TWI674100B - 多孔籠狀奈米碳點的製造方法 - Google Patents
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Abstract
一種多孔籠狀奈米碳點的製造方法，係用以解決習用奈米碳點的粒徑過小，無法應用於直接投予生物體的問題。該多孔籠狀奈米碳點的製造方法包含：將檸檬酸溶解於聚乙二醇2-胺乙基醚以得一第一混合液；將溴化十六烷基三甲銨及氫氧化鈉依序加入該第一混合液中以得一第二混合液；將該第二混合液封裝於具有聚四氟乙烯塗層之容器中，並裝於一不鏽鋼微波容器中，進行加熱以得一黃色澄清溶液；對該黃色澄清溶液進行離心並去除一上清液以得一待純化液；使該待純化液通過氯化銨飽和管柱，再以奈米純水進行洗脫以得一洗出液；及對該洗出液進行真空加熱以得一多孔籠狀奈米碳點。
Description
本發明係關於一種奈米碳點的製造方法，特別係關於一種可以製造多孔籠狀奈米碳點的奈米碳點的製造方法。
一般而言，奈米碳點由於對近紅外光具有良好的吸收效果，因而可以被應用於實質固態瘤(solid tumor)的光熱療法(photothermal therapy)；然而，習用奈米碳點的粒徑僅為2~5nm，難以應用於直接投予生物體，因此仍需要提供一種多孔籠狀奈米碳點，以解決上述的問題。
為解決前述問題，本發明的目的遂提供一種多孔籠狀奈米碳點的製造方法，可以製造獲得大粒徑之多孔籠狀奈米碳點者。
本發明之多孔籠狀奈米碳點的製造方法，係可以包含：將2公克之檸檬酸溶解於10毫升之聚乙二醇2-胺乙基醚，於25±3℃之溫度下超音波震盪20分鐘，得一第一混合液；將100mM、0.1公克之溴化十六烷基三甲銨及0.1N、5毫升之氫氧化鈉依序加入該第一混合液中，連續攪拌1小時，得一第二混合液；將該第二混合液封裝於具有聚四氟乙烯塗層之容器中，並裝於一不鏽鋼微波容器中，於200℃之溫度下加熱12小時，得一黃色澄清溶液；以20000rpm之轉速對該黃色澄清溶液進行離心25分鐘三次，去除一上清液，得一待純化液；使該待純化液通過氯化銨飽和管
柱，再以奈米純水進行洗脫8小時，得一洗出液；及於80℃之溫度下，對該洗出液進行真空加熱12小時，得一多孔籠狀奈米碳點；如此，經由前述多孔籠狀奈米碳點的製造方法可以製造獲得粒徑約為20~50nm的多孔籠狀奈米碳點，藉由該多孔籠狀奈米碳點的粒徑、多孔籠狀的構型及高孔隙度，使該多孔籠狀奈米碳點具有良好的藥物負載能力，而能夠應用於作為藥物載體，並能夠直接投予生物體，以於該生物體的體內釋放所攜帶之藥物；又，該多孔籠狀奈米碳點於600~1000nm之波長(近紅外光波段)下具有良好的吸光能力與光熱轉換能力，更可以應用於光熱療法，於近紅外光的照射下，使該多孔籠狀奈米碳點的溫度上升，為本發明之功效。
第1圖：試驗(A)中，多孔籠狀奈米碳點的紫外光一可見光分光光譜分析結果。
第2圖：試驗(A)中，多孔籠狀奈米碳點的穿透式電子顯微影像圖。
第3a圖：試驗(B)中，於未以近紅外光照射的狀況下，各組多孔籠狀奈米碳點的氨甲蝶呤的累積釋放百分比折線圖。
第3b圖：試驗(B)中，於以近紅外光照射的狀況下，各組多孔籠狀奈米碳點的氨甲蝶呤的累積釋放百分比折線圖。
第4圖：試驗(C)中，各組細胞的溫度變化折線圖。
第5圖：試驗(D)中，各組細胞的細胞存活率變化折線圖。
為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明一實施例之多孔籠狀奈米碳點的製造方法，係以檸檬酸(citric acid)作為前驅物，經由水熱處理(hydrothermal treatment)進行
碳化作用(carbonization)，再於溴化十六烷基三甲銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，cetyltrimethylammonium bromide，簡稱CTAB)的存在下，使其自行組裝而形成一多孔籠狀奈米碳點(clathrate-like carbon dot，簡稱C-dotCL)，詳如下述。
於該多孔籠狀奈米碳點的製造方法中，首先，工者可以將2公克之檸檬酸溶解於10毫升之聚乙二醇2-胺乙基醚(poly(ethylene glycol)2-amino ethyl ether)，於25±3℃之溫度下超音波震盪20分鐘，使檸檬酸與聚乙二醇2-胺乙基醚可以均勻混合而得一第一混合液。
接著，工者再將0.1公克之溴化十六烷基三甲銨(100mM)及5毫升之氫氧化鈉(0.1N)依序加入該第一混合液中，連續攪拌1小時，得一第二混合液。
將該第二混合液封裝於具有聚四氟乙烯塗層之容器(Teflon-coated container)中，並將該具有聚四氟乙烯塗層之容器裝於一不鏽鋼微波容器(stainless-steel autoclave container)中，於200℃之溫度下加熱12小時，使該第二混合液形成一黃色澄清溶液(clear,yellow-colored solution)。
該黃色澄清溶液可以於20000rpm之轉速下離心25分鐘，並將前述離心流程重複三次，去除一上清液後，即可以獲得一待純化液，藉由此一離心流程，可以有效地去除未完全反應的溴化十六烷基三甲銨。
於取得該待純化液後，工者可以使該待純化液通過氯化銨飽和管柱(ammonium chloride saturated Sephadex G-100 column)，再以奈米純水(nano-pure water)進行洗脫8小時，得一洗出液(eluate)，以進一步去除其中的微量溴化十六烷基三甲銨。
最後，可以於80℃之溫度下，對該洗出液進行真空加熱(vaccum heating)12小時，即可以獲得粉末狀之多孔籠狀奈米碳點，該多
孔籠狀奈米碳點能夠再回溶於奈米孔水(nanopore water)之中，使其pH值維持於pH 7.0，並保存於4℃備用。
經由前述之多孔籠狀奈米碳點的製造方法所製造獲得的多孔籠狀奈米碳點，其粒徑約為20~50nm，再者，該多孔籠狀奈米碳點藉由其多孔籠狀的構型(clathrate-like structural arrangement)及所具有之高孔隙度(porosity)，具有良好的藥物負載能力(drug loading capacity)，因而能夠應用於作為藥物載體，並藉由其適中的粒徑(20~50nm)而能夠直接投予生物體，以於該生物體的體內釋放所攜帶之藥物；又，該多孔籠狀奈米碳點於600~1000nm之波長(近紅外光波段)下具有良好的吸光能力與光熱轉換能力(photothermal conversion efficiency)，更可以應用於光熱療法，於近紅外光的照射下，使該多孔籠狀奈米碳點的溫度上升，進而殺死該多孔籠狀奈米碳點周遭的癌症細胞。
舉例而言，可以使多孔籠狀奈米碳點負載有氨甲蝶呤(emthexate，簡稱MTX)等抗癌藥物，例如將10毫升之多孔籠狀奈米碳點水溶液(200μg/mL)混合5毫升之氨甲蝶呤(0.5M，溶於1M NaOH中)，於25±3℃之溫度下攪拌3小時，其間持續充填氮氣(nitrogen purging)以避免外界干擾，再以奈米純水清洗數次以去除未固定於該多孔籠狀奈米碳點上的氨甲蝶呤，最終以純水進行透析(dialysis)48小時，而獲得負載有氨甲蝶呤的多孔籠狀奈米碳點(C-dotCL-MTX)。
此外，由於癌症細胞的細胞膜上多具有葉酸受器(folic acid receptor，簡稱FAR)，更可以使葉酸(folic acid)連接於前述負載有氨甲蝶呤的多孔籠狀奈米碳點(C-dotCL-MTX)上，進而提升該多孔籠狀奈米碳點的靶向能力(targeting capacity)。詳而言之，以n-羥基琥珀酰亞胺(n-hydroxysuccinamide，簡稱NHS)及N,N-dicyclohexylcarbodiimide(N,N-二環己基碳二亞胺，簡稱DCC)活化葉酸的羧基(carboxylate group)，接
著混合15毫升之負載有氨甲蝶呤的多孔籠狀奈米碳點(C-dotCL-MTX)與5毫升之經活化的葉酸(3：0.1 w/v)，以150rpm之轉速攪拌6小時(期間持續填充氮氣)，再於黑暗中靜置24小時，所得之溶液再以20000rpm之轉速離心25分鐘，獲得的沉澱物(pellet)回溶於奈米純水後，最後再使用3000kDa之透析袋，依序以磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline，簡稱PBS，pH 7.2)與去離子水進行透析後，即可以獲得連接有葉酸的多孔籠狀奈米碳點(C-dotCL-MTX-FA)。
為證實以本發明之多孔籠狀奈米碳點的製造方法所製造獲得的多孔籠狀奈米碳點確實能夠應用於作為藥物載體且亦可以應用於光熱療法，遂進行以下試驗：
(A)多孔籠狀奈米碳點的性質
請參照第1圖所示，分析該多孔籠狀奈米碳點(C-dotCL，第A1組)及負載有氨甲蝶呤的多孔籠狀奈米碳點(C-dotCL-MTX，第A2組)的紫外光-可見光分光光譜(UV-vis spectra)，其結果顯示：該多孔籠狀奈米碳點不僅於紫外光區段具有較大的吸光值(250nm、350nm)，且於近紅外光波段(600~1000nm)下也具有良好的吸光能力。
接著以透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，簡稱TEM)觀察該多孔籠狀奈米碳點的粒徑大小，其結果顯示該多孔籠狀奈米碳點的粒徑約介於20~50nm之間。
(B)多孔籠狀奈米碳點的藥物負載能力與藥物釋放能力
藉由該多孔籠狀奈米碳點的表面所攜帶之正電荷，與氨甲蝶呤之間的靜電作用力(electrostatic interaction)，使該多孔籠狀奈米碳點的藥物負載能力高達約97%。
本試驗另觀察於不同pH值環境下，該多孔籠狀奈米碳點的藥物釋放能力，係分別於pH 5.8(第B1組)與pH 7.4(第B2組)的環境
中，計算不同時間下，氨甲蝶呤的累積釋放百分比，其結果如第3a圖所示，於pH 5.8的略酸性環境(第B1組)中，2小時內可以釋放2.2%之氨甲蝶呤，8小時時可以達14%，直到72小時即可以完全釋放，而中性環境(第B2組)中，該多孔籠狀奈米碳點的氨甲蝶呤釋放速率略優於略酸性環境(第B1組)中的該多孔籠狀奈米碳點的氨甲蝶呤釋放速率。
續參照第3b圖所示，在波長為1064nm之近紅外光照射的狀況下，相較於中性環境(第B2組)中的該多孔籠狀奈米碳點的氨甲蝶呤釋放速率，略酸性環境(第B1組)中的該多孔籠狀奈米碳點的氨甲蝶呤釋放速率較佳。
值得注意的是，癌症細胞發生轉移之後，其高度的代謝作用將會使得癌症細胞所處的微環境(microenvironment)呈現偏酸性(slightly acidic)，而在近紅外光照射的狀況下，該多孔籠狀奈米碳點於略酸性環境中具有較佳的氨甲蝶呤釋放速率，顯示該多孔籠狀奈米碳點具有良好的靶向能力，可以癌症細胞所處的微環境周圍有效釋放氨甲蝶呤。
(C)多孔籠狀奈米碳點的光熱轉換能力
本試驗係如第1表所示，以不同濃度之多孔籠狀奈米碳點處理細胞，利用波長為1064nm之近紅外光進行照射，並記錄各組細胞於照射後不同時間點的溫度；本試驗另以未處理該多孔籠狀奈米碳點的細胞作為第C0組。
請參照第4圖所示，近紅外光的照射時間與經該多孔籠狀奈米碳點處理之細胞的溫度呈正相關，顯示該多孔籠狀奈米碳點具有良好的光熱轉換能力，特別是當處理之多孔籠狀奈米碳點的濃度達60μg/mL以上時(即，第C6~C8組)，其光熱轉換能力約達40%。
(D)連接有葉酸的多孔籠狀奈米碳點之促細胞凋亡效能
本試驗係如第2表所示，以BCSC細胞株(乳癌幹細胞)及Vero細胞株(非洲綠猴腎細胞)作為模式細胞株，分別處理不同濃度之連接有葉酸的多孔籠狀奈米碳點(C-dotCL-MTX-FA)，並於近紅外光的照射下，觀察各組細胞株的細胞存活率。
請參照第5圖所示，在未以近紅外光照射的細胞中(第D1-0、D2-0組)，隨著連接有葉酸的多孔籠狀奈米碳點(C-dotCL-MTX-FA)
之濃度上升，各組細胞的細胞存活率均有下降，惟仍以同時以近紅外光照射的細胞中(第D1-1、D2-1組)的細胞存活率之下降幅度較大，顯示近紅外光的照射有助於連接有葉酸的多孔籠狀奈米碳點(C-dotCL-MTX-FA)之促細胞凋亡效能。
綜合上述，經由本發明之多孔籠狀奈米碳點的製造方法可以製造獲得粒徑約為20~50nm的多孔籠狀奈米碳點，藉由該多孔籠狀奈米碳點的粒徑、多孔籠狀的構型及高孔隙度，使該多孔籠狀奈米碳點具有良好的藥物負載能力，而能夠應用於作為藥物載體，並能夠直接投予生物體，以於該生物體的體內釋放所攜帶之藥物；又，該多孔籠狀奈米碳點於600~1000nm之波長(近紅外光波段)下具有良好的吸光能力與光熱轉換能力，更可以應用於光熱療法，於近紅外光的照射下，使該多孔籠狀奈米碳點的溫度上升，為本發明之功效。
雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
Claims (1)
- 一種多孔籠狀奈米碳點的製造方法，係包含：將2公克之檸檬酸溶解於10毫升之聚乙二醇2-胺乙基醚，於25±3℃之溫度下超音波震盪20分鐘，得一第一混合液；將100mM、0.1公克之溴化十六烷基三甲銨及0.1N、5毫升之氫氧化鈉依序加入該第一混合液中，連續攪拌1小時，得一第二混合液；將該第二混合液封裝於具有聚四氟乙烯塗層之容器中，並裝於一不鏽鋼微波容器中，於200℃之溫度下加熱12小時，得一黃色澄清溶液；以20000rpm之轉速對該黃色澄清溶液進行離心25分鐘三次，去除一上清液，得一待純化液；使該待純化液通過氯化銨飽和管柱，再以奈米純水進行洗脫8小時，得一洗出液；及於80℃之溫度下，對該洗出液進行真空加熱12小時，得一多孔籠狀奈米碳點。
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| CN103663412A (zh) * | 2013-12-05 | 2014-03-26 | 中国科学院大学 | 一种荧光光色可调碳量子点的制备方法 |
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