TWI685661B - 鑑定癌級別之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種建立一已給定癌級別之指標的方法。此方法包含摹繪分析一參考癌細胞樣品表面之寡醣分佈型態；以吸附劑吸附該已摹繪分析之參考癌細胞樣品；測量附著於該已摹繪分析之參考癌細胞樣品上之該吸附劑之量；及取得該參考癌細胞樣品之寡醣分佈型態與附著於該已摹繪分析之參考癌細胞樣品上該吸附劑量間的參考關聯，以形成該已給定癌級別之指標。本發明亦關於一種一已給定癌級別之指標及一種對一待測細胞樣品鑑定癌級別之方法。

Description

鑑定癌級別之方法
本發明係關於癌症之使用。特定言之，本發明係關於一種鑑定癌級別之方法。
目前，疾病的診斷係由病理學家所負責。蘇木精-伊紅（H＆E）染色和免疫組織化學（IHC）是常規之應用方法。    舉例言之，習用診斷結腸癌之方法係採用大腸鏡檢查或乙狀結腸鏡檢查以檢測病變及腫瘤位置。活體檢查係將取自息肉或實體腫瘤之組織切片後，進行H＆E染色或IHC染色來判定其級別。不幸的是，精確的組織病理學檢查、正確之癌級別鑑定與早期癌檢測相當困難，其結果可能被檢測區域中腺體形成的計數百分比，以及分化良好的良性組織、癌前期與早期癌中間之形態分化程度而影響診斷之結果。    組織切片的癌級別鑑定不僅基於組織切片的形態學檢查和組織切片中之腺體形成百分比，同時癌級別鑑定之結果必須由至少三位病理學家一致確認。由於人工操作引起的錯誤、儀器的檢測限度以及個體病理學家診斷之不適當病理檢查，其偽陰性或偽陽性之可能性仍然很高。然而，癌級別鑑定之結果將影響癌症患者的後續治療策略。
用於癌級別鑑定之快速診斷與高可靠性方法是至關重要的，尤其是對於癌前病變組織及早期癌症診斷。    本揭露係關於一種建立一已給定癌級別之指標的方法，其包括：    提供一參考癌細胞樣品，其中該參考癌細胞樣品具有該已給定癌級別，及包含寡醣鏈錨定於該參考癌細胞樣品之表面；    提供一第一吸附劑及一第二吸附劑，其中該第一吸附劑及第二吸附劑之碳數為自20至46，且該第一吸附劑之碳數少於該第二吸附劑之碳數；    摹繪分析錨定於該參考癌細胞樣品表面的寡醣鏈之寡醣分佈型態；    分別以該第一吸附劑及第二吸附劑吸附該已摹繪分析之參考癌細胞樣品；    分別測量附著於該已摹繪分析之參考癌細胞樣品上該第一吸附劑之量，及測量附著於該已摹繪分析之參考癌細胞樣品上該第二吸附劑之量；及    取得該參考癌細胞樣品之寡醣分佈型態與附著於該已摹繪分析之參考癌細胞樣品上該第一吸附劑量間之一第一參考關聯；取得該參考癌細胞樣品之寡醣分佈型態與附著於該已摹繪分析之參考癌細胞樣品上該第二吸附劑量間之一第二參考關聯，其中該第一參考關聯與該第二參考關聯形成該已給定癌級別之指標。    本揭露係關於一種一已給定癌級別之指標，其係由如前述之方法所建立。    本揭露係關於一種對一待測細胞樣品鑑定癌級別之方法，其包含：     提供該待測細胞樣品，其中該待測細胞樣品包含寡醣鏈錨定於該待測細胞樣品之表面；    提供一第一吸附劑及一第二吸附劑，其中該第一吸附劑及第二吸附劑之碳數為自20至46，且該第一吸附劑之碳數少於該第二吸附劑之碳數；    摹繪分析錨定於該待測細胞樣品表面的寡醣鏈之寡醣分佈型態；    分別以該第一吸附劑及第二吸附劑吸附該已摹繪分析之待測細胞樣品；    分別測量附著於該已摹繪分析之待測細胞樣品上該第一吸附劑之量，及測量附著於該已摹繪分析之待測細胞樣品上該第二吸附劑之量；    取得該待測細胞樣品之寡醣分佈型態與附著於該已摹繪分析之待測細胞樣品上該第一吸附劑量間之一第一待測關聯；取得該待測細胞樣品之寡醣分佈型態與附著於該已摹繪分析之待測細胞樣品上該第二吸附劑量間之一第二待測關聯；    比較該第一待測關聯及該第二待測關聯與如前述之該已給定癌級別之指標，以鑑定該待測細胞樣品之癌級別。    上文已相當廣泛地概述本揭露之技術特徵及優點，俾使下文之本揭露詳細描述得以獲得較佳瞭解。構成本揭露之申請專利範圍標的之其它技術特徵及優點將描述於下文。本揭露所屬技術領域中具有通常知識者應瞭解，可相當容易地利用下文揭示之概念與特定實施例可作為修改或設計其它結構或製程而實現與本揭露相同之目的。本揭露所屬技術領域中具有通常知識者亦應瞭解，這類等效建構無法脫離後附之申請專利範圍所界定之本揭露的精神和範圍。
本揭露描述於圖中之實施例或實例現使用特定語言描述，應理解者，其並非旨在限制本揭露之範圍。針對所描述實施例之任何改變或修改，以及本文中描述原理之任何進一步應用，皆應被視為本發明所屬技術領域中具通常知識者可一般思及。    應理解者，儘管在本文中可使用第一、第二、第三等術語描述各種元件，惟該等元件並不受這些術語之限制。相反地，這些術語僅用於區隔一個元件與另一個元件。因此，在不脫離本發明概念教示之情況下，下文中所討論的第一元件可稱為第二元件。    本文中所使用之術語僅為描述特定例示實施例之用，並不旨在限制本發明之概念。除非上下文另有明確說明者，本文中所使用單數形式「一」、「一個」和「該」也意指包括複數形式。還應理解者，當在本說明書中使用時，術語「包括」和「包含」係指所述特徵、整體、步驟、操作、元件或組件之存在，但不排除存在或添加一個或多個其他特徵、整體、步驟、操作、元件或組件。    本揭露係關於一種建立一已給定癌級別之指標的方法，其包括：    提供一參考癌細胞樣品，其中該參考癌細胞樣品具有該已給定癌級別，及包含寡醣鏈錨定於該參考癌細胞樣品之表面；    提供一第一吸附劑及一第二吸附劑，其中該第一吸附劑及第二吸附劑之碳數為自20至46，且該第一吸附劑之碳數少於該第二吸附劑之碳數；    摹繪分析錨定於該參考癌細胞樣品表面的寡醣鏈之寡醣分佈型態；    分別以該第一吸附劑及第二吸附劑吸附該已摹繪分析之參考癌細胞樣品；    分別測量附著於該已摹繪分析之參考癌細胞樣品上該第一吸附劑之量，及測量附著於該已摹繪分析之參考癌細胞樣品上該第二吸附劑之量；及    取得該參考癌細胞樣品之寡醣分佈型態與附著於該已摹繪分析之參考癌細胞樣品上該第一吸附劑量間之一第一參考關聯；取得該參考癌細胞樣品之寡醣分佈型態與附著於該已摹繪分析之參考癌細胞樣品上該第二吸附劑量間之一第二參考關聯，其中該第一參考關聯與該第二參考關聯形成該已給定癌級別之指標。    本文中所使用之「癌級別」一詞係描述癌細胞或組織與正常細胞或正常組織相比之不正常的水平或程度。本文中所使用之「已給定癌級別」係指一癌級別，其係經常規之病理學上醫學檢驗所檢測及界定。    本文中所使用之「指標」一詞係指代表一特定癌級別之標記。根據本揭露之指標係助於提供一客觀之臨床標誌，以代表該癌級別。    本文所使用之「參考癌細胞樣品」一詞係指一具有已依常規醫學檢驗界定之給定癌級別之癌細胞樣品。該參考癌細胞樣品之癌級別較佳係由本發明所屬技術領域具通常知識者所一致檢測或界定。舉例言之，該參考癌細胞樣品之癌級別，係在顯微鏡下觀察細胞形態不正常程度及生長速度偏差度所給定，H&E染色或IHC染色亦可應用於給定癌級別。    該參考癌細胞樣品包含寡醣鏈錨定於該參考癌細胞樣品表面。該寡醣鏈通常經由醣化反應而連結至一蛋白質而作為醣蛋白。蛋白質之醣化反應係為最常見之轉譯後修飾，其與關鍵生理過程相關，包括蛋白質三級結構折疊和展開、細胞與細胞之間的辨識與溝通及細胞與基底相互作用及細胞分化。蛋白質之異常醣化反應與寡醣鏈的不完全合成和錯誤的合成密切相關，其在癌症發展期間產生更多之分支、縮短或加長的醣蛋白寡醣鏈。例如，在結腸癌細胞中，已證明錨定在細胞膜上與蛋白質連接之特定寡醣鏈長度分布密度隨著癌級別而增加。雖不願為理論所限制，但咸信蛋白質寡醣鏈之延伸及分布密度可代表癌級別。    較佳地，根據本揭露之癌症可為良性、癌前病變或惡性腫瘤。本文中所提及之癌症類型包括，例如，腦癌、子宮頸癌、食道癌、甲狀腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、子宮內膜癌、肺癌、胃癌、膽囊/膽管癌、肝癌、胰腺癌、結腸癌、卵巢癌、絨毛膜癌、子宮體癌、子宮頸癌、腎盂/輸尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、腎癌、神經內分泌癌、陰莖癌、睾丸癌、胎兒腺癌、腎母細胞瘤、皮膚癌、惡性黑色素瘤、神經母細胞瘤、骨肉瘤、尤文氏瘤、軟組織肉瘤、神經內分泌癌或口腔癌。更佳地，該癌係為結腸癌、乳腺癌、胃癌、子宮頸癌、前列腺癌、腎癌、神經內分泌癌或口腔癌。    較佳地，該參考癌細胞樣品係為根據本揭露癌之一細胞株。更佳地，該參考癌細胞樣品係為衍生自結腸癌、乳腺癌、胃癌、子宮頸癌、前列腺癌、腎癌或口腔癌之一細胞株。    本文中所使用之「吸附劑」一詞係一指試劑，其可吸附於細胞表面上，特別是癌細胞表面上。較佳地，根據本揭露之吸附劑吸附錨定於癌細胞表面之寡醣鏈。雖不願為理論所限制，但咸信吸附劑和寡醣鏈間之物理吸附與基於凡得瓦力相互作用及偶極誘導偶極相互作用之物理性吸附類型強烈相關。當吸附劑與寡醣鏈間之物理性吸附越強大，則可觀察到越多量吸附劑附著於癌細胞表面。基於凡得瓦力相互作用及偶極誘導偶極相互作用，寡醣鏈之鏈長係與吸附劑相似或相近。    根據本揭露之吸附劑碳數係介於20與46間；較佳係介於20與34間；更佳係介於22與30間。根據本揭露，該方法包含提供一第一吸附劑及一第二吸附劑，其中該第一吸附劑及第二吸附劑之碳數為自20至46，且該第一吸附劑之碳數少於該第二吸附劑之碳數。於本接露之一具體實施例中，該第一吸附劑或該第二吸附劑係為正烷烴或於末端具有正烷基之酯類化合物。較佳地，作為該第一吸附劑或該第二吸附劑之正烷烴碳數為22、25、28、30、32或34，例如正二十二烷、正二十五烷或正三十烷。另一方面，作為該第一吸附劑或該第二吸附劑之正烷酯碳數為自20至46，更佳為22、25、28、30、32、34、36、38、40、42、44或46，例如Beeswax（蜂蠟, C 30H 61CO 2C 15H 31或C 46H 92O 2）。於本揭露之一較佳具體實施例中，一系列具有不同正烷基之吸附劑可用於吸附不同錨定於癌細胞表面之寡醣鏈。舉例言之，一系列具有碳數22、25、28及30之吸附劑可用於根據本揭露之方法中。    較佳地，根據本揭露之吸附劑係調劑為一溶液。較佳地，根據本揭露之吸附劑濃度為介於約1 wt%至約10 wt%間；較佳為介於約2.5 wt%至約7.5 wt%間。    較佳地，根據本揭露之癌細胞係固定於一固體基底上，例如玻片、金屬鍍膜之玻片或石英玻片。將癌細胞固定於固體基底之方法係為本發明所屬技術領域中具通常知識者所已知。    根據本揭露之方法包含摹繪分析錨定於該參考癌細胞樣品表面的寡醣鏈之寡醣分佈型態。本文中所使用之「寡醣分佈型態」係指一細胞樣品之寡醣鏈樣式，較佳地，係連接至錨定於細胞樣品表面上蛋白質寡醣鏈之寡醣鏈樣式。該寡醣分佈型態包含但不限於聚醣之鏈長、單醣種類、單醣數目及寡醣分支之程度、疏水性、親水性或極性；較佳係為鏈長。該寡醣分佈型態代表錨定於細胞表面之寡醣鏈分佈而非任何特定之寡醣鏈。    根據本揭露之方法包含分別以該第一吸附劑及第二吸附劑吸附該已摹繪分析之參考癌細胞樣品；及分別測量附著於該已摹繪分析之參考癌細胞樣品上該第一吸附劑之量，及測量附著於該已摹繪分析之參考癌細胞樣品上該第二吸附劑之量。因該第一吸附劑之正烷基碳數係小於該第二吸附劑，此兩吸附劑可吸附不同長度之寡醣鏈。吸附劑與錨定於細胞樣品寡醣鏈間之物理性吸附能力，包含正常、癌前病變及惡性腫瘤樣品，係具有明顯之不同。如一吸附劑之烷基與共價連接至錨定於細胞樣品表面上蛋白質之寡醣鏈的鏈長彼此相近，則彼此間之物理性吸附能力較強，且有較多量之吸附劑附著於細胞樣品上。    測量附著於細胞樣品之吸附劑量包含但不限於描述於實例中之方法。於本揭露之一較佳具體實施例中，可應用蠟物理性吸附動力學技術。簡單言之，將附著於細胞表面之吸附劑置於去吸附劑中，並使用傅立轉換葉紅外光譜成像技術測量附著在細胞樣品上吸附劑之量。舉例言之，該去吸附劑為二甲苯或己烷。    於本揭露之某一具體實施例中，附著於該已摹繪分析之參考癌細胞樣品之該第二吸附劑量係大於該第一吸附劑。於已摹繪分析之參考癌細胞樣品上可發現較大量之第二吸附劑，其導因於錨定在癌細胞表面之寡醣鏈的群體單位面積比正常細胞樣品更多。相反地，與惡性細胞樣品相比，在正常細胞表面上則發現相對較短之寡醣鏈的分布。    根據本揭露之方法包含取得該參考癌細胞樣品之寡醣分佈型態與附著於該已摹繪分析之參考癌細胞樣品上該第一吸附劑量間之一第一參考關聯；取得該參考癌細胞樣品之寡醣分佈型態與附著於該已摹繪分析之參考癌細胞樣品上該第二吸附劑量間之一第二參考關聯，其中該第一參考關聯與該第二參考關聯形成該已給定癌級別之指標。    於本揭露之一具體實施例中，該摹繪分析、吸附及測量步驟包含：    進行不同時間長度的水解反應，以逐步水解錨定在參考癌細胞樣品上之寡醣鏈；    分別以該第一吸附劑及第二吸附劑吸附該已由不同時間長度水解之參考癌細胞樣品；    分別測量附著於該已由不同時間長度水解之參考癌細胞樣品上之該第一吸附劑及該第二吸附劑之量。    該細胞樣品之水解反應係於錨定在細胞樣品表面上之寡醣鏈上實施水解。藉由測量一系列不同時間長度水解反應後，附著於細胞樣品上該第一吸附劑與附著於細胞樣品上該第二吸附劑，而獲得該第一參考關聯和第二參考關聯。在本發明的一具體實施例中，該水解反應係採用酸催化水解。錨定在細胞樣品表面上之寡醣鏈之鏈長因水解且隨著水解時間增加而縮短。在本發明的一具體實施例中，該水解反應的時間長度為0秒至約15秒；較佳地，在0秒和約11秒間。較佳地，水解時間之步距設定在約0.5秒至約5秒間；更佳地，在約1秒至約2秒間。另一方面，使用於酸催化水解之試劑是鹽酸(HCl (aq))。較佳地，其係使用pH值在約-1和約6.5間，較佳在約2和約5間之試劑進行水解反應。    於本揭露之一較佳具體實施例中，該第一參考關聯或第二參考關聯係經由將附著於每個水解反應之參考癌細胞樣品上該第一吸附劑及該第二吸附劑於中紅外光譜範圍為積分紅外吸收帶3000-2800 cm -1的數值來比對蠟的殘留量。    於本揭露之一具體實施例中，該摹繪分析、吸附及測量步驟包含：    將參考癌細胞樣品施加一系列之電壓；    分別以該第一吸附劑及第二吸附劑吸附該施加電壓之參考癌細胞樣品，及分別以該第一吸附劑及第二吸附劑吸附該未施加電壓之參考癌細胞樣品；    分別測量附著於該施加電壓之參考癌細胞樣品上之該第一吸附劑及該第二吸附劑之量，及分別測量附著於該未施加電壓之參考癌細胞樣品上之該第一吸附劑及該第二吸附劑之量。    雖不願為理論所限制，但咸信當將施加一已給定之電壓於固定在導電基底上之一已給定細胞樣品時，將誘導額外之極化，尤其是施加於已給定細胞樣品細胞表面之寡醣鏈上。該具有特定癌級別之已給定細胞樣品的寡醣分佈型態在特定電壓下將顯示最大之吸附劑殘留量，此稱為特徵誘導最大膜極化，以及當施加逐步增加的電壓時，將顯示誘導極化分佈。此外，此誘導極化與附著於細胞樣品上的吸附劑量具比例關係，且與3000-2800 cm -1的中紅外光譜範圍內之紅外吸收相關。在達到細胞樣品的特徵誘導最大極化之前，附著在細胞樣品上的吸附劑和寡醣鏈間的物理吸附能力變得更強。之後，當施加的電壓大於細胞樣品的特徵最大極化電壓時，物理吸附能力則減小。在本揭露之一具體實施例中，係以逐步增加之方式施加一系列電壓。每個物理性吸附能力，係藉由測量附著於施加逐步增加一系列電壓之細胞樣品上每一吸附劑於3000-2800 cm -1範圍內的紅外吸收度來確定。此外，崩潰電壓則由附著於細胞樣品上之吸附劑量而確定，亦即為當施加的已給定電壓與沒有施加電壓的細胞樣品之結果相同或接近時之電壓。可利用給定細胞樣品的物理性吸附能力來詳細說明醣蛋白之醣鏈變化進行癌級別的鑑定。在本揭露之一具體實施例中，係經由比較附著於施加電壓之細胞樣品上的吸附劑量與不施加電壓之細胞樣品上的吸附劑量，來確定崩潰電壓。    較佳地，該電壓在約0 V和約500 V之間；更佳地，在約0 V和約300 V之間；尤佳地，在約0 V和約200 V之間。將一系列電壓施加到細胞樣品上時，電壓增加5 V、10 V或20 V。    施加電壓於細胞樣品之方法包含但不限於描述於實例中之方法。電場強度係藉由分別施加一正電壓於細胞樣品導電基底玻片上和接地至固定於導電基底玻片而產生。例如，兩個導電基底玻片之間的距離設定為5 mm，更佳為設定在約1 mm和約20 mm間，甚至沒有接地電極。    該參考癌細胞樣品之寡醣分佈型態與附著於該已由電壓摹繪分析之參考癌細胞樣品上該第一及第二吸附劑量間之該第一及第二參考關聯則可取得。    於本揭露之一較佳具體實施例中，包含一控制分析。該方法進一步包含：    提供一正常細胞樣品，其中該正常細胞樣品包含固有寡醣鏈錨定於該正常細胞樣品之表面；    摹繪分析錨定於該正常細胞樣品表面的寡醣鏈之寡醣分佈型態；    分別以該第一吸附劑及第二吸附劑吸附該已摹繪分析之正常細胞樣品；    分別測量附著於該已摹繪分析之正常細胞樣品上該第一吸附劑之量，及測量附著於該已摹繪分析之正常細胞樣品上該第二吸附劑之量；及    取得該正常細胞樣品之寡醣分佈型態與附著於該已摹繪分析之正常細胞樣品上該第一吸附劑量間之一第一控制關聯；取得該正常細胞樣品之寡醣分佈型態與附著於該已摹繪分析之正常細胞樣品上該第二吸附劑量間之一第二控制關聯。    較佳地，該正常細胞樣品與參考癌細胞樣品之寡醣分佈型態不同。於控制分析中實施摹繪分析、吸附、測量及取得之方法係與前述具給定癌級別之參考癌細胞樣品中之描述類似。    於本揭露之一實例中，人類正常結腸纖維母細胞（CCD-18Co）、人類結腸癌細胞株（SW-1116、SW-480、SW-403、LoVo、HT-29）、人類結腸癌組織切片和人類口腔鱗狀上皮癌細胞株（SCC-15、SCC-25、OC-2、OC-3和OEC-M1），係藉由利用酸催化水解（acid-catalyzed hydrolysis, ACH）結合蠟物理性吸附動力學（ACH-WPK）和FTIR成像來辨識。在ACH-WPK過程中，描繪附著於每個細胞樣品表面上每種吸附劑量之時間曲線。附著於細胞樣品上Paraplast吸附劑（或正二十五烷）吸附劑之最大量發生在較高癌級別細胞樣品中，其與較低癌級別相比具有更長之水解時間。另一方面，附著在良性腫瘤或正常纖維母細胞之組織切片樣品上的吸附劑量則隨著水解時間的增加而呈下降趨勢。此外，較高度的惡性結腸細胞或腫瘤在水解反應期亦可能表現出兩種或更多Paraplast吸附劑（或正二十五烷）之附著最大值，其表明了在惡性細胞或腫瘤內形成了兩種或更多的癌級別。因此，可以利用附著在細胞樣品上的最大吸附劑量之水解時間建立已給定癌級別之指標。    於本揭露之一實例中，基於施加電壓細胞樣品間的物理性吸附能力和不同癌級別口腔癌樣品上附著之吸附劑殘留量，建立崩潰電壓或最大誘導膜極化與口腔癌癌級別之間的關聯。當逐步提高施加電壓時，附著在固定於導電基底上的口腔癌細胞樣品表面上Paraplast（或正二十五烷）或Beeswax（蜂蠟, C 30H 61CO 2C 15H 31或C 46H 92O 2）之相對量呈現準高斯分佈，並且對於SCC-25、SCC-15、OC-2、OC-3和OEC-M1之口腔癌細胞株，吸附劑附著最大量分別發現於電壓30 V、30 V、70 V、50 V和70 V時。此外，SCC-25、SCC-15、OC-2、OC-3和OEC-M1細胞之崩潰電壓分別為85 V、90 V、165 V、167 V和183 V。此結果與口腔鱗狀上皮癌細胞之病理癌級別一致。    本揭露係關於一種一已給定癌級別之指標，其係由如前述之方法所建立。本文中所使用之「指標」一詞係指代表一特定狀態之標記。根據本揭露之指標係助於提供一客觀之臨床標誌，以代表一給定樣品之癌級別。較佳地，該指標係用以鑑定樣品之癌級別；更佳地，該指標係基於附著在給定樣品上第一吸附劑與第二吸附劑量之紅外線吸收度比而建立。    較佳地，亦提供一指標群，其包含複數個前述不同癌級別之指標。較佳地，針對一給定癌之每個癌級別建立指標。    本揭露係關於一種對一待測細胞樣品鑑定癌級別之方法，其包含：     提供該待測細胞樣品，其中該待測細胞樣品包含寡醣鏈錨定於該待測細胞樣品之表面；    提供一第一吸附劑及一第二吸附劑，其中該第一吸附劑及第二吸附劑之碳數為自20至46，且該第一吸附劑之碳數少於該第二吸附劑之碳數；    摹繪分析錨定於該待測細胞樣品之表面的寡醣鏈之寡醣分佈型態；    分別以該第一吸附劑及第二吸附劑吸附該已摹繪分析之待測細胞樣品；    分別測量附著於該已摹繪分析之待測細胞樣品上之該第一吸附劑之量，及測量附著於該已摹繪分析之待測細胞樣品上之該第二吸附劑之量；    取得該待測細胞樣品之寡醣分佈型態與附著於該已摹繪分析之待測細胞樣品上之該第一吸附劑之量間之一第一待測關聯；取得該待測細胞樣品之寡醣分佈型態與附著於該已摹繪分析之待測細胞樣品上之該第二吸附劑之量間之一第二待測關聯；    比較該第一待測關聯及該第二待測關聯與如前述之該已給定癌級別之指標，以鑑定該待測細胞樣品之癌級別。本文中所使用之「待測細胞樣品」係指具有未知癌級別之樣品。該待測細胞包含但不限於源自一癌病患之活體或組織。該待測細胞樣品包含癌細胞。實施摹繪分析、吸附、測量及取得之方法係與前述具給定癌級別之參考癌細胞樣品中之描述類似。    該待測細胞樣品之癌級別係由比較該第一待測關聯及該第二待測關聯與如前述已給定癌級別之指標而鑑定。如該第一待測關聯及該第二待測關聯與該第一參考關聯及該第二參考關聯分別相似或相同，則該待測細胞樣品之癌係別鑑定為該已給定癌級別。    較佳地，該摹繪分析、吸附及測量步驟包含：    進行不同時間長度的水解反應，以逐步水解錨定在待測細胞樣品上之寡醣鏈；    分別以該第一吸附劑及第二吸附劑吸附該已由不同時間長度水解之待測細胞樣品；    分別測量附著於該已由不同時間長度水解之待測細胞樣品上之該第一吸附劑及該第二吸附劑之量。    較佳地，藉由測量附著於該已由不同時間長度水解之待測細胞樣品上之該第一吸附劑及該第二吸附劑之量，可獲得該第一待測關聯及該第二待測關聯。    較佳地，該摹繪分析、吸附及測量步驟包含：    將待測細胞樣品施加一系列之電壓；    分別以該第一吸附劑及第二吸附劑吸附該施加電壓之待測細胞樣品，及分別以該第一吸附劑及第二吸附劑吸附該未施加電壓之待測細胞樣品；    分別測量附著於該施加電壓之待測細胞樣品上之該第一吸附劑及該第二吸附劑之量，及分別測量附著於該未施加電壓之待測細胞樣品上之該第一吸附劑及該第二吸附劑之量。    較佳地，藉由測量附著於該施加電壓之待測細胞樣品上該第一吸附劑及該第二吸附劑之量，可獲得該第一待測關聯及該第二待測關聯。    提供以下實例以協助本發明所屬技術領域中具通常知識者實踐本發明。 實例 1 癌細胞 酸催化水解反應將人類正常結腸纖維母細胞（CCD-18Co）和結腸癌細胞株（SW-1116、SW-480、SW-403、LoVo、HT-29）固定在紅外反射玻片(Low-e slide)上。將細胞樣品浸入0.001N HCl (aq)（pH = 3）中給定的時間長度(1 秒)。然後以D.I.水洗除去HCl （ aq ）。將樣品乾燥並準備用於FTIR成像的測量，作為樣品背景紅外影像及數值。 基於蠟物理性吸附動力學之 FTIR 成像將組織樣品浸入在53℃至62℃範圍內的二甲苯（二甲苯，C 8H 10）溶劑中24小時，以除去嵌入組織切片內的石蠟，並獲得固定在紅外反射玻片上樣品之樣品背景紅外影像。    將樣品浸入含5.5 wt% Paraplast（或正二十五烷）或Beeswax（蜂蠟, C 30H 61CO 2C 15H 31或C 46H 92O 2）（作為吸附劑）之二甲苯溶液中5分鐘上蠟，然後在45℃下加熱10分鐘蒸發附著在樣品上之二甲苯殘留物。將上蠟之樣品使用二甲苯5秒以部分脫蠟，然後保持在室溫下完全蒸發二甲苯，通過FTIR成像系統獲得樣品的空間解析紅外光譜。扣除背景後，殘留蠟紅外影像所得信號表示附著在樣品表面上之吸附劑殘留蠟相對量。    基於酸催化水解（ACH）和基於蠟物理性吸附動力學之FTIR成像示於圖1中。    結果顯示在圖2中。於SW-1116、SW-480、SW-403、LoVo和HT-29的ACH-WPK的FTIR成像結果顯示增加之Paraplast（或正二十五烷）殘留量，及Paraplast（或正二十五烷）的最大殘留量分別在水解的第3、第3、第8、第3和第4秒可觀察得。    如圖3所示，結腸組織切片中的幾個區域被檢查為良性腫瘤（B1）、低度分化惡性腫瘤I（B10）、高度分化惡性腫瘤II（B14）。此組織切片係使用兩種吸附劑Paraplast（或正二十五烷）和Beeswax（蜂蠟, C 30H 61CO 2C 15H 31或C 46H 92O 2）進行WPK-FTIR成像過程。    對結腸組織切片進行ACH-WPK和FTIR成像。其結果如圖4至圖9所示。為了獲得癌級別與給定組織切片的寡醣鏈之寡醣鏈長度改變關聯，使用ACH處理一系列時間長度水解反應逐步使寡醣鏈長縮短，並與附著在組織切片區域之水解樣品上之Paraplast（或正二十五烷）或Beeswax（蜂蠟, C 30H 61CO 2C 15H 31或C 46H 92O 2）殘留物相對量產生關聯。    在水解一系列時間長度後，B1-Bn吸附劑殘留物之時間分佈表現出附著在組織切片表面上的Paraplast（或正二十五烷）和Beeswax（蜂蠟，C 30H 61CO 2C 15H 31或C 46H 92O 2）殘留物之單指數衰減。如圖4所示，ACH-WPK-FTIR光譜圖像與蠟殘留量的時間分佈顯示當處理較長時間之去醣化水解時，具較少Paraplast（或正二十五烷）殘留，此表示當醣鏈的鏈長經酸催化水解醣苷鍵使醣鏈的鏈長縮短，Paraplast（或正二十五烷）和蜂蠟（C 30H 61CO 2C 15H 31或C 46H 92O 2）對組織切片物理性吸附能力的減弱。    如圖5所示，在B10-Bn區域，ACP-WPK-FTIR圖像和Paraplast（或正二十五烷）殘留物的時間分佈在水解處理前也顯示單一指數衰減，但蜂蠟（C 30H 61CO 2C 15H 31或C 46H 92O 2）殘留物並無明顯變化。如圖6所示，B10-Pre顯示在水解處理期間，Beeswax（蜂蠟, C 30H 61CO 2C 15H 31或C 46H 92O 2）殘留物量減少，但觀察到Paraplast（或正二十五烷）殘留量增加。如圖7所示，ACH-WPK-FTIR光譜圖像和附著在B10-Ma區域的蠟殘留物時間分佈顯示在水解過程中之第3秒具有最大量的Paraplast（或正二十五烷）殘留，此表示醣鏈的鏈長經水解後縮短。因此，水解3秒後寡醣鏈其餘部分之鏈長被認為與Paraplast（或正二十五烷）之鏈長類似，並且觀察到隨著時間的延長，寡醣鏈的鏈長因水解而縮短，且Beeswax（蜂蠟, C 30H 61CO 2C 15H 31或C 46H 92O 2）之殘留物減少。此外，如圖8和9所示，在水解處理良性惡性區域時間分佈之2秒鐘後觀察到Paraplast（或正二十五烷）殘留物的最大量，表明在B14-Bn和MaB14-區域已發展了高度癌級別。 實例 2如實例1中所述，對口腔癌細胞株SCC-15（低度）和OEC-M1（高度）進行ACH-WPK結合FTIR成像，其使用0.01N HCl （ aq ）（pH = 2）水解細胞樣品的寡醣鏈和使用n-C 22H 46（正十二烷）、n-C 25H 52（正二十五烷）、n-C 28H 58（正二十八烷）和Beeswax（蜂蠟,C 30H 61CO 2C 15H 31或C 46H 92O 2）用作寡醣之吸附劑。    結果顯示在圖10中。基於附著於細胞表面的n-C 22H 46、n-C 25H 52、n-C 28H 58和Beeswax（蜂蠟,C 30H 61CO 2C 15H 31或C 46H 92O 2）殘留物的相對量，將ACH-WPK結合FTIR成像用於檢測人類口腔癌細胞的癌級別。蠟殘留的時間分佈表明，較高癌級別之癌細胞樣品顯示正烷吸附劑的最大殘留量，在較長時間長度水解後，在較短的正烷基鏈長度有較多的蠟殘留相對量。 實例 3將OEC-M1、SCC-15、SCC-25、OC-2和OC-3的口腔鱗狀上皮癌細胞株固定在紅外反射玻片上。 基於蠟物理性吸附動力學之 FTIR 成像通過浸入二甲苯溶劑中20分鐘來清潔樣品，以確保除去細胞表面之有機物，並獲得樣品背景紅外影像（如圖11所示）。    將樣品浸入含5.5 wt% Paraplast（或正二十五烷）或Beeswax（蜂蠟,C 30H 61CO 2C 15H 31或C 46H 92O 2）（作為吸附劑）之二甲苯溶液中2分鐘上蠟，然後在室溫10分鐘完全蒸發附著在樣品上之二甲苯溶劑。將上蠟之樣品使用二甲苯浸泡5秒（OEC-M1、SCC-15及SCC-25）及7秒（OC-2及OC-3）進行脫附，然後保持在室溫下使樣品上的二甲苯完全蒸發。於3000-2800 cm -1光譜範圍內，經由積分扣除細胞樣片上蠟前背景的吸收曲線下之面積，將附著在樣品表面上之吸附劑蠟殘留相對量之相關聯。 逐步增加電壓將電壓施加在固定於導電載玻片上的樣品外部，並且對已給定之已施加電壓樣品進行如上所述的WPK結合FTIR成像程序。    接下來，自樣品釋放外部所施加電壓，並且再次對樣品進行WPK結合FTIR成像程序（R*用於表示釋放電壓的過程）。    外部施加於口腔癌細胞株的細胞樣品之電壓從10 V至170 V（OEC-M1）、90 V（SCC-15和SCC-25）或150 V（OC-2和OC-3），電壓步距為20 V。    結果如圖11所示。電壓輔助之WPK結果表明，蜂蠟吸附劑與細胞樣品間之物理性吸附能力因外部施加電壓而增強。在外部施加電壓範圍內，已給定癌級別細胞樣品之最大誘導膜極化率定義為附著到細胞樣品最大蠟殘留量時之特定電壓。當施加一特定電壓時，癌細胞株之細胞樣品表現出Paraplast（或正二十五烷）和Beeswax（蜂蠟,C 30H 61CO 2C 15H 31或C 46H 92O 2）物理性吸附能力顯著降低，則被定義為給定細胞樣品之崩潰電壓。 崩潰電壓對樣品進行如下步驟：如上所述，通過逐步增加0 V至300 V的電壓來施加電壓，其電壓步距為1至10 V，以掃描細胞樣品之最大誘導膜極化的電壓和崩潰電壓。    結果顯示在圖12中。細胞樣品和Paraplast（或正二十五烷）和Beeswax（蜂蠟,C 30H 61CO 2C 15H 31或C 46H 92O 2）間之物理性吸附能力在崩潰電壓逐漸降低，對OEC-M1、SCC-15、SCC-25、OC-2和OC-3癌細胞之崩潰電壓分別為183 V、85 V、90 V、165 V和167 V。    雖然已詳述本揭露及其優點，然而應理解可進行各種變化、取代與替代而不脫離申請專利範圍所定義之本揭露的精神與範圍。例如，可用不同的方法實施上述的許多製程，並且以其他製程或其組合替代上述的許多製程。    再者，本申請案的範圍並不受限於說明書中所述之製程、機械、製造、物質組成物、手段、方法與步驟之特定實施例。該技藝之技術人士可自本揭露的揭示內容理解可根據本揭露而使用與本文所述之對應實施例具有相同功能或是達到實質相同結果之現存或是未來發展之製程、機械、製造、物質組成物、手段、方法、或步驟。據此，此等製程、機械、製造、物質組成物、手段、方法、或步驟係包含於本申請案之申請專利範圍內。雖然已結合上文闡述之特定實施例描述本發明，但一般技術者將明白本發明之許多替代方案及其修改及變更。所有此等替代方案、修改及變更被視為落入本發明之範疇內。
圖1顯示實例1之酸催化水解（ACH）（圖1B）和基於蠟物理性吸附動力學之FTIR成像程序（圖1A）。    圖2顯示在pH = 3的HCl （ aq ）溶液處理不同時間長度後，使用具有不同正烷基之正烷烴吸附CCD-18Co（a）、SW-1116（b）、SW-480（c）、SW-403（d）、LoVo（e）和HT-29（f）結腸細胞樣品的蠟物理性吸附能力與時間之間的曲線。    圖3顯示通過使用WPK-FTIR成像光譜代表附著在人結腸組織切片表面上Paraplast（或正二十五烷）殘留和Beeswax（蜂蠟，C 30H 61CO 2C 15H 31或C 46H 92O 2）殘留分佈。良性腫瘤之良好分化（WD）形態區域為B1-Bn、B10-Bn、B14-Bn和B10-Pre的癌前區域。惡性區域之分化不良(PD)形態區域組織為B10-Ma和B14-Ma。WD組織良性區域為（a）B1-Bn、（b）B10-Bn、（e）B14-Bn和（c）B10-Pre的癌前病變區域。PD組織惡性區域為（c）B10-Ma和（f）B14-Ma。（良性區域（Bn）、癌前病變區域（Pre）、惡性區域（Ma））    圖4顯示不同時間長度水解後，良性組織切片B1-Bn區域之蠟殘留物時間曲線。    圖5顯示不同時間長度水解後，附著在良性組織切片中B10-Bn區域之蠟殘留量的時間曲線。    圖6顯示不同時間長度水解後，附著在癌前病變組織切片中B10-Pre區域之蠟殘留量的時間曲線。    圖7顯示不同時間長度水解後，附著在惡性組織切片中B10-Ma區域之蠟殘留量的時間曲線。    圖8顯示不同時間長度水解後，附著在良性組織切片中B14-Bn區域之蠟殘留量的時間曲線。    圖9顯示不同時間長度水解後，附著在惡性組織切片中B14-Ma區域之蠟殘留量的時間曲線。    圖10顯示附著在低度口腔癌細胞（SCC-15）樣品及高度口腔癌細胞樣品（OEC-M1）經不同時間長度水解後，蠟（n-C 22H 46、n-C 25H 52、n-C 28H 58、n-C 30H 62、Beeswax（蜂蠟, C 30H 61CO 2C 15H 31或C 46H 92O 2））殘留物之時間分佈。    圖11顯示如實例3所述使用WPK-FTIR成像，施加逐步增加電壓於口腔癌細胞（OEC-M1、SCC-15、SCC-25、OC-2、OC-3）之第一和第二吸附劑量極化率曲線。    圖12顯示實例3使用WPK-FTIR成像，施加逐步增加電壓於口腔癌細胞（OEC-M1、SCC-15、SCC-25、OC-2、OC-3）之崩潰電壓結果。

Claims (16)

  1. 一種建立一已給定癌級別之指標的方法，其包括：提供一參考癌細胞樣品，其中該參考癌細胞樣品具有該已給定癌級別，及包含寡醣鏈錨定於該參考癌細胞樣品之表面；提供一第一吸附劑及一第二吸附劑，其中該第一吸附劑及第二吸附劑為碳數自20至46之正烷烴或於末端具有正烷烴之酯類化合物，且該第一吸附劑之碳數少於該第二吸附劑之碳數；摹繪分析錨定於該參考癌細胞樣品表面的寡醣鏈之寡醣分佈型態；分別以該第一吸附劑及第二吸附劑吸附該已摹繪分析之參考癌細胞樣品；分別測量附著於該已摹繪分析之參考癌細胞樣品上該第一吸附劑之量，及測量附著於該已摹繪分析之參考癌細胞樣品上該第二吸附劑之量；及取得該參考癌細胞樣品之寡醣分佈型態與附著於該已摹繪分析之參考癌細胞樣品上該第一吸附劑量間之一第一參考關聯；取得該參考癌細胞樣品之寡醣分佈型態與附著於該已摹繪分析之參考癌細胞樣品上該第二吸附劑量間之一第二參考關聯，其中該第一參考關聯與該第二參考關聯形成該已給定癌級別之指標。
  2. 如請求項1之方法，其中該癌係為結腸癌、乳腺癌、胃癌、子宮頸癌、前列腺癌、腎癌、神經內分泌癌或口腔癌。
  3. 如請求項1之方法，其中該第一吸附劑或該第二吸附劑係為正烷烴或正烷基酯。
  4. 如請求項1之方法，其中該摹繪分析、吸附及測量步驟包含：進行不同時間長度的水解反應，以逐步水解錨定在參考癌細胞樣品上的之寡醣鏈；分別以該第一吸附劑及第二吸附劑吸附該已由不同時間長度水解之參考癌細胞樣品；分別測量附著於該已由不同時間長度水解之參考癌細胞樣品上之該第一吸附劑及該第二吸附劑之量。
  5. 如請求項4之方法，其中該水解反應係由pH值為自約-1至約6.5之水解劑所進行。
  6. 如請求項1之方法，其中該摹繪分析、吸附及測量步驟包含：將參考癌細胞樣品施加一系列之電壓；分別以該第一吸附劑及第二吸附劑吸附該施加電壓之參考癌細胞樣品，及分別以該第一吸附劑及第二吸附劑吸附該未施加電壓之參考癌細胞樣品；分別測量附著於該施加電壓之參考癌細胞樣品上之該第一吸附劑及該第二吸附劑之量，及分別測量附著於該未施加電壓之參考癌細胞樣品上之該第一吸附劑及該第二吸附劑之量。
  7. 如請求項6之方法，其中該一系列之電壓係自約0V至約500V。
  8. 如請求項1之方法，其進一步包含：提供一正常細胞樣品，其中該正常細胞樣品包含固有寡醣鏈錨定於該正常細胞樣品之表面；摹繪分析錨定於該正常細胞樣品之表面的寡醣鏈之寡醣分佈型態；分別以該第一吸附劑及第二吸附劑吸附該已摹繪分析之正常細胞樣品；分別測量附著於該已摹繪分析之正常細胞樣品上之該第一吸附劑之量，及測量附著於該已摹繪分析之正常細胞樣品上之該第二吸附劑之量；及取得該正常細胞樣品之寡醣分佈型態與附著於該已摹繪分析之正常細胞樣品上之該第一吸附劑之量間之一第一控制關聯；取得該正常細胞樣品之寡醣分佈型態與附著於該已摹繪分析之正常細胞樣品上之該第二吸附劑之量間之一第二控制關聯。
  9. 一種一已給定癌級別之指標，其係由如請求項1之方法所建立。
  10. 一種對一待測細胞樣品鑑定癌級別之方法，其包含：提供該待測細胞樣品，其中該待測細胞樣品包含寡醣鏈錨定於該待測細胞樣品之表面；提供一第一吸附劑及一第二吸附劑，其中該第一吸附劑及第二吸附劑為碳數自20至46之正烷烴或於末端具有正烷烴之酯類化合物，且該第一吸附劑之碳數少於該第二吸附劑之碳數； 摹繪分析錨定於該待測細胞樣品之表面的寡醣鏈之寡醣分佈型態；分別以該第一吸附劑及第二吸附劑吸附該已摹繪分析之待測細胞樣品；分別測量附著於該已摹繪分析之待測細胞樣品上之該第一吸附劑之量，及測量附著於該已摹繪分析之待測細胞樣品上之該第二吸附劑之量；取得該待測細胞樣品之寡醣分佈型態與附著於該已摹繪分析之待測細胞樣品上之該第一吸附劑之量間之一第一待測關聯；取得該待測細胞樣品之寡醣分佈型態與附著於該已摹繪分析之待測細胞樣品上之該第二吸附劑之量間之一第二待測關聯；比較該第一待測關聯及該第二待測關聯與如請求項9之該已給定癌級別之指標，以鑑定該待測細胞樣品之癌級別。
  11. 如請求項10之方法，其中該癌係為結腸癌、乳腺癌、胃癌、子宮頸癌、前列腺癌、腎癌或口腔癌。
  12. 如請求項10之方法，其中該第一吸附劑或該第二吸附劑係為正烷或正烷基酯。
  13. 如請求項10之方法，其中該摹繪分析、吸附及測量步驟包含：進行不同時間長度的水解反應，以逐步水解錨定在待測細胞樣品上的之寡醣鏈；分別以該第一吸附劑及第二吸附劑吸附該已由不同時間長度水解之待測細胞樣品；分別測量附著於該已由不同時間長度水解之待測細胞樣品上之該第 一吸附劑及該第二吸附劑之量。
  14. 如請求項13之方法，其中該水解反應係由pH值為自約-1至約6.5之水解劑所進行。
  15. 如請求項10之方法，其中該摹繪分析、吸附及測量步驟包含：將待測細胞樣品施加一系列之電壓；分別以該第一吸附劑及第二吸附劑吸附該施加電壓之待測細胞樣品，及分別以該第一吸附劑及第二吸附劑吸附該未施加電壓之待測細胞樣品；分別測量附著於該施加電壓之待測細胞樣品上之該第一吸附劑及該第二吸附劑之量，及分別測量附著於該未施加電壓之待測細胞樣品上之該第一吸附劑及該第二吸附劑之量。
  16. 如請求項16之方法，其中該一系列之電壓係自約0V至約500V。
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