TWI570411B - 用於腫瘤診斷及治療之多炔糖苷衍生物的標靶ｐｄｉａ４ - Google Patents

用於腫瘤診斷及治療之多炔糖苷衍生物的標靶ｐｄｉａ４ Download PDF

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Description

用於腫瘤診斷及治療之多炔糖苷衍生物的標靶PDIA4
本發明係關於Pdia4參與細胞生長和細胞增生，及診斷與Pdia4的存在及/或數量有關聯之癌症的方法。
聚炔烴(polyynes)是一組具有兩個或更多碳三鍵的有機化合物。迄今為止，已有超過1000種聚炔烴由植物、真菌、細菌及珊瑚分離出(ShiShun,A. L.,et al.(2006) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 45(7),1034-1057)。聚炔烴類化合物具有多種生物活性。其中許多已被證明具有廣泛的藥用和生物特性，例如抗腫瘤，抗發炎，抗血管新生，抗糖尿病，抗微生物，抗病毒，抗原蟲(anti-protozan)，和光毒性(Shi Shun,A. L.,et al.(2006) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 45(7),1034-1057;Dembitsky,V. M.(2006) Lipids 41(10),883-924)。超過300種聚炔烴已報告顯示對多種腫瘤細胞具有細胞毒性(Dembitsky,V. M.(2006) Lipids 41(10),883-924)。然而，其抗腫瘤機制研究甚少。
鬼針草(Bidens pilosa)的兩種直鏈聚炔烴：聚多炔糖苷(cytopiloyne,CP)及其配糖體(aglycone,CPA)會抑制T細胞增生且誘導臍靜脈內皮細胞的細胞凋亡。聚多炔糖苷和配糖體屬於聚炔烴的次類，其為四個共軛三鍵的直鏈結構(Wu,L. W.,et al.(2004) Pharm. Res. 21(11),2112-2119;Chiang,Y. M.,et al.(2007) J. Ethnopharmacol. 110(3),532-538)。從鬼針草植物來的這兩種化合物，初步確定對於白血病和肝癌具有細胞毒性(Sundararajan,P.,et al.(2006) Afr. Health Sci. 6(1),27-30;Chang,J. S.,et al.(2001) Am. J. Ch. Med. 29(2),303-312)。聚多炔糖苷抑制T細胞增生(Chang,C. L.,et al.(2007) J. Immunol. 178(11),6984-6993)，且配糖體藉由破壞細胞週期而促進內皮細胞的凋亡，進而使血管新生凋亡(Wu,L. W.,et al.(2004) Pharm. Res. 21(11),2112-2119;Wu,L. W.,et al.(2007) Planta Med. 73(7),655-661)。但是，對於聚多炔糖苷衍生物的抗腫瘤作用及機制暸解甚少。
蛋白質雙硫鍵異構酶(Protein disulfide isomerases,PDIs)家族是一個酵素家族能夠催化新生蛋白質的雙硫鍵之氧化還原反應。它們也具有伴隨蛋白(chaperone)活性，幫助蛋白質摺疊，而大多數蛋白質雙硫鍵異構酶家族位於內質網內，但是部份的家族成員也在其他細胞的隔間被發現。蛋白質雙硫鍵異構酶家族在哺乳動物的發育過程和疾病中扮演的重要的角色(Ni.M.,et al.(2007) FEBS letters 581(19),3641-3651)。它們參與內質網的功能，例如蛋白生成與摺疊時雙硫鍵的形成與交換。除了透過蛋白質摺疊外，它們也有與內質網的無關功能係藉由維持特定蛋白質的構形，例如，病原體感染(Ou,W.,et al.(2006) Virology 350(2),406-417;Naguleswaran,A.,et al.(2005) Int. j. Parasitol. 35(13),1459-1472)、受精(Ellerman,D. A.,et al.(2006) Developmental cell 10(6),831-837),凝聚(Manukyan,D.,et al.(2008) Thrombosis research 122 Suppl 1,S19-22)、免疫(Garbi,N.,et al.(2006) Nat Immunol 7(1),93-102),腫瘤轉移(Goplen,D.,et al.(2006) Cancer research 66(20),9895-9902)或細胞生長與發育的功能(Li,X. A.,et al.(1991) Molecular and cellular biology 11(7),3446-3453;Severino,A.,et al.(2007) J Am Coll Cardiol 50(11),1029-1037;U.S. Pat. Pub. No. 2003/0152565)。PCT專利第WO2010/004214公開號係關於一種在體外診斷大腸癌的方法，利用至少一個對抗PDI抗原決定位的抗PDI單株抗體，確定蛋白質雙硫鍵異構酶(PDI)腫瘤標記的存在。一些PDI可出現在細胞質的內質網和細胞隔間(細胞表面、細胞核等)。它們的分佈位置與它們在內質網或非內質網的功能有關(Turano,C.,et al.(2002) Journal of cellular physiology 193(2),154-163)。雙硫鍵異構酶家族的成員眾多，研究不易，更不用說它們在調節細胞生長的機制。酵母菌的突變實驗顯示蛋白質雙硫鍵異構酶家族對酵母菌的生存能力是必要的(Farquhar,R.,et al.(1991) Gene 108(1),81-89)，而這5個酵母菌雙硫鍵異構酶的功能是無法互相交換的(Norgaard,P.,et al.(2001) J. Cell Biol. 152(3),553-562)。同樣地，蛋白質雙硫鍵異構酶家族抑制劑：桿菌素(bacitricin)可以引發腫瘤細胞的死亡(Lovat,P. E.,et al.(2008) Cancer Res. 68(13),5363-5369)。不過，Pdia3的基因剔除會導致老鼠的胚胎發育終止(Garbi,N.,et al.(2006) Nat Immunol 7(1),93-102)，這建議部分蛋白質雙硫鍵異構酶家族功能是獨特的。
在哺乳動物中，蛋白質雙硫鍵異構酶家族有9個成員在人類中含有1到3個CGHC的酵素活化中心。蛋白質雙硫鍵異構酶家族可能有不同的氧化還原的能力，可以幫助不同的新生蛋白質之摺疊(Maattanen,P.,et al.(2006) Biochem Cell Biol 84(6),881-889)，也就是具有蛋白的基質特異性。在這9個成員中，Pdia4是唯一一個有3個CGHC的蛋白質雙硫鍵異構酶(Maattanen,P.,et al.(2006) Biochem Cell Biol 84(6),881-889)。Pdia4位在內質網中，參與未摺疊蛋白反應，且具有與鈣結合之活性。在轉移肝癌細胞中，Pdia4的表達量會升高。此外，當DG44細胞以增加內質網壓力的離子載體(ionophore)處理時，也會增加它的表達量。然而，Pdia4的生物功能很少被研究。Pdia4基因的啟動子含有內質網壓力增強子，會受內質網壓力所誘導(Parker,R.,et al.(2001) Molecular and cellular biology 21(9),3220-3233;Li,X. A.,et al.(1991) Molecular and cellular biology 11(7),3446-3453)。Pdia4也會與其它內質網蛋白質，例如Hspa5、Hsp90β1、Pdi、Calr和Cabp1等，黏在新生蛋白質上，幫助新生成蛋白質的摺疊(Kuznetsov,G.,Chen,L. B.,and Nigam,S. K.(1994) The Journal of biological chemistry 269(37),22990-22995;Feng,W.,et al.(1995) The Journal of biological chemistry 270(20),11851-11859;Vandenbroeck,K.,et al.(2006) Cytokine 33(5),264-273)。Pdia4可與Hsp90β1或Hspa5形成複合體。CHO細胞中內質網壓力增強子的放大，會導致內質網蛋白質Pdia4、Hspa5和Hsp90β1的減少與細胞生長和生存能力下降(Li,X. A.,et al.(1991) Molecular and cellular biology 11(7),3446-3453)。儘管Pdia4可能與細胞生長和生存能力相關，然而Pdia4在細胞生長和生存能力所扮演的角色並不清楚。
急性淋巴細胞性白血病(Acute lymphocytic leukemia,ALL)是最常見的兒童癌症。在美國它的發病率是每年有每10萬男性和女性有1.6人。急性淋巴細胞性白血病約有15%的病例為T細胞急性淋巴細胞性白血病(T cell acute lymphocytic leukemia,T-ALL)，這種疾病是由T細胞惡性轉化所引起(Grabher,C.,et al.(2006) Nat. Rev. Cancer 6(5),347-359)。T-ALL的發病機制是與致癌基因或腫瘤抑癌基因的基因變異或異常表達有關。雖然T-ALL的治療效果為有很大的進展，然而對於T-ALL仍是需要新穎先導化合物。從T細胞急性淋巴細胞白血病的病患取得建立的Jurkat細胞，是T-ALL的一種生理腫瘤模型(Gillis,S.,et al.(1980)J.Exp.Med. 152(6),1709-1719)。
在化學生物學領域，小分子化合物可作為檢測生物機制及影響的工具(Spring,D.R.(2005)Chem.Soc.Rev. 34(6),472-482)。化合物標靶的辨識為化學生物研究最關鍵的步驟，也是最困難的任務。此辨識可協助發展新穎的成藥(druggable)基因，了解其信息傳遞並瞭解化合物的作用(Burdine,L.,et al.(2004)Chem.Biol. 11(5),593-597)。在本發明中，我們首先評估CP和CPA對Jurkat細胞(白血病T細胞株)生長的效果。接著，我們確定前述聚炔烴的分子標靶並描述標靶和聚炔烴之間的相互作用。最後，在體外及體內研究Jurkat細胞生長中標靶基因的功能。
因此，判斷CP和CPA在體內的分子標靶，以及用於篩選方法和研究工具之聚炔烴的可能機制，為本發明所屬技術領域所迫切需求。
本發明揭露的實施例包括一種診斷癌症的方法，該方法包含：(a)對一個體之一生物性樣本執行一分析，以測定Pdia4的存在及/或數量；以及(b)若由測定的結果顯示與癌症相關之Pdia4的存在及/或數量，則判斷該個體具有癌症。
本發明其他實施例則揭露包括一種鑑定腫瘤對於Pdia4拮抗劑治療有反應可能性的方法，包含：a)給予一Pdia4拮抗劑至具有一腫瘤之一個體；以及b)在給予該Pdia4拮抗劑後的一段時間內，監測該腫瘤中微血管成熟之一標記；其中給予Pdia4拮抗劑而有該腫瘤微血管密度減少的反應，表示該腫瘤對於隨後的Pdia4拮抗劑有反應；前述方法也可包含給予一Pdia4拮抗劑至一個體。
在一些實施例中，該方法進一步包含給予一個或多個第二化學治療劑至該個體管理一個或多個第二化療藥物的問題。在另外的實施例中，該第二化學治療劑相同於該Pdia4拮抗劑。在其他實施例中，該第二化學治療劑不同於該Pdia4拮抗劑。
在一些實施例中，Pdia4拮抗劑抑制Pdia4蛋白質的表達。在其他實施例中，Pdia4拮抗劑抑制Pdia4的生物活性。在還有一些實施例中，Pdia4拮抗劑使Pdia4基因或其啟動子不活化。在一些實施例中，Pdia4拮抗劑是選自由一反義分子(antisense molecule)、一三螺旋分子、一核醣酶(ribozyme)和一siRNA所組成的群組。在一些實施例中，siRNA包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：3。在一些實施例中，Pdia4拮抗劑是選自由一Pdia4的抗體、聚炔烴(polyynes)和桿菌素(bacitricin)所組成的群組。在一些實施例中，Pdia4拮抗劑是紫杉烷(taxane)和艾黴素(doxorubicin)的一結合物。該紫杉烷可以為紫杉醇(paclitaxel)或朵西紫杉酚(docetaxel)。
在一些實施例中，該方法進一步包含給予放射治療至該個體。在一些實施例中，該第二化學治療劑是選自由伊妥普賽(etoposide)、CPT-I1及替莫唑胺(temozolomide,TMZ)所組成的群組。在其他實施例中，該第二化學治療劑係選自由CPT-I1、替莫唑胺(temozolomide,TMZ)、博萊黴素(bleomycin)、卡鉑(carboplatin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、順鉑(cisplatin)、秋水仙素(colchicine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、柔紅黴素(daunorubicin)、放線菌素(dactinomycin)、乙烯雌酚艾黴素(diethylstilbestrol doxorubicin)、伊妥普賽(etoposide)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、氟嘧啶(floxuridine)、馬法蘭(melphalan)、胺甲基葉酸(methotrexate)、絲裂黴素(mitomycin)、6-硫醇嘌呤(6-mercaptopurine)、坦尼坡賽(teniposide)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)、長春新鹼(vincristine)及長春鹼(vinblastine)所組成的群組。
在一些實施例中，癌症是一神經膠質母細胞瘤。在一些實施例中，Pdia4拮抗劑不是血纖維蛋白溶酶原-5(kringle 5)、或kringle 5的衍生物。
在某些實施例中，Pdia4拮抗劑抑制Pdia4蛋白質的表達。該Pdia4拮抗劑能抑制Pdia4的生物活性，或使Pdia4基因或其啟動子不活化。在一些實施例中，Pdia4拮抗劑是選自由一反義分子(antisense molecule)、一三螺旋分子、一核醣酶(ribozyme)和一siRNA所組成的群組。
本發明揭露診斷癌症的方法，該癌症與生物性樣本中Pdia4的存在及/或數量有關。測定出兩種直鏈聚炔烴：聚多炔糖苷(cytopiloyne,CP)及其配糖體(aglycone,CPA)經由增生及/或促進細胞死亡，而抑制Jurkat細胞(T細胞)生長；以及一種蛋白質雙硫鍵異構酶Pdia4，是CP衍生物的主要標靶。同樣也測定出在腫瘤細胞，例如白血病、乳癌細胞和腎纖維細胞瘤，Pdia4的表達量會升高；並確定Pdia4藉由調控細胞增生及凋亡而促進腫瘤細胞的生長，由白血病Jurkat細胞可資證明。因此，樣本中Pdia4的存在及/或數量可為癌症的表示。此些發現可用於發展診斷癌症的方法。
定義
本發明中所使用“癌症”一詞，是指動物細胞有能力自主生長。此些細胞的例子包括細胞具有不正常狀態的細胞或快速增殖的細胞生長。該詞是指包括細胞不當增生(cancerous growths)，如腫瘤、致癌基因的進程、移轉組織和惡性轉型細胞、組織或器官，不分病理型態或侵襲的階段。此外，還包括各種器官系統的惡性腫瘤，如呼吸道、心血管、腎臟、生殖、血液系統、神經系統、肝臟、胃腸、內分泌系統、以及腺癌，其中包括惡性腫瘤，如大多數的結腸癌、腎細胞癌、前列腺癌及/或睪丸腫瘤、非小細胞肺癌、小腸癌、及食道癌。
在某些實施例中，癌症可以是白血病，例如，癌症可為急性白血病，包括但不限於急性淋巴性細胞白血病(ALL)，急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)和急性單核細胞白血病。在其他實施例中，癌症可以是乳腺癌。在其他一些實施例中，癌症可以是腎纖維細胞瘤。
在某些實施例中，癌症(cancer)可能是惡性上皮細胞腫瘤(carcinoma)。“惡性上皮細胞腫瘤”一詞是所屬技術領域中所認知，其是指上皮或內分泌組織的惡性腫瘤。該詞包括惡性肉瘤(carcinosarcomas)，其中包括癌組織及肉瘤狀組織的惡性腫瘤。本發明癌症包括但不限於食道癌、肝癌、基底細胞癌、鱗狀細胞癌(各種組織)、膀胱癌、包括過渡細胞癌、支氣管癌、結腸癌、大腸癌、胃癌、肺癌包括小細胞肺癌和非小細胞肺癌、腎上腺皮質癌、甲狀腺癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腺癌、汗腺細胞癌、皮脂腺癌、乳突癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓質癌、腎細胞癌、腺管原位癌或膽道癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、威姆氏腫瘤(Wilm's tumor)、子宮頸癌、子宮內膜癌、睪丸癌、骨肉瘤、上皮細胞癌或鼻咽癌等。
在其他實施例中，癌症可以是肉瘤。肉瘤的例子包括但不限於纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、骨性肉瘤(osteogenic sarcoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)、血管肉瘤、內皮肉瘤(endotheliosarcoma)、淋巴管肉瘤(lymphangiosarcoma)、淋巴管內皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、滑液膜瘤(synovioma)、間皮瘤(mesothelioma)、伊文氏腫瘤(Ewing's sarcoma)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤和其他軟組織肉瘤。
還有一些實施例中，癌症可能是腫瘤，如固態腫瘤(solid tumor)。固態腫瘤的例子包括但不限於神經膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、星形細胞瘤、神經管胚細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果腺瘤(pinealoma)、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡樹突神經膠細胞瘤(oligodendroglioma)、腦膜瘤(menangioma)、黑色素瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤和視網膜母細胞瘤。
白血病的例子包括但不限於慢性骨髓增生徵候群、急性骨髓細胞性白血病、慢性淋巴細胞白血病包括B細胞慢性淋巴球性白血病(B-cell CLL)、T細胞前淋巴球白血病(T-cell CLL prolymphocytic leukemia)、髮樣細胞白血病和急性淋巴細胞白血病。
在另一些實施例中，癌症是可以淋巴瘤。淋巴瘤的例子包括但不限於B細胞淋巴瘤，例如伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)，霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)等。
本發明中所使用“拮抗劑”一詞，是以最廣泛的意義且指任何分子或化合物，其能部分或完全阻止、抑制或中和由Pdia4媒介的生物活性，例如防止或降低Pdia4的活性或Pdia4的酵素活性(如蛋白質雙硫鍵異構酶活動)。“Pdia4拮抗劑”一詞還包括任何分子，模仿Pdia4媒介的生物活性和具體的變化，較佳是消除或降低Pdia4的功能或表達，防止或降低Pdia4與其結合夥伴(例如CP和CPA)或受質的結合，或消除或降低異構酶活性的效能。在一些實施例中，活性的抑制至少是5%，例如，至少有下列任一：5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%或更高的抑制作用，包括上述任何範圍任何先前的數值及定義任何二個先前數值之間的任何範圍。拮抗劑可以包括但不限於有機和無機小分子、核酸、胜肽、胜肽類似物和中和抗體。
本發明中所使用“化學治療劑”一詞，是指任何治療劑，其可用於治療或改善細胞增生症，如腫瘤或癌症。化學治療劑的例子包括但不限於抗腫瘤劑、烷化劑、植物生物鹼、抗菌劑、磺胺、抗病毒劑、鉑劑、和所屬技術領域中其他知名的抗癌藥物。本發明化學治療劑的具體例子，包括但不限於順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、布沙分(busulphan)、胺甲基葉酸(methotrexate)、柔紅黴素、艾黴素、環磷醯胺、馬法蘭(melphalan)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、紫杉醇(paclitaxel)或朵西紫杉酚(docetaxel)及其他習知藥物(參見例如Goodman & Gilman's,The Pharmacological Basis of Therapeutics(9th Ed)(Goodman,et al.,eds.)(McGraw-Hill)(1996);and 1999 Physician's Desk Reference(1998))。在一些實施例，化學治療劑可為CPT-I1、替莫唑胺(temozolomide,TMZ)、博萊黴素(bleomycin)、卡鉑(carboplatin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、順鉑(cisplatin)、秋水仙素(colchicine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、柔紅黴素(daunorubicin)、放線菌素(dactinomycin)、乙烯雌酚艾黴素(diethylstilbestrol doxorubicin)、伊妥普賽(etoposide)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、氟嘧啶(floxuridine)、馬法蘭(melphalan)、胺甲基葉酸(methotrexate)、絲裂黴素(mitomycin)、6-硫醇嘌呤(6-mercaptopurine)、坦尼坡賽(teniposide)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)及其組合。
本發明中所使用“啟動子”一詞，是指通常位於編碼區域上游的未編碼DNA序列，其包含RNA聚合酶II的結合位點，並能啟動DNA的轉錄。啟動子區域也包括其他反應子，可作為基因表現的調控子。
本發明中所使用“表達”一詞，是指細胞中內源性基因、轉基因(transgene)或編碼區域的轉錄及/或轉譯。在反義結構中，表達可只涉及反義DNA的轉錄。
本發明中所使用“抗體”一詞，是以最廣泛的意義且只要他們表現出理想的生物活性，特別包括人類、非人類(如鼠)、人化抗體(humanized antibodies)，包括但不限於全長單株抗體、多株抗體、多特定結合抗體和抗體片段、包括內體(intrabodies)。一般情況下，一種抗體會表現出結合到一個特定抗原的特異性。“抗體”一詞是指包括完整的免疫球蛋白或抗體分子以及碎片段，例如Fa,F(ab')2、和Fv，其具有結合一抗原決定因子(antigenic determinant)的能力。
本發明中所使用“生物特性(biological property)”或”生物活性”一詞，是指一種由蛋白質引起的生物功能，例如Pdia4或其他本文揭露的化合物。例如，Pdia4的生物特性包括但不限於，調節細胞生長、細胞增生和細胞週期、促進腫瘤細胞生長(例如，藉由調節增生和細胞凋亡)和調節細胞的死亡。關於Pdia4拮抗劑(或Pdia4抑制劑)的生物活性，特別是指完全或部分消除、排除、降低、或減少Pdia4的生物特性。較佳Pdia4拮抗劑的生物活性，包括但不限於治療、減輕、預防癌症。
本發明中所使用“治療”一詞，是指是指對病人給予或應用一治療劑，或對病人的分離組織或細胞株給予或應用一治療劑，該病人具有疾病、疾病徵候群或罹病傾向，其目的為治癒、癒合、減輕、緩解、改變、糾正、改善、提高或影響疾病、疾病徵候群或罹病傾向。
本發明中所使用“個體”一詞，是指哺乳動物，例如人類、或一實驗模式或動物模式或疾病模式。該個體也可以是非人類的動物，如馬，牛，羊或其他家畜。
Pdia4
本文揭露的蛋白質雙硫鍵異構酶(PDIs)家族是參與調控腫瘤生長及/或轉移。例如，在浸潤性腫瘤細胞內PDI被過度表達(Goplen,D.,et al.(2006) Cancer research 66(20),9895-9902)。以桿菌素(bacitricin)抑制PDI會引起腫瘤死亡(Lovat,P. E.,et al.(2008) Cancer research 68(13),5363-5369)。本發明揭露Pdia4在腫瘤的生長/轉移的角色。例如，下文所揭露，Pdia4於多種型態的腫瘤中是向上調節(第4圖)，且CP衍生物藉由抑制Pdia4的雙硫鍵異構酶活性，為Jurkat細胞有效的細胞生長抑制劑(第1圖)。此外，當以CP的衍生物處理時，阻斷(knockdown)Pida4對Jurkat細胞生長也有類似的效果(第4圖)。另外，受尊重的出版物表明，CP抑制T細胞增生(Chang,C. L.,et al.(2007) J. Immunol. 178(11),6984-6993)且CPA誘導臍靜脈內皮細胞的細胞死亡(Wu,L. W.,et al.(2004) Pharm. Res. 21(11),2112-2119;Wu,L. W.,et al.(2007) Planta Med. 73(7),655-661)。
PDI對於細胞生長和生存也是必不可少(Farquhar,R.,et al.(1991) Gene 108(1),81-89)。在哺乳類動物中，有9個PDI成員含有1至3個CGHC的酵素活化中心。PDI家族目前唯一有數據的是，Pdia3的基因剔除會導致老鼠胚胎發育的終止及MHC/胜肽無法組合(Garbi,N.,et al.(2006) Nat Immunol 7(1),93-102)。然而，其他PDI的功能少為人知，如Pdia4。Pdia4有數個獨特的功能，包括是唯一的PDI具有最高數目(三個)CGHC的酵素活化中心、腫瘤和ER壓力的誘導表達、沒有已知的多餘功能和對特定受質的雙硫鍵異構酶/伴隨蛋白的活性。如下所述，Pdia4的不活化或抑制(第1圖，第4圖)抑制細胞生長和增生，並增加細胞死亡。
半胱氨酸做為PDI和其他酵素的活性部位。修飾過的半胱氨酸已被證明會損害PDI的催化活性(Carbone,D. L.,(2005) Chem. Res. Toxicol. 18(8),1324-1331)。CPA/Pdia4加合物(adduct)的MS數據表明，CPA只結合到Pdia4的第二酵素活化中心，此係藉由半胱氨酸殘基共價的方式(第2圖)。此加合物實際上抑制Pdia4的異構酶活性(第2圖)。這些數據是與文獻描述第二CGHC的酵素活化中心突變很大程度上受質結合和Pdia4催化活性的損害一致(Satoh,M.,et al.(2005)Cell Stress Chap. 10(3),211-220)。此外，我們的數據支持CPA容易進入Pdia4之第二CGHC的酵素活化中心的解釋。然而，我們無法檢測到任何CPA在第一和第三CGHC位置。另一個大問題是，在Jurkat細胞中BCP對Pdia4具有優先的親和力結合，卻非對其他PDIs。有幾種可能的原因，其一原因為Pdia4是Jurkat細胞中最豐富的PDIs，第二原因是各PDI可能有其特定的受質(Maattanen,P.,et al.(2006)Biochem Cell Biol 84(6),881-889)，第三原因是各PDI家族被認為無多餘的功能(Norgaard,P.,et al.(2001)J Cell Biol 152(3),553-562)。
Pdia4拮抗劑
如上所述，“拮抗劑”一詞是是以最廣泛的意義且指任何分子或化合物，其能部分或完全阻止、抑制或中和由Pdia4媒介的生物活性，例如防止或降低Pdia4的活性或Pdia4的酵素活性(如蛋白質雙硫鍵異構酶活動)。“Pdia4拮抗劑”一詞還包括任何分子，模仿Pdia4媒介的生物活性和具體的變化，較佳是消除或降低Pdia4的功能或表達，防止或降低Pdia4與其結合夥伴(例如CP和CPA)或受質的結合，或消除或降低異構酶活性的效能。
拮抗Pdia4的方法不限任何方式。在一些實施例中，Pdia4拮抗劑可直接作用於Pdia4，例如與Pdia4結合，以防止或降低Pdia4的活化。在一些實施例中，Pdia4拮抗劑可干擾較佳是消除或減少Pdia4與結合夥伴或受質如Hspa5的交互作用。在一些實施例中，Pdia4拮抗劑可調節Pdia4基因的表達量，例如抑制或減少Pdia4基因轉錄。在一些實施例中，Pdia4拮抗劑可調節Pdia4蛋白質在細胞中的數量，例如抑制或減少Pdia4 mRNA的轉譯，或增加Pdia4 mRNA或Pdia4蛋白質的降解。
Pdia4拮抗劑不限任何類型。Pdia4拮抗劑包括例如小分子、核酸、抗體、胜肽等。在一些實施例中，Pdia4拮抗劑可以是一個結合至Pdia4的小分子。在一些實施例中，Pdia4拮抗劑可以是阻止Pdia4和結合夥伴相互作用的化合物。在一些實施例中，Pdia4拮抗劑是一種阻止Pdia4活化的化合物。在一些實施例中，Pdia4拮抗劑抑制Pdia4蛋白質的表達。在其他實施例中，Pdia4拮抗劑抑制Pdia4的生物活性。一些實施例中，Pdia4拮抗劑使Pdia4基因或其啟動子不活化。在一些實施例中，Pdia4拮抗劑是是選自由一反義分子(antisense molecule)、一三螺旋分子、一核醣酶(ribozyme)和一siRNA所組成的群組。在一些實施例中，Pdia4拮抗劑是一核酸，例如，抗Pdia4小髮夾RNA(shRNA)或Pdia4反義RNA(siRNA)。在一些實施例中，siRNA包含SEQ ID NO：1(CCGGGCUUGU GUUGACCAAA GAGAACUCGA GUUCUCUUUG GUCAACACAA GCUUUUUG)，SEQ ID NO：2(CCGGCCAAGA AGUACAAGGG CCAAACUCGA GUUUGGCCCU UGUACUUCUU GGUUUUUG)，或SEQ ID NO：3(CCGGGCAAGG UGUCAAACGA UGCUACUCGA GUAGCAUCGU UUGACACCUU GCUUUUUG)。在一些實施例中，體內的siRNA是從一編碼DNA序列的質體產生，其具有相對應的siRNA序列。在一些實施例中，相對應的DNA序列可以為SEQ ID NO：4(CCGGGCTTGT GTTGACCAAA GAGAACTCGAGTTCTCTTTGGTCAACACAAGCTTTTTG，對應於SEQ ID NO：1)，SEQ ID NO：5(CCGGCCAAGA AGTACAAGGG CCAAACTCGAGTTTGGCCCTTGTACTTCTTGGTTTTTG；對應於SEQ ID NO：2)，或SEQ ID NO：6(CCGGGCAAGG TGTCAAACGA TGCTACTCGAGTAGCATCGTTTGACACCTTGCTT TTTG，對應於SEQ ID NO：3)。在一些實施例中，Pdia4拮抗劑是選自由一Pdia4的抗體、聚炔烴(polyynes)和桿菌素(bacitricin)所組成的群組。在一些實施例中，Pdia4拮抗劑是紫杉烷(taxane)和艾黴素(doxorubicin)的一結合物。該紫杉烷是紫杉醇(paclitaxel)或朵西紫杉酚(docetaxel)。
可以阻止Pdia4活化的抗體也適用於本發明揭露的方法。例如，可以結合至Pdia4且防止Pdia4與其結合夥伴及/或其受質相互作用的抗體。在一些實施例中，為可結合至Pdia4的一個或多個結合夥伴及/或受質的抗體。該抗體無任何限制，但較佳是單株抗體，更佳為人類或人化單株抗體。Pdia4抗體可用習知的製備方法製備，並可使用本文介紹的方法辨識抑制性抗體。
預測醫學
本發明的某些層面涉及到預測醫學領域中預後(預測)目的之診斷分析、預測分析和監控臨床試驗，藉此達到治療病患的目的。
本發明的方法可用於產前或測定一個體的後代是否有疾病的風險。
診斷和預後分析
在生物性樣本中，Pdia4蛋白質或核酸的存在、數量、或缺少進行評估，係藉由從一待測個體中取得一生物性樣本，且使該生物性樣本與一化合物或一試劑接觸，能檢測出Pdia4的蛋白質或編碼Pdia4蛋白質之核酸(如，mRNA，基因組DNA)，而檢測出生物樣品中Pdia4蛋白質或核酸的存在。“生物性樣本”一詞，包括由一個體分離出的組織、細胞和生物性液體，或仍出現於個體內的組織、細胞和生物性液體。生物性樣本的一個例子是血清。該Pdia4基因的表達量可以用多種方式測量，包括但不限於：測量Pdia4基因編碼的mRNA、測量Pdia4基因編碼蛋白質的量、或測量Pdia4基因編碼蛋白質的活性。
相對應於細胞內Pdia4基因的mRNA表達量，可藉由確定原位和體外形式測定。
分離出的mRNA可用於雜交或放大實驗，包括但不限於南方或北方分析，聚合酶鏈鎖反應分析及探針陣列。用於檢測mRNA表達量之較佳診斷方法，係關於使分離出的mRNA與一核酸分子(探針)接觸，該探針可與該基因編碼出的mRNA雜交而被偵測。核酸探針可以為例如全長Pdia4核酸，或其部份核酸。
在一方式中，mRNA(或cDNA)是固定在一個表面，並與探針接觸，例如藉由在洋菜凝膠中跑分離出的mRNA並把mRNA從凝膠轉移至薄膜，如硝化纖維。在另一種方式中，探頭固定在一個表面，而使mRNA(或cDNA)與探針接觸，例如一個二維基因晶片陣列。熟習技藝人士可以調整已知的mRNA檢測方法以檢測Pdia4基因編碼的mRNA表達量。
樣本中由Pdia4基因編碼的mRNA表達量可藉由核酸放大而評估，例如藉由反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)((Mullis(1987) U.S. Pat. No. 4,683,202)、連接酶鏈反應(Barany(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193)、自我延續序列的複製(Guatelli et al.,(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)、轉錄放大系統(Kwoh et al.,(1989),Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177)、Q-β複製酶(Lizardi et al.,(1988) Bio/Technology 6:1197)、滾環複製(Lizardi et al.,U.S. Pat. No. 5,854,033)或任何其他核酸放大方法，隨後放大分子的檢測是利用所屬技術領域中已知的技術。本文中所使用的放大引子被定義為一對核酸分子可黏著一基因的5'區域或3'區域(分別為+和-股、或反之亦然)，並包含5'區域和3'區域之間一個短區域。一般來說，擴大引子長度是約從10至30個核苷酸，側翼區域長度約50至200個核苷酸。在適當的條件和適當的試劑，放大的核酸分子包含核苷酸序列兩側的引子。
對於原位方法，一細胞或一組織樣本可被製備/處理且固定於一支撐體上，通常是一玻片，接著與探針接觸，可藉由該探針與Pdia4基因編碼的mRNA雜交而進行分析。
在另一個實施例中，本方法進一步包含使一控制組樣本接觸一化合物或試劑，以檢測Pdia4 mRNA或基因組DNA，並與試驗組樣本比較Pdia4 mRNA或基因組DNA的存在。
有多種方法可以用來判定Pdia4編碼蛋白質的表達量。一般而言，該些方法包含接觸一試劑，其可選擇性地結合至蛋白質，如一樣本中的抗體，以評估樣本中蛋白質的表達量。在較佳實施例中，抗體帶有一可檢測標記。抗體可為多株抗體，或更佳為單株抗體。可以使用一個完整的抗體或其片段(如Fab或F(ab')2)。“標記”一詞，係關於探針或抗體，包含以一可檢測物質藉由耦合(即物理性連接)直接標記至探針或抗體，以及藉由與檢測物質間的反應而間接標記探針或抗體。此處提供可檢測物質的例子。
該檢測方法可用於在體外和體內的生物性樣本中檢測Pdia4蛋白質。在體外Pdia4蛋白質的檢測技術包括免疫酵素測定法(ELISAs)、免疫沉澱分析法(immunoprecipitations)、免疫螢光法、酵素免疫分析(EIA)、放射免疫法(RIA)和西方墨點法。在體內Pdia4蛋白質的檢測技術包括導入一標記的抗Pdia4抗體到一個體內。例如，該抗體可標有一放射性標記，其於個體內的存在和位置可用標準影像技術檢測。
在另一個實施例中，該方法進一步包含使一控制組樣本與一化合物或試劑接觸，以檢測Pdia4蛋白質，並與試驗組樣本比較Pdia4蛋白質的存在。
本發明還包括用於檢測生物性樣本中Pdia4存在的套組。例如，該套組包含能檢測生物性樣本中Pdia4蛋白質或mRNA的一化合物或一試劑及一標準品。該化合物或試劑可封裝在一個合適的容器中。該套組可以進一步包含使用該套組來檢測Pdia4蛋白質或核酸的說明書。
對於以抗體為基礎的套組，該套組可包括：(1)第一抗體(例如，連接到一固態支撐體)其結合至一對應至本發明標記的多胜肽，以及選擇性地(2)第二抗體，另一種抗體可結合至多胜肽或第一抗體，並與一檢測試劑共軛。
對於以寡核苷酸為基礎的套組，該套組可包括：(1)一寡核苷酸，例如一可檢測標記的寡核苷酸，其可與一核酸序列雜交，該核酸序列係編碼一對應於本發明標記的多胜肽，或(2)一對引子，可用於放大對應於本發明標記之一核酸分子。該套組還包括一個緩衝試劑、一保存劑、或一蛋白質穩定劑。該套組還包括偵測檢測試劑的必要組件(如酵素或受質)。該套件還包含一控制組樣本或一系列控制組樣本其可被檢測並與試驗樣本作比較。套組的每個組件可包含在一單獨的容器且多種容器以及說明書可置於一單一封裝內，該說明書解釋使用本套組的結果分析。
本發明的診斷方法可判別個體具有疾病或失調或其發展的風險，該疾病或失調係與Pdia4表達量或活性有關。
在一實施例中，係判定與Pdia4表達量或活性異常相關的疾病或失調，並評估由一個體取得之待測樣本的Pdia4蛋白質或核酸(如mRNA或基因組DNA)，其中該表達程度，例如，Pdia4存在蛋白質或核酸的存在與否，係用於診斷該個體具有與Pdia4表達量或活性異常相關的疾病或失調或其發展的風險。本文所用的“測試樣本”是指由所欲檢測個體取得之生物性樣本，包括生物液體(如血清)、細胞樣本、或組織。
本文描述的預後分析係用來判定一個體是否可以給予一試劑(例如促效劑、拮抗劑、擬胜肽類、蛋白質、胜肽、核酸、小分子或其他候選藥物)以治療與Pdia4表達量或活性異常相關的疾病或失調。
使用Pdia4作為替代標記(Surrogate Marker)
本發明的Pdia4分子也可用作為疾病或疾病狀態的標記、疾病狀態預兆的標記、疾病狀態傾向的標記、藥物活性的標記、或作為一個體藥物基因組學的標記。使用本發明的方法，可以檢測Pdia4分子的存在與否、及/或數量，並且與一個或多個體內生物性狀態相關，例如，本發明的Pdia4分子可以作為一個或多個失調或疾病狀態或導致疾病狀態條件的替代標記。本發明使用“替代標記”是指一個客觀的生化標記，其與一疾病或失調存在與否相關，或與一疾病或失調的病程相關(例如，腫瘤存在與否)。此種標記的存在或數量與疾病是獨立的。因此，此些標記可顯示特定療程在減少疾病狀態或失調上是否有效。替代標記特別用於當一疾病狀態或失調的存在或程度是難以藉由標準方法評估(如早期腫瘤)，或當需要評估疾病病程的潛在風險臨床療效之標記取得前。本技術領域使用替代標記的例子包括：Koomen et al.(2000) J. Mass. Spectrorn. 35: 258-264;and James(1994) AIDS Treatment News Archive 209。
舉例來說，微血管密度(MVD)是一個替代標記，可明確反應腫瘤血管生成，並在多種腫瘤中已作為一潛在的預後標記。磁振造影技術提供一種非侵入性的方法，用於對腫瘤微血管密度和功能之治療效果的動力學評估。磁振造影技術包括動態對比增強(DCE)磁振造影、表面擴散係數(ADC)圖和血氧相依程度(BOLD)功能性MR(fMR)。磁振造影技術已開發出腫瘤微血管和微環境參數之非侵入性的縱向表徵。已證實可利用MRI的4.7T主磁場強度用於以免疫組織化學驗證評估血管瘤內的狀態(Bhattacharya et al.,2004,Clin Cancer Res.,10:8005-8017)。MRI是一種多用途的技術，實驗上和臨床上使用於表現腫瘤微血管的特徵。目前已成功使用MRI評估多種參數，例如血管體積、滲透率、灌注和氧合作用。對比增強MRI是一個非常有用的造影技術，被廣泛應用於臨床前和臨床研究之抗血管和抗血管生成療法的評估。在治療期間和之後的不同時間，藉由4.7T MR連續評估腫瘤能顯著有效於確定腫瘤的血管。此種技術的非侵入性特質與多斷層結合便達到腫瘤和正常組織同時視覺化。
本發明的Pdia4分子也可為有用的藥效動力標記。本發明中所用的“藥效動力標記”是一個客觀的生化標記，特別是與藥物的效果相關。藥效動力標記的存在或數量非與給予藥物的疾病狀態或失調相關；因此，標記的存在或數量便顯示在一個體內藥物的存在或活性。例如，藥效動力標記可顯示藥物在生物組織中的濃度、其中該標記無論是在組織中表達或轉錄或不轉錄，皆與藥物程度有關。通過此種方式，可藉由藥效動力標記監控藥物的分布或吸收。同樣，藥效動力標記的存在或數量可能與藥物的代謝產物之存在或數量有關，使得該藥效動力標記的存在或數量的標記顯示藥物在體內相對的失效率。藥效動力標記特別使用在提高藥物效用檢測的靈敏度，尤其是在低劑量給予藥物時。因為即使少量的藥物，便可充分活化多回合的標記(例如，Pdia4標記)的轉錄或表達，可於數量上放大該標記而使其比起藥物本身容易檢測。此外，由於標記本身的特性可以更容易地被檢測出，例如，本發明的方法使用抗Pdia4抗體於一種免疫為基礎的檢測系統中作為Pdia4蛋白質標記，或Pdia4-專一性放射性標定探針可用於檢測Pdia4 mRNA標記。此外，由於藥物治療超出可直接觀察的範圍，便可使用藥效動力標記為風險預測規劃。在本技術領域中使用藥效動力標記的例子包括：Matsuda et al. U.S. Pat. No. 6,033,862;Hattis et al.(1991) Env. Health Perspect. 90: 229-238;Schentag(1999) Am. J. Health-Syst. Pharm. 56 Suppl. 3: S21-S24;and Nicolau(1999) Am. J. Health-Syst. Pharm. 56 Suppl. 3: S16-S20。
本發明的Pdia4分子也可為有用的藥物基因(pharmacogenomic)標記。本發明所用的“藥物基因標記”是一個客觀的生化標記，其與個體的特定臨床藥物反應或敏感性相關(參見例如McLeod et al.(1999) Eur. J. Cancer 35:1650-1652)。藥物基因標記的存在和數量，與在給藥前預測個體對於特定藥物或類藥物的反應相關。藉由評估一個體內一個或多個藥物基因標記的存在或數量，可以選擇出對該個體最適當的藥物治療，或可預期有較大的成功。例如，一個體內特定腫瘤標記的RNA或蛋白質的存在或數量(例如，Pdia4蛋白質或RNA)，可選擇出對於個體中可能出現的特定腫瘤最適合的藥物或療程。同樣地，Pdia4 DNA特定序列突變的存在與否與其Pdia4藥物反應有關。使用藥物基因標記可達到對於每個個體應用最適當的治療，而不需皆給予療程。
實施例
以下包括實驗和取得成果的實施例係僅供參考，並不能用於限制本發明。
實施例1製備的材料與方法
細胞和試劑
Jurkat E6.1細胞(Weiss,A.,et al.(1984) J. Immunol. 133(1),123-128)，MCF-7細胞，THP-1細胞，HEK 293T細胞皆依據ATCC的說明進行培養。人類CD4+T細胞生長於含10%胎牛血清(FBS及含如同培養Jurkat細胞之營養物質的RPMI 1640培養基(Chang,S. L.,et al.(2007) J. Ethnopharmacol. 112(2),232-236)。Scid/灰褐色小鼠購自Charles River and housed。
WST-1試劑(4-[3-(4-碘苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-5-四唑鎓]-1,3-雙磺酸苯(4-[3-(4-lodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-trtrazolio]-1,3-benzenedisulfonate))、5-溴-2-脫氧尿苷(BrdU)、碘化丙啶(propidine iodide,PI)、硫酸魚精蛋白、嘌呤黴素二氫氯化鹽、β-巰基乙醇、生物素、N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(EDCI)、Et3N、1-羥基苯三唑(HOBt)、乙腈、碳酸氫銨(ammonium bicarbonate)和碘乙醯胺均購自Sigma-Aldrich公司(St. Louis,MO,USA)。胰蛋白酶購自Promega公司(WI,USA)。硫胱胺酸蛋白酶3/7(caspases 3/7)螢光受質和Annexin V-PE購自BioVision公司(CA，USA)。Alexa Fluor 647琥珀醯亞胺酯(AFSE)、RPMI 1640、DMEM、FCS、青黴素/鏈黴素/麩胺酸溶液、HEPES購自Invitrogen公司(CA，USA)。牛胰蛋白酶抑制劑(BPTI，Trasylol)自拜耳取得(Leverkusen,Germany)。抗-Hspa5、抗-GST、抗-肌動蛋白、抗-BrdU和抗-微管蛋白均購自Santa Cruz公司(Santa Cruz,CA,USA)。抗-Pdia4購自Stressgen公司(MI，USA)。
RNAi試劑係由國家型干擾性核醣核酸核心設施的TRC-HS 1.0資料庫取得(中央研究院，台灣)。
CPA、CP和BCP的製備
CPA和CP依據吳等人文獻內容由鬼針草純化出(Wu,L. W.,et al.(2004) Pharm. Res. 21(11),2112-2119;and Chiang,Y. M.,et al.(2007) J. Ethnopharmacol. 110(3),532-538)。關於BCP合成，使CP(24.1 mg)與一混合物培養於室溫過夜，該混合物為生物素(48.6 mg)、EDCI(76.1 mg)、HOBt(9.0 mg)、和Et3N(55.9 μl)溶於DMF(2.15 ml)。反應生成的混合物以半製備HPLC的RP-18管柱純化[Phenomenex Luna 5μ C18(2),250 mm×10 mm]使用40%乙腈水。BCP(4.7 mg)因生物素與CP之1-羥基的共軛而產生。其NMR數據顯示如下：1H NMR(500 MHz,CDCl3): δ 1.46(2H,p,J=7.5 Hz,H2-6"),1.58(1H,m,Ha-5"),1.67(2H,p,J=7.5 Hz,H2-7"),1.73(1H,m,Hb-5"),1.84(2H,td,J=7.0,5.5 Hz,H2-3),1.98(3H,s,H3-13),2.39(2H,t,J=7.5 Hz,H2-8"),2.59(2H,t,J=7.0 Hz,H2-4),2.71(1H,d,J=12.5 Hz,Hβ-3"),2.93(1H,dd,J=12.5,5.0 Hz,Hα-3"),3.16(1H,dd,J=9.0,8.0 Hz,H-2'),3.20(1H,dt,J=10.0,5.0 Hz,H-4"),3.27(2H,m,H-4' and H-5'),3.34(1H,m,H-3'),3.66(1H,dd,J=11.5,5.0 Hz,Ha-6'),3.85(1H,br d,J=11.5 Hz,Hb-6'),3.94(1H,p,J=5.5 Hz,H-2),4.16(1H,dd,J=11.0,5.5 Hz,Ha-1),4.30(1H,m,Hb-1 and H-1"),4.33(1H,d,J=8.0 Hz,H-1'),and 4.49(1H,dd,J=8.0,5.0 Hz,H-2"). HR-ESI-MS m/z=611.2036(計算是C29H36N2O9SNa=611.2034)。1H NMR質譜由運作Bruker Avance 500 AV光譜儀(500 MHz,CD3OD)所得。HR-ESI-MS係由Bruker BioTOF II質譜儀所得。
WST-1分析、表面染色和細胞內染色
WST-1分析是測量細胞活性。簡而言之，Jurkat細胞(5 x 103)生長在每孔100 μl的孔盤中。在與DMSO或CP衍生物培養24小時後，該細胞便在37℃培養於WST-1達30分鐘且以440 nm吸收辨識特徵。為染色Jurkat細胞的BCP-結合蛋白，以30 μM的DMSO、生物素和BCP分別培養Jurkat細胞達24小時。在洗滌後，細胞表面或細胞內以卵白素-PE-TR進行染色(Caltag，CA，USA)，接著以是螢光活化細胞分選(FACS)分析。螢光活化細胞分選數據採用FCS express 3.0軟體分析(De Novo Inc,CA,USA)。
慢病毒的生產和感染
包裝載體(packaging vectors)有提供包裹所須Gag和Pol蛋白質的pCMV-dR8.91，以及提供Env蛋白質的pMD2G。pPGK-GFP、pLKO.1-D9(TRCN0000049334)和PLKO.1-B(TRCN0000001023)在pLKO.1慢病毒載體中分別包含一空序列、一Pdia4 RNAi序列和一Hspa5 RNAi序列(Ciaffi,M.,et al.(2006) Gene 366(2),209-218)。PLKO.1-D9-GFP的構建係藉由以GFP cDNA取代PLKO.1-D9的嘌呤黴素抗性基因。為了產生慢病毒顆粒，以TransIT-LT1試劑(Mirus Bio,WI,USA)使HEK 293T細胞與包裝質體和pPGK-GFP、pLKO.1-D9-GFP、PLKO.1-B或pLKO.1-D9-GFP/PLKO.1-B轉染。在轉染後42小時和66小時收集慢病毒顆粒並以文獻中的描述濃縮(Tiscornia,G.,et al.(2006) Nat. Protoc. 1(1),241-245)。由pPGK-GFP、pLKO.1-D9-GFP、PLKO.1-B和pLKO.1-D9-GFP/PLKO.1-B轉染所得的慢病毒顆粒感染至穩定的Jurkat細胞株內，分別命名為GK、A4、A5和A4/A5細胞。
細胞生長，細胞增生，細胞週期及硫胱胺酸蛋白酶3/7的活性
在使用的2天前，Jurkat細胞感染不同的慢病毒顆粒。將細胞分為3等份，一等分用於測試6天的細胞生長，並使用伊紅Y計算活細胞和死細胞的數目。另一等分以AFSE染色，用於監測6天的細胞增生，並隨後以FACS分析。其他等分是以整除5-溴-2-脫氧尿苷(BrdU)脈衝30分鐘，且追蹤0至48小時。這些細胞以抗-BrdU抗體進行細胞內染色及FACS分析。另外等分測試硫胱胺酸蛋白酶的活性。硫胱胺酸蛋白酶3/7螢光受質與1 μg的裂解物培養且測量caspase活性，其顯示以Victor V發光計數器測量的相對發光值(RLU)。為了評估體內腫瘤的生長，慢病毒感染的Jurkat細胞(1×106)皮下接種於scid/灰褐色小鼠。對於該腫瘤小鼠就腫瘤之發病率、腫瘤的大小及存活率進行評估。
西方墨點法
為了鑑定BCP-結合蛋白，在37℃使Jurkat細胞(107)與DMSO或200 μg的BCP在20 ml的RPMI培養基中培養24小時。洗滌後，該細胞以0.3 ml Brij裂解液裂解。一部分(50 μg)以過氧化物-共軛卵白素進行西方墨點法，並接著以增敏化學發光套組發展。其餘裂解物的沉澱係藉由鏈黴親和素瓊脂糖珠進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，接著以考馬斯藍(coomassie blue)染色。為了確認在體內BCP和Pida4的相互作用，在37℃使Jurkat細胞(106)與DMSO或32 μg的BCP在2 ml的RPMI培養基中培養24小時。總裂解物以鏈黴素瓊脂糖珠沉澱且該沉澱物以抗-Pdia4抗體或抗-Pdi抗體進行西方墨點法。為了檢測Pdia4在細胞隔間的表達程度，依據製造商的指示抽取出人類CD4+T細胞和Jurkat細胞不同的細胞之細胞質、細胞膜和核蛋白質(Chemicon,CA,USA)。在初代和腫瘤細胞中Pdia4蛋白質的程度。人類CD4+T細胞(PT)、Jurkat細胞E6.1、MCF-7、THP-1和293T細胞的總裂解物(50 μg)以抗-Pdia4抗體進行SDS-PAGE和西方墨點法。在剝離膠條後，同樣的膜再以肌動蛋白點漬。為了檢測Pdia4和Hspa5的抑制效率，慢病毒感染細胞的總裂解物以抗-Pdia4抗體和抗-Hspa5抗體進行西方墨點法。為了研究Pdia4和Hspa5之間的交互作用，2 x 107的Jurkat細胞與DSP在4℃培養24小時。該裂解物以抗-Pdia4抗體或控制組血清沉澱，該沉澱物經SDS PAGE分離。該膜以抗體點漬。在剝離膠條後，同樣的膜再以抗-Pdia4抗體點漬
膠體內水解和該膜在膠消化和液相層析-奈電噴灑離子化串聯質譜儀(In-gel digestion and liquid chromatography-nanoelectrospray ionization-tandem mass spectrometery,LC-nanoESI-MS/MS)分析
把條帶1從考馬斯藍凝膠切下並進行膠體內水解。簡而言之，凝膠經乙腈脫水、真空乾燥、再於37℃以碳酸氫銨水合1小時。在以碘乙醯胺進行烷基化後，凝膠在37℃懸浮於含有胰蛋白酶的25 mM碳酸氫銨16小時。以LC-nanoESI-MS/MS系統分析胰蛋白酶胜肽。簡言之，胜肽等量留滯和脫鹽於LC-Packings PepMapTM C18 μ-PrecolumnTM管柱(300 μm i.d. x 5mm;Dionex,CA,USA)以0.1%甲酸2分鐘。該胜肽以C18毛細管柱進行分離(15 cm x 75 μm i.d.)填充5 μm,Zorbax 300 SB C18顆粒(Micro-Tech Scientific,CA,USA)，使用含0.1%甲酸的5%至80%乙腈作40分鐘的快速梯度沖提，且使用配有ESI源的Micromass Q-TOF UltimaTM API質譜儀。經過收集數據後，樣本的MS/MS光譜相結合並使用Mascot程式查詢非-冗餘蛋白質資料庫(Matrix Science,MA,USA)。GST-Pdia4(200 μg)與DMSO或CPA(24 μg)培養24小時，係用於GST-Pdia4和GST-Pdia4/CPA加合物的MS/MS分析。這些蛋白質進行LC/MS/MS分析。
蛋白質體質譜分析由中央研究院的蛋白質體研究核心設施執行。
GST蛋白質的製備及其蛋白質交互作用沉澱試驗(pull down assay)
由人類Hspa5 cDNA、人類Pdia4 cDNA、小鼠Tec cDNA的SH3區域分別選殖至pGEX4T3，而得到pGEX4T3-Hspa5、pGEX4T3-Pdia4、和pGEX4T3-TecSH3。GST融合蛋白質由細菌性宿主大腸桿菌BL21 DE3 pLysS純化而得，根據製造商的說明其有上述結構(Amersham Biosciences,NJ,USA)。穀胱甘瓊脂糖珠結合GST融合蛋白質(0.15 μg)與DMSO載具或BCP(0.026 μg)培養過夜。蛋白質以SDS-PAGE進行分離並使用卵白素-POD點墨。在競爭分析中，使用CP(0.16 μg(10倍)和0.81 μg(50倍))或CPA(0.09 μg(10倍)和0.45 μg(50倍))加入上述培養液內。在干擾試驗中，加入2-巰基乙醇(2.2 mg)至培養液內。為了測試CPA在GST-Pdia 4的雙硫鍵異構酶活性的效果，在載具(vehicle)存在時以還原的BPTI(0.39 μg)與氧化還原緩衝液培養，5.64 μg GST-Pdia4或5.64 μg加CPA的GST-Pdia4(0.33 μg)。測定還原的BPTI轉化為雙硫化物中間體，以殘留分率(%)顯示GST-Pdia4的酵素活性(Satoh,M.,et al.(2005) Cell Stress Chap. 10(3),211-220)。
即時反轉錄聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)定量PDI mRNAs
從Jurkat細胞利用Trizol試劑(Invitrogen)抽取出總RNA(total RNA)，並使用Amersham Biosciences套組將其轉換成第一股cDNAs(first-stranded cDNAs)。利用100 ng的cDNA作為模板與不同的引子組進行即時PCR。Pdia2,Pdi,Pdia3,Pdia4,Pdia5,Pdia6,Pdia13,Pdia15和Pdia16的mRNA表達係對肌動蛋白正規化。相對表達程度(R.E.L.)表示為Pdia2的倍數。
共軛焦顯微鏡
Jurkat細胞以固定緩衝液(Biolegend,CA,USA)固定。該細胞與含1 μg/m抗-Pdia4抗體的滲透緩衝液(Biolegend)培養0.5小時。在洗滌後，將該細胞與0.5 μg/ml的FITC-共軛二級抗血清培養。選擇性地，Jurkat細胞可用BCP和FITC-共軛卵白素染色。以Prolong anti-Fade套組(Invitrogen)塗佈前述細胞於玻片上並固定。使用蔡司LSM 510顯微鏡獲得共軛焦影像。
統計
由三個或以上獨立實驗所得到的數據，提出了以平均值±標準誤差(SE)。多組間用ANOVA分析進行比較。P<0.05被認為有意義。
實施例2CP和CPA調節急性白血病Jurkat T細胞的細胞生長
已有文獻公佈某些聚炔烴會抑制腫瘤細胞生長(Dembitsky,V. M.(2006) Lipids 41(10),883-924)。CP為一種直鏈聚炔烴，其表現為抑制性T細胞的增生(Chang,C. L.,et al.(2007) J. Immunol. 178(11),6984-6993)及其配糖CPA會促進人類臍靜脈內皮細胞的死亡(Wu,L. W.,et al.(2007) Planta Med. 73(7),655-661)。在此例子中評價二個直鏈聚炔烴：CP和CPA對於從急性白血病患者之T細胞株Jurkat細胞生長的功效(Weiss,A.,et al.(1984) J. Immunol. 133(1),123-128)。結果發現，CP和CPA藉由抑制增生和/或促進細胞死亡，抑制Jurkat細胞(T-ALL line)的細胞生長。
WST-1的檢測結果顯示，CP和CPA對於Jurkat細胞生長抑制的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)分別為52.8和2.5μg/ml(參見表1)。細胞生長與細胞增生及生存/死亡有相關。接著測試CP衍生物對Jurkat細胞的影響，CP和CPA抑制Jurkat細胞生長並呈劑量依賴性(第1A圖)，此與WST-1的數據符合。在低劑量時，CP(從5至13.5 μg/ml)和CPA(從0.7至1.3 μg/ml)抑制Jurkat細胞生長(第1A圖)，但並未出現明顯細胞毒性。相比之下，20 μg/ml以上的CP和2.5 μg/ml以上的CPA會增加Jurkat細胞的細胞死亡達10%以上(第1B圖)。
進一步測試CP和CPA低劑量對Jurkat細胞細胞增生的影響。由ASFE檢測證明此二種聚炔烴在低劑量時便可顯著抑制Jurkat細胞增生(第1C圖)。整體觀之，數據顯示出CP和CPA在低劑量藉由抑制細胞增生而抑制Jurkat細胞的細胞生長，並在高劑量時促進細胞死亡。CPA同樣地發現會誘導TS/A，乳腺腫瘤的細胞死亡。
實施例3 使用BCP辨識CP和CPA的分子標把
為了更佳理解CP衍生物的抗-生長機制，本實施例中辨識CP衍生物的分子標靶。
生物素化的CP(Biotinylated CP,BCP)是生物素與CP的共軛物，可作為一探針用來辨識Jurkat細胞內CP衍生物的分子標靶。生物素與CP的共軛，並不會顯著改變CP的生物活性，可由BCP和CP的IC50證明(見表1)。首先，使用西方墨點法確定Jurkat細胞的BCP結合蛋白。參見第2A圖，88 kD的蛋白質命為條帶1，可與BCP交互作用(第2A圖左)。在考馬斯藍凝膠中的BCP沉澱物，其與控制組沉澱物相較，條帶1似乎同樣是最突出的蛋白質(第2A圖右)。然而，一對額外的蛋白質條帶出現在載具(vehicle)和BCP二者的沉澱物中(第2A圖右)，這可能在沉澱過程中省略預清除(pre-clearing)步驟。接下來，條帶1的蛋白質使用LC/MS/MS方法鑑定其特徵。藉由蛋白質體分析和資料庫檢索，Pdia4(一種蛋白質雙硫鍵異構酶)、與Hspa5(一種葡萄糖調節蛋白質78)，被鑑定為BCP的標靶(第2B圖)。為了進一步確認BCP是否可以直接結合Pdia4和Hspa5，以表現TecSH3之GST融合蛋白體外培養BCP，TecSH3係為與Pdia4和Hspa5無關的蛋白質。西方墨點法的數據顯示，GST-Pdia4結合至BCP較優異(第3A圖)。相較之下，GST-Hspa5與BCP僅有些微互動，與GST-TecSH3類似。為了測試CP和CPA是否能與Pdia4結合，對於GST-Pdia4交互作用使用過量CP和CPA以與BCP競爭。競爭分析顯示，CPA和CP以劑量依賴性方式干擾BCP和GST-Pdia4之間的互動(第3B圖)。CPA比起CP似為更有效的干擾。這些數據表示CP和CPA相似於BCP，可以與Pdia4結合。此外，一種還原劑2-巰基乙醇(ME)，會大幅減少GST-Pdia4和BCP的交互作用(第3C圖)，顯示雙硫鍵有參與此交互作用。
試驗BCP和Pdia4在體內的結合。發現Pdia4在Jurkat細胞中與BCP有關聯(第3D圖)。前述數據顯示，Hspa5出現於BCP結合蛋白複合物內(第2B-2C圖)，但是對於BCP具有些微的結合親和力(第3A圖)。這意味著Hspa5和Pdia4之間有關聯。我們確認，在Jurkat細胞Pdia4與Hspa5有直接關聯(第3D圖)。同樣在甲狀腺細胞內也發現此關聯(Kuznetsov,G,Chen,L. B.,and Nigam,S. K.(1994) The Journal of biological chemistry 269(37),22990-22995)。總而言之，本例子顯示CP和CPA直接結合到Pdia4且顯示Hspa5間接結合到BCP。
前述數據與先前研究一致，此表明Pdia4與其他ER伴隨蛋白(Hspa5、Hsp90β1等)複合(Kuznetsov,G.,Chen,L. B.,and Nigam,S. K.(1994) J. Biol. Chem. 269(37),22990-22995;Feng,W.,et al.(1995) The J. Biol. Chem. 270(20),11851-11859;Vandenbroeck,K.,et al.(2006) Cytokine 33(5),264-273)。如第5圖所示，Pdia4和Hspa5促進Jurkat細胞的細胞生長。此實施例顯示，Pdia4可為癌症治療的藥物標靶，且CP衍生物可作為白血病或其他腫瘤的先導化合物。
實施例4藉由CPA共價結合和抑制Pdia4的酵素活性
BCP與GST-Pdia4或內源性Pdia4蛋白質的關聯完整保留於變性的SDS凝膠且被2-巰基乙醇的存在影響很大(第3A-3D圖)。為了驗證BCP以半胱氨酸相關方式共價結合至GST-Pdia4的假設，對CPA、最有效CP衍生物，和GST-Pdia4之間的相互作用進行MS/MS分析(第3E圖)。發現只有一個CPA加合至Pdia4的第二CGHC酵素活性中心之二個半胱氨酸殘基(第3E圖)。然而，CPA也可能略加合至第一和第三CGHC酵素活性中心。為了確認此共價相互作用是否會影響Pdia4的雙硫鍵異構酶活性，使用BPTI的還原形式作為Pdia4受質以測試GST-Pdia4的酵素活性。GST-Pdia4顯示在氧化還原緩衝液中，雙硫鍵異構酶的活性相較於GST蛋白質證明減少牛胰蛋白酶抑制劑雙硫鍵的形成(第3F圖左)。此外，CPA抑制此種活性(第3F圖右)。前述數據表明，CPA藉由作用於CGHC活性中心的半胱氨酸殘基而抑制Pdia4(第3F圖)。
實施例5Pdia4在T細胞及/或其他細胞的表達和分佈
Pdia4是CP衍生物的標靶。為了更佳理解Pdia4的生物意義，便研究在Jurkat細胞中Pdia4的細胞分佈。共軛焦影像顯示，Pdia4存在於細胞質和細胞膜超過在核內(第4A圖)。接下來，檢驗在Jurkat細胞和初代細胞中Pdia4的表達。如第4B圖所示，Pdia4分佈在細胞質，細胞膜和核隔間，且Pdia4蛋白質在Jutkat細胞內的程度高於初代T細胞(第4B圖)。在不同類型的腫瘤細胞，Pdia4蛋白質的細胞質表現程度與初代CD4+ T細胞比較同樣高於4-10倍。
實施例6 Pdia4在Jurkat細胞生長、增生和死亡的角色
在本實施例中，Pdia4的功能分析揭示其作用牽連至Jurkat細胞的細胞生長，增生和活化硫胱胺酸蛋白酶3/7。
研究Pdia4在Jurkat細胞生長的功能。GK細胞係為以表現空序列之慢病毒感染的Jurkat細胞，和A4細胞係為以表現Pdia4 RNAi序列之慢病毒感染的Jurkat細胞。Pdia4在A4細胞內的蛋白質表達為其在GK細胞內表達的20%(第4C圖左)。同樣比較GK細胞和A4細胞的細胞生長。如第4C圖所示，Pdia4阻斷(knockdown)降低Jurkat細胞的細胞生長達200%(第4C圖右)。為了研究Pdia4控制的細胞生長機制，使用AFSE測試控制組或阻斷Jurkat的細胞增生。Pdia4的阻斷明顯地減緩細胞增生(第4D圖)。此外，在Jurkat細胞中以Pdia4阻斷，會使硫胱胺酸蛋白酶3和硫胱胺酸蛋白酶7的活性略有增加(第4E圖)，這意味著Pdia4減少被誘導的細胞死亡。前述顯示的數據表明，Hspa5與Pdia4有關聯，顯示Hspa5和Pdia4參與相同的途徑。
GK，A4，A5細胞皆為表現Hspa5 RNAi序列之慢病毒的被感染Jurkat細胞，而A4/A5細胞則是表現Pdia4 RNAi和Hspa5 RNAi序列之慢病毒的被共同感染Jurkat細胞，評估其細胞生長。如第4F圖所示，Pdia4和Hspa5之雙阻斷抑制Jurkat細胞的細胞生長比任何單一阻斷更嚴重。同樣研究被空序列感染的Jurkat細胞在體內的細胞生長，或研究在SCID/灰褐色小鼠體內的Pdia4 RNAi。前述數據也顯示Pdia4促進細胞生長、細胞增生和細胞週期超過減少細胞死亡。
惟以上之敘述僅為本發明之較佳實施例說明，凡熟悉此項技藝者當可依據上述之說明而作其它種種之改良，惟這些改變仍屬於本發明之精神及以下所界定之專利範圍中。所有在此引用的專利、專利申請案或參考資料皆以其完整內容作為本文之一部分。
在本發明中，單數的使用可包括複數，除非特別說明，或是熟悉此項技藝者依據本發明揭露的內容明瞭只有單數是有效的實施。因此舉例來說，”一”可為一個以上，而”一實施例”可為其敘述可適用於多個實施例。此外，在本發明中”及/或”皆可為包括的意涵”及”與排他的意涵”或”。因此，本發明中的列舉應為包括列舉項目的所有可能組合及排除其他項目之各個項目。此詞”及/或”並未特別單指”及”或”或”。對於熟悉此項技藝者在閱讀本案內容時，此詞的意義是明顯。
本發明之所有參考文獻，包括專利、專利申請書、文獻及教科書等，且該些參考文獻皆以其完整內容納入本文。倘若一個或多個的參考文獻和相似材質與本案不同或有矛盾，由本發明主控包括但不限於被定義之詞、詞之用法、描述的技術等。
前面的說明及例子中詳述本發明的較佳實施例並描述發明人設想的最佳實施例。然而，無論前述如何詳細，本發明仍有多種方式可實行，且本發明的範圍係依據其後的申請專利範圍及其均等物為準。
對於熟悉此項技藝者，當本案發明說明書使用到”包含”、”所組成”、”實質上由...組成”，此為簡易描述所有三種可能性，除非另有規定或除非這個詞用在申請專利範圍(在這種情況時，各詞的意涵為申請專利範圍解釋下其一般可接受的含義)。因此，正如上行所使用的詞語，其指出所有三種可能性，除非他處有明確註明。
<110>　中央研究院
<120>　用於腫瘤診斷及治療之多炔糖苷衍生物的標靶PDIA4
<130>　SINICA.004A
<150>　61/333060
<151>　2010-05-10
<160>　6
<170>　FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>　1
<211>　58
<212>　RNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　siRNA
<400>　1
<210>　2
<211>　58
<212>　RNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　siRNA
<400>　2
<210>　3
<211>　58
<212>　RNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　siRNA
<400>　3
<210>　4
<211>　58
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成聚核苷酸
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成聚核苷酸
<400>　5
<210>　6
<211>　58
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成聚核苷酸
<400>　6
第1A-1C圖係顯示聚多炔糖苷(CP)及聚多炔糖苷配糖體(CPA)在細胞生長與細胞增生及生存/死亡的影響，第1A-1B圖係顯示CP和CPA影響Jurkat細胞生長和死亡的長條圖，Jurkat細胞生長於DMSO(-)的RPMI培養基，CP和CPA的濃度如圖所示培養6天，使用伊紅和細胞計數器計算存活細胞數目(第1A圖)和死亡細胞數量(第1B圖)，存活率(%)為以化合物處理之存活細胞數與控制組的比例乘以100%，死亡率(%)為死亡細胞數與全體細胞數(包含存活及死亡細胞)的比例乘以100%。第1C圖係顯示CP和CPA影響Jurkat細胞增生的長條圖，已先標有AFSE的Jurkat細胞的生長條件相同於第1A-1B圖；使用FACS檢測細胞在第0、2、4和6天的平均螢光強度(MFI)。
第2A圖係顯示BCP結合蛋白的鑑定；生物素化的CP(BCP)是生物素與CP的共軛物，Jurkat細胞與DMSO(lane 1)或BCP(lane 2)培養，以卵白素-POD對50 μg的裂解物進行西方墨點法點漬(第2A圖左)。殘餘的總裂解物以鏈黴素瓊脂糖珠沉澱，接著分離沉澱物以考馬斯藍(CB)染色(第2A圖右)。BCP結合蛋白為條帶1，第2B圖係顯示使用MS鑑定BCP結合蛋白(條帶1)。切下條帶1進行膠體內水解，並以LC/QTOF分析，確認二種蛋白質：Pdia4和Hspa5。第2C圖係顯示內源性Pdia4和Hspa5的交互作用，Jurkat細胞以DSP培養。總裂解物(lane 1)、或具有抗-Pdia4抗體附加鏈黴素珠的沉澱物(lane 2)、或以抗-Hspa5或抗-Pdia4抗體進行西方墨點法之具有鏈黴素珠的沉澱物(lane 3)。
第3A-3E圖係顯示CP衍生物標靶的驗證。第3A圖是西方墨點法顯示GST融合蛋白結合至BCP。珠連結GST-TecSH3(lanes 1-2)、GST-Hspa5(lanes 3-4)或GST-Pdia4(lanes 5-6)蛋白質與DMSO載具(lanes 1,3和5)或BCP(lanes 2,4和6)培養。在抽出後，該些蛋白質經卵白素-POD的西方墨點法。第3B圖顯示GST-Pdia4和CP衍生物結合的競爭分析。GST-Pdia4過夜培養於DMSO(lane 1)或BCP(lanes 2-6)存在CP(10X and 50X)或存在CPA(10X and 50X)，該些蛋白質分析如(A)。第3C圖顯示藉由降低試劑干擾GST-Pdia4/BCP的交互作用。GST-Pdia4與DMSO(lanes 1 and 3)、BCP(lane 2)或BCP添加2-巰基乙醇(ME)(lane 4)過夜培養，該些蛋白質分析如(A)。第3D圖顯示體內Pdia4與BCP的交互作用。Jurkat細胞與DMSO(lane 1和3)或BCP(lanes 2和4)培養。總裂解物以抗-Pdia4抗體的西方墨點法分析。第3E圖顯示GST-Pdia4 CPA加合物(adduct)的MS/MS分析，GST-Pdia4與CPA共培養。經胰蛋白酶分解後，該些胜肽經LC/MS/MS分析，顯示CPA-修飾胜肽的序列相當於185-210殘基。第3F圖顯示以CPA抑制GST-Pdia4的雙硫鍵異構酶活性。還原形式的BPTI在氧化還原緩衝液中與載具(vehicle)、GST、GST-Pdia4或具有CPA的GST-Pdia4培養。酵素分析活性以還原形式BPTI的區段(%)表示。
第4A-4F圖係顯示Pdia4的功能分析。第4A圖顯示Pdia4位置的共軛焦影像分析。分別以添加FITC-共軛二級抗體的無免疫之兔血清(CTR)、添加FITC-共軛二級抗體的抗-Pdia4抗體(anti-Pdia4)及具有卵白素-FITC的BCP(BCP)染色Jurkat細胞，其後並以DAPI雙重染色。第4B圖顯示Pdia4在初代CD4+T細胞和Jutkat細胞內的分佈。使用西方墨點法分別分析人類CD4+T細胞(pT,0.5x106)和Jutkat細胞E6.1(0.5×106)之細胞質(C)蛋白質、細胞核(N)蛋白質和細胞膜(M)蛋白質。第4C圖顯示Pdia4阻斷細胞生長的效果，以慢病毒載體pPGK-GFP(Mock)或pLKO.1-D9-GFP(A4 KD)感染Jutkat細胞，該細胞生長於含10%或2.5%胎牛血清的RPMI達6天，計算此二個群落的細胞數量，並以抗-Pdia4和抗-微管蛋白抗體的西方墨點法判斷此二個群落的Pdia4表達量。第4D圖顯示Pdia4阻斷細胞增生的效果，其把與第4C圖同樣的細胞以AFSE染色，並生長於含10%胎牛血清的RPMI達6天，隨後以FACS分析細胞的AFSE強度。第化圖顯示Pdia4阻斷硫胱胺酸蛋白酶3/7活性的效果。細胞(A)的總裂解物與螢光硫胱胺酸蛋白酶3/7受質培養。測量硫胱胺酸蛋白酶3/7活性的相對發光值(RLU)。第4F圖顯示Pdia4和Hspa5對於細胞生長的相加效果，係以慢病毒載體pPGK-GFP(Mock)、pLKO.1-D9-GFP(A4KD)、pLKO.1-B2-Hyg(A5 KD)或pLKO.1-D9-GFP(KD)/pLKO.1-B2-Hyg(A4/A5 KD)感染Jutkat細胞。

Claims (29)

  1. 一種診斷癌症的方法，包含：(a)對一個體之一生物性樣本執行一分析，以測定Pdia4的數量；以及(b)若由測定的結果顯示與癌症相關之Pdia4的數量和初代細胞相比，癌症細胞中Pdia4蛋白質增加4倍或以上，則判斷該個體具有癌症，其中該癌症係為原位癌。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該生物性樣本係來自於給予一Pdia4拮抗劑至該待診斷癌症之個體。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該生物性樣本係來自於給予一個或多個第二化學治療劑之該個體，其中該第二化學治療劑是相同或不同於該Pdia4拮抗劑。
  4. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該Pdia4拮抗劑抑制Pdia4蛋白質的表達。
  5. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該Pdia4拮抗劑抑制Pdia4的生物活性。
  6. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該Pdia4拮抗劑使Pdia4基因或其啟動子不活化。
  7. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該Pdia4拮抗劑是選自由一反義分子(antisense molecule)、一三螺旋分子、一核醣酶(ribozyme)和一siRNA所組成的群組。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該siRNA包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：3。
  9. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該Pdia4拮抗劑是選自由一Pdia4的抗體、聚炔烴(polyynes)和桿菌素(bacitricin)所組成的群組。
  10. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該Pdia4拮抗劑是紫杉烷(taxane)和艾黴素(doxorubicin)的一結合物。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該紫杉烷是紫杉醇(paclitaxel)或朵西紫杉酚(docetaxel)。
  12. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該生物性樣本係來自於給予放射治療之該個體。
  13. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該Pdia4拮抗劑不是血纖維蛋白溶酶原-5(kringle 5)、或kringle 5的衍生物。
  14. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該第二化學治療劑是選自由伊妥普賽(etoposide)、CPT-Il及替莫唑胺(temozolomide,TMZ)所組成的群組。
  15. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該第二化學治療劑係選自由CPT-Il、替莫唑胺(temozolomide,TMZ)、博萊黴素(bleomycin)、卡鉑(carboplatin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、順鉑(cisplatin)、秋水仙素(colchicine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、柔紅黴素(daunorubicin)、放線菌素(dactinomycin)、乙烯雌酚艾黴素(diethylstilbestrol doxorubicin)、伊妥普賽(etoposide)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、氟嘧啶(floxuridine)、馬法蘭(melphalan)、胺甲基葉酸(methotrexate)、絲裂黴素(mitomycin)、6-硫醇嘌呤(6-mercaptopurine)、坦尼坡賽(teniposide)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)、長春新鹼(vincristine)及長春鹼(vinblastine)所組成的群組。
  16. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該癌症是一神經膠質母細胞瘤。
  17. 一種鑑定腫瘤對於Pdia4拮抗劑治療有反應可能性的方法，包含：a)以一Pdia4拮抗劑處理一腫瘤生物性樣本；以及b)在以Pdia4拮抗劑處理後的一段時間內，監測該腫瘤生物性樣本中微血管成熟之一標記；其中給予Pdia4拮抗劑可減少該腫瘤微血管密度，即表示該腫瘤對Pdia4拮抗劑有反應，其中該腫瘤係為原位癌。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該Pdia4拮抗劑抑制Pdia4蛋白質的表達。
  19. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該Pdia4拮抗劑抑制Pdia4蛋白質的生物活性。
  20. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該Pdia4拮抗劑使Pdia4基因 或其啟動子不活化。
  21. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該Pdia4拮抗劑是選自由一反義分子、一三螺旋分子、一核醣酶和一siRNA所組成的群組。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之方法，其中該siRNA包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：3。
  23. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該Pdia4拮抗劑是一Pdia4的抗體。
  24. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該Pdia4拮抗劑是紫杉烷和艾黴素的一結合物。
  25. 如申請專利範圍第24項所述之方法，其中該紫杉烷是紫杉醇(paclitaxel)或朵西紫杉酚(docetaxel)。
  26. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該Pdia4拮抗劑是聚炔烴和桿菌素。
  27. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該腫瘤生物性樣本係來自於給予放射治療之該個體。
  28. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該腫瘤生物性樣本係來自於給予一化學治療劑之該個體。
  29. 如申請專利範圍第28項所述之方法，其中該化學治療劑係選自由CPT-Il、替莫唑胺(temozolomide,TMZ)、博萊黴素(bleomycin)、卡鉑(carboplatin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、順鉑(cisplatin)、秋水仙素(colchicine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、柔紅黴素(daunorubicin)、放線菌素(dactinomycin)、乙烯雌酚艾黴素(diethylstilbestrol doxorubicin)、伊妥普賽(etoposide)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、氟嘧啶(floxuridine)、馬法蘭(melphalan)、胺甲基葉酸(methotrexate)、絲裂黴素(mitomycin)、6-硫醇嘌呤(6-mercaptopurine)、坦尼坡賽(teniposide)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)、長春新鹼(vincristine)及長春鹼(vinblastine)所組成的群組。
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