TWI677508B - 抗內毒素多胜肽 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供一種抗內毒素多胜肽，其具有通式(I)KR12-L-C1結構，其中C1獨立地為具有α-螺旋結構的雙極性或疏水性短胜肽，L為Ala-Gly-Pro(AGP)或胜肽鍵，且其中疏水端(hydrophobic)的疏水性介於約0.425~0.765之間。本發明之抗內毒素多胜肽可中和脂多醣，且同時具有低溶血性及高耐鹽性。本發明另提供一種設計抗內毒素多胜肽的方法，上述抗內毒素胜肽之疏水端為具疏水性之官能基，並可藉由調整疏水端之係數調控抗內毒素胜肽的抗內毒素活性，其中該抗內毒素胜肽具殺菌及抗發炎之功效。

Description

抗內毒素多胜肽
本發明係關於一種抗內毒素胜肽，且特別是關於可形成轉折立體結構之一種抗菌、低溶血性及鹽類耐受性的抗內毒素多胜肽。
在植物、昆蟲及動物的先天防禦系統中，抗菌胜肽(Antimicrobial peptides，AMPs)已被使用來抑制細菌感染。抗菌胜肽可破壞細胞膜，而導致細菌死亡。抗菌胜肽的膜裂解機制可解決抗藥性的問題。
內毒素(endotoxin,Lipopolysaccharide)是革蘭氏陰性菌細胞外膜重要組成之一，在細菌死亡同時，大量的內毒素會釋放到血液並導致過免疫反應，嚴重時會發展為致死率極高的敗血症。人體對細菌之內毒素極為敏感，極微量(1-5ng/kg體重)的內毒素就能引起體溫上升。發熱反應持續約4小時後逐漸消退。自然感染時，因革蘭氏陰性菌不斷生長繁殖，同時伴有陸續死亡、釋出內毒素，故發熱反應將持續至體內病原菌完全消滅為止。內毒素引起發熱反應的原因是內毒素作用於體內的巨噬細胞等，使之產生白細胞介素1、6和腫瘤壞死因子α等細胞因子，這些細胞因子作用於宿主下丘腦的體溫調節中樞，促使體溫升高發熱。
若於治療細菌感染時所給予之抗生素不具抗內毒素功效，會使患者產生休克。因此毒殺細菌同時能抑制或中和內毒素，避免過量免疫反應發生已是抗菌藥物開必然面臨的考驗。業界仍亟需一種一方面能中和內毒素且另一方面能減低過量免疫反應的抗內毒素藥物。
有鑑於上述先前技術所存在之問題，本發明提供一種抗內毒素多胜肽。
本發明抗內毒素多胜肽是利用靜電作力與疏水性攻擊細菌外膜，此異於小分子抗生素的機制，因而抗菌胜肽被認為對於抗藥性菌株具有極高治療潛力，且對於抗生素具高取代性，然而許多抗菌胜肽僅具有毒殺細菌能力而無中和內毒素之活性。因此如何開發抗菌胜肽兩端之其中一端具雙極性(amphipathic)，而另一端具疏水性(hydrophobic)，且兩端之間具有可供抗菌胜肽形成轉折立體結構的單一胺基酸、胜肽鍵、或胜肽，不僅使得抗菌胜肽於使用時具抗菌、抗內毒素活性，並具有降低過度免疫反應、抗發炎的功效，進而達到使用者使用時能安全使用，不會對生物體、人體產生不良反應與副作用，實為現有抗菌胜肽技術極待克服的問題。
本發明係提供一種抗內毒素多胜肽，其具有通式(II)：A1-L-C1 (II)
其中，A1及C1獨立地為α-螺旋結構的雙極性短胜肽，其中之一具有雙極性，另一為疏水性；L為G(Gly)、P(Pro)、GP(Gly-Pro)或AGP(Ala-Gly-Pro)的1~3個的短胜肽；以及該抗內毒素多胜肽中疏水端(hydrophobic)的疏水性介於約0.425至0.765之間。
在本發明一實施例中，其中A1及C1獨立地為6至12個胺基酸的短胜肽。
在本發明一實施例中，其中該抗內毒素胜肽包括芳香族胺基酸。
在如上文所述之本發明的實施例中，，其中該抗內毒素胜肽結合至一脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)。
由上述必要技術手段所衍生之附屬技術手段為，其中該抗內毒素胜肽具高耐鹽性。
於本發明之一實施態樣中，一種抗內毒素胜肽，其通式(I)為下列所示：KR12-L-C1 (I)
其中，C1獨立地為α-helix結構的6至12個短胜肽，其中C1為選自疏水性短胜肽或雙極性短胜肽，且該抗內毒素的疏水端(hydrophobic)疏水性介於約0.425至0.765之間；以及L為數量1~3個的短胜肽，其中該L選自G(Gly)、P(Pro)、GP(Gly-Pro)或AGP(Ala-Gly-Pro)。
本發明另提出一種全新設計具有抗內毒素活性的菌胜肽之方法，抗菌胜肽之一端(C端或N端)具有雙極性(amphipathic)，另一端具有疏水性(hydrophobic)，兩端中間具有bent hinge可供轉折的立體結構，便可達到控制抗菌胜肽的抗內毒素活性。包括將一AGP(Ala-Gly-Pro)或胜肽鍵插至一抗菌胜肽中，使抗菌胜肽的兩端具有轉折。而原本不具抗內毒素活性之抗菌胜肽，經由上述通則之修飾，即可具備抗內毒素活性。上述抗菌胜肽之疏水端可以不為胺基酸，可為具疏水性之官能基(如長碳鏈)，且此抗菌胜肽不具長度限制。舉例而言，於本發明一實施例中最短為6個胺基酸之抗菌胜肽即可達到此效果，並可藉由調整疏水端之係數(此與胺基酸的長度有關)控制抗菌胜肽的抗內毒素活性。前述抗菌胜肽亦具有抗菌、抗發炎的功效。
本發明更提供一種醫藥組成物及用於製備中和內毒素之醫藥組成物的用途，包括具有通式(I)或通式(II)之抗內毒素多胜肽及藥學上可接受之載體。
第1A-1H圖顯示抗菌胜肽的結構，分別包括(1A)cecropin A、(1B)cecropin B、(1C)KR12(SEQ ID NO：1)、 (1D)WR6(SEQ ID NO：2)、(1E)KR15AGP(SEQ ID NO：3)、(1F)KR12AGPKR6(SEQ ID NO：4)、(1G)KR12AGPWR6(SEQ ID NO：5)及(1H)KR12AGPVR6(SEQ ID NO：6)胜肽的結構。
第2圖顯示KR15AGP(SEQ ID NO：3)、KR12AGPKR6(SEQ ID NO：4)、KR12AGPWR6(SEQ ID NO：5)及KR12AGPVR6(SEQ ID NO：6)胜肽的最小抑制濃度(MIC)。
第3圖顯示抗內毒素胜肽中和LPS的能力，其中KR12AGPWR6(SEQ ID NO：5)(□)胜肽中和LPS的能力較佳。
第4圖顯示抗內毒素的細胞毒性。
第5A-5C圖顯示胜肽所誘導的大單層水泡(Large Unilamellar vesicles,LUV)滲漏。本發明所有胜肽都會造成POPC/膽固醇LUV的滲漏(第5A圖)。KR12AGPKR6(SEQ ID NO：4)、KR12AGPWR6(SEQ ID NO：5)及KR12AGPVR6(SEQ ID NO：6)胜肽會造成POPC/LPS及POPC/POPG LUV的滲漏(第5B-5C圖)。
第6A-6E圖顯示本發明胜肽在磷酸緩衝液(6A)、TE緩衝液(6B)、POPC/膽固醇(6C)、POPC/LPS(6D)及POPC/POPG(6E)下的隨機結構。
第7A-7B圖顯示本發明胜肽所造成LPS堆積。
第8A-8B圖顯示本發明KR12AGPWR6(SEQ ID NO：5)胜肽可抑制NO的生成(8A)及TNF-α的生成(8B)。
第9A-9D圖顯示本發明KR12AGPWR6(SEQ ID NO：5)胜肽可降低老鼠的TNF-α(9A)，並可改善老鼠肺泡表皮細胞及肺出血的情況(9B-9D)。
本發明所述之“抗菌胜肽”係指具有毒殺微生物或抑制其生長的胜肽。抗菌胜肽的抗菌活性包括，但不限於抗細菌、抗病毒或抗真菌。
本發明所述之“抗菌活性”係指胜肽可改變微生物功能及代謝途徑，如，影響複製、生長、生存等的特性。在一實施例中，抗菌活性有關於抑制微生物的生長以及毒殺至少一種細菌。
本發明所述之“微生物”係指細菌、真菌、病毒及原生動物等，特別是，本發明之微生物可為具有脂質雙層膜的細胞或組織的微生物。在一實施例中，脂質雙層膜為細胞膜。微生物包括一般已知的病原性細菌、真菌、病毒及原生動物。
本發明係提供一種抗內毒素胜肽，其通式(II)：A1-L-C1，A1及C1獨立地為具有α-螺旋結構的雙極性短胜肽，L為G(Gly)、P(Pro)、GP(Gly-Pro)或AGP(Ala-Gly-Pro)的1~3個的短胜肽。
本發明之通式(II)中，A1及C1可分別為任何已知的抗菌胜肽或其片段，或A1及C1為一抗菌胜肽的N端或C端。A1及C1獨立地為具有α-螺旋結構，其中之一具有雙極性，而另一為疏水性。
換句話說，假若通式(II)中之A1為雙極性(amphipathic)短胜肽，則C1為疏水性(hydrophobic)短胜肽；假若通式(II)中之A1為疏水性短胜肽，則C1為雙極性短胜肽。
在一實施例中，本發明抗菌胜肽或抗內毒素胜肽包括約2至100個胺基酸，約5至50個胺基酸，約7至20個胺基酸，較佳為6至12個。
在一實施例中，其中A1及C1係具有若N端第2個胺基酸殘基為精胺酸(R)或賴胺酸(K)且往C端間隔2至3個胺基酸殘基，則鄰接另一個精胺酸(R)之特徵短序列。
在一實施例中，其中A1及C1係選自KRIVQR、IKDFLR或若N端第1個與第2個胺基酸殘基為精胺酸(R)且往C端間隔2個胺基酸殘基，則鄰接另一個精胺酸(R)之特徵短序列。
在一實施例中，A1及C1包括，但不限於，KRIVQRIKDFLR(SEQ ID NO：1)、RRWWRW(SEQ ID NO：2)、KRIVQR(SEQ ID NO：7)、IKDFLR(SEQ ID NO：8)及/或RRLVRI(SEQ ID NO：9)。
應注意的是，本發明之抗內毒素胜肽具有疏水性及芳香族胺基酸。在一實施例中，本發明胜肽之疏水端(hydrophobic)疏水性介於約0.425至0.765之間。在另一實施例中，本發明胜肽具有芳香族胺基酸，例如，苯丙氨酸(Phe,F)、色氨酸(Trp,W)及/或酪氨酸(Tyr,Y)。
由於本發明抗內毒素多胜肽的α-螺旋結構可毒殺微生物，且抗內毒素胜肽N-端及/或C-端胜肽的長度及完整性對於抗菌活性非常重要。
本發明之抗內毒素胜肽在溶液或哺乳動物細胞中具有隨機的結構。抗內毒素胜肽的雙極性結構可藉由電荷與脂多醣結合，以形成α-螺旋結構。疏水性的一端則插入脂多醣的脂質A中。所以，被封阻的脂質A及堆積的脂多醣無法造成發炎反應。
另外，本發明之抗內毒素胜肽同時具有低細胞毒性及高耐鹽性。
當然，本發明不限於此，於本發明另一實施例中，一種抗內毒素胜肽，其通式(I)為下列所示：KR12-L-C1 (I)
其中，C1獨立地為α-helix結構的6至12個短胜肽，其中C1為選自疏水性短胜肽或雙極性短胜肽，且該抗內毒素的疏水端(hydrophobic)疏水性介於約0.425至0.765之間；以及L為數量1~3個的短胜肽，其中該L選自G(Gly)、P(Pro)、GP(Gly-Pro)或AGP(Ala-Gly-Pro)。
於本發明另一實施例中，前述通式(I)中之C1選自RRWWRW(SEQ ID NO：2)、IKDFLR(SEQ ID NO：8)或 RRLVRI(SEQ ID NO：9)。
本發明另提出一種全新設計具有抗內毒素活性的抗菌胜肽之方法，抗菌胜肽之一端(C端或N端)具有雙極性(amphipathic)，另一端具有疏水性(hydrophobic)，兩端中間具有bent hinge可供轉折的立體結構，便可達到控制抗菌胜肽的抗內毒素活性。包括將一AGP(Ala-Gly-Pro)或胜肽鍵插至一抗菌胜肽中，使抗菌胜肽的兩端具有轉折。而原本不具抗內毒素活性之抗菌胜肽，經由上述通則之修飾，即可具備抗內毒素活性。上述抗菌胜肽之疏水端可以不為胺基酸，可為具疏水性之物質(如長碳鏈)，且此抗菌胜肽不具長度限制。於本發明一實施例中，抗菌胜肽之長度最短為6個胺基酸即可達抗內毒素活性之效果，並可藉由調整疏水端之係數(此與胺基酸的長度有關)控制抗菌胜肽的抗內毒素活性。且此抗菌胜肽亦具有抗菌、抗發炎的功效。
本發明另提供一種醫藥組成物，包括本發明之抗內毒素胜肽及藥學上可接受之載體。
本發明所述之“藥學上可接受之載體”係指藥學上可接受之物質、組成物、載體，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包封材料，可攜帶或運送本發明抗內毒素胜肽由一個體的位置、體液、組織、器官或部份至另一位置、體液、組織、器官。
藥學上可接受之載體包括糖類、澱粉、纖維素、麥芽、明膠、滑石、賦形劑、油類、乙二醇、多元醇、酯類、洋菜、緩衝劑、海藻酸、生理食鹽水、林格氏溶液、乙醇、磷酸緩衝液等其它非毒性物質。
於本發明再一實施例中，本發明更包括一種用於製備中和內毒素之抗內毒素胜肽之用途，包括一有效劑量之抗內毒素胜肽及一醫藥可接受性賦形劑所組成。
於本發明又一實施例中，抗內毒素胜肽/抗菌胜肽係包括KRIVQRIKDFLR(SEQ ID NO：1)、 RRWWRW(SEQ ID NO：2)、KRIVQRAGPIKDFLR(SEQ ID NO：3)、KRIVQRIKDFLRAGPIKDFLR(SEQ ID NO：4)、KRIVQRIKDFLRAGPRRWWRW(SEQ ID NO：5) KRIVQRIKDFLRAGPRRLVRI(SEQ ID NO：6)、KRIVQR(SEQ ID NO：7)、IKDFLR(SEQ ID NO：8)、以及RRLVRI(SEQ ID NO：9)。
【實施例】
1. 抗內毒素多胜肽的設計
在本發明一實施例中，使用脂多醣去活性(LPS-inactive)α-螺旋胜肽KR12(SEQ ID NO：1)與WR6(SEQ ID NO：2分別作為本發明抗內毒素多胜肽的N端及C端，以形成本發明抗內毒素多胜肽，包括KR15AGP(SEQ ID NO：3)、KR12AGPKR6(SEQ ID NO：4)、KR12AGPWR6(SEQ ID NO：5)及KR12AGPVR6(SEQ ID NO：6)，如表一所示。
將AGP插入KR12(SEQ ID NO：1)中以形成KR15AGP(SEQ ID NO：3)胜肽。再者，KR12AGPKR6(SEQ ID NO：4)、KR12AGPWR6(SEQ ID NO：5)及KR12AGPVR6(SEQ ID NO：6)胜肽分別使用KR12(SEQ ID NO：1)作為雙極性N端α-螺旋結構，另在C端使用3種疏水性α-螺旋結構以增加抗內毒素胜肽的疏水性(第1圖)。
2. 抗菌活性及鹽耐受性
本實施例使用國家臨床實驗室標準委員會的培養基微量稀釋法進行分析。利用MH培養基或含NaCl(50、100、200或300mM)的LYM培養基(含5.4mM KCl、5.6mM Na2HPO4、0.5mMMgSO4、1.0mM檸檬酸鈉、0.4mg ZnCl2、2.0mg FeCl3．6H2O、0.1mg CuSO4．5H2O、0.1mg MnSO4．H2O、0.1mg Na2B4O7．10H2O、700mg不含色氨酸的胺基酸混合物(Clontech)、20mg L-色氨酸、2%維生素混合物(100X,Sigma)及2%葡萄糖)連續稀釋本發明抗內毒素胜肽，獲得濃度為約3200至100μg/ml的抗內毒素胜肽溶液。
取1μl胜肽溶液置於96孔盤，分別與99μl的菌液(5 x 105CFU/ml)混合。以ELISA分析儀(Thermo Max,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)讀取OD600吸光值。分別將不含胜肽溶液的培養液及菌液作為陰性及陽性對照組。將最小抑菌濃度(MIC)以TreeViewProgram軟體轉換後以顏色深淺表示。參照第2圖，KR15AGP(SEQ ID NO：3)胜肽不管在MH或LYM培養基中對革蘭氏陽性及陰性菌不具有抑菌效果。KR12AGPKR6(SEQ ID NO：4)胜肽可有效地抑制細菌生長(最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration；MIC)=約2μg/ml)。然而，當培養基的鹽濃度為200mM時，KR12AGPKR6(SEQ ID NO：4)的MIC增加至約16μg/ml，當鹽濃度為300mM時，KR12AGPKR6(SEQ ID NO：4)不具有抑菌效果。
KR12AGPWR6(SEQ ID NO：5)在高鹽環境下的抑菌效果更佳(MIC=約2-4μg/ml)。KR12AGPVR6(SEQ ID NO：6)在低鹽環境下具有高抑菌效果，但在200mM NaCl下則失去抑菌效果。相較於其它的細菌，KR12AGPKR6(SEQ ID NO：4)、KR12AGPWR6(SEQ ID NO：5)及KR12AGPVR6(SEQ ID NO：6)三者對不動桿菌(Acinetobacter sp.)的抑菌效果較佳。換句話說，於鹽濃度至少為200mM時，該等抗內毒素胜肽最小抑菌濃度不高於4μg/ml。
整體來說，胜肽的抑菌效果為KR12AGPWR6(SEQ ID NO：5)>KR12AGPKR6(SEQ ID NO：4)>KR12AGPVR6(SEQ ID NO：6)>KR15AGP(SEQ ID NO：3)。
3. 抗內毒素胜肽與脂多醣的結合
本實施例使用Limulus Amebocyte Lysate(LAL)分析(Cape Cod Inc,East Falmouth,MA,USA)來評估抗內毒素胜肽中和脂多醣及與脂多醣結合的能力。在96孔盤中，將25μl不同濃度(128、64、32、16、8μg/ml)的胜肽溶液與25μl的標準內毒素(5EU)混合，立即加入50μl的Pyrochrome®。在37℃下以微量盤式分析儀偵測OD405吸光值，持續25分鐘。
參照第3圖，KR12AGPWR6(SEQ ID NO：5)可劑量依賴性地抑制LPS與因子C(factor C)的結合，且中和其下游反應。相較之下，KR15AGP(SEQ ID NO：3)、KR12AGPKR6(SEQ ID NO：4)及KR12AGPVR6(SEQ ID NO：6)的效果較差。換句話說，本發明該等抗內毒素胜肽可中和脂多醣之抑制率約達60%。
4. 細胞毒性試驗
在本實施例中，使MTT法分析細胞毒性。將J744A.1細胞接種於96孔盤，濃度為104cell/100μl/well，培養24小時。將培養基移除後，加入100μl胜肽液(2至64μg/ml)。培養24小時後，加入0.5mg/ml的MTT溶液，培養3小時。將MTT移除後，加入100μl DMSO以溶解三苯基甲脂(formazan)結晶。微量盤式分析儀偵測(VICTOR3)偵測 OD540吸光值以計算細胞存活率。
參照第4圖，所有的胜肽在濃度為32μg/ml時都不具有細胞毒性。KR12AGPWR6(SEQ ID NO：5)胜肽在濃度64μg/ml時有輕微的細胞毒性(細胞存活率約70%)。
5. 大單層水泡的胜肽滲漏性
在本實施例中，使用Avanti小體積擠壓設備(Avanti small-volume extrusion)以擠壓法製備POPC/LPS(POPC：LPS=12.5：1mol/mol)、POPC/膽固醇(POPC：膽固醇=2：1mol/mol)及POPC/POPG(POPC：POPG=3：1mol/mol)大單層水泡(LUV)。以鈣黃綠素緩衝液(70mM鈣黃綠素及10mM Tris,pH 7.4)製備含鈣黃綠素的LUV。鈣黃綠素的滲漏利用Perkin-Elmer冷光分光光度計，偵測496nm及515nm的激發及發射波長，以分析胜肽所造成的鈣黃綠素滲漏。將100mg/mlTriton X-100的螢光強度作為100%滲漏。
滲漏的比例=(F-F0)/(Fr-F0)x 100%，其中F0為無胜肽的螢光強度，Fr為100%滲漏的螢光強度。
參照第5圖，所有的胜肽都會造成POPC/膽固醇LUV的滲漏(第5A圖)。KR12AGPKR6(SEQ ID NO：4)、KR12AGPWR6(SEQ ID NO：5)及KR12AGPVR6(SEQ ID NO：6)胜肽會造成POPC/LPS及POPC/POPG LUV劑量依賴性的滲漏(第5B-5C圖)。KR12AGPWR6(SEQ ID NO：5)胜肽在POPC/LPS及POPC/POPG LUV具有最大的滲漏效果，分別為80%及70%。此結果顯示本發明胜肽造成負電荷LUV的鈣黃綠素滲漏與其抗菌活性一致。
6. 圓偏光二色光譜分析
在本實施例中，利用AVIV202分光偏振譜儀(spectropolarimeter)偵測胜肽的圓偏光二色光譜(Circular dichroism spectroscopy)，以分析胜肽的二級結構。將胜肽以20mM磷酸緩衝液稀釋至60μM至1mM，並掃描波長190至260nm。
參照第6圖，所有的胜肽在磷酸緩衝液及POPC/膽固醇下具有隨機結構。除了KR15AGP(SEQ ID NO：3)之外，其餘胜肽在TFE、POPC/LPS、POPC/POPG下會形成α-螺旋結構。藉由分析222-230nm的負波峰，可知各胜肽在POPC/LPS及POPC/POPG時的α-螺旋程度為KR12AGPWR6(SEQ ID NO：5)>KR12AGPKR6(SEQ ID NO：4)>KR12AGPVR6(SEQ ID NO：6)>KR15AGP(SEQ ID NO：3)。此結果顯示胜肽在負電荷膜的螺旋程度與其抗菌能力相對應。
7.LPS的堆積
將LPS分子溶於氯仿/甲醇(氯仿：甲醇=2：1)中，於40℃下超音波震盪20分鐘後於4℃靜置隔夜。將原液以20mM磷酸鹽緩衝液(含150mM氯化鈉)稀釋至25μM，並於4℃靜置隔夜備用。胜肽的濃度為8或16μg/ml。將LPS溶液與胜肽反應後，以Malvern Zetasizer ZS(Malvern,UK)進行動態光散射分析(dynamic light scattering,DLS)，以偵測LPS顆粒大小及分佈。
參照第7圖，8及16μg/ml的KR12AGPWR6(SEQ ID NO：5)會促使LPS(7A)及POPC/LPS LUV(7B)的堆積，且增加粒徑大小。然而，KR15AGP(SEQ ID NO：3)、KR12AGPKR6(SEQ ID NO：4)及KR12AGPVR6(SEQ ID NO：6)不會造成LPS堆積及粒徑大小改變。
8. 發炎反應的抑制
將J744A.1細胞(3 x 105)接種於24孔盤培養24小時。以PBS清洗，並加入含LPS(E.coli 026：B6(SIGMA,150ng/ml))及本發明胜肽(2至32μg/ml)。經24小時處理後，取上清液，以1000rpm離心10分鐘。將50μl上清液與50μl的Griess試劑(SIGMA)混合，並置於室溫10分鐘後，偵測OD540吸光值及NO濃度。另外，以ELISA分析套組(eBiosciences)分析上清液中TNF-α的濃度。
參照第8圖，在所有的胜肽中，僅 KR12AGPWR6(SEQ ID NO：5)可抑制NO的生成，且具有劑量依賴性(8A)。相同地，KR12AGPWR6(SEQ ID NO：5)也可抑制TNF-α的生成(8B)。
9. 內毒素動物試驗
本實施例所使用的老鼠購自於國家動物中心的5週齡C57BL/6公鼠。將老鼠分成3組，每組5隻，分別腹腔注射(a)18mg/kg體重的LPS(E.coli O26：B6)；(b)18mg/kg體重LPS與10mg/kg體重胜肽；以及(c)對照組。在注射後1.5小時採血，將血液以3000rpm於4℃下離心10分鐘。取上清液以ELISA分析套組(eBiosciences)分析上清液中TNF-α的濃度。24小時後，將所有老鼠犧牲。以4%福馬林固定肺，並於ultraclear緩衝液(J.K.Baker)及乙醇梯度中脫臘。以H&E染色後，以光學顯微鏡(Eclipse E400,Nikon)及數位顯微攝影機(AxioCam ICc 5,ZEISS)觀察肺部形態。
參照第9圖，KR12AGPWR6(SEQ ID NO：5)胜肽可有效地降低老鼠的TNF-α(9A)。KR12AGPWR6(SEQ ID NO：5)胜肽可有效地減少肺泡表皮細胞及肺出血的情況(9B,9C,9D)。
綜上，本發明提供抗內毒素胜肽之通式(II)為A1-L-C1，通式(I)為KR12-L-C1中，抗菌胜肽/抗內毒素胜肽之一端(C端或N端)具有雙極性，另一端具有疏水性，兩端中間具有bent hinge如通式(II)與通式(I)中的L而可供轉折的立體結構，如此便可達到控制本發明抗菌胜肽的抗內毒素活性。前述實施例中，其中L係以AGP為例，不僅具抗內毒素活性，亦具抗菌、抗發炎的功效。當然，本發明不限於此，通式(II)與通式(I)中的L亦可選自G(Gly)、P(Pro)、或GP(Gly-Pro)，其如同L為AGP所進行的測試，除可供轉折的立體結構外，亦具抗內毒素活性與抗菌功效，及進一步有效降低發炎反應，例如因發炎反應而導致血管通透性增加所造成血管破裂出血。然而，因L為G(Gly)、P(Pro)、或GP(Gly-Pro)的測試 結果大致與L為AGP時相似，於此便不在贅述。
所有說明書中所揭示之發明技術特點可以任意方式組合。說明書中揭示之每一技術特點可以提供相同、等同或相似目的之其他方式替換。因此，除非另有特別說明，文中所有揭示之特點均只是等同或相似特點之一般系列之實例。
由上述可知，熟習此技藝者能輕易地了解本發明之必要特徵，在不脫離其精神與範圍之下能就本發明做許多改變與調整以應用於不同用途與條件。

Claims (7)

  1. 一種抗內毒素胜肽，其通式(I)為下列所示：KR12-L-C1(I)其中，C1獨立地為α-helix結構的6至12個短胜肽，其中C1為選自疏水性短胜肽或雙極性短胜肽，且該抗內毒素的疏水端(hydrophobic)疏水性介於約0.425至0.765之間；其中KR12係選自KRIVQRIKDFLR(SEQ ID NO：1)；其中C1選自RRWWRW(SEQ ID NO：2)、IKDFLR(SEQ ID NO：8)或RRLVRI(SEQ ID NO：9)；以及L為數量1~3個的短胜肽，其中該L選自G(Gly)、P(Pro)、GP(Gly-Pro)或AGP(Ala-Gly-Pro)。
  2. 一種抗內毒素胜肽，其通式(II)為下列所示：A1-L-C1 (II)其中，C1獨立地為α-helix結構的6至12個短胜肽，其中C1為選自疏水性短胜肽或雙極性短胜肽，且該抗內毒素的疏水端(hydrophobic)疏水性介於約0.425至0.765之間；其中A1係選自KRIVQR(SEQ ID NO：7)；其中C1選自RRWWRW(SEQ ID NO：2)、IKDFLR(SEQ ID NO：8)或RRLVRI(SEQ ID NO：9)；以及L為數量1~3個的短胜肽，其中該L選自G(Gly)、P(Pro)、GP(Gly-Pro)或AGP(Ala-Gly-Pro)。
  3. 一種醫藥組成物，包括如請求項1或請求項2所述之抗內毒素胜肽及藥學上可接受之載體。
  4. 一種用於製備中和內毒素之抗內毒素胜肽之用途，包括如請求項1或請求項2之一有效劑量之抗內毒素胜肽及一醫藥可接受性賦形劑所組成。
  5. 如請求項4所述之用途，其中鹽濃度至少為200mM時，該等抗內毒素胜肽最小抑菌濃度不高於4μg/ml。
  6. 如請求項4所述之用途，其中該等抗內毒素胜肽中和脂多醣之抑制率達60%。
  7. 如請求項4所述之用途，其中該抗內毒素胜肽係包括KRIVQRIKDFLR(SEQ ID NO：1)、RRWWRW(SEQ ID NO：2)、KRIVQRAGPIKDFLR(SEQ ID NO：3)、KRIVQRIKDFLRAGPIKDFLR(SEQ ID NO：4)、KRIVQRIKDFLRAGPRRWWRW(SEQ ID NO：5)KRIVQRIKDFLRAGPRRLVRI(SEQ ID NO：6)、KRIVQR(SEQ ID NO：7)、IKDFLR(SEQ ID NO：8)、以及RRLVRI(SEQ ID NO：9)。
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