TWI699373B - 用以鑑別蓮霧之果皮顏色的引子對及方法 - Google Patents

Abstract

一種引子對，係用以鑑別蓮霧的果皮顏色，其包含：一正向引子及一反向引子，該正向引子具有如SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列，該反向引子具有如SEQ ID NO：2所示之核苷酸序列。本發明另包含使用該引子對以鑑別蓮霧之果皮顏色的方法。

Description

用以鑑別蓮霧之果皮顏色的引子對及方法

本發明係關於一種引子對，尤其是一種用以鑑別蓮霧之果皮顏色的引子對；本發明另關於以該引子對鑑別蓮霧之果皮顏色的方法。

蓮霧(Syzygium samarangense)為桃金孃科(Myrtaceae)的重要經濟果樹，其果皮顏色大致可以分為深紅色、淡紅色、粉紅色、白色及綠色等，惟由於蓮霧的主要栽培品種長久以來都是果實具有紅色外觀的粉紅種或大果種，且果皮呈色的深淺常是消費者判斷果實成熟度及品質，甚至是市場決定販售價格的慣用標準，使得紅色果皮成為蓮霧重要的育種目標之一。

儘管粉紅種或大果種為目前主要栽培品種，惟仍然有著色不佳、裂果率高及易受寒害等缺點，針對果皮顏色部分，儘管能夠應用果實呈色鮮紅或深紅且著色穩定的品種(品系)來改良粉紅種或大果種的著色問題，惟工者仍難以掌控雜交後代的果皮顏色；再者，由於蓮霧在產生果實之前無法經由植株外觀判斷其果皮顏色，使得工者必須等到蓮霧植株成熟結果之後，才可以確認果皮顏色，相當耗時及耗費金錢，依據上述，仍然需要提供一種用以鑑別蓮霧之果皮顏色的引子對及方法。

為解決上述問題，本發明的目的是提供一種用以鑑別蓮霧之果皮顏色的引子對，係用以鑑別蓮霧之果皮顏色者。

本發明的次一目的是提供一種用以鑑別蓮霧之果皮顏色的方法，係使用如上述之引子對者。

本發明的用以鑑別蓮霧之果皮顏色的引子對，包含：一正向引子，具有如SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列；及一反向引子，具有如SEQ ID NO：2所示之核苷酸序列。

據此，本發明的用以鑑別蓮霧之果皮顏色的引子對，係藉由該正向引子及該反向引子的核苷酸序列，而能夠用以共同擴增MYB基因的啟動子之特異性片段，藉此工者無須等待蓮霧產生果實，或是在果實尚未呈色時，即能夠用以鑑別蓮霧之果皮顏色，進而可以達成提高育種效率及降低種苗培育成本等功效。

基於相同的技術概念，本發明的用以鑑別蓮霧之果皮顏色的方法，包含：一反應混合液配製步驟，混合一待測樣品、一反應緩衝液、一去氧核糖核酸混合液、如上述之用以鑑別蓮霧之果皮顏色的引子對，及一DNA聚合酶，以配製成一反應混合液，該待測樣品中包含一樣本DNA；一樣本DNA擴增步驟，以該DNA聚合酶擴增該反應混合液中的樣本DNA；及一偵測步驟，偵測該反應混合液中經擴增之樣本DNA。

據此，本發明的用以鑑別蓮霧之果皮顏色的方法，藉由使用該正向引子及該反向引子共同擴增MYB基因的啟動子之特異性片段，只要依據偵測該反應混合液中是否存在有經擴增之樣本DNA，即能夠鑑別蓮霧之果皮顏色是否為紅色，可以達成提高育種效率及降低種苗培育成本等功效。

該用以鑑別蓮霧之果皮顏色的方法，其中，該樣本DNA擴增步驟包含：一變性子步驟，係於90~95℃下，使該反應混合液中的樣本DNA 變性成二單股DNA，該二單股DNA包含一正向單股DNA及一反向單股DNA；一煉合子步驟，係於53~59℃下使該正向引子煉合該反向單股DNA，及使該反向引子煉合該正向單股DNA；一聚合子步驟，係於68~74℃下，使該DNA聚合酶自該正向引子及該反向引子複製該樣本DNA；一重複子步驟，係依序重複該變性子步驟、該煉合子步驟及該聚合子步驟，使該樣本DNA擴增至一預定值。

〔本發明〕

1:引子對

11:正向引子

12:反向引子

T:樣本DNA

T1:反向單股DNA

T2:正向單股DNA

〔第1a圖〕本發明之用以鑑別蓮霧之果皮顏色的方法的變性子步驟之示意圖。

〔第1b圖〕本發明之用以鑑別蓮霧之果皮顏色的方法的煉合子步驟之示意圖。

〔第1c圖〕本發明之用以鑑別蓮霧之果皮顏色的方法的聚合子步驟之示意圖。

〔第2圖〕以本發明之用以鑑別蓮霧之果皮顏色的方法分析編號01~20的蓮霧品種(品系)的分析結果。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：請參照第1a~1c圖所示，本發明之一實施例的用以鑑別蓮霧之果皮顏色的引子對1可以包含一正向引子11及一反向引子12，該正向引子11係對應蓮霧MYB基因的啟動子之特異性片段反向單股DNA T1，該反 向引子12則對應蓮霧MYB基因的啟動子之特異性片段正向單股DNA T2，因而可以用以共同擴增MYB基因的啟動子之特異性片段。於本實施例中，該引子對1之正向引子11具有如SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列，該引子對1之反向引子12具有如SEQ ID NO：2所示之核苷酸序列。

該引子對可以應用檢測一待測樣品中是否包含前述MYB基因的啟動子之特異性片段，工者即能夠藉此鑑別該待測樣品的果皮顏色，因此，用以鑑別蓮霧之果皮顏色的方法可以包含：一反應混合液配製步驟、一樣本擴增步驟及一偵測步驟。

詳而言之，該待測樣品可以為尚未結果之蓮霧果樹的葉片，也可以為尚未成熟呈現出紅色之蓮霧果實的果皮；舉例而言，工者可以採取蓮霧果樹的葉片後，於低溫下進行暗處理，以降低葉片中的醣類(例如遮光後放置於冰箱1天)，接著將葉片以液態氮研磨粉碎後，以溴化十六烷基三甲胺(cetyltrimethylammonium bromide，簡稱CTAB)法進行DNA萃取，以取得樣本DNA T；又或者，工者也可以採取蓮霧果實，削取約1~2mm厚度的果皮以液態氮研磨後，依前述葉片DNA萃取方法以取得樣本DNA T。

於該反應混合液配製步驟中，係混合該待測樣品、一反應緩衝液、一去氧核糖核酸混合液、一氯化鎂溶液、該引子對1及一DNA聚合酶，以配製成該反應混合液，該待測樣品中包含該樣本DNA T。

於該樣本DNA擴增步驟中，係以該DNA聚合酶擴增該反應混合液中的樣本DNA。於本實施例中，該樣本DNA擴增步驟可以包含一變性子步驟、一煉合子步驟、一聚合子步驟及一重複子步驟。

請參照第1a圖所示，該變性子步驟係於90~95℃下，使該反應混合液中的樣本DNA T變性成包含該正向單股DNA T2及該反向單股DNA T1的二單股DNA；續請參照第1b圖所示，該煉合子步驟係於53~59℃下， 使該正向引子11煉合該反向單股DNA T1，及使該反向引子12煉合該正向單股DNA T2；另請參照第1c圖所示，該聚合子步驟係於68~74℃下，使該DNA聚合酶自該正向引子11及該反向引子12複製該樣本DNA T；及該重複子步驟係依序重複該變性子步驟、該煉合子步驟及該聚合子步驟，使該樣本DNA擴增至一預定值。

該偵測步驟中，則係偵測該反應混合液中經擴增之樣本DNA；舉例而言，工者可以利用聚丙烯醯胺凝膠(PAGE)電泳進行分析，或者利用瓊脂糖凝膠(agarose)電泳進行分析，若是其中能夠偵測到經擴增之樣本DNA，即顯示該待測樣品的果皮顏色為紅色。

據此，為證實藉由該引子對即可以應用於快速且簡便地鑑別蓮霧之果皮顏色，遂取如第1表所示之品種(品系)的蓮霧果樹的葉片進行以下試驗：

本試驗係以如第1表所示之品種(品系)的蓮霧果樹的葉片作為該樣品DNA T，並混合如第2表所示之正向引子11、反向引子12、去氧核糖核酸混合液、氯化鎂溶液、反應緩衝液及DNA聚合酶，以得該反應混合液。

接著將該反應混合液混合均勻後，置入PCR反應器內進行反應，係於94℃之溫度下變性4分鐘後，再於94℃之溫度下變性45秒、於56℃之溫度下煉合60秒、於72℃之溫度下延長45秒，重複30循環之後，最終於72℃之溫度下延長4分鐘。

以1%之瓊脂糖凝膠電泳分析完成反應之反應混合液，其結果如第2圖所示，編號01~15的蓮霧品種(品系)均可以觀察到約為759bp的條帶，而此一條帶則不存在於編號16~20的綠色果皮/白色果皮的蓮霧品種(品系)，顯示藉由該用以鑑別蓮霧之果皮顏色的引子對1，確實能夠有效區分蓮霧之果皮顏色。

綜上所述，本發明的用以鑑別蓮霧之果皮顏色的引子對，係藉由該正向引子及該反向引子的核苷酸序列，而能夠用以共同擴增MYB基因的啟動子之特異性片段，藉此工者無須等待蓮霧產生果實，或是在果實尚未呈色時，即能夠用以鑑別蓮霧之果皮顏色，可以達成提高育種效率及降低種苗培育成本等功效。

再者，本發明的用以鑑別蓮霧之果皮顏色的方法，藉由使用該正向引子及該反向引子共同擴增MYB基因的啟動子之特異性片段，只要依據偵測該反應混合液中是否存在有經擴增之樣本DNA，即能夠鑑別蓮霧之果皮顏色是否為紅色，可以達成提高育種效率及降低種苗培育成本等功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

                         SEQUENCE LISTING
          <![CDATA[<110>  國立屏東科技大學]]>
          <![CDATA[<120>  用以鑑別蓮霧之果皮顏色的引子對及方法]]>
          <![CDATA[<130>  ]]>
          <![CDATA[<160>  2     ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<223>  用以鑑別蓮霧的果皮顏色之正向引子]]>
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          cgaatctcct aaaccgttgc                                                   20
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          <![CDATA[<400>  2]]>
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1:引子對

11:正向引子

12:反向引子

T:樣本DNA

T1:反向單股DNA

T2:正向單股DNA

Claims (3)

1. 一種用以鑑別蓮霧之果皮顏色的引子對，係包含：一正向引子，具有如SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列；及一反向引子，具有如SEQ ID NO：2所示之核苷酸序列。
2. 一種用以鑑別蓮霧之果皮顏色的方法，包含：一反應混合液配製步驟，混合一待測樣品、一反應緩衝液、一去氧核糖核酸混合液、一氯化鎂溶液、如申請專利範圍第1項所述之用以鑑別蓮霧之果皮顏色的引子對，及一DNA聚合酶，以配製成一反應混合液，該待測樣品中包含一樣本DNA；一樣本DNA擴增步驟，以該DNA聚合酶擴增該反應混合液中的樣本DNA；及一偵測步驟，偵測該反應混合液中經擴增之樣本DNA。
3. 如請求項2之用以鑑別蓮霧之果皮顏色的方法，其中，該樣本DNA擴增步驟包含：一變性子步驟，係於90~95℃下，使該反應混合液中的樣本DNA變性成二單股DNA，該二單股DNA包含一正向單股DNA及一反向單股DNA；一煉合子步驟，係於53~59℃下，使該正向引子煉合該反向單股DNA，及使該反向引子煉合該正向單股DNA；一聚合子步驟，係於68~74℃下，使該DNA聚合酶自該正向引子及該反向引子複製該樣本DNA；一重複子步驟，係依序重複該變性子步驟、該煉合子步驟及該聚合子步驟，使該樣本DNA擴增至一預定值。

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