TWI464269B - 用於檢測沙門桿菌菌株的核酸分子、檢驗套組、生物晶片以及方法 - Google Patents

Description

用於檢測沙門桿菌菌株的核酸分子、檢驗套組、生物晶片以及方法

本發明是有關於用於檢測腸道沙門桿菌(Salmonella enterica )的引子對和/或探針。本發明亦有關於使用該等引子對和/或探針來檢測存在於一樣品中的腸道沙門桿菌的檢驗套組(diagnostic kit)、生物晶片(biochip)以及方法。

沙門桿菌菌株(Salmonella strains)是一群革蘭氏陰性的兼性厭氧菌(gram-negative facultative anaerobic bacteria)，它們普遍存在於人類與動物的體內或者食物與環境中。沙門桿菌屬主要包含有腸道沙門桿菌(Salmonella enterica )以及邦戈爾沙門桿菌(Salmonella bongori )這2種物種，其中腸道沙門桿菌可被區分為6種亞種(subspecies)，而邦戈爾沙門桿菌可被區分為1種亞種。這些沙門桿菌屬亞種(Salmonella subspecies)可依據體質抗原(somatic antigen)[亦即O抗原(O antigen)]的表現差異而被區分為不同的血清群(serogroup)，而各個血清群又可依據鞭毛抗原(flagellar antigen)[亦即H抗原(H antigen)]的表現差異而被進一步區分為不同的血清型(serotype)。

會感染人類與動物的沙門桿菌菌株大多是屬於腸道沙門桿菌，而其中較為常見者是下列的腸道沙門桿菌血清型(Salmonella enterica serovars)：腸道沙門桿菌腸道亞種鼠傷寒血清型(S .enterica subsp.enterica ser.Typhimurium)[亦被簡稱為鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella Typhimurium)]、腸道沙 門桿菌腸道亞種腸炎血清型(S .enterica subsp.enterica ser.Enteritidis)[亦被簡稱為腸炎沙門桿菌(Salmonella Enteritidis)]、腸道沙門桿菌腸道亞種哈達爾血清型(S .enterica subsp.enterica ser.Hadar)[亦被簡稱為哈達爾沙門桿菌(Salmonella Hadar)]、腸道沙門桿菌腸道亞種嬰兒型血清型(S .enterica subsp.enterica ser.Infantis)[亦被簡稱為嬰兒型沙門桿菌(Salmonella Infantis)]以及腸道沙門桿菌腸道亞種維爾肖氏血清型(S .enterica subsp.enterica ser.Virchow)[亦被簡稱為維爾肖氏沙門桿菌(Salmonella Virchow)]等。

腸道沙門桿菌是一種呈桿狀(rod-shaped)的腸內細菌(enterobacteria)，當人類攝入受到此種細菌汙染的食品[例如生肉(raw meat)、生鮮產品(fresh produce)、加工肉(processed meat)、果汁以及乳製品(dairy product)]時，會引起傷寒熱(typhoid fever)、副傷寒熱(paratyphoid fever)以及食物媒介疾病(food-borne illness)[諸如沙門桿菌病(salmonellosis)]等。帶有沙門桿菌病的病患通常會產生急性腸結腸炎伴隨突發的頭痛(acute enterocolitis with sudden onset of headache)、腹痛(abdominal pain)、腹瀉(diarrhea)、噁心(nausea)以及嘔吐(vomiting)等臨床症狀(clinical symptom)，嚴重者甚至會出現敗血症(septicemia)或死亡。

由於腸道沙門桿菌已嚴重地威脅到人類的健康並且造成畜牧業以及食品業的損失，因此，如何早期且快速地檢測出這些腸道沙門桿菌即成為本技術領域的研究人員關注 與研究的重點。

為了克服傳統的菌株培養與菌學特徵鑑定[例如，革蘭氏染色(gram staining)、API鑑定系統、血清分型(serotyping)、生理或生化特徵鑑定、抗生素耐受性試驗等]在操作過程上較為繁複且耗時之缺點，目前有許多分子生物學方法已被應用於檢測各種沙門桿菌菌株。這些生物學方法包括：聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)、脈衝電場凝膠電泳(pulse-field gel electrophoresis,PFGE)、多重聚合酶鏈反應(multiplex polymerase chain reaction)、隨機擴增的多型性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)、限制片段長度多型性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)、免疫分析法(Immunoassay method)、DNA探針分析法(DNA probe method)以及生物晶片(biochip)等。

近年來，生物晶片技術的發展已逐漸受到重視並且已被廣泛地應用於各種病原菌(pathogen)的檢測、癌症的分類、新藥的研發以及基因的定序與鑑定等等。生物晶片的優點包括：體積小、分析結果的可信度與精確性較高、分析速度快，以及使用較少的樣品與試劑即可獲得整體性的實驗數據。生物晶片依據其功能性可被區分為下面四大類：(1)基因晶片(gene chip)，亦被稱為微陣列晶片(microarray chip)；(2)微流體晶片(microfluidic chip)；(3)蛋白質晶片(protein chip)；以及(4)晶片實驗室(Lab-on-a-chip)。

一般而言，在細菌的基因組DNA序列中會包含有高度 守恆(highly conserved)與高度變異(highly variable)的DNA序列，它們可供用於物種-特異性(species-specific)、亞種-特異性(subspecies-specific)或血清型-特異性(serovar-specific)的檢測或鑑定。已有研究顯示，腸道沙門桿菌菌株的O抗原、H抗原以及莢膜抗原(capsular antigen)[亦即Vi抗原(Vi antigen)]的生合成基因(biosynthesis gene)可以被用來作為腸道沙門桿菌菌株的血清型-特異性檢測之標的基因。

例如，在Yang Honget al .(2008),BMC Microbiology ,8：178-185中，Yang Hong等人針對沙門桿菌血清群(Salmonella serogroups)中的O抗原生合成基因[包括wba 操縱子(wba operon)]以及H1與H2鞭毛蛋白(flagellin)基因之中心變異區域(central variable region)的核苷酸序列來分別設計出專一性引子對，並將之拿來進行對偶基因分型多重PCR(allelotyping multiplex PCR)。經由實驗結果證實，藉由偵測O抗原以及H抗原之對偶基因組合(gene allele combination)可以有效地鑑別腸炎沙門桿菌、哈達爾沙門桿菌、海德堡沙門桿菌(S .Heidelberg)以及鼠傷寒沙門桿菌。

在Mohd Elbagir Elhassan Nori and Kwai Lin Thong(2010),African Journal of Microbiology Research ,4：871-876中，Mohd Elbagir Elhassan Nori與Kwai Lin Thong主要是探討一種標靶O、H以及Vi抗原之連續多重聚合酶鏈反應(sequential multiplex polymerase chain reaction)的組合在區分不同血清型的沙門桿菌菌株上的效用。研究結果顯示：藉由針對該等抗原的連續多重聚合酶鏈反應的組合可以有 效地將腸道沙門桿菌菌株[諸如鼠傷寒沙門桿菌、副傷寒沙門桿菌(Salmonella Paratyphi)、腸炎沙門桿菌、慕尼黑沙門桿菌(Salmonella Muenchen)以及哈達爾沙門桿菌等]進行血清分型(serotyping)。

另外，在Masato Akibaet al .(2011),Journal of Microbiological Methods ,85：9-15中，Masato Akiba等人藉由對7種腸道沙門桿菌血清型[包括鼠傷寒沙門桿菌、豬霍亂沙門桿菌(Salmonella Choleraesuis)、嬰兒型沙門桿菌、哈達爾沙門桿菌、腸炎沙門桿菌、都伯林沙門桿菌(Salmonella Dublin)以及雞沙門桿菌(Salmonella Gallinarum)]進行基因組序列比對(genomic sequence comparison)，而篩選出對於該等腸道沙門桿菌血清型分別具有特異性的3段血清型-特異性基因組區域(serovar-specific genomic regions,SSGRs)，繼而針對該等SSGRs的核苷酸序列來分別設計出血清型-特異性引子對(每種菌株各設計出3組血清型-特異性引子對)。經由實驗結果顯示，依據上述所設計出的血清型-特異性引子對可藉由多重聚合酶鏈反應來快速且專一性地鑑定出所欲偵測的腸道沙門桿菌血清型。

雖然已存在有上述文獻報導，申請人仍積極致力於尋找可供用於檢測腸道沙門桿菌的核酸分子。於本發明中，申請人針對3種腸道沙門桿菌血清型(包括嬰兒型沙門桿菌、維爾肖氏沙門桿菌以及哈達爾沙門桿菌)的基因組DNA當中具有高度變異的DNA序列，而篩選出對於該3種腸道沙門桿菌血清型分別具有高度專一性與靈敏度的核酸分子以供 快速檢測或鑑定之用。

發明概要

於是，在第一個方面，本發明提供一種用於檢測一腸道沙門桿菌的引子試劑，其包含有下列的至少一者：(a)一用於檢測哈達爾沙門桿菌的第1組引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：4所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：5所示的核苷酸序列之反向引子；(b)一用於檢測嬰兒型沙門桿菌的第2組引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：6所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：7所示的核苷酸序列之反向引子；(c)一用於檢測嬰兒型沙門桿菌的第3組引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：8所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：7所示的核苷酸序列之反向引子；(d)一用於檢測維爾肖氏沙門桿菌的第4組引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：9所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：7所示的核苷酸序列之反向引子；以及(e)一用於檢測維爾肖氏沙門桿菌的第5組引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：10所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：7所 示的核苷酸序列之反向引子。

在第二個方面，本發明提供一種用於檢測一腸道沙門桿菌的探針試劑，其包含有下列的至少一者：(a)一用於檢測哈達爾沙門桿菌的探針，其具有一選自於如序列辨識編號：4、序列辨識編號：5以及序列辨識編號：11所示的核苷酸序列；(b)一用於檢測嬰兒型沙門桿菌的探針，其具有一選自於如序列辨識編號：6、序列辨識編號：8以及序列辨識編號：12所示的核苷酸序列；以及(c)一用於檢測維爾肖氏沙門桿菌的探針，其具有一選自於如序列辨識編號：9、序列辨識編號：10以及序列辨識編號：13所示的核苷酸序列。

上述的引子對和/或探針對於所欲偵測的標的腸道沙門桿菌皆具有高度的專一性(specificity)以及靈敏度(sensitivity)，因而可供用來檢測存在於一樣品中的腸道沙門桿菌。因此，在第三個方面，本發明提供一種用於檢測一樣品中是否存在有一腸道沙門桿菌的方法，其包括：令該樣品進行一種使用至少一組如上所述的引子對的DNA擴增反應；以及檢測是否有一藉由使用該至少一組引子對而被擴增出的DNA片段，其中該DNA片段之存在表示有一對應於該至少一組引子對的腸道沙門桿菌之存在。

在第四個方面，本發明亦提供一種用於檢測一樣品中是否存在有一腸道沙門桿菌的方法，其包括： 令該樣品進行一種使用至少一個如上所述的探針的雜交反應；以及檢測是否有一藉由使用該至少一個探針來進行雜交反應而被形成的雜交物，其中該雜交物之存在表示有一對應於該至少一個探針的腸道沙門桿菌之存在。

在第五個方面，本發明提供一種用於檢測一腸道沙門桿菌的檢驗套組，其包含有一如上所述的引子試劑和/或一如上所述的探針試劑。

在第六個方面，本發明提供一種用於檢測一腸道沙門桿菌的生物晶片，其包含有一如上所述的引子試劑和/或一如上所述的探針試劑。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。

發明的詳細說明

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

為了本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：術語“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及術語“包括(comprises)”具有一對應的意義。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中 者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。為表清楚，下面的界定被使用於本文中。

如本文中所用的，“核酸”、“核酸序列”或“核苷酸序列”等術語意指呈單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸序列或核糖核苷酸序列，且當中包含有已知的天然存在的核苷酸(naturally occurring nucleotides)或人造化學仿效物(aritificial chemical mimics)。如本文中所用的，“核酸”此術語可與“基因”、“DNA”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“聚核苷酸”交換使用。

如本文中所用的，術語“核酸片段”與“DNA片段”可被互換地使用，並且意指一種DNA聚合物(DNA polymer)，該DNA聚合物是呈一獨立節段(separate segment)的形式或者是作為一較大的DNA建構物(DNA construct)的一組分(component)，其可以是衍生自經分離的DNA(isolated DNA)或是藉由本技術領域中所熟知的方法而被化學地或酵素地合成。

除非另有指明，一核酸序列除了於本文中所揭示的特定序列外，亦涵蓋其互補序列(complementary sequences)，以及它們的守恆性類似物(conservative analogs)、相關的自然存在的結構變異體和/或合成的非天然存在的類似物。

如本文中所用的，“雜交(hybridization)”與“黏合(annealing)”等術語可被相互交換使用，並且意指2個單股核苷酸序列藉由依據華特生-克里克規則(Watson-Crick rules) 而經由它們的嘌呤(purine)和/或嘧啶(pyrimidine)鹼基之氫鍵結(hydrogen bonding)來彼此序列專一性地結合，藉此而形成一雜交物(hybrid)。該雜交物是一個具有穩定的核酸結構的雙螺旋核酸複合物(duplex nucleic acid complex)，其包括RNA：RNA、RNA：DNA或DNA：DNA雙螺旋分子。

傳統上，在檢測會引起食品中毒的腸道沙門桿菌時大多是使用菌株培養與菌學特徵鑑定等方法，但是這些檢測方法具有操作過程較為繁複、耗時以及不精確等的缺點。因此，如何能快速且精確地檢測出存在於生物檢體或食品中的腸道沙門桿菌，已成為食品業以及醫學界努力的目標。分子生物學方法[諸如，聚合酶鏈反應(PCR)以及生物晶片技術等]具有速度快、分析結果的可信度與精確性高等之優點，因此，申請人致力於研發這方面的快速檢測方法。

一般而言，在腸道沙門桿菌的基因組DNA序列中會包含有高度守恆與高度變異的DNA序列，它們可供用於物種-特異性、亞種-特異性或血清型-特異性之檢測或鑑定。因此，申請人嘗試從哈達爾沙門桿菌、嬰兒型沙門桿菌以及維爾肖氏沙門桿菌的基因組DNA序列中分別設計出對於這些腸道沙門桿菌血清型具有高度專一性與靈敏度的引子對和/或探針以供快速檢測或鑑定之用。

於本發明中，申請人依據哈達爾沙門桿菌的完整基因組(下載自ftp：//ftp.sanger.ac.uk/pub/pathogens/Salmonella/HADAR.dbs)當中的哈達爾-特異性基因組區域(hadar-specific genomic region,HSR)以及嬰兒型沙門桿菌的完整基 因組(下載自ftp：//ftp.sanger.ac.uk/pub/pathogens/Salmonella/SIN.dbs)當中的嬰兒型-特異性基因組區域(infantis-specific genomic region,ISR)，而分別設計出1組對於哈達爾沙門桿菌具有血清型-特異性的引子對HADAF/HADAR以及2組對於嬰兒型沙門桿菌具有血清型-特異性的引子對INFA1F/InViR與INFA2F/InViR。

另一方面，維爾肖氏沙門桿菌的基因組(genome)至今尚未被完全地定序，而依據申請人先前的研究發現：嬰兒型沙門桿菌的完整基因組當中的核苷酸殘基位置3710138至3713529處與維爾肖氏沙門桿菌所具者具有高度的序列相似性。因此，申請人針對上述的嬰兒型沙門桿菌的完整基因組的核苷酸序列而設計出一組Univer-F引子(序列辨識編號：1)與Univer-R引子(序列辨識編號：2)，繼而使用維爾肖氏沙門桿菌CA08.158的基因組DNA作為模版(template)來進行聚合酶鏈反應(PCR)。之後，藉由瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)來進行分析而發現到：維爾肖氏沙門桿菌有得到2個大小分別約為3000 bp以及500 bp的PCR產物。

接著，該大小約為500 bp的維爾肖氏沙門桿菌的PCR產物經由定序分析結果顯示：它包含有一大小為341 bp且具有如序列辨識編號：3所示之核苷酸序列的DNA片段。然後，使用BLAST軟體(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)而將該經定序的DNA片段的核苷酸序列(序列辨識編號：3)拿來與上述嬰兒型沙門桿菌的完整基因組當中的的核苷酸序列進 行比對分析。所得到的比對結果顯示：該維爾肖氏沙門桿菌的DNA片段大體上可對應於該嬰兒型沙門桿菌的完整基因組當中的核苷酸殘基位置3713150至3713480處，其中該DNA片段與該核苷酸殘基位置3713251至3713480處的核苷酸序列具有高度相似性，但是與該核苷酸殘基位置3713150至3713250處的核苷酸序列則具有較高的變異性(參見圖1)。因此，申請人依據該DNA片段而設計出2組對於維爾肖氏沙門桿菌具有血清型-特異性的引子對VIRC1F/InViR與VIRC2F/InViR。有關上述針對3種腸道沙門桿菌血清型而設計出的5組血清型-特異性引子對所具有的核苷酸序列分別被彙整於表2中。

除了設計供用於偵測腸道沙門桿菌的引子對之外，申請人亦依據該哈達爾沙門桿菌的完整基因組當中的哈達爾-特異性基因組區域(HSR)以及該嬰兒型沙門桿菌的完整基因組當中的嬰兒型-特異性基因組區域(ISR)中所示的核苷酸序列，而分別設計出針對哈達爾沙門桿菌以及嬰兒型沙門桿菌的血清型-特異性探針HADAP以及INFA1P。另外，依據上述所設計出的VIRC1F引子的互補序列被使用作為針對維爾肖氏沙門桿菌的血清型-特異性探針VIRC1P。有關上述針對3種腸道沙門桿菌血清型而分別設計出的3種血清型-特異性探針所具有的核苷酸序列被彙整於表5中。

為了評估依據本發明的引子對和/或探針對於腸道沙門桿菌的檢測專一性以及靈敏度，申請人以得自於雞肉樣品中之細菌菌株的基因組DNA作為模版，並分別使用本發明 的5組血清型-特異性引子對HADAF/HADAR、INFA1F/InViR、INFA2F/InViR、VIRC1F/InViR以及VIRC2F/InViR來進行PCR反應，或者是使用一種由HADAF/HADAR、INFA1F/InViR以及VIRC1F/InViR所構成的引子組合來進行多重PCR(multiplex PCR)。經由PCR或多重PCR所得到的PCR擴增產物在藉由瓊脂糖凝膠電泳分析後發現：依據本發明的引子對對於所欲偵測的標的腸道沙門桿菌皆具有高度的專一性以及靈敏度。

此外，申請人進一步將依據上述所得到的PCR擴增產物拿來與點佈(spotted)有依據本發明的探針的生物晶片進行雜交反應。經由雜交後的圖譜顯示：依據本發明的探針對於所欲偵測的標的腸道沙門桿菌亦都具有高度的專一性以及靈敏度。

基於以上所述，依據本發明的引子對以及探針被預期可供用於快速地檢測存在於一樣品中的腸道沙門桿菌。於是，本發明提供一種用於檢測一腸道沙門桿菌的引子試劑，其包含有下列的至少一者：(a)一用於檢測哈達爾沙門桿菌的第1組引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：4所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：5所示的核苷酸序列之反向引子；(b)一用於檢測嬰兒型沙門桿菌的第2組引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：6所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：7所示的 核苷酸序列之反向引子；(c)一用於檢測嬰兒型沙門桿菌的第3組引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：8所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：7所示的核苷酸序列之反向引子；(d)一用於檢測維爾肖氏沙門桿菌的第4組引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：9所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：7所示的核苷酸序列之反向引子；以及(e)一用於檢測維爾肖氏沙門桿菌的第5組引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：10所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：7所示的核苷酸序列之反向引子。

本發明亦提供一種用於檢測一腸道沙門桿菌的探針試劑，其包含有下列的至少一者：(a)一用於檢測哈達爾沙門桿菌的探針，其具有一選自於如序列辨識編號：4、序列辨識編號：5以及序列辨識編號：11所示的核苷酸序列；(b)一用於檢測嬰兒型沙門桿菌的探針，其具有一選自於如序列辨識編號：6、序列辨識編號：8以及序列辨識編號：12所示的核苷酸序列；以及(c)一用於檢測維爾肖氏沙門桿菌的探針，其具有一選自於如序列辨識編號：9、序列辨識編號：10以及序列辨識編號：13所示的核苷酸序列。

依據本發明的引子和/或探針可進一步使用一具有本技藝中的通常技術者所熟知的標準技術而被附接或結合至一個可偵測的標記(detectable label)以容許檢測或定量該等腸道沙門桿菌。適用於本發明之可偵測的標記包括，但不限於：半抗原標記(hapten labels)，例如，生物素(biotin)以及地高辛(digoxigenin,Dig)；化學螢光標記(chemiluminescent labels)；螢光標記(fluorescent labels)，例如，螢光素(fluorescein)、玫瑰紅(rhodamine)、FAM、TET、HEX、JOE、TAMA、NTB、TAMRA、ROX、VIC、NED、雅基馬黃(Yakima Yellow)、BHQI、BHQ2、BHQ3、Iowa Black FQ、Iowa Black RQ、DABCYL、DABSYL、ElleQuencher、Eclipse Dark Quencher、甲基紅(Methyl Red)、德州紅(Texas Red)、孔雀綠(malachite green)、分散藍3(DisperseBlue3)、Bodipy 493/503、花青基苷(cyanin,Cy)染料[諸如，Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5與Cy7]、AlexaFluor染料[諸如，AlexaFluor 488、532、546、555、568、594、610、647以及680]、PromoFluor染料[諸如，PromoFluor 488、555、590、633、647以及680]以及LC-Red染料[諸如，LC-Red610、640、670以及705]；酵素標記；放射性標記(例如，³² P)；顆粒標記(particle labels)，例如，金膠體(gold colloids)以及量子點(quantum dot)；以及比色標記(colorimetric labels)，例如，染劑以及有色的玻璃或塑膠珠粒(colored glass or plastic beads)。

依據本發明，在該等探針的5’端和/或3’端上可加入或 刪除至少一個核苷酸殘基，而使其所具有的長度是落在大約15至30個核苷酸殘基之範圍內。此外，在該等探針的5’端和/或3’端上可加入至少一個胸苷(thymidine)以使得它們在被點佈(spotted)於生物晶片的表面上時可具有較佳的固定性(immobilization)，並且增強它們在進行雜交反應時所獲得的偵測訊號。而這些都是熟習此項技術者所詳知且慣用的技術。較佳地，在該等探針的5’端和/或3’端上所加入之胸苷的數目是落在大約10至35個的範圍內。

本發明亦提供一種用於檢測一樣品中是否存在有一腸道沙門桿菌的方法，其包括：令該樣品進行一種使用至少一組如上所述的引子對的DNA擴增反應；以及檢測是否有一藉由使用該至少一組引子對而被擴增出的DNA片段，其中該DNA片段之存在表示有一對應於該至少一組引子對的腸道沙門桿菌之存在。

依據本發明，在進行該DNA擴增反應之前，從該樣品中萃取出總基因組DNA以作為模版。

依據本發明，該DNA擴增反應可藉由使用下列方法學之至少一者而被進行：聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)、反轉錄酶聚合酶鏈反應(reverse transcriptase PCR,RT-PCR)、即時定量聚合酶鏈反應(Real time quantitative PCR)、巢式PCR(nested PCR)、熱啟動PCR(hot-start PCR)、原位PCR(in-situ PCR)、簡併性寡核苷酸引子PCR(degenerate oligonucleotide primer PCR,DOP PCR)、微PCR(micro PCR)、多重聚合酶鏈反應(multiplex polymerase chain reaction)、以限制片段長度多型性核酸序列為主之擴增反應(restriction fragments length polymorphism nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)、轉錄-調節的擴增反應(transcription-mediated amplification,TMA)、環媒介等溫擴增反應(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)以及滾環擴增反應(rolling circle amplification,RCA)。有關這些方法學的操作條件的設定是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該DNA擴增反應可以在一選自於由下列所構成的群組中的生物晶片上被進行：微流體晶片(例如，樣品前處理晶片、反應型晶片以及分析型晶片)以及晶片實驗室。

依據本發明，該DNA片段的檢測可以藉由一種使用一探針的雜交反應而被進行，其中：(a)當使用針對哈達爾沙門桿菌的該第1組引子對來進行該DNA擴增反應時，該探針具有一選自於如序列辨識編號：4、序列辨識編號：5以及序列辨識編號：11所示的核苷酸序列；(b)當使用針對嬰兒型沙門桿菌的該第2組引子對來進行該DNA擴增反應時，該探針具有一選自於如序列辨識編號：6、序列辨識編號：7、序列辨識編號：8以及序列辨識編號：12所示的核苷酸序列； (c)當使用針對嬰兒型沙門桿菌的該第3組引子對來進行該DNA擴增反應時，該探針具有一選自於如序列辨識編號：7以及序列辨識編號：8所示的核苷酸序列；(d)當使用針對維爾肖氏沙門桿菌的該第4組引子對來進行該DNA擴增反應時，該探針具有一選自於如序列辨識編號：7、序列辨識編號：9、序列辨識編號：10以及序列辨識編號：13所示的核苷酸序列；以及(e)當使用針對維爾肖氏沙門桿菌的該第5組引子對來進行該DNA擴增反應時，該探針具有一選自於如序列辨識編號：7以及序列辨識編號：10所示的核苷酸序列。

依據本發明，該雜交反應可以在一選自於由下列所構成的群組中的生物晶片上被進行：基因晶片、微流體晶片(例如，樣品前處理晶片、反應型晶片以及分析型晶片)以及晶片實驗室。在本發明的一個較佳具體例中，該雜交反應是在一基因晶片上被進行。

依據本發明，該樣品可以選自於下列所構成的群組：食品樣品、生物樣品(biological sample)以及環境樣品(environmental sample)。

較佳地，該樣品是一食品樣品，它包括，但不限於：流體乳品(fluid milk products)，例如牛奶以及羊奶；飲料(beverages)；肉品，例如雞肉、牛肉、羊肉以及豬肉；海產 食品(sea foods)，例如魚類以及貝類(shellfish)；動物飼料(animal feeds)；水(water)；乳製品(dairy products)，例如優酪乳(yogurt)、冰淇淋(ice cream)以及乳酪(cream cheeses)；蔬菜；水果；以及罐頭食品(canned foods)。在本發明的一個較佳具體例中，該食品樣品是雞肉。

如此處所用的，術語“生物樣品”意指一得自於一生物體(organism)(諸如，人類或動物)或該生物體的組分(components)(諸如，細胞以及組織)的樣品。該生物樣品包括，但不限於：血液(blood)、血漿(plasma)、血清(serum)、尿液(urine)、唾液(saliva)、腦脊髓液(cerebrospinal fluid)、間隙液(interstitial fluid)、腹水(peritoneal fluid)、肌肉(muscle)以及糞便(feces)。

如此處所用的，術語“環境樣品”意指一得自於無生命物體(inanimate objects)或者在一室內或室外環境中的儲庫(reservoirs)的樣品。該環境樣品包括，但不限於：土壤樣品、灰塵樣品、空氣樣品、大體積樣品(bulk samples)[諸如建築材料(building materials)、家具(furniture)以及掩埋場的內容物(landfill contents)]以及其他的儲庫樣品[諸如動物廢料(animal refuse)、經收割的穀物(harvested grains)以及糧食(foodstuffs)]。

依據本發明的探針可直接被拿來與上述的食品樣品、生物樣品或環境樣品進行雜交反應。因此，本發明提供一種用於檢測一樣品中是否存在有一腸道沙門桿菌的方法，其包括： 令該樣品進行一種使用至少一個如上所述的探針的雜交反應；以及檢測是否有一藉由使用該至少一個探針來進行雜交反應而被形成的雜交物，其中該雜交物之存在表示有一對應於該至少一個探針的腸道沙門桿菌之存在。

在本發明的一個較佳具體例中，該至少一個探針具有一選自於如序列辨識編號：11、序列辨識編號：12以及序列辨識編號：13所示的核苷酸序列。

可瞭解到的是，該雜交反應的操作條件會進一步隨著所使用的儀器設備、該樣品的種類與預處理的方式以及所使用的反應內容物的用量比例等因素而被變動，以便達致最佳的檢測效果。而這些操作條件的選擇是熟習此項技藝者能例行性地自行決定的。

依據本發明，該雜交反應可以在一選自於由下列所構成的群組中的生物晶片上被進行：基因晶片、微流體晶片(例如，樣品前處理晶片、反應型晶片以及分析型晶片)以及晶片實驗室。在本發明的一個較佳具體例中，該雜交反應是在一基因晶片上被進行。

依據本發明的引子對和/或探針可被應用於製備一種用於檢測一腸道沙門桿菌的檢驗套組。而除了該等引子對和/或探針之外，該檢驗套組可進一步包含一用於監控DNA擴增產物的核酸染劑。較佳地，該核酸染劑是選自於下列所構成的群組：溴化乙錠(ethidium bromide,EtBr)、SYBR GREEN I、SYBR GREEN II、SYBR Orange、SYBR Gold、 碘化丙錠(Propidium Iodide,PI)、SYTOX Blue以及SYPRO Ruby。

依據本發明的引子對和/或探針亦被預期可供應用於生物晶片，俾以快速地檢測存在於一樣品中的腸道沙門桿菌。

較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。

實施例 實驗材料：

1.在下面實施例中所使用的腸道沙門桿菌血清型(Salmonella enteric serotype)的細菌菌株(bacteria strains)是分離自泰國BETAGRO雞肉場之雞隻的肉(meat)或糞便中，或者是得自於台灣的疾病管制局[Centers for Disease Control,R.O.C.(Taiwan)]，這些菌株包括：(1)分離自雞隻的肉或糞便中的菌株：阿托納沙門桿菌(S .Altona)、奧巴尼沙門桿菌(S .Albany)、阿戈納沙門桿菌(S .Agoma)、柏塔沙門桿菌(S .Berta)、波昂沙門桿菌(S .Bonn)、病牛沙門桿菌(S .Bovismorbificans)、雞副傷寒沙門桿菌(S .Bredeny)、布靈得盧柏沙門桿菌(S .Braenderup)、布蘭登堡邦沙門桿菌(S .Brandenburg)、康斯塔特沙門桿菌(S .Cannstatt)、列克星敦沙門桿菌(S .Lexington)、古巴 沙門桿菌(S .Cubana)、開羅沙門桿菌(S .Cairo)、加利福尼亞沙門桿菌(S .California)、赤斯特沙門桿菌(S .Chester)、吉大港沙門桿菌(S .Chittagong)、科羅拉多沙門桿菌(S .Colorado)、科雷帕克沙門桿菌(S .Coleypark)、埃班道夫沙門桿菌(S .Eppendorf)、埃森沙門桿菌(S .Essen)、基夫沙門桿菌(S .Give)、海德堡沙門桿菌(S .Heidelberg)、印第安納沙門桿菌(S .Indiana)、爪哇沙門桿菌(S .Java)、肯塔基沙門桿菌(S .Kentucky)、克雷非沙門桿菌(S .Krefeld)、萊墨特沙門桿菌(S .Limete)、曼哈頓沙門桿菌(S .Manhattan)、火雞沙門桿菌(S .Meleagridis)、邁阿密沙門桿菌(S .Miami)、蒙特維的亞沙門桿菌(S .Montevideo)、恩昌加沙門桿菌(S .Nchanga)、紐溫頓沙門桿菌(S .Newington)、奈及利亞沙門桿菌(S .Nigeria)、俄亥俄沙門桿菌(S .Ohio)、奧斯陸沙門桿菌(S .Oslo)、奧拉南堡沙門桿菌(S .Oranienburg)、巴拿馬沙門桿菌(S .Panama)、A型副傷寒桿菌(S .Paratyphi A)、浦那沙門桿菌(S .Ponna)、聖地牙哥沙門桿菌(S .Sandiego)、山夫頓堡沙門桿菌(S .Senftenberg)、田納西沙門桿菌(S .Tennessee)、湯姆維沙門桿菌(S .Thomasville)以及湯普森沙門桿菌(S .Thompson)；以及(2)得自於台灣的疾病管制局的菌株：腸炎沙門桿菌CF09.001、CF09.002、CF09.003、CF09.009、 CF09.011、CF09.012、CF09.013、CF09.017、CF09.018與CF09.023、鼠傷寒沙門桿菌CF09.015、CF09.016、CF09.019、CF09.020、CF09.021、CF09.037、CF09.039、SD09.016、SD09.018與SD09.023、哈達爾沙門桿菌CA08.102、CA08.106、CA08.124、CA08.129、CA08.157、CA08.159、CA08.160、CB09.011與CF09.010、嬰兒型沙門桿菌CC07.003、CC07.016、CC07.063、CC07.090、NQ08.053、SA08.050、SA08.059、SB08.005、SB08.038與SD08.109、維爾肖氏沙門桿菌CA08.075、CA08.116、CA08.135、CA08.158、CF08.016、CF08.030、CF08.039、CF08.041、CF08.050與CF08.054、阿戈納沙門桿菌SA09.039與SQ09.012、奧巴尼沙門桿菌CF09.014與SD09.001、鴨沙門桿菌(S .Anatum)CA08.145與CA06.166、奧古斯田柏格沙門桿菌(S .Augustenborg)CA06.114與CG06.201、巴雷利沙門桿菌(S .Bareilly)SA09.063與SB09.004、布洛克雷沙門桿菌(S .Blockley)NJ08.069與WHO08.006、布靈得盧柏沙門桿菌SD08.079與SD08.096、塞羅沙門桿菌(S .Cerro)SB08.046與SB08.071、赤斯特沙門桿菌NA07.025與NL07.041、豬霍亂沙門桿菌SB08.003與SB08.008、德貝沙門桿菌(S .Derby)NJ09.006與NJ09.015、都柏林沙門桿菌(S .Dublin)CA07.122與 CA07.126、海法沙門桿菌(S .Haifa)NB06.053與NB06.062、哈瓦那沙門桿菌(S .Havana)SB07.026與SD07.148、豪坦沙門桿菌(S .Houteu)CH08.005與SA08.089、印第安納沙門桿菌WHO08.007與CG04132、伊桑吉沙門桿菌(S .Isangi)SQ07.020與SQ07.044、開杜古沙門桿菌(S .Kedougou)NO08.042與NQ08.034、利赤非爾德沙門桿菌(S .Litchfield)CC08.008與CC08.067、利文斯通沙門桿菌O14變異株(S .Livingstonevar .O14)NL08.069與NL08.105、倫敦沙門桿菌(S .London)CA07.069與CA07.072、馬森雅沙門桿菌(S .Massenya)NJ08.061與NJ08.064、木班達卡沙門桿菌(S .Mbandaka)CB09.010與NL09.004、蒙特維的亞沙門桿菌SA09.003與SA09.024、慕尼黑沙門桿菌NL07.005與CG05.044、新港沙門桿菌(S .Newport)CF09.005與CF09.006、巴拿馬沙門桿菌CH07.059與NG06.062、A型副傷寒桿菌SB07.060與SB07.068、B型副傷寒沙門桿菌Java 變異株(S .ParatyphiB var .Java )CF09.004與SA09.012、波茨坦沙門桿菌(S .Potsdam)CF08.071與CF08.092、聖保羅沙門桿菌(S .Saintpaul)SA09.014與SA09.016、史華氏沙門桿菌(S Schwarzengrund)CF08.009與CF08.040、山夫頓堡沙門桿菌(S .Senftenberg)NC04.037與SA04.051、芙蓉沙門桿菌(S .Seremban)SA08.144與SA08.275、 新加坡沙門桿菌(S .Singapore)SP08.013與CC06.097、史坦萊沙門桿菌(S .Stanley)CF09.026與CF09.028、坦巴孔達沙門桿菌(S .Tambacounda)CA08.128與CG06.008、田納西沙門桿菌CA08134與CA06.018、湯普森沙門桿菌SG05.251與CA06.191、傷寒沙門桿菌(S .Typhi)CH09.016、CH09.017、04-901-356988、04-901-764625、04-901-925948、04-901-925983、04-901-989321、04-901-995173、06-901-234525與06-901-234524、烏干達沙門桿菌(S .Uganda)SA08.111與SA08.185、維多利亞沙門桿菌(S .Victoria)SD08.011與SD08.100，以及華太夫雷登沙門桿菌(S .Weltevreden)SB09.001與SQ09.016。

2.在下面實施例中所使用的各種非-腸道沙門桿菌的細菌菌株是分別購自於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)(300新竹市食品路331號，台灣)、美國類型培養物收集中心(American Type Culture Collection,ATCC)以及瑞典的哥特堡大學的菌種保存中心(Culture Collection,University of Göteborg,CCUG)，這些菌株包括：(1)葡萄球菌屬物種(Staphylococcus spp.)：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )BCRC 13824、13825、 13830、12654、12656與ATCC 700699、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus )BCRC 15252、中間型葡萄球菌(Staphylococcus intermedius )BCRC 15236與12157、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis )BCRC 10785、豬葡萄球菌(Staphylococcus hyicus )BCRC 12925、溶血性葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus )BCRC 12923以及葡萄球菌屬物種菌株BCRC 12660；(2)李斯特菌屬物種(Listeria spp.)：單核球增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes )BCRC 14845、14846、14847、14848、14930、15327、15330、15331、15332、15333與15334以及穆氏李斯特菌(Listeria murrayi )BCRC 15362、15360、14849與14843；(3)假單胞菌屬物種(Pseudomonas spp.)：螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens )BCRC 16016、13902、11028、13904與10304、戀臭假單胞菌(P .putida )BCRC 10459、綠膿桿菌(P .aeruginosa )BCRC 10944以及門多薩假單胞菌(P .mendocina )BCRC 10458；(4)不動桿菌屬物種(Acinetobacter spp.)：不動桿菌屬物種菌株BCRC 15420與17454、醋酸鈣不動桿菌(A .calcoaceticus )BCRC 11562、鮑氏不動桿菌(A .baumannii )BCRC 15556與15318、鄔氏不動桿菌(A .ursingii )BCRC 17329以及約氏不動桿菌(A .johnsonii )BCRC 14853； (5)大腸桿菌(Echerichia coli )BCRC 14824與14825、大腸桿菌O157：H7(Eschrichia coli O157：H7)BCRC 13086、13094、13095、ATCC 35150與43890；(6)鏈球菌屬物種(Streptococcus spp.)：無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae )BCRC 10787、乳房鏈球菌(Streptococcus uberis )ATCC 700407以及牛鏈球菌(Streptococcus bovis )CCUG 4214；(7)阪崎克羅諾桿菌(Cronobacter sakazakii )BCRC 14122、13988與14153；(8)弧菌屬物種(Vibrio spp.)：腸炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus )BCRC 13023與13025以及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus )BCRC 12829；(9)梭菌屬物種(Clostridium spp.)：產氣莢膜芽胞梭菌(Clostridium perfringens )BCRC 10914、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum )BCRC 10639、艱難梭菌(Clostridium difficile )BCRC 10642以及溶血性梭菌(Clostridium haemolyticum )BCRC 10643；(10)莫拉氏菌屬物種(Moraxella spp.)：黏膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis )BCRC 10629以及奧斯陸莫拉氏菌(Moraxella osloensis )BCRC 10705；(11)仙人掌桿菌(Bacillus cereus )BCRC 10250；(12)腎棒狀桿菌(Corynebacterium renale )BCRC 10657；(13)菲律賓鏈黴菌(Streptomyces filipinensis )BCRC 11472； (14)水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis )BCRC 14814；以及(15)啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae )BCRC 20577。

3.在下面實施例中所使用的胰蛋白酶大豆肉湯培養基(Tryptic Soy Broth,TSB)以及平板計數培養基(Plate Count Agar,PCA)是購自於Difco(Difco Uboratories,Detroit,Michigan U.S.A)。

4.在下面實施例中所使用的經生物素(biotin)標定的引子對以及探針是由生工科技公司(台北，台灣)所合成。

一般實驗方法： 1.基因組DNA的萃取(extraction of genomic DNA)：

細菌菌株的基因組DNA的萃取是使用血液與組織基因組DNA Miniprep系統(Blood and Tissue Genomic DNA Miniprep System,VIOGENE)來進行。首先，將1 mL的細菌培養物或食品樣品置於一微量離心管中，繼而以10,000 rpm來進行離心歷時5分鐘。在倒除上澄液之後，以1 mL無菌水來清洗沉澱物(pellets)共計2次。之後，加入200 μL無菌水以充分懸浮菌體，繼而加入20 μL溶菌酶(lysozyme)(2 mg/mL)以及20 μL RNase A(2 mg/mL)並於37℃下反應歷時3小時。接著，加入200 μL Ex緩衝液以及15 μL蛋白酶K(proteinase K)(10 mg/mL)並予以震盪混合，由此所形成的混合物被置於60℃水浴下反應過夜。之後，將該混合物置於70℃水浴下歷時30分鐘俾以讓蛋白酶K失去活性，繼而加入250 μL絕對酒精並予以輕微地震盪混合歷時數秒。接著， 將一B/T基因組DNA Mini管柱(B/T Genomic DNA Mini Column)放入至一個收集管(collection tube)中，並將所有混合物移至該管柱中，繼而以8,000 rpm來進行離心歷時2分鐘。之後，將該管柱放入至一個新的收集管中，並以500 μL WS緩衝液來清洗該管柱內的沉澱物共計2次，繼而以8,000 rpm來進行離心歷時2分鐘。在移除洗出物(eluate)之後，將該管柱放回該收集管內，並以12,000 rpm來進行離心歷時3分鐘。最後，將該管柱放入至一個新的微量離心管中，繼而將100 μL無菌水(被預熱至70℃)加入至該管柱的中心處並靜置歷時5分鐘，然後以13,000 rpm來進行離心歷時30秒以洗提出細菌菌株的基因組DNA。由此而得到的基因組DNA被儲存於-20℃下備用。

實施例1. 用於偵測腸道沙門桿菌的引子對(primer pairs)的設計

首先，申請人依據Masato Akibaet al .(2011)(同上述)而分別從Sanger Institute的FTP位址ftp：//ftp.sanger.ac.uk/pub/pathogens/Salmonella/HADAR.dbs與ftp：//ftp.sanger.ac.uk/pub/pathogens/Salmonella/SIN.dbs中下載哈達爾沙門桿菌以及嬰兒型沙門桿菌的完整基因組序列(complete genome sequence)，然後依據該哈達爾沙門桿菌的完整基因組當中的哈達爾-特異性基因組區域(hadar-specific genomic region,HSR)以及該嬰兒型沙門桿菌的完整基因組當中的嬰兒型-特異性基因組區域(infantis-specific genomic region,ISR)中所示的核苷酸序列，而分別針對哈達 爾沙門桿菌以及嬰兒型沙門桿菌來設計出多組引子對。

另外，維爾肖氏沙門桿菌的基因組(genome)至今尚未被完全地定序，而依據申請人先前的研究發現：嬰兒型沙門桿菌的完整基因組當中的核苷酸殘基位置3710138至3713529處與維爾肖氏沙門桿菌所具者具有高度的序列相似性。因此，申請人針對上述的嬰兒型沙門桿菌的完整基因組當中的核苷酸殘基位置3710138至3710158處以及核苷酸殘基位置3713529至3713507處，而設計出具有下面所示核苷酸序列的引子對Univer-F引子與Univer-R引子。

Univer-F引子

5’-cctgatgaaaagcggacaaag-3’(序列辨識編號：1)

Univer-R引子

5’-gccttgataatgcctgtgcagaa-3’(序列辨識編號：2)

之後，將上面“實驗材料”的第1項當中所述的維爾肖氏沙門桿菌CA08.158接種至TSB肉湯培養基中，並於一恆溫振盪培養箱(37℃、150 rpm)內進行培養過夜。接著，取1 mL的細菌培養物並且依照上面“一般實驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述的方法來進行基因組DNA的萃取。然後，以所得到的維爾肖氏沙門桿菌CA08.158的基因組DNA作為模版(template)，並使用上面所設計出的引子對Univer-F引子與Univer-R引子來進行使用下面表1中所示的反應條件之聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)。

於完成PCR後，藉由2%瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)來對所得到的PCR反應溶液進行分析，而實驗結果發現：維爾肖氏沙門桿菌有得到2個大小分別約為3000 bp以及500 bp的PCR產物。接著，該大小約為500 bp的維爾肖氏沙門桿菌的PCR產物是藉由使用凝膠萃取套組(Gel Extraction Kit)(Viogene,USA)而從瓊脂糖凝膠中被純化以及回收，繼而委託禾鑫生物科技公司來進行定序分析，而定序結果顯示該經純化的PCR產物包含有一大小為341 bp且具有如序列辨識編號：3所示之核苷酸序列的DNA片段。然後，使用BLAST軟體(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)而將該經定序的DNA片段的核苷酸序列(序列辨識編號：3)拿來與上述嬰兒型沙門桿菌的完整基因組當中的的核苷酸序列進行比對分析，所得到 的序列比對的分析結果被顯示於圖1中。從圖1可見，該維爾肖氏沙門桿菌的DNA片段大體上可對應於該嬰兒型沙門桿菌的完整基因組當中的核苷酸殘基位置3713150至3713480處，其中該DNA片段與該核苷酸殘基位置3713251至3713480處的核苷酸序列具有高度相似性，但是與該核苷酸殘基位置3713150至3713250處的核苷酸序列則具有較高的變異性。因此，申請人依據該DNA片段來設計出多組針對維爾肖氏沙門桿菌的引子對。

之後，上述針對3種腸道沙門桿菌血清型所設計出的多組引子對利用NCBI網站所提供的Gene Blast軟體而被拿來與NCBI網站的細菌基因資料庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi)中的所有基因序列進行比對分析，藉此而篩選出1組對於哈達爾沙門桿菌具有血清型-特異性的引子對(serovar-specfic primer pair)HADAF/HADAR、2組對於嬰兒型沙門桿菌具有血清型-特異性的引子對INFA1F/InViR與INFA2F/InViR以及2組對於維爾肖氏沙門桿菌具有血清型-特異性的引子對VIRC1F/InViR與VIRC2F/InViR(參見表2)，繼而將這5組引子對標定以生物素後來供後續的實驗之用。

實施例2. 本發明的引子對在腸道沙門桿菌檢測上的專一性(specificity)以及靈敏度(sensitivity)之分析

為了評估在上面實施例1中針對3種腸道沙門桿菌血清型所設計出的5組血清型-特異性引子對的專一性以及靈敏度，下面的實驗被進行。

A、引子對的專一性試驗：

首先，將上面“實驗材料”的第1與2項當中所述的259種細菌菌株分別接種至TSB肉湯培養基中，並於一恆溫振盪培養箱(37℃、150 rpm)內進行培養過夜。接著，分別取1 mL的細菌培養物並且依照上面“一般實驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述的方法來進行基因組DNA的萃取。然後，以所得到的各個細菌菌株的基因組DNA作為模版(template)，並分別使用在上面實施例1中所設計出的經生物素標定的引子對HADAF/HADAR、INFA1F/InViR、INFA2F/InViR、VIRC1F/InViR以及VIRC2F/InViR來進行聚合酶鏈反應(PCR)，而PCR的反應條件被顯示於下面表3中。

於完成PCR之後，藉由2%瓊脂糖凝膠電泳來確認是否有得到一如表2中所示之既定大小的PCR產物。

B、引子對的靈敏度試驗：

為瞭解本發明所揭示的5組血清型-特異性引子對在腸道沙門桿菌菌株檢測上的靈敏度，哈達爾沙門桿菌CA08.159、嬰兒型沙門桿菌SB08.005以及維爾肖氏沙門桿菌CA08.158被拿來進行下面的實驗。首先，將這3種菌株分別接種至TSB肉湯培養基中，並於一恆溫振盪培養箱(37℃、150 rpm)內進行培養過夜。所形成的細菌培養物以TSB肉湯培養基予以調整至一為10⁹ CFU/mL(以平板計數培養基來進行菌數計數)的濃度，並以之作為原液(stock)來進行10倍連續稀釋(10-fold serial dilution)，藉此而得到具有不同濃度(10² ~10⁹ CFU/mL)的稀釋菌液。之後，對各個含有不同細菌濃度的稀釋菌液分別取1 mL並且依照上面“一般實 驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述的方法來進行基因組DNA的萃取。

另外，將一部分之依據上述方式所得到的含有不同細菌濃度的稀釋菌液置於一恆溫振盪培養箱(37℃、150 rpm)內進行增殖培養(enrichment culturing)歷時10小時。之後，對各個經增殖培養的含有不同細菌濃度的稀釋菌液分別取1 mL並且依照上面“一般實驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述的方法來進行基因組DNA的萃取。

依據上面所得到的各個未經增殖培養以及經增殖培養的細菌菌株的基因組DNA被拿來作為模版，並分別使用如上面表2中所示之5組血清型-特異性引子對來進行PCR，而PCR的反應條件是如上面表3中所示者。

於完成PCR之後，藉由2%瓊脂糖凝膠電泳來確認是否有得到一如表2中所示之既定大小的PCR產物。

結果： A、引子對的專一性試驗：

經由瓊脂糖凝膠電泳分析結果發現，當以各個細菌菌株的基因組DNA作為模版並使用經生物素標定的引子對HADAF/HADAR來進行PCR時，只有哈達爾沙門桿菌有得到一大小約為427 bp的PCR擴增產物。

另外，當使用經生物素標定的引子對INFA1F/InViR以及INFA2F/InViR來進行PCR時，只有嬰兒型沙門桿菌分別有得到一大小約為268以及240 bp的PCR擴增產物；以及當使用經生物素標定的引子對VIRC1F/InViR以及 VIRC2F/InViR來進行PCR時，只有維爾肖氏沙門桿菌分別有得到一大小約為273以及234 bp的PCR擴增產物。

這個實驗結果顯示：依據本發明的5組血清型-特異性引子對HADAF/HADAR、INFA1F/InViR、INFA2F/InViR、VIRC1F/InViR以及VIRC2F/InViR對於所欲檢測的標的菌株皆具有檢測專一性。

B、引子對的靈敏度試驗：

下面表4顯示依據本發明的5組血清型-特異性引子對的靈敏度試驗結果。從表4可見，經生物素標定的引子對HADAF/HADAR、INFA1F/InViR、INFA2F/InViR、VIRC1F/InViR以及VIRC2F/InViR對於未經增殖培養的腸道沙門桿菌菌株的檢測靈敏度可以達到10³ CFU/mL，而對於經增殖培養的腸道沙門桿菌菌株的檢測靈敏度可以達到10⁰ CFU/mL。這個實驗結果顯示：依據本發明的5組血清型-特異性引子對HADAF/HADAR、INFA1F/InViR、INFA2F/InViR、VIRC1F/InViR以及VIRC2F/InViR具有高靈敏度而可供應用於偵測腸道沙門桿菌菌株。

實施例3. 用於偵測腸道沙門桿菌的探針(probes)的設計

依據哈達爾沙門桿菌的完整基因組(下載自ftp：//ftp.sanger.ac.uk/pub/pathogens/Salmonella/HADAR.dbs)當中的哈達爾-特異性基因組區域(HSR)以及嬰兒型沙門桿菌的完整基因組(下載自ftp：//ftp.sanger.ac.uk/pub/pathogens/Salmonella/SIN.dbs)當中的嬰兒型-特異性基因組區域(ISR)，而分別針對哈達爾沙門桿菌以及嬰兒型沙門桿菌來設計出多種探針。

之後，該等探針利用NCBI網站所提供的Gene Blast軟體來分別與NCBI網站的細菌基因資料庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi)中的所有基因序列進行比對分析，藉此而篩選出分別對於哈達爾沙門桿菌以及嬰兒型沙門桿菌具有血清型-特異性的探針HADAP以及INFA1P。

另外，在上面實施例1中所設計出的VIRC1F引子的互 補序列(complementary sequences)被使用作為針對維爾肖氏沙門桿菌的血清型-特異性探針VIRC1P。

為表清楚，依據本發明的引子對以及探針的相關資訊(包括：核苷酸序列、所擴增出的PCR產物大小、對應於標的基因或完整的基因組DNA的所在位置等)已被整合於下面表5中。

實施例4. 依據本發明的引子對對於食品中的腸道沙門桿菌的檢測能力之評估

為了評估依據本發明的5組血清型-特異性引子對對於存在於食品中的腸道沙門桿菌菌株的檢測專一性與靈敏度，含有各種不同腸道沙門桿菌菌株的雞肉樣品被拿來進行PCR。

A、製備含有哈達爾沙門桿菌、嬰兒型沙門桿菌或維爾肖氏沙門桿菌的雞肉樣品：

首先，將哈達爾沙門桿菌CA08.159、嬰兒型沙門桿菌SB08.005以及維爾肖氏沙門桿菌CA08.158分別接種至TSB肉湯培養基中，並於一恆溫振盪培養箱(37℃、150 rpm)內進行培養過夜。所形成的細菌培養物以TSB肉湯培養基予以調整至一為10⁹ CFU/mL(以平板計數培養基來進行菌數計數)的濃度，並以之作為原液來進行10倍連續稀釋，藉此而得到具有不同濃度(10² ~10⁹ CFU/mL)的稀釋菌液。之後，對各個含有不同細菌濃度的稀釋菌液分別取100 μL，繼而加入1 mL的雞肉均質液與8.9 mL的TSB肉湯培養基並予以混合均勻，藉此而得到含有不同細菌濃度(10⁰ ~10⁷ CFU/mL)的雞肉樣品。

另外，將一部分之依據上述的方式所得到的含有不同細菌濃度的雞肉樣品置於一恆溫振盪培養箱(37℃、150 rpm)內進行增殖培養歷時10小時，藉此而得到經增殖培養之含有不同細菌濃度的雞肉樣品。

B、引子對的專一性試驗：

對在上面第A項當中所製得之未經增殖培養的含有哈達爾沙門桿菌、嬰兒型沙門桿菌或維爾肖氏沙門桿菌的雞肉樣品(各個樣品含有一為10⁷ CFU/mL的細菌濃度)各取1 mL，並依照上面“一般實驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述的方法來進行基因組DNA的萃取。然後，以所得到的各個腸道沙門桿菌菌株的基因組DNA作為模版並分別使用經生物素標定的引子對HADAF/HADAR、INFA1F/InViR、INFA2F/InViR、VIRC1F/InViR以及VIRC2F/InViR來進行PCR，而PCR的反應條件是如上面表3中所示者。於完成PCR之後，各個菌株皆會分別得到5個PCR擴增產物，因此總計可得到15個PCR擴增產物，其中藉由使用引子對HADAF/HADAR、INFA1F/InViR以及VIRC1F/InViR而得到的9個PCR擴增產物被統稱為第1群PCR產物。

所得到的15個PCR產物分別被拿來進行2%瓊脂糖凝膠電泳分析，俾以確認是否可得到一如表5中所示之既定大小的PCR產物。

C、引子對的靈敏度試驗：

對在上面第A項當中所製得的未經增殖培養以及經增殖培養之含有不同濃度(10⁰ ~10⁷ CFU/mL)的哈達爾沙門桿菌的雞肉樣品各取1 mL，並依照上面“一般實驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述的方法來進行基因組DNA的萃取。接著，以所得到之未經增殖培養以及經增殖培養的哈達爾沙門桿菌的基因組DNA作為模版，並使用經 生物素標定的引子對HADAF/HADAR來進行PCR，而PCR的反應條件是如上面表3中所示者。於完成PCR之後，總計可得到16個PCR擴增產物，它們被統稱為第2群PCR產物。

有關含有嬰兒型沙門桿菌或維爾肖氏沙門桿菌之雞肉樣品的靈敏度試驗大體上是參照上面針對含有哈達爾沙門桿菌的雞肉樣品當中所述的方式來進行，不同之處在於：當以嬰兒型沙門桿菌的基因組DNA作為模版來進行PCR時，所選用的引子對為INFA1F/InViR以及INFA2F/InViR；而當以維爾肖氏沙門桿菌的基因組DNA作為模版來進行PCR時，所選用的引子對為VIRC1F/InViR以及VIRC2F/InViR。於完成PCR之後，嬰兒型沙門桿菌以及維爾肖氏沙門桿菌皆會各得到32個PCR擴增產物，其中藉由使用引子對INFA1F/InViR與VIRC1F/InViR而得到的PCR擴增產物分別被統稱為第3與4群PCR產物。

最後，上面所得到的80個PCR產物分別被拿來進行2%瓊脂糖凝膠電泳分析，俾以確認是否可得到一如表5中所示之既定大小的PCR產物。

結果： A、引子對的專一性試驗：

經由瓊脂糖凝膠電泳分析結果發現，當分別以得自於雞肉樣品中的哈達爾沙門桿菌、嬰兒型沙門桿菌或維爾肖氏沙門桿菌的基因組DNA作為模版並使用經生物素標定的引子對HADAF/HADAR來進行PCR時，只有哈達爾沙門桿 菌有得到一大小約為427 bp的PCR擴增產物；當使用經生物素標定的引子對INFA1F/InViR以及INFA2F/InViR來進行PCR時，只有嬰兒型沙門桿菌分別有得到一大小約為268以及240 bp的PCR擴增產物；以及當使用經生物素標定的引子對VIRC1F/InViR以及VIRC2F/InViR來進行PCR時，只有維爾肖氏沙門桿菌分別有得到一大小約為273以及234 bp的PCR擴增產物。

這個實驗結果顯示：依據本發明的5組血清型-特異性引子對HADAF/HADAR、INFA1F/InViR、INFA2F/InViR、VIRC1F/InViR以及VIRC2F/InViR對於存在於食品中的標的菌株具有檢測專一性。

B、引子對的靈敏度試驗：

下面表6顯示依據本發明的5組血清型-特異性引子對對於存在於雞肉樣品中的腸道沙門桿菌菌株的檢測靈敏度。從表6可見，經生物素標定的引子對HADAF/HADAR、INFA1F/InViR、INFA2F/InViR、VIRC1F/InViR以及VIRC2F/InViR對於未經增殖培養的雞肉樣品中的腸道沙門桿菌菌株的檢測靈敏度可以達到10³ CFU/mL，而對於經增殖培養的雞肉樣品中的腸道沙門桿菌菌株的檢測靈敏度可以達到10⁰ CFU/mL。

這個實驗結果顯示：依據本發明的5組血清型-特異性引子對HADAF/HADAR、INFA1F/InViR、INFA2F/InViR、VIRC1F/InViR以及VIRC2F/InViR對於存在於食品中的標的菌株具有高度的檢測靈敏度。

實施例5. 藉由多重聚合酶鏈反應(multiplex polymerase chain reaction,multiplex PCR)來偵測食品中的腸道沙門桿菌

為了評估一由本發明的3種血清型-特異性引子對HADAF/HADAR、INFA1F/InViR以及VIRC1F/InViR所構成的引子組合在多重聚合酶鏈反應上的檢測效用，在上面實施例4的第A項當中所製得之未經增殖培養的含有不同腸道沙門桿菌菌株的雞肉樣品被拿來進行下面的實驗。

實驗方法：

首先，對在上面實施例4的第A項當中所製得之未經增殖培養的含有哈達爾沙門桿菌、嬰兒型沙門桿菌或維爾肖氏沙門桿菌的雞肉樣品(各個樣品含有一為10⁷ CFU/mL的細菌濃度)各取1 mL，並依照上面“一般實驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述的方法來進行基因組DNA的萃取。接著，將得自於雞肉樣品中的3種腸道沙門桿菌血清型的基因組DNA(濃度為150 μg/μL)依據下面表7 中所示的組合與用量比例來進行混合，藉此而得到基因組DNA混合物A至D。然後，分別以所得到的基因組DNA混合物A至D作為模版，並使用一由經生物素標定的引子對HADAF/HADAR、INFA1F/InViR以及VIRC1F/InViR所構成的引子組合來進行多重聚合酶鏈反應，而多重聚合酶鏈反應的反應條件是如下面表8中所示者。

於完成多重PCR之後，所得到4個PCR擴增產物(它們被統稱為第5群PCR產物)分別被拿來進行2%瓊脂糖凝膠電泳分析，俾以確認是否可得到既定大小的PCR產物。

結果：

圖2顯示以基因組DNA混合物A至D作為模版並分別使用一由經生物素標定的引子對HADAF/HADAR、INFA1F/InViR以及VIRC1F/InViR所構成的引子組合來進行多重PCR時所得到的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析結果，其中徑M表示DNA階梯標記(DNA ladder marker)，而徑1至徑4分別表示基因組DNA混合物A至D。從圖2可見，該引子組合中的血清型-特異性引子對HADAF/HADAR、 INFA1F/InViR以及VIRC1F/InViR可以同時專一性地偵測到存在於各個基因組DNA混合物中的標的菌株。

這個實驗結果證實：一由本發明的3種血清型-特異性引子對(亦即HADAF/HADAR、INFA1F/InViR以及VIRC1F/InViR)所構成的引子組合可供用於多重PCR，藉此可同時專一性地偵測到存在於食品中的哈達爾沙門桿菌、嬰兒型沙門桿菌以及維爾肖氏沙門桿菌。

實施例6. 依據本發明的探針對於食品中的腸道沙門桿菌的檢測能力之評估

為了評估在上面實施例3中所設計出的3種探針(如表5中所顯示者)對於存在於食品中的腸道沙門桿菌的檢測專一性與靈敏度，在上面實施例4以及5當中所得到的第1至5群PCR產物被拿來進行下面的實驗。

A、生物晶片的製備：

首先，為了讓依據本發明的3種探針在被點佈(spotted)於生物晶片的表面上時可具有較佳的固定性(immobilization)，這3種探針的5’端或3’端分別被修飾以寡(dT)[oligo(dT)]，而由此所得到的40-員探針(40-mer probes)被顯示於下面的表9中。

之後，將所合成出的40-員探針1至3分別溶於無菌水中，藉此而得到具有一濃度為10~20 μM的探針原液1至3。接著，對探針原液1至3各取25 μL並分別與25 μL的2X探針溶液(2X Probe solution)(Dr.Chip Biotech.,Taiwan)進行混合以形成晶片探針溶液1至3。將所形成的晶片探針溶液1至3加入至一個96井的培養盤中，然後藉由自動點製儀(Automatic arrayer)(Ezspot SR-A300,Shuai Ran precision,Taiwan)將40-員探針1至3點佈於塑膠膜(plastic membrane)(DR.Chip,Dr.Chip Biotech.,Taiwan)上，繼而使用UV交聯器C1508(UV-cross linker Cl508)(UVItec,Cambridge,England)(254 nm/0.6-1.2焦耳)將該等40-員探針固定(immobilized)在塑膠膜上，藉此而形成一含有依據本發明的3種探針的生物晶片。另外，經生物素標定的隨機序列片段以及2X探針溶液分別被用來作為正對照組(positive control)以及負對照組(negative control)。有關該生物晶片的DNA探針點佈位置(DNA probe spot position)被顯示在圖3中，其中A3表示探針2；B1表示探針3；B2表示 探針1；C1表示正對照組；以及C2表示負對照組。

B、生物晶片的專一性試驗：

首先，將25 μL在上面實施例4的“B、引子對的專一性試驗”中所得到的第1群PCR產物(共計9個PCR擴增產物)分別置於一為1.5 mL的微量離心管(microtube)中並加入200 μL DR.Hyb^TM 緩衝液(DR.Hyb^TM Buffer)(Dr.Chip Biotech.,Taiwan)。接著，於99℃下進行變性反應(denaturation)歷時10分鐘，繼而於冰上靜置歷時5分鐘，藉此而得到9種含有單股DNA的混合溶液。之後，將上面第A項所製得之生物晶片置於雜交盒(hybridization box)(DR.Chip Biotech.,Taiwan)中並分別加入上面所得到的9種混合溶液，接著蓋上盒蓋並置於一溫度被設定在50℃的烘箱(DR.Mini^TM Oven,Dr.Chip Biotech.,Taiwan)中進行震盪反應歷時1小時。之後，將各個雜交盒中的溶液移除並於室溫下以250μL的清洗緩衝液(Wash Buffer)(Dr.Chip Biotech.,Taiwan)來洗滌該等生物晶片1次，繼而再以250 μL的清洗緩衝液予以洗滌1次以移除非特異性結合的DNA-DNA雜交物(hybrids)。接著，將200 μL的封阻試劑(Blocking Reagent)(Dr.Chip Biotech.,Taiwan)與0.2 μL的鏈黴素-AP(Streptavidin-AP)(NEL751,Perkin Elmer Co.,MA,USA)混合均勻並分別加入各個雜交盒中，然後置於一溫度被設定在30℃的烘箱中進行震盪反應歷時30分鐘。在移除該等雜交盒中的液體之後，加入500 μL的清洗緩衝液並靜置歷時1分鐘，繼而將清洗緩衝液移除。此清洗-靜置步驟被重複4 次。之後，將196 μL的偵測緩衝液(Detection Buffer)(Dr.Chip Biotech.,Taiwan)與4 μL的BCIP/NBT受質溶液(BCIP/NBT substrate solution)(NEL937,Perkin Elmer Co.,MA,USA)混合均勻並分別加入各個雜交盒中，然後靜置歷時15至30分鐘以進行顯色反應(chromogenic reaction)。之後，將該等雜交盒置於烘箱(DR.Mini^TM Oven,Dr.Chip Biotech.,Taiwan)中烘乾歷時10至15分鐘，繼而取出該等生物晶片並以影像分析系統(DR.AiM^TM Reader,Dr.Chip Biotech.,Taiwan)來進行掃描。

此外，為了進一步評估該生物晶片能否檢測出同時存在於一食品中的多種腸道沙門桿菌菌株，申請人選用在上面實施例5當中所得到的第5群PCR產物(共計4個PCR擴增產物)並參照上面所描述的方式來進行變性反應，藉此所得到的4種含有單股DNA的混合溶液分別被拿來與該生物晶片進行雜交反應，而有關雜交反應的反應條件以及操作步驟是如上面所描述者。

C、生物晶片的靈敏度試驗：

在上面實施例4的“C、引子對的靈敏度試驗”當中所得到的第2至4群PCR產物(各群分別有16個PCR擴增產物，共計48個PCR擴增產物)是參照上面第B項所述的方式來進行變性反應，藉此所得到的48種含有單股DNA的混合溶液分別被拿來與該生物晶片進行雜交反應，而有關雜交反應的反應條件以及操作步驟是如上面第B項當中所描述者。

結果： A、生物晶片的專一性試驗：

為了瞭解當本發明的DNA探針被應用在生物晶片時對於腸道沙門桿菌菌株的檢測專一性，以得自於雞肉樣品中的哈達爾沙門桿菌、嬰兒型沙門桿菌或維爾肖氏沙門桿菌的基因組DNA作為模版並分別使用經生物素標定的引子對HADAF/HADAR、INFA1F/InViR以及VIRC1F/InViR來進行PCR後所得到的9種PCR產物分別被拿來與一含有依據本發明的3種血清型-特異性探針的生物晶片進行雜交反應。圖4顯示經由雜交後所得到的圖譜，由圖4A可見，當以哈達爾沙門桿菌的基因組DNA作為模版並使用經生物素標定的引子對HADAF/HADAR來進行PCR後所得到的PCR產物被拿來與該生物晶片進行雜交反應時，在B2處有觀察到一雜交訊號。由圖4B可見，當以嬰兒型沙門桿菌的基因組DNA作為模版並使用經生物素標定的引子對INFA1F/InViR來進行PCR後所得到的PCR產物被拿來與該生物晶片進行雜交反應時，在A3處有觀察到一雜交訊號。由圖4C可見，當以維爾肖氏沙門桿菌的基因組DNA作為模版並分別使用經生物素標定的引子對VIRC1F/InViR來進行PCR後所得到的PCR產物被拿來與該生物晶片進行雜交反應時，在B1處有觀察到一雜交訊號。

以4種含有不同的細菌基因組DNA的混合物(亦即上面表7中所列示的基因組DNA混合物A至D)作為模版並分別使用一由經生物素標定的引子對HADAF/HADAR、 INFA1F/InViR以及VIRC1F/InViR所構成的引子組合來進行多重PCR後所得到的4種PCR產物(亦即第5群PCR產物)分別被拿來與該生物晶片進行雜交反應。圖5顯示經由雜交後所得到的圖譜，由圖5A可見，當以一由哈達爾沙門桿菌與嬰兒型沙門桿菌的基因組DNA所構成的混合物(亦即基因組DNA混合物A)作為模版來進行多重PCR後所得到的PCR產物被拿來與該生物晶片進行雜交反應時，在B2以及A3處分別有觀察到一雜交訊號。由圖5B可見，當以一由哈達爾沙門桿菌與維爾肖氏沙門桿菌的基因組DNA所構成的混合物(亦即基因組DNA混合物B)作為模版來進行多重PCR後所得到的PCR產物被拿來與該生物晶片進行雜交反應時，在B2以及B1處分別有觀察到一雜交訊號。由圖5C可見，當以一由嬰兒型沙門桿菌與維爾肖氏沙門桿菌的基因組DNA所構成的混合物(亦即基因組DNA混合物C)作為模版來進行多重PCR後所得到的PCR產物被拿來與該生物晶片進行雜交反應時，在A3以及B1處分別有觀察到一雜交訊號。由圖5D可見，當以一由哈達爾沙門桿菌、嬰兒型沙門桿菌與維爾肖氏沙門桿菌的基因組DNA所構成的混合物(亦即基因組DNA混合物D)作為模版來進行多重PCR後所得到的PCR產物被拿來與該生物晶片進行雜交反應時，在B2、A3以及B1處分別有觀察到一雜交訊號。

上面的實驗結果證實：依據本發明的血清型-特異性探針1至3分別可以專一性地偵測到存在於食品中的哈達爾沙門桿菌、嬰兒型沙門桿菌以及維爾肖氏沙門桿菌。因此， 依據本發明的血清型-特異性探針1至3可被應用於基因晶片(gene chip)以供快速地檢測腸道沙門桿菌菌株。

B、生物晶片的靈敏度試驗：

表10顯示使用一含有依據本發明的3種血清型-特異性探針的生物晶片來檢測存在於雞肉樣品中的腸道沙門桿菌菌株時所得到的靈敏度試驗結果。從表10可見，該生物晶片對於未經增殖培養的雞肉樣品中的腸道沙門桿菌菌株的檢測靈敏度可以達到10² CFU/mL，而對於經增殖培養的雞肉樣品中的腸道沙門桿菌菌株的檢測靈敏度可以達到10⁰ CFU/mL。這個實驗結果顯示：依據本發明的血清型-特異性探針1至3對於所欲偵測的標的菌株具有高靈敏度，因而可被應用於基因晶片以供快速地偵測出存在於食品中的微量腸道沙門桿菌。

於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

圖1顯示使用BLAST軟體來對嬰兒型沙門桿菌以及維爾肖氏沙門桿菌的核苷酸序列進行比對分析而得到的結果，其中以符號“＊”所標示者代表這2種腸道沙門桿菌之守恆的核苷酸殘基，而以灰底所標示的數字代表對應於嬰兒型沙門桿菌的完整基因組當中的核苷酸殘基位置；圖2顯示以基因組DNA混合物A至D作為模版並分別使用一由經生物素標定的引子對HADAF/HADAR、INFA1F/InViR以及VIRC1F/InViR所構成的引子組合來進行多重PCR時所得到的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析結果，其中徑M表示DNA階梯標記，而徑1至徑4分別表示基因組DNA混合物A至D；圖3顯示一含有依據本發明的3種探針的生物晶片的DNA探針點佈位置，其中A3表示探針2；B1表示探針3；B2表示探針1；C1表示正對照組；以及C2表示負對照組；圖4A至4C分別顯示以得自於雞肉樣品中的哈達爾沙門桿菌、嬰兒型沙門桿菌或維爾肖氏沙門桿菌的基因組DNA作為模版，並分別使用經生物素標定的引子對HADAF/HADAR、INFA1F/InViR以及VIRC1F/InViR來進行PCR後所得到的PCR產物被拿來與一含有依據本發明的 3種血清型-特異性探針的生物晶片進行雜交反應時所觀察到的雜交圖譜；以及圖5A至5D分別顯示以基因組DNA混合物A至D作為模版，並分別使用一由經生物素標定的引子對HADAF/HADAR、INFA1F/InViR以及VIRC1F/InViR所構成的引子組合來進行多重PCR後所得到的PCR產物被拿來與一含有依據本發明的3種血清型-特異性探針的生物晶片進行雜交反應時所觀察到的雜交圖譜。

<110> 弘光科技大學

<120> 用於檢測沙門桿菌菌株的核酸分子、檢驗套組、生物晶片以及方法

<130> 用於檢測腸道沙門桿菌的引子以及探針

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增維爾肖氏沙門桿菌的隨機DNA片段的Univer-F引子

<400> 1

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增維爾肖氏沙門桿菌的隨機DNA片段的Univer-R引子

<400> 2

<210> 3

<211> 341

<212> DNA

<213> 維爾肖氏沙門桿菌

<400> 3

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測哈達爾沙門桿菌的HADAF引子

<400> 4

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測哈達爾沙門桿菌的HADAR引子

<400> 5

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測嬰兒型沙門桿菌的INFA1F引子

<400> 6

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測嬰兒型沙門桿菌與維爾肖氏沙門桿菌的InViR引子

<400> 7

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測嬰兒型沙門桿菌的INFA2F引子

<400> 8

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測維爾肖氏沙門桿菌的VIRC1F引子

<400> 9

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測維爾肖氏沙門桿菌的VIRC2F引子

<400> 10

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測哈達爾沙門桿菌的HADAP探針

<400> 11

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測嬰兒型沙門桿菌的INFA1P探針

<400> 12

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測維爾肖氏沙門桿菌的VIRC1P探針

<400> 13

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測哈達爾沙門桿菌之經寡d(T)修飾的HADAP探針

<220>

<221> 寡d(T)

<222> (26)..(40)

<400> 14

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測嬰兒型沙門桿菌之經寡d(T)修飾的INFA1P探針

<220>

<221> 寡d(T)

<222> (26)..(40)

<400> 15

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測維爾肖氏沙門桿菌之經寡d(T)修飾的VIRC1P探針

<220>

<221> 寡d(T)

<222> (1)..(19)

<400> 16

Claims (21)

1. 一種用於檢測一腸道沙門桿菌的引子試劑，其包含有下列的至少一者：(a)一用於檢測維爾肖氏沙門桿菌的第1組引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：9所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：7所示的核苷酸序列之反向引子；以及(b)一用於檢測維爾肖氏沙門桿菌的第2組引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：10所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：7所示的核苷酸序列之反向引子。
2. 如申請專利範圍第1項的引子試劑，其進一步包含有下列的至少一者：(a)一用於檢測哈達爾沙門桿菌的第3組引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：4所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：5所示的核苷酸序列之反向引子；(b)一用於檢測嬰兒型沙門桿菌的第4組引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：6所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：7所示的核苷酸序列之反向引子；以及(c)一用於檢測嬰兒型沙門桿菌的第5組引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：8所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：7所示的 核苷酸序列之反向引子。
3. 一種用於檢測一腸道沙門桿菌的探針試劑，其包含有一用於檢測維爾肖氏沙門桿菌的探針，其中該探針具有一選自於如序列辨識編號：9、序列辨識編號：10以及序列辨識編號：13所示的核苷酸序列。
4. 如申請專利範圍第3項的探針試劑，其進一步包含有下列的至少一者：(a)一用於檢測哈達爾沙門桿菌的探針，其具有一選自於如序列辨識編號：4、序列辨識編號：5以及序列辨識編號：11所示的核苷酸序列；以及(b)一用於檢測嬰兒型沙門桿菌的探針，其具有一選自於如序列辨識編號：6、序列辨識編號：8以及序列辨識編號：12所示的核苷酸序列。
5. 一種用於檢測一樣品中是否存在有一腸道沙門桿菌的方法，其包括：令該樣品進行一種使用一引子試劑的DNA擴增反應，其中該引子試劑包含有下列的至少一者：(a)一用於檢測維爾肖氏沙門桿菌的第1組引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：9所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：7所示的核苷酸序列之反向引子；以及(b)一用於檢測維爾肖氏沙門桿菌的第2組引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：10所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：7所示 的核苷酸序列之反向引子；以及檢測是否有一藉由使用該至少一組引子對而被擴增出的DNA片段，其中該DNA片段之存在表示有一對應於該至少一組引子對的腸道沙門桿菌之存在。
6. 如申請專利範圍第5項的方法，其中該引子試劑進一步包含有下列的至少一者：(a)一用於檢測哈達爾沙門桿菌的第3組引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：4所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：5所示的核苷酸序列之反向引子；(b)一用於檢測嬰兒型沙門桿菌的第4組引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：6所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：7所示的核苷酸序列之反向引子；以及(c)一用於檢測嬰兒型沙門桿菌的第5組引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：8所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：7所示的核苷酸序列之反向引子。
7. 如申請專利範圍第5或6項的方法，其中該樣品是選自於下列所構成的群組：食品樣品、生物樣品以及環境樣品。
8. 如申請專利範圍第7項的方法，其中該樣品是一選自於由下列所構成的群組中的食品樣品：流體乳品、飲料、肉品、海產食品、動物飼料、水、乳製品、蔬菜、水果 以及罐頭食品。
9. 如申請專利範圍第5或6項的方法，其中在進行該DNA擴增反應之前，從該樣品中萃取出總基因組DNA以作為模版。
10. 如申請專利範圍第5或6項的方法，其中該DNA擴增反應是藉由使用下列方法學之至少一者而被進行：聚合酶鏈反應、反轉錄酶聚合酶鏈反應、即時定量聚合酶鏈反應、巢式PCR、熱啟動PCR、原位PCR、簡併性寡核苷酸引子PCR、微PCR、多重聚合酶鏈反應、以限制片段長度多型性核酸序列為主之擴增反應、轉錄-調節的擴增反應、環媒介等溫擴增反應以及滾環擴增反應。
11. 如申請專利範圍第5或6項的方法，其中該DNA片段的檢測是藉由一種使用一探針的雜交反應而被進行。
12. 如申請專利範圍第11項的方法，其中：(a)當使用該第3組引子對來進行該DNA擴增反應時，該探針具有一選自於如序列辨識編號：4、序列辨識編號：5以及序列辨識編號：11所示的核苷酸序列；(b)當使用該第4組引子對來進行該DNA擴增反應時，該探針具有一選自於如序列辨識編號：6、序列辨識編號：7、序列辨識編號：8以及序列辨識編號：12所示的核苷酸序列；(c)當使用該第5組引子對來進行該DNA擴增反應時，該探針具有一選自於如序列辨識編號：7以及序列辨識編號：8所示的核苷酸序列； (d)當使用該第1組引子對來進行該DNA擴增反應時，該探針具有一選自於如序列辨識編號：7、序列辨識編號：9、序列辨識編號：10以及序列辨識編號：13所示的核苷酸序列；以及(e)當使用該第2組引子對來進行該DNA擴增反應時，該探針具有一選自於如序列辨識編號：7以及序列辨識編號：10所示的核苷酸序列。
13. 如申請專利範圍第11項的方法，其中該雜交反應是在一選自於由下列所構成的群組中的生物晶片上被進行：基因晶片、微流體晶片以及晶片實驗室。
14. 一種用於檢測一樣品中是否存在有一腸道沙門桿菌的方法，其包括：令該樣品進行一種使用一探針試劑的雜交反應，其中該探針試劑包含有一用於檢測維爾肖氏沙門桿菌的探針，其具有一選自於如序列辨識編號：9、序列辨識編號：10以及序列辨識編號：13所示的核苷酸序列；以及檢測是否有一藉由使用該探針來進行雜交反應而被形成的雜交物，其中該雜交物之存在表示有一對應於該探針的腸道沙門桿菌之存在。
15. 如申請專利範圍第14項的方法，其中該探針試劑進一步包含有下列的至少一者：(a)一用於檢測哈達爾沙門桿菌的探針，其具有一選自於如序列辨識編號：4、序列辨識編號：5以及序列辨識編號：11所示的核苷酸序列；以及 (b)一用於檢測嬰兒型沙門桿菌的探針，其具有一選自於如序列辨識編號：6、序列辨識編號：8以及序列辨識編號：12所示的核苷酸序列。
16. 如申請專利範圍第14或15項的方法，其中該樣品是選自於下列所構成的群組：食品樣品、生物樣品以及環境樣品。
17. 如申請專利範圍第16項的方法，其中該樣品是一選自於由下列所構成的群組中的食品樣品：流體乳品、飲料、肉品、海產食品、動物飼料、水、乳製品、蔬菜、水果以及罐頭食品。
18. 如申請專利範圍第14或15項的方法，其中該雜交反應是在一選自於由下列所構成的群組中的生物晶片上被進行：基因晶片、微流體晶片以及晶片實驗室。
19. 如申請專利範圍第15項的方法，其中該至少一個探針具有一選自於如序列辨識編號：11、序列辨識編號：12以及序列辨識編號：13所示的核苷酸序列。
20. 一種用於檢測一腸道沙門桿菌的檢驗套組，其包含有一如申請專利範圍第1或2項的引子試劑和/或一如申請專利範圍第3或4項的探針試劑。
21. 一種用於檢測一腸道沙門桿菌的生物晶片，其包含有一如申請專利範圍第1或2項的引子試劑和/或一如申請專利範圍第3或4項的探針試劑。