TWI572346B - 組織修復及再生之超薄板結構 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種超薄板結構,尤指一種適用於修復組織及協助組織再生之超薄板結構。
組織工程技術發展日新月異,組織再生、或修復一直為醫療研究發展重點。一般作為組織修復或再生的多孔特性聚合物,通常係用來作為細胞培養的基質,將細胞培養於此多孔聚合物上,或與膠原蛋白基質混合以形成具有組織修復功能的支架。然而,實際上,細胞生長不均以致無法達到運用之標準乃係目前組織工程技術中的常見問題,故無法在生物體中作為良好的醫療材料,使組織工程之效應打折。
以骨修補植入體為例,一般骨修補植入體大致分為兩種型態,分為固態植入體,或注入型植入體,其中,固態植入體係預先量測組織修補大小後,製作其預設之固態植入體,再將其植入所欲修補之組織中;而注入型植入體係透過液態組織修補材料,將其填補於欲修補之組織中,待其凝固,即形成與固態植入體相當之組織修補材料。對於目前固態的骨修補植入體來說,需先於植入體外圍培養骨母細胞,使骨母細胞生長遍佈植入體內、外,再將其植入於所欲修補之骨組織中。然而,細胞生長較慢、細胞生長不均、或細胞無法生長入植入體
中心等問題,係目前固態骨修補植入體所無法突破的瓶頸。美國US6884621B2一案係關於一種多孔薄膜培養組織細胞,其係於0.8mm厚度之單一層含有膠原蛋白之薄膜上培養多層次細胞,然而,於組織工程上,該前案之薄膜厚度過厚,在堆疊操作下,容易降低細胞的生長效率,此外,在單一薄膜上進行多層次細胞之培養亦可能降低細胞生長的品質,因此仍然無法突破上述之技術問題。
儘管目前已有技術將高分子薄膜應用於組織修補或再生之用途,然而仍舊無法克服當薄膜堆疊時,細胞無法繼續正常生長之瓶頸。有鑑於此,改善細胞於組織修補或再生材料之生長係組織工程領域所需克服的問題。
本發明之主要目的係在提供一種組織修復及再生之超薄板結構,透過此超薄板結構之使用,以使受傷之組織達到快速修復及再生之功效。
本發明另一目的係在提供一種組織修復及再生之超薄板結構之製備方法,以形成本發明之組織修復及再生之超薄板結構。
為達成上述目的,本發明係提供一種組織修復及再生之超薄板結構,包含:一或多層具生物相容性及降解性之超薄板,其中,此具生物相容性及降解性之超薄板厚度係介於10-200μm間,較佳係介於75-150μm間,且此具生物相容性及降解性之超薄板係包括:一具生物相容
性及降解性之載體;一細胞生長基質,其中,細胞生長基質係形成於具生物相容性及降解性之載體上;以及一目標細胞,其中,目標細胞係形成於細胞生長基質上。
本發明之組織修復及再生之超薄板結構可為單層超薄板結構或多層超薄板結構。而上述該些生物相容性及降解性之超薄板係可透過層疊(layer-by-layer)之方式形成一多層超薄板結構。而層疊方式係可利用層推式、捲推式、交錯層疊式等方法進行,單就不同欲修復之組織調整適當的層疊方法。
上述本發明中,具生物相容性及降解性之載體材料並無特別限制,較佳係包含至少一選自由:氫氧基磷灰石(HA)、磷酸三鈣(TCP)、乳酸(PLA)、聚丙烯腈(PAN)、聚碸(PSF)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨基甲酸酯(PU)、雙相磷酸鈣(BCP)、及聚吡咯(PPY)所組成之群組。更佳為乳酸(PLA)、雙相磷酸鈣(BCP)、或其組合。其中,BCP等材料可為奈米等級係包含羥基磷灰石(HA)以及磷酸三鈣(TCP),係應用於骨組織修復的重要材料。再則,細胞生長基質係用於提供細胞生長所需之培養成分,較佳係包含至少一選自由:膠原蛋白、重組膠原蛋白(Reconstitute collagen,R-collagen)、電紡絲重組膠原蛋白、透明質酸、海藻酸所組成之群組。更佳係為重組膠原蛋白(Reconstitute collagen,R-collagen)、或電紡絲重組膠原蛋白。重組膠原蛋白係一種透過胃蛋白酶處理再以戊二醛
(glutaraldehyde)進行重組(reconstituted)之膠原蛋白,相較於天然膠原蛋白,其具有誘導組織、細胞再生及修復之能力。另外,於組織修復及再生之多層超薄板結構中,目標細胞並無特別限制,視所欲修復之組織選擇適當的目標細胞,例如:幹細胞、骨肉瘤細胞、或神經細胞等。
本發明組織修復及再生之超薄板結構中,複數之具生物相容性及降解性之超薄板透過層疊方式形成多層超薄板結構。其中,單一具生物相容性及降解性之超薄板係包括生物相容性之載體,此載體為一種多孔結構,而孔洞係可提供細胞生長所需之空間,超薄板之孔洞大小為20至40μm,在其上塗附電紡絲重組膠原蛋白,厚度約為30至60nm,其中超薄板之生物降解率為一到三個月等。由於,本發明之具生物相容性及降解性之超薄板提供了適合細胞生長的環境,因此,即使在數層超薄板堆疊形成多層超薄板結構情況下,各層超薄板之間仍可預留孔洞空間,以供目標細胞生長所需。又,於超薄板上塗附電紡絲重組膠原蛋白之前後,可同時塗附骨生長之細胞素,如TGFb-1,BMP-2,BMP-4,Osteoprotegerin等,以使本發明之超薄板結構適合應用於組織修復及再生之植入體,例如骨組織修復植入體等。以骨修復植入體為例,習知之植入體係由一聚合物,外圍培養目標細胞所形成,理想狀況下,植入體外圍之目標細胞應生長入植入體中心,遍佈植入體內外,以提供所欲修復之骨組織較佳的修復環境。然而,實際上,習知之骨修復植入體
多半為非多孔材質且結構太厚,而無法使外圍目標細胞生長入植入體中心,因此無法達到最佳的骨修復功效。相較於本發明之組織修復及再生之多層超薄板結構,本發明係先將細胞培養於單層具生物相容性及降解性之超薄板上,可視不同需求層疊成不同厚度或裁切成不同形狀,接著再植入所欲修復或再生之組織,如此,可使本發明之超薄板結構達到較佳的組織快速修復及再生功效。
另外,除了上述本發明所提供的組織修復及再生之多層超薄板結構外,本發明更提供一種組織修復及再生之超薄板製備方法,係包括以下步驟:(A)提供至少一具生物相容性及降解性之載體;(B)形成一細胞生長基質於具生物相容性及降解性之載體上;以及(C)培養一目標細胞於細胞生長基質上,以形成一具生物相容性及降解性之超薄板,其中,此具生物相容性及降解性之超薄板厚度較佳係介於10-200μm間,更佳係介於75-150μm間。
根據上述本發明之組織修復及再生之超薄板結構,其除了可形成單層超薄板結構之外,亦可透過層疊方法形成多層超薄板結構。因此,上述本發明之方法更可包括一步驟(D),(D)層疊(layer-by-layer)上述些具生物相容性及降解性之超薄板,以形成一多層超薄板結構,而層疊方式係可利用層推式、捲推式、交錯層疊式等方法進行,單就不同欲修復之組織調整適當的層疊方法。
於上述步驟中,具生物相容性及降解性之載體材料同樣無特別限制,較佳係包含至少一選自由:氫氧基磷灰石(HA)、磷酸三鈣(TCP)、乳酸(PLA)、聚丙烯腈(PAN)、聚碸(PSF)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨基甲酸酯(PU)、雙相磷酸鈣(BCP)、及聚吡咯(PPY)所組成之群組。更佳為乳酸(PLA)、雙相磷酸鈣(BCP)、或其組合。再則,細胞生長基質係用於提供細胞生長所需之培養成分,較佳係包含至少一選自由:膠原蛋白、重組膠原蛋白(Reconstitute collagen,R-collagen)、奈米電紡絲重組膠原蛋白、透明質酸、海藻酸所組成之群組,再佳係為重組膠原蛋白、或奈米電紡絲重組膠原蛋白,更佳係奈米電紡絲重組膠原蛋白。另外,目標細胞並無特別限制,視所欲修復之組織選擇適當的目標細胞,例如:幹細胞、骨肉瘤細胞、或神經細胞等。舉例而言,本發明之修復組織及再生之超薄板結構可包含奈米電紡絲膠原蛋白及骨細胞生長素等。
與傳統同樣形成具有目標細胞之植入體比較,以本發明之方法所形成之組織修復及再生之超薄板結構(相當於一種用於組織修復及再生之植入體),其目標細胞可利用較短的培養時間生長於具生物相容性及降解性之超薄板上;且由於單層超薄板係為具有多孔洞之材質,因此層疊後所形成之多層超薄板結構較不會有細胞凋亡之現象;此外,本發明超薄板結構可透過堆疊之方式形成多層超薄板結構,由於其所覆蓋之細胞生長基質(如:骨細
胞生長激素及重組膠原蛋白)可深入植體,故可使目標細胞具有垂直擴散之生物效應。另外,由於本發明多層超薄板結構之厚度以及形狀可視欲修復之進行適當的調整,因此大幅突破了傳統植入體的限制。
以下係藉由具體實施例說明本發明之實施方式,熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地了解本發明之其他優點與功效。此外,本發明亦可藉由其他不同具體實施例加以施行或應用,在不悖離本發明之精神下進行各種修飾與變更。
實施例1-製備組織修復及再生之超薄板結構
請參考圖1本發明實施例1之組織修復及再生超薄板結構之製備流程示意圖。將配置完成的具生物相容性及降解性之載體溶液1倒入模具2中,以形成凝固的具孔洞之生物相容性及降解性載體3,接著,將生物相容性及降解性之載體3浸泡於細胞生長基質(圖未示)中,使細胞生長基質布滿具生物相容性及降解性之載體3之孔洞中,最後,將目標細胞(圖未示)培養於布滿細胞生長基質之載體3上,以形成具有生物相容性及降解性之超薄板4。使用者可根據不同待修復組織之需求,將具生物相容性及降解性之超薄板4層疊成適當厚度的多層超薄板結構5。
本實施例係以乳酸(PLA)、雙相磷酸鈣(BCP)製作一具生物相容性及降解性之載體。首先,取PLA粒子係於60
℃真空中乾燥24小時,接著,取3g的PLA溶於20ml之DMF溶劑中,於65℃攪拌1小時。接著,加入6g之BCP,再攪拌1小時,以形成PLA、BCP為1:3比例混合之混合液。將混合液倒入模具中等待形成超薄板狀之PLA-BCP載體,接著,將超薄板狀之PLA-BCP載體置入去離子水中,以去除DMF溶劑,並形成本實施例具生物相容性及降解性之PLA-BCP載體,其中,本實施例之PLA-BCP載體厚度為100μm。
接著,以電紡絲技術,將重組膠原蛋白(Reconstituted collagen,R-collagen)薄形且均勻的形成PLA-BCP載體上(即為電紡絲重組膠原蛋白),並將骨細胞生長激素形成於該載體上。於此,本實施例之重組膠原蛋白溶液製法係:取牛的第一型膠原蛋白,以胃蛋白脢(Pepsin)處理並以2-巰基乙醇(β-mercaptoetnanal)還原,形成α-螺旋結構,接著以戊二醛(Glutaraldehyde)重組形成戊二醛聚胺複合物(glutaraldehyde polymer-amine complex),此複合物便為重組膠原蛋白(R-collagen),最後將此溶於5mM醋酸中,而得到本實施例之重組膠原蛋白溶液。
最後,將MG63骨肉瘤細胞培養於上述形成有電紡絲重組膠原蛋白之PLA-BCP載體上,以形成本實施例之具有MG63骨肉瘤細胞培養生物相容性及降解性之超薄板。
其中,於PLA-BCP載體部份,圖2至圖5係不同倍率下之SEM結果圖。圖2係本發明實施例1之PLA-BCP載體放大倍率100倍,加速電壓5kVSEM結果圖;圖3係本發明實
施例1之PLA-BCP載體放大倍率500倍,加速電壓5kVSEM結果圖;圖4係本發明實施例1之PLA-BCP載體放大倍率1000倍,加速電壓5kVSEM結果圖;圖5係本發明實施例1之PLA-BCP載體放大倍率100倍,加速電壓10kVSEM結果圖。由以上SEM結果可明顯發現,PLA-BCP載體係為多孔結構,而其孔洞可提供MG63骨肉瘤細胞培養於PLA-BCP載體層疊情況下,仍具有足夠的生長空間。
另外,以四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測MG63骨肉瘤細胞培養於PLA-BCP載體上之存活率。首先,將實驗分成六組,其中,第一組係將MG63骨肉瘤細胞培養於PLA載體;第二組係將MG63骨肉瘤細胞培養培養於BCP載體;第三組係將MG63骨肉瘤細胞培養培養於PLA-BCP載體;第四組係將MG63骨肉瘤細胞培養培養於形成有電紡絲重組膠原蛋白之PLA載體;第五組係將MG63骨肉瘤細胞培養於形成有電紡絲重組膠原蛋白之BCP載體;而第六組係將MG63骨肉瘤細胞培養於形成有電紡絲重組膠原蛋白之PLA-BCP載體。由圖6本發明實施例1之MTT比色法結果圖,於第一至三組中,細胞於未形成電紡絲重組膠原蛋白之載體上,存活率明顯不佳。比較第一組及第四組、第二組以及第五組,其結果可明顯發現,以電紡絲重組膠原蛋白作為細胞生長基質,其細胞存活率明顯改善。於第四至六組中,形成有電紡絲重組膠原蛋白之PLA-BCP載體,其細胞存活率更為明顯偏高。更且,
比較第一至六組,可明顯發現形成有電紡絲重組膠原蛋白之PLA-BCP載體更適合細胞生長。
由此證實,細胞可快速生長於形成有電紡絲重組膠原蛋白之PLA-BCP載體,且存活率明顯偏高。再則,由以上之細胞存活率結果更可證實,本實施例PLA-BCP載體之多孔結構,在配合電紡絲重組膠原蛋白之細胞生長基質情況下,提供了細胞優良的生長環境。本實施例之具生物相容性及降解性之超薄板,可依照不同欲修復或再生之組織情況,層疊成適當厚度並裁切成適當大小的多層膜結構,透過製作不同形狀,如圓柱狀、椎狀、層狀、板狀等等,以形成用來修復組織或協助組織再生之植入體。
上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已,本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準,而非僅限於上述實施例。
1‧‧‧具生物相容性之載體溶液
2‧‧‧模具
3‧‧‧具生物相容性及降解性之載體
4‧‧‧具生物相容性及降解性之超薄板
5‧‧‧多層超薄板結構
圖1本發明實施例1之組織修復及再生膜結構之製備流程示意圖。
圖2係本發明實施例1之PLA-BCP載體放大倍率100倍,加速電壓5kVSEM結果圖。
圖3係本發明實施例1之PLA-BCP載體放大倍率500倍,加速電壓5kVSEM結果圖。
圖4係本發明實施例1之PLA-BCP載體放大倍率1000倍,加速電壓5kVSEM結果圖。
圖5係本發明實施例1之PLA-BCP載體放大倍率100倍,加速電壓10kVSEM結果圖。
圖6本發明實施例1之MTT比色法結果圖。
1‧‧‧具生物相容性之載體溶液
2‧‧‧模具
3‧‧‧具生物相容性及降解性之載體
4‧‧‧具生物相容性及降解性之超薄板
5‧‧‧多層超薄板結構
Claims (10)
- 一種組織修復及再生之超薄板結構,包含:一或多層具生物相容性及降解性之超薄板,其中,該具生物相容性及降解性之超薄板厚度係介於10-200μm間,且該具生物相容性及降解性之超薄板係包括:一具生物相容性及降解性之載體,其中,該具生物相容性及降解性之載體材料係包含至少一選自由:氫氧基磷灰石(HA)、磷酸三鈣(TCP)、乳酸(PLA)、聚丙烯腈(PAN)、聚碸(PSF)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨基甲酸酯(PU)、雙相磷酸鈣(BCP)、及聚吡咯(PPY)所組成之群組;一細胞生長基質,係形成於該具生物相容性及降解性之載體上,且該細胞生長基質係包含至少一選自由:膠原蛋白、重組膠原蛋白(Reconstitute collagen,R-collagen)、電紡絲重組膠原蛋白、透明質酸、海藻酸所組成之群組;以及一目標細胞,係形成於該細胞生長基質上;其中,該雙相磷酸鈣(BCP)等材料係為奈米等級係包含羥基磷灰石(HA)以及磷酸三鈣(TCP)。
- 如申請專利範圍第1項所述之組織修復及再生之超薄板結構,其中,該具生物相容性及降解性之超薄板厚度係介於75-150μm間。
- 如申請專利範圍第1項所述之組織修復及再生之超薄板結構,其中,該些具生物相容性及降解性之超薄 板係透過層疊(layer-by-layer)之方式形成一多層超薄板結構。
- 如申請專利範圍第1項所述之組織修復及再生之超薄板結構,其中,該細胞生長基質係為重組膠原蛋白(Reconstitute collagen,R-collagen)、或電紡絲重組膠原蛋白。
- 如申請專利範圍第1項所述之組織修復及再生之超薄板結構,其中,該目標細胞係為幹細胞、骨肉瘤細胞。
- 一種組織修復及再生之超薄板製備方法,係包括:(A)提供至少一具生物相容性及降解性之載體,其中,該具生物相容性及降解性之載體材料係包含至少一選自由:氫氧基磷灰石(HA)、磷酸三鈣(TCP)、乳酸(PLA)、聚丙烯腈(PAN)、聚碸(PSF)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨基甲酸酯(PU)、雙相磷酸鈣(BCP)、及聚吡咯(PPY)所組成之群組;(B)形成一細胞生長基質於該具生物相容性及降解性之載體上,其中,該細胞生長基質係包含至少一選自由:膠原蛋白、重組膠原蛋白(Reconstitute collagen,R-collagen)、電紡絲重組膠原蛋白、透明質酸、海藻酸所組成之群組;以及 (C)培養一目標細胞於該細胞生長基質上,以形成一具生物相容性及降解性之超薄板,其中,該具生物相容性及降解性之超薄板厚度係介於10-200μm間;其中,該雙相磷酸鈣(BCP)等材料係為奈米等級係包含羥基磷灰石(HA)以及磷酸三鈣(TCP)。
- 如申請專利範圍第6項所述之製備方法,其中,該具生物相容性及降解性之超薄板厚度係介於75-150μm間。
- 如申請專利範圍第6項所述之製備方法,其中更包含一步驟(D):(D)層疊(layer-by-layer)該些具生物相容性及降解性之超薄板,以形成一多層超薄板結構。
- 如申請專利範圍第6項所述之製備方法,其中,該細胞生長基質係為重組膠原蛋白(Reconstitute collagen,R-collagen)、或電紡絲重組膠原蛋白。
- 如申請專利範圍第6項所述之製備方法,其中,該目標細胞係為幹細胞、骨肉瘤細胞。
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