TWI602915B - 幹細胞培養裝置、其形成方法、及從其部分脫附幹細胞之方法 - Google Patents

Description

幹細胞培養裝置、其形成方法、及從其部分 脫附幹細胞之方法

本發明是有關於一種細胞培養裝置。

現今的幹細胞的二維培養(如培養瓶及培養皿培養)及三維培養(如微載體培養)是批式過程。在這些培養系統中，幹細胞培養過程包含三步驟：細胞下種及貼附至表面、細胞增生、及細胞脫附。為了獲取大量幹細胞以進行細胞療法，這些步驟需重複操作。在多數情況中，酵素被用以使幹細胞從細胞培養皿或微載體脫離，例如針對人類成體幹細胞((hASC)的胰蛋白酶、針對人類胚胎幹細胞(hESC)及人類誘導多能性幹細胞(hiPSC)的分散酶或accutase。然而，據發現酵素處理會藉由水解一些膜相關蛋白及擾亂細胞連接和細胞外基質(ECM)而破壞細胞膜，其損害細胞功能並使得細胞培養皿或微載體須丟棄。

此外，雖然一些培養皿及微載體可用於傳統幹細胞培養以脫附幹細胞而不需酵素處理，但整片細胞群會完全 脫附，使得沒有幹細胞能在表面上留存並增生。為了獲取大量枝幹細胞，細胞須被重複下種。因此，由於無法部份脫附幹細胞，傳統幹細胞培養方法的幹細胞增生需要大量的培養皿及微載體。

為了解決傳統幹細胞培養系統的瓶頸，能促使幹細胞部份脫附而因此能連續收穫的新式幹細胞培養系統有龐大需求。

本發明提供一種細胞培養裝置，包含具有表面之容器及固定於表面上的複數個奈米刷毛。奈米刷毛由苯乙烯共聚物或寡肽所製成。

在本發明之一些實施例中，表面包含聚苯乙烯，且奈米刷毛由苯乙烯共聚物所製成，且苯乙烯共聚物包含聚[苯乙烯-共-N-異丙烯丙烯醯胺](poly[styrene-co-N-isopropylacrylamide]，P[St-NIPAAm])以及聚[苯乙烯-共-丙烯酸](poly[styrene-co-acrylic acid]，P[St-AA])。

在本發明之一些實施例中，細胞培養裝置更包含細胞外基質(ECM)片段，其接枝至聚[苯乙烯-共-丙烯酸](P[St-AA])，且聚[苯乙烯-共-丙烯酸](P[St-AA])介於細胞外基質片段及包含聚苯乙烯的表面之間。

在本發明之一些實施例中，細胞外基質片段是玻連蛋白(vitronectin，VN)寡肽。

在本發明之一些實施例中，苯乙烯共聚物更包含聚[苯乙烯-共-聚乙二醇甲基丙烯酸酯](poly[styrene-co-polyethylene glycol methacrylate]，P[St-PEGMA])。

在本發明之一些實施例中，聚[苯乙烯-共-聚乙二醇甲基丙烯酸酯](P[St-PEGMA])對聚[苯乙烯-共-N-異丙烯丙烯醯胺](P[St-NIPAAm])之重量比為0：1至3：7。

在本發明之一些實施例中，表面包含聚乙烯醇-共-衣康酸(polyvinylalcohol-co-itaconic acid，PVA-IA)水膠，且奈米刷毛由寡肽所製成，且寡肽包含玻連蛋白(vitronectin，VN)寡肽、骨涎蛋白(bone sialprotein，BSP)寡肽、肝素結合肽(heparin binding peptide，HBP1)、玻連蛋白-2C(VN2C)寡肽、玻連蛋白-2G(VN2G)寡肽、或其組合。

在本發明之一些實施例中，聚乙烯醇-共-衣康酸(PVA-IA)水膠具有10-35kPa之儲能模數。

在本發明之一些實施例中，容器包含培養皿、培養瓶或微載體。

本發明提供一種形成細胞培養裝置之方法。此方法包含：提供具有表面之容器而此表面含有聚苯乙烯、塗覆聚[苯乙烯-共-丙烯酸](P[St-AA])至表面上、以N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS) 活化被塗覆聚[苯乙烯-共-丙烯酸](P[St-AA])之表面，以形成已活化表面、在活化被塗覆聚[苯乙烯-共-丙烯酸](P[St-AA])之表面之後，接枝細胞外基質(ECM)片段至聚[苯乙烯-共-丙烯酸](P[St-AA])、以及在接枝細胞外基質(ECM)片段之後，塗覆聚[苯乙烯-共-N-異丙烯丙烯醯胺](P[St-NIPAAm])至已活化表面上。

在本發明之一些實施例中，此形成細胞培養裝置之方法更包含在接枝細胞外基質(ECM)片段之後，塗覆聚[苯乙烯-共-聚乙二醇甲基丙烯酸酯](P[St-PEGMA])至已活化表面上。

在本發明之一些實施例中，塗覆聚[苯乙烯-共-丙烯酸](P[St-AA])至表面上包含將含有聚[苯乙烯-共-丙烯酸](P[St-AA])之第一溶液加至表面上，且聚[苯乙烯-共-丙烯酸](P[St-AA])於第一溶液中所具有濃度為0.5-3.5mg/ml。

在本發明之一些實施例中，塗覆該聚[苯乙烯-共-N-異丙烯丙烯醯胺](P[St-NIPAAm])至已活化表面上包含將含有聚[苯乙烯-共-N-異丙烯丙烯醯胺](P[St-NIPAAm])之第二溶液加至已活化表面上，且聚[苯乙烯-共-N-異丙烯丙烯醯胺](P[St-NIPAAm])於第二溶液中所具有濃度為2-5mg/ml。

在本發明之一些實施例中，塗覆聚[苯乙烯-共-聚乙二醇甲基丙烯酸酯](P[St-PEGMA])至已活化表面上包含將含有聚[苯乙烯-共-聚乙二醇甲基丙烯酸酯](P[St-PEGMA])之第三溶液加至已活化表面上，且聚[苯乙烯-共-聚乙二醇甲基 丙烯酸酯](P[St-PEGMA])於第三溶液中所具有濃度為2-5mg/ml。

本發明提供一種形成細胞培養裝置之方法。此方法包含：提供具有表面之容器而此表面含有聚乙烯醇-共-衣康酸(PVA-IA)水膠、以N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化聚乙烯醇-共-衣康酸(PVA-IA)水膠，以形成已活化聚乙烯醇-共-衣康酸(PVA-IA)水膠、以及接枝寡肽至已活化聚乙烯醇-共-衣康酸(PVA-IA)水膠。

在本發明之一些實施例中，接枝寡肽至已活化聚乙烯醇-共-衣康酸(PVA-IA)水膠包含將含有寡肽之第四溶液加至已活化聚乙烯醇-共-衣康酸(PVA-IA)水膠表面，且寡肽於第四溶液中所具有濃度為40-1600μg/ml。

本發明亦提供一種從細胞培養裝置部分脫附幹細胞之方法。此方法包含：下種一些幹細胞至複數個奈米刷毛、培養幹細胞、藉由溫度改變或剪應力從奈米刷毛脫附一部分之幹細胞、以及收穫此部分之幹細胞。

在本發明之一些實施例中，奈米刷毛由苯乙烯共聚物所製成，且藉由溫度改變從奈米刷毛脫附幹細胞之此部分包含將奈米刷毛之溫度降低至0-20℃。

在本發明之一些實施例中，奈米刷毛由寡肽所製成，且藉由剪應力從奈米刷毛脫附幹細胞之此部分包含搖晃奈米刷毛。

在本發明之一些實施例中，幹細胞為人類脂肪誘導幹細胞(hADSC)、人類胚胎幹細胞(hESC)、人類誘導多能性幹細胞(hiPSC)、或其組合。

應可瞭解到前述一般敘述及下列進一步詳細描述僅為範例。且係用以提供所請之本發明的進一步闡釋。

10、20、30、40‧‧‧細胞培養裝置

100‧‧‧容器

110‧‧‧表面

112‧‧‧聚乙烯醇-共-衣康酸(PVA-IA)水膠

200‧‧‧奈米刷毛

210‧‧‧苯乙烯共聚物

212‧‧‧聚[苯乙烯-共-N-異丙烯丙烯醯胺](P[St-NIPAAm])

214‧‧‧聚[苯乙烯-共-丙烯酸](P[St-AA])

216‧‧‧聚[苯乙烯-共-聚乙二醇甲基丙烯酸酯](P[St-PEGMA])

220‧‧‧寡肽

221‧‧‧玻連蛋白(VN)寡肽

222‧‧‧骨涎蛋白(BSP)寡肽

224‧‧‧肝素結合肽(HBP1)

226‧‧‧玻連蛋白2C(VN2C)寡肽

228‧‧‧玻連蛋白2G(VN2G)寡肽

300‧‧‧細胞外基質(ECM)片段

402、404、406、408、410、412‧‧‧步驟

502、504、506‧‧‧步驟

602、604、606、608‧‧‧步驟

為使本發明之特徵、優點與實施例能更顯明易懂，所附圖式之說明如下：第1A圖係顯示根據本發明一些實施例之細胞培養裝置的剖視圖。

第1B圖係顯示根據本發明一些實施例之細胞培養裝置的剖視圖。

第2圖係顯示根據本發明一些實施例之形成細胞培養裝置的流程圖。

第3A圖係顯示根據本發明一些實施例之細胞培養裝置的剖視圖。

第3B圖係顯示根據本發明一些實施例之細胞培養裝置的剖視圖。

第4圖係顯示根據本發明一些實施例之形成細胞培養裝置的流程圖。

第5圖係顯示根據本發明一些實施例之從細胞培養裝置部分脫附幹細胞之流程圖。

第6圖係顯示根據本發明實驗例1-3及比較例1-2之培養於熱感應性表面之hADSC的型態圖。

第7圖係顯示根據本發明實驗例2之歷經部分脫附循環之hADSC的型態圖。

第8圖係顯示根據本發明實驗例1-3之歷經部分脫附循環之hADSC的脫附率圖。

第9圖係顯示根據本發明實驗例2之歷經部分脫附循環之hADSC的存/亡染色圖。

第10A-10D圖係顯示根據本發明實驗例2之歷經部分脫附循環之hADSC的幹細胞標記表現之流式細胞儀散佈圖。

第11圖係顯示根據本發明實驗例1-2及比較例3-4之培養於熱感應性表面之hESC的型態圖。

第12A圖係顯示根據本發明實驗例1-2、4-13及比較例1、4-7之培養於熱感應性表面之hESC的的貼附率圖。

第12B圖係顯示根據本發明實驗例1-2、4-13及比較例1、4-7之培養於熱感應性表面之hESC的的脫附率圖。

第12C圖係顯示根據本發明實驗例1-2、4-13及比較例1、4-7之培養於熱感應性表面之hESC的的分化率圖。

第13A圖係顯示根據本發明實驗例11之歷經部分脫附循環之hESC的型態圖。

第13B圖係顯示根據本發明實驗例11及比較例4之歷經部分脫附循環之hESC的脫附率圖。

第14A圖係顯示根據本發明實驗例11之部分脫附循環後的hESC之多能性標記表現的免疫染色圖。

第14B圖係顯示根據本發明實驗例11之部分脫附循環後的hESC所形成之胚體圖。

第14C圖係顯示根據本發明實驗例11之部分脫附循環後的hESC之分化標記表現的免疫染色圖。

第15A-15D圖係顯示根據本發明實驗例14及比較例8之部分脫附循環後之C1s及N1s峰值的高解析度XPS光譜圖。

第16A圖係顯示根據本發明實驗例14-19及比較例2、9之不同VN寡肽(oligoVN)濃度下PVA-IA-oligoVN水膠的氮/碳(N/C)之原子比例圖。

第16B圖係顯示根據本發明實驗例18、20-23之不同長度交聯時間下PVA-IA-oligoVN水膠的氮/碳(N/C)之原子比例圖。

第17A圖係顯示根據本發明實驗例18、20-23及比較例4、10之培養於不同彈性PVA-IA-oligoVN水膠的hESC之型態圖。

第17B圖係顯示根據本發明實驗例18、21-23及比較例4、10之培養於不同彈性PVA-IA-oligoVN水膠的hESC及hiPSC之貼附率圖。

第17C圖係顯示根據本發明實驗例18、21-23及比較例4、10之培養於不同彈性PVA-IA-oligoVN水膠的hESC及hiPSC之分化率圖。

第18A圖係顯示根據本發明實驗例14-19及比較例4、10之培養於不同oligoVN表面密度之PVA-IA-oligoVN水膠的hESC及hiPSC之型態圖。

第18B圖係顯示根據本發明實驗例14、16-19及比較例4、10之培養於不同oligoVN表面密度之PVA-IA-oligoVN水膠的hESC及hiPSC之貼附率圖。

第18C圖係顯示根據本發明實驗例14、16-19及比較例4、10之培養於不同oligoVN表面密度之PVA-IA-oligoVN水膠的hESC及hiPSC之分化率圖。

第19A-19B圖係顯示根據本發明實驗例14及比較例4、10之多代培養於最適彈性PVA-IA-oligoVN水膠的hESC及hiPSC之增生率圖。

第20A-20B圖係顯示根據本發明實驗例14及比較例4、10之多代培養於最適彈性PVA-IA-oligoVN水膠的hESC及hiPSC之貼附率圖。

第21A-21B圖係顯示根據本發明實驗例14及比較例4、10之多代培養於最適彈性PVA-IA-oligoVN水膠的hESC及hiPSC之分化率圖。

第22圖係顯示根據本發明實驗例14及比較例10之培養於最適彈性PVA-IA-oligoVN水膠的hESC之群集型態圖。

第23A圖係顯示根據本發明實驗例14之培養於最適彈性PVA-IA-oligoVN水膠的hESC之多能性標記表現的免疫染色圖。

第23B圖係顯示根據本發明實驗例14之培養於最適彈性PVA-IA-oligoVN水膠的hiPSC之多能性標記表現的免疫染色圖。

第24A圖係顯示根據本發明實驗例14之培養於PVA-IA-oligoVN水膠的hESC及hiPSC所形成之胚體圖。

第24B圖係顯示根據本發明實驗例14之培養於PVA-IA-oligoVN水膠的hESC之分化標記表現的免疫染色圖。

第24C圖係顯示根據本發明實驗例14之培養於PVA-IA-oligoVN水膠的hiPSC之分化標記表現的免疫染色圖。

第25A-25D圖係顯示根據本發明實驗例14之培養於PVA-IA-oligoVN水膠的hESC之體內分化圖。

現將對本發明之實施例進行詳細的參照敘述，其範例顯示於附隨圖式中。在所有可能之處，圖式及敘述中相同的參考標號係指示相同或相似之部分。

如前所述，據發現使幹細胞脫附的酵素處理會造成細胞膜之破損。至於不需酵素處理而可使幹細胞脫附的一些表面，整片細胞群通常會完全脫附，其涉及了由表面外緣及/或底部進行的水流穿透，使得沒有幹細胞能貼附至表面。因此， 上述兩種方式不僅耗費大量拋棄式培養皿、培養瓶或微載體，更耗費大量努力與時間重複地下種幹細胞以大量收獲而進行臨床使用，其係由於無法部份脫附幹細胞。

因此，本發明提供一種細胞培養裝置，藉由利用細胞培養裝置表面之奈米刷毛，而促使幹細胞的部份脫附及連續收穫。透過僅僅改變溫度或施加剪應力至奈米刷毛，幹細胞可從奈米刷毛部份脫附，使酵素處理可免除，且同一細胞培養裝置中的貼附細胞可進一步增生。

參閱第1A圖，其係顯示根據本發明一些實施例之細胞培養裝置的剖視圖。細胞培養裝置10包含具有表面110之容器100，且複數個奈米刷毛200固定於表面110上。奈米刷毛200由苯乙烯共聚物210或寡肽220所製成。

在一些實施例中，表面110含有聚苯乙烯，奈米刷毛200由苯乙烯共聚物210所製成，且苯乙烯共聚物210包含聚[苯乙烯-共-N-異丙烯丙烯醯胺](poly[styrene-co-N-isopropylacrylamide]，P[St-NIPAAm])212及聚[苯乙烯-共-丙烯酸](poly[styrene-co-acrylic acid]，P[St-AA])214。在這些實施例中，表面110及苯乙烯共聚物210皆包含聚苯乙烯，促使苯乙烯共聚物210附著至表面110。換句話說，疏水性聚苯乙烯(PSt)係作為定錨點，使苯乙烯共聚物210塗覆至表面110上。

P[St-NIPAAm]212包含聚[N-異丙烯丙烯醯胺](PNIPAAm)其特徵為熱感應性。PNIPAAm包含親水性醯胺基 及疏水性異丙基的重複單元。當溫度升高時，尤其高於低臨界溶液溫度(LCST)時，PNIPAAm傾向於由親水性的延展線捲狀，變為疏水性的緊實球狀。因此，P[St-NIPAAm]212在例如35-40℃的高溫時展現疏水性，並由於細胞膜的疏水性而增強細胞附著。然而，隨著溫度下降，P[St-NIPAAm]212的疏水性亦降低。疏水性愈低，則親水性愈高。P[St-NIPAAm]212在例如0-20℃的低溫時親水性增加，其不利於細胞附著，並導致細胞脫附。

P[St-AA]214包含聚丙烯酸(PAA)，其提供細胞外基質(ECM)片段300的結合位置以促使幹細胞附著。在一些實施例中，ECM片段300接枝至P[St-AA]214，且P[St-AA]214介於ECM片段300及含有聚苯乙烯的表面110之間。換句話說，ECM片段300可不與表面110直接接觸，而因此P[St-AA]214係作為ECM片段300與表面110之橋樑。在一些實施例中，細胞外基質(ECM)片段300是玻連蛋白(VN)寡肽(此縮寫為oligoVN)，所具有之胺基酸序列為KGGPQVTRGDVFTMP。培養於接枝oligoVN之表面的幹細胞據報導可良好地維持多能性，尤其是人類胚胎幹細胞(hESC)及人類誘導多能性幹細胞(hiPSC)。

參閱第1B圖，其係顯示根據本發明一些實施例之細胞培養裝置的剖視圖。如第1B圖所示，苯乙烯共聚物210更包含聚[苯乙烯-共-聚乙二醇甲基丙烯酸酯](poly[styrene-co-polyethylene glycol methacrylate]， P[St-PEGMA])216。P[St-PEGMA]216含有聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)，其為高度親水性。在一些實施例中，將親水性的P[St-PEGMA]216塗覆至表面110會加速細胞在低溫的脫附。在一些實施例中，P[St-PEGMA]216對P[St-NIPAAm]212的重量比為0：1至3：7。

在一些實施例中，由於協助提供了更多親水性，僅降低溫度即足以使細胞從奈米刷毛200脫附。由於不需要由表面外緣及/或底部進行水流穿透，可避免整片細胞群的完全脫附，而可達成從細胞培養裝置部份脫附幹細胞。

將含有不同濃度或重量比之P[St-NIPAAm]212、P[St-AA]214、及P[St-PEGMA]216的苯乙烯共聚物210塗覆至含有聚苯乙烯的表面110上，可產生具有不同組成及對hASC、hESC、及hiPSC有不同親和力之奈米刷毛。在一些實施中，當奈米刷毛200由苯乙烯共聚物210所製成時，從表面部分脫附幹細胞之方式主要可歸因於P[St-NIPAAm]的熱感應性。因此，在那些實施例中，表面110及塗覆之苯乙烯共聚物210可被統稱為熱感應性表面以求簡潔。

參閱第2圖，其係顯示根據本發明一些實施例之形成細胞培養裝置的流程圖。此方法包含提供具有表面110之容器100，而此表面110含有聚苯乙烯(步驟402)、塗覆聚[苯乙烯-共-丙烯酸](P[St-AA])214至表面110上(步驟404)、以N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化被塗覆聚[苯乙烯-共-丙烯酸] (P[St-AA])214之表面110以形成已活化表面(步驟406)、在活化被塗覆聚[苯乙烯-共-丙烯酸](P[St-AA])214之表面110之後接枝細胞外基質(ECM)片段300至聚[苯乙烯-共-丙烯酸](P[St-AA])214(步驟408)、以及在接枝細胞外基質(ECM)片段300之後塗覆聚[苯乙烯-共-N-異丙烯丙烯醯胺](P[St-NIPAAm])212至已活化表面上(步驟410)。此方法更包含在接枝細胞外基質(ECM)片段300之後塗覆聚[苯乙烯-共-聚乙二醇甲基丙烯酸酯](P[St-PEGMA])216至已活化表面上(步驟412)，其只在形成細胞培養裝置20而非細胞培養裝置10時進行操作。各步驟之細節詳述如下： 在步驟402中，具有表面110之容器100係被提供，且表面110包含聚苯乙烯以促使苯乙烯共聚物210塗覆至表面上。在一些實施例中，容器為培養皿、培養瓶或微載體。在一些實施例中，容器是組織培養聚苯乙烯培養皿(TCPS)。

在塗覆苯乙烯共聚物210至表面110之前，苯乙烯共聚物210之合成先進行。P[St-AA]214、P[St-NIPAAm])212、及P[St-PEGMA]216之合成係透過可逆型加成-分裂鏈轉移(RAFT)聚合法。詳細而言，苯乙烯單體與5-氰基-5-(硫代苯甲醯)己酸藉由溶於甲苯的4,4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)在70-90℃進行14-18小時的自由基聚合反應以形成聚苯乙烯-RAFT試劑。在正己烷中進行再結晶後，聚苯乙烯-RAFT試劑會與丙烯酸(AA)共聚合以形成P[St-AA]214、與N-異丙烯丙烯醯胺(NIPAAm)共聚合以形成P[St-NIPAAm]212、或與聚乙二 醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)共聚合以形成P[St-PEGMA]216。共聚合反應係藉由溶於甲苯的4,4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)在70-90℃進行14-18小時。在正己烷中進行再結晶後，苯乙烯共聚物210係被冷凍乾燥並保存於0-10℃的乾燥環境中。

在一些實施例中，對於P[St-NIPAAm]212的單一分子而言，PSt的重複單元數量為25-35個，而PNIPAAm的重複單元數量為160-200個。在一些實施例中，對於P[St-AA]214的單一分子而言，PSt的重複單元數量為50-60個，而PAA的重複單元數量為50-250個。在一些實施例中，對於P[St-PEGMA]216的單一分子而言，PSt的重複單元數量為55-65個，而PEGMA的重複單元數量為100-250個。

在步驟404中，塗覆P[St-AA]214至表面上包含將含有P[St-AA]214的第一溶液加至表面上，且P[St-AA]214於第一溶液中所具有濃度為0.5-3.5mg/ml。P[St-AA]214(尤其PAA的重複單元為170-180個的P[St-AA]214)係溶於乙醇以形成第一溶液。表面110浸於第一溶液中並置於20-30℃下1-4小時。之後，第一溶液接著被移除，而塗覆P[St-AA]214的表面則被磷酸緩衝液(PBS，pH 7.2)清洗2-5次。

接著，在步驟406中，塗覆P[St-AA]214的表面藉由在30-40℃.下浸於包含5-20mg/ml的N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)及5-20mg/ml的N-羥基丁二醯亞胺(NHS)之水溶液中0.5-2小時以進行活化。在一些實施例中，EDC及NHS在水溶液中具有相同濃度。EDC為交聯 劑，用以將羧基或磷酸基耦合至一級胺而形成醯胺鍵。然而，在耦合反應中形成的反應性中間物可在水溶液中被快速水解。因此，為了增加中間物的穩定性，NHS係被引入以將胺基反應性中間物轉變為NHS酯，其在後續的耦合反應中更為穩定。接著，包含NHS酯的已活化表面係接著被PBS沖洗2-5次。

在步驟408中，ECM片段300係被接枝至P[St-AA]214。ECM片段300的接枝提供幹細胞附著位置，並因此增強幹細胞貼附。在一些實施例中，ECM片段300為oligoVN。ECM片段300係溶於PBS溶液，且在PBS溶液中所具有濃度為40-1200μg/ml。針對hADSC貼附，ECM片段之濃度為40-60μg/ml。針對hESC貼附，ECM片段之濃度為900-1200μg/ml。塗覆P[St-AA]214的已活化表面係在0-10℃浸於具有ECM片段300的PBS溶液中20-28小時以將ECM片段300接枝至P[St-AA]214。

在步驟410中，塗覆P[St-NIPAAm]212至已活化表面上包含將含有P[St-NIPAAm]212的第二溶液加至以已活化表面，且P[St-NIPAAm]212在第二溶液中所具有濃度為2-5mg/ml。P[St-NIPAAm]212係溶於乙醇以形成第二溶液。已活化表面係浸於第二溶液並置於20-30℃下1-4小時。之後，第二溶液接著被移除，且塗覆P[St-NIPAAm]212的已活化表面被PBS清洗2-5次。P[St-NIPAAm]212的塗覆提供熱感應性，使得幹細胞能在低溫脫附。

在步驟412中，塗覆P[St-PEGMA]216至已活化表面上包含將含有P[St-PEGMA]216的第三溶液加至以已活化表面，且P[St-PEGMA]216在第三溶液中所具有濃度為2-5mg/ml。P[St-PEGMA]216係溶於乙醇以形成第三溶液。已活化表面係浸於第三溶液並置於20-30℃下1-4小時。之後，第三溶液接著被移除，且塗覆P[St-PEGMA]216的已活化表面被PBS清洗2-5次。P[St-PEGMA]216的塗覆提供親水性，其使得幹細胞的低溫脫附能加速。

在一些實施例中，第二溶液及第三溶液具有相同濃度，且可以不同體積比例混合，以形成P[St-PEGMA]216對P[St-NIPAAm]212重量比例不同的已活化表面，使得幹細胞的部分脫附效果不同。在一些實施例中，P[St-PEGMA]216對P[St-NIPAAm]212的重量比例是0：1至3：7，其包含了0：1、1：9、1：4、3：7、及其他合適比例。

接著參閱第3A圖，其係顯示根據本發明一些實施例之細胞培養裝置的剖視圖。細胞培養裝置30包含具有表面110之容器100。在一些實施例中，表面110含有聚乙烯醇-共-衣康酸(polyvinylalcohol-co-itaconic acid，PVA-IA)水膠112，且奈米刷毛200由寡肽220所製成，而寡肽包含玻連蛋白(vitronectin，VN)寡肽221(亦簡稱為oligoVN)、骨涎蛋白(bone sialprotein，BSP)寡肽222、肝素結合肽(heparin binding peptide，HBP1)224、玻連蛋白-2C(VN2C)寡肽226、玻連蛋白-2G(VN2G)寡肽228、或其組合。

已接枝的寡肽提供幹細胞附著位置並促進幹細胞貼附，而具有不同彈性(即儲能模數，E’)的PVA-IA水膠112可在剪應力施加時促使幹細胞部分脫附。在一些實施例中，PVA-IA水膠112具有10-35kPa之儲能模數。

PVA-IA水膠112之特色在於不同彈性，其係基於不同交聯強度。交聯強度主要取決於交聯時間。PVA-IA水膠112之交聯可由諸如戊二醛、乙醛、甲醛、及其他一元醛來操作，其在PVA鏈的側羥基之間形成乙縮醛架橋。已交聯PVA-IA形成緻密結構，其具有強大的分子內及分子間氫鍵與大量羧基。羧基不但促進PVA-IA水膠112的水合，更提供寡肽接枝的一些位置。

接著參閱第3B圖，其係顯示根據本發明一些實施例之細胞培養裝置的剖視圖。第3B圖所示的細胞培養裝置40與第3A圖所示的細胞培養裝置30的差異在於所接枝寡肽的多樣性。在一些實施例中，只有一種寡肽被接枝至PVA-IA水膠112，如第3A圖所示的細胞培養裝置30。在一些實施例中，二或多種以上之寡肽被接枝至PVA-IA水膠112，如第3B圖所示的細胞培養裝置30。在一些實施例中，PVA-IA水膠112及所接枝的寡肽220可被共同稱為PVA-IA-寡肽水膠以求簡潔。

Oligo VN 221具有之胺基酸序列為KGGPQVTRGDVFTMP，並作為重要的幹細胞附著位置以維持幹細胞的多能性。Oligo VN 221包含RGD胺基酸序列，其為連結細胞膜的整合素(integrin)結合位置，尤其是integrin α_Vβ₃ 及α_Vβ₅。一旦oligo VN 221被接枝至PVA-IA水膠112，oligo VN 221與整合素之結合會將幹細胞固定至PVA-IA水膠112。

BSP寡肽222具有之胺基酸序列為KGGNGEPRGDTYRAY，並亦包含RGD序列以結合整合素。一旦BSP寡肽222被接枝至PVA-IA水膠112，BSP寡肽222與整合素之結合會將幹細胞固定至PVA-IA水膠112並協助維持幹細胞的多能性。

HBP1 224具有之胺基酸序列為GKKQRFRHRNRKG，並包含一個能被細胞膜上硫酸肝素蛋白多醣(heparan sulfate proteoglycan)辨識的結合位置。硫酸肝素蛋白多醣與細胞的焦點黏連(focal adhesion)有關，其為細胞貼附的重要特徵。因此，一旦HBP1 224被接枝至PVA-IA水膠112，HBP1 224與硫酸肝素蛋白多醣之結合會將幹細胞固定至PVA-IA水膠112並協助維持幹細胞的多能性。

VN2C寡肽226(所具有之胺基酸序列為GCGGKGGPQVTRGDVFTMP)是雙鏈分子，其雙鏈由雙硫鍵所連接。VN2C寡肽226與oligoVN 221的序列不同在於增加了GCGG序列。由於亦具有RGD序列，VN2C寡肽226可因此與整合素結合。一旦VN2C寡肽226被接枝至PVA-IA水膠112，VN2C寡肽226與整合素之結合會將幹細胞固定至PVA-IA水膠112並協助維持幹細胞的多能性。

VN2G寡肽228(所具有之胺基酸序列為GGGGKGGPQVTRGDVFTMP)是雙鏈分子，其雙鏈由雙硫鍵所 連接。VN2G寡肽228與oligoVN 221的序列不同在於增加了GGGG序列。由於亦具有RGD序列，VN2G寡肽228可因此與整合素結合。一旦VN2G寡肽228被接枝至PVA-IA水膠112，VN2C寡肽226與整合素之結合會將幹細胞固定至PVA-IA水膠112並協助維持幹細胞的多能性。

接著參閱第4圖，其係顯示根據本發明一些實施例之形成細胞培養裝置的流程圖。此方法包含：提供具有表面110之容器100，而表面110包含聚乙烯醇-共-衣康酸(PVA-IA)水膠112(步驟502)、以N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化PVA-IA水膠，以形成已活化PVA-IA水膠(步驟504)、以及接枝寡肽220至已活化PVA-IA水膠(步驟506)。各步驟之細節詳述如下。

在步驟502中，具有表面110之容器100係被提供，而表面112含有PVA-IA水膠112。將含有0.5-3mol%衣康酸(itaconic acid)且水解度95-99%而聚合度1500-2000的PVA-IA(Japan VAM & Poval Co.,Ltd.，大阪，日本)溶於超純水中以形成PVA-IA溶液，若針對細胞培養則其濃度為0.02-0.1wt%，若針對流變儀測定則其濃度為0.3-1wt%。接著，PVA-IA溶液被震盪1-3天並置於室溫0.5-2天以去除氣泡。

接著，2-5m1的PVA-IA溶液被加入至容器中並進行乾燥5-8天以形成PVA-IA薄膜。PVA-IA薄膜接著被浸入含有0.5-2wt%戊二醛、15-25wt%硫酸鈉、及0.5-2wt%硫酸的交聯溶液中0.2-50小時以形成已交聯的PVA-IA水膠112。在 交聯後，PVA-IA水膠112被清洗並在寡肽接枝及細胞培養前保存於超純水中，而超純水每日更換兩次。將PVA-IA水膠112浸於75v/v%乙醇溶液過夜以滅菌及以超純水清洗亦在細胞培養前進行。

不同長度的交聯時間會導致PVA-IA水膠的不同彈性(即儲能模數，E’)。交聯時間愈長，儲能模數愈高，而PVA-IA水膠愈堅硬。在約0.2-50小時的交聯時間下，PVA-IA水膠的儲能模數約為10-35kPa。

在步驟504中，PVA-IA水膠112係被EDC及NHS活化以形成已活化PVA-IA水膠。PVA-IA水膠112的活化係透過在20-30℃浸於含有5-15mg/ml的EDC及5-15mg/ml的NHS之溶液4-8小時。EDC交聯PVA-IA水膠112的羧基交聯至NHS，以形成胺反應性的NHS酯，其不會被水解而可用於後續的寡肽接枝反應。在活化之後，包含NHS酯的已活化PVA-IA水膠接著被PBS清洗2-5次。

在步驟506中，將寡肽220接枝至以活化PVA-IA水膠包含將含有寡肽220之第四溶液加至已活化PVA-IA水膠表面，且寡肽220於第四溶液中所具有濃度為40-1600μg/ml。寡肽220係溶於PBS以形成第四溶液。已活化PVA-IA水膠會浸於第四溶液中並置於0-10℃下20-28小時。在接枝寡肽220後，已接枝寡肽的PVA-IA水膠係被超純水清洗10-14小時以去除殘餘寡肽，並浸於超純水中直到用於細胞培養。

接著參閱第5圖，其係顯示係顯示根據本發明一些實施例之從細胞培養裝置部分脫附幹細胞之流程圖。此方法包含下種一些幹細胞至複數個奈米刷毛200(步驟602)、培養幹細胞(步驟604)、藉由溫度改變或剪應力從奈米刷毛200脫附一部分之幹細胞(步驟606)、以及收穫此部分之幹細胞(步驟608)。各步驟之細節詳述如下。

在步驟602中，一些幹細胞被下種至複數個奈米刷毛200。在一些實施例中，幹細胞係以5,000-20,000個細胞/cm²的濃度下種至細胞培養裝置10、20、30、或40之奈米刷毛200。

在步驟604中，幹細胞被培養以擴大細胞群集之規模。在一些實施例中，幹細胞被培養於多種細胞培養基中，例如Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)、無外源(xeno-free)血清、或無滋養層(feeder-free)血清。在培養基的滋養下，幹細胞在30-40℃下被培養於提供2-10% CO₂的培養箱0.5-8天。當細胞群集到達70-90%的匯合度時，幹細胞即適於脫附。

在步驟606中，一部分之幹細胞自藉由溫度改變或剪應力從奈米刷毛脫附。在一些實施例中，奈米刷毛200由苯乙烯共聚物210所製成，且藉由溫度改變從奈米刷毛200脫附部分之幹細胞包含降低奈米刷毛200的溫度至0-20℃。在一些實施例中，奈米刷毛被維持於0-20℃達2-8小時。由於P[St-NIPAAm]212在低溫時所增加的親水性，一部分的幹細胞會從奈米刷毛200脫附，而其餘部分之幹細胞維持貼附。

在一些實施例中，奈米刷毛200由寡肽220所製成，且藉由剪應力從奈米刷毛200脫附部分之幹細胞包含搖晃奈米刷毛。在一些實施例中，奈米刷毛200係於原本的培養溫度下以30-100rpm之速率被搖晃2-10分鐘。由於PVA-IA水膠112的彈性，一部分的幹細胞會從奈米刷毛200脫附，而其餘部分之幹細胞維持貼附。

在步驟608中，幹細胞的此部分係被收穫。不論幹細胞的此部分是藉由溫度改變或剪應力從奈米刷毛200脫附，已脫附細胞可被收穫已進行進一步研究的臨床應用，而留存的貼附細胞可再次地被培養以擴大細胞群集。由於幹細胞的部分脫附，此「培養-脫附」循環可在單一的細胞培養裝置中重複，促成幹細胞的連續收穫。

幹細胞包含人類脂肪誘導幹細胞(hADSC)、人類胚胎幹細胞(hESC)、人類誘導多能性幹細胞(hiPSC)、或其組合。hESC及hiPSC亦被歸類為人類多能性幹細胞(hPSC)。

下列之實驗例1-13及比較例1-7係用以詳述本發明之熱感應性表面的特定實施例，而實驗例14-25及比較例2、4、8-10係用以詳述本發明之PVA-IA寡肽水膠的特定實施例。兩者皆使得本領域中通常知識者可實施本發明。以下之實驗例及比較例並非用以限制本發明。

實驗例1-3及比較例1-2：

hADSC從熱感應性表面的部分脫附

人類脂肪誘導幹細胞(hADSC)最初被置於組織培養聚苯乙烯盤(TCPS)上並培養3代。在第3代後，hADSC係用以培養於塗附有苯乙烯共聚物的不同熱感應性表面。第3代後的hADSC係以約10,000個細胞/cm²的濃度下種至熱感應性表面。

貼附率係由以下等式進行計算：貼附率(%)=(表面上貼附細胞數/最初下種細胞數)×100%

脫附率係由以下等式進行計算：脫附率(%)=(從表面脫附的細胞數/表面上貼附細胞數)×100%

分化率係由以下等式進行計算：分化率(%)=已分化細胞之比率(%)+部分分化細胞之比率×0.5(%)

hADSC係被下種至具有不同P[St-AA]表面密度及不同P[St-NIPAAm]對P[St-PEGMA]重量比例的熱感應性表面上。由於所塗覆P[St-AA]之飽和表面密度為500μg/cm²，此密度被稱為100%的P[St-AA]覆蓋率，其係在第一溶液中的P[St-AA]的濃度為3mg/ml時所達成。基於此，所塗覆P[St-AA]之表面密度及其分別對應之P[St-AA]覆蓋率比例為500μg/cm²以達100%、375μg/cm²以達75%，250μg/cm²以達50%，以及125μg/cm²以達25%。此外，由於此處oligoVN 被接枝至P[St-AA]，因此P[St-AA]的覆蓋率比例亦可被視為P[St-AA]-oligoVN的覆蓋率比例。

hADSC係被下種至P[St-AA]-oligoVN覆蓋率25%且P[St-NIPAAm]：P[St-PEGMA](N：P)重量比例為1：0、4：1、7：3、及0：1的熱感應性表面上，其分別為第(a)及(f)圖中的實驗例1、第(b)及(g)圖中的實驗例2、第(c)及(h)圖中的實驗例3、及第(d)及(i)圖中的比較例1。此外，一些hADSC被下種至未塗覆的TCPS，其第(e)及(j)圖中的比較例2。所有組別的hADSC皆在37℃培養1天。

第6圖係顯示根據本發明實驗例1-3及比較例1-2之培養於熱感應性表面之hADSC的型態圖。比例尺代表500μm。如第6圖的(a)-(e)所示，不論P[St-NIPAAm]：P[St-PEGMA]的比例(N：P比例)，hADSC可良好貼附至實驗例1-3並顯現顯著的細胞增生，其相似於比較例1-2的hADSC。在第6圖的(f)-(i)中，再將溫度降至4℃後6小時，大部分hADSC從實驗例1-3部份脫附，卻從比較例1完全脫附，顯示hADSC的部分脫附可由實驗例1-3達成，其脫附率為50-90%。然而，沒有hADSC由比較例2脫附。

實驗例2：

從熱感應性表面連續收穫hADSC

如上之表1包含具有交替溫度變化的5個循環。如表1所示，每一個循環包含在37℃的細胞增生期及4℃的細胞脫附期。細胞增生期隨著循環的進程逐漸延長直到第3循環，而細胞脫附期維持在3-5小時。

第7圖係顯示根據本發明實驗例2之歷經部分脫附循環之hADSC的型態圖。比例尺代表500μm。如第7圖所示，在5個循環中，hADSC可在37℃時良好貼附至實驗例2(具有25%的P[St-AA]-oligoVN覆蓋率及4：1的N：P比例)，並在4℃時從實驗例2重複地部份脫附。留存的貼附hADSC可在實驗例2上增生良好，而促使連續收穫。

實驗例1-3：

在連續收穫中hADSC部分脫附率之改變

第8圖係顯示根據本發明實驗例1-3(分別之N：P為1：0、4：1、及7：3)之歷經部分脫附循環之hADSC的脫附率圖。脫附率在脫附循環中會有所變化，顯現出前期循環中增加，而在後期循環中減少。詳細而言，實驗例1及2顯現的在5個循環中的脫附率大於60%。相較於此，雖然塗覆有最高量的P[St-PEGMA]，實驗例3的脫附率從第4循環開始跌至約40%，顯示P[St-PEGMA無法促進hADSC的重複脫附超過4個循環。

實驗例2：

在連續收穫後貼附與脫附的hADSC之健康度

由於hADSC可透過溫度改變而被連續收穫，為了進行仰賴溫度的連續脫附，仍留存細胞的健康度驗證是重要的。為了完成這樣的評估，存/亡染色方式係用以評估5個部分脫附循環後實驗例2上的hADSC。存活細胞係的染色強度較高。第9(a)圖顯示在37℃下3天的hADSC，而第9(b)圖顯示在4℃下5小時的hADSC，比例尺代表500μm。如第9圖(a)-(b)所示，在部份脫附前後，實驗例2上的hADSC皆為活細胞。

為了探討從實驗例2上脫附的hADSC之健康度，在第5循環後脫附的hADSC被抗體染色並由流式細胞儀分析。第10A-10D圖係顯示從實驗例2脫附之歷經部分脫附循環之hADSC間質幹細胞(MSC)標記CD44、CD73、CD90及造血幹細胞與內皮前驅細胞標記CD34表現之流式細胞儀散佈圖。如第10A-10D圖所示，從實驗例2脫附之hADSC強力表現MSC表面標記CD44、CD73、CD90而並未表現CD34。此型態類似於培養在比較例1上之hADSC，顯示從熱感應性表面脫附的hADSC係強健而健康的。

實驗例1-2及比較例3-4：

從熱感應性表面部分脫附hESC

除了分析hADSC，hESC從熱感應性表面的部分脫附亦被評估。第11圖係顯示根據本發明實驗例1-2及比較例3-4之培養於熱感應性表面之hESC的型態圖。用於hESC(WA09細胞株)培養的熱感應性表面具有25%的P[St-AA]-oligoVN覆蓋率及不同N：P比例。在第(a)及(e)圖中，N：P是0：0(比較例 3)。在第(b)及(f)圖中，N：P是1：0(實驗例1)。在第(c)及(g)圖中，N：P是4：1(實驗例2)。在第(d)及(h)圖中，hESC係生長於Matrigel(比較例4)。第11圖(a)-(d)顯示培養於37℃下5天的hESC，而第11圖(e)-(h)顯示培養於4℃下6小時的hESC。

如第11圖(a)-(d)所示，培養於37℃的5hESC在所有組別皆貼附良好。在第11圖(e)-(h)中，當溫度降至4℃達6小時，在實驗例1及2上的hESC不需要移液(pipetting)即可部份脫附，而比較例3及4上的hESC在溫度降低後未展現細胞脫附。這顯示hESC可透過部分脫附而持續培養於熱感應性表面上。

實驗例1-2、4-13及比較例1、4-7：

具有不同P[St-AA]-oligVN覆蓋率及N：P比例之熱感應性表面上hESC的貼附、脫附、及分化

為了探討不同P[St-AA]-oligVN覆蓋率及N：P比例對hESC的貼附、脫附、及分化之影響，此測試包含16種不同表面，由25%、50%、75%、及100%的P[St-AA]-oligVN覆蓋率搭配1：0、9：1、4：1、及0：1的N：P比例所定義而來。實驗例5、6、7、及1具有1：0的N：P比例及分別100%、75%、50%、及25%的覆蓋率。實驗例8、9、10、及4具有9：1的N：P比例及分別100%、75%、50%、及25%的覆蓋率。實驗例11、12、13、及2具有4：1的N：P比例及分別100%、75%、50%、及25%的覆蓋率。比較例5、6、7、及1具有0：1的N：P比例及分別100%、75%、50%、及25%的覆蓋率。

第12A圖係顯示根據本發明實驗例1-2、4-13及比較例1、4-7之培養於熱感應性表面之hESC的的貼附率圖。如第12A圖所示，實驗例5-13展現高hESC貼附率(高於55%)。相較之下，實驗例2、4及比較例1展現低hESC貼附率(低於40%)。

第12B圖係顯示根據本發明實驗例1-2、4-13及比較例1、4-7之培養於熱感應性表面之hESC的的脫附率圖。如第12B圖所示，除了比較例1之外，hESC的脫附率在所有組別中皆相對偏低(低於55%)。這說明了hESC相較於hADSC(具有50-90%的脫附率)對熱感應性表面展現更高的親和力。此外，P[St-NIPAAm]在表面的非均質分布可導致不同的hESC脫附情形。因此，儘管P[St-NIPAAm]在4℃的親水性增加，hESC的脫附仍較困難，使得實驗例5-13能同時達成部分脫附及高貼附率。

第12C圖係顯示根據本發明實驗例1-2、4-13及比較例1、4-7之培養於熱感應性表面之hESC的的分化率圖。如第12C圖所示，hESC在實驗例1-2、4-13及比較例4-7幾乎未被觀察到分化。然而，比較例1可觀察到高於3%的分化率。這顯示P[St-AA]-oligoVN覆蓋率25%而缺乏P[St-NIPAAm]會使所提供的hESC附著位置不足，使得多能性無法維持。

實驗例11及比較例4：

從熱感應性表面連續收穫hESC

表2 hESC部分脫附的溫度控制時間表

上述表2包含3個交替溫度變化的循環。每個循環包含在37℃的細胞增生期及4℃的細胞脫附期。細胞增生期在第3循環時增長，而細胞脫附期在所有循環中維持6小時。

第13A圖係顯示根據本發明實驗例11之歷經部分脫附循環之hESC的型態圖。箭頭指出脫附的hESC群集。比例尺代表500μm。如第13A圖所示，在3個循環中，實驗例11(P[St-AA]-oligoVN覆蓋率100%而N：P比例4：1)的hESC可在37℃時良好貼附至實驗例11，並在4℃時重複地由實驗例11部分脫附，其促成hESC的連續收穫。

第13B圖係顯示根據本發明實驗例11及比較例4之歷經部分脫附循環之hESC的脫附率圖。實驗例11的脫附率在第2循環時下降，而在第3循環時回升，而所有脫附率皆高於25%。相對地，比較例4(Matrigel表面)在所有循環中幾乎沒有hESC脫附。

實驗例11及比較例4：

在連續收穫後hESC的多能性及分化能力

為了探討hESC在連續收穫後的多能性，在3個部分脫附循環後從實驗例11脫附的hESC被免疫染色以檢驗多能性標記octamer-binding transcription factor 4(Oct4)及sex determining region Y-box 2(Sox2)的表現。hESC亦被Hoechst染色以標示細胞核。第14A圖(a)-(d)分別顯示在3個部分脫附循環後由實驗例11脫附的hESC之Oct4、Sox2、Hoechst及重疊訊號圖。第14A圖(e)-(h)分別顯示培養於比較例4的hESC之Oct4、Sox2、Hoechst及重疊訊號圖。比例尺代表100μm。

如第14A圖(a)-(d)所示，在經過3個部分脫附循環後，hESC強力表現Oct4及Sox2蛋白。在第14A圖(e)-(h)中，培養於比較例4的hESC亦表現這些蛋白。這顯示在連續收穫之後hESC的多能性仍被維持。

為了探討所維持的多能性能否對應至分化能力，在3個部分脫附循環後從實驗例11脫附的hESC之分化能力主要以形成胚體(embryoid body)的能力進行檢驗。第14B圖係顯示根據本發明實驗例11之部分脫附循環後的hESC所形成之胚體圖。如第14B圖所示，胚體可由3個部分脫附循環後從實驗例11脫附的hESC所形成。

為了進一步探討分化的細胞類型，在3個部分脫附循環後從實驗例11脫附的hESC被內胚層標記甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、中胚層標記平滑肌肌動蛋白(smooth muscle actin，SMA)、及外胚層標記神經膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)進行免疫染色。

第14C圖係顯示根據本發明實驗例11之部分脫附循環後的hESC之分化標記表現的免疫染色圖。第14C圖(a)-(c)分別顯示AFP、Hoechst、及重疊訊號圖。第14C圖(d)-(f)分別 顯示SMA、Hoechst、及重疊訊號圖。第14C圖(g)-(i)分別顯示GFAP、Hoechst、及重疊訊號圖。比例尺代表100μm。

如第14C圖(a)-(c)、(d)-(f)、及(g)-(i)分別所示，hESC高度表現AFP、SMA、及GFAP。這顯示由熱感應性表面脫附的hESC仍可在連續收穫後維持可分化成三個胚層(內胚層、中胚層、及外胚層)衍生細胞之能力。

實驗例14及比較例8：

oligoVN接枝後oligoVN與PVA-IA水膠之鍵結

在此研究中，接枝至PVA-IA水膠的寡肽為oligoVN。交聯24小時後之PVA-IA水膠被分為兩組：一組有接枝oligoVN(實驗例14)，另一組則沒有接枝(比較例8)。對比較例14而言，接枝時oligoVN於第四溶液中之濃度為1000μg/ml。為了評估在接枝後oligoVN的存在及其鍵結，實驗例14及比較例8皆透過X射線光電子能譜學(XPS)進行檢驗。

第15A-15D圖係顯示根據本發明實驗例14及比較例8之C1s及N1s峰值的高解析度XPS光譜圖。第15A及15B圖分別顯示比較例8之C1s及N1s峰值。第15C及15D圖分別顯示實驗例14之C1s及N1s峰值。如第15C圖所示，C-N鍵結(285.9eV),O-C=O鍵結(289.3eV)、與C-C和C-H鍵結(285.0eV)可在實驗例14的XPS光譜中被清晰觀察到。但在第15A圖中，主要僅有C-C和C-H鍵結(285.0eV)可在比較例8的XPS光譜中被觀察到。如第15D圖所示，在399eV的顯著N1s峰值可在在實驗例14的XPS光譜中被觀察到。但在第15B 圖中，在399eV僅有微弱的N1s峰值可在比較例8的XPS光譜中被觀察到。由於PVA-IA水膠缺乏氮原子，因此氮原子是在oligoVN接枝之後才取得。實驗例14的C-N鍵結及O-C=O鍵結顯示oligoVN是以共價鍵連接至PVA-IA水膠而形成PVA-IA-oligoVN水膠。

實驗例14-19及比較例2、9：

oligoVN濃度對於所接枝oligoVN之影響

第16A圖係顯示根據本發明實驗例14-19及比較例2、9之不同VN寡肽(oligoVN)濃度下PVA-IA-oligoVN水膠的氮/碳(N/C)之原子比例圖。實驗例15、16、17、18、14、及19代表交聯24小時之PVA-IA-oligoVN水膠，在接枝時的oligoVN濃度分別為50、100、250、500、1000、及1500μg/ml。比較例9為僅進行EDC/NHS活化而交聯24小時之PVA-IA-oligoVN水膠。如第16A圖所示，比較例2及9的N/C比例極微。相較之下，N/C比例隨著oligoVN濃度增加至500μg/ml而增加，如實驗例15-18所示。然而，當oligoVN濃度高於500μg/ml，N/C比例即約略相同而位在實驗誤差內，如實驗例14及19所示。這顯示當oligoVN濃度到達500μg/ml時，接枝至PVA-IA水膠之oligoVN的表面密度達到飽和。

實驗例18、20-23：

不同長度的交聯時間對所接枝oligoVN之影響

第16B係顯示根據本發明實驗例18、20-23之不同長度交聯時間下PVA-IA-oligoVN水膠的氮/碳(N/C)之原子比 例圖。實驗例20、21、22、18、及23為接枝時oligoVN濃度為500μg/ml而交聯時間分別為1、6、12、24、及48小時的PVA-IA-oligoVN水膠。如第16B圖所示，實驗例18、20-23的N/C比例大致相同。由於交聯時間的不同會導致PVA-IA-oligoVN水膠的彈性不同，這顯示不論PVA-IA-oligoVN水膠的彈性，接枝至PVA-IA水膠的oligoVN之表面密度大致相同。

實驗例18、20-23及比較例4、10：

hPSC在不同彈性的PVA-IA-寡肽水膠上的貼附及分化

上述表3係顯示有關於不同交聯時間的PVA-IA-oligoVN水膠之彈性。交聯時間愈長，儲能模數愈高，而水膠愈堅硬。

第17A圖係顯示根據本發明實驗例18、20-23及比較例4、10之培養於不同彈性PVA-IA-oligoVN水膠的hESC之型態圖。比較例10代表Synthemax II表面，而比較例4代表Matrigel表面。比例尺代表100μm。如第17A圖所示，第1代的hESC(WA09細胞株)而並未貼附至實驗例20，因為其水 膠柔軟(儲能模數低於15kPa)。然而，，hESC可良好貼附至實驗例18、21-23，因為其儲能模數高於15kPa。這顯示儲能模數高於15kPa的PVA-IA-oligoVN水膠對於hESC的貼附是必需的。

第17B圖係顯示根據本發明實驗例18、21-23及比較例4、10之培養於不同彈性PVA-IA-oligoVN水膠的hESC及hiPSC之貼附率圖。hESC(WA09細胞株)及hiPSC(HPS0077細胞株)在實驗例18及比較例4上皆展現高貼附率。然而，hPSC在實驗例21-23及比較例10上展現中低貼附率。這顯示最適的儲能模數25.3kPa(實驗例18)在所有PVA-IA-oligoVN水膠中展現最高的貼附率。

第17C圖係顯示根據本發明實驗例18、21-23及比較例4、10之培養於不同彈性PVA-IA-oligoVN水膠的hESC及hiPSC之分化率圖。hESC(WA09細胞株)及hiPSC(HPS0077細胞株)在實驗例18及比較例4上皆展現低分化率。然而，hESC及hiPSC在實驗例23及比較例10上展現高分化率。這顯示最適的儲能模數25.3kPa(實驗例18)對於維持多能性是必須的。

根據上述貼附率及脫附率，PVA-IA-oligoVN水膠的最適儲能模數被定為25.3kPa，以使hESC及hiPSC皆能達到高貼附率及高多能性(低分化率)。

實驗例14-19及比較例4、10：

在oligoVN表面密度不同的PVA-IA-寡肽水膠上hESC之貼附與分化

第18A圖係顯示根據本發明實驗例14、16-19及比較例4、10之培養於不同oligoVN表面密度之PVA-IA-oligoVN水膠的hESC及hiPSC之型態圖。實驗例15、16、17、18、14、及19代表交聯24小時之PVA-IA-oligoVN水膠，在接枝時的oligoVN濃度分別為50、100、250、500、1000、及1500μg/ml。比較例10代表Synthemax II表面，而比較例4代表Matrigel表面。箭頭指出已脫附細胞。比例尺代表100μm。如第18A圖所示，可發現hESC(WA09細胞株)輕易地從實驗例15-17脫附，其oligoVN濃度皆小於500μg/ml。此外，由於貼附狀況差，hESC無法培養於實驗例15上超過2代。

第18B圖係顯示根據本發明實驗例14、16-19及比較例4、10之培養於不同oligoVN表面密度之PVA-IA-oligoVN水膠的hESC及hiPSC之貼附率圖。hESC(WA09細胞株)及hiPSC(HPS0077細胞株)在第3代時隨著oligoVN濃度增加至500μg/ml而貼附率增加，如實驗例16-18所顯示。一旦oligoVN濃度到達500μg/ml，hESC及hiPSC的貼附率及大致維持相同而位於實驗誤差內，如實驗例14及19所顯示。hESC及hiPSC在實驗例14及19的貼附率顯著高於在比較例10的貼附率，但略低於在比較例4的貼附率。這顯示hESC及hiPSC的貼附率在oligoVN濃度為500μg/ml時達飽和。

第18C圖係顯示根據本發明實驗例14、16-19及比較例4、10之培養於不同oligoVN表面密度之PVA-IA-oligoVN水膠的hESC及hiPSC之分化率圖。hESC(WA09細胞株)及 hiPSC(HPS0077細胞株)於第3代時在實驗例18、14、19及比較例4上皆展現極低的分化率。但hPSC卻在實驗例16-17上展現高分化率。這顯示維持hESC及hiPSC多能性的oligoVN臨界濃度為500μg/ml。

基於hPSC的貼附率及脫附率，接枝時的oligoVN濃度應高於500μg/ml(例如500-1500μg/ml)以使hESC及hiPSC良好貼附至PVA-IA-oligoVN水膠並維持高多能性。

實驗例14及比較例4、10：

hESC及hiPSC在無外源培養條件下於具有最適彈性PVA-IA-oligoVN水膠的長期培養

為了評估hESC及hiPSC在PVA-IA-oligoVN水膠上的多代培養，hESC(WA09細胞株)及hiPSC(HPS0077細胞株)係培養於實驗例14(交聯24小時、oligoVN濃度1000μg/ml而具有最適彈性25.3kPa)、比較例4(Matrigel表面)及比較例10(Synthemax II表面)。

第19A-19B圖係顯示根據本發明實驗例14及比較例4、10之多代培養於最適彈性PVA-IA-oligoVN水膠的hESC及hiPSC之增生率圖。第19A圖代表hESC的增生倍率，而第19B圖代表hiPSC的增生倍率。如第19A-19B圖所示，培養於實驗例14的hESC及hiPSC增生倍率幾乎與比較例10之倍率相同，但略低於比較例4之倍率。

第20A-20B圖係顯示根據本發明實驗例14及比較例4、10之多代培養於最適彈性PVA-IA-oligoVN水膠的hESC 及hiPSC之貼附率圖。第20A圖代表hESC的貼附率，而第20B圖代表hiPSC的貼附率。如第20A-20B圖所示，縱使培養於實驗例14的hESC及hiPSC之貼附率在20代中未顯著高於比較例10，但在較早世代(少於5代)卻有顯著差異。此外，培養於比較例4的hESC及hiPSC之貼附率在20代中皆高於80%。

第21A-21B圖係顯示根據本發明實驗例14及比較例4、10之多代培養於最適彈性PVA-IA-oligoVN水膠的hESC及hiPSC之分化率圖。第21A圖代表hESC的分化率，而第21B圖代表hiPSC的分化率。如第21A-21B圖所示，培養於實驗例14的hESC及hiPSC之分化率與在比較例4上的分化率一樣低，並顯著低於比較例10。

根據上述，即便比較例4的培養之增生倍率及貼附率較佳，其培養係在具有外源(xeno-containing)的條件下，因此不利於後續的臨床應用。然而，實驗例14的培養相較於比較例10在無外源(xeno-free)條件下具有較高貼附率及較低分化率。因此，這些結果顯示hESC及hiPSC可在無外源條件下培養於實驗例14上進行多代培養。

實驗例14及比較例10：

培養於PVA-IA-oligoVN水膠的hESC型態

第22圖係顯示根據本發明實驗例14及比較例10之培養於最適彈性PVA-IA-oligoVN水膠的hESC之群集型態圖。第22圖(a)-(b)代表培養於比較例10上的hESC，而第22圖(c)-(d)代表培養於實驗例14上的hESC。箭頭指出已分化 hESC。比例尺在(a)-(b)中代表50μm，而在(c)-(d)中代表100μm。培養於比較例10及實驗例14之hESC係事先培養於DMEM/Ham’s F-12培養基中的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)滋養層上。

如第22圖所示，轉移至比較例10的hPSC在第1代時更容易分化，而轉移至實驗例14的hPSC維持多能性。換句話說，hESC在比較例10上相較於在實驗例14上展現更顯著的分化。

實驗例14：

培養於PVA-IA-oligoVN水膠的hESC及hiPSC之多能性

hESC(WA09細胞株)及hiPSC(HPS0077細胞株)的多能性係在培養於實驗例14上經過20代後進行免疫染色，由多能性標記Oct3/4、Sox2、腫瘤相關抗原-1-81(tumor-related antigens-1-81，Tra-1-81)、及階段特定性胚胎抗原-4(stage-specific embryonic antigen-4，SSEA-4)的表現量所判定。hESC同時以Hoechst染色以染出細胞核並標示細胞位置。

第23A-23B圖係顯示根據本發明實驗例14之培養於PVA-IA-oligoVN水膠的hESC及hiPSC之多能性標記表現的免疫染色圖。第23A圖代表hESC的蛋白表現，而第23A圖代表hiPSC的蛋白表現。第23A圖(a)-(d)分別顯示hESC的Oct3/4、Sox2、Tra-1-81、及SSEA-4訊號，而23A圖(e)-(h)則顯示分別對應到第23A圖(a)-(d)的hESC之Hoechst訊號。 第23B圖(a)-(d)分別顯示hiPSC的Oct3/4、Sox2、Tra-1-81、及SSEA-4訊號，而23B圖(e)-(h)則顯示分別對應到第23B圖(a)-(d)的hiPSC之Hoechst訊號。比例尺代表100μm。

如第23A-23B圖所示，於無外源條件下在實驗例14上經過20代培養的hESCs(WA09細胞株)及hiPSCs(HPS0077細胞株)強力表現Oct3/4、Sox2、Tra-1-81、及SSEA-4，顯示其維持多能性。

實驗例14：

培養於PVA-IA-oligoVN水膠的hESC及hiPSC之體外分化

hESC及hiPSC之體外(in vitro)分化係透過胚體(EB)的形成來評估。於無外源條件下在實驗例14上經過20代培養後，hESC(WA09細胞株)及hiPSC(HPS0077細胞株)接著以極低蛋白附著培養盤進行懸浮培養以形成EB。

第24A圖係顯示根據本發明實驗例14之培養於PVA-IA-oligoVN水膠的hESC及hiPSCs所形成之胚體圖。第24A圖(a)-(b)代表由hESC(WA09細胞株)形成之胚體，而第24A圖(c)-(d)代表由hiPSC(HPS0077細胞株)形成之胚體。

在EB形成後，EB的體外分化能力係進一步透過進行中胚層及外胚層標記之免疫染色來檢驗。第24B圖係顯示根據本發明實驗例14之培養於PVA-IA-oligoVN水膠的hESC之分化標記表現的免疫染色圖。第24B圖(a)-(d)分別代表GFAP(外胚層標記)、SMA(中胚層標記)、Hoechst(細胞核標記)、及 重疊之表現影像圖。第24B圖(e)-(h)分別代表βIII-tubulin(外胚層標記)、AFP(中胚層標記)、Hoechst(細胞核標記)、及重疊之表現影像圖。比例尺代表100μm。如第24B圖(a)-(d)所示，可觀察到GFAP及SMA的同位置表現。如第24B圖(e)-(h)所示，亦可觀察到βIII-tubulin及AFP的同位置表現。

第24C圖係顯示根據本發明實驗例14之培養於PVA-IA-oligoVN水膠的hiPSC之分化標記表現的免疫染色圖。第24C圖(a)-(d)分別代表GFAP(外胚層標記)、SMA(中胚層標記)、Hoechst(細胞核標記)、及重疊之表現影像圖。第24C圖(e)-(h)分別代表βIII-tubulin(外胚層標記)、AFP(中胚層標記)、Hoechst(細胞核標記)、及重疊之表現影像圖。比例尺代表100μm。如第24C圖(a)-(d)所示，可觀察到GFAP及SMA的同位置表現。如第24C圖(e)-(h)所示，亦可觀察到βIII-tubulin及AFP的同位置表現。

這些結果顯示於無外源條件下在實驗例14上經過20代培養後，hESC及hiPSC皆能維持多能性而在體外分化成三個胚層的衍生細胞，包括表現GFAP及β III-tubulin的外胚層細胞或表現AFP及SMA的中胚層細胞。

實驗例14：

培養於PVA-IA-oligoVN水膠的hESC之體內分化

hESC的體內(in vivo)分化能力係透過畸胎瘤的形成進行評估。在實驗例14上經過10代培養的hESC(WA09細胞株)接著以皮下方式外源移植至非肥胖糖尿病/嚴重複合型免 疫缺乏症(SCID)小鼠以產生畸胎瘤。畸胎瘤以蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，H&E)染色，其中蘇木精標示出細胞核，而伊紅標示出細胞質。

第25A-25D圖係顯示根據本發明實驗例14之培養於PVA-IA-oligoVN水膠的hESC之體內分化圖。比例尺代表100μm。箭頭指出已分化細胞。如第25A-25B圖所示，皮下外源移植至小鼠的hESCs(WA09細胞株)在8週後形成畸胎瘤(被圈選部分)，而畸胎瘤直徑約10-15公分。如第25C圖所示，H&E染色顯示已分化細胞，包括來自中胚層的成骨細胞(osteoblast)(左上箭頭)及軟骨細胞(chondrocyte)(右下箭頭)。如第25D圖所示，H&E染色顯示已分化細胞，包括來自內胚層的腸細胞(enteron)(右上箭頭)及來自外胚層的神經元(neuron)(左下箭頭)。

上述結果顯示在實驗例14(交聯24小時、oligoVN濃度1000μg/ml而具有最適彈性25.3kPa)長期培養10-20代的hESC及hiPSC可維持多能性，而在體內及體外分化成來自三個胚層的衍生細胞。

實驗例17、24及25：

培養於PVA-IA-寡肽水膠的hESC在部分脫附循環中的脫附率

經了解培養在PVA-IA-oligoVN水膠上培養10-20代的hESC的生長穩定、多能性維持、及分化能力後，評估在 同一PVA-IA-寡肽水膠上、經多次部分脫附循環後的hESC亦至為重要。

培養於PVA-IA-寡肽水膠的hESC可藉由施加剪應力於PVA-IA-寡肽水膠而部分脫附，其係藉由在37℃的培養溫度下以60rpm之速率搖晃含有PVA-IA-寡肽水膠的細胞培養裝置5分鐘而達成。部份脫附使得留存的hESC後續能在培養過程中於同一PVA-IA-寡肽水膠上增生群集，因而可達成hESC的連續收穫。

表4顯示培養於四種不同PVA-IA-寡肽水膠上的hESC可進行10個循環的部分脫附。實驗例17、24、及25為交聯24小時的PVA-IA水膠培養皿，而在接枝時分別具有500μg/ml的oligoVN、BSP寡肽、及VN2C寡肽。由於交聯時間為24小時，實驗例17、24、25皆展現25.3kPa的彈性。如上表4所示，在實驗例17、24、及25的hESC皆在10個部分脫附循 環中展現78-92%的脫附率，顯示在實驗例17、24、及25的hESC在多個循環中的脫附率約略一致。

實驗例17、17’、24及25：

培養於PVA-IA-寡肽水膠的hESC在部分脫附循環中的增生倍率

除了脫附率，培養於PVA-IA-寡肽水膠(包含實驗例17、17’、24、25)的hESC在部分脫附循環中的增生倍率亦進行評估。

實驗例17及17’的差異在於實驗例17為PVA-IA-oligoVN水膠於培養皿上，而實驗例17’為PVA-IA-oligoVN水膠於微載體上。如表5所示，實驗例17及24上的hESC展現出略低的增生倍率，其每一循環中的增生倍率皆低於10.5。然而，在實驗例17’及24’上的hESC展現略低的增生倍率，其每一循環中的增生倍率皆不低於10.5。這顯示 在微載體上的PVA-IA-oligoVN水膠及接枝VN2C寡肽的PVA-IA水膠適宜hESC進行數次部分脫附循環及連續收穫。

雖然本發明已以實施方式揭露如上，但其他實施方式亦有可能。因此，所請請求項之精神與範圍並不限定於此處實施方式所含之敘述。

任何熟習此技藝者可明瞭，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

40‧‧‧細胞培養裝置

100‧‧‧容器

112‧‧‧聚乙烯醇-共-衣康酸(PVA-IA)水膠

220‧‧‧寡肽

221‧‧‧玻連蛋白(VN)寡肽

222‧‧‧骨涎蛋白(BSP)寡肽

224‧‧‧肝素結合肽(HBP1)

226‧‧‧玻連蛋白2C(VN2C)寡肽

228‧‧‧玻連蛋白2G(VN2G)寡肽

Claims (13)

1. 一種幹細胞培養裝置，包含：一容器，具有一表面；以及複數個奈米刷毛，固定於該表面，其中該些奈米刷毛包含細胞外基質(ECM)片段接枝聚[苯乙烯-共-丙烯酸](poly[styrene-co-acrylic acid]，P[St-AA])與聚[苯乙烯-共-丙烯酸](poly[styrene-co-N-isopropylacrylamide]，P[St-NIPAAm])，該細胞外基質(ECM)片段用以提供該幹細胞附著位置。
2. 如申請專利範圍第1項所述之幹細胞培養裝置，其中該表面包含聚苯乙烯。
3. 如申請專利範圍第1項所述之幹細胞培養裝置，其中該細胞外基質片段是玻連蛋白(vitronectin，VN)寡肽。
4. 如申請專利範圍第1項所述之幹細胞培養裝置，其中該些奈米刷毛更包含聚[苯乙烯-共-聚乙二醇甲基丙烯酸酯](poly[styrene-co-polyethylene glycol methacrylate]，P[St-PEGMA])。
5. 如申請專利範圍第4項所述之幹細胞培養裝置，其中該聚[苯乙烯-共-聚乙二醇甲基丙烯酸酯] (P[St-PEGMA])對該聚[苯乙烯-共-N-異丙烯丙烯醯胺](P[St-NIPAAm])之一重量比為0：1至3：7。
6. 如申請專利範圍第1項所述之幹細胞培養裝置，其中該容器包含一培養皿、一培養瓶或一微載體。
7. 一種形成幹細胞培養裝置之方法，該方法包含：提供具有一表面之一容器，其中該表面包含聚苯乙烯；塗覆聚[苯乙烯-共-丙烯酸](poly[styrene-co-acrylic acid]，P[St-AA])至該表面上；以N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化被塗覆該聚[苯乙烯-共-丙烯酸](P[St-AA])之該表面，以形成一已活化表面；在活化被塗覆該聚[苯乙烯-共-丙烯酸](P[St-AA])之該表面之後，接枝細胞外基質(ECM)片段至該聚[苯乙烯-共-丙烯酸](P[St-AA])；以及在接枝該細胞外基質(ECM)片段之後，塗覆聚[苯乙烯-共-N-異丙烯丙烯醯胺](poly[styrene-co-N-isopropylacrylamide]，P[St-NIPAAm])至該已活化表面上。
8. 如申請專利範圍第7項所述之方法，更包含在接枝該細胞外基質(ECM)片段之後，塗覆聚[苯乙烯-共-聚乙 二醇甲基丙烯酸酯](poly[styrene-co-polyethylene glycol methacrylate]，P[St-PEGMA])至該已活化表面上。
9. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中塗覆該聚[苯乙烯-共-丙烯酸](P[St-AA])至該表面上包含將包含該聚[苯乙烯-共-丙烯酸](P[St-AA])之一第一溶液加至該表面上，且該聚[苯乙烯-共-丙烯酸](P[St-AA])於該第一溶液中具有一濃度為0.5-3.5mg/ml。
10. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中塗覆該聚[苯乙烯-共-N-異丙烯丙烯醯胺](P[St-NIPAAm])至該已活化表面上包含將包含該聚[苯乙烯-共-N-異丙烯丙烯醯胺](P[St-NIPAAm])之一第二溶液加至該已活化表面上，且該聚[苯乙烯-共-N-異丙烯丙烯醯胺](P[St-NIPAAm])於該第二溶液中具有一濃度為2-5mg/ml。
11. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中塗覆該聚[苯乙烯-共-聚乙二醇甲基丙烯酸酯](P[St-PEGMA])至該已活化表面上包含將包含該聚[苯乙烯-共-聚乙二醇甲基丙烯酸酯](P[St-PEGMA])之一第三溶液加至該已活化表面上，且該聚[苯乙烯-共-聚乙二醇甲基丙烯酸酯](P[St-PEGMA])於該第三溶液中具有一濃度為2-5mg/ml。
12. 一種從申請專利範圍第1項所述之該幹細胞培養裝置部分脫附幹細胞之方法，該方法包含：下種一些幹細胞至該些奈米刷毛；在35℃至40℃下培養該些幹細胞；將該些奈米刷毛之一溫度降低至0℃至20℃，以從該些奈米刷毛脫附一部分之該些幹細胞，從而收穫該部分之該些幹細胞。
13. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該些幹細胞為人類脂肪誘導幹細胞(hADSC)、人類胚胎幹細胞(hESC)、人類誘導多能性幹細胞(hiPSC)、或其組合。