TWI701039B - 一種治療肌少症及酒精性肝損傷的發酵穀米水解物及其於保健食品組成物之應用 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種發酵穀米水解物的用途，該發酵穀米水解物係發酵穀米
經水解蛋白酶水解及超過濾後所得分子量小於8000道爾頓之發酵穀米水解超濾物。由於該發酵穀米水解物具有治療肌少症及酒精性肝損傷之功效，因此本發明之另一目的為提供一種具有治療肌少症及酒精性肝損傷之保健食品組成物，其中該保健食品組成物係包含該發酵穀米水解物及食品上可接受之載劑。
Description
本發明係有關於一種發酵穀米水解物，尤其是一種發酵穀米水解物用於治療肌少症及酒精性肝損傷，及其於保健食品組成物之應用。
隨著年紀增長，若肌肉質量合併肌肉強度或功能之衰退，即所謂之「肌少症」。據研究指出，成年人在40歲後，肌肉質量是以每十年8%之速度減少，70歲後流失速度加快至每十年15%。而大腿肌肉力量在40歲後，量是以每十年10-15%之速度下降，70歲後下降速度加快至每十年25-40%。肌少症不只影響老年人之身體健康、行動能力、生活品質、甚至增加跌倒風險、認知功能障礙、失能及死亡率。雖然年紀老化造成的肌肉量流失可能無法避免，但適當的治療與介入能夠延緩或改變其不良影響，目前最重要且有效的方法是營養的補充搭配適當的運動訓練。營養的補充主要是蛋白質，若無慢性腎臟病者，依體重每天每公斤建議攝取1.2-1.5公克的蛋白質，亦即每餐約攝取25-30公克的蛋白質。
台灣大約四分之一的人有脂肪肝。脂肪肝係指肝臟有脂肪的堆積，正常的肝臟中，脂質含量應低於肝臟總重量之5%，當脂質佔肝臟重量5~10%為輕度脂肪肝，10~25%為中度脂肪肝，而當超過25%時則為重度脂肪肝。當肝臟脂質過量或難以代謝時，就會滯留堆積形成脂肪肝，常見的原因包含：肥胖症、長期多量飲酒、高三酸甘油脂血症、血糖代謝異常(如糖尿病)、營養過剩或營養不良、長期接觸傷害肝臟的化學物質或藥物等。脂肪堆積於肝臟中會造成肝臟發炎，產生疤痕組織而演變成肝硬化、甚至肝癌，是需要重視的問題。此外，脂肪肝常與其他慢性疾病一起發生，包含糖尿病、高血壓、高血脂、慢性腎臟病、高尿酸，或憂鬱等。慢性酗酒是最常見的脂肪肝病因，如果飲酒量>80-60公克/天，則其發生率增長5~25倍。長期的過度飲酒，通過乙醇本身與其代謝產物乙醛可使肝細胞反覆發生脂肪變性、壞死和再生，而導致酒精性肝病，包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化，甚至是肝癌的發生。脂肪肝、急/慢性肝炎、肝硬化於治療時應採均衡飲食，且如同上述之肌少症，應攝取適量蛋白質，其攝取量應達每公斤體重1.0-1.2g。綜合前述，攝取適量蛋白質有助於改善肌少症及酒精性肝損傷。
不同的蛋白質來源及水解程度亦可能影響到肌肉的合成。例如，先前的研究指出乳清蛋白水解物較乳清蛋白及支鏈胺基酸更易促進骨骼肌之葡萄糖汲取能力(Morifuji,M.,Kanda,A.,Koga,J.,Kawanaka,K.,& Higuchi,M.(2010).Post-exercise carbohydrate plus whey protein hydrolysates supplementation increases skeletal muscle glycogen level in rats.Amino acids,38(4),1109-1115.)，且促進運動後骨骼肌蛋白質合成速率提升之表現也以乳清蛋白水解物較游離型胺基酸來得佳(Kanda,A.,Nakayama,K.,Fukasawa,T.,Koga,J.,Kanegae,M.,
Kawanaka,K.,& Higuchi,M.(2013).Post-exercise whey protein hydrolysate supplementation induces a greater increase in muscle protein synthesis than its constituent amino acid content.British Journal of Nutrition,110(6),981-987.)
此外，臺灣菸酒股份有限公司釀酒副產物清酒粕富含蛋白質，具有提升骨骼肌蛋白質合成速率與降低分解速率、增強運動表現與抗疲勞等功效(Chen,Y.M.,Lin,C.L.,Wei,L.,Hsu,Y.J.,Chen,K.N.,Huang,C.C.,& Kao,C.H.(2016).Sake protein supplementation affects exercise performance and biochemical profiles in power-exercise-trained mice.Nutrients,8(2),106.)，顯示該酒粕蛋白質可做為保健食品之成份來源。
鑑於現有技術的問題在於(1)酒粕中仍富含多項雜質未除去；(2)先前技術所提之蛋白質類預防酒精性肝損傷物質為動物性來源，須開發素食者可食用之蛋白質。本發明提供一種發酵穀米水解物的用途，該發酵穀米水解物係發酵穀米經水解蛋白酶水解及超過濾後所得分子量小於8000道爾頓之發酵穀米水解超濾物。
於一具體實施例中，該發酵穀米水解物分子量係小於100000道爾頓。較佳地，該發酵穀米水解物分子量係小於8000道爾頓。
於一具體實施例中，該發酵穀米水解物係具有治療肌少症之功效。
於另一具體實施例中，該發酵穀米水解物係具有治療肝損傷之功效。較佳地，該肝損傷係為酒精性肝損傷。
於一具體實施例中，該酒精性肝損傷係為酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、及酒精性肝硬化。較佳地，該酒精性肝損傷為酒精性脂肪肝及酒精性肝炎。
由於該發酵穀米水解物具有治療肌少症及酒精性肝損傷之功效，因此本發明之另一目的為提供一種保健食品組成物，該保健食品組成物係包含該發酵穀米水解物及食品上可接受之載劑。
於一具體實施例中，保健食品組成物具有治療肌少症及酒精性肝損傷功效。
應該理解的是，前面的一般描述與下面的詳細描述均只是例示性及解釋性的，而不是對本發明的限制。
當結合附圖閱讀時，將更佳地理解前述發明內容以及以下對本發明的詳細描述。為了說明本發明的目的，在附圖中顯示目前較佳的具體實施例。
附圖中：圖1為發酵穀米的水解度對其成分刺激肌肉細胞汲取葡萄糖能力的影響。I：基礎組(KRH緩衝液)；II：水解度=18%；III：水解度=27%；IV：水解度=33%；V：水解度=37%；VI：水解度=42%；VII：水解度=45%；VIII：水解度=51%；IX：水解度=55%；X：水解度=61%；XI：水解度=63%；XII：水解度=75%。*表示p<0.05。
圖2為發酵穀米的水解度對其成分刺激肌肉細胞生長蛋白質的影響。I：發酵穀米泥(發酵穀米濕料+水)；II：發酵穀米水解物；III：發酵穀米水解後超過濾分離純化第一階段之超濾物(分子量<100000道爾頓)；IV：發酵
穀米水解後超過濾分離純化第二階段之超濾物(分子量<8000道爾頓)；V：乳清蛋白(Whey Protein Concentrate，簡稱WPC)；VI：支鏈胺基酸(Branched-chain amino acid，簡稱BCAA)。*表示p<0.05。
圖3為發酵穀米各純化階段之組分對刺激肌肉細胞生長蛋白質的影響。I：發酵穀米泥(發酵穀米濕料+水)；II：發酵穀米水解物；III：發酵穀米水解後超過濾分離純化第一階段之超濾物(分子量<100000道爾頓)；IV：發酵穀米水解後超過濾分離純化第二階段之超濾物(分子量<8000道爾頓)；V：乳清蛋白(Whey Protein Concentrate，簡稱WPC)；VI：支鏈胺基酸(Branched-chain amino acid，簡稱BCAA)。*表示p<0.05。
圖4為小鼠肌力表現之量測結果。第I組：正常對照組；第Ⅱ組：低劑量發酵穀米水解後超過濾分離純化第二階段之超濾物；第Ⅲ組：高劑量發酵穀米水解後超過濾分離純化第二階段之超濾物；第Ⅳ組：低劑量酵母抽出物水解後超過濾分離純化第二階段之超濾物；第V組：高劑量酵母抽出物水解後超過濾分離純化第二階段之超濾物；第Ⅵ組：乳清蛋白組；第Ⅶ組：支鏈胺基酸組。若兩組之間沒有顯著差異而分類在同一組，以相同字母標記之，若為顯著差異者則不涵蓋相同字母(如a與b，或a與bc彼此具顯著差異；反之，bc與b，bc與c則不具顯著差異，以此類推)。
圖5為小鼠四肢肌肉重量平均差異。第I組：正常對照組；第Ⅱ組：低劑量發酵穀米水解後超過濾分離純化第二階段之超濾物；第Ⅲ組：高劑量發酵穀米水解後超過濾分離純化第二階段之超濾物；第Ⅳ組：低劑量酵母抽出物水解後超過濾分離純化第二階段之超濾物；第V組：高劑量酵母抽出物水解後超過濾分離純化第二階段之超濾物；第Ⅵ組：乳清蛋白組；第Ⅶ組：支鏈胺基酸組。若
兩組之間沒有顯著差異而分類在同一組，以相同字母標記之，若為顯著差異者則不涵蓋相同字母(如a與b，或a與bc彼此具顯著差異；反之，bc與b，bc與c則不具顯著差異，以此類推)。
圖6為小鼠肝臟組織切片。第I組：對照組；第Ⅱ組：酒精組；第Ⅲ組：護肝雞精組；第Ⅳ組：低劑量發酵穀米水解後超過濾分離純化第二階段之超濾物；第V組：高劑量發酵穀米水解後超過濾分離純化第二階段之超濾物。
圖7為小鼠肝臟抗氧化能力分析。第I組：對照組；第Ⅱ組：酒精組；第Ⅲ組：護肝雞精組；第Ⅳ組：低劑量發酵穀米水解後超過濾分離純化第二階段之超濾物；第V組：高劑量發酵穀米水解後超過濾分離純化第二階段之超濾物。若兩組之間沒有顯著差異而分類在同一組，以相同字母標記之，若為顯著差異者則不涵蓋相同字母(如a與b，或a與bc彼此具顯著差異；反之，bc與b，bc與c則不具顯著差異，以此類推)。
圖8為小鼠肝臟三酸甘油酯含量變化。第I組：對照組；第Ⅱ組：酒精組；第Ⅲ組：護肝雞精組；第Ⅳ組：低劑量發酵穀米水解後超過濾分離純化第二階段之超濾物；第V組：高劑量發酵穀米水解後超過濾分離純化第二階段之超濾物。*表示p<0.05。
除非另外定義，本文所用之所有技術及科學術語具有與熟習本發明所屬領域之技術者普遍了解之相同意義。
應理解本文所使用的術語僅具有針對描述具體實施例之目的，而意不在於限制。
如本文所用，單數形式「一」(a、an)及「該」包括複數參照，除非另外明確指示內容。因此，例如，對「一樣本」之參照包括複數個此等樣本及熟習本技術者已知之其等同物。
如本文所用，「發酵」係指一種生物體對於有機物的分解過程，其中該生物體包括微生物、植物細胞及酵母菌等，其於有氧或無氧狀態下，分解有機物產生能量之一種方式。
如本文所用，「穀米」係指禾本科糧食作物及其種子，包括大米、小麥、玉米、小米以及其他雜穀，如高粱、野米、燕麥、薏仁米等，所含主要營養物質為糖類與蛋白質等，為許多地區之主要糧食。
如本文所用，「超濾」係指使用半透薄膜基於粒度及薄膜孔隙之尺寸，以物理方式且選擇性地自溶液移除粒子及/或離子的過濾技術。
如本文所用，「肌少症」係指肌肉大幅減少之症狀，嚴重者可能造成失能、跌倒、功能退化、甚至導致死亡。一般而言，肌少症可從肌肉量減少、肌力減弱、及肌耐力減少來判斷。
如本文所用，「酒精性肝損傷」係指酒精攝取過量而產生之肝臟併發症。臨床上可分為酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、及酒精性肝硬化等，酒精性脂肪肝患者之肝功能檢查可能仍正常或輕度異常，急性酒精性肝炎之症狀包括發燒、疲倦、厭食、體重減輕、肝臟腫大且壓痛、黃疸、白血球升高、營養不良等現象，實驗室檢查可見明顯肝發炎現象[GOT(麩胺酸草酸轉胺脢)/GPT(丙酮酸轉胺脢)值上升]。酒精性肝硬化的特點是小結節性肝硬化，病人可出現門脈高壓，食道及/或胃靜脈瘤出血，甚至腹水之情形，最後可能會併發肝衰竭、肝腦病變或肝癌等威脅生命的症狀。
本發明提供一種發酵穀米水解物的用途，該發酵穀米水解物係發酵穀米經水解蛋白酶水解及超過濾後所得分子量小於8000道爾頓之發酵穀米水解超濾物。
於一方面，該發酵穀米水解物分子量係小於100000道爾頓；較佳地，小於8000道爾頓。
於一方面，該發酵穀米水解物係具有治療肌少症之功效。
於一方面，該發酵穀米水解物具有優於市售乳清蛋白及支鏈胺基酸之促進肌肉細胞蛋白質合成的功效。
於另一方面，該發酵穀米水解物係具有治療酒精性肝損傷之功效。
該酒精性肝損傷係指酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、及酒精性肝硬化，較佳地，該酒精性肝損傷係指酒精性脂肪肝及酒精性肝炎。
再者，本發明之另一目的為提供一種具有治療肌少症及酒精性肝損傷之保健食品組成物，其中該保健食品組成物係包含該發酵穀米水解物及食品上可接受之載劑。
根據本發明之實施例，該食品組成物可形成，例如但不侷限，顆粒、粉末、液體、及固體形式。該食品組成物可進一步包含食品工業上及生理上可接受之賦形劑或添加劑。該賦形劑或添加劑可根據該領域中慣用之技術適當添加，沒有特別限制。該賦形劑或添加劑例如但不侷限於澱粉、玉米澱粉、乳糖、糊精、環糊精、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、明膠、樹膠、洋菜膠、古阿樹膠、果膠、阿拉伯膠、西黃耆膠或鹿角膠，或其他添加物例如防腐劑或矯味劑等。
為能進一步說明本發明，以下將茲分別舉實例做詳細說明，惟，該等實例係為用以解說之例示，其中所使用之任何詞彙並不限制本發明說明書及申請範圍之範圍及意義。
材料
酶法水解工藝
(1)發酵穀米取自臺灣菸酒股份有限公司桃園酒廠；(2)落地型50公升發酵槽；(3)鹼性蛋白酶(Alcalase)、中性蛋白酶(Neutrase)、及複合風味蛋白酶(Flavourzyme)購自臺灣恆州實業股份有限公司代理之NOVO；(4)1M及2M氫氧化鈉(NaOH)；及(5)板框壓濾機。
超過濾
(1)超過濾設備系統；及(2)超過濾膜管(截留分子量=100000道爾頓及8000道爾頓)。
冷凍乾燥
(1)冷凍乾燥機。
L6骨骼肌細胞葡萄糖汲取能力功效試驗
(1)大鼠L6骨骼肌細胞株購自Japan Health Sciences Foundation,Health Science Research Resources Bank(Osaka,Japan)，其培養基組成為：90% Dulbecco’s Modified Eagle Medium、10% Fetal bovine serum、2mM L-glutamine、1.5g/L sodium bicarbonate、0.1mM non-essential amino acids、1.0mM sodium pyruvate。培養條件設定為：37℃、5% CO2，每星期定期繼代培養2-3次；(2)2-Deoxy-D-glucose(簡稱2DG)：Sigma-Aldrich,Cat.No.D6134；(3)0.1M NaOH；(4)0.1M鹽酸(HCl)；(5)200mM TEA(Triethanolamine，pH 8.1)緩衝溶
液：溶解Triethanolamine hydrochloride(TEA；Wako Chemicals,Cat.No.146-07271)在水中至濃度為200mM，並用1M氫氧化鈉調整pH值至8.1；(6)KRH(Krebs-Ringer-HEPES)緩衝溶液：內含50mM HEPES、137mM NaCl、4.7mM KCl、1.85mM CaCl2、1.3mM MgSO4。以0.5M氫氧化鈉調整pH值至7.4；(7)牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，簡稱BSA)：CAS 9048-46-8；A8806-5G；Sigma；(8)2-Deoxy-D-glucose 6-phosphate sodium salt,monohydrate(簡稱DG6P)：Santa Cruz,Cat.No.SC-220734；(9)反應溶劑：50mM TEA、50mM KCl、0.02%(w/v)BSA、0.1mM NADP、0.2units/mL diaphorase、2μM resazurin sodium salt、15 to 20U/mL G6PDH；及(10)多功能微孔盤分光光譜儀。
L6骨骼肌細胞全蛋白定量分析功效試驗
(1)大鼠L6骨骼肌細胞株；(2)KRH(Krebs-Ringer-HEPES)緩衝溶液；(3)胰島素：Insulin,Human,Recombinant；CAS 11061-68-0；SI-I2643-25MG；Sigma；(4)考馬司亮藍G-250：Coomassie Brilliant Blue G-250；CAS 6104-58-1；B0770-5G；Sigma；(5)RIPA Buffer solution：Cat.No.R3792；500mL,Sterile；Teknova(150mM Sodium Chloride；1.0% Triton X-100；1.0% Sodium Deoxycholate；0.1% Sodium Dodecyl Sulfate；50mM Tris-HCl,pH 7.5；2mM EDTA,pH=8.0)；(6)BSA；及(7)多功能微孔盤分光光譜儀。
具體實施例一
發酵穀米水解超濾物製備
將12公斤發酵穀米濕料與28公斤水均質混合，並於50公升發酵槽內攪拌，形成發酵穀米泥。將反應溫度調整至約55℃，以2M氫氧化鈉調整pH值至7左右後，加入如下之水解蛋白酶：(1)鹼性蛋白酶(5%，以蛋白質計)：
適用於T=30-65℃，pH=7.0-10.0；(2)中性蛋白酶(2%，以蛋白質計)：適用於T=45-55℃，pH=5.5-7.5；及(3)風味蛋白酶(1%，以蛋白質計)：適用於T=50℃，pH=5.0-7.0，並控制反應條件：溫度=55-60℃、pH=7.0-7.5(過程中持續監控，並以1M氫氧化鈉調整pH)、及時間=3-4小時，水解反應結束後，將收集之液體經過85-95℃(歷時15-30分鐘)的熱處理，使其內之水解蛋白酶失活，並經板框壓濾收取濾液，即為發酵穀米水解物。
以物質之分子量大小進行分離純化的篩選依據。將發酵穀米水解物經過截留分子量為100000道爾頓的超過濾膜，收集其透流液(分子量小於100000道爾頓之發酵穀米水解超濾物)，並以該透流液進一步經過截留分子量為8000道爾頓的超過濾膜，收集其透流液，即可取得分子量小於8000道爾頓之清發酵穀米水解超濾物，再將其冷凍乾燥，即製得分子量小於8000道爾頓之發酵穀米水解超濾物凍乾粉。
具體實施例二
L6骨骼肌細胞葡萄糖汲取能力功效試驗
準備已經分化好的L6骨骼肌細胞株在九十六孔微孔盤中，使用適當的細胞培養基，接著應用於2DG汲取測定。製備待測樣品溶液：(1)親水性樣品：溶解待測樣品在適當的培養基中以至目標濃度；及(2)疏水性樣品：透過溶解在二甲基亞碸(DMSO)中，用適當的培養基稀釋至目標濃度來準備待測樣品，並調整二甲基亞碸最終濃度至0.1%至1.0%。細胞須先維持無血清培養基4~18小時，透過降低胎牛血清中一些生長因子和胰島素誘發作用的影響，以增強葡萄糖汲取活性模式。之後移除細胞培養基，使用100μL含有0.1% BSA的KRH緩衝溶液洗滌各孔細胞，洗滌完後移除KRH緩衝溶液，再加入100μL待測樣品至
各孔細胞中，在37℃的5%二氧化碳培養箱內培養15分鐘後，以100μL含有0.1% BSA的KRH緩衝溶液洗滌各孔細胞，洗滌完後移除KRH緩衝溶液，添加100μL含有0.1% BSA及1mM 2DG的KRH緩衝溶液至各孔細胞中，在37℃的5%二氧化碳培養箱內培養20分鐘後，以100μL含有0.1% BSA的KRH緩衝溶液洗滌各孔細胞，洗滌完後移除KRH緩衝溶液，加入50μL的0.1M NaOH到各孔中，利用微孔盤震盪器混合均勻，以85℃持續加熱60分鐘，藉此裂解細胞，之後再於各孔內添加50μL的0.1M HCl以酸鹼中和細胞裂解物，添加50μL的200mM TEA緩衝溶液，並利用微孔盤震盪器混合均質。利用50mM TEA緩衝溶液(pH 8.1)序列稀釋DG6P標準品溶液(濃度：30、15、7.5、3.75、1.875、0μM)，接者將原先細胞培養盤內各孔之100μL混合均質液及100μL不同濃度的DG6P標準品溶液，轉移到九十六孔測光孔盤中，分別添加100μL反應溶劑到九十六孔測光孔盤之各孔內，在37℃下反應90分鐘後，使用多功能微孔盤分光光譜儀(λex=530-570nm，λem=590-620nm)量測九十六孔測光孔盤內各孔溶液所呈現之螢光強度，計算各實驗組螢光強度數值與無樣品處理組之螢光強度的比值，並以DG6P標準品的螢光強度繪製標準曲線，以其擬合曲線方程式推求實驗組樣品內DG6P的相應含量。
如圖1所示，發酵穀米水解時間越長，其水解程度亦將越高。由實驗結果可觀察到水解度約33-37%(IV~V)之發酵穀米水解物，對於肌肉細胞具有最佳之葡萄糖汲取能力的活性表現，故將間接有助於蛋白質及肝醣的生合成，且其相較基礎組(I)皆呈現有顯著性差異。
具體實施例三
L6骨骼肌細胞全蛋白定量分析功效試驗
將培養於DMEM+10%FBS的L6肌肉細胞液以Trypsin-EDTA刮下，稀釋其細胞濃度達約4x104cells/mL，植入九十六孔微孔盤(每孔滴加100μL)，於37℃的5%二氧化碳培養箱內培養兩天，將96孔微孔盤內的培養液吸除，更換成每孔滴加180μL DMEM+2%FBS，再於37℃的5%二氧化碳培養箱內培養兩天後，分別滴入20μL控制組樣品(KRH緩衝液)、含有1000nM insulin的控制組樣品、含有1000nM insulin的實驗組樣品(發酵穀米泥、發酵穀米水解物、發酵穀米水解超濾物)、含有1000nM insulin的市售競品(乳清蛋白、支鏈胺基酸)，至九十六孔微孔盤，於37℃的5%二氧化碳培養箱內培養三天後，吸除孔內全部液體，並以KRH緩衝溶液(KRH buffer)洗滌以去除培養液及樣品之潛在干擾，接著分別於每孔添加30μL蛋白質萃取緩衝溶液(RIPA buffer)，將細胞培養盤震盪1分鐘後，置於4℃冰箱中，15分鐘後再震盪1分鐘，持續1小時，共歷經四個循環以裂解肌肉細胞，釋出其內之蛋白質，再分別皆加入370μL的10mM檸檬酸緩衝溶液(10mM Citric acid-sodium citrate buffer，pH 5)，以進行稀釋並調整反應環境之酸鹼度。之後預先加入200μL以3倍去離子水和1倍布拉德福試劑[內含0.01%(w/v)考馬斯亮藍G-250、4.7%(w/v)乙醇及8.5%(w/v)磷酸]所混合形成之稀釋版布拉德福試劑(此稀釋液可於室溫下儲存約兩星期)至擬進行吸光值量測的九十六孔測光孔盤中，再分別添入50μL之含有肌肉細胞蛋白質的樣品稀釋液，利用微孔盤震盪器，將九十六孔測光孔盤內之溶液混合均勻，並於室溫下反應2分鐘，再以多功能微孔盤分光光譜儀測定並記錄各孔的OD595數值，計算各實驗組OD595強度數值與控制組之OD595強度的比值，並繪製BSA的標準檢量線(BSA濃度為橫坐標，OD595為縱座標)，藉由樣品溶液偵測得的吸光值及該檢量線之擬合方程式，計算出樣品溶液的相應蛋白質濃度，進而回推出
經不同樣品培養後之肌肉細胞內的全蛋白含量，最後再將其分別除以培養細胞用之樣品內的蛋白質含量(亦即組分蛋白質)，即可得知在單位組分蛋白質(單位：毫克)的投料培養下，能創造出多少相應之肌肉細胞全蛋白含量(單位：毫克)。
如圖2，發酵穀米水解時間越長，其水解程度亦將越高。由實驗結果亦可觀察到水解度落在約33-37%(IV~V)區間之發酵穀米水解物，具有較佳之促進肌肉細胞生長蛋白質的活性表現，且相較基礎組(I)皆呈現有顯著性差異。
進一步研究發酵穀米各純化階段之組分對刺激肌肉細胞生長蛋白質的影響，由圖3可發現發酵穀米水解後超過濾分離純化第二階段之超濾物(IV)相對於市售競品-乳清蛋白(V)及支鏈胺基酸(VI)，具有較佳之促進肌肉細胞生長蛋白質的功效活性表現，且其相較於清酒粕泥(I)呈現出顯著性差異。
具體實施例四
發酵穀米水解物於抗肌少症之應用
由樂斯科生物科技有限公司購入63隻八周齡雄性C57BL/6小鼠，飼養於溫度控制在22±2℃、濕度60-80%、明暗週期12小時的動物房中。63隻小鼠依體重作S型分組，每組9隻分三籠(每籠3隻)，每組起始體重平均相近，分別為：正常對照組(I)：給予正常流質飼料(表1)並任食；低劑量發酵穀米水解超濾物組(Ⅱ)：給予含有低劑量發酵穀米水解超濾物的正常流質飼料並任食；高劑量發酵穀米水解超濾物組(Ⅲ)：給予含有高劑量發酵穀米水解超濾物的正常流質飼料並任食；低劑量酵母抽出物水解超濾物組(Ⅳ)：給予含有
低劑量酵母抽出物水解超濾物的正常流質飼料並任食；高劑量酵母抽出物水解超濾物組(V)：給予含有高劑量酵母抽出物水解超濾物的正常流質飼料並任食；乳清蛋白組(Ⅵ)：給予含有市售乳清蛋白的正常流質飼料並任食，作為正控制組；支鏈胺基酸組(Ⅶ)：給予含有市售支鏈胺基酸的正常流質飼料並任食，作為正控制組。
小鼠入動物房兩週適應期後，開始餵食含有試驗樣品之飼料，並於試驗第十週將小鼠犧牲，收集四肢肌肉組織並保存在-80℃冰箱中，以供後續分析使用。此研究之所有數據皆以MINITAB 14軟體處理，並以一元變方分析(One way ANOVA)進行統計分析，當組間差異顯現時，再以最小顯著差異法(Least significant difference，LSD)方法比較各組間之差異。在分析圖上，若兩組之間沒有顯著差異而分類在同一組，以相同字母標記之，若為顯著差異者則不涵蓋相同字母(如a與b，或a與bc彼此具顯著差異；反之，bc與b，bc與c則不具顯著差異，以此類推)。
於試驗開始後之第5週及第10週，分別對小鼠進行其肌力表現的量測，分析結果圖4所示，經試樣餵養5週後，低劑量發酵穀米水解超濾物(第Ⅱ組)之肌力表現顯著高於正常對照組(第I組)；持續餵養10週後，低、高劑量發酵穀米水解超濾物(第Ⅱ組、第Ⅲ組)均顯著高於正常對照組(第I組)與市售乳清蛋白(第Ⅵ組)和支鏈胺基酸組(第Ⅶ組)，說明發酵穀米水解超濾物確實具有提升肌力之功效。
此外，經10週試樣餵養，各組小鼠予以犧牲後，各別取下四肢肌肉秤重，取平均作統計分析以進行肌肉量之比較。如圖5所示，食用低、高劑量發酵穀米水解超濾物(第Ⅱ組、第Ⅲ組)之小鼠四肢肌肉重量皆顯著大於正常對照組(第I組)，說明發酵穀米水解超濾物應具有增加肌肉量之功效。
具體實施例五
發酵穀米水解物於減緩酒精性肝損傷之應用
由樂斯科生物科技有限公司購入48隻八周齡雄性C57BL/6小鼠，飼養於溫度控制在22±2℃、濕度60-80%、明暗週期12小時的動物房中。48隻小鼠依體重作S型分組，每組6隻分兩籠(每籠3隻)，每組起始體重平均相近，分別為：對照組(I)：給予正常流質飼料並任食；酒精組(Ⅱ)：給予Lieber-DeCarli酒精流質飼料並任食；護肝雞精組(Ⅲ)：給予含有市售護肝雞精的酒精流質飼料並任食；低劑量發酵穀米水解超濾物組(IV)：給予含有低劑量發酵穀米水解超濾物的Lieber-DeCarli酒精流質飼料並任食；及高劑量發酵穀米水解超濾物組(V)：給予含有高劑量發酵穀米水解超濾物的Lieber-DeCarli酒精流質飼料並任食(表2)。
小鼠一入動物房兩週適應期後開始進行介入物與酒精誘導試驗，並於試驗第十週將小鼠犧牲，收集血液、肝臟組織為後續分析之樣品。小鼠採血前一晚將飼料移除，禁食八小時後以採血針採血，檢體靜置於冰上一小時後，以轉速2500g、4℃之條件離心15分鐘，此步驟重複後取得小鼠血清。所有採集的樣品都保存在-80℃冰箱中，以供後續分析使用。此研究之所有數據皆以MINITAB 14軟體處理，並以一元變方分析(One way ANOVA)進行統計分析，當組間差異顯現時，再以最小顯著差異法(Least significant difference，LSD)方法比較各組間之差異。
慢性酒精攝取造成肝臟產生大囊泡性脂肪肝(Macrovesicular fatty liver)，可以使用蘇木素-伊紅染色(Hematoxylin-eosin stain，簡稱H&E stain)觀察肝臟的型態變化。參見圖6，第2組的小鼠肝臟切片上，在中央靜脈區(Central vein，簡稱CV)的周圍有許多膨大的脂肪小滴堆積，為典型的大囊泡性脂肪肝特徵，但給予發酵穀米水解物的小鼠，其肝臟切片中脂肪堆積狀況有明顯改善，表示發酵穀米水解物能緩解慢性酒精攝取造成肝臟脂肪堆積的情形。
測量小鼠肝中抗氧化系統，如超氧化物岐化酶(Superoxide dimutase，簡稱SOD)、過氧化酶(Catalase，簡稱CAT)、穀胱甘肽過氧化酶(Glutathione peroxidase，簡稱GPx)、穀胱甘肽還原酶(Glutathione reductase，GRd)活性變化。參閱圖7，小鼠肝臟中的CAT在五組之間並無顯著差異(p>0.05)，SOD活性測試中，補充穀物發酵水解物的組別，其SOD活性明顯較高(p<0.05)；GPx的活性分析顯示，食用含酒精流質飼料的小鼠其GPx活性較差，而補充發酵穀米水解物的組別可顯著提升GPx活性(p<0.05)；GRd的活性分析顯示，食用含酒精流質飼料的小鼠其GRd活性較差，補充高劑量穀物發酵水解物可顯著提升GRd活性(p<0.05)。
測量各組小鼠肝中三酸甘油酯含量變化。如圖8，由肝臟中三酸甘油酯含量分析顯示，食用含酒精流質飼料的小鼠(Ⅱ)其三酸甘油酯含量較高，而補充穀物發酵水解物(V、Ⅳ)可顯著降低肝臟內三酸甘油酯含量(p<0.05)。
本領域中的通常知識者將理解，可以對上述具體實施例進行改變而不脫離其廣泛的發明構思。因此，應當理解，本發明不限於所揭露的特定具體實施例，而是旨在涵蓋由所附的申請專利範圍所界定的本發明的精神及範圍內的修改。
Claims (7)
- 一種發酵穀米水解物用於製備治療肌少症之藥劑之用途，其中該發酵穀米水解物係以包含下列步驟之方法製備：(1)將發酵穀米以蛋白酶進行水解反應，水解反應後收集液體，將收集之液體經過85-95℃熱處理，使其內之水解蛋白酶失活，並經板框壓濾收取一濾液；及(2)自該濾液中取分子量小於8000道爾頓之部分為該發酵穀米水解物。
- 一種發酵穀米水解物用於製備治療酒精性肝損傷之藥劑之用途，其中該發酵穀米水解物係以如請求項1所述之方法製備。
- 如請求項2之用途，其中該酒精性肝損傷係為酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、及酒精性肝硬化。
- 如請求項3之用途，其中該酒精性肝損傷係為酒精性脂肪肝及酒精性肝炎。
- 一種食品組成物，其包含如請求項1至2任一項之發酵穀米水解物，及食品上可接受之載劑。
- 如請求項5之食品組成物，其具有治療肌少症之功效。
- 如請求項5之食品組成物，其具有治療酒精性肝損傷之功效。
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|---|---|---|---|---|
| CN103468600A (zh) * | 2013-06-26 | 2013-12-25 | 江苏大学 | 一种发酵谷物的乳酸菌及其用途 |
-
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Non-Patent Citations (4)
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| Animal Science Journal 79(3):347 - 353 · May 2008 |
| EVALUATION OF THE PROTEIN QUALITY AND AVAILABLE LYSINE OF GERMINATED AND FERMENTED CEREALS First published: March 1979| Journal of Food Science https://doi.org/10.1111/j.1365-2621.1979.tb03811.x| |
| 食品生技 2010 NO.23 41-49 |
| 食品生技 2010 NO.23 41-49 EVALUATION OF THE PROTEIN QUALITY AND AVAILABLE LYSINE OF GERMINATED AND FERMENTED CEREALS First published: March 1979| Journal of Food Science https://doi.org/10.1111/j.1365-2621.1979.tb03811.x| Animal Science Journal 79(3):347 - 353 · May 2008 * |
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