TWI609183B - 用於評估多形性膠質母細胞瘤患者適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗爲基礎的免疫治療之方法及預測多形性膠質母細胞瘤患者經樹突狀細胞腫瘤疫苗治療後的存活率之方法 - Google Patents

用於評估多形性膠質母細胞瘤患者適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗爲基礎的免疫治療之方法及預測多形性膠質母細胞瘤患者經樹突狀細胞腫瘤疫苗治療後的存活率之方法 Download PDF

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Description

用於評估多形性膠質母細胞瘤患者 適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療之方法及預測多形性膠質母細胞瘤患者經樹突狀細胞腫瘤疫苗治療後的存活率之方法
本發明係關於一種用於評估癌症患者適用以免疫治療之方法，以及預測癌症患者經治療後的存活率之方法，特別是一種用於評估多形性膠質母細胞瘤患者適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療之方法以及預測多形性膠質母細胞瘤患者經治療後的存活率之方法。
多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)是神經膠質瘤(glioma)中的星狀細胞瘤(astrocytoma)，在WHO分級中屬於第IV級的星形細胞瘤，為最常見惡性程度最高的原發性腦腫瘤。
傳統治療多形性膠質母細胞瘤的方法為手術、放射療法和化療，但因多形性膠質母細胞瘤的浸潤性非常高，所謂「浸潤性」係因大腦中的膠質細胞為神經系統中的組成單位之一，提供支持、供給營養、維持環境恆定及提供絕緣等功能，故神經膠質細胞會緊緊包覆住神經軸突。由於軸突很長，如果神經膠質細胞發生癌變，癌細胞會順著軸突蔓延至遠方。因手術無法切除癌細胞遙遠浸潤部分，所以術後容易造成殘留，術後需再輔以化學及放射治療，但又因存在具放射線抗性和化學抗性的癌幹細胞，治療後復發率相當高。
近年來，在癌症的診斷治療上，除了一般的檢查以及傳統的臨床分期之外，某些生物標記(biomarker)亦已被使用於癌症的診斷、決定輔助治療方法或預測患者的預後情形。例如在乳癌的診斷治療上，已發展以動情素接受體(estrogen receptor,ER)和表皮生長因子受體2(epidermal growth factor receptor2,HER2)為生物標記進行治療藥物的選用。因多形性膠質母細胞瘤惡性程度高、治療後復發率高以及致死率高，更需發展與多形性膠質母細胞瘤治療方法反應率或預測患者治療後存活率相關聯的方法，使醫師能在臨床上擬定更適合個別患者的治療計畫，以提高治療後的存活率。
有鑑於此，本發明之一目的係提供一種用於評估多形性膠質母細胞瘤患者是否適用以樹突狀細胞腫瘤疫 苗為基礎的免疫治療之方法，藉由檢測多形性膠質母細胞瘤患者的腫瘤組織或周邊血液單核細胞中特定生物標記之表現量，可快速且客觀的使醫師於臨床上可識別出適用於以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療的多形性膠質母細胞瘤患者，排除不太可能對以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療有成效的病患，以確保有效地分配及利用醫療資源。
本發明之另一目的係提供一種預測多形性膠質母細胞瘤患者經治療後的存活率之方法。藉由檢測多形性膠質母細胞瘤患者的腫瘤組織或周邊血液單核細胞中特定生物標記之表現量，可以直接預測多形性膠質母細胞瘤患者經樹突狀細胞腫瘤疫苗治療後的存活率，使醫師於臨床上判斷患者是否需再配合其他的藥物或治療計畫，以拉長其整體存活期或無疾病存活期。
依據本發明之一態樣是在提供一種用於評估多形性膠質母細胞瘤患者適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療之方法，其包含取樣步驟、檢測步驟和比對步驟。取樣步驟係自多形性膠質母細胞瘤患者取得檢體樣本，檢測步驟係測定檢體樣本中一生物標記之表現量並計算基礎數值，其中生物標記係選自PD-1蛋白、PD-L1蛋白以及CD8蛋白所組成之群組。比對步驟係將基礎數值與預設閾值進行比較，當基礎數值低於預設閾值時，判定多形性膠質母細胞瘤患者適用於以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療。
依據前述之用於評估多形性膠質母細胞瘤患者 適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療之方法，其中檢體樣本可以為腫瘤組織或血液。
依據前述之用於評估多形性膠質母細胞瘤患者適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療之方法，其中腫瘤組織可以為組織切片或組織微陣列。
依據前述之用於評估多形性膠質母細胞瘤患者適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療之方法，其中檢測步驟可以利用免疫組織化學染色法測定生物標記之表現量。
依據前述之用於評估多形性膠質母細胞瘤患者適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療之方法，其中檢測步驟更包含可以利用組織化學評分法或影像處理法計算訊號值，而影像處理法可以利用RGB(red/green/blue)色彩模型、CMYK(cyan/magenta/yellow/key)色彩模型或HSI(hue/saturation/intensity)色彩模型分析檢體樣本之影像。
依據前述之用於評估多形性膠質母細胞瘤患者適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療之方法，其中檢測步驟更包含將PD-1蛋白之訊號值除以CD8蛋白之訊號值以獲得基礎數值。
本發明之另一態樣是在提供一種預測多形性膠質母細胞瘤患者經治療後的存活率之方法，其包含取樣步驟、檢測步驟以及比對步驟。取樣步驟係自多形性膠質母細胞瘤患者取得檢體樣本。檢測步驟係測定檢體樣本中一生物 標記之表現量並計算基礎數值，其中生物標記係選自PD-1蛋白、PD-L1蛋白以及CD8蛋白所組成之群組。比對步驟係將基礎數值與預設閾值進行比較，當基礎數值低於預設閾值時，表示多形性膠質母細胞瘤患者經治療後具有較佳之存活率。
依據前述之預測多形性膠質母細胞瘤患者經治療後的存活率之方法，其中治療可以選自手術治療、放射線治療、化學治療、免疫治療或前述任意之組合。
依據前述之預測多形性膠質母細胞瘤患者經治療後的存活率之方法，其中免疫治療可以為以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療。
依據前述之預測多形性膠質母細胞瘤患者經治療後的存活率之方法，其中檢體樣本可以為腫瘤組織或血液。
依據前述之預測多形性膠質母細胞瘤患者經治療後的存活率之方法，其中腫瘤組織可以為組織切片或組織微陣列。
依據前述之預測多形性膠質母細胞瘤患者經治療後的存活率之方法，其中檢測步驟可以利用免疫組織化學染色法測定生物標記之表現量。
依據前述之預測多形性膠質母細胞瘤患者經治療後的存活率之方法，其中檢測步驟更包含利用組織化學評分法或影像處理法計算訊號值，而影像處理法可以利用RGB色彩模型、CMYK色彩模型或HSI色彩模型分析組織 切片之影像。
依據前述之預測多形性膠質母細胞瘤患者經治療後的存活率之方法，其中檢測步驟更包含將PD-1蛋白之訊號值除以CD8蛋白之訊號值以獲得基礎數值。
上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
100‧‧‧用於評估多形性膠質母細胞瘤患者適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療之方法
110‧‧‧步驟
120‧‧‧步驟
130‧‧‧步驟
200‧‧‧預測多形性膠質母細胞瘤患者經治療後的存活率之方法
210‧‧‧步驟
220‧‧‧步驟
230‧‧‧步驟
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖為依照本發明一實施方式之用於評估多形性膠質母細胞瘤患者適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療之方法的步驟流程圖；第2圖為依照本發明一實施方式之預測多形性膠質母細胞瘤患者經治療後的存活率之方法的步驟流程圖；第3圖為以免疫組織化學染色法測定的顯微照片圖，(A)部份為PD-1蛋白，(B)部份為PD-L1蛋白，(C)部分為CD8蛋白；第4圖為PD-L1蛋白表現量強度的顯微照片圖，(A)部份為正常腦組織之低PD-L1表現量的顯微照片圖，(B)部分為多形性膠質母細胞瘤患者之腦組織之高PD-L1表現量的顯微照片圖，(C)部分為經色彩轉換後正常腦組織之低 PD-L1表現量的顯微照片圖，(D)部份為經色彩轉換後多形性膠質母細胞瘤患者腦組織之高PD-L1表現量的顯微照片圖；第5圖為依PD-L1蛋白表現量為基礎將多形性膠質母細胞瘤患者分群的整體存活曲線圖，(A)部份為未接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者的整體存活曲線，(B)部份為接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者的整體存活曲線；第6圖為依PD-L1蛋白表現量為基礎將多形性膠質母細胞瘤患者分群的無疾病存活曲線圖，(A)部份為未接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者的無疾病存活曲線，(B)部份為接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者的無疾病存活曲線；第7圖為全部多形性膠質母細胞瘤患者的存活曲線圖，(A)部份為整體存活曲線圖，(B)部份為無疾病存活曲線；第8圖為依CD8蛋白表現量為基礎，將接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者分群的存活曲線圖，(A)部份為整體存活曲線，(B)部份為無疾病存活曲線；第9圖為依PD-1蛋白表現量為基礎，將接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者分群的存活曲線圖，(A)部份為整體存活曲線，(B)部份為無疾病存活曲線；第10圖為依PD-1蛋白表現量除以CD8蛋白表現量為基礎，將接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞 瘤患者分群的存活曲線圖，(A)部份為整體存活曲線，(B)部份為無疾病存活曲線；第11圖為依PD-1蛋白表現量及PD-L1蛋白表現量為基礎，將接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者分群的存活曲線圖，(A)部份為整體存活曲線，(B)部份為無疾病存活曲線；第12圖為PD-1蛋白和整體存活期的相關圖；第13圖為PD-1蛋白和無疾病存活期的相關圖；第14圖為PD-1蛋白表現量除以CD8蛋白表現量和整體存活期的相關圖；第15圖為PD-1蛋白表現量除以CD8蛋白表現量和無疾病存活期的相關圖；第16圖為周邊血液單核細胞的PD-1蛋白表現量除以CD8蛋白表現量和腫瘤浸潤淋巴細胞的PD-1蛋白表現量除以CD8蛋白表現量的相關圖；第17圖為依周邊血液單核細胞的PD-1蛋白表現量為基礎，將接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者分群的存活曲線圖，(A)部份為整體存活曲線，(B)部份為無疾病存活曲線；以及第18圖為依周邊血液單核細胞的PD-1蛋白表現量除以CD8蛋白表現量為基礎，將接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者分群的存活曲線圖，(A)部份為整體存活曲線，(B)部份為無疾病存活曲線。
本說明書揭露內容提出一種用於評估多形性膠質母細胞瘤患者是否適用以免疫治療之方法，以及預測多形性膠質母細胞瘤患者經治療後的存活率之方法，係利用組織切片染色方式測定多形性膠質母細胞瘤患者檢體樣本之一特定生物標記之表現量，並以組織化學評分法或影像處理法進行半定量分析，用於評估多形性膠質母細胞瘤患者是否適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎免疫治療，以及預測多形性膠質母細胞瘤患者經治療後的存活率。以下為本說明書中所用特定名詞的說明： 前述「生物標記(biomarker)」一詞係指可作為生物性狀態指標的物質，其可經由客觀地測量或評估做為正常生物機轉、致病機轉或治療中反應的指標。
前述「PD-1(Program death-1，細胞程式死亡受體-1)」也稱為表面抗原分化簇279(cluster of differentiation 279，CD279)，是人類體內由PDCD1基因編碼的一種蛋白質。PD-1一種隸屬於免疫球蛋白超家族的細胞表面受體，並表達於T細胞和原始B細胞上。
前述「PD-L1(programmed cell death ligand 1，細胞程式死亡-配體1)」也稱為表面抗原分化簇274(cluster of differentiation 274，CD274)或B7同源體1(B7 homolog 1，B7-H1)，是人類體內由CD274基因編碼的一種蛋白質。PD-L1是大小為40kDa的第一型跨膜蛋白，推測PD-L1在懷孕、組織移植、自體免疫疾病或 其它疾病如肝炎等特殊情形下，與免疫系統的抑制有關。可由免疫抑制性受體傳遞，以傳遞負向調控訊息的方式，抑制部分免疫反應的發生，並維持周邊系統的免疫容忍性，PD-1即為免疫抑制性受體之一。在正常情形下，免疫系統會對聚集在淋巴結或脾臟的外來抗原產生反應，促發具抗原特異性的細胞毒殺性T細胞(CD8+ T cell)增生。而PD-L1與PD-1結合，可以傳導抑制性的信號，以減低淋巴結CD8+ T細胞的增生，且PD-1還可以藉由調節Bcl-2基因，控制淋巴結中抗原特異性T細胞的聚積。
前述「CD8(cluster of differentiation 8，表面抗原分化簇8)」是一種跨膜糖蛋白，CD8為細胞毒殺型T細胞的膜上標記，其為T細胞受體(T cell receptor，TCR)的共受體，與主要組織相容性複合體(Major Histocompatibility Complex,MHC)結合，並且特異性針對第I型MHC蛋白。
請參照第1圖，為依照本發明一實施方式之用於評估多形性膠質母細胞瘤患者適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療之方法100的步驟流程圖。在第1圖中，用於評估多形性膠質母細胞瘤患者適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療之方法100包含步驟110、步驟120和步驟130。
步驟110是進行一取樣步驟，係自多形性膠質母細胞瘤患者取得檢體樣本，其中檢體樣本可以為腫瘤組織或血液，而腫瘤組織可以為冷凍組織切片、組織蠟塊切片或 組織微陣列。
步驟120是進行一檢測步驟，係測定檢體樣本中一生物標記之表現量並計算基礎數值。更進一步地說，檢測步驟係利用免疫組織化學染色法測定檢體樣本的PD-1蛋白、PD-L1蛋白之表現量以及PD-1蛋白相對於CD8蛋白之表現量，再以組織化學評分法或影像處理法進行半定量分析以計算訊號值。當計算PD-1蛋白之表現量和PD-L1蛋白之表現量時，前述之訊號值即為基礎數值，而在計算PD-1蛋白相對於CD8蛋白之表現量時，基礎數值為將PD-1蛋白表現量之訊號值除以CD8蛋白表現量之訊號值。影像處理法可以為以RGB(red/green/blue)色彩模型、CMYK(cyan/magenta/yellow/key)色彩模型或HSI(hue/saturation/intensity)色彩模型對檢體樣本之影像做分析。
步驟130是進行一比對步驟，係將基礎數值與預設閾值進行比較，當基礎數值低於預設閾值時，判定多形性膠質母細胞瘤患者適用於以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療。其中預設閾值會隨著檢測步驟中計算基礎數值的方法不同而作調整。
請再參照第2圖，為依照本發明一實施方式之預測多形性膠質母細胞瘤患者經治療後的存活率之方法200的步驟流程圖。在第2圖中，預測多形性膠質母細胞瘤患者經治療後的存活率之方法200包含步驟210、步驟220和步驟230。
步驟210是進行一取樣步驟，係自多形性膠質母細胞瘤患者取得檢體樣本，其中檢體樣本可以為腫瘤組織或血液，而腫瘤組織可以為冷凍組織切片、組織蠟塊切片或組織微陣列。
步驟220是進行一檢測步驟，係測定檢體樣本中一生物標記之表現量並計算基礎數值。更進一步地說，檢測步驟係利用免疫組織化學染色法測定檢體樣本的PD-1蛋白和PD-L1蛋白之表現量，以及PD-1蛋白相對於CD8蛋白之表現量，再以組織化學評分法或影像處理法進行半定量分析以計算訊號值。當計算PD-1蛋白之表現量和PD-L1蛋白之表現量時，前述之訊號值即為基礎數值，而在計算PD-1蛋白相對於CD8蛋白之表現量時，基礎數值為將PD-1蛋白表現量之訊號值除以CD8蛋白表現量之訊號值。而影像處理法可以為以RGB色彩模型、CMYK色彩模型或HSI色彩模型對檢體樣本之影像做分析。
步驟230是進行一比對步驟，係將基礎數值與預設閾值進行比較，當基礎數值低於預設閾值時，表示多形性膠質母細胞瘤患者經治療後具有較佳之存活率，其中預設閾值會隨著檢測步驟中計算基礎數值的方法不同而作調整。前述治療可以選自手術治療、放射線治療、化學治療、免疫治療或前述任意之組合。較佳地，免疫治療可以為以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療。
茲以下列具體試驗例進一步示範說明本發明，用以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀 的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些試驗例視為對本發明範圍的限制，但用於說明如何實施本發明的材料及方法。
<試驗例> 一、多形性膠質母細胞瘤患者
此臨床試驗計劃係經中國醫藥大學暨附設醫院研究倫理委員會(China Medical University & Hospital Research Ethics Committee)核准之臨床試驗計劃，受試者為多形性膠質母細胞瘤患者，本臨床試驗計畫係對患者的情況進行追蹤，追蹤時間長達十年。
共有35名多形性膠質母細胞瘤患者在2005-2014年間參與本臨床試驗計劃，其年齡分布範圍為27至78歲(平均為50.97歲)。請參照下表一，為多形性膠質母細胞瘤患者的臨床特徵，變項可分為性別、年紀以及治療方式，其中治療方式又可再區分為放射線治療、化學治療、手術治療、合併化學及放射線治療以及免疫治療。若以性別為變項，35位多形性膠質母細胞瘤患者中有17位為男性，18位為女性；若以年紀為變項，其中8位患者的年紀大於等於60歲，27位患者的年紀小於60歲。而在治療方式的部分，35位多形性膠質母細胞瘤患者中有26位接受過放射線治療，23位接受過化學治療，10位接受過手術治療，14位接受過合併化學及放射線治療，21位接受過免疫治療。
二、免疫組織化學染色法測定生物標記之蛋白質表現量 1.檢體樣本為腫瘤組織
實驗上，以習知的病理切片方式取得前述多形性膠質母細胞瘤患者的腫瘤組織做為檢體樣本，而檢體樣本可為冷凍組織切片、蠟塊組織切片或組織微陣列，之後以免疫組織化學染色法(immunohistochemistry,IHC)檢測所得檢體樣本中的生物標記PD-1、PD-L1和CD8的表現。
免疫組織化學染色法之步驟如下，若為蠟塊組織，首先將厚度為1-2μm之石蠟組織切片樣本置於經有機矽烷塗覆之玻片上，烘烤隔夜(50~55℃)，將石蠟溶解並加強玻片與組織檢體的附著力，以利後續免疫組織化學染色進行。之後先進行脫蠟，將組織及細胞間隙中的石蠟去除後，再進行免疫組織化學染色。若為冷凍切片組織，則將厚度2至4μm之冷凍切片直接進行免疫組織化學染色。免疫組織化學染色法使用的一級抗體分別為PD-1(Leica)、PD-L1(Abcam)和CD8(Leica)，稀釋倍數分別為1：200、1：100和1：100，組織切片先以EDTA緩衝溶液於100℃反應20分鐘進行抗原修復，並於室溫下與一級抗體反應1小時。再利用DAB二級抗體(檢測PD-L1)或AP二級抗體(檢測PD-1和CD8)檢測染色結果。所有樣本在檢測過後再以蘇木素(Hematoxylin)進行複染(counterstain)。
請參照第3圖，第3圖為以免疫組織化學染色法測定的顯微照片圖，其中(A)部份為PD-1蛋白，(B)部份為PD-L1蛋白，(C)部分為CD8蛋白，顯微照片的放大倍率皆為400倍。由第3圖可見，多形性膠質母細胞瘤患者之腦組織切片染色後，細胞核的部份呈現藍色，而有表達PD-L1的部分則會呈現黑褐色，有表達PD-1和CD8的部分會呈現紅色。
2.檢體樣本為血液
實驗上，對前述多形性膠質母細胞瘤患者進行抽血以取得其血液為檢體樣本，並將血液檢體樣本作成細胞 蠟塊(cell block)，之後以免疫組織化學染色法檢測所得檢體樣本中的生物標記PD-1和CD8的表現。
細胞蠟塊的製作之步驟如下，將患者的血液檢體樣本在室溫下放置於微量離心管中，以福馬林固定1小時。再將血液檢體樣本以離心力15,000rpm離心30秒後，將上清液小心移除，保留福馬林固定後胞沉澱。於室溫下以最小體積的3%(w/v)超低膠凝溫度的瓊脂溶液再次懸浮細胞沉澱，再以離心力15,000rpm離心30秒。將上清液小心移除，所得的瓊脂細胞懸浮液在-20℃下凝固10至20分鐘。將凝固後的瓊脂細胞轉移到微量離心管的蓋子上，再將裝有瓊脂細胞的蓋子以3%(w/v)標準瓊脂溶液填滿。將所得的瓊脂凝膠塊從蓋子上取下，再以石蠟包埋進行組織處理以獲得細胞蠟塊。
將前述細胞蠟塊進行免疫組織化學染色法，免疫組織化學染色法使用的一級抗體分別為PD-1(Leica)和CD8(Leica)，稀釋倍數分別為1：200和1：100，細胞蠟塊先以EDTA緩衝溶液於100℃反應20分鐘進行抗原修復，並於室溫下與一級抗體反應1小時。再利用AP二級抗體檢測染色結果。所有樣本在檢測過後再以蘇木素進行複染。
三、結果分析 1.多形性膠質母細胞瘤組織切片診斷
組織病理學中多形性膠質母細胞瘤的診斷，通常是依據組織的樣式，而非鑑定特定的細胞類型。其中高度 間變性的神經膠質細胞、有絲分裂活性以及血管增殖和/或壞死的存在，是診斷多形性膠質母細胞瘤所必需的。為了診斷多形性膠質母細胞瘤，定義了6種不同的細胞類型，分別為小間變細胞(small anaplastic cell,SAC)、小原纖細胞(small fibrillated cell,SFC)、原纖化星形膠質細胞(fibrillated astrocyte,FA)、多形性星形細胞(pleomorphic astrocyte,PA)、原漿性星形膠質細胞(gemistocytic astrocyte,GA)和大多形性細胞(large bizarre cell,LBC)。並且在免疫組織化學染色切片中，可觀察到2種PD-L1染色的組織樣式，分別為纖維狀樣式和膜狀樣式。
請參照下表二，為本臨床試驗計畫中35位多形性膠質母細胞瘤患者免疫組織化學染色切片的診斷結果，在進行免疫組織化學染色切片診斷時，病理醫師係在未知切片原診斷的情況下進行閱片。如表二之診斷結果所示，35位參與本臨床試驗計劃的患者確實皆為多形性膠質母細胞瘤患者。
2.半定量分析
前述35位多形性膠質母細胞瘤患者免疫組織化學染色檢測的結果，可依據組織化學評分法或影像處理法進一步進行半定量分析。
2.1 組織化學評分法 2.1.1 PD-L1
組織化學評分法係於25HPF(High power field，高倍數視野)下(顯微放大倍率為400倍)，依多形性膠質母細胞瘤細胞膜的PD-L1蛋白染色強度，給予0、1或2的評分。評分的原始具體標準如下：0表示沒有任何腫瘤細胞染上顏色，1表示腫瘤細胞有薄弱或中等程度且完整的細胞膜或細胞質染色，2表示腫瘤細胞有強而完整的細胞膜或 細胞質染色。並計算腫瘤細胞被染色的百分比(染上顏色的細胞數/全部細胞數×100%)。而組織化學評分法可依下述公式得到一訊號值(HSCORE)：HSCORE=Σ(i×Pi).....................................公式1，其中i表示生物標記的染色強度(0、1或2)，Pi表示腫瘤細胞被染色的百分比(0%~100%)，可得訊號值介於0至200。而於組織化學評分法中預設閾值為80，當以組織化學評分法計算出的訊號值大於或等於80時，定義為高PD-L1表現量。當以組織化學評分法計算出的訊號值小於80時，定義為低PD-L1表現量。
2.1.2 PD-1和CD8
PD-1和CD8之組織化學評分法係於25HPF下(顯微放大倍率為400倍)，計算染上顏色的細胞數，並將25HPF所得到的細胞數加總後得到一訊號值，而將所有接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者(n=21)的免疫化學組織切片經組織化學評分法計算後，可得一中位數，此中位數即為預設閾值，當以組織化學評分法計算出的訊號值大於或等於中位數時，定義為高生物標記表現量。當以組織化學評分法計算出的訊號值小於中位數時，定義為低生物標記表現量。
請參照下表三，分別為以組織化學評分法，計算所有接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者表現CD8蛋白和表現PD-1蛋白之細胞數，以及將PD-1蛋白表現量除以CD8蛋白表現量(PD-1/CD8比)之統 計，可見CD8的中位數為231，PD-1的中位數為26，PD-1/CD8比的中位數為0.13，故當以組織化學評分法計算出的CD8蛋白之訊號值大於或等於231時，定義為高CD8表現量。當以組織化學評分法計算出的訊號值小於231時，定義為低CD8表現量。當以組織化學評分法計算出的PD-1蛋白之訊號值大於或等於26時，定義為高PD-1表現量。當以組織化學評分法計算出的訊號值小於26時，定義為低PD-1表現量。當以組織化學評分法計算出的PD-1/CD8比大於或等於0.13時，定義為高PD-1/CD8比。當以組織化學評分法計算出的訊號值小於0.13時，定義為低PD-1/CD8比。
2.2 影像處理法
雖可以利用組織化學評分法定義PD-L1表現量，但其係以人力進行影像分析工作，使得定義PD-L1表現量費時或因人為判讀有誤差產生，細胞的染色程度更不易量化，只能由人為主觀的判斷染色強度，故本發明中亦利用影像處理法進行PD-L1蛋白表現量的半定量，使定義高PD-L1表現量和低PD-L1表現量時更為客觀。
本試驗例係藉由RGB(red/green/blue)色彩模型將色彩空間轉換，於彩色的影像中強調所需之物體特 徵。實驗上，先在25HPF下(顯微放大倍率為400倍)擷取顯微影像，在計算染色強度時，將顯微影像由RGB數碼轉換為紅色頻道(red channel)，此時可得一RGB數值。而於影像處理法中預設閾值為25000，當以影像處理法計算出的RGB數值大於或等於25000時，定義為高PD-L1表現量。當以影像處理法計算出的RGB數值小於25000時，定義為低PD-L1表現量。影像本試驗例以RGB色彩模型為一例示，然需說明的是，前述RGB色彩模型僅為影像處理法之色彩模型之一實施方式，本發明並不限於此，亦可使用CMYK(cyan/magenta/yellow/key)色彩模型或HSI(hue/saturation/intensity)色彩模型進行影像處理。
請參照第4圖，為PD-L1蛋白表現量強度的顯微照片圖，(A)部份為正常腦組織之低PD-L1表現量的顯微照片圖，(B)部分為多形性膠質母細胞瘤患者腦組織之高PD-L1表現量的顯微照片圖，(C)部分為經色彩轉換後正常腦組織之低PD-L1表現量的顯微照片圖，(D)部份為經色彩轉換後多形性膠質母細胞瘤患者腦組織之高PD-L1表現量的顯微照片圖。其中綠色十字為細胞核的部份，其表示顯微照片中的細胞數，紅色表示細胞染上PD-L1的部分。由第4圖的結果顯示，(A)和(B)部份的顯微照片中計算出的細胞數為260個，RGB數值為3938，因訊號值小於25000，故被定義為低PD-L1表現量。(C)和(D)部份的顯微照片中計算出的細胞數為307個，RGB數值為75347，因訊號值大於25000，故被定義為高PD-L1表現量。
3.檢體樣本為腫瘤組織之統計分析 3.1 存活分析
依上述半定量方法將35位多形性膠質細胞瘤患者，依據生物標記的表現量分為高生物標記表現量和低生物標記表現量的患者，其中評估所使用的檢體樣本為患者之腫瘤組織。再進一步利用GraphPad PRISM 4.05(San Diego,CA,USA)以及SAS 9.01進行統計分析。以Kaplan Meier的方法計算存活期(survival)，並以對數等級檢定(log rank test)方法評估存活期之統計上的顯著性。在所有的統計分析中，p值小於0.05時，認為其具有顯著性。
存活分析(survival analysis)是各種癌症臨床試驗裡常見的統計分析方法，存活分析是處理時間變數的統計方法，其係處理從觀察開始至「事件(event)」發生所需「時間長度」的資料。在本試驗例中使用兩種時間變數評估指標，分別為整體存活期(Overall Survival,OS)和無疾病存活期(Disease Free Survival,DFS)。其中整體存活期的評估指標係將「死亡」定為事件，觀察受試者從進入臨床試驗到死亡的時間，而無疾病存活期的評估指標係將「腫瘤復發」定為事件，觀察受試者從進入臨床試驗到腫瘤復發的時間。
請參照第5圖至第11圖，第5圖為依PD-L1蛋白表現量為基礎將多形性膠質母細胞瘤患者分群的整體存活曲線圖，(A)部份為未接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者的整體存活曲線，(B)部份為接受樹突 狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者的整體存活曲線。第6圖依PD-L1蛋白表現量為基礎將多形性膠質母細胞瘤患者分群的無疾病存活曲線圖，(A)部份為未接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者的無疾病存活曲線，(B)部份為接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者的無疾病存活曲線。第7圖為全部多形性膠質母細胞瘤患者的存活曲線圖，(A)部份為整體存活曲線圖，(B)部份為無疾病存活曲線。第8圖為依CD8蛋白表現量為基礎，將接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者分群的存活曲線圖，(A)部份為整體存活曲線，(B)部份為無疾病存活曲線。第9圖為依PD-1蛋白表現量為基礎，將接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者分群的存活曲線圖，(A)部份為整體存活曲線，(B)部份為無疾病存活曲線。第10圖為依PD-1蛋白表現量除以CD8蛋白表現量為基礎，將接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者分群的存活曲線圖，(A)部份為整體存活曲線，(B)部份為無疾病存活曲線。第11圖為依PD-1蛋白表現量及PD-L1蛋白表現量為基礎，將接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者分群的存活曲線圖，(A)部份為整體存活曲線，(B)部份為無疾病存活曲線。其中未接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者的人數為14位，接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者的人數為21位，全部多形性膠質母細胞瘤患者的人數為35位，圖中出現的空心圓點是 標示設限資料發生的時間點。
由第5圖的結果顯示，不論是在接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者或未接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者，低PD-L1蛋白表現量患者，其整體存活時間較高PD-L1蛋白表現量患者還長。而以對數等級檢定方法評估，在未接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者組別中，低PD-L1蛋白表現量和高PD-L1蛋白表現量兩組的p值為0.184，而在接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者組別中，低PD-L1蛋白表現量和高PD-L1蛋白表現量兩組的p值為0.138。
由第6圖的結果顯示，不論是在接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者或未接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者，低PD-L1蛋白表現量患者相較高PD-L1蛋白表現量患者，其發生腫瘤復發的時間較長。而以對數等級檢定方法評估，在未接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者組別中，低PD-L1蛋白表現量和高PD-L1蛋白表現量兩組的p值為0.771。在接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者組別中，低PD-L1蛋白表現量和高PD-L1蛋白表現量兩組的p值為0.743。
在第7圖中共有4個組別，組別1為低PD-L1蛋白表現量且接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者，組別2為高PD-L1蛋白表現量且接受樹突狀細 胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者，組別3為低PD-L1蛋白表現量且未接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者，組別4為高PD-L1蛋白表現量且未接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者。由第7(A)圖的結果顯示，組別1和組別2有接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者，其整體存活時間較組別3和組別4未接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者還長，但不論是否接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療，低PD-L1蛋白表現量的多形性膠質母細胞瘤患者的整體存活時間皆較高PD-L1蛋白表現量的多形性膠質母細胞瘤患者還長。以對數等級檢定方法評估，4個組別的p值小於0.001，組別3和組別1兩組的p值小於0.001，組別4和組別2兩組的p值小於0.001，組別3和組別2兩組的p值小於0.001。
而由第7(B)圖的結果顯示，組別1和組別2有接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者，其無疾病存活時間皆較組別3和組別4未接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者還長，但不論是否接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療，低PD-L1蛋白表現量的多形性膠質母細胞瘤患者的無疾病存活時間皆較高PD-L1蛋白表現量的多形性膠質母細胞瘤患者還長。以對數等級檢定方法評估，4個組別的p值等於0.004，組別3和組別1兩組的p值等於0.016，組別4和組別2兩組的p值等於0.020，組別3和組別2兩組的p值等於0.048。
由第8圖的結果顯示，在接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者中，低CD8蛋白表現量和高CD8蛋白表現量的患者，不論在整體存活期或是無疾病存活期皆無差異，低CD8蛋白表現量和高CD8蛋白表現量兩組在整體存活期的p值為0.734，在無疾病存活期的p值為0.792。
由第9圖的結果顯示，在接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者中，低PD-1蛋白表現量和高PD-1蛋白表現量的患者，在整體存活期上具有顯著的差異，p值為0.004，而在無疾病存活期上也有差異，p值為0.146。
由第10圖的結果顯示，當以PD-1蛋白表現量除以CD8蛋白表現量(PD-1/CD8比)為基準時，在接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者中，低PD-1/CD8比的患者在整體生存期上顯著的長於高PD-1/CD8比的患者，p值為0.006。而在無疾病存活期上，低PD-1/CD8比的患者也長於高PD-1/CD8比的患者，p值為0.158。
另由第11圖來同時看PD-1蛋白表現量以及PD-L1蛋白表現量對於接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者的整體生存期和無疾病生存期的影響。在第11圖中共有4個組別，組別5為低PD-1蛋白表現量且低PD-L1蛋白表現量的患者，組別6為高PD-L1蛋白表現量且低PD-L1蛋白表現量的患者，組別7為低PD-1蛋白表現 量且高PD-L1蛋白表現量的患者，組別8為高PD-1蛋白表現量且高PD-L1蛋白表現量的患者。第11(A)圖的結果顯示，整體生存期最長的組別為低PD-1蛋白表現量且低PD-L1蛋白表現量的患者(組別5)。就PD-1的表現量來看，組別5和組別7低PD-L1蛋白表現量的患者，其整體存活時間較組別6和組別8高PD-L1蛋白表現量的患者還長。但就PD-L1的表現量來看，在低PD-L1蛋白表現量的組別中(組別5和組別6)，低PD-L1蛋白表現量且高PD-1蛋白表現量的組別6，其整體生存期反而短於高PD-L1蛋白表現量且低PD-1蛋白表現量的組別7，顯示接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者，PD-1蛋白的表現量較PD-L1蛋白的表現量更為重要。以對數等級檢定方法評估，4個組別的p值等於0.007，組別5和組別6兩組的p值等於0.046，組別5和組別7兩組的p值等於0.851，組別5和組別8兩組的p值等於0.018，組別6和組別7兩組的p值等於0.317，組別6和組別8兩組的p值等於0.142，組別7和組別8兩組的p值等於0.129。
第11(B)圖的結果顯示，無疾病生存期最長的組別為低PD-1蛋白表現量且低PD-L1蛋白表現量的患者(組別5)。但就無疾病生存期分析來看，各組之間的差異不大，雖組別5和組別7低PD-1蛋白表現量的患者，其無疾病存活時間較組別6和組別8高PD-1蛋白表現量的患者還長，但差異不大。以對數等級檢定方法評估，4個組別的p值等於0.341，組別5和組別6兩組的p值等於0.809，組別5和組 別7兩組的p值等於0.388，組別5和組別8兩組的p值等於0.274，組別6和組別7兩組的p值等於0.317，組別6和組別8兩組的p值等於0.330，組別7和組別8兩組的p值等於0.129。
由生存分析的結果顯示，不論是在接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者或接受其它治療的多形性膠質母細胞瘤患者，低PD-L1蛋白表現量的患者，其整體存活期和無疾病存活期皆較高PD-L1蛋白表現量的患者還長，且此差異在接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者上更為顯著。顯示PD-L1表現量低的多形性膠質母細胞瘤患者適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療，且其經治療後的存活率較佳。此外，在接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者中，低PD-1蛋白表現量的患者，其整體存活期和無疾病存活期皆較高PD-1蛋白表現量的患者還長，另低PD-1/CD8比的患者，其整體存活期和無疾病存活期亦較高PD-1/CD8比的患者長。顯示PD-1表現量低的多形性膠質母細胞瘤患者，或PD-1/CD8比低的多形性膠質母細胞瘤患者適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療，且其經治療後的存活率較佳，特別是經由以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療。
3.2 處理效應評估分析
然而利用對數等級檢定方法僅能判斷不同組別之間的差異是否顯著，但無法提供處理效應(treatment effect)的估計，本試驗例進一步利用Cox比例風險模型 (Cox proportional hazard model)評估處理效應。
請參照表四，表四為接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者的危險比(hazard ratio)估計及95%信賴區間。當危險比大於1時表示表現此生物標記的患者發生死亡事件的比率是大於未表現此生物標記的患者，當危險比大於1、p值小於0.05且95%信賴區間為小於1則顯示表現此生物標記達到統計上的顯著差異。由表四的結果可見，在統計上具有顯著意義的是PD-1在整體存活期上的影響，高PD-1蛋白表現量患者發生死亡事件的比率是低PD-1蛋白表現量患者的4.72倍，顯示PD-1蛋白表現量對於接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者的整體存活期具有重要的影響。
3.3 相關係數分析
本試驗例將進一步利用皮爾森相關係數(Pearson correlation coefficient)分別分析接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者的PD-1蛋白表現量與整體存活期的相關性、PD-1蛋白表現量與無疾病存活期的相關性、PD-1/CD8比與整體存活期的相關性以及 PD-1/CD8比與無疾病存活期的相關性。皮爾森相關係數是用以測量兩連續變數(x,y)之間直線關係的強弱，計算出的皮爾森相關係數(r)會介於-1到+1之間，當r大於0時，兩變數具正相關性，即隨著x增加，y也隨之遞增；當r小於0時，兩變數具負相關性，即隨著x增加，y卻遞減。而兩變數之間的相關程度則依|r|決定，當|r|約為1時，表示兩變數完全相關；|r|介於0.7~0.99時，表示兩變數高度相關；|r|介於0.4~0.69時，表示兩變數中度相關；|r|介於0.1~0.39時，表示兩變數低度相關；當|r|介於0.01~0.09時，表示兩變數接近無相關；而當|r|約=0，表示兩變數無相關。
請參照第12圖至第15圖及表五至表八，第12圖為PD-1蛋白和整體存活期的相關圖，表五為PD-1蛋白和整體存活期的相關係數。第13圖為PD-1蛋白和無疾病存活期的相關圖，表六為PD-1蛋白和無疾病存活期的相關係數。第14圖為PD-1/CD8比和整體存活期的相關圖，表七為PD-1/CD8比和整體存活期的相關係數。第15圖為PD-1/CD8比和無疾病存活期的相關圖，表八為PD-1/CD8比和無疾病存活期的相關係數。
由第12圖和表五的結果顯示，PD-1和整體存活期為負相關性，且其皮爾森相關係數為-0.446達到統計上顯著的相關性，而由第13圖和表六的結果顯示，PD-1和無疾病存活期為負相關性，其皮爾森相關係數為-0.338，顯示PD-1和整體存活期為低度相關。由第14圖和表七的結果顯示，PD-1/CD8比和整體存活期為負相關性，且其皮爾森相關係數為-0.677達到統計上顯著的相關性。而由第15圖和表八的結果顯示，PD-1/CD8比和無疾病存活期為負相關性，其皮爾森相關係數為-0.377，顯示PD-1/CD8比和無疾病存活期為低度相關。
由相關係數分析的結果顯示，當接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者的PD-1蛋白表現量越低時，其整體存活期和無疾病存活期越長，而接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者的PD-1/CD8比越低時，其整體存活期和無疾病存活期亦越長。顯示PD-1表現量低的多形性膠質母細胞瘤患者，或PD-1/CD8比低的多形性膠質母細胞瘤患者適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療，且其經治療後的存活率較佳，特別是經由以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療。
4.檢體樣本為血液之統計分析 4.1 相關係數分析
請參照下表九，分別為以組織化學評分法，計算13位接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者的周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)和腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)，表現CD8蛋白和表現PD-1蛋白之細胞數，以及將PD-1蛋白表現量除以CD8蛋白表現量(PD-1/CD8比)之統計。
PD-1和CD8之組織化學評分法係於25HPF下(顯微放大倍率為400倍)，計算染上顏色的細胞數，並將25HPF所得到的細胞數加總後得到一訊號值，而將接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者(n=13)的細胞蠟塊經組織化學評分法計算後，可得一中位數，此中位數即為預設閾值，當以組織化學評分法計算出的訊號值大於或等於中位數時，定義為高生物標記表現量。當以組織化學評分法計算出的訊號值小於中位數時，定義為低生物標記表現量。其中CD8的中位數為231，PD-1的中位數為26，PD-1/CD8比的中位數為0.13，故當以組織化學評分法計算出的CD8蛋白之訊號值大於或等於231時，定義為高CD8表現量。當以組織化學評分法計算出的訊號值小於231時，定義為低CD8表現量。當以組織化學評分法計算出的PD-1蛋白之訊號值大於或等於26時，定義為高PD-1表現量。當以組織化學評分法計算出的訊號值小於26時，定義為低PD-1表現量。當以組織化學評分法計算出的PD-1/CD8比大於或等於0.13時，定義為高PD-1/CD8比。當以組織化學評分法計算出的訊號值小於0.13時，定義為低PD-1/CD8比。
表九
本試驗例將進一步利用皮爾森相關係數分析接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者的周邊血液單核細胞的PD-1/CD8比和腫瘤浸潤淋巴細胞的PD-1/CD8比的相關性。請參照第16圖及表十，第16圖為周邊血液單核細胞的PD-1/CD8比和腫瘤浸潤淋巴細胞的PD-1/CD8比的相關圖，表十為周邊血液單核細胞的PD-1/CD8比和腫瘤浸潤淋巴細胞的PD-1/CD8比的相關係數。
由第16圖和表十的結果顯示，周邊血液單核細胞的PD-1/CD8比和腫瘤浸潤淋巴細胞的PD-1/CD8比為正相關性，且其皮爾森相關係數為0.752，顯示周邊血液單核細胞的PD-1/CD8比和腫瘤浸潤淋巴細胞的PD-1/CD8比為高度相關性，證明本發明之用於評估多形性膠質母細胞瘤患者適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療之方法以及預測多形性膠質母細胞瘤患者經治療後的存活率之方法，可由多形性膠質母細胞瘤患者之血液檢體樣本即可進行評估，不需取得患者的腫瘤組織才能進行評估。
4.2 存活分析
依上述半定量方法將13位接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質細胞瘤患者，依據生物標記的表現量分為高生物標記表現量和低生物標記表現量的患者，其中評估所使用的檢體樣本為患者之血液。再進一步利用GraphPad PRISM 4.05(San Diego,CA,USA)以及SAS 9.01進行統計分析。以Kaplan Meier的方法計算存活期 (survival)，並以對數等級檢定(log rank test)方法評估存活期之統計上的顯著性。在所有的統計分析中，p值小於0.05時，認為其具有顯著性。
請參照第17圖和第18圖，第17圖為依周邊血液單核細胞的PD-1蛋白表現量為基礎，將接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者分群的存活曲線圖，(A)部份為整體存活曲線，(B)部份為無疾病存活曲線。第18圖為依周邊血液單核細胞的PD-1/CD8比為基礎，將接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者分群的存活曲線圖，(A)部份為整體存活曲線，(B)部份為無疾病存活曲線。
由第17圖的結果顯示，在接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者中，低PD-1蛋白表現量和高PD-1蛋白表現量的患者，在整體存活期上具有顯著的差異，p值為0.014，而在無疾病存活期上也有差異，p值為0.232。
由第18圖的結果顯示，當以PD-1/CD8比為基準時，在接受樹突狀細胞腫瘤疫苗治療的多形性膠質母細胞瘤患者中，低PD-1/CD8比的患者在整體生存期上顯著的長於高PD-1/CD8比的患者，p值為0.019。而在無疾病存活期上，低PD-1/CD8比的患者也顯著的長於高PD-1/CD8比的患者，p值為0.024。
而由第17圖和第18圖的結果顯示，以多形性膠質母細胞瘤患者的血液為檢體樣本進行評估，其結果與以多 形性膠質母細胞瘤患者的腫瘤組織為檢體樣本進行評估相同，再次證明可僅抽取多形性膠質母細胞瘤患者之血液，即可進行評估該多形性膠質母細胞瘤患者是否適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療，以及預測該多形性膠質母細胞瘤患者經治療後的存活率。
綜合上述，本發明提供一種用於評估多形性膠質母細胞瘤患者適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療之方法，藉由檢測多形性膠質母細胞瘤患者的腫瘤組織或周邊血液單核細胞中PD-1蛋白表現量、PD-L1蛋白表現量或計算PD-1/CD8比，可快速且客觀的使醫師於臨床上可識別出適用於以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療的多形性膠質母細胞瘤患者，排除不太可能對以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療有成效的病患，以確保有效地分配及利用醫療資源。本發明另提供一種預測多形性膠質母細胞瘤患者經治療後的存活率之方法。藉由檢測多形性膠質母細胞瘤患者的腫瘤組織或周邊血液單核細胞中PD-1蛋白表現量、PD-L1蛋白表現量或計算PD-1/CD8比，可以直接預測多形性膠質母細胞瘤患者經治療後的存活率，使醫師於臨床上判斷患者是否需再配合其他的藥物或治療計畫，以拉長其整體存活期或無疾病存活期。
然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
100‧‧‧用於評估多形性膠質母細胞瘤患者適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療之方法
110‧‧‧步驟
120‧‧‧步驟
130‧‧‧步驟

Claims (10)

  1. 一種用於評估多形性膠質母細胞瘤患者適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療之方法，其包含：提供該多形性膠質母細胞瘤患者之一檢體樣本，其中該檢體樣本為一腫瘤組織或一血液；進行一檢測步驟，係測定該檢體樣本中之一生物標記之表現量並計算一訊號值，其中該生物標記為PD-1蛋白和CD8蛋白；將PD-1蛋白之該訊號值除以CD8蛋白之該訊號值以獲得一基礎數值；以及進行一比對步驟，係將該基礎數值與一預設閾值進行比較，當該基礎數值低於該預設閾值，藉此判定該多形性膠質母細胞瘤患者適用於以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用於評估多形性膠質母細胞瘤患者適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療之方法，其中該腫瘤組織為一組織切片或一組織微陣列。
  3. 如申請專利範圍第1-2項任一項所述之用於評估多形性膠質母細胞瘤患者適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療之方法，其中該檢測步驟為利用免疫組織化學染色法(immunohistochemistry,IHC)測定該 生物標記之表現量。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之用於評估多形性膠質母細胞瘤患者適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療之方法，其中該訊號值係利用一組織化學評分法或一影像處理法計算。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之用於評估多形性膠質母細胞瘤患者適用以樹突狀細胞腫瘤疫苗為基礎的免疫治療之方法，其中該影像處理法係利用RGB(red/green/blue)色彩模型、CMYK(cyan/magenta/yellow/key)色彩模型或HSI(hue/saturation/intensity)色彩模型分析該檢體樣本之一影像。
  6. 一種預測多形性膠質母細胞瘤患者經樹突狀細胞腫瘤疫苗治療後的存活率之方法，其包含：提供該多形性膠質母細胞瘤患者之一檢體樣本，其中該檢體樣本為一腫瘤組織或一血液；進行一檢測步驟，係測定該檢體樣本中之一生物標記之表現量並計算一訊號值，其中該生物標記為PD-1蛋白和CD8蛋白；將PD-1蛋白之該訊號值除以CD8蛋白之該訊號值以獲得一基礎數值；以及 進行一比對步驟，係將該基礎數值與一預設閾值進行比較，當該基礎數值低於該預設閾值時，該多形性膠質母細胞瘤患者經該樹突狀細胞腫瘤疫苗治療後具有較佳之存活率。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之預測多形性膠質母細胞瘤患者經樹突狀細胞腫瘤疫苗治療後的存活率之方法，其中該腫瘤組織為一組織切片或一組織微陣列。
  8. 如申請專利範圍第6-7項任一項所述之預測多形性膠質母細胞瘤患者經樹突狀細胞腫瘤疫苗治療後的存活率之方法，其中該檢測步驟為利用免疫組織化學染色法測定該生物標記之表現量。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之預測多形性膠質母細胞瘤患者經樹突狀細胞腫瘤疫苗治療後的存活率之方法，其中該訊號值係利用一組織化學評分法或一影像處理法計算。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之預測多形性膠質母細胞瘤患者經樹突狀細胞腫瘤疫苗治療後的存活率之方法，其中該影像處理法係利用RGB色彩模型、CMYK色彩模型或HSI色彩模型分析該檢體樣本之一影像。
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