TWI626055B - 杭荊芥萃取物及其用於製備抑制皮屑芽孢菌與白色念珠菌組成物之用途 - Google Patents
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Abstract
本發明系關於一種杭荊芥(Schizonepeta tenuifolia Briq.)萃取物及其用於製備抑制皮屑芽孢菌(Malassezia furfur)與白色念珠菌(Candida albicans)組成物之用途,杭荊芥萃取物係以特定步驟製備而得,以一有效劑量之杭荊芥萃取物施予一個體,可抑制皮屑芽孢菌之生長;藉此,本發明具有改善皮屑芽孢菌引起之皮膚問題的功效。
Description
本發明系關於一種杭荊芥萃取物及其用於製備抑制皮屑芽孢菌(Malassezia furfur)組成物之用途,尤指一種經由特定製備方法萃取而得的杭荊芥萃取物,可用以有效改善個體因皮屑芽孢菌引起之相關皮膚疾病。
皮屑芽孢菌(Malassezia furfur)是一種嗜油性真菌,屬於正常菌群的一種,並存在於人體的皮脂腺中。皮屑芽孢菌會利用脂肪酶(lipase)分解人體分泌的油脂,因此若皮膚油脂分泌過度旺盛時,促進皮屑芽孢菌的大量生長,導致皮膚油脂被大量分解而產生會引起皮膚發炎的脂肪酸,進而導致人體皮膚組織損傷。目前已知道與皮屑芽孢菌大量生長有關的皮膚疾病包括毛囊炎、脂漏性皮膚炎、頭皮屑、汗斑與牛皮癬等等。
目前用以處置皮屑芽孢菌感染或皮屑芽孢菌過度生長的方法包括,外用含有抗真菌藥物益康唑(econazole)或酮康唑(ketoconazole)
的藥物、硫磺藥水(precipitated sulfur),以及內服抗黴菌藥物氟康唑(fluconazole)或伊曲康唑(itraconazole)。然而,這些藥物已知具有不同的副作用,或是會與其他藥物產生不良作用,例如氟康唑(fluconazole)會導致腸胃道症狀,且若與抗組織胺藥物息斯敏(astemizole)、特芬那定(terfenadine)共同使用時,可能會造成使用者嚴重患者心律不整。因此,研發出副作用更低的皮屑芽孢菌抑制劑,為十分重要的研發目標。
美國專利公告號US 9278994 B2號專利係一種短抗微生物脂肽(lipopeptides),係將KPV三肽或KdPT三肽以脂肪酸修飾後,以獲得具有抗微生物活性之脂肽(lipopeptides),此脂肽可以用以處置皮膚或黏膜之損傷或感染,例如異位性皮膚炎、毛囊炎、頭皮屑或足癬。另,中華民國專利公開號為TW 201412324(A)號之申請案,係一種用於治療牛皮癬及皮脂溢出症局部用組成物,搭配至少兩種植物萃取物(如掌葉大黃根、木藍、黃蘗樹、馬齒莧、當歸或無患子)以及包含甘草酸鉀、神經醯胺等等成分之組成物,可改善頭皮不適的狀況。然而,上述專利並未證實該些組成物對於皮屑芽孢菌的影響。
杭荊芥(Schizonepeta tenuifolia Briq.),又名荊芥,是一種多年草本生的唇形科植物。杭荊芥之乾燥地上部分可以入藥,其藥性為辛溫解表,性味有辛、微溫。功效為發汗、散風濕,助脾消食、清熱散淤、破結解毒等等。在一些治療過敏性皮膚炎、牛皮癬或外
傷的複方組成物中都含有杭荊芥,但杭荊芥單獨對於皮膚相關疾病之影響卻少有研究。
今,發明人有鑑於現有治療皮屑芽孢菌相關疾病之醫藥組成物於實際實施時仍有多處缺失,於是乃一本孜孜不倦之精神,並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐,而加以改善,並據此研創出本發明。
本發明係一種杭荊芥(Schizonepeta tenuifolia Briq.)萃取物及於製備抑制皮屑芽孢菌(Malassezia furfur)組成物之用途,其主要係指藉由特定步驟萃取杭荊芥植物後,製得之萃取物具有抑制皮屑芽孢菌(Malassezia furfur)生長之功效,藉此可應用於改善皮屑芽孢菌相關的皮膚疾病。
本發明提供一種杭荊芥(Schizonepeta tenuifolia Briq.)萃取物,其製備方法包含:先以乙醇萃取一杭荊芥材料,以獲得一乙醇粗萃物;將乙醇粗萃物以體積比2:1之乙酸乙酯/水溶液進行分配萃取,劃分出一乙酸乙酯相與一第一水相;以體積比1:1之甲醇/正己烷溶液萃取乙酸乙酯相,以獲得一甲醇相與一正己烷相,其中甲醇相包含第一萃取物。
本發明亦提供一種杭荊芥(Schizonepeta tenuifolia Briq.)萃取物於製備抑制皮屑芽孢菌(Malassezia furfur)生長之組成物之用途,係以一有效劑量的杭荊芥萃取物施予一所需個體,以達到抑制皮屑芽孢菌生長的目的。
於本發明之一實施例中,第一萃取物含有119.30±1.43μg/mg總多酚。
於本發明之一實施例中,第一萃取物的皮屑芽孢菌最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentrations)為0.6μg/mL。
於本發明之一實施例中,有效劑量為25~100μg/mL。
於本發明之一實施例中,有效劑量為100μg/mL。
於本發明之一實施例中,第一萃取物抑制皮屑芽孢菌生長之抑菌率為89.07%。
於本案之一實施例中,第一萃取物可進一步抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis)與白色念珠菌(Candida albicans)生長。
於本發明之一實施例中,第一萃取物亦具有清除自由基,以達到抗氧化之功效。
於本案之一實施例中,第一萃取物亦能藉由抑制一氧化氮(NO)的產生,達到抗發炎之功效。
藉此,本案杭荊芥萃取物可作為抗皮屑芽孢菌的醫藥組成物或妝品組成物,以達到抗皮屑芽孢菌相關皮膚疾病之功效。
第一圖:本發明杭荊芥萃取物的製備流程圖。
第二圖;本發明杭荊芥萃取物的真菌抑菌率分析圖。
第三圖:本發明杭荊芥萃取物的細菌抑菌率分析圖。
第四圖:本發明杭荊芥萃取物抑制一氧化氮生成分析圖。
第五圖:本發明杭荊芥萃取物對小鼠細胞存活率分析圖。
本發明之目的及其結構功能上的優點,將依據以下圖面所示之結構,配合具體實施例予以說明,俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。
本發明為一種杭荊芥(Schizonepeta tenuifolia Briq.)萃取物,製備方法包含:以乙醇萃取一杭荊芥材料,以獲得一乙醇粗萃物;將乙醇粗萃物以體積比2:1之乙酸乙酯/水溶液進行分配萃取,劃分出一乙酸乙酯相與一第一水相;再以體積比1:1之甲醇/正己烷溶液萃取乙酸乙酯相,以獲得一甲醇相與一正己烷相,其中甲醇相包含第一萃取物。將製備之杭荊芥萃取物,以一有效劑量給予一所需個體,可抑制皮屑芽孢菌的生長,以達到抗菌之功效。其中,第一萃取物的總多酚含量為119.30±1.43μg/mg。
本發明亦提供上述杭荊芥萃取物於製備抑制皮屑芽孢菌(Malassezia furfur)生長之組成物之用途,其中杭荊芥萃取物的有效劑量為25~100μg/mL,較佳劑量為100μg/mL;第一萃取物的皮屑芽孢菌最小抑菌濃度為0.6μg/mL,抑菌率可達到89.07%,並可進一步抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis)與白色念珠菌(Candida albicans)生長;此
外,第一萃取物亦能有清除自由基與抑制一氧化氮(NO)生成之,因此具有抗氧化與抗發炎之功效。
此外,藉由下述具體實施例,可進一步證明本發明可實際應用之範圍,但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。
實驗一、杭荊芥萃取物之製備
請參照第一圖,為本案杭荊芥萃取流程圖。本案杭荊芥萃取物之製備流程簡述如下;取杭荊芥(Schizonepeta tenuifolia Briq.)葉片,洗淨並晾乾;篩選完整葉面,以35~40℃烘乾。將烘乾之杭荊芥葉片磨成粉末,獲得之重量為1.58公斤;在室溫下以乙醇浸泡連續萃取5次,收集並過濾上清液,進行減壓濃縮以獲得杭荊芥乙醇粗萃物,其重量為130.0克。將乙醇粗萃物以體積比2:1之乙酸乙酯(Ethyl acetate)/水(H2O)溶液進行分配萃取,並劃分出一乙酸乙酯相與一第一水相,進一步將乙酸乙酯相以體積比1:1之正己烷(n-Hexane)/95%甲醇(Methanol)溶液進行分配萃取,得到一甲醇相與一正己烷相,甲醇相包含第一萃取物,且正己烷相包含第二萃取物;另以體積比1:1之正丁醇(n-Butanol)/水溶液,對第一水相進行分配萃取,劃分出一正丁醇相與一第二水相,正丁醇相中包含第三萃取物,且第二水相中包含第四萃取物。將上述之甲醇相、正己烷相、正丁醇相與第二水相進行減壓從縮後,獲得22.3克之第一萃取物、27.4克之第二萃取物、31.5克第三萃取物以及46.7克第四萃取物。
實驗二、杭荊芥萃取物總多酚含量測定
Folin-Ciocalteu比色法為最普遍應用於檢測總多酚含量的方法,由於Folin-Ciocalteu試劑中含有鎢鉬酸,鎢鉬酸還原時會生成藍色化合物,其顏色深淺與受試物的多酚含量成正比,再搭配以沒食子酸(gallic acid)配置之標準品,便可測得受試物中總多酚的相對含量。實驗方法簡單敘述如下:配置2%碳酸鈉(Na2CO3)溶液與5% Folin-Ciocalteu試劑備用;在96孔盤中加入20μL、不同濃度的沒食子酸(gallic acid)標準品(0、0.87、1.74、3.48與6.96μg/mL)或本發明之杭荊芥萃取物(0.5mg/mL),再加入10μL 5% Folin-Ciocalteu試劑,均勻混合後反應10分鐘;接著加入200μL 2%碳酸鈉(Na2CO3)溶液,均勻混合後反應10分鐘;將96孔盤以分光光度計測量波長620nm之吸光值,並以沒食子酸(gallic acid)溶液之量測結果製備出標準曲線後,將杭荊芥萃取物的吸光值與標準曲線進行比對換算,以獲得杭荊芥萃取物之「總多酚當量」,意即「1毫克(mg)杭荊芥萃取物和多少微克(μg)的沒食子酸具相同還原鎢鉬酸的功效」,結果請見表一。如表一,第一萃取物中富含最多總多酚(119.30±1.43μg/mg),其餘萃取物的總多酚含量,由高至低依序為第三萃取物(56.53±0.60μg/mg)、乙醇粗萃物(43.42±0.29μg/mg)、第四萃取物(23.44±0.60μg/mg)、與第二萃取物(12.13±1.14μg/mg)。
實驗三、杭荊芥萃取物對皮屑芽孢菌之最小抑菌濃度
最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration)是指受試物與微生物經過隔夜培養後,能使微生物的生長受到明顯阻滯的最小受試物濃度,其實驗方法如下:取200μL隔夜培養之菌液放置入96孔盤,先測量其吸光值以推測原菌液中可能之菌落數量;取180μL、以培養基稀釋至菌量為105~107CFUs/mL的稀釋菌液,置入96孔盤中,再分別加入不同濃度的杭荊芥萃取物共同培養;將上述菌液隔夜培養後,進行連續稀釋並塗抹至洋菜膠培養盤上,隔夜培養並計算菌落數;將獲得之菌落數乘以稀釋倍數,並可獲得總生菌數(CFUs/mL),並與對照組進行比對,以獲得最小抑菌濃度。本實驗目的為測試杭荊芥萃取物對皮屑芽孢菌(Malassezia furfur)BCRC22243的最小抑菌濃度。參閱見表二,第一萃取物具有濃度最低之最小抑菌濃度,表示第一萃取物抑制皮屑芽孢菌生長的效果最佳,其餘萃取物抑制皮屑芽孢菌生長能力高低,依序為乙醇初萃物>第二萃取物>第三、第四萃取物。
實驗四、杭荊芥萃取物對頭皮屑相關微生物之抑菌率
以濃度100μg/mL之第一萃取物,測試對於頭皮屑相關微生物生長的影響,這些微生物包含皮屑芽孢菌(Malassezia furfur)BCRC22243、黑麴黴(Aspergillus niger)BCRC30130、白色念珠菌(Candida albicans)BCRC20511與毛髮癬菌(Trichophyton mentagrophytes)BCRC32066。取200μL培養12~24小時之菌液放置入96孔盤,先測量其吸光值以推測原菌液中可能之菌落數量;取180μL、以培養基稀釋至菌量為105~107CFUs/mL的稀釋菌液置入96孔盤中,再加入20μL之純水(對照組)、或濃度為100μg/mL的第一萃取物(實驗組)進行共同培養;皮屑芽孢菌與毛髮癬菌的培養條件為30℃、培養3-4天;黑麴黴與白色念珠菌的培養條件為25℃、培養3-4天。將菌液培養後,進行連續稀釋並塗抹至洋菜膠培養盤上,培養後再計算菌落數;將獲得之菌落數乘以稀釋倍數,並可獲得總生菌數(CFUs/mL)。將實驗組的總生菌數與對照組的總生菌數進行計算,以獲得抑菌率。抑菌率的計算公式如下:抑菌率(%)=[(對照組總生菌數-實驗組總生菌數)/對照組總生菌數]X 100%
參閱表三與第二圖,顯示第一萃取物對於皮屑芽孢菌的抑菌率最高,具有89.07%之抑菌率,對白色念珠菌的抑菌率則為30.73%,然而第一萃取物無法抑制黑麴黴與毛髮癬菌生長。
實驗五、杭荊芥萃取物對環境微生物之抑菌率
以濃度100μg/mL之第一萃取物,測試其對環境中常見微生物之抑菌率,環境常見微生物包含金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)BCRC12657、大腸桿菌(Escherichia coli)BCRC10675、仙人掌桿菌(Bacillus cereus)BCRC10603、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)BCRC10944與沙門氏桿菌(Salmonella choleraesuis)BCRC10744。測試步驟與實驗四相同,其中金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌與之培養條件為37℃、培養18~24小時;仙人掌桿菌之培養條件為30℃、培養18~24小時。
如表四與第三圖,第一萃取物對金黃色葡萄球菌的抑菌率為74.33%、綠膿桿菌的菌率約58.93%、大腸桿菌的抑菌率為38.82%以及沙門氏桿菌的抑菌率為20.86%;然而第一萃取物無法抑制仙人掌桿菌的生長。
實驗六、杭荊芥萃取物抗氧化能力測試
DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)是一種穩定的自由基,在波長517nm有最大吸光值;當抗氧化物存在時,DPPH會與抗氧化物形成電子配對,呈現的顏色會由藍紫轉為淡黃色,且改變其吸收波長517nm之能力,故藉由517nm吸光值的變化,即可換算出受試物清除自由基的能力。將純水(對照組)或不同濃度的杭荊芥萃取物(實驗組),加入新鮮配置的100μM DPPH乙醇溶液,混勻之後於避光的環境下,37℃作用30分鐘,接著以分光光度計偵測波長517nm之吸光值,並製作出檢量線以算出自由基抑制率為50%之杭荊芥萃取物濃度(IC50),抑制率公式如下:DPPH抑制率(%)=[(對照組吸光值-實驗組吸光值)/對照組吸光值]X 100%
表五為本案第一~第四萃取物清除DPPH自由基之IC50,其中維生素E為陽性對照組(positive control),IC50越低者,代表其清除自由基能力越佳;結果顯示第一萃取物具有最佳的清除DPPH自由基能力,而第二萃取物清除DPPH自由基的能力最差。
實驗七、杭荊芥萃取物抑制發炎反應
發炎反應發生時,免疫細胞會產生大量的一氧化氮(NO),進而造成細胞的損傷。本實驗以小鼠中樞神經系統的防禦免疫細胞,小鼠微膠細胞(microglia),BV-2細胞為實驗模型,檢測杭荊芥萃取物對於發炎反應的影響。
細胞內生成的一氧化氮(NO)會氧化成亞硝酸根(NO2 -)與硝酸根(NO3 -),透過量測亞硝酸根(NO2 -)的含量便可以間接測定NO的生成量。Griess試劑會與亞硝酸根(NO2 -)反應並形成紅色溶液,且在波長550nm有最大吸收峰,若波長550nm吸光值越高,表示細胞內有越多亞硝酸根(NO2 -)。實驗步驟為:將固定量BV-2細胞以體積100μL置於96孔培養盤中,分別加入1μ之純水(對照組)、不同濃度(25、50、75與100μg/mL)的第一萃取物(實驗組)以及硫酸多黏菌素B(polymyxin B sulfate,PMB,陽性對照組)後,於37℃、5%二氧化碳(CO2)的環境下反應30分鐘;接著加入適量之脂多醣(lipopolysaccharide,LPS)共同培養20小時。將培養上清液吸取至新的96孔盤中,加入等體積的Griess試劑並混合均勻,以分光光度計偵測波長550nm之吸光值。
請參見表六與第四圖,對照組之NO含量為4.39±0.28μM;而細胞單獨加入LPS後,細胞內NO含量顯著上升(31.0±2.06μM,p<0.05);當BV-2細胞同時處理LPS與第一萃取物時,細胞內的NO含量會隨著第一萃取物的濃度增加而有下降的趨勢,表示第一萃
取物具有抑制發炎反應的功效,其中又以使用劑量為100μg/mL的組別之抑制發炎功效最佳。
實驗八、杭荊芥萃取物細胞毒性測試
MTT細胞存活測試是利用細胞代謝活性的高低,作為細胞存活率高低的依據,其原理為:活細胞的粒線體酵素能夠將3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide試劑(簡稱MTT試劑)還原成紫色結晶物(formazan),以溶劑將紫色結晶物溶解並偵測其吸光值,便可以推知細胞代謝活性高低,並將其作為細胞存活率高低的指標;當紫色結晶越多,吸光值越高,表示存活的細胞數越多。
將固定量之BV-2細胞,以體積100μL置於96孔培養盤中,加入1μ之純水(對照組)、不同濃度(25、50、75與100μg/mL)的第一萃取物(實驗組)以及硫酸多黏菌素B(PMB,陽性對照組),於37℃、5%二氧化碳(CO2)的環境下反應30分鐘,再加入適量之LPS後共同培養20小時;去除培養基並加入MTT試劑(配置於1倍PBS緩衝液
中),並於37℃、5%二氧化碳(CO2)的環境下反應3小時。去除上清液,加入100μL二甲基亞碸溶劑(dimethyl sulfoxide,DMSO)以溶解紫色結晶,震盪均勻後測量波長550nm之吸光值。將吸光值與對照組(純水)組進行比對,以計算出細胞存活率,計算公式如下:細胞存活率(%)=(實驗組吸光值/對照組吸光值)X 100%
第五圖為BV-2細胞的存活率結果,結果顯示單獨加入LPS的細胞存活率與對照組相比,僅為對照組之74.52±2.21%,而加入25~100μg/mL的第一萃取物後,會使BV-2細胞存活率回復至80%以上,表示第一萃取物的確可以減緩細胞因為發炎反應而損傷或死亡之情形。
由上述之實施說明可知,本發明與現有技術相較之下,本發明具有以下優點:
1.本發明之杭荊芥萃取物具有優秀的抑制皮屑芽孢菌能力,其中第一萃取物的最小抑菌濃度最低為0.6μg/mL,且抑制皮屑芽孢菌的抑菌率可高達到89.07%。
2.本發明之杭荊芥萃取物可進一步抑制白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌以及沙門氏桿菌的生長,可作為一種多功效的抗菌物質。
3.本發明之杭荊芥萃取物亦具有抗氧化之功效,可有效清除自由基,且能夠透過抑制NO生成,達到抗發炎之功效,並避免細胞因過度發炎反應而死亡。
綜上所述,本發明杭荊芥萃取物及其用於製備抑制皮屑芽孢菌組成物之用途,的確能藉由上述所揭露之實施例,達到所預期之使用功效,且本發明亦未曾公開於申請前,誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請,懇請惠予審查,並賜准專利,則實感德便。
惟,上述所揭之說明,僅為本發明之較佳實施例,非為限定本發明之保護範圍;其;大凡熟悉該項技藝之人士,其所依本發明之特徵範疇,所作之其它等效變化或修飾,皆應視為不脫離本發明之設計範疇。
Claims (8)
- 一種杭荊芥(Schizonepeta tenuifolia Briq.)萃取物於製備抑制白色念珠菌(Candida albicans)生長之醫藥組成物之用途,其係以一有效劑量之該杭荊芥萃取物施予一所需個體,以達到抑制白色念珠菌生長之用途,其中該杭荊芥萃取物係藉由下列步驟製得:步驟一:以一乙醇萃取一杭荊芥材料,以獲得一乙醇粗萃物;步驟二:以一體積比2:1之乙酸乙酯/水溶液萃取該乙醇粗萃物,以獲得一乙酸乙酯相與一第一水相;以及步驟三:以一體積比1:1之甲醇/正己烷溶液萃取該乙酸乙酯相,以獲得一甲醇相與一正己烷相,該甲醇相包含一第一萃取物,且該杭荊芥萃取物為該第一萃取物。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其中該第一萃取物之白色念珠菌抑菌率係為30.73%。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其中該有效劑量係100μg/ml。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其中該第一萃取物係進一步抑制皮屑芽孢菌生長,且對皮屑芽孢菌之最小抑菌濃度係為0.6μg/ml。
- 如申請專利範圍第4項所述之用途,其中該第一萃取物抑制皮屑芽孢菌生長之抑菌率係為89.07%。
- 如申請專利範圍第1項或第4項所述之用途,其中該第一萃取物係進一步抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、綠膿桿菌 (Pseudomonas aeruginosa)、大腸桿菌(Escherichia coli)與腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)生長。
- 如申請專利範圍第1項或第4項所述之用途,其中該第一萃取物係進一步具有抗氧化之功效,其係藉由清除自由基,以達到抗氧化之功效。
- 如申請專利範圍第1項或第4項所述之用途,其中該第一萃取物係進一步具有抗發炎之功效,其係藉由抑制一氧化氮(NO)之產生,以達到抗發炎之功效。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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TWI679017B (zh) * | 2018-09-18 | 2019-12-11 | 嘉藥學校財團法人嘉南藥理大學 | 植物萃取物用於製備抑制白色念珠菌生物膜組成物之用途 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
TW201817439A (zh) | 2018-05-16 |
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