TWI586808B - 用於檢測葡萄球菌菌株的核酸分子、檢驗套組、生物晶片以及方法 - Google Patents

Description

用於檢測葡萄球菌菌株的核酸分子、檢驗套組、生物晶片以及方法

本發明是有關於用於檢測葡萄球菌菌株(Staphylococcus strains)的核酸分子。本發明亦有關於使用該等核酸分子來檢測存在於一樣品中的葡萄球菌菌株的檢驗套組(diagnostic kit)、生物晶片(biochip)以及方法。

葡萄球菌屬物種(Staphylococcus spp.)是一群革蘭氏陽性的兼性厭氧菌(gram-positive facultative anaerobic bacteria)，它們普遍定殖(colonize)於人類與動物的皮膚(skin)以及黏膜(mucous membrane)上。目前常見的會感染人類與動物的葡萄球菌屬物種包括：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、溶血性葡萄球菌(S.haemolyticus)、肉葡萄球菌(S.carnosus)、豬葡萄球菌(S.hyicus)、中間型葡萄球菌群(S.intermedius group,SIG)[包括中間型葡萄球菌(S.intermedius)以及假中間型葡萄球菌(S.pseudintermedius)]以及木糖葡萄球菌(S.xylosus)等。

葡萄球菌屬物種屬於一種伺機性病原菌(opportunistic pathogen)，主要會引起人類的食品中毒、院內感染(nosocomial infections)以及敗血症(sepsis)等。此外，葡萄球菌屬物種亦會造成哺乳類動物(諸如牛或羊)的乳腺炎(mastitis)以及皮膚炎(dermatitis)，進而使得乳製品或肉製品受到污染。由於葡萄球菌屬物種已嚴重地威脅到人類的健 康並且造成畜牧業以及食品業的損失，因此，如何早期且快速地檢測出這些葡萄球菌屬物種即成為本技術領域的研究人員關注與研究的重點。

為了克服傳統的菌株培養與菌學特徵鑑定[例如：革蘭氏染色(gram staining)、API鑑定系統、生理或生化特徵鑑定、抗生素耐受性試驗等]在操作過程上較為繁複且耗時之缺點，目前有許多分子生物學方法已被應用於檢測葡萄球菌物種，這些方法包括：聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)、脈衝電場凝膠電泳(pulse-field gel electrophoresis,PFGE)、多重聚合酶鏈反應(multiplex polymerase chain reaction)、隨機擴增的多型性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)、限制片段長度多型性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)、免疫分析法(Immunoassay method)、DNA探針分析法(DNA probe method)以及生物晶片(biochip)等。

近年來，生物晶片技術的發展已逐漸受到重視並且已被廣泛地應用於各種病原菌(pathogen)的檢測、癌症的分類、新藥的研發以及基因的定序與鑑定等等。生物晶片的優點包括：體積小、分析結果的可信度與精確性較高、分析速度快，以及使用較少的樣品與試劑即可獲得整體性的實驗數據。生物晶片依據其功能性可被區分為下面四大類：(1)基因晶片(gene chip)，亦被稱為微陣列晶片(microarray chip)；(2)微流體晶片(microfluidic chip)；(3)蛋白質晶片(protein chip)；以及(4)晶片實驗室(Lab-on-a- chip)。

一般而言，在細菌的基因組DNA序列中會包含有高度守恆(highly conserved)與高度變異(highly variable)的DNA序列，它們可供用於屬-特異性(genus-specific)或物種-特異性(species-specific)之檢測或鑑定。

熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)是一種細胞因應環境的壓力所產生的保護性蛋白質，它廣泛地存在於真核與原核細胞中並且依據分子量的大小可被區分為下面六個家族：HSP10(又被稱為GroES)、HSP40、HSP60(又被稱為GroEL)、HSP70、HSP90以及HSP100。熱休克蛋白基因(亦即hsp)是一種具有高度守恆性(high conservative)的內控基因(house-keeping gene)，它常被用來設計供用於偵測或鑑定細菌物種的專一性引子。例如，已有研究將hsp60基因應用在葡萄球菌屬物種(Staphylococcus spp.)、大型球菌屬物種(Maccrococcus spp.)以及曲桿菌屬物種(Campylobacter spp.)的物種鑑定(species identification)與系統分類(phylogenetic classification)上(Anita Y.C.Kwok and Anthony W.Chow(2003),International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,53：87-92；R.I.Kärenlampi et al.(2004),Journal of clinical microbiology,42：5731-5738)。

在Jui-Chang Tsai et al.(2005),Journal of clinical microbiology,43：235-241中，Jui-Chang Tsai等人發現在腸球菌屬物種(Enterococcus spp.)中，groES與groEL-groES基因間區域(intergenic region,IGR)具有高度種間變異(high interspecies variation)以及低度種內變異(low intraspecies variation)的特性，因而可供用於臨床上相關的腸球菌屬物種的鑑定。

另外，在弘光科技大學生物產業科技研究所的張予馨所著碩士論文[名稱：“利用熱休克蛋白基因及其區間序列設計Staphylococcus aureus、Staphylococcus saprophyticus、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus haemolyticus、Streptococcus agalactiae、Streptococcus uberis、Streptococcus bovis之特異性PCR引子組與生物晶片開發及應用(Development of PCR primers and microarrays for the detection of Staphylococcus aureus,Staphylococcus saprophyticus,Staphylococcus epidermidis,Staphylococcus haemolyticus,Streptococcus agalactiae,Streptococcus uberis and Streptococcus bovis using heat shock protein gene)”]中，張予馨利用Primer Premier 5.0軟體並針對金黃色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌以及溶血性葡萄球菌的完整基因組當中的hsp10基因、hsp60基因與hsp10-hsp60基因間區域而分別設計出4組專一性引子對，其中包括：適用於金黃色葡萄球菌的引子對S.aur-F/S.aur-R(對應於NCBI登錄編號NC_002758當中所示的核苷酸殘基位置2150637至2150659處以及2150413至2150392處)、適用於腐生葡萄球菌的引子對S.sap-F/S.sap-R(對應於NCBI登錄編號NC_002976當中所示的核苷酸殘基位置1553420至1553441處以及1553733至1553711處)、適用於表皮葡萄 球菌的引子對S.epi-F/S.epi-R(對應於NCBI登錄編號NC_007168當中所示的核苷酸殘基位置1010349至1010368處以及1010552至1010529處)以及適用於溶血性葡萄球菌的引子對S.hae-F/S.hae-R(對應於NCBI登錄編號NC_007350當中所示的核苷酸殘基位置880438至880455處以及880627至880608處)。另外，該篇碩士論文亦進一步依據上面4種葡萄球菌菌株的完整基因組當中的hsp10基因以及hsp60基因而設計出一組針對葡萄球菌屬物種的通用引子對(universal primer)universal-F與universal-R(對應於NCBI登錄編號NC_002758當中所示的核苷酸殘基位置2150335至2150353處與2150556至2150539處，NCBI登錄編號NC_002976當中所示的核苷酸殘基位置1553657至1553675處與1553860至1553841處，NCBI登錄編號NC_007168當中所示的核苷酸殘基位置1010606至1010588處與1010396至1010413處，以及NCBI登錄編號NC_007350當中所示的核苷酸殘基位置880689至880671處與880478至880495處)。經由實驗結果證實，引子對S.aur-F/S.aur-R、S.sap-F/S.sap-R、S.epi-F/S.epi-R以及S.hae-F/S.hae-R分別對於金黃色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌以及溶血性葡萄球菌具有高度的專一性，因而可供用於物種-特異性之檢測，此外，通用引子對universal-F/universal-R對於葡萄球菌屬物種的檢測具有高度的專一性，因而可供用於屬-特異性之檢測。

雖然已存在有上述文獻報導，申請人仍積極致力於尋 找其它可供用於檢測葡萄球菌屬物種的核酸分子。因此，於本發明中，申請人選用groESL基因(包括groEL基因、groES基因以及groEL-groES的基因間區域)來作為標的基因(target gene)，並從中篩選出對於葡萄球菌屬物種(特別是肉葡萄球菌、豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌以及木糖葡萄球菌)具有高度專一性與靈敏度的核酸分子以供快速檢測或鑑定之用。

發明概要

於是，在第一個方面，本發明提供一種用於檢測一葡萄球菌菌株的核酸分子試劑，其包含有下列的至少一者：(a)一用於檢測豬葡萄球菌菌株的核酸分子，其具有一選自於如序列辨識編號：6以及序列辨識編號：7所示的核苷酸序列；(b)一用於檢測中間型葡萄球菌菌株的核酸分子，其具有一選自於如序列辨識編號：8、序列辨識編號：9以及序列辨識編號：16所示的核苷酸序列；(c)一用於檢測木糖葡萄球菌菌株的核酸分子，其具有一選自於如序列辨識編號：10、序列辨識編號：11以及序列辨識編號：17所示的核苷酸序列；(d)一用於檢測肉葡萄球菌菌株的核酸分子，其具有一選自於如序列辨識編號：12、序列辨識編號：13以及序列辨識編號：18所示的核苷酸序列；以及(e)一用於檢測葡萄球菌屬物種的菌株的核酸分子，其 具有一如序列辨識編號：14、序列辨識編號：15以及序列辨識編號：19所示的核苷酸序列。

上述的核酸分子對於所欲偵測的標的菌種皆具有高度的專一性(specificity)以及靈敏度(sensitivity)，因而可供用來檢測存在於一樣品中的葡萄球菌菌株。因此，在第二個方面，本發明提供一種用於檢測一樣品中是否存在有一葡萄球菌菌株的方法，其包括：令該樣品進行一種使用至少一組引子對的DNA擴增反應，其中該至少一組引子對是選自於由下列所構成的群組：(a)一用於檢測豬葡萄球菌菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：6所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：7所示的核苷酸序列之反向引子；(b)一用於檢測中間型葡萄球菌菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：8所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：9所示的核苷酸序列之反向引子；(c)一用於檢測木糖葡萄球菌菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：10所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：11所示的核苷酸序列之反向引子；(d)一用於檢測肉葡萄球菌菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：12所示的核苷酸序列之前向 引子，以及一具有一如序列辨識編號：13所示的核苷酸序列之反向引子；以及(e)一用於檢測葡萄球菌屬物種的菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：14所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：15所示的核苷酸序列之反向引子；以及檢測是否有一藉由使用該至少一組引子對而被擴增出的DNA片段，其中該DNA片段之存在表示有一對應於該至少一組引子對的葡萄球菌菌株之存在。

依據本發明的核酸分子亦被預期可作為探針。因此，在第三個方面，本發明提供一種用於檢測一樣品中是否存在有一葡萄球菌菌株的方法，其包括：令該樣品進行一種使用至少一個探針的雜交反應，其中該至少一個探針所具有的核苷酸序列以及所對應的葡萄球菌菌株是如上面對於該等核酸分子所界定者；以及檢測是否有一藉由使用該至少一個探針來進行雜交反應而被形成的雜交物，其中該雜交物之存在表示有一對應於該至少一個探針的葡萄球菌菌株之存在。

在第四個方面，本發明提供一種用於檢測一葡萄球菌菌株的檢驗套組，其包含有一如上所述的核酸分子試劑。

在第五個方面，本發明提供一種用於檢測一葡萄球菌菌株的生物晶片，其包含有一如上所述的核酸分子試劑。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得 明顯。

發明的詳細說明

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

為了本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：術語“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及術語“包括(comprises)”具有一對應的意義。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。為表清楚，下面的界定被使用於本文中。

如本文中所用的，“核酸”、“核酸序列”或“核苷酸序列”等術語意指呈單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸序列或核糖核苷酸序列，且當中包含有已知的天然存在的核苷酸(naturally occurring nucleotides)或人造化學仿效物。如本文中所用的，“核酸”此術語可與“基因”、“DNA”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“聚核苷酸”交換使用。

如本文中所用的，術語“核酸片段”與“DNA片段”可被互換地使用，並且意指一種DNA聚合物(DNA polymer)，該DNA聚合物是呈一獨立節段(separate segment)的形式或者是作為一較大的DNA建構物(DNA construct)的一組分 (component)，其可以是衍生自經分離的DNA(isolated DNA)或是藉由本技術領域中所熟知的方法而被化學地或酵素地合成。

除非另有指明，一核酸序列除了於本文中所揭示的特定序列外，亦涵蓋其互補序列(complementary sequences)，以及它們的守恆性類似物(conservative analogs)、相關的自然存在的結構變異體和/或合成的非天然存在的類似物。

如本文中所用的，“雜交(hybridization)”與“黏合(annealing)”等術語可被相互交換使用，並且意指2個單股核苷酸序列藉由依據華特生-克里克規則(Watson-Crick rules)而經由它們的嘌呤(purine)和/或嘧啶(pyrimidine)鹼基之氫鍵結(hydrogen bonding)來彼此序列專一性地結合，藉此而形成一雜交物(hybrid)。該雜交物是一個具有穩定的核酸結構的雙螺旋核酸複合物(duplex nucleic acid complex)，其包括RNA：RNA、RNA：DNA或DNA：DNA雙螺旋分子。

傳統上，在檢測會引起食品中毒的葡萄球菌菌株時大多是使用菌株培養與菌學特徵鑑定等方法，但是這些檢測方法具有操作過程較為繁複、耗時以及不精確等的缺點。因此，如何能快速且精確地檢測出存在於生物檢體或食品中的葡萄球菌菌株，已成為食品業以及醫學界努力的目標。分子生物學方法[諸如，聚合酶鏈反應(PCR)以及生物晶片技術等]具有速度快、分析結果的可信度與精確性高等之優點，因此，申請人致力於研發這方面的快速檢測方法。

一般而言，在細菌的基因組DNA序列中會包含有高度 守恆與高度變異的DNA序列，它們可供用於屬-特異性或物種-特異性之檢測或鑑定。因此，申請人選用groESL基因(包括groEL基因、groES基因以及groEL-groES基因間區域)來作為標的基因，並嘗試設計出對於葡萄球菌屬物種(特別是肉葡萄球菌、豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌以及木糖葡萄球菌)具有高度專一性與靈敏度的核酸分子以供快速檢測或鑑定之用。

就申請人所知，目前豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌以及木糖葡萄球菌的基因組(genome)尚未被完全地定序，因而無法得知這3種菌株的groESL基因的核苷酸序列與位置。因此，於本發明中，申請人選用5種基因組已被完全地定序的葡萄球菌菌株並且依據該5種菌株的完整基因組(complete genome)當中的groESL基因，其中包括：NCBI登錄編號NC_002758(金黃色葡萄球菌mu50的完整基因組)、NCBI登錄編號NC_002976(表皮葡萄球菌RP62A的完整基因組)、NCBI登錄編號NC_007168(溶血性葡萄球菌JCSC1435 DNA的完整基因組)、NCBI登錄編號NC_007350(腐生葡萄球菌ATCC 15305的完整基因組)以及NCBI登錄編號AM295250(肉葡萄球菌TM300的完整基因組)當中的groESL基因，而尋找出高度守恆的DNA序列並且據此來設計出一組簡併性引子對(degenerative primer pairs)Univer708F引子(序列辨識編號：1)與Univer708R引子(序列辨識編號：2)，繼而分別使用豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌以及木糖葡萄球菌的基因組DNA作為模版(template)來進 行聚合酶鏈反應(PCR)。之後，將所得到的3種菌株的PCR產物拿來進行定序分析，而分析結果顯示：豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌以及木糖葡萄球菌的PCR產物分別具有一如序列辨識編號：3至5所示的核苷酸序列。

之後，使用ClustalX軟體而將該3種菌株的PCR產物的核苷酸序列(序列辨識編號：3至5)拿來與上述5種基因組已被完全地定序的的葡萄球菌菌株(包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、腐生葡萄球菌以及肉葡萄球菌)的groESL基因的核苷酸序列進行比對分析，而分析結果發現：這8種葡萄球菌菌株在groEL基因以及groES基因的核苷酸序列上具有高度相似性，而在groEL-groES IGR的核苷酸序列上則具有高度變異性(參見圖1)。申請人據此而推論：依據本發明所得到的3種PCR產物(分別具有一如序列辨識編號：3至5所示的核苷酸序列)分別含有豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌以及木糖葡萄球菌的groESL基因片段(包括部分groEL基因、全長groEL-groES IGR以及部分groES基因)。

接著，申請人依據所得到的豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌與木糖葡萄球菌的groESL基因片段的核苷酸序列(序列辨識編號：3至5)以及NCBI登錄編號AM295250(肉葡萄球菌TM300的完整基因組)當中的groESL基因，而分別設計出對於豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌具有物種-特異性的引子對S.hyi F/S.hyi R、S.int F/S.int R、S.xyl F/S.xyl R以及S.car F/S.car R。另外，申請 人從圖1中所示之8種葡萄球菌菌株的groESL基因的核苷酸序列中去挑選出高度守恆的DNA序列，藉此而設計出對於葡萄球菌屬物種的菌株具有屬-特異性的簡併性引子對UniF/UniR。有關本發明的針對葡萄球菌菌株而設計出的4組物種-特異性引子對以及1組屬-特異性引子對所具有的核苷酸序列分別被彙整於表3以及表4中。

另一方面，申請人依據上面所得到之木糖葡萄球菌的groESL基因片段的核苷酸序列(序列辨識編號：5)與NCBI登錄編號AM295250(肉葡萄球菌TM300的完整基因組)當中的groEL-groES基因間區域，而分別設計出對於木糖葡萄球菌與肉葡萄球菌具有物種-特異性的探針。同時，申請人針對圖1所示之8種葡萄球菌菌株的groESL基因中具有高度守恆性的DNA序列，而設計出對於葡萄球菌屬物種的菌株具有屬-特異性的探針。此外，依據上述所設計出的S.int R引子的互補序列(complementary sequences)以及S.hyi R引子亦分別被使用作為針對中間型葡萄球菌以及豬葡萄球菌的物種-特異性探針。有關本發明的針對葡萄球菌菌株而設計出的4種物種-特異性探針以及1種屬-特異性探針所具有的核苷酸序列分別被彙整於表7以及表8中。

為了評估依據本發明的引子和/或探針對於葡萄球菌菌株的檢測專一性(specificity)以及靈敏度(sensitivity)，申請人以得自於不同食品樣品或生物樣品(biological sample)中之細菌菌株的基因組DNA作為模版，並分別使用本發明的4組物種-特異性引子對以及1組屬-特異性引子對來進行 PCR反應。所得到的PCR擴增產物在藉由瓊脂糖凝膠電泳分析後發現：依據本發明的引子對對於所欲偵測的標的葡萄球菌菌株皆具有高度的專一性以及靈敏度。

此外，申請人進一步將依據上述使用屬-特異性引子對UniF/UniR而得到的PCR擴增產物拿來與點佈(spotted)有依據本發明的探針的生物晶片進行雜交反應。經由雜交後的圖譜顯示：依據本發明的探針對於所欲偵測的標的葡萄球菌菌株亦都具有高度的專一性以及靈敏度。

基於以上所述，依據本發明的引子對與探針被預期可供用於快速地檢測存在於一樣品中的葡萄球菌菌株。於是，本發明提供一種用於檢測一葡萄球菌菌株的核酸分子試劑，其包含有下列的至少一者：(a)一用於檢測豬葡萄球菌菌株的核酸分子，其具有一選自於如序列辨識編號：6以及序列辨識編號：7所示的核苷酸序列；(b)一用於檢測中間型葡萄球菌菌株的核酸分子，其具有一選自於如序列辨識編號：8、序列辨識編號：9以及序列辨識編號：16所示的核苷酸序列；(c)一用於檢測木糖葡萄球菌菌株的核酸分子，其具有一選自於如序列辨識編號：10、序列辨識編號：11以及序列辨識編號：17所示的核苷酸序列；(d)一用於檢測肉葡萄球菌菌株的核酸分子，其具有一選自於如序列辨識編號：12、序列辨識編號：13以及序列辨識編號：18所示的核苷酸序列；以及 (e)一用於檢測葡萄球菌屬物種的菌株的核酸分子，其具有一如序列辨識編號：14、序列辨識編號：15以及序列辨識編號：19所示的核苷酸序列。

依據本發明的核酸分子可進一步使用一具有本技藝中的通常技術者所熟知的標準技術而被附接或結合至一個可偵測的標記(detectable label)以容許檢測或定量該等葡萄球菌菌株。適用於本發明之可偵測的標記包括，但不限於：半抗原標記(hapten labels)[例如，生物素(biotin)以及地高辛(digoxigenin,Dig)]、化學螢光標記(chemiluminescent labels)、螢光標記(fluorescent labels)[例如，螢光素(fluorescein)、玫瑰紅(rhodamine)、NH₂-花青基苷5(NH₂-cyanin 5,Cy5)以及NH₂-花青基苷3(NH₂-cyanin 3,Cy3)]、酵素標記、放射性標記(例如，³²P)、顆粒標記(particle labels)[例如，金膠體(gold colloids)]以及比色標記(colorimetric labels)[例如，染劑以及有色的玻璃或塑膠珠粒(colored glass or plastic beads)]。

依據本發明，當該等核酸分子被使用作為探針時，在它們的5’端和/或3’端上可加入或刪除至少一個核苷酸殘基，而使其所具有的長度是落在大約15至30個核苷酸殘基之範圍內。此外，在該等核酸分子的5’端和/或3’端上可加入至少一個胸苷(thymidine)以使得它們在被點佈(spotted)於生物晶片的表面上時可具有較佳的固定性(immobilization)，並且增強它們在進行雜交反應時所獲得的偵測訊號。而這些都是熟習此項技術者所詳知且慣用的 技術。較佳地，在該等核酸分子的5’端和/或3’端上所加入之胸苷的數目是落在大約10至35個的範圍內。

本發明亦提供一種用於檢測一樣品中是否存在有一葡萄球菌菌株的方法，其包括：令該樣品進行一種使用至少一組引子對的DNA擴增反應，其中該至少一組引子對是選自於由下列所構成的群組：(a)一用於檢測豬葡萄球菌菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：6所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：7所示的核苷酸序列之反向引子；(b)一用於檢測中間型葡萄球菌菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：8所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：9所示的核苷酸序列之反向引子；(c)一用於檢測木糖葡萄球菌菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：10所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：11所示的核苷酸序列之反向引子；(d)一用於檢測肉葡萄球菌菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：12所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：13所示的核苷酸序列之反向引子；以及(e)一用於檢測葡萄球菌屬物種的菌株的引子對，其包 含一具有一如序列辨識編號：14所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：15所示的核苷酸序列之反向引子；以及檢測是否有一藉由使用該至少一組引子對而被擴增出的DNA片段，其中該DNA片段之存在表示有一對應於該至少一組引子對的葡萄球菌菌株之存在。

依據本發明，在進行該DNA擴增反應之前，從該樣品中萃取出總基因組DNA以作為模版。

依據本發明，該DNA擴增反應可藉由使用下列方法學之至少一者而被進行：聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)、反轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)、即時定量聚合酶鏈反應(Real time quantitative PCR)、巢式PCR(nested PCR)、熱啟動PCR(hot-start PCR)、原位PCR(in-situ PCR)、簡併性寡核苷酸引子PCR(degenerate oligonucleotide primer PCR,DOP PCR)、微PCR(micro PCR)、多重聚合酶鏈反應(multiplex polymerase chain reaction)、以限制片段長度多型性核酸序列為主之擴增反應(restriction fragments length polymorphism nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)、轉錄-調節的擴增反應(transcription-mediated amplification,TMA)、環媒介等溫擴增反應(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)以及滾環擴增反應(rolling circle amplification,RCA)。有關這些方法學的操作條件的設定是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該DNA擴增反應可以在一選自於由下列所構成的群組中的生物晶片上被進行：微流體晶片(例如，樣品前處理晶片、反應型晶片以及分析型晶片)以及晶片實驗室。

依據本發明，該DNA片段的檢測可以藉由一種使用一探針的雜交反應而被進行。較佳地，該探針具有一選自於由下列所構成的群組中的核苷酸序列：序列辨識編號：6、序列辨識編號：7、序列辨識編號：8、序列辨識編號：9、序列辨識編號：10、序列辨識編號：11、序列辨識編號：12、序列辨識編號：13、序列辨識編號：14、序列辨識編號：15、序列辨識編號：16、序列辨識編號：17、序列辨識編號：18以及序列辨識編號：19。

在本發明的一個較佳具體例中，該探針具有一選自於由下列所構成的群組中的核苷酸序列：序列辨識編號：7、序列辨識編號：16、序列辨識編號：17、序列辨識編號：18以及序列辨識編號：19。

依據本發明，該雜交反應可以在一選自於由下列所構成的群組中的生物晶片上被進行：基因晶片、微流體晶片(例如，樣品前處理晶片、反應型晶片以及分析型晶片)以及晶片實驗室。在本發明的一個較佳具體例中，該雜交反應是在一基因晶片上被進行。

依據本發明，該樣品可以選自於下列所構成的群組：食品樣品、生物樣品以及環境樣品(environmental sample)。

較佳地，該樣品是一食品樣品，包括，但不限於：流 體乳品(fluid milk products)，例如牛奶以及羊奶；飲料(beverages)；肉品，例如雞肉、牛肉、羊肉以及豬肉；海產食品(sea foods)，例如魚類以及貝類(shellfish)；動物飼料(animal feeds)；水(water)；乳製品(dairy products)，例如優酪乳(yogurt)、冰淇淋(ice cream)以及乳酪(cream cheeses)；蔬菜；水果；以及罐頭食品(canned foods)。在本發明的一個較佳具體例中，該食品樣品是牛奶。在本發明的另一個較佳具體例中，該食品樣品是水。

較佳地，該樣品是一選自於由下列所構成的群組中的生物樣品：血液(blood)、血漿(plasma)、血清(serum)、尿液(urine)、唾液(saliva)以及糞便(feces)。在本發明的一個較佳具體例中，該生物樣品是血液。在本發明的另一個較佳具體例中，該生物樣品是尿液。

如此處所用的，一“環境樣品(environmental sample)”包括一得自於無生命物體(inanimate objects)或者在一室內或室外環境中的儲庫(reservoirs)的樣品。該環境樣品包括，但不限於：土壤樣品、灰塵樣品、空氣樣品、大體積樣品(bulk samples)[諸如建築材料(building materials)、家具(furniture)以及掩埋場的內容物(landfill contents)]以及其他的儲庫樣品[諸如動物廢料(animal refuse)、經收割的穀物(harvested grains)以及糧食(foodstuffs)]。

依據本發明的核酸分子可被使用作為探針並直接被拿來與上述的食品樣品、生物樣品或環境樣品進行雜交反應。因此，本發明亦提供一種用於檢測一樣品中是否存在 有一葡萄球菌菌株的方法，其包括：令該樣品進行一種使用至少一個探針的雜交反應，其中該至少一個探針所具有的核苷酸序列以及所對應的葡萄球菌菌株是如上面對於該等核酸分子所界定者；以及檢測是否有一藉由使用該至少一個探針來進行雜交反應而被形成的雜交物，其中該雜交物之存在表示有一對應於該至少一個探針的葡萄球菌菌株之存在。

在本發明的一個較佳具體例中，該至少一個探針具有一選自於由下列所構成的群組中的核苷酸序列：序列辨識編號：7、序列辨識編號：16、序列辨識編號：17、序列辨識編號：18以及序列辨識編號：19。

可瞭解到的是，該雜交反應的操作條件會進一步隨著所使用的儀器設備、該樣品的種類與預處理的方式以及所使用的反應內容物的用量比例等因素而被變動，以便達致最佳的檢測效果。而這些操作條件的選擇是熟習此項技藝者能例行性地自行決定的。

依據本發明，該雜交反應可以在一選自於由下列所構成的群組中的生物晶片上被進行：基因晶片、微流體晶片(例如，樣品前處理晶片、反應型晶片以及分析型晶片)以及晶片實驗室。在本發明的一個較佳具體例中，該雜交反應是在一基因晶片上被進行。

依據本發明的核酸分子可被應用於製備一種用於檢測一葡萄球菌菌株的檢驗套組。而除了該等核酸分子之外，該檢驗套組可進一步包含一用於監控DNA擴增產物的核酸 染劑。較佳地，該核酸染劑是選自於下列所構成的群組：溴化乙錠(ethidium bromide,EtBr)、SYBR GREEN I、SYBR GREEN II、SYBR Orange、SYBR Gold、碘化丙錠(Propidium Iodide,PI)、SYTOX Blue以及SYPRO Ruby。

依據本發明的核酸分子亦被預期可供應用於生物晶片，俾以快速地檢測存在於一樣品中的葡萄球菌菌株。

較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。

實施例 實驗材料：

1.在下面實施例中所使用的細菌菌株(bacteria strains)是購自於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)(300新竹市食品路331號，台灣)以及美國類型培養物收集中心(American Type Culture Collection,ATCC)，其中這些菌株包括：(1)葡萄球菌屬物種(Staphylococcus spp.)，包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 700699、BCRC 10782、12652、12654、12656、12657、13830、13828、13825、13826、13827、13829、 13830、13831與13824、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)BCRC 12922與12924、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)ATCC 12228、BCRC 10785、17069、15246與11030、溶血性葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)BCRC 12923、15237與15240、豬葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)BCRC 12925、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)ATCC 15305、BCRC 10786與13977、中間型葡萄球菌(Staphylococcus intermedius)BCRC 15235與15236、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)BCRC 15442、15252與15253、科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)BCRC 12155、沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)BCRC 12929、模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)BCRC 10778與12928、緩慢葡萄球菌(Staphylococcus lentus)BCRC 12926，以及松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)BCRC 12927；(2)鏈黴菌屬物種(Streptomyces spp.)，包括弗氏鏈黴菌(Streptomyces fradiae)ATCC 19609以及金羊毛鏈黴菌(Streptomyces chrysomallus)BCRC 11511；(3)糞產鹼桿菌(Alcaligenes faecalis)BCRC 10828；(4)芽孢桿菌屬物種(Bacillus spp.)，包括凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)BCRC 10251、液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)BCRC 10267、仙人掌 芽孢桿菌(Bacillus cereus)BCRC 10603與12812、液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)BCRC 10267，以及枯草桿菌(Bacillus subtilis)BCRC 10448；(5)擴展短桿菌(Brevibacterium linens)BCRC 19391與10041；(6)弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)BCRC 12291；(7)腸桿菌屬物種(Enterobacter spp.)，包括陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)ATCC 23355以及產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)BCRC 10370；(8)志賀桿菌屬物種(Shigella spp.)，包括副痢疾桿菌(Shigella flexneri)BCRC 10772、宋內氏桿菌(Shigella sonnei)BCRC 10773，以及痢疾桿菌(Shigella boydii)BCRC 15959；(9)綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)BCRC 13894；(10)少洞鞘胺醇單孢菌(Sphingomonas paucimobilis)BCRC 13893；(11)鏈球菌屬物種(Streptococcus spp.)，包括變種鏈球菌(Streptococcus mutans)BCRC 10793以及化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)BCRC 10797；(12)蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)BCRC 10906；(13)克留氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)BCRC 10692；(14)抗壞血酸克呂沃爾菌(Kluyvera ascorbata)BCRC 11645；(15)乳桿菌屬物種(Lactobacillus spp.)，包括嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)BCRC 14065以及醱酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)BCRC 12194；(16)普通變形桿菌(Proteus vulgaris)BCRC 10728；(17)玫瑰色庫克菌(Kocuria rosea)BCRC 11577；(18)摩根氏桿菌(Morganella morganii)BCRC 10706；(19)微球菌屬物種(Micrococcus spp.)，包括黃色微球菌(Micrococcus luteus)BCRC 10449以及易變微球菌(Micrococcus varians)BCRC 12152；(20)腸炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus)ATCC 17803與BCRC 12958；(21)小腸大腸炎耶氏桿菌(Yersinia enterocolitica)BCRC 10807；以及(22)大腸桿菌(Echerichia coli)BCRC 10807、14824與13084。

2.在下面實施例中所使用的胰蛋白酶大豆肉湯培養基(Tryptic Soy Broth,TSB)以及平板計數培養基(Plate Count Agar,PCA)是購自於Difco(Difco Uboratories,Detroit,Michigan U.S.A)。

3.在下面實施例中所使用的引子對以及探針是由禾鑫生物科技公司(台北，台灣)所合成。

一般實驗方法：

1.基因組DNA的萃取(extraction of genomic DNA)： 細菌菌株的基因組DNA的萃取是使用組織與細胞基因組DNA純化套組(Tissue & Cell Genomic DNA Purification Kit,GeneMark)來進行。首先，將1 mL的細菌培養物置於一微量離心管中，繼而以13,000 rpm來進行離心歷時5分鐘。在倒除上澄液之後，以1 mL無菌水來清洗沉澱物(pellets)共計2次，繼而加入250 μL溶葡萄球菌素緩衝液(lysostaphin buffer)來充分散浮菌體，接著加入1 μL溶葡萄球菌素(50 mg/mL)以及10 μL溶菌酶(lysozyme)(10 mg/mL)並於37℃下進行反應歷時2小時。之後，加入200 μL Ex緩衝液以及25 μL蛋白酶K(proteinase K)(10 mg/mL)並予以震盪混合，繼而置於60℃水浴下反應歷時1小時。接著，加入4 μL RNase A(10 mg/mL)並於室溫下反應歷時5分鐘，然後加入200 μL結合溶液(binding solution)並予以震盪混合，由此所形成的混合物被置於70℃水浴下反應歷時10分鐘，繼而加入200 μL絕對酒精並予以震盪混合歷時數秒。

之後，將一離心管柱(spin column)放入至一收集管(collection tube)中，並將所有混合物移至該離心管柱中，繼而以13,000 rpm來進行離心歷時10分鐘。在移除洗出物(eluate)之後，加入300 μL結合溶液來進行洗滌以移除內核酸酶(endonuclease)。接著，將該離心管柱放回該收集管內，並以10,000 rpm來進行離心歷時1分鐘。在移除洗出物之後，加入700 μL清洗溶液(wash solution)並以8,000 rpm來進行離心歷時1分鐘以進行洗滌共計2次。之後，將 該離心管柱放回該收集管內，並以13,000 rpm來進行離心歷時3分鐘以移除絕對酒精。接著，將該離心管柱放入至一個新的微量離心管中，並在60℃下靜置歷時5至10分鐘以揮發所有的酒精。最後，將100 μL無菌水加入至該離心管柱的中心處並靜置歷時2分鐘，繼而以13,000 rpm來進行離心歷時1分鐘以洗提出細菌菌株的基因組DNA。由此而得到的基因組DNA被儲存於-20℃下備用。

2.血液樣品的收集： 藉由使用K₂ EDTA管(K₂ EDTA tube,BD vacutainer^®)而從本發明的研究人員的靜脈中來收集血液樣品備用。

3.尿液樣品的收集： 收集來自本發明的研究人員的尿液，繼而進行滅菌處理，藉此而得到經滅菌的尿液樣品備用。

4.製備含有豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌、木糖葡萄球菌或肉葡萄球菌之食品樣品以及生物樣品：

(1)未經增殖培養之含有不同葡萄球菌菌株的水樣品與尿液樣品： 首先，將豬葡萄球菌BCRC 12925、中間型葡萄球菌BCRC 15236、木糖葡萄球菌BCRC 15442以及肉葡萄球菌BCRC 12922分別接種至TSB肉湯培養基中，並於一恆溫振盪培養箱(37℃、180 rpm)內進行培養歷時8小時。所形成的細菌培養物以TSB肉湯培養基予以調整至一為10⁹ CFU/mL(以平板計數培養基來進行菌數計數)的濃度，並以之作為原液來進行10倍連續稀釋，藉此而得到具有不同濃 度(10¹~10⁷ CFU/mL)的稀釋菌液。之後，對各個含有不同細菌濃度的稀釋菌液分別取1 mL，繼而加入9 mL的無菌水並予以混合均勻，藉此而得到含有不同細菌濃度(10⁰~10⁶ CFU/mL)的水樣品。

而有關含有該等葡萄球菌菌株的尿液樣品的製備大體上是參照上述水樣品的製備方式來進行，不同之處在於：以依據上面第3項「尿液樣品的收集」當中所述的方法而得到的經滅菌的尿液樣品來代替無菌水。

(2)製備未經增殖培養與經增殖培養之含有不同葡萄球菌菌株的牛奶樣品與血液樣品： 有關未經增殖培養之含有不同葡萄球菌菌株的牛奶樣品的製備大體上是參照上面第(1)項當中針對水樣品所述的方式來進行，不同之處在於：以牛奶來代替無菌水。而有關未經增殖培養之含有不同葡萄球菌菌株的血液樣品的製備大體上是參照上面第(1)項當中針對水樣品所述的方式來進行，不同之處在於：以依據上面第2項「血液樣品的收集」當中所述的方法而得到的血液樣品來代替無菌水。

另外，將一部分之依據上述方式所得到的含有不同細菌濃度的牛奶樣品與血液樣品分別置於一恆溫振盪培養箱(37℃、180 rpm)內進行增殖培養歷時8至12小時，藉此而得到經增殖培養之含有不同細菌濃度的牛奶樣品與血液樣品。

實施例1. 用於偵測葡萄球菌屬物種的引子對的設計 A、針對豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌以及木糖葡萄球菌 的groEL-groES基因的定序分析：

為了設計針對葡萄球菌屬物種的專一性引子對，申請人選用groESL基因[包括groEL基因、groES基因以及groEL-groES基因間區域(intergenic region,IGR)]來作為標的基因(target gene)。然而，目前豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌以及木糖葡萄球菌的基因組(genome)尚未被完全地定序，因而無法得知這3種菌株的groEL-groES基因間區域。

因此，為了選殖出豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌以及木糖葡萄球菌的groEL-groES基因間區域，申請人選用5種基因組已被完全地定序的葡萄球菌菌株並且依據該5種菌株的完整基因組(complete genome)當中的groESL基因，其中包括：NCBI登錄編號NC_002758(金黃色葡萄球菌mu50的完整基因組)、NCBI登錄編號NC_002976(表皮葡萄球菌RP62A的完整基因組)、NCBI登錄編號NC_007168(溶血性葡萄球菌JCSC1435 DNA的完整基因組)、NCBI登錄編號NC_007350(腐生葡萄球菌ATCC 15305的完整基因組)以及NCBI登錄編號AM295250(肉葡萄球菌TM300的完整基因組)當中的groESL基因，而尋找出高度守恆(highly conserved)的DNA序列並且據此來設計出一組具有下面所示核苷酸序列的簡併性引子對(degenerate primer pairs)Univer708F引子與Univer708R引子。

Univer708F引子

5’-ccratttcttcatcwgcwgc-3’(序列辨識編號：1)

Univer708R引子

5’-gcwaaagayaaytcdaargaagg-3’(序列辨識編號：2)其中符號r代表g或a；符號w代表a或t/u；符號y代表t/u或c；以及符號d代表a或g或t/u。

之後，將上面“實驗材料”的第1項當中所述的豬葡萄球菌BCRC 12925、木糖葡萄球菌BCRC 15442以及中間型葡萄球菌BCRC 15236分別接種至TSB肉湯培養基中，並於一恆溫振盪培養箱(37℃、180 rpm)內進行培養過夜。接著，分別取1 mL的細菌培養物並且依照上面“一般實驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述的方法來進行基因組DNA的萃取。然後，分別以所得到的各個細菌菌株的基因組DNA作為模版(template)，並使用上面所設計出的簡併性引子對Univer708F引子與Univer708R引子來進行使用下面表1中所示的反應條件之聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)。

於完成PCR後，對所得到的3種菌株的PCR反應溶液各取一部分並藉由2%瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)來進行分析，而實驗結果發現：豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌以及木糖葡萄球菌分別有得到一大小約為700~800 bp的PCR產物。接著，該3種菌株的PCR產物是委託禾鑫生物科技公司來進行定序分析，而定序結果顯示：豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌以及木糖葡萄球菌的PCR產物分別具有一如序列辨識編號：3至5所示的核苷酸序列。

之後，使用ClustalX軟體而將序列辨識編號：3至5所示的核苷酸序列拿來與上述5種基因組已被完全地定序的葡萄球菌菌株(包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、腐生葡萄球菌以及肉葡萄球菌)的groESL基因的核苷酸序列進行序列比對分析。針對各個葡萄球菌菌株的全長groEL-groES IGR、位在IGR的上游處(5’方向)的部分groEL基因以及位在IGR的下游處(3’方向)的部分groES基因的序列比對結果被顯示於圖1中。

從圖1可見，這8種菌株在groEL基因以及groES基因的核苷酸序列上具有高度相似性，而在groEL-groES IGR的核苷酸序列上則具有高度變異性。申請人據此而推論：依據本發明所得到的3種PCR產物(分別具有一如序列辨識編號：3至5所示的核苷酸序列)分別含有豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌以及木糖葡萄球菌的groESL基因片段(包括部分groEL基因、全長groEL-groES IGR以及部分groES基 因)，而有關這3種菌株的groESL基因片段對應於所得到的PCR產物的核苷酸殘基位置被彙整於下面表2中。

B、葡萄球菌屬的物種-特異性引子對(species-specfic primer pair)的設計：

依據在上面第A項當中所得到的豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌與木糖葡萄球菌的groESL基因片段的核苷酸序列(序列辨識編號：3至5)以及NCBI登錄編號AM295250(肉葡萄球菌TM300的完整基因組)當中的groESL基因，而分別針對豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌、木糖葡萄球菌以及肉葡萄球菌來設計出多組引子對。

之後，該等引子對利用NCBI網站所提供的BLASTN軟體來分別與NCBI網站的細菌基因資料庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/genlist.cgi？taxid=2&type=0&name=Complete%20Bacteria)中的所有基因序列進行比對分析，藉此而篩選出分別對於豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌、木糖葡萄球菌以及肉葡萄球菌具有物種-特異性的引 子對S.hyi F/S.hyi R、S.int F/S.int R、S.xyl F/S.xyl R以及S.car F/S.car R來供後續的實驗之用。

為表清楚，依據本發明的4組物種-特異性引子對的相關資訊(包括：核苷酸序列、所擴增出的PCR產物大小以及對應於標的基因或完整基因組DNA的所在位置等)已被整合於下面表3中。

C、葡萄球菌屬的屬-特異性引子對(genus-specific primer pair)的設計：

依據圖1所示的序列比對結果，從這8種葡萄球菌菌株的groESL基因中挑選出具有高度守恆性的區域，並據此來設計出多組針對葡萄球菌屬物種的簡併性引子對。

之後，該等簡併性引子對利用NCBI網站所提供的BLASTN軟體來分別與NCBI網站的細菌基因資料庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/genlist.cgi？taxid=2&type=0&name=Complete%20Bacteria)中的所有基因序列進行比對分析，藉此而篩選出一組對於葡萄球菌屬物種的菌株具有屬-特異性的簡併性引子對UniF/UniR，繼而將該引子對標定以生物素(biotin)後來供後續的實驗之用。

為表清楚，依據本發明的屬-特異性引子對的相關資訊(包括：核苷酸序列、針對各種葡萄球菌所擴增出的PCR產物大小以及對應於各種葡萄球菌的標的基因或完整基因組DNA的所在位置等)已被整合於下面表4中，並以粗體字標示於圖1中。

實施例2. 本發明的引子對在葡萄球菌屬物種檢測上的專一性(specificity)以及靈敏度(sensitivity)的分析

為了評估在上面實施例1中針對葡萄球菌菌株所設計出的4組物種-特異性引子對以及1組屬-特異性引子對的專一性以及靈敏度，下面的實驗被進行。

A、引子對的專一性試驗：

首先，將上面“實驗材料”的第1項當中所述的77種細菌菌株分別接種至TSB肉湯培養基中，並於一恆溫振盪培養箱(37℃、180 rpm)內進行培養過夜。接著，分別取1 mL的細菌培養物並且依照上面“一般實驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述的方法來進行基因組DNA的萃取。然後，以所得到的各個細菌菌株的基因組DNA作為模版，並分別使用在上面實施例1中所設計出的物種-特異性引子對S.hyi F/S.hyi R、S.int F/S.int R、S.xyl F/S.xyl R、S.car F/S.car R以及經生物素標定的屬-特異性引子對UniF/UniR來進行PCR，而PCR的反應條件被顯示於下面表5中。

於完成PCR之後，藉由2%瓊脂糖凝膠電泳來確認是否有得到一如表3與表4中所示之既定大小的PCR產物。

B、引子對的靈敏度試驗：

為瞭解本發明所揭示的4組物種-特異性引子對以及1組屬-特異性引子對在葡萄球菌菌株檢測上的靈敏度，豬葡萄球菌BCRC 12925、中間型葡萄球菌BCRC 15236、木糖葡萄球菌BCRC 15442、肉葡萄球菌BCRC 12922、金黃葡萄球菌ATCC 700699、表皮葡萄球菌ATCC 12228、腐生葡萄球菌ATCC 15305以及溶血葡萄球菌BCRC 15240被拿來進行下面的實驗。首先，將這8種葡萄球菌菌株分別接種至TSB肉湯培養基中，並於一恆溫振盪培養箱(37℃、180 rpm)內進行培養歷時8小時。所形成的細菌培養物以TSB肉湯培養基予以調整至一為10⁹ CFU/mL(以平板計數培養基來進行菌數計數)的濃度，並以之作為原液(stock)來進行 10倍連續稀釋(10-fold serial dilution)，藉此而得到具有不同濃度(10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹以及10⁰ CFU/mL)的稀釋菌液。之後，對各個含有不同細菌濃度的稀釋菌液分別取1 mL並且依照上面“一般實驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述的方法來進行基因組DNA的萃取。

另外，將一部分之依據上述方式所得到的含有不同細菌濃度的稀釋菌液置於一恆溫振盪培養箱(37℃、180 rpm)內進行增殖培養(enrichment culturing)歷時6至8小時。之後，對各個經增殖培養的含有不同細菌濃度的稀釋菌液分別取1 mL並且依照上面“一般實驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述的方法來進行基因組DNA的萃取。

依據上面所得到的各個未經增殖以及經增殖培養的細菌菌株的基因組DNA被拿來作為模版，並分別使用如上面表3以及表4中所示之4組物種-特異性以及1組屬-特異性引子對來進行PCR，而PCR的反應條件是如上面表5中所示者。

於完成PCR之後，藉由2%瓊脂糖凝膠電泳來確認是否有得到一如表3與表4中所示之既定大小的PCR產物。

結果： A、引子對的專一性試驗：

經由瓊脂糖凝膠電泳分析結果發現，當以各個細菌菌株的基因組DNA作為模版並使用引子對S.hyi F/S.hyi R來進行PCR時，只有豬葡萄球菌有得到一大小約為192 bp的 PCR擴增產物；當使用引子對S.int F/S.int R來進行PCR時，只有中間型葡萄球菌有得到一大小約為180 bp的PCR擴增產物；當使用引子對S.xyl F/S.xyl R來進行PCR時，只有木糖葡萄球菌有得到一大小約為182 bp的PCR擴增產物；當使用引子對S.car F/S.car R來進行PCR時，只有肉葡萄球菌有得到一大小約為108 bp的PCR擴增產物；以及當使用經生物素標定的引子對UniF/UniR來進行PCR時，只有葡萄球菌屬物種(諸如金黃色葡萄球菌、肉葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、豬葡萄球菌、腐生葡萄球菌、中間型葡萄球以及木糖葡萄球菌)有得到一大小約為191~232 bp的PCR擴增產物。

這個實驗結果顯示：依據本發明的物種-特異性引子對S.hyi F/S.hyi R、S.int F/S.int R、S.xyl F/S.xyl R、S.car F/S.car R以及經生物素標定的屬-特異性引子對UniF/UniR分別對於豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌以及葡萄球菌屬物種的菌株具有檢測專一性。

B、引子對的靈敏度試驗：

下面表6顯示依據本發明的4組物種-特異性引子對以及1組屬-特異性引子對的靈敏度試驗結果。從表6可見，引子對S.hyi F/S.hyi R、S.int F/S.int R、S.xyl F/S.xyl R、S.car F/S.car R以及經生物素標定的引子對UniF/UniR對於未經增殖培養的葡萄球菌菌株的檢測靈敏度可以達到10² CFU/mL，而對於經增殖培養的葡萄球菌菌株的檢測靈敏度可以達到10⁰ CFU/mL。這個實驗結果顯示：依據本發明的 物種-特異性引子對S.hyi F/S.hyi R、S.int F/S.int R、S.xyl F/S.xyl R、S.car F/S.car R以及經生物素標定的屬-特異性引子對UniF/UniR具有高靈敏度而可供應用於偵測葡萄球菌屬物種的菌株。

實施例3. 用於偵測葡萄球菌屬物種的探針(probes)的設計 A、葡萄球菌屬的物種-特異性探針的設計：

依據在上面實施例1的第A項當中所得到之木糖葡萄球菌的groESL基因片段的核苷酸序列(序列辨識編號：5)以及NCBI登錄編號AM295250(肉葡萄球菌TM300的完整基因組)當中的groEL-groES的基因間區域，而分別針對木糖 葡萄球菌以及肉葡萄球菌來設計出多種探針。

之後，該等探針利用NCBI網站所提供的BLASTN軟體來分別與NCBI網站的細菌基因資料庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/genlist.cgi？taxid=2&type=0&name=Complete%20Bacteria)中的所有基因序列進行比對分析，藉此而篩選出對於木糖葡萄球菌與肉葡萄球菌具有物種-特異性的探針。

另外，在上面實施例1中所設計出的S.int R引子的互補序列(complementary sequences)以及S.hyi R引子分別被使用作為針對中間型葡萄球菌以及豬葡萄球菌的物種-特異性探針。

為表清楚，依據本發明的4種物種-特異性探針的相關資訊(包括：核苷酸序列以及對應於標的基因或完整基因組DNA的所在位置等)已被整合於下面表7中，並以網底標示於圖1中。

B、葡萄球菌屬的屬-特異性探針的設計：

依據圖1所示的序列比對結果，從這8種葡萄球菌菌株的groESL基因中挑選出具有高度守恆性的區域，並據此來設計出多組針對葡萄球菌屬物種的簡併性探針。

之後，該等簡併性探針利用NCBI網站所提供的BLASTN軟體來分別與NCBI網站的細菌基因資料庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/genlist.cgi？taxid=2&type=0&name=Complete%20Bacteria)中的所有基因序列進行比對分析，藉此而篩選出對於葡萄球屬物種的菌株具有屬-特異性的簡併性探針。

為表清楚，依據本發明的屬-特異性探針的相關資訊(包括：核苷酸序列以及對應於各種葡萄球菌的標的基因或完整基因組DNA的所在位置等)已被整合於下面表8中，並以方框標示於圖1中。

實施例4. 本發明的引子對對於葡萄球菌屬物種的檢測能力的評估

為了評估依據本發明所設計出的4組物種-特異性引子對以及1組屬-特異性引子對對於存在於食品中的葡萄球菌菌株的檢測專一性與靈敏度，含有各種不同葡萄球菌菌株的水樣品與牛奶樣品被拿來進行PCR。

A、引子對的專一性試驗：

對依照上面“一般實驗方法”的第4項「製備含有豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌、木糖葡萄球菌或肉葡萄球菌之食品樣品以及生物樣品」當中所述的方法而得到之未經增殖培養的含有豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌、木糖葡萄球菌或肉葡萄球菌的水樣品以及牛奶樣品(各個樣品皆含有一為10⁶ CFU/mL的細菌濃度)各取1 mL，並依照上面“一般實驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述的方法來進行基因組DNA的萃取。然後，以所得到的各個細菌菌株的基因組DNA作為模版並分別使用物種-特異性引子對S.hyi F/S.hyi R、S.int F/S.int R、S.xyl F/S.xyl R、S.car F/S.car R以及經生物素標定的屬-特異性引子對UniF/UniR來進行PCR，而PCR的反應條件是如上面表5中所示者。依據上述，當以得自於水樣品與牛奶樣品的細菌基因組DNA來進行PCR時，各個菌株皆會分別得到10個PCR擴增產物，因此總計可得到40個PCR擴增產物。

所得到的40個PCR擴增產物被拿來進行2%瓊脂糖凝膠電泳分析，俾以確認是否可得到一如表3與表4中所示 之既定大小的PCR產物。

B、引子對的靈敏度試驗：

對依照上面“一般實驗方法”的第4項「製備含有豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌、木糖葡萄球菌或肉葡萄球菌之食品樣品以及生物樣品」當中所述的方法而得到的未經增殖培養與經增殖培養之含有不同濃度(10⁰~10⁵ CFU/mL)的豬葡萄球菌的牛奶樣品以及未經增殖培養之含有不同濃度(10⁰~10⁶ CFU/mL)的豬葡萄球菌的水樣品各取1 mL，並依照上面“一般實驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述的方法來進行基因組DNA的萃取。接著，以所得到之未經增殖培養以及經增殖培養的豬葡萄球菌的基因組DNA作為模版，並分別使用物種-特異性引子對S.hyi F/S.hyi R以及經生物素標定的屬-特異性引子對UniF/UniR來進行PCR，而PCR的反應條件是如上面表5中所示者。於完成PCR之後，總計可得到38個PCR擴增產物。

有關含有中間型葡萄球菌、木糖葡萄球菌或肉葡萄球菌之牛奶樣品以及水樣品的靈敏度試驗大體上是參照上面針對含有豬葡萄球菌的牛奶樣品當中所述的方式來進行，不同之處在於：當以中間型葡萄球菌、木糖葡萄球菌以及肉葡萄球菌的基因組DNA作為模版來進行PCR時，所選用的物種-特異性引子對分別為S.int F/S.int R、S.xyl F/S.xyl R以及S.car F/S.car R。於完成PCR之後，中間型葡萄球菌、木糖葡萄球菌以及肉葡萄球菌皆會各得到38個PCR擴增產物。

最後，上面所得到的152個PCR擴增產物分別被拿來進行2%瓊脂糖凝膠電泳分析，俾以確認是否可得到一如表3與表4中所示之既定大小的PCR產物。

結果： A、引子對的專一性試驗：

經由瓊脂糖凝膠電泳分析結果發現，當分別以得自於牛奶樣品以及水樣品中的豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌、木糖葡萄球菌以及肉葡萄球菌的基因組DNA作為模版並使用引子對S.hyi F/S.hyi R來進行PCR時，只有豬葡萄球菌有得到一大小約為192 bp的PCR擴增產物；當使用引子對S.int F/S.int R來進行PCR時，只有中間型葡萄球菌有得到一大小約為180 bp的PCR擴增產物；當使用引子對S.xyl F/S.xyl R來進行PCR時，只有木糖葡萄球菌有得到一大小約為182 bp的PCR擴增產物；當使用引子對S.car F/S.car R來進行PCR時，只有肉葡萄球菌有得到一大小約為108 bp的PCR擴增產物；以及當使用經生物素標定的引子對UniF/UniR來進行PCR時，上述4種葡萄球菌屬物種皆有得到一大小約為191~232 bp的PCR擴增產物。

這個實驗結果顯示：依據本發明的4組物種-特異性引子對S.hyi F/S.hyi R、S.int F/S.int R、S.xyl F/S.xyl R、S.car F/S.car R以及1組經生物素標定的屬-特異性引子對UniF/UniR分別可以專一性地偵測到存在於食品中的豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌以及葡萄球菌屬物種的菌株。

B、引子對的靈敏度試驗：

下面表9顯示依據本發明的4組物種-特異性引子對以及1組屬-特異性引子對對於存在於牛奶樣品與水樣品中的葡萄球菌菌株的檢測靈敏度。從表9可見，物種-特異性引子對S.hyi F/S.hyi R、S.int F/S.int R、S.xyl F/S.xyl R以及S.car F/S.car R以及經生物素標定的屬-特異性引子對UniF/UniR對於未經增殖培養的牛奶樣品或水樣品中的葡萄球菌菌株的檢測靈敏度可以達到10¹~10⁵ CFU/mL，而對於經增殖培養的牛奶樣品中的葡萄球菌菌株的檢測靈敏度可以達到10⁰ CFU/mL。

這個實驗結果顯示：依據本發明的4組物種-特異性引子對S.hyi F/S.hyi R、S.int F/S.int R、S.xyl F/S.xyl R、S.car F/S.car R以及1組經生物素標定的屬-特異性引子對UniF/UniR對於所欲偵測的標的菌種具有高靈敏度，因而可供應用於偵測食品中的葡萄球菌菌株。

實施例5. 本發明的探針對於食品樣品以及生物樣品中的葡萄球菌菌株的檢測能力之評估

為了評估在上面實施例3中所設計出的5種探針對於存在於食品樣品以及生物樣品中的葡萄球菌菌株的檢測專一性與靈敏度，含有不同葡萄球菌菌株的食品樣品(包括牛奶樣品與水樣品)以及生物樣品(包括尿液樣品以及血液樣品)被拿來進行下面的實驗。

A、生物晶片的製備：

除了在上面實施例3中所設計出的5種探針之外，申請人參照弘光科技大學生物產業科技研究所的張予馨所著 碩士論文當中所揭示之針對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌以及腐生葡萄球菌的專一性探針，並作部分修改後而設計出4種經改良的探針(參見表10以及圖1中以底線所標示之處)，它們在下面的實驗中被使用作為負對照組。

為了讓本發明中所使用的9種探針在被點佈(spotted)於生物晶片的表面上時可具有較佳的固定性(immobilization)，這9種探針的5’端或3’端分別被修飾以寡(dT)[oligo(dT)]，而由此所得到的40-員探針(40-mer probes)或50-員探針被顯示於下面的表11中。

之後，將所合成出的探針1~9分別溶於無菌水中，藉此而得到具有一濃度為100 μM的探針原液1~9。接著，對探針原液1~9各取3 μL並分別與12 μL的2X探針溶液(2X Probe solution)(DR.Chip Biotech.,Taiwan)進行混合以形成晶片探針溶液1~9。將所形成的晶片探針溶液1~9加入至一個96井的培養盤中，然後藉由自動點製儀(Automatic arrayer)(Ezspot SR-A300,Shuai Ran precision,Taiwan)將探針1~9點佈於塑膠膜(plastic membrane)(DR.Chip Biotech.,Taiwan)上，繼而使用UV交聯器C1508(UV-cross linker C1508)(UVItec,Cambridge,England)(254 nm/0.6-1.2焦耳)將該等40-員或50-員探針固定(immobilized)在塑膠膜上，藉此而形成一含有依據本發明的5種探針以及習知的4種探針的生物晶片。另外，經生物素標定的隨機序列片段被用來作為正對照組(positive control)。有關該生物晶片的DNA探針點佈位置(DNA probe spot position)被顯示在圖2中，其中A1表示探針1；A2表示探針2；A3表示探針3；A4表示探針4；C1表示探針8；C2表示探針5；C3表示探針6；C4表示探針7；B2表示正對照組；以及B3表示探針9。

B、生物晶片的專一性試驗：

首先，對依照上面“一般實驗方法”的第4項「製備含有豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌、木糖葡萄球菌或肉葡萄球菌之食品樣品以及生物樣品」當中所述的方法而得到之未經增殖培養的含有豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌、木糖葡 萄球菌或肉葡萄球菌的血液樣品、尿液樣品、水樣品以及牛奶樣品(各個樣品皆含有一為10⁶ CFU/mL的細菌濃度)各取1 mL，並依照上面“一般實驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述的方法來進行基因組DNA的萃取。然後，以所得到的各個細菌菌株的基因組DNA作為模版並使用經生物素標定的引子對UniF/UniR來進行PCR，而PCR的反應條件被顯示於下面表12中。於完成PCR之後，各個菌株皆會分別得到4個PCR擴增產物，因此總計可得到16個PCR擴增產物。

之後，對在上面所得到的16個PCR擴增產物各取10 μL並分別置於一為1.5 mL的微量離心管(microtube)中，繼而加入180 μL DR.Hyb^TM緩衝液(DR.Hyb^TM Buffer)(DR.Chip Biotech.,Taiwan)。接著，於95℃下進行變性反應(denaturation)歷時10分鐘，繼而於冰上靜置歷時5分鐘， 藉此而得到16種含有單股DNA的混合溶液。之後，將上面第A項所製得之生物晶片置於雜交盒(hybridization box)(DR.Chip Biotech.,Taiwan)中並分別加入上面所得到的16種混合溶液，接著蓋上盒蓋並置於一溫度被設定在45℃的烘箱(DR.Mini^TM Oven,DR.Chip Biotech.,Taiwan)中進行震盪反應歷時3小時。之後，將各個雜交盒中的溶液移除並於室溫下以200 μL的2X檸檬酸鈉鹽(saline sodium citrate,SSC)緩衝液來洗滌該等生物晶片1次，繼而再以200 μL的1X SSC緩衝液予以洗滌2次以移除非特異性結合的DNA-DNA雜交物(hybrids)。接著，將200 μL的封阻試劑(Blocking Reagent)(DR.Chip Biotech.,Taiwan)分別加入各個雜交盒中，然後置於一溫度被設定在45℃的烘箱中進行震盪反應歷時30分鐘。之後，移除各個雜交盒中的液體並以200 μL的2X SSC緩衝液來洗滌該等生物晶片2次，每次歷時5分鐘。接著，將200 μL的經鏈黴素綴合的鹼性磷酸酶(Streptavidin conjugated-alkaline phosphatase)(PerkinElmer Life Science,Boston,MA,USA)分別加入各個雜交盒中，繼而置於一溫度被設定在45℃的烘箱中進行震盪反應歷時30分鐘。在移除該等雜交盒中的液體之後，加入200 μL的2X SSC緩衝液並靜置歷時5分鐘，繼而將2X SSC緩衝液移除。此清洗-靜置步驟被重複2次。之後，將4 μL的偵測緩衝液(Detection Buffer)(DR.Chip Biotech.,Taiwan)與196 μL的BCIP/NBT受質溶液(BCIP/NBT substrate solution)(PerkinElmer Life Science, Boston,MA,USA)混合均勻並分別加入各個雜交盒中，然後靜置歷時5~10分鐘以進行顯色反應(chromogenic reaction)。之後，將該等雜交盒置於烘箱中烘乾歷時5分鐘，繼而取出該等生物晶片並以影像分析系統(DR.AiM^TM Reader,Dr.Chip Biotech.,Taiwan)來進行掃描。

C、生物晶片的靈敏度試驗：

對依照上面“一般實驗方法”的第4項「製備含有豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌、木糖葡萄球菌或肉葡萄球菌之食品樣品以及生物樣品」當中所述的方法而得到的未經增殖培養與經增殖培養之含有不同濃度(10⁰~10⁶ CFU/mL)的豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌、木糖葡萄球菌或肉葡萄球菌的牛奶樣品與血液樣品，以及未經增殖培養之含有不同濃度(10⁰~10⁶ CFU/mL)的豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌、木糖葡萄球菌或肉葡萄球菌的尿液樣品與水樣品各取1 mL，並依照上面“一般實驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述的方法來進行基因組DNA的萃取。接著，以所得到之未經增殖培養以及經增殖培養的各個細菌菌株的基因組DNA作為模版，並使用經生物素標定的引子對UniF/UniR來進行PCR，而PCR的反應條件是如上面表12中所示者。依據上述，當以得自於牛奶樣品與血液樣品的細菌基因組DNA來進行PCR時，豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌、木糖葡萄球菌以及肉葡萄球菌皆會各得到28個PCR擴增產物，共計112個PCR擴增產物；而當以得自於尿液樣品與水樣品的細菌基因組DNA來進行PCR時，這4種葡萄球菌菌株 皆會各得到14個PCR擴增產物，共計56個PCR擴增產物。因此，總計可得到168個PCR擴增產物。

之後，所得到的168個PCR擴增產物是參照上面第B項當中所述的方式來進行變性反應，藉此而得到168種含有單股DNA的混合溶液。接著，將這168種含有單股DNA的混合溶液分別拿來與在上面第A項當中所製得之生物晶片進行雜交反應，而有關雜交反應的反應條件以及操作步驟是如上面第B項當中所描述者。

結果： A、生物晶片的專一性試驗：

為了瞭解當本發明的DNA探針被應用於生物晶片時對於葡萄球菌菌株的檢測專一性，以得自於牛奶樣品中的豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌、木糖葡萄球菌或肉葡萄球菌的基因組DNA作為模版，並且使用經生物素標定的引子對UniF/UniR來進行PCR後所得到的4種PCR產物分別被拿來與一含有依據本發明的5種探針以及習知的4種探針的生物晶片進行雜交反應。經由雜交後的圖譜顯示：當以肉葡萄球菌的基因組DNA作為模版並使用經生物素標定的引子對UniF/UniR來進行PCR後所得到的PCR產物被拿來與該生物晶片進行雜交反應時，在C1以及B3處分別有觀察到一雜交訊號(參見圖3A)；當以豬葡萄球菌的基因組DNA作為模版並使用經生物素標定的引子對UniF/UniR來進行PCR後所得到的PCR產物被拿來與該生物晶片進行雜交反應時，在C2以及B3處分別有觀察到一雜交訊號(參見圖 3B)；當以中間型葡萄球菌的基因組DNA作為模版並使用經生物素標定的引子對UniF/UniR來進行PCR後所得到的PCR產物被拿來與該生物晶片進行雜交反應時，在C3以及B3處分別有觀察到一雜交訊號(參見圖3C)；以及當以木糖葡萄球菌的基因組DNA作為模版並使用經生物素標定的引子對UniF/UniR來進行PCR後所得到的PCR產物被拿來與該生物晶片進行雜交反應時，在C4以及B3處分別有觀察到一雜交訊號(參見圖3D)。

另外，當以得自於水樣品、血液樣品以及尿液樣品中的該等細菌菌株的基因組DNA作為模版，並且分別使用經生物素標定的引子對UniF/UniR來進行PCR後所得到的PCR產物分別被拿來與該生物晶片進行雜交反應時，亦會得到相同的實驗結果(數據未顯示)。

上面的實驗結果證實：依據本發明的探針5至9分別可以專一性地偵測到存在於食品樣品以及生物樣品中的豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌以及葡萄球菌屬物種的菌株，因而可被應用於基因晶片(gene chip)以供快速檢測之用。

B、生物晶片的靈敏度試驗：

表13顯示使用一含有依據本發明的5種探針以及習知的4種探針的生物晶片來檢測存在於食品樣品以及生物樣品中的葡萄球菌菌株時所得到的靈敏度試驗結果。從表13可見，該生物晶片對於未經增殖培養的牛奶樣品、水樣品以及尿液樣品中的葡萄球菌菌株的檢測靈敏度可以達到10² CFU/mL，而對於經增殖培養的牛奶樣品中的葡萄球菌菌株的檢測靈敏度可以達到10⁰ CFU/mL。另外，該生物晶片對於未經增殖培養的血液樣品中的葡萄球菌菌株的檢測靈敏度可以達到10⁵~10⁶ CFU/mL，而對於經增殖培養的血液樣品中的葡萄球菌菌株的檢測靈敏度可以達到10² CFU/mL。

這個實驗結果顯示：依據本發明的探針5至9對於所欲偵測的標的菌種具有高靈敏度，因而可被應用於基因晶片以供快速地偵測出存在於食品樣品以及生物樣品中的微量葡萄球菌菌株。

於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

圖1顯示使用ClustalX軟體來對8種葡萄球菌菌株之groESL基因的核苷酸序列進行比對分析而得到的結果，其中以粗體字所標示者代表本發明的屬-特異性引子對UniF/UniR對應於這8種葡萄球菌菌株之標的基因的位置；以方框所標示者代表本發明的屬-特異性探針對應於這8種葡萄球菌菌株之標的基因的位置；以底線所標示者代表習知的4種經改良的物種-特異性探針對應於標的葡萄球菌菌株之標的基因的位置；以網底所標示者代表本發明的4種物種-特異性探針對應於標的葡萄球菌菌株之標的基因的位置；以及以符號“＊”所標示者代表這8種葡萄球菌菌株之守恆的核苷酸殘基；圖2顯示一含有依據本發明的5種探針以及習知的4種探針的生物晶片的DNA探針點佈位置，其中A1表示探針1；A2表示探針2；A3表示探針3；A4表示探針4；C1表示探針8；C2表示探針5；C3表示探針6；C4表示探針7；B2表示正對照組；以及B3表示探針9；以及 圖3A至3D分別顯示以得自於牛奶樣品中的豬葡萄球菌、中間型葡萄球菌、木糖葡萄球菌或肉葡萄球菌的基因組DNA作為模版，並分別使用經生物素標定的引子對UniF/UniR來進行PCR後所得到的PCR產物被拿來與一含有依據本發明的5種探針以及習知的4種探針的生物晶片進行雜交反應時所觀察到的雜交圖譜。

<110> 弘光科技大學

<120> 用於檢測葡萄球菌菌株的核酸分子、檢驗套組、生物晶片以及方法

<130> 用於檢測葡萄球菌菌株的核酸分子

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增葡萄球菌菌株的groESL基因的簡併性前向引子

<400> 1

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增葡萄球菌菌株的groESL基因的簡併性反向引子

<400> 2

<210> 3

<211> 732

<212> DNA

<213> 豬葡萄球菌

<220>

<221> 部分groES基因的核苷酸序列

<222> (1)..(193)

<220>

<221> groEL-groES IGR的核苷酸序列

<222> (194)..(272)

<220>

<221> 部分groEL基因的核苷酸序列

<222> (273)..(732)

<400> 3

<210> 4

<211> 692

<212> DNA

<213> 中間型葡萄球菌

<220>

<221> 部分groES基因的核苷酸序列

<222> (1)..(172)

<220>

<221> groEL-groES IGR的核苷酸序列

<222> (173)..(220)

<220>

<221> 部分groEL基因的核苷酸序列

<222> (221)..(692)

<400> 4

<210> 5

<211> 693

<212> DNA

<213> 木糖葡萄球菌

<220>

<221> 部分groEL基因的核苷酸序列

<222> (1)..(432)

<220>

<221> groEL-groES IGR的核苷酸序列

<222> (433)..(498)

<220>

<221> 部分groES基因的核苷酸序列

<222> (499)..(693)

<400> 5

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測豬葡萄球菌的S.hyi F引子

<400> 6

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測豬葡萄球菌的S.hyi R引子

<400> 7

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測中間型葡萄球菌的S.int F引子

<400> 8

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測中間型葡萄球菌的S.int R引子

<400> 9

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測木糖葡萄球菌的S.xyl F引子

<400> 10

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測木糖葡萄球菌的S.xyl R引子

<400> 11

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測肉葡萄球菌的S.car F引子

<400> 12

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測肉葡萄球菌的S.car R引子

<400> 13

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測葡萄球菌屬物種的UniF引子

<400> 14

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測葡萄球菌屬物種的UniR引子

<400> 15

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測中間型葡萄球菌的探針

<400> 16

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測木糖葡萄球菌的探針

<400> 17

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測肉葡萄球菌的探針

<400> 18

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測葡萄球菌屬物種的探針

<400> 19

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測金黃色葡萄球菌的探針

<400> 20

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測表皮葡萄球菌的探針

<400> 21

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測腐生葡萄球菌的探針

<400> 22

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測溶血性葡萄球菌的探針

<400> 23

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測金黃色葡萄球菌之經寡d(T)修飾的探針

<220>

<221> 寡d(T)

<222> (23)..(40)

<400> 24

<210> 25

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測表皮葡萄球菌之經寡d(T)修飾的探針

<220>

<221> 寡d(T)

<222> (1)..(14

<400> 25

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測腐生葡萄球菌之經寡d(T)修飾的探針

<220>

<221> 寡d(T)

<222> (28)..(40)

<400> 26

<210> 27

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測溶血性葡萄球菌之經寡d(T)修飾的探針

<220>

<221> 寡d(T)

<222> (1)..(13)

<400> 27

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測豬葡萄球菌之經寡d(T)修飾的探針

<220>

<221> 寡d(T)

<222> (1)..(17)

<400> 28

<210> 29

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測中間型葡萄球菌之經寡d(T)修飾的探針

<220>

<221> 寡d(T)

<222> (21)..(40)

<400> 29

<210> 30

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測木糖葡萄球菌之經寡d(T)修飾的探針

<220>

<221> 寡d(T)

<222> (29)..(50)

<400> 30

<210> 31

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測肉葡萄球菌之經寡d(T)修飾的探針

<220>

<221> 寡d(T)

<222> (1)..(16)

<400> 31

<210> 32

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測葡萄球菌屬物種之經寡d(T)修飾的探針

<220>

<221> 寡d(T)

<222> (1)..(20)

<400> 32

Claims (19)

1. 一種用於檢測一葡萄球菌菌株的核酸分子試劑，其包含有一用於檢測中間型葡萄球菌菌株的引子對和/或探針，其中該引子對包含一具有一如序列辨識編號：8所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：9所示的核苷酸序列之反向引子，該探針具有一如序列辨識編號：16所示的核苷酸序列。
2. 如申請專利範圍第1項的核酸分子試劑，其進一步包含有下列的至少一引子對和/或探針：(a)一用於檢測豬葡萄球菌菌株的引子對和/或探針，其中該引子對包含一具有一如序列辨識編號：6所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：7所示的核苷酸序列之反向引子，該探針具有一如序列辨識編號：7所示的核苷酸序列；(b)一用於檢測木糖葡萄球菌菌株的引子對和/或探針，其中該引子對包含一具有一如序列辨識編號：10所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：11所示的核苷酸序列之反向引子，該探針具有一如序列辨識編號：17所示的核苷酸序列；(c)一用於檢測肉葡萄球菌菌株的引子對和/或探針，其中該引子對包含一具有一如序列辨識編號：12所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：13所示的核苷酸序列之反向引子，該探針具有一如序列辨識編號：18所示的核苷酸序列；以及 (d)一用於檢測葡萄球菌屬物種的菌株的引子對和/或探針，其中該引子對包含一具有一如序列辨識編號：14所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：15所示的核苷酸序列之反向引子，該探針具有一如序列辨識編號：19所示的核苷酸序列。
3. 一種用於檢測一樣品中是否存在有一葡萄球菌菌株的方法，其包括：令該樣品進行一種使用一核酸分子試劑的DNA擴增反應，其中該核酸分子試劑包含有一用於檢測中間型葡萄球菌菌株的引子對，該引子對包含一具有一如序列辨識編號：8所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：9所示的核苷酸序列之反向引子；以及檢測是否有一藉由使用該引子對而被擴增出的DNA片段，其中該DNA片段之存在表示有一對應於該引子對的葡萄球菌菌株之存在。
4. 如申請專利範圍第3項的方法，其中該核酸分子試劑進一步包含有下列的至少一引子對：(a)一用於檢測豬葡萄球菌菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：6所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：7所示的核苷酸序列之反向引子；(b)一用於檢測木糖葡萄球菌菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：10所示的核苷酸序列之前向 引子，以及一具有一如序列辨識編號：11所示的核苷酸序列之反向引子；(c)一用於檢測肉葡萄球菌菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：12所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：13所示的核苷酸序列之反向引子；以及(d)一用於檢測葡萄球菌屬物種的菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：14所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：15所示的核苷酸序列之反向引子。
5. 如申請專利範圍第3或4項的方法，其中該樣品是選自於下列所構成的群組：食品樣品、生物樣品以及環境樣品。
6. 如申請專利範圍第5項的方法，其中該樣品是一選自於由下列所構成的群組中的食品樣品：流體乳品、飲料、肉品、海產食品、動物飼料、水、乳製品、蔬菜、水果以及罐頭食品。
7. 如申請專利範圍第5項的方法，其中該樣品是一選自於由下列所構成的群組中的生物樣品：血液、血漿、血清、尿液、唾液以及糞便。
8. 如申請專利範圍第3或4項的方法，其中在進行該DNA擴增反應之前，從該樣品中萃取出總基因組DNA以作為模版。
9. 如申請專利範圍第3或4項的方法，其中該DNA擴增反 應是藉由使用下列方法學之至少一者而被進行：聚合酶鏈反應、反轉錄酶聚合酶鏈反應、即時定量聚合酶鏈反應、巢式PCR、熱啟動PCR、原位PCR、簡併性寡核苷酸引子PCR、微PCR、多重聚合酶鏈反應、以限制片段長度多型性核酸序列為主之擴增反應、轉錄-調節的擴增反應、環媒介等溫擴增反應以及滾環擴增反應。
10. 如申請專利範圍第4項的方法，其中該DNA片段的檢測是藉由一種使用一選自於由下列所構成的群組中的探針的雜交反應而被進行：(a)一用於檢測豬葡萄球菌菌株的探針，其具有一如序列辨識編號：7所示的核苷酸序列；(b)一用於檢測中間型葡萄球菌菌株的探針，其具有一如序列辨識編號：16所示的核苷酸序列；(c)一用於檢測木糖葡萄球菌菌株的探針，其具有一如序列辨識編號：17所示的核苷酸序列；(d)一用於檢測肉葡萄球菌菌株的探針，其具有一如序列辨識編號：18所示的核苷酸序列；以及(e)一用於檢測葡萄球菌屬物種的菌株的探針，其具有一如序列辨識編號：19所示的核苷酸序列。
11. 如申請專利範圍第10項的方法，其中該雜交反應是在一選自於由下列所構成的群組中的生物晶片上被進行：基因晶片、微流體晶片以及晶片實驗室。
12. 一種用於檢測一樣品中是否存在有一葡萄球菌菌株的方法，其包括： 令該樣品進行一種使用一核酸分子試劑的雜交反應，其中該核酸分子試劑包含有一用於檢測中間型葡萄球菌菌株的探針，該探針具有一如序列辨識編號：16所示的核苷酸序列；以及檢測是否有一藉由使用該探針來進行雜交反應而被形成的雜交物，其中該雜交物之存在表示有一對應於該探針的葡萄球菌菌株之存在。
13. 如申請專利範圍第12項的方法，其中該核酸分子試劑進一步包含有下列的至少一探針：(a)一用於檢測豬葡萄球菌菌株的探針，其具有一如序列辨識編號：7所示的核苷酸序列；(b)一用於檢測木糖葡萄球菌菌株的探針，其具有一如序列辨識編號：17所示的核苷酸序列；(c)一用於檢測肉葡萄球菌菌株的探針，其具有一如序列辨識編號：18所示的核苷酸序列；以及(d)一用於檢測葡萄球菌屬物種的菌株的探針，其具有一如序列辨識編號：19所示的核苷酸序列。
14. 如申請專利範圍第12或13項的方法，其中該樣品是選自於下列所構成的群組：食品樣品、生物樣品以及環境樣品。
15. 如申請專利範圍第14項的方法，其中該樣品是一選自於由下列所構成的群組中的食品樣品：流體乳品、飲料、肉品、海產食品、動物飼料、水、乳製品、蔬菜、水果以及罐頭食品。
16. 如申請專利範圍第14項的方法，其中該樣品是一選自於由下列所構成的群組中的生物樣品：血液、血漿、血清、尿液、唾液以及糞便。
17. 如申請專利範圍第12或13項的方法，其中該雜交反應是在一選自於由下列所構成的群組中的生物晶片上被進行：基因晶片、微流體晶片以及晶片實驗室。
18. 一種用於檢測一葡萄球菌菌株的檢驗套組，其包含有一如申請專利範圍第1或2項的核酸分子試劑。
19. 一種用於檢測一葡萄球菌菌株的生物晶片，其包含有一如申請專利範圍第1或2項的核酸分子試劑。