培養72小時，使用微好氧包(Genbox microaer,BioMérieux,96125)。
將0.22μm注射型過濾器過濾之各培養液備用。將含10mg/mL NaHCO3之Brucella broth加入繼代培養72小時後的幽門螺旋桿菌，細菌濃度調至107-108CFU/mL作為菌液，將菌液與各培養液以1：1混合置於潮濕的厭氧箱中以37℃靜置培養，使用微好氧包(Genbox microaer,BioMérieux,96125)。
檸檬酸緩衝溶液以檸檬酸和檸檬酸鈉依照pH值以不同比例混合而成，無法調製的部分則用HCl和NaOH調製固定pH值。磷酸緩衝溶液以KH2PO4和Na2HPO4依照pH值以不同比例混合而成，無法調製的部分則用HCl和NaOH調製固定pH值。純培養液的pH值用HCl和NaOH調製。各培養液以上述方法調至固定pH值後，額外添加抗壞血酸至固定濃度，菌液與各培養液組成如下：
第一組：C3V3000(Brucella broth 28g/L,0.1M Citrate buffer and 10mM Urea,pH3.0)+(6000mg/L Vitamin C)。
第二組：C3V6000(Brucella broth 28g/L,0.1M Citrate buffer and 10mM Urea,pH3.0)+(12000mg/L Vitamin C)。
第三組：C3V9000(Brucella broth 28g/L,0.1M Citrate buffer and 10mM Urea,pH3.0)+(18000mg/L Vitamin C)。
將依檢測時間培養後的各培養液分別以生理食鹽水做10倍率連續稀釋後，將各倍率菌液以塗盤法塗至繼代培養用的Brucella固體培養基中，在潮濕的厭氧箱中以37℃靜置培養72小時，使用微好氧包(Genbox microaer,BioMérieux,96125)，最後計算各培養液之活菌數。
尿素之添加請詳見參考文獻D(6)和D(7)；NaHCO3之添加請詳見參考文獻D(5)、D(8)和D(9)。
實施例三
幽門螺旋桿菌抗菌實驗(檢測時間點：0/20/40/60分鐘)：蘋果酸緩衝組合、乳酸緩衝組合、檸檬酸緩衝組合以及磷酸緩衝組合
菌種及培養方法
實驗使用菌株為Helicobacter pylori strain 26695(ATCC700392)，繼代培養使用Brucella固體培養基(Brucella broth 28g/L,Agar 15g/L and 10%(v/v)Horse serum,pH7.0)，以畫線法種菌後在潮濕的厭氧箱中以37℃靜置培養72小時，使用微好氧包(Genbox microaer,BioMérieux,96125)。
將0.22μm注射型過濾器過濾之各培養液備用。將含10mg/mL NaHCO3之Brucella broth加入繼代培養72小時後的幽門螺旋桿菌，細 菌濃度調至107-108CFU/mL作為菌液，將菌液與各培養液以1：1混合置於潮濕的厭氧箱中以37℃靜置培養，使用微好氧包(Genbox microaer,BioMérieux,96125)。
檸檬酸緩衝溶液以檸檬酸和檸檬酸鈉依照pH值以不同比例混合而成，無法調製的部分則用HCl和NaOH調製固定pH值。蘋果酸與乳酸緩衝溶液以蘋果酸、蘋果酸鈉或乳酸、乳酸鈉依照相同方式配製。磷酸緩衝溶液以KH2PO4和Na2HPO4依照pH值以不同比例混合而成，無法調製的部分則用HCl和NaOH調製固定pH值。純培養液的pH值用HCl和NaOH調製。各培養液以上述方法調至固定pH值後，額外添加抗壞血酸至固定濃度，菌液與各培養液組成如下：菌液：(Brucella broth 28g/L,NaHCO3 10g/L and 10mM Urea)。
第一組：M3(Brucella broth 28g/L,0.1M Malic Acid buffer and 10mM Urea,pH3.0)。
第二組：M4(Brucella broth 28g/L,0.1M Malic Acid buffer and 10mM Urea,pH4.0)。
第三組：M5(Brucella broth 28g/L,0.1M Malic Acid buffer and 10mM Urea,pH5.0)。
第四組：L3(Brucella broth 28g/L,0.1M Lactic acid buffer and 10mM Urea,pH3.0)。
第五組：L4(Brucella broth 28g/L,0.1M Lactic acid buffer and 10mM Urea,pH4.0)。
第六組：L5(Brucella broth 28g/L,0.1M Lactic acid buffer and 10mM Urea, pH5.0)。
第七組：P3(Brucella broth 28g/L,0.1M Phosphate buffered saline(PBS)and 10mM Urea,pH3.0)。
第八組：P4(Brucella broth 28g/L,0.1M Phosphate buffered saline(PBS)and 10mM Urea,pH4.0)。
第九組：P5(Brucella broth 28g/L,0.1M Phosphate buffered saline(PBS)and 10mM Urea,pH5.0)。
第十組：C3(Brucella broth 28g/L,0.1M Citrate buffer and 10mM Urea,pH3.0)。
第十一組：C4(Brucella broth 28g/L,0.1M Citrate buffer and 10mM Urea,pH4.0)。
第十二組：C5(Brucella broth 28g/L,0.1M Citrate buffer and 10mM Urea,pH5.0)。
將依檢測時間培養後的各培養液分別以生理食鹽水做10倍率連續稀釋後，將各倍率菌液以塗盤法塗至繼代培養用的Brucella固體培養基中，在潮濕的厭氧箱中以37℃靜置培養72小時，使用微好氧包(Genbox microaer,BioMérieux,96125)，最後計算各培養液之活菌數。
實施例四
幽門螺旋桿菌抗菌實驗(檢測時間點：0/20/40/60分鐘)：蘋果酸緩衝組合加抗壞血酸、乳酸緩衝組合加抗壞血酸、檸檬酸緩衝組合加抗壞血酸以及磷酸緩衝組合加抗壞血酸
菌種及培養方法
實驗使用菌株為Helicobacter pylori strain 26695(ATCC700392)，繼代培養使用Brucella固體培養基(Brucella broth 28g/L,Agar 15g/L and 10%(v/v)Horse serum,pH7.0)，以畫線法種菌後在潮濕的厭氧箱中以37℃靜置培養72小時，使用微好氧包(Genbox microaer,BioMérieux,96125)。
將0.22μm注射型過濾器過濾之各培養液備用。將含10mg/mL NaHCO3之Brucella broth加入繼代培養72小時後的幽門螺旋桿菌，細菌濃度調至107-108CFU/mL作為菌液，將菌液與各培養液以1：1混合置於潮濕的厭氧箱中以37℃靜置培養，使用微好氧包(Genbox microaer,BioMérieux,96125)。
檸檬酸緩衝溶液以檸檬酸和檸檬酸鈉依照pH值以不同比例混合而成，無法調製的部分則用HCl和NaOH調製固定pH值。蘋果酸與乳酸緩衝溶液以蘋果酸、蘋果酸鈉或乳酸、乳酸鈉依照相同方式配製。磷酸緩衝溶液以KH2PO4和Na2HPO4依照pH值以不同比例混合而成，無法調製的部分則用HCl和NaOH調製固定pH值。純培養液的pH值用HCl和NaOH調製。各培養液以上述方法調至固定pH值後，額外添加抗壞血酸至固定濃度，菌液與各培養液組成如下：菌液：(Brucella broth 28g/L,NaHCO3 10g/L and 10mM Urea)。
第一組：M3V3000(Brucella broth 28g/L,0.1M Malic Acid buffer and 10mM Urea,pH3.0)+(6000mg/L Vitamin C)。
第二組：M4V3000(Brucella broth 28g/L,0.1M Malic Acid buffer and 10mM Urea,pH4.0)+(6000mg/L Vitamin C)。
第三組：M5V3000(Brucella broth 28g/L,0.1M Malic Acid buffer and 10mM Urea,pH5.0)+(6000mg/L Vitamin C)。
第四組：L3V3000(Brucella broth 28g/L,0.1M Lactic acid buffer and 10mM Urea,pH3.0)+(6000mg/L Vitamin C)。
第五組：L4V3000(Brucella broth 28g/L,0.1M Lactic acid buffer and 10mM Urea,pH4.0)+(6000mg/L Vitamin C)。
第六組：L5V3000(Brucella broth 28g/L,0.1M Lactic acid buffer and 10mM Urea,pH5.0)+(6000mg/L Vitamin C)。
第七組：P3V3000(Brucella broth 28g/L,0.1M Phosphate buffered saline (PBS)and 10mM Urea,pH3.0)+(6000mg/L Vitamin C)。
第八組：P4V3000(Brucella broth 28g/L,0.1M Phosphate buffered saline (PBS)and 10mM Urea,pH4.0)+(6000mg/L Vitamin C)。
第九組：P5V3000(Brucella broth 28g/L,0.1M Phosphate buffered saline (PBS)and 10mM Urea,pH5.0)+(6000mg/L Vitamin C)。
第十組：C3V3000(Brucella broth 28g/L,0.1M Citrate buffer and 10mM Urea,pH3.0)+(6000mg/L Vitamin C)。
第十一組：C4V3000(Brucella broth 28g/L,0.1M Citrate buffer and 10mM Urea,pH4.0)+(6000mg/L Vitamin C)。
第十二組：C5V3000(Brucella broth 28g/L,0.1M Citrate buffer and 10mM Urea,pH5.0)+(6000mg/L Vitamin C)。
將依檢測時間培養後的各培養液分別以生理食鹽水做10倍率連續稀釋後，將各倍率菌液以塗盤法塗至繼代培養用的Brucella固體培養 基中，在潮濕的厭氧箱中以37℃靜置培養72小時，使用微好氧包(Genbox microaer,BioMérieux,96125)，最後計算各培養液之活菌數。
(五)實驗結果
實施例一
實施例一的結果請見表一及第一圖。
Figure 108135302-A0101-12-0018-1
實施例二
實施例二的結果請見表二及第二圖。
Figure 108135302-A0101-12-0018-2
Figure 108135302-A0101-12-0019-3
實施例三
實施例三的結果請見表三及第三圖。
Figure 108135302-A0101-12-0019-5
實施例四
實施例四的結果請見表四及第四圖。
Figure 108135302-A0101-12-0019-6
Figure 108135302-A0101-12-0020-7
由實施例一的結果可知，本案pH值小於5的檸檬酸緩衝組合在碳酸氫鹽環境具殺菌效用。傳統上皆認為檸檬酸不但無殺幽門螺旋桿菌效果，並且有反向趨勢(請詳參考文獻D(10)：檸檬酸顯著增強幽門螺旋桿菌尿素酶活性且環境pH非關鍵因素之第1766頁左欄第26-35行和第1圖)。本案以pH值小於5的檸檬酸緩衝組合作為幽門螺旋桿菌殺菌劑之組合成分，可謂第一次在pH值小於5的碳酸氫鹽環境使用檸檬酸做為殺幽門螺旋桿菌成份且其具殺菌效用，極具新穎性和進步性。
pH值小於5的檸檬酸緩衝組合加抗壞血酸在碳酸氫鹽環境具顯著「劑量關係(dose dependent)」殺菌效用。此外，經由比較C3與C3V3000、C4與C4V3000，可觀察到抗壞血酸對檸檬酸緩衝組合之殺菌具明顯「加乘效用(synergistic effect)」。
相反地，磷酸緩衝組合或水在有碳酸氫鹽之環境不具殺菌效能，添加抗壞血酸亦無殺菌和「加乘效用」。
依據實施例一的實驗結果，於實施例二進行不同濃度的抗壞血酸搭配pH3之檸檬酸緩衝組合來驗證不同濃度抗壞血酸的殺菌加乘效用以及20分鐘內有效殺菌的最適濃度。
有效殺菌(Bactericidal Activity)通常定義為在特定的培養時間(通常為20到24小時)相對於接種密度，菌落形成單位的數量減少99.9%(請參照Goldman's Cecil Medicine(Twenty Fourth Edition),2012)。
實施例二之第二圖的活菌數從7 Log10(CFU/mL)下降到3 Log10(CFU/mL)，已達99.9%的殺菌效用。關於不同濃度抗壞血酸在pH3的殺菌加乘效用，C3(無抗壞血酸)無法在60分鐘內有效殺菌；C3V3000(3000mg/L抗壞血酸)在60分鐘內有效殺菌；C3V6000(6000mg/L抗壞血酸)在40分鐘內有效殺菌；C3V9000(9000mg/L抗壞血酸)在20分鐘內有效殺菌且在60分鐘內有效滅菌。
實施例一及實施例二證明pH值小於5的檸檬酸緩衝組合加抗壞血酸在碳酸氫鹽環境具有殺菌效用，該殺菌效用呈現「劑量依賴(dose dependent)」，且抗壞血酸對檸檬酸緩衝組合之殺菌具明顯「加乘效用(synergistic effect)」，且在pH等於3時有較佳緩衝容量(buffer capacity)(請詳參考文獻D(11)，故具較佳滅菌效用。這是「新發現」且「非顯而易見」！
由實施例三及實施例四的結果可知，本案pH值小於5的蘋果酸緩衝組合在碳酸氫鹽環境具殺菌效用。傳統上皆認為蘋果酸不但無殺幽門螺旋桿菌效果，並且有反向趨勢(請詳檸檬酸和蘋果酸皆能在酸性環境增強幽門螺旋桿菌尿素酶活性(Effect of different organic acids(citric,malic and ascorbic)on intragastric urease activity,2005之Summary中的Conclusions以及第1圖及第2圖))。本案以pH值小於5的檸檬酸或蘋果酸緩衝組合作為幽門螺旋桿菌殺菌劑之組合成分，可謂第一次在pH值小於5的碳酸氫鹽環境使用檸檬酸或蘋果酸做為殺幽門螺旋桿菌成份且其具殺菌效用，極具新穎性和進步性。
此外，經由比較實施例三及實施例四，可觀察到抗壞血酸對檸檬酸或蘋果酸緩衝組合之殺菌具明顯「加乘效用(synergistic effect)」。
相反地，磷酸緩衝組合或水在有碳酸氫鹽之環境不具殺菌效能，添加抗壞血酸亦無殺菌和「加乘效用」。
pH值小於5的檸檬酸或蘋果酸緩衝組合在碳酸氫鹽環境具顯著「劑量關係(dose dependent)」殺菌效用。
依據實施例之C3、C3V3000、C4V3000以及M3、M3V3000、M4V3000可觀察到pH小於5的緩衝組合在60分鐘後的pH值和殺菌結果。
請參照參考文獻D(1)第292頁第3圖，其顯示幽門螺旋桿菌體內之抗壞血酸氧化酶活性和pH之關連性。幽門螺旋桿菌體內有兩種抗壞血酸氧化酶：細胞間質抗壞血酸氧化酶和細胞內膜抗壞血酸氧化酶(請詳參考文獻D(12))。該關連性顯示這兩類抗壞血酸氧化酶活性在pH4-5之間同時呈現較弱活性(請詳參考文獻D(12)第3圖)，有利抗壞血酸殺菌(請參照第[0074]段)。
因檸檬酸和蘋果酸具抗壞血酸氧化酶活性抑制效能，所以在pH小於5時，抗壞血酸展現明顯殺菌之加乘效用。磷酸緩衝組合和水明顯不具抗壞血酸氧化酶活性抑制效能，添加等劑量抗壞血酸仍無法展現殺菌之效用(請參照實施例一、二、三及四的圖式和表中60分鐘後的pH值和殺菌結果)。
幽門桿菌是少數同時具備尿素酶和抗壞血酸氧化酶之降解作用極強的微生物(請詳參考文獻D(12)表1)。幽門桿菌抗壞血酸氧化酶與pH的關係請詳參考文獻D(12)第3圖。
如本案實驗所示，幽門螺旋桿菌難消滅之主因在其寄生環境是黏膜上皮細胞且該細胞因受環境氯離子(chloride ion)置換誘導(exchange induction)而分泌碳酸氫鹽(HCO3 -)抗酸(請參照參考文獻D(13)第2圖)。
胃黏膜在低pH環境較不利幽門螺旋桿菌游動(mobility)(請參照參考文獻D(14)摘要)，有利本案緩衝組合物在黏膜內殺菌和滅菌。
當本案之緩衝組合pH等於3時，其在胃竇之pH小於3，有利抑制胃酸分泌(參考文獻D(15)第422頁PH CHANGES)，即等同抑制上皮細胞的碳酸氫鹽分泌(胃部的氯離子藉由交換作用引導上皮細胞釋出碳酸氫鹽以便在黏膜內抗酸(請參照參考文獻D(13)第2圖)，故有利殺菌和滅菌。
檸檬酸之實測pKa等於3.1，檸檬酸的標準pKa等於3.12(請參照參考文獻D(11))，因而檸檬酸緩衝組合在pH等於3時呈現相當強的緩衝容量(buffer capacity)。
因此，pH等於3是殺菌和滅菌關鍵，在此pH條件呈現的緩衝容量(buffer capacity)亦是關鍵，在此pH條件能有效抑制抗壞血酸氧化酶活性是另一關鍵！在此pH條件添加抗壞血酸是快速殺菌的最關鍵(加乘效用)。抗壞血酸搭配檸檬酸或蘋果酸緩衝組合在pH等於3時，會快速在黏膜內形成酸性環境(pH等於3)，有利殺菌和滅菌。
本案檸檬酸或蘋果酸緩衝組合(pH=3)在胃竇之pH應略小於3且不致顯著改變胃竇之低pH環境(請參照參考文獻D(16)第1圖)，有助抑制胃酸分泌(即抑制氯離子分泌)。因胃竇pH小於3而抑制胃酸分泌(抑制胃酸分泌類似制酸劑的作用，但不造成pH上升此點和制酸劑完全不同(請參照參考文獻D(15))，也間接抑制上皮細胞的碳酸氫鹽之持續性分泌，有利本案之檸檬酸或蘋果酸緩衝組合在酸性微環境殺菌和滅菌。
胃黏膜內上皮細胞的碳酸氫鹽(HCO3 -)分泌和胃部氯離子濃 度呈正相關(請參照參考文獻D(17)第4圖)。
觀察實施例一，關鍵是「60分鐘pH值」，「60分鐘pH值」代表黏膜和上皮細胞頂部之間(mucoepithelial interface)的pH。
本案pH等於3的檸檬酸緩衝組合和檸檬酸緩衝組合加抗壞血酸具有效殺菌和滅菌能力(60分鐘內滅菌)，且pH等於3的抗壞血酸搭配檸檬酸緩衝組合可在20分鐘內有效殺菌。碳酸氫鈉(NaHCO3)添加正凸顯這關鍵的黏膜和上皮細胞頂部之間(mucoepithelial interface)的pH變化。
綜上所述(實施例一、二及四)可知，本案pH等於3之檸檬酸或蘋果酸緩衝組合搭配抗壞血酸中，抗壞血酸具胃黏膜的修復和保護作用(請參照參考文獻D(18)摘要)、抗壞血酸具降黏性(mucolysis)(請參照參考文獻D(19)摘要)、且抗壞血酸在pH等於3之檸檬酸或蘋果酸緩衝組合顯著起到快速殺菌之效用和顯著加乘效用。胃竇在pH小於3時會抑制胃酸分泌(請參照參考文獻D(15)第422頁PH CHANGES)，有利殺菌和滅菌。C3V9000(檸檬酸緩衝組合搭配抗壞血酸)可有效消滅幽門桿菌，為較佳滅菌組合。
關於幽門螺旋桿菌日益增強的抗藥性，本案緩衝組合物(抗壞血酸搭配檸檬酸或蘋果酸緩衝組合)是特意從大自然找到殺菌的組合，而非刻意以人為方式合成。幽門螺旋桿菌的抗藥性成因為幽門螺旋桿菌可經由基因交換或染色體突變產生抗藥性(請詳參考文獻D(20)和D(21))。幽門螺旋桿菌在複製時可自然發生基因突變(Gene mutation)，此時若同時使用抗生素，則多中選精便易產生抗藥性突變種而同時易於進行大量複製(請詳參考文獻D(20)和D(21))。幽門螺旋桿菌在pH6-8的環境會分裂繁殖，此環境正是抗生素有效殺菌的最適pH環境，這應該是造成抗生素有日趨嚴重抗藥性的 主因(請詳參考文獻(D5))。本案緩衝組合物(抗壞血酸搭配檸檬酸或蘋果酸緩衝組合)主要在pH等於3的環境殺菌，所以基本上，幽門螺旋桿菌在此環境不會分裂繁殖，應不可能產生抗藥性突變種。
由於本發明的非藥物幽門桿菌殺菌組合物不含抗生素成分，較無抗藥性和食安之疑慮。
本發明實屬難能的創新發明，深具產業應用價值，援依法提出申請。此外，本發明可以由所屬技術領域中具有通常知識者做任何修改，但不脫離如所附申請專利範圍所要保護的範圍。
實施例
1.一種非藥物幽門桿菌殺菌組合物，包括：一第一日常食用成分，其中該第一日常食用成分包含於一溶液狀態下，具有一分子態及一解離態、該分子態第一日常食用成分用以在pH值小於5之環境下，執行殺除一幽門桿菌及抑制該幽門桿菌之一抗壞血酸氧化酶之功能、且該第一日常食用成分係為檸檬酸、蘋果酸或其組合；一第二日常食用成分，用以中和一碳酸氫鹽，且該有機酸係為檸檬酸、蘋果酸或其組合；一鹽類，用以與該檸檬酸、蘋果酸或其組合構成一緩衝組合，其中該鹽類係為檸檬酸鹽、蘋果酸鹽或其組合；以及一第三日常食用成分，用以在第一及第二日常食用成分存在條件下，更徹底執行殺除該幽門桿菌，其中該第三日常食用成分為一抗壞血酸。
2.如實施例1所述之非藥物幽門桿菌殺菌組合物，其中該抗壞血酸的濃度為3000-9000ppm。
3.如實施例1-2所述之非藥物幽門桿菌殺菌組合物，其中該抗壞血酸的濃度 為9000ppm。
4.如實施例1-3所述之非藥物幽門桿菌殺菌組合物，其中該鹽類係為檸檬酸鈉、蘋果酸鈉或其組合。
5.一種非藥物幽門桿菌殺菌組合物，包括：一第一日常食用成分，其中該第一日常食用成分係由一有機酸及其鹽類所組成之一緩衝組合、該第一日常食用成分用以中和一碳酸氫鹽，且用以在pH值小於5之環境下，執行殺除一幽門桿菌及抑制該幽門桿菌之一抗壞血酸氧化酶之功能、且該有機酸係為係為檸檬酸、蘋果酸或其組合；以及一第二日常食用成分，用以在該第一日常食用成分存在條件下，更徹底執行殺除該幽門桿菌，其中該第二日常食用成分為一抗壞血酸。
6.如實施例5所述之非藥物幽門桿菌殺菌組合物，其中該非藥物幽門桿菌殺菌組合物的pH值小於5。
7.如實施例5-6所述之非藥物幽門桿菌殺菌組合物，其中該非藥物幽門桿菌殺菌組合物的pH值介於3-5。
8.如實施例5-7所述之非藥物幽門桿菌殺菌組合物，其中該非藥物幽門桿菌殺菌組合物的pH值為3。
9.一種非藥物幽門桿菌殺菌組合物，包括：一第一日常食用成分，其中該第一日常食用成分包含於一溶液狀態下，具有一分子態及一解離態、該分子態第一日常食用成分用以在pH值小於5之環境下，執行殺除一幽門桿菌及抑制該幽門桿菌之一抗壞血酸氧化酶之功能、且該第一日常食用成分係為檸檬酸、蘋果酸或其組合；以及一第二日常食用成分，係一鹽類，用以與該第一日常食用成分構成一緩衝組合，並用以中和一碳酸氫鹽，以利該第一日常食用成分持續有效進行殺除該幽門桿菌及抑制該幽門桿菌抗壞血酸氧化酶之功能，其中該鹽類係為 檸檬酸鹽、蘋果酸鹽或其組合。
10.如實施例9所述之非藥物幽門桿菌殺菌組合物，其中該非藥物幽門桿菌殺菌組合物的pH值為3。
參考文獻：
D(1): Factors that mediate colonization of the human stomach by Helicobacter pylori(2014)
D(2): Breakdown of the mucus layer by H. pylori(1994)
D(3): Future perspective for potential Helicobacter pylori eradication therapies(2018)
D(4): Gastroduodenal mucus bicarbonate barrier:protection against acid and pepsin(2005)
D(5): The life and death of Helicobacter pylori(1998)
D(6): Urea Protects Helicobacter(Campylobacter) pylori From the Bactericidal Effect of Acid(1990).
D(7): Helicobacter pylori Requires an Acidic Environment To Survive in the Presence of Urea(1995)
D(8): Gastric mucosal protective mechanisms: roles of epithelial bicarbonate and mucus secretions(1984).
D(9): Gastric mucus and bicarbonate secretion in relation to mucosal protection.(1981)
D(10): Citric acid-enhanced Helicobacter pylori urease activity in vivo is unrelated to gastric emptying(2001)
D(11): The buffering capacity of citrate buffer (http://www.fgsc.net/fgn42/nozawa.html)
D(12): Investigation of Helicobacter pylori ascorbic acid oxidating activity(1995)
D(13): Acid Transport through Gastric Mucus (2004)
D(14): Helicobacter pylori moves through mucus by reducing mucin viscoelasticity(2009)
D(15): Progress report: Inhibition of gastric secretion by the pyloric antrum(1974)
D(16): Comparison of gastric body and antral pH: a 24 hour ambulatory study in healthy volunteers(1989)
D(17): Three distinct mechanisms of HCO3 secretion in rat distal colon(2004)
D(18): Vitamin C, Gastritis, and Gastric Disease: a historical review and Update(2012)
D(19): Mucolysis by Ascorbic Acid and Hydrogen Peroxide on Compact Mucin Secreted in Pseudomyxoma Peritonei(2011)
D(20): Helicobacter pylori Mutations Conferring Resistance to Fluoroquinolones and Clarithromycin among Dyspeptic Patients Attending a Tertiary Hospital, Tanzania(2019)
D(21): 幽門螺旋桿菌根除失敗原因及對策[二.內部因素(Hp本身因素)-(一)Hp的抗藥性)]-感染控制雜誌(Nosocomial Infection Control Journal, NICJ)(16:5 民95.10;頁276-282)(2006)
D(22): 含鉍劑四合一療法 可提升幽門螺旋桿菌除菌率！(2017)

Claims (6)

  1. 一種非藥物幽門桿菌殺菌組合物，包括：一第一日常食用成分，其中該第一日常食用成分於一溶液狀態下，具有一分子態及一解離態、該分子態第一日常食用成分用以在pH值小於5之環境下執行殺除一幽門桿菌及抑制該幽門桿菌之一抗壞血酸氧化酶之功能，且該第一日常食用成分係為檸檬酸、蘋果酸或其組合；一第二日常食用成分，係一鹽類，用以與該第一日常食用成分構成一緩衝組合、並用以中和一碳酸氫鹽，以利該第一日常食用成分持續有效進行殺除該幽門桿菌及抑制該幽門桿菌之該抗壞血酸氧化酶之功能，其中該鹽類係為檸檬酸鹽、蘋果酸鹽或其組合；以及一第三日常食用成分，用以在該第一日常食用成分以及該第二日常食用成分存在的條件下，更徹底執行殺除該幽門桿菌，其中該第三日常食用成分為一抗壞血酸。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之非藥物幽門桿菌殺菌組合物，其中該抗壞血酸的濃度為3000-9000ppm。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之非藥物幽門桿菌殺菌組合物，其中該抗壞血酸的濃度為9000ppm。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之非藥物幽門桿菌殺菌組合物，其中該鹽類係為檸檬酸鈉、蘋果酸鈉或其組合。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之非藥物幽門桿菌殺菌組合物，其中該非藥物幽門桿菌殺菌組合物的pH值小於5。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之非藥物幽門桿菌殺菌組合物，其中該非藥物幽門桿菌殺菌組合物的pH值介於3-5。
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Journal of Advanced Research 13 (2018) 51–57
Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 2011; 26(3): 309–318
台北榮民總醫院新聞稿「消滅幽門螺旋桿菌二線藥物療法 】， 2018/08/21

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