TWI695719B - 含有亞鐵胺基酸粒子的組合物及其用於製造治療或改善胰臟相關疾病的醫藥品的用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種組合物，其中該組合物中含有由亞鐵胺基酸螯合物燒結而成之亞鐵胺基酸螯合物粒子，且所述亞鐵胺基酸螯合物粒子之平均粒徑為500奈米至2600奈米、平均分子量為1,500道爾頓(Dalton)至600,000道爾頓。且本發明之組合物可用於製備治療或改善胰臟相關疾病的醫藥品的用途，其中所述醫藥品含有有效劑量之所述組合物以及藥學上可接受的載劑。

Description

含有亞鐵胺基酸粒子的組合物及其用於製造治療或改善胰臟相關疾病的醫藥品的用途

本發明涉及含有由亞鐵胺基酸螯合物燒結而成之亞鐵胺基酸螯合物粒子之組合物，還涉及該組合物在製備治療或減緩胰臟相關疾病的用途。

胰臟常見疾病有胰臟癌及胰臟炎，胰臟相關疾病的治療難度在於胰臟之臟器位置、功能及有限之治療方法。

胰臟癌的治療進展在眾多癌症類別中呈現較為緩慢的進步，至今整體的五年存活率只有9%。胰臟癌是第四大癌症致死原因，而在台灣，胰臟癌為國人第八大癌症死亡原因，每年每十萬人口中就有8.5人因此病而喪生。歸咎緩慢進展的原因，則是因為可用藥物比較有限。因此針對胰臟癌發展新藥物極為有價值。而惡性腹水是晚期胰臟癌臨床患者常見的症狀，多爲胰臟癌的腹膜浸潤所致，惡性腹水的現象可能爲血性或漿液性，隨著腹水量的增加、壓迫到腹腔內的器官，會產生食慾下降、胃口不好等情形，有些患者會因為惡性腹水造成腸子蠕動變差，甚至出現麻痺性腸阻塞，而產生嘔吐症狀。腹水之形成不僅影響了患者之生活品質，亦不利於患者的後期治療及康復；胰臟炎是胰臟分泌的消化酵素開始消化胰臟自身與周圍的組織，而導致發炎的現象，並無相對應的治療藥物，通常使用支持性療法使胰臟自行恢復。因此尋找一種有效治療或減緩胰臟疾病之藥物是目前亟需之課題。

為達上述目的，本發明提供一種組合物，且該組合物可用於治療或減緩胰臟相關疾病。其中該組合物中含有由亞鐵胺基酸螯合物燒結而成之亞鐵胺基酸螯合物粒子，且所述亞鐵胺基酸螯合物粒子之平均粒徑為500奈米至2600奈米、平均分子量為1,500(Dalton)至600,000道爾頓。

於其中一實施態樣中，較佳地，所述亞鐵胺基酸螯合物粒子之平均分子量為1,500道爾頓至15,000道爾頓；於另一實施態樣中，較佳地，所述亞鐵胺基酸螯合物粒子之平均分子量為400,000道爾頓至550,000道爾頓，更佳地，所述亞鐵胺基酸螯合物粒子之平均分子量為550,000道爾頓。

較佳地，所述之組合物中的亞鐵胺基酸螯合物之亞鐵與胺基酸的螯合比例係介於1：1至1：4之間。

較佳地，所述之組合物中的亞鐵胺基酸螯合物之亞鐵與胺基酸的螯合比例係介於1：1.5至1：2.5之間。

較佳地，所述之組合物中的亞鐵胺基酸螯合物係由無機鐵與胺基酸混合並歷經60ºC至90ºC加熱8小時至48小時所製得之含有亞鐵胺基酸螯合物之組合物，其中無機鐵與胺基酸之重量比例係介於1：1.2至1：1.5之間。

更佳地，所述之無機鐵係硫酸亞鐵、氯化亞鐵、焦磷酸亞鐵或其組合；該胺基酸係甘胺酸。

本發明所述之「有效劑量」係指在劑量上及對於所需要之時間段而言對達成所要治療或減緩胰臟相關疾病的有效之量；依據本發明，係指透過施予特定範圍量之含有亞鐵胺基酸螯合物燒結而成之亞鐵胺基酸螯合物粒子之組合物，能夠降低人類或小鼠胰臟癌細胞存活率、誘導胰臟癌細胞死亡、抑制人類胰臟癌細胞遷移及侵襲之能力、抑制原位移植胰臟癌腫瘤之生長、降低或減緩原位移植胰臟癌晚期惡性腹水、治療或減緩胰臟炎。

較佳地，本發明之組合物的給其中給藥對象可為人類、小鼠、犬或貓等，所述之組合物之有效劑量可為0.1 mg/kg/day至120 mg/kg/day。

較佳地，所述之組合物的有效劑量於小鼠係介於每日每公斤1 毫克(mg/kg/day)至120 mg/kg/day；更佳地，介於10 mg/kg/day至120 mg/kg/day，更佳地，介於24 mg/kg/day至72 mg/kg/day。

較佳地，所述之組合物之有效劑量於犬隻、貓隻係介於每日每公斤0.1 毫克(mg/kg/day)至20 mg/kg/day；更佳地，介於1 mg/kg/day至5 mg/kg/day。

較佳地，所述之組合物之有效劑量於人係介於1 mg/ day至7000 mg/day；更佳地，介於10 mg/day至700 mg/day。以上劑量是根據2005年美國食品藥物管理局所公告之實驗初期估算方法(Estimating the maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers)計算而得。

本發明所述之「醫藥學上可接受之載劑」包含，但不限於還原劑(reducing agent)、溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、表面活性劑(surfactant)，及其他類似或適用本發明之載劑。

較佳地，所述還原劑包含，但不限抗壞血酸(ascorbic acid)、檸檬酸(citric acid)、乙酸(acetic acid)、丙酸(propionic acid)、丁酸(butyric acid)、乳酸(lactic acid)、羥琥珀酸(malic acid)、磺酸(sulfonic acid)、丁二酸(succinic acid)或其組合。

本發明所述之「醫藥品」可以多種形式存在，該等形式包含，但不限於液體、半固體及固體藥劑形式，諸如溶液(solution)、乳劑(emulsion)、懸浮液(suspension)、粉末(powder)、錠劑(tablet)、丸劑(pill)、口含錠(lozenge)、片劑(troche)、口嚼膠(chewing gum)、膠囊(capsule)、脂質體、栓劑以及其他類似或適用本發明之劑型。

較佳地，所述之醫藥品係經腸道的或非經腸道的劑型。

更佳地，所述之該經腸道的劑型係口服劑型，其口服劑型係溶液、乳劑、懸浮液、粉末、錠劑、丸劑、口含錠、片劑、口嚼膠或膠囊。

較佳地，所述胰臟相關疾病包括，但不限於胰臟癌、胰臟癌轉移、胰臟癌產生之腹水、胰臟炎。

較佳地，所述之組合物給藥方式是搭配Gemcitabine同時給予，更佳地，所述Gemcitabine的給藥方式是進行一次以上之Gemcitabine給藥週期，所述Gemcitabine給藥週期為每週給藥Gemcitabine兩次，連續三週給藥後於第四週停止給藥Gemcitabine。

本發明所述之組合物可治療或減緩胰臟相關之疾病，且無明顯副作用產生，搭配Gemcitabine同時給藥以治療或減緩原位移植胰臟癌時有更佳之療效，並且有較少的肝毒性副作用，如：黃疸的產生。

本發明將由下列的實施例做為進一步說明，這些實施例並不限制本發明前面所揭示的內容。熟習本發明之技藝者，可以做些許之改良與修飾，但不脫離本發明之範疇。

製備例 1 製備 含有亞鐵胺基酸粒子的組合物

本發明之含有亞鐵胺基酸螯合物粒子的組合物係由台灣配位體股份有限公司製作(批次號碼：F171001；製造日期：2017年10月5日)，且該組合物為冷凍乾燥之粉末，其係以下述方式製備。首先，將硫酸亞鐵與甘胺酸(純度98%以上)以重量比1：1.3混合並歷經60°C至90°C加熱8小時至48小時，以獲得亞鐵胺基酸螯合物，其中亞鐵胺基酸螯合物之亞鐵與胺基酸螯合比例係介於1：1至1：4之間，接著，亞鐵胺基酸螯合物在200-240 °C下進行燒結，以獲得亞鐵胺基酸螯合物粒子。經由雷射粒徑分析儀(Beckman Coulter, N5, Submicron Particle Size Analyzer)在水中進行動態光散射測得亞鐵胺基酸螯合物粒子的平均粒徑為1465.90±132.29 奈米。利用Waters Alliance 2695 System進行凝膠穿透層析儀(GPC)測定數目平均分子量(Mn)、重量平均分子量(Mw)、峰值平均分子量(MP)和多分散性(polydispersity，PDI)，分別為68188道爾頓(Dalton)、525538道爾頓(Dalton)、286426道爾頓(Dalton)及7.707205。

製備例 2 人類胰腺癌細胞培養

將人類之胰腺癌細胞(PANC-1)以含有10%胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS, GIBCO, Invitrogen)、青黴素[100單位/毫升(U/mL)]、鏈黴素[100 微克/毫升(μg/mL)]之杜氏改良培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium, GIBCO, Invitrogen)培養於37°C、加濕的5% 二氧化碳之培養箱中；人類之胰腺癌細胞(BxPC-3、SUIT-2及AsPC-1) 以含有10%胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS, GIBCO, Invitrogen)、青黴素[100單位/毫升(U/mL)]、鏈黴素[100 微克/毫升(μg/mL)]之RMPI-1640) 培養於37°C、加濕的5% 二氧化碳之培養箱中。PANC-1、BxPC-3及AsPC-1購自生物資源保存及研究中心(財團法人食品工業發展研究所)，SUIT-2細胞株經由生物資源保存及研究中心之人類細胞複核(STR profile)鑑定。

製備例 3 人類正常胰臟 導管 細胞培養

人類之胰臟導管上皮細胞HPDE-E6E7(購自Expasy No.CVCL_S972)以添加有上皮生長因子(epidermal growth factor)及牛腦下垂體萃取物(Life Technologies, Inc., Grand Island, NY)的KSF培養基培養於37°C、加濕的5% 二氧化碳之培養箱中。

實施例 1 抗胰臟癌 -- 細胞增生實驗

使用MTT試驗測試本發明之組合物之半最大抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC ₅₀)。取製備例2-3製備之正常胰臟細胞(人類胰臟導管上皮細胞)及胰臟癌細胞(胰腺癌細胞)種植於96孔盤上，每孔4×10 ³個細胞，並使用製備例1之本發明之組合物以劑量依賴方法(10 ⁰、10 ¹、10 ²、10 ³、10 ⁴μg/mL)之處理後培養24、48、72小時，在每孔中添加MTT試劑，再繼續培養四小時(37°C且5% 二氧化碳)後，利用微孔盤分析儀(BioTek)測量570nm下之吸光值。

請參閱如下表1所示，本發明之組合物處理24、48、72小時對人類胰臟導管上皮細胞及人類胰腺癌細胞之半最大抑制濃度。總地來說，本發明之組合物對胰臟癌細胞(人類胰腺癌細胞)之細胞增生率的抑制較正常胰臟細胞更為顯著。

表1、本發明之組合物對胰臟癌細胞及正常胰臟細胞之24、48、72小時MTT試驗半最大抑制濃度

實施例 2 本發明之組合物誘導胰臟癌細胞死亡實驗

分析本發明之組合物對細胞死亡之誘導。將人類胰腺癌細胞種植於6孔盤中，並以劑量依賴方法(0、100、250、500、750、1000 μg/mL)處理製備例1的本發明之組合物48及72小時後，以PBS緩衝溶液潤洗後，添加胰蛋白酶作用後，並以70%乙醇於-20°C下固定一小時，細胞以含有RNase 及碘化丙啶(propidium iodide) 的PBS重新懸浮同時進行染色，利用流式細胞儀偵測(FACSCalibur flow cytometer，Becton Dickinson)代表細胞死亡的亞第一間期(sub-G1)細胞累積。

請參閱下表2為本發明之組合物對此些細胞的半最大抑制濃度分析結果，實驗數據顯示出本發明之組合物可抑制細胞增生率，本發明之組合物可顯著誘導人類胰腺癌細胞死亡。

表2、使用流式細胞儀分析本發明之組合物對胰臟癌細胞之半最大抑制濃度

實施例 3-1 本發明之組合物對人類胰臟癌細胞遷移的影響

利用有8微米孔洞的transwell小室(Corning Costar; Lowell, MA, USA)置入24孔細胞培養盤中進行細胞遷移測試。使用製備例2之人類胰臟癌細胞進行細胞遷移測試，對照組細胞係未經本發明之組合物處理；實驗組細胞經由製備例1的本發明之組合物以劑量依賴方法處理24小時。將實驗組及對照組細胞(2×10 ⁴細胞/孔)種植於上層腔室(upper chamber)無血清的培養基中，下層腔室則為添加有10%胎牛血清之培養基作為化學吸引，於37°C、5% 二氧化碳下培養24小時後，將transwell小室之多孔膜下表面之細胞利用甲醇固定、使用結晶紫(0.05重量%)染色，並利用光學顯微鏡(40倍，隨機3視野/孔)計算穿透多孔膜的遷移之細胞數。

實施例 3-2 本發明之組合物對人類胰臟癌細胞侵襲的影響

利用有8微米孔洞的transwell小室(Corning Costar; Lowell, MA, USA)置入24孔細胞培養盤中進行細胞侵襲測試，且transwell小室之多孔膜上塗佈有基質膠(matrigel，60微克；BD Bioscience)。使用製備例2之胰臟癌細胞進行細胞遷移測試，對照組細胞為未經本發明之組合物處理；實驗組細胞經由製備例1的本發明之組合物以劑量依賴方法處理24小時，將實驗組及對照組細胞(1×10 ⁵細胞/孔)種植於上層腔室(upper chamber)無血清的培養基中，且下層腔室為添加有10%胎牛血清之培養基作為化學吸引，培養24小時後，將transwell小室之多孔膜下表面之細胞利用甲醇固定、使用結晶紫(0.05重量%)染色，並利用光學顯微鏡(40倍，隨機3視野/孔)計算穿透多孔膜侵襲之細胞數。

實施例3-1及3-2之結果，請參照圖1至圖4，其中，圖1，本發明之組合物對PANC-1細胞株的細胞遷移能力及細胞侵襲能力的抑制為劑量依賴性的。且如圖2所示SUIT-2細胞、圖3所示BxPC-3細胞、圖4所示AsPC-1細胞之移動性亦受到本發明之組合物之抑制。上述數據結果顯示了本發明之組合物在抑制癌細胞的移動性上扮演一重要角色。

實施例 4 本發明之組合物對原位移植胰臟癌腫瘤之抑制

將製備例2製備的PANC-1人類胰腺癌細胞株以習知技術將冷光螢光載體轉殖標記後，利用手術將該冷光螢光標記之以5×10 ⁵細胞數量原位植入實驗小鼠(自樂思科公司購入之60隻NOD-SCID實驗小鼠)的胰臟。在細胞植入動物胰臟間隔10日後，開始進行測量胰臟癌的非侵入式活體影像系統(In Vivo Imaging System，IVIS)基線訊號，在取得活體冷光的基線訊號測量值以隨機平均分組方式將所有實驗小鼠進行分組[IVIS訊號測量值的總平均數加減三個標準差，選取IVIS訊號測量值標準內的動物，並分成控制組、製備例1之本發明之組合物低劑量組每公斤24毫克(24 mg/kg ) 及本發明之組合物高劑量組每公斤72毫克(72 mg/kg)]。分組後開始進行藥物的給予，將生理食鹽水與溶解於生理食鹽水之兩種濃度的本發明之組合物經由餵食管直接管餵至實驗小鼠胃中。小鼠在接受本發明之組合物處理後一個月內持續接受藥物毒性的觀察，體重的測量，並且持續四週測量IVIS訊號。待小鼠出現死亡、不可逆的嚴重毒性與嚴重腹水狀況則必須犧牲，因此視為事件點，用以統計生存率的差異。在實驗分組方面，扣除實驗中死亡、IVIS 訊號測量值過高或過低 (標準外離群值)後，控制組 、高劑量組及低劑量組中每組可分得13隻原位移植胰臟癌實驗小鼠 (包含每組各三隻實驗小鼠作為胰臟癌惡性腹水定量試驗) 。而每次IVIS訊號之測量時間點，分別為十天基線 (Baseline 10D)、實驗進行第13天(13D)、17天(17D)、20天(20D)、24天(24D)、31天(31D)與38天(38D)，總共7個IVIS訊號值測量時間點。給藥後前兩週每週IVIS測量兩次，主要在於觀察本發明之組合物對於胰臟癌的初期療效變化，後兩週則恢復每週一次IVIS的測量記錄。在本發明之組合物給予實驗小鼠方面，以不間斷地連續給予本發明之組合物90天後停藥，給藥方式與時間主要是配合控制組在植入PANC-1(5×10 ⁵)的細胞數目下，原位植入胰臟癌小鼠生命生存期大約90天左右。實驗期間記錄每隻小鼠的生命生存期。

請參閱圖5-1至5-7及圖6所示，在給予本發明之組合物處理原位移植胰臟癌的兩組實驗組 (高劑量及低劑量)，與對照組相比較下在實驗進行第24天(24D)後，就有明顯的抑制原位移植胰臟癌腫瘤生長的效果。偵測訊號之差異隨時間到第38天達到最大。高劑量與低劑量兩組之間的IVIS的訊號測量結果則沒有明顯的差異。因此，本發明之組合物的使用可抑制胰臟細胞株PANC-1原位移植實驗小鼠胰臟之腫瘤生長。 為了能進一步清楚觀察出本發明之組合物治療胰臟癌的效果，將每一個IVIS測量時間點的數據，兩組實驗組 (高劑量及低劑量)與控制組相比較，製成下表三。如下表三所示，在本發明之組合物處理後的第三天(D13，也就是實驗進行第13天) 後就可以觀察到每一個IVIS測量點，兩組實驗組均比控制組的胰臟癌腫瘤生長情形來的緩慢，因此本發明之組合物對於胰臟癌具有抑制腫瘤生長的效果。且在最後一個IVIS測量時間點 (38D)，可以看到本發明之組合物的兩組實驗組對於胰臟癌約有50%~60%的抑制胰臟癌生長的療效。 表三、本發明之組合物實驗組與控制組在每個IVIS測量時點之比較

此外，請進一步參考圖7所示，為處理本發明之組合物高低劑量之兩實驗組與控制組在生命生存期之差異。在控制組10隻實驗小鼠中，實驗進行至第65天就出現的第一隻死亡的實驗小鼠，等到實驗進行80天後控制組陸續出現大規模死亡狀況，到第91天後最後一隻控制組實驗小鼠死亡，控制組整組在生命生存期的平均數為85.7天。對於處理本發明之組合物高低劑量之兩實驗組各十隻實驗小鼠的生命生存期，兩組在出現第一隻死亡的實驗小鼠同樣發生在實驗進行第86天，兩組在生命生存期趨勢線圖幾乎呈現非常一致的緩慢下降狀態，表示本發明之組合物不論高劑量或者低劑量，在給予90天後，對原位移植胰臟癌之實驗小鼠，具有相同延長實驗小鼠生命生存期的治療效果。兩組以本發明之組合物處理之實驗小鼠生命生存期最長天數同樣出現在第137天，在低劑量組整組在生命生存期的平均數為108.7天；在高劑量組整組在生命生存期的平均數為107天，高低劑量組生存期比控制組平均數高出約22天。

實施例 5 本發明之組合物對伴隨胰臟癌發生之腹水之影響使用實施例4預留的供胰臟癌惡性腹水定量試驗之小鼠，兩實驗組(高劑量組及低劑量組之製備例1組合物)、一控制組，三組各三隻，觀察惡性腹水的情況，每日測量小鼠之體重，且在實驗進行90天解剖老鼠進行胰臟癌惡性腹水定量，且每日觀測小鼠外觀與活動力。 請參閱圖8所示，在本發明之組合物處理第80天(亦即實驗進行90天)，每組體重的變化，本發明之組合物處理80天期間，高低劑量兩組每日平均體重變化，幾乎都沒有太大的起伏。而控制組在處理第70天(實驗進行80天)左右，平均體重變化開始呈現大幅增加，至本發明之組合物處理第80天(實驗進行90天)平均體重增加將近3克重。請進一步參閱圖9，可見實驗進行90天之解剖前控制組與處理本發明之組合物低劑量組照片，控制組小鼠腹腔變得異常腫脹，而觀察本發明之組合物處理之低劑量組實驗動物腹腔則無明顯改變。根據觀察，解剖後小鼠腹腔腹水的狀況，控制組小鼠呈現腹水瀰漫整個腹腔器官；本發明之組合物低劑量組的小鼠則無這種情形。控制組及低劑量組小鼠腹水定量之結果，控制組平均有6毫升腹水；而本發明組合物處理低劑量組平均約有1毫升的腹水。控制組與本發明之組合物低劑量處理實驗組小鼠在原位移植胰臟癌惡性腹水的定量上有極大的差距，表示本發明之組合物的處理對原位移植胰臟癌的小鼠晚期惡性腹水的產生具有減緩或降低的療效。此外觀察整個實驗從一開始到實驗進行90天後，實驗小鼠對於本發明之組合物處理是否有副作用狀況。我們發現實驗組的小鼠在體重、外觀與活動力上並沒有太大的改變，據此作合理推測本發明之組合物對原位移植胰臟癌之實驗小鼠，應無明顯的副作用。

實施例 6 合併 Gemcitabine 與本發明之組合物對原位移植胰臟癌的治療效果 ( 一 )

將製備例2製備的PANC-1人類胰臟癌細胞株以冷光螢光載體轉殖標記後，利用手術將該冷光螢光標記之以5×10 ⁵細胞數量原位植入實驗小鼠(自樂思科公司購入之50隻NOD-SCID實驗小鼠)的胰臟，在細胞植入動物胰臟間隔10日後，開始進行測量胰臟癌的非侵入式活體影像系統(In Vivo Imaging System，IVIS)基線訊號，在取得活體冷光的基線訊號測量值以隨機平均分組方式將所有實驗小鼠進行分組[IVIS訊號測量值的總平均數加減三個標準差，選取IVIS訊號測量值標準內的動物，並分成控制組(control，使用生理食鹽水)、製備例製備之本發明之組合物組(每日給予1次24 mg/kg之製備例1之組合物，給予方式為經由餵食管直接管餵至實驗小鼠胃中)、Gemcitabine組(每週以靜脈注射的方式施打兩次100 mg/kg Gemcitabine ) 及合併組(本發明之組合物組每日給予24 mg/kg及每週給予Gemcitabine兩次100 mg/kg)]後，即進行藥物給予。本實驗中之本發明之組合物劑量、給藥方式選擇是基於實施例4之高(72 mg/kg)、低劑量(24 mg/kg)無顯著差異，因此選擇以24 mg/kg之劑量進行本次實驗；而胰臟癌一線藥物之劑量、給藥方式是根據Cook, Natalie, et al. "Gamma secretase inhibition promotes hypoxic necrosis in mouse pancreatic ductal adenocarcinoma." Journal of Experimental Medicine 209.3 (2012): 437-444.及Olive, Kenneth P., et al. "Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer." Science (2009).兩篇期刊論文決定Gemcitabine以100mg/kg每週兩次的給藥方式進行實驗。本次實驗的IVIS測量時間點分別為：十天基線 (Baseline 10D)、實驗進行第17天(給藥後7天)、實驗進行第24天(給藥後14天)、實驗進行第31天(給藥後21天)及實驗進行第38天(給藥後28天)，並於第九週將所有實驗動物採血檢測總膽紅素(T-Bilirubin)、麩胺酸草乙酸轉胺酶/天門冬胺酸轉胺酶(GOT/AST)與麩胺酸丙酮酸轉胺酶/丙胺酸轉胺酶(GPT/ALT)，配合肉眼觀察是否有出現黃疸現象，肉眼觀察的黃疸現象指標分別為是否小鼠瘦弱、膽異常腫大、毛皮暗黃、四肢與尾巴呈現異常黃色。實驗期間記錄每隻小鼠的生命生存期。 請同時參照圖10-1至圖10-5及圖11所示，本發明之組合物組與控制組相比，有明顯的抑制胰臟癌腫瘤生長的效果，且與實施例五的高劑量(72mg/kg)與低劑量(24mg/kg)實驗組的效果相近，約有50%抑制胰臟癌腫瘤生長的療效；Gemcitabine組在給藥28天後，抑制原位移植胰臟腫瘤生長的結果與本發明之組合物組效果相近，且在整體實驗期間，IVIS 訊號測量結果呈現的趨勢也很一致，約有50%抑制胰臟癌腫瘤生長的效果；合併組在給藥28天後，較本發明之組合物組與Gemcitabine組有更佳的抑制原位移植胰臟癌腫瘤生長效果，與控制組相比抑制胰臟癌腫瘤生長更是高達80%，因此合併本發明之組合物與胰臟癌臨床一線化療藥物Gemcitabine，更具有抑制原位移植胰臟癌腫瘤生長的效果。 請進一步參照圖12所示，Gemcitabine組與合併組實驗小鼠先後都發生黃疸現象，意即觀察到老鼠瘦弱、膽異常腫大、毛皮暗黃、四肢與尾巴也呈現異常黃色並伴隨惡性腹水產生，並在發現不久後兩組老鼠開始陸續死亡。在事件剛發生時(給藥9週)，對整個實驗中的所有老鼠進行採血，並檢測血液中的總膽紅素、GOT 與GPT，所得的結果如圖13-1至13-3所示，Gemcitabine組與合併組兩組的總膽紅素、GOT 與GPT都明顯高於其他沒有給予Gemcitabine的組別，因此推測連續不間斷給予Gemcitabine可能造成嚴重的黃疸現象產生。請進一步參閱圖14所示，在控制組8隻實驗小鼠中，實驗進行至第60天出現的第一隻死亡的實驗小鼠，於實驗第91天後最後一隻控制組實驗小鼠死亡，控制組整組生命生存期的平均數為80.1天。合併組及Gemcitabine組，兩組在給藥9週之後發現實驗小鼠出現黃疸現象，且在給藥第10週 (實驗進行第80天) 開始出現大規模實驗小鼠死亡。Gemcitabine組出現第一隻死亡的實驗小鼠發生在實驗進行第77天，於實驗進行第100天最後一隻實驗小鼠死亡，整組在生命生存期的平均數為89.4天。合併組第一隻死亡小鼠則出現在實驗進行第84天，於實驗進行第108天最後一隻實驗小鼠死亡，整組在生命生存期的平均數為94.1天。根據上述生存期數據，此兩組的實驗小鼠一旦出現黃疸現象，約兩週後就會完全死亡。本發明之組合物組出現第一隻死亡的實驗小鼠發生在實驗進行第88天，於實驗進行第138天最後一隻實驗小鼠死亡，本發明之組合物組整組生命生存期的平均數為106天，較控制組生存期的平均數高出約26天，有延長原位移植胰臟癌實驗小鼠生命生存期的效果。

實施例 7 合併 Gemcitabine 與本發明之組合物對原位移植胰臟癌的治療效果 ( 二 )

將製備例2製備的PANC-1人類胰臟癌細胞株以冷光螢光載體轉殖標記後，利用手術將該冷光螢光標記之以5×10 ⁵細胞數量原位植入實驗小鼠(自樂思科公司購入之40隻NOD-SCID實驗小鼠)的胰臟，在細胞植入動物胰臟間隔10日後，開始進行測量胰臟癌的非侵入式活體影像系統(In Vivo Imaging System，IVIS)基線訊號，在取得活體冷光的基線訊號測量值以隨機平均分組方式將所有實驗小鼠進行分組[IVIS訊號測量值的總平均數加減三個標準差，選取IVIS訊號測量值標準內的動物，並分成控制組(control，使用生理食鹽水)、本發明之組合物組(每日給予24 mg/kg製備例1之組合物)、Gemcitabine組(每週給予兩次100 mg/kg，連續三週後，於第四週停止Gemcitabine的施打，此四週稱為一個Gemcitabine給藥週期，本實施例中總共執行了3個Gemcitabine給藥週期) 及合併組(每週給予Gemcitabine兩次100 mg/kg，連續三週後，於第四週停止Gemcitabine的施打及每日給予製備例1本發明之組合物24 mg/kg)。給藥途徑與實施例6相同，但給藥方式相較於實施例6作調整，係由於實施例6發現連續九週不間斷給予Gemcitabine使原位移植胰臟癌實驗小鼠產生黃疸現象，且於給藥第10~12週接連死亡。本次實驗的IVIS測量時間點分別為：十天基線 (Baseline 10D)、實驗進行第17天(給藥後7天)、實驗進行第24天(給藥後14天)、實驗進行第31天(給藥後21天)、實驗進行第38天(給藥後28天)、實驗進行第45天(給藥後35天)、實驗進行第59天(給藥後49天)；並在固定時間點[十天基線(給藥第0週)、給藥後第四週、給藥後第四週、給藥後第十週、給藥後第十週]對實驗小鼠採血，並檢測血中的總膽紅素、GOT與GPT以監測造成黃疸原因的指標因素，配合肉眼觀察是否有出現黃疸現象，肉眼觀察的黃疸現象指標分別為是否小鼠瘦弱、膽異常腫大、毛皮暗黃、四肢與尾巴呈現異常黃色。實驗期間記錄每隻小鼠的生命生存期。 實驗結果請參閱圖15-1至圖15-7及圖16所示，在給藥49天，與控制組相比，本發明之組合物組於49天後，對於抑制原位移植胰臟癌腫瘤生長亦有非常好的效果(抑制效果達50%以上)，效果與實施例4及6在給藥28天的效果接近，腫瘤生長的趨勢線圖也呈現同樣的趨勢，且實施例4、6及7三次實驗一致呈現出有50%以上抑制原位移植胰臟癌腫瘤生長的療效；Gemcitabine組在給藥後49天，抑制原位移植胰臟癌腫瘤生長的效果與本發明之組合物組的效果呈現很相近的趨勢。在49天實驗期間，IVIS 測量時間點之腫瘤生長趨勢線所呈現的結果也很一致，約有50~60%抑制原位移植胰臟癌腫瘤生長的效果。因此，改變Gemcitabine給藥方式，對於Gemcitabine組的效果沒有太大影響，在給藥後28天至49天期間原位移植胰臟癌生長抑制還是有50~60%的治療效果；在改變Gemcitabine給藥方式後，合併組比單獨給藥的兩組(本發明之組合物組及Gemcitabine組)對原位移植胰臟癌腫瘤具有更好的抑制生長的效果，本次實驗結果相較於控制組，呈現抑制胰臟癌腫瘤生長高達80%以上(給藥28天)的效果，與實施例6幾乎相同。且合併組的IVIS時間點訊號測量值相較於同一時間點的控制組訊號測量值，在給藥28天與給藥49天兩個時間點上，可看出對於抑制原位移植胰臟癌腫瘤生長，沒有太大的差異(抑制腫瘤生長效果分別為84%與77%)。因此，改變Gemcitabine給藥方式，對於合併組的後期治療效果應該沒有太大影響。因此從本實施例重複之動物試驗更可以確定合併本發明之組合物與胰臟癌臨床一線化療藥物Gemcitabine，對於原位移植胰臟癌腫瘤的生長有更好的抑制效果。 請進一步參閱圖17-1至圖17-4，本實施例固定時間點採血監測總膽紅素、GOT與GPT。分別有十天基線、給藥後第四週、給藥後第八週(給藥後第四週與第八週分別跟第一與第二次Gemcitabine給藥週期結束時間點一致)、給藥後第十週與給藥後第十二週(給藥後第十週與第十二週係與第三次Gemcitabine給藥週期進行與結束時間點一致)共五個時間點，而給藥後第十三週的採血時間點係因發現小鼠異常，出現黃疸現象，所以在預定的五個時間點額外增加採血監測時間點。如圖17-1所示，採血監測的三個項目在給藥後之前12週各組平均數都落在正常血液生化值範圍內 (正常值:總膽紅素：0~1 mg/dl；GOT/AST:40~100 U/L；GPT/ALT:30~50 U/L)。Gemcitabine組在給藥後第八週可能因為有一隻實驗小鼠，血液溶血或機器檢測誤差，導致整組在GPT數值異常往上提高，至給藥第十週則恢復正常。控制組在給藥後第十週以後總膽紅素與GOT兩項數值都有略高於其他3組實驗組，然控制組在給藥後10週實驗小鼠開始陸續死亡，所以3項血液檢測數值的平均數與其他組的差距並未有明顯拉開。進行給藥後第十三週 (第三次Gemcitabine給藥週期結束後一週)，發現除控制組(實驗小鼠剩一隻)外，其他給藥的三組：本發明之組合物組、Gemcitabine組與合併組都有1至2隻實驗小鼠產生瘦弱、膽異常腫大、毛皮暗黃、四肢與尾巴呈現異常黃色等黃疸現象，緊急採血檢測，所得各組總紅膽素、GOT與GPT之趨勢圖為圖17-2、17-3、17-4，從這3個圖觀察出總紅膽素部分，本發明之組合物組與Gemcitabine組各有一隻；合併組有三隻實驗小鼠明顯高於標準值(0.1-0.9 mg/mL)，且總膽紅素高於標準值的實驗小鼠也在10天內陸續死亡。Gemcitabine組在給藥後第十三週採血後，發現一開始沒有產生黃疸現象的實驗小鼠也接連出現黃疸現象，並在出現黃疸後不久實驗小鼠陸續死亡。關於本實施例之實驗小鼠生命生存期請參照圖18，及下表四 表四、控制組及給藥實驗組之小鼠生命生存期

可觀察出，本發明之組合物組之生命生存期明顯優於控制組，與實施例4、6之結果一致，本發明之組合物組實驗小鼠最長生存期為140天，平均數比控制組高出約25.2天，本發明之組合物能延長原位移植胰臟癌腫瘤實驗小鼠的生命生存期；且本次實驗相較於實施例6改變了Gemcitabine給藥方式後，有給予Gemcitabine的Gemcitabine組及合併組實驗小鼠生命生存期明顯比實施例6之對應組別的實驗小鼠要長；實驗小鼠若發生黃疸現象，將集中在一段時間(給藥後第13週及第14週)內陸續死亡，但是如果實驗小鼠撐過此期間就會有較長的生存期。此外，合併組實驗小鼠生命生存期最長為150天以上，存活期平均數比控制組高出約36天，合併組治療對原位移植胰臟癌之實驗小鼠的生命生存期明顯優於本發明之組合物組及Gemcitabine組。表格中每組僅有7隻小鼠之數據，是由於每一組分別均取一隻小鼠解剖。

實施例 8 本發明之組合物對胰臟炎的影響

對血液中的胰臟炎指標澱粉酶amylase數值[正常值500-1500 單位每公升(U/L)] 過高之三犬隻投予製備例1之本發明之組合物，給藥方式為每日管餵一次，每日每十公斤10毫克(10 mg/10kg/day)，持續給予一週後，測量澱粉酶數值，並以一澱粉酶數值異常之犬隻作為控制組，僅投予生理食鹽水進行支持性治療作為對照。並追蹤各組實驗動物之血液中澱粉酶數值，判斷胰臟炎是否改善。 請參閱下表五所示，本實驗結果顯示，相較於投予生理食鹽水之對照組，投予本發明之組合物進行之犬隻血液中之澱粉酶異常值均下降，因此，本發明之組合物對胰臟炎有改善之效果。雖未記載於表格中，然貓隻的胰臟炎亦觀察到可經由投予本發明組合物改善，使胰臟炎指標—澱粉酶數值降至正常值。 表五、投予本發明之組合物一週對犬隻之胰臟炎影響

綜上所述，本發明含有亞鐵胺基酸粒子的組合物(本發明之組合物)可治療或減緩胰臟相關疾病，具體而言，本發明之組合物可抑制胰臟癌細胞之生長、誘導胰臟癌細胞死亡、抑制胰臟癌細胞之遷徙及侵襲能力、抑制原位移植胰臟癌腫瘤生長、減緩原位移植胰臟癌腫瘤往外擴散的情形、減緩或降低原位移植胰臟癌晚期惡性腹水、能有較少的肝毒性副作用，且搭配胰臟癌一線藥物Gemcitabine有更佳之抑制胰臟腫瘤生長之效果；此外本發明之組合物可治療或減緩胰臟炎。

根據本發明可作之不同修正及變化對於熟悉該項技術者而言均顯然不會偏離本發明的範圍與精神。雖然本發明已敘述特定的較佳具體事實，必須瞭解的是本發明不應被不當地限制於該等特定具體事實上。事實上，在實施本發明之已述模式方面，對於熟習該項技術者而言顯而易知之不同修正亦被涵蓋於下列申請專利範圍之內。

圖1 對PANC-1細胞以劑量依賴方法使用本發明之組合物處理24小時之細胞遷移能力及侵襲能力以分析本發明之組合物對PANC-1細胞移動性之抑制(誤差槓為至少三個獨立實驗之平均值±標準差；ns為沒有顯著差異，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；Student ttest)。 圖2 對SUIT-2細胞以劑量依賴方法使用本發明之組合物處理24小時之細胞遷徙能力及侵襲能力以分析本發明之組合物對SUIT-2細胞移動性之抑制(誤差槓為至少三個獨立實驗之平均值±標準差；ns為沒有顯著差異，**p＜0.05，***p＜0.001；Student ttest) 。 圖3 對BxPC-3細胞以劑量依賴方法使用本發明之組合物處理24小時之細胞遷徙能力及侵襲能力以分析本發明之組合物對BxPC-3細胞移動性之抑制(誤差槓為至少三個獨立實驗之平均值±標準差；ns為沒有顯著差異， ***p＜0.001；Student ttest) 。 圖4 對AsPC-1細胞以劑量依賴方法使用本發明之組合物處理24小時之細胞遷徙能力及侵襲能力以分析本發明之組合物對AsPC-1細胞移動性之抑制(誤差槓為至少三個獨立實驗之平均值±標準差；ns為沒有顯著差異，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；Student ttest) 。 圖5-1 以本發明之組合物處理原位移植胰臟癌腫瘤之十天基線 (Baseline 10D) 生物冷光影像。 圖5-2 本發明之組合物對原位移植胰臟癌腫瘤之實驗進行第13天之生物冷光影像。 圖5-3 本發明之組合物對原位移植胰臟癌腫瘤之實驗進行第17天之生物冷光影像。 圖5-4 本發明之組合物對原位移植胰臟癌腫瘤之實驗進行第20天之生物冷光影像。 圖5-5 本發明之組合物對原位移植胰臟癌腫瘤之實驗進行第24天之生物冷光影像。 圖5-6 本發明之組合物對原位移植胰臟癌腫瘤之實驗進行第31天之生物冷光影像。 圖5-7 本發明之組合物對原位移植胰臟癌腫瘤之實驗進行第38天之生物冷光影像。 圖6 本發明之組合物對原位移植胰臟癌小鼠之腫瘤生長趨勢線圖。 圖7 本發明之組合物高低劑量實驗組對原位移植胰臟癌小鼠之生命生存期圖。 圖8 本發明之組合物高低劑量實驗組對原位移植胰臟癌小鼠之惡性腹水定量試驗。 圖9 處理本發明之組合物低劑量組實驗小鼠之解剖前腹側與背側外觀。 圖10-1 本發明之組合物與Gemcitabine (GEM)單獨或合併治療胰臟癌腫瘤之基線十天生物冷光影像。 圖10-2 本發明之組合物與Gemcitabine單獨或合併治療胰臟癌腫瘤之實驗進行第17天生物冷光影像。 圖10-3 本發明之組合物與Gemcitabine單獨或合併治療胰臟癌腫瘤之實驗進行第24天生物冷光影像。 圖10-4 本發明之組合物與Gemcitabine單獨或合併治療胰臟癌腫瘤之實驗進行第31天生物冷光影像。 圖10-5 本發明之組合物與Gemcitabine單獨或合併治療胰臟癌腫瘤之實驗進行第38天生物冷光影像。 圖11 本發明之組合物與Gemcitabine單獨或合併治療之胰臟癌腫瘤生長變化趨勢圖。 圖12 本發明之組合物與Gemcitabine合併治療胰臟癌腫瘤之給藥第9週小鼠黃疸現象解剖圖。 圖13-1 本發明之組合物與Gemcitabine單獨或合併治療胰臟癌腫瘤之實驗動物採血之每組血液總膽紅素值。 圖13-2 本發明之組合物與Gemcitabine單獨或合併治療胰臟癌腫瘤之實驗動物採血之每組血液GOT/AST值。 圖13-3 本發明之組合物與Gemcitabine單獨或合併治療胰臟癌腫瘤之實驗動物採血之每組血液GPT/ALT值。 圖14 本發明之組合物與Gemcitabine單獨或合併治療胰臟癌腫瘤之實驗動物生命生存期圖。 圖15-1 本發明之組合物與Gemcitabine單獨或合併治療胰臟癌腫瘤(II)之基線十天生物冷光影像。 圖15-2 本發明之組合物與Gemcitabine單獨或合併治療胰臟癌腫瘤(II)之實驗進行第17天生物冷光影像。 圖15-3 本發明之組合物與Gemcitabine單獨或合併治療胰臟癌腫瘤(II)之實驗進行第24天生物冷光影像。 圖15-4 本發明之組合物與Gemcitabine單獨或合併治療胰臟癌腫瘤(II)之實驗進行第31天生物冷光影像。 圖15-5 本發明之組合物與Gemcitabine單獨或合併治療胰臟癌腫瘤(II)之實驗進行第38天生物冷光影像。 圖15-6 本發明之組合物與Gemcitabine單獨或合併治療胰臟癌腫瘤(II)之實驗進行第45天生物冷光影像。 圖15-7 本發明之組合物與Gemcitabine單獨或合併治療胰臟癌腫瘤(II)之實驗進行第59天生物冷光影像。 圖16 本發明之組合物與Gemcitabine單獨或合併治療(II)之胰臟癌腫瘤生長變化趨勢圖 。 圖17-1 本發明之組合物與Gemcitabine單獨或合併治療胰臟癌腫瘤(II)之各組實驗動物血液總膽紅素、GOT/AST與GPT/ALT平均趨勢圖。 圖17-2 Gemcitabine單獨治療胰臟癌腫瘤(II)之Gemcitabine組實驗動物血液總膽紅素、GOT/AST與GPT/ALT趨勢分析圖 。 圖17-3 本發明之組合物單獨治療胰臟癌腫瘤(II)之本發明之組合物組實驗動物血液總膽紅素、GOT/AST與GPT/ALT趨勢分析圖。 圖17-4 本發明之組合物與Gemcitabine合併治療胰臟癌腫瘤(II)之合併組實驗動物血液總膽紅素、GOT/AST與GPT/ALT趨勢分析圖。 圖18 本發明之組合物與Gemcitabine單獨或合併治療胰臟癌腫瘤(II)之合併組實驗小鼠生命生存期圖。

Claims (11)

1. 一種組合物，其中所述組合物中含有由亞鐵胺基酸螯合物燒結而成之亞鐵胺基酸螯合物粒子，且所述亞鐵胺基酸螯合物粒子之平均粒徑為500奈米至2600奈米、平均分子量為1,500道爾頓(Dalton)至600,000道爾頓，其中所述亞鐵胺基酸螯合物為亞鐵甘胺酸螯合物。
2. 如請求項1所述之組合物，其中所述之亞鐵胺基酸螯合物之亞鐵與胺基酸的螯合比例為1：1至1：4之間。
3. 一種如請求項1或2所述之組合物用於製備治療或改善胰臟相關疾病的醫藥品的用途，其中所述醫藥品含有有效劑量之所述組合物以及藥學上可接受的載劑。
4. 如請求項3所述之用途，其中所述胰臟相關疾病為胰臟癌。
5. 如請求項3所述之用途，其中所述胰臟相關疾病為胰臟癌轉移。
6. 如請求項3所述之用途，其中所述胰臟相關疾病為胰臟癌產生之腹水。
7. 如請求項3所述之用途，其中所述胰臟相關疾病為胰臟炎。
8. 如請求項3所述之用途，其中所述組合物之給藥對象為人類。
9. 如請求項3所述之用途，其中所述組合物之有效劑量係介於0.1mg/kg/day至120mg/kg/day。
10. 如請求項3所述之用途，其中所述組合物之給藥方式是搭配Gemcitabine同時給予。
11. 如請求項10所述之用途，所述Gemcitabine的給藥方式是進行一次以上之Gemcitabine給藥週期，所述Gemcitabine給藥週期為每週給藥Gemcitabine兩次，連續三週給藥後於第四週停止給藥Gemcitabine。

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