TWI564391B - Method for producing Euglena with high wax content - Google Patents

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TWI564391B
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Yuka MARUKAWA
Nobuo Aoki
Hitoshi Matsuda
Hiroaki Kato
Akira Yoneda
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Euglena Co Ltd
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Description

蠟酯含量高之綠蟲藻(Euglena)生產方法
本發明係關於一種蠟酯含量高之綠蟲藻之生產方法，其可以低能量、低成本生產成為生物燃料原料的蠟酯含量高之微型藻綠蟲藻。
於聚焦在全球暖化問題之近來，抑制成為溫室效應氣體之一的二氧化碳氣體之排出量、及藉由將二氧化碳固定而降低大氣中二氧化碳濃度成為一大課題。
於此種狀況下，使用含有經固定化之二氧化碳的化石燃料作為能源會導致經固定之二氧化碳再次釋放至大氣中，而成為環境問題。又，由於化石燃料為有限資源，因而亦存在枯竭之問題。
為了解決如上所述之問題，需要化石燃料以外之燃料源，在對於以高等植物或藻類作為原料的生物燃料之開發的期待高漲。
作為成為生物燃料原料之候補的高等植物，已知有大豆、玉米、棕櫚等，但當以可食用性作物作為原料時，因對糧食不足之擔憂而成為問題。
另一方面，亦正進行自麻風樹(Jatropha curcas)、亞麻薺(Camelina sativa)等非食用性植物之生產，但每單位面積之生產量低之情況成為問題。
另一方面，廣泛地生存於池塘或沼澤中之光合成微生物及原生動物具有與植物相同的光合成能力，由水與二氧化碳生物合成碳水化合 物或脂質，並於細胞內儲存數十質量%。已知其生產量高於植物，以每單位面積計，該等生產量為可說是生產量較高的棕櫚的10倍以上。
且說，作為光合成微生物之一種的微型藻綠蟲藻係鞭毛蟲(Flagellate)之一群，包括以具有運動性之藻類而著名之裸藻。大部分綠蟲藻具有葉綠體，且進行光合成而進行獨立營養生活，但亦存在捕食性者或吸收營養性者。綠蟲藻(Euglena)係被分類在動物學與植物學兩者的屬。
於動物學中，屬於原生動物門(Protozoa)之鞭毛蟲綱(Mastigophorea)、植物鞭毛蟲亞綱(Phytomastigophorea)之目中存在眼蟲目(Euglenida)，其係由三個亞目Euglenoidina、Peranemoidina、Petalomonadoidina所構成。
於Euglenoidina中，作為屬，包括綠蟲藻屬(Euglena)、囊裸藻屬(Trachelemonas)、Strombonas、扁裸藻屬(Phacus)、鱗孔裸藻屬(Lepocinelis)、紡錘形綠色鞭毛藻屬(Astasia)、柄裸藻屬(Colacium)。於植物學中，有裸藻門植物(Euglenophyta)，其下有裸藻綱(Euglenophyceae)、裸藻目(Euglenales)，作為該目所包含之屬，除綠蟲藻屬(Euglena)以外，與動物分類表相同。
綠蟲藻於細胞內儲存為碳水化合物之綠蟲藻糖(Paramylon)。
綠蟲藻糖為約700個葡萄糖藉由β-1,3-鍵結進行聚合而成之高分子體之粒子。
若綠蟲藻處於厭氧狀態，則會進行分解為儲存多糖之綠蟲藻糖，並以由脂肪酸與脂肪醇所構成之蠟酯作為最終產物之蠟酯醱酵。
一般藻類包含之植物油脂之成分相當於主骨架之碳分佈為16以上之輕油、或與其相比為重質之石油餾分(petroleum distillate)，相對於此，綠蟲藻之蠟酯係由以碳數14作為中心之脂肪酸及醇所構成。此情況顯示，由綠蟲 藻之蠟酯獲得之生物質燃料處於現有噴射機燃料之碳數分佈10~16之範圍內，並且於藉由燃料化(氫化、異構化)的烴之製造中，與其他植物油脂相比可容易地純化為噴射機燃料。
於此種情況下，業界摸索出利用微生物進行蠟酯醱酵以生產潔淨且有用之能源的技術。
專利文獻1中記載有藉由好氧培養綠蟲藻，其後置於厭氧條件下，使儲存多糖綠蟲藻糖醱酵而轉化為蠟/酯(蠟酯)。
[專利文獻1]日本特公平3-65948號公報
如此，提出有利用微生物進行蠟酯醱酵而生產能源，但於專利文獻1之技術中，作為好氧性培養之方法，僅揭示有添加葡萄糖等有機物作為碳源、或於通常之光合成條件下進行培養等一般方法。
於此種技術中，關於生物燃料之製造，使用葡萄糖等碳源之培養法無法配合成本，且未探討二氧化碳之固定。
作為其他技術，有本申請人過去提出之日本專利特願2010-163370號(提出本申請案時未公開之技術)。
其中，揭示有由如下步驟所構成之蠟酯含量高之綠蟲藻的製造方法：第1步驟，於通入二氧化碳之獨立營養培養條件下進行微型藻綠蟲藻之好氧性培養；第2步驟，藉由於氮饑餓狀態進一步培養而增加每個細胞之綠蟲藻糖儲存量；及第3步驟，其後藉由置於厭氧狀態而使之進行以綠蟲藻糖作為基質之蠟酯醱酵。
即，於本技術中，可藉由實行好氧培養→於氮饑餓狀態下進一步培養→將細胞保持於厭氧狀態的一系列步驟，而有效地生產蠟酯含量高之綠蟲 藻。
於本技術中，藉由步驟2之氮饑餓狀態下之培養，可使碳水化合物充分地儲存於綠蟲藻中。
並且，於步驟3中，藉由使步驟2中培養之細胞處於厭氧狀態，而使於步驟2中充分地儲存之碳水化合物轉化為蠟酯，因此其結果為步驟3中蠟酯儲存量增加。
於此處所載之技術中，可確實地製造蠟酯含量高之綠蟲藻。但是，若長時間處於氮饑餓狀態，則有蠟酯醱酵之效率下降之問題。由於與醱酵相關之酵素為蛋白質，故需要氮源以生物合成出構成蛋白質之胺基酸，但於氮饑餓狀態無法從細胞外部重新地供給氮源。一般認為，於綠蟲藻細胞內，與醱酵相關之酵素的生產量下降會導致醱酵效率之下降。
本發明之目的在於解決上述各問題，並提供一種蠟酯含量高之綠蟲藻之生產方法，其可藉由於厭氧醱酵前添加營養素使蠟酯之醱酵效率恢復，而更有效地生產蠟酯含量高之綠蟲藻。
根據本發明之蠟酯含量高之綠蟲藻之生產方法，上述課題可藉由如下方式解決：至少進行於缺氮條件下好氧培養微型藻綠蟲藻之第1步驟、及將細胞保持於厭氧狀態之第2步驟，並且於進行上述第2步驟之前，將營養源添加至經過上述第1步驟之培養液。
如此，除好氧培養→將細胞保持於厭氧狀態之一系列步驟以外，於進行第2步驟之前，將營養源添加至經過第1步驟之培養液，藉此可有效率地生產蠟酯含量高之綠蟲藻。
即，藉由於第1步驟即氮饑餓狀態下之培養，可將碳水化合物充分地儲存於綠蟲藻中。
因此，藉由於第2步驟中使所培養之細胞處於厭氧狀態，可將充分儲存之碳水化合物轉化為蠟酯。
但是，若長時間處於氮饑餓狀態，則對構建與醱酵相關之酵素的胺基酸生物合成有幫助之氮源之供給會中斷，而使蠟酯醱酵之效率下降。
即，構成酵素之蛋白質之生物合成量減少，醱酵效率下降。
又，於使用第1步驟所培養之綠蟲藻，並直接將其移至第2步驟時，存在如下問題：為蠟酯原料的綠蟲藻糖儲存量雖然增加，但第2步驟之厭氧醱酵中蠟酯的生產效率下降，蠟酯相對於甘油二酸酯及甘油三酸酯之比例會停留在低水準。
因此，於在第2步驟中進行厭氧醱酵之前，藉由添加營養源，可抑制第2步驟中之醱酵效率下降，而有效率地生產蠟酯含量高之綠蟲藻，並且可確保蠟酯相對於甘油二酸酯及甘油三酸酯之比例為高水準，而製成適合製造航空燃料用燃料油基材者。
此時，宜為添加上述營養源之時機係以上述第2步驟中之厭氧狀態下即上述培養液的溶氧濃度下降至0.03 mg/L以下之時間點作為基準，於時間上為該時間點之前。
若添加營養素，則由於消除缺氮狀態，故而會促進所儲存之綠蟲藻糖分解。
因此，若添加營養素之時間點過早，則會消耗培養中所添加之營養素而回到缺氮狀態。
因此，添加營養素之時間點為重要，較理想為以厭氧狀態下培養液之溶氧濃度下降至0.03 mg/L以下的時間點作為基準，以時間進行管理。
具體而言，較理想為厭氧醱酵之3小時前，更佳為厭氧醱酵前1小時以內。
此時，具體而言，上述營養源宜為氮源。
又，上述營養源可為碳源，進而較佳為併用氮源與碳源。
作為「氮源」，宜選擇磷酸氫二銨、硫酸銨等銨化合物，甘胺酸、麩胺 酸等胺基酸。
再者，認為通常綠蟲藻無法將硝酸態氮同化，但於藉由基因重組技術等而改變為能將硝酸同化時，從細胞外吸收之硝酸態氮會被代謝為氨態氮，因此於該情形時，作為氮源之選項亦可包含硝酸化合物。
作為「碳源」，較佳為選擇葡萄糖、果糖等糖質，乙醇等醇，蘋果酸等有機化合物，麩胺酸等胺基酸。
再者，作為較佳之選擇，若上述氮源為銨化合物且上述碳源為葡萄糖，則於產率、獲取性、成本方面等有利。
又，除上述條件以外，所添加之營養源之量亦重要。
其原因在於：若營養源之添加量過多，則綠蟲藻糖之儲存量減少，若添加量過少，則不會產生厭氧醱酵效率之改善。
因此，於本發明中，較佳為以銨離子濃度成為10 mg/L左右之方式添加銨化合物。
如上所述，為了解決上述課題，本發明之蠟酯含量高之綠蟲藻製造方法的最大特徵在於：於進行藉由於氮饑餓狀態培養綠蟲藻而儲存碳水化合物之培養步驟、及藉由使所培養之細胞處於厭氧狀態而將碳水化合物轉化為蠟酯之厭氧醱酵步驟時，於厭氧醱酵步驟之前添加營養源。
根據本發明，藉由於氮饑餓狀態下之培養而使碳水化合物充分地儲存於綠蟲藻，之後使所培養之細胞處於厭氧狀態，藉此進行將充分地儲存之碳水化合物轉化為蠟酯的一系列步驟，於該等步驟之中，於厭氧醱酵之前添加營養素使蠟酯之醱酵效率恢復，而可更有效地生產蠟酯含量高之綠蟲藻。
因此，可從經光合成固定化之二氧化碳價廉地提供油脂含量多之生質(biomass)原料。
又，若藉由本發明而製造生物燃料，則亦會使能量自給率提高。
圖1係表示本發明之一實施形態的蠟酯含量高之綠蟲藻之生產方法步驟圖。
圖2係表示本發明之比較例1的GPC分析結果之圖表。
圖3係表示本發明之實施例1的GPC分析之結果之圖表。
圖4係表示本發明之實施例2的GPC分析之結果之圖表。
圖5係表示本發明之實施例3的GPC分析之結果之圖表。
以下，基於圖式說明本發明之一實施形態。
再者，以下所說明之構成並非限定本發明，可於本發明之主旨範圍內進行各種改變。
本實施形態係關於一種綠蟲藻之生產方法，其係藉由於好氧性條件下培養綠蟲藻，其後使之處於厭氧狀態下而生產綠蟲藻之方法，其中藉由於厭氧醱酵之前添加營養素使蠟酯之醱酵效率恢復，而可更有效地生產蠟酯含量高之綠蟲藻。
(第1實施形態)
根據圖1，對本發明之蠟酯含量高之綠蟲藻之生產方法的第1實施形態進行說明。
本生產方法包括利用缺氮條件下之培養基好氧培養綠蟲藻之步驟1(相當於第1步驟)、及進行厭氧處理而使碳水化合物醱酵為蠟酯之步驟2(相當於第2步驟)。
首先，於步驟1(相當於第1步驟)之前，進行綠蟲藻之預培養。
預培養係使用AY培養基。
再者，作為獨立營養培養基之AY培養基較佳係設為酸性條件，例如較佳為調整成pH值2.5~6.5，更佳為pH值3.0~6.0。
具體而言，於本例中，使用去離子水，製作表1所示之組成之AY培養基，並使用稀硫酸調整成pH值3.5，之後進行高溫高壓滅菌(autoclave sterilization)。
所謂AY培養基，係自通常用作綠蟲藻之異養(heterotrophy)培養基之Koren-Hutner培養基去除葡萄糖、蘋果酸、胺基酸等異養成分而成的獨立營養培養基。
表1係本獨立營養培養基之一例，VB1表示維生素B1，VB12表示維生素B12。
以水深為20 cm之方式，將約2 L經殺菌之AY培養基添加至長度10 cm、寬度10 cm、高度27 cm之丙烯酸系樹脂製培養容器，於其中接種纖細裸藻(Euglena gracilis)Z株。
培養容器係設置於放置在磁力攪拌器SRSB10LA(ADVANTEC)之上的恆溫水槽內，使用6 cm之攪拌子以300 rpm之強度進行攪拌。
CO2之通氣較佳為以0.05 vvm~0.2 vvm(100~200 mL/min)之流量、於光強度600~1200 μmol/(m2‧s)下進行。
「vvm」表示「每單位體積之氣體通氣量(volume per volume mimnute)」。
具體而言，於本例中，光源係將金屬鹵素燈/EYE Clean Ace BT型(岩崎電氣製造)設置於培養液面之正上方，以凝聚至培養液面之光成為約900 μmol/(m2‧s)之強度之方式調節高度。
為使光之照射時間近似屋外之晝夜條件，而設為於點亮12小時後熄滅12小時之明暗週期。作為碳源，以0.1 vvm(200 mL/min)之流量通入15%濃度之CO2。
再者，預培養時間宜設為24~120小時，較佳設為48~96小時。
同樣地，培養溫度宜設為26~32℃，更佳為設為28~30℃。
具體而言，於本例中，利用AY培養基預培養3天之後，自2 L之培養液將綠蟲藻細胞離心分離(2,500 rpm、5分鐘、室溫)，其後利用去離子水洗淨1次，而製成各培養之種藻體。
於步驟1(相當於第1步驟)中，於缺氮條件下，好氧培養綠蟲藻，而使綠蟲藻糖之儲存量增加。
再者，缺氮AY培養基較佳設為酸性條件，例如宜調整為pH值2.5~6.5，更佳為調整為pH值3.0~6.0。
具體而言，於本例中，使用去離子水，製作表2所示組成之缺氮AY培養基，於使用稀硫酸調整成pH值3.5後進行高溫高壓滅菌。
所謂缺氮培養基，係指含氮化合物之含量為5 mg/L以下之培養基。
以水深成為20 cm之方式，將約4.5 L經殺菌之缺氮AY培養基添加至長度15 cm、寬度15 cm、高度27 cm之丙烯酸系樹脂製培養容器中，而接種以AY培養基進行預培養之種藻體。
綠蟲藻之初始濃度宜設為0.05~5.0 g/L，更佳設為0.2~1.0 g/L。
具體而言，於本例中，將初始濃度設為約0.3 g/L，光照射、攪拌、通氣等培養條件係藉由與預培養相同之範圍及方法實施。
缺氮培養時間設為48小時以內(明亮期24小時以內)。
於本實施形態中，設為48小時。
關於該缺氮培養時間之選擇，於下文之「比較例1」中詳述。
再者，光照射係藉由實施如下之明暗週期：將暗期之開始設為培養開始0小時，於12小時後點亮金屬鹵素燈，於24小時後熄滅，並於第36小時再次點亮。
繼而，於步驟2(相當於第2步驟)中，進行所培養之綠蟲藻之厭氧處理，而將綠蟲藻保持於厭氧狀態下。
首先，使用離心分離機將培養液自2 L濃縮至0.5 L左右，並轉至600 mL容量之高型燒杯(tall beaker)中。
對約400 mL左右之培養液，以200 mL/min之流量通入氮氣30分左右而進行厭氧處理。
於厭氧處理中，確認溶氧濃度成為0.03 mg/L以下而設為結束。
於利用石蠟(parafilm)覆蓋通入氮氣後之燒杯上部後，為了遮光，利用鋁箔覆蓋整體，並於室溫靜置3天。
將此時之室溫設為26℃~27℃。
再者，厭氧處理通常如上述記載，係藉由對培養後之培養基通入氮氣或氬氣等氣體等非活性氣體而進行，但藉由濃縮培養液而提高細胞密度等處理亦會使溶氧濃度下降。
又，厭氧處理亦可藉由將培養基靜置而進行。
即，其原因在於：若不攪拌培養基而將其靜置，則因細胞沈澱而成為高密度，結果成為氧不足。亦可藉由利用離心分離形成高密度狀態而進行厭氧處理。
此時之pH值只要並非極端低或極端高之值即可，光照射之有無不會對蠟酯醱酵產生影響。保持溫度只要並非如綠蟲藻死滅之高溫、如培養基冷凍之低溫即可。通常，蠟酯醱酵於6小時~72小時內完成。
又，於本實施形態中，係於進行步驟2之前、即進行厭氧處理之前，將營養源添加至綠蟲藻培養液。
再者，所謂「厭氧處理前(厭氧醱酵前)」，係指以綠蟲藻培養液之溶氧濃度下降至0.03 mg/L以下之時間點作為基準，於時間上為該時間點之前的時機。
又，作為營養源，可假定氮源、碳源、或氮源及碳源之混合物等。
作為營養源之氮源之添加量相對於被處理液(於步驟1中獲得之培養液)，以銨離子為基準來計宜為7~15 mg/L，較佳為8~12 mg/L。
又，作為營養源之碳源(葡萄糖)添加量相對於被處理液(於步驟1中獲得之培養液)，宜為0.2~2.0 g/L，較佳為0.5~1.5 g/L。
作為氮源，包括磷酸氫二銨、硫酸銨等銨化合物，甘胺酸、麩胺酸等胺基酸。
通常認為綠蟲藻無法將硝酸態氮同化，但於藉由基因重組技術等而改變為能將硝酸同化時，從細胞外吸收之硝酸態氮被代謝為氨態氮，因此於該情形時，作為氮源亦包括硝酸化合物。
又，作為「碳源」，包括葡萄糖、果糖等糖質，乙醇等醇，蘋果酸等有機化合物，麩胺酸等胺基酸。
於本例中，使用銨化合物作為氮源，使用葡萄糖作為碳源。
於添加氮源之情形時，於厭氧處理1小時前、即缺氮培養第47小時，每1 L培養液添加磷酸氫二銨((NH4)2HPO4)0.1643 g(相當於10 mg/L)作為氮源。
關於添加該氮源之時間點，於下文之「實施例1」中詳述。
又，於添加碳源之情形時，於厭氧處理1小時前、即缺氮培養第47小時，每1 L培養液添加葡萄糖1 g作為碳源。
關於添加該碳源之時間點，於下文之「實施例2」中詳述。
進而，於一併添加氮源及碳源之情形時，於厭氧處理0~1小時前、即缺氮培養第48小時~第47小時，添加葡萄糖及磷酸氫二銨。
關於添加該氮源及碳源之時間點，於下文之「實施例3」中詳述。
如此，藉由於該等步驟1→步驟2組合營養源之添加，會產生蠟酯儲存量飛躍性地增加之各步驟無法單獨獲得的有利效果。
又，可製造於油脂組成定性評價中亦表現出高評價之蠟酯。
以下，於比較例及各實施例中，說明各條件之選定根據。
(比較例1) <缺氮培養時間之研究> (1)預培養、缺氮培養、厭氧處理
預培養與上述相同。
於利用AY培養基預培養3天後，自2 L之培養液將綠蟲藻細胞離心分離(2,500 rpm、5分鐘、室溫)，利用去離子水洗淨1次，而製成缺氮培養之種藻體。
使用去離子水製作上述表2所示之組成之缺氮AY培養基，以與上述步驟1相同之方式進行缺氮培養。
實施如下之明暗週期：將暗期之開始設為培養開始0小時，於12小時後點亮金屬鹵素燈，於24小時後熄滅，並於第36小時再次點亮。將所準備之培養液設為樣品1-1。
樣品1-1係於培養開始第48小時回收。
關於厭氧處理，以與上述步驟2相同之方式進行。
再者，自厭氧處理後之培養液藉由離心分離(2,500 rpm、5分鐘、室溫)回收綠蟲藻細胞，於所回收之沈澱物冷凍之後，進行冷凍乾燥而製成下述樣本。
冷凍乾燥機係使用DRW240DA(Advantec)而進行。
(2)碳水化合物之定量
綠蟲藻乾燥粉末之碳水化合物含有率係藉由以下方法定量。
由於綠蟲藻細胞所含之碳水化合物之90%左右為綠蟲藻糖，故而亦認為該定量實質上係定量綠蟲藻糖。
將經乾燥之綠蟲藻粉末約0.1 g放入至50 mL容積之Falcon型離心管，並添加丙酮10 mL。
利用超音波粉碎機(Tomy製造，UD-201)粉碎90秒鐘，並進行離心分離(2,000 rpm、5分鐘、室溫)。
於除去上清液後，於沈澱物添加丙酮10 mL，再次於上述條件下進行超音波粉碎，並進行離心。
於再次除去上清液後，於沈澱物添加1%之SDS(Sodium Dodecyl Sulfonate，十二烷基磺酸鈉)溶液20 mL，於利用旋渦混合器(vortex mixer)進行攪拌而使之懸浮之後，利用沸水進行30分鐘熱水浴。
於將其離心分離(2,000 rpm、5分鐘、室溫)之後，於離心沈澱物添加0.1%之SDS溶液10 mL，利用旋渦混合器進行攪拌而使之懸浮。
再次將其離心分離(2,000 rpm、5分鐘、室溫)，於離心沈澱物添加RO水20 mL，利用旋渦混合器進行攪拌而使之懸浮，並洗淨沈澱物。
於進行離心分離(2,000 rpm、5分鐘、室溫)後，於0.5 N之氫氧化鈉20 mL使沈澱物懸浮、可溶化，將靜置數小時至一晚之懸浮液製成萃取物並進行糖定量。
萃取物係藉由苯酚硫酸法而進行糖定量。
於萃取溶液0.5 mL添加5%之苯酚0.5 mL、硫酸2.5 mL，利用旋渦混合器使之懸浮。
於將其於室溫下靜置20~30分鐘之後，利用分光光度計(SHIMADZU，UVmini-1240)讀取480 nm之吸光度。
再者，校準曲線之製作係使用葡萄糖溶液(0 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL、150 μg/mL、250 μg/mL)或0.005%綠蟲藻糖(paramylon)溶液。
(3)油脂之萃取、定量
源自綠蟲藻乾燥粉末之油脂萃取及定量係藉由以下方法進行。
於密閉容器添加綠蟲藻乾燥藻體0.2~0.3 g，添加其10倍重量之正己烷，室溫下以200 rpm振盪1小時。
藉由過濾將固液分離，使用原乾燥重量之約20倍量之己烷洗淨漏斗上之濾餅。
整合濾液與洗淨液，並利用設定為浴溫55℃之蒸發器餾去正己烷，藉此回收油脂。
重複2次上述操作，將第1次與第2次之萃取油脂整合。
根據所回收之油分之重量與己烷萃取所使用的綠蟲藻乾燥藻體之重量，算出厭氧處理後之乾燥藻體中油脂的含有率。
再者，於綠蟲藻之厭氧醱酵中，由於在由丙酮酸生成乙醯-輔酶A(acetyl-coenzyme A)之過程釋放CO2，故而每個細胞之重量減少，但於表1中未進行厭氧處理前後之重量減少的修正。
(4)油脂之成分分析
為查明從綠蟲藻乾燥粉末萃取之油脂成分，藉由以下方法進行凝膠滲透層析(GPC)分析。
於己烷萃取後之油脂乾固物添加氯仿10 mL而將其溶解，其後使經過濾者為測定溶液。
HPLC(High Performance Liquid Chromatograph，高效液相層析)系統係使用Allience 2695(Waters)，管柱採用G2000H8(Tosoh)。
測定係於管柱溫度23℃、流速1 mL/min、濃度：1.0質量%、注入量：100 μL之條件下實施，偵測器係使用折射計(RI)。
將該GPC分析結果示於圖2。
再者，將厭氧處理前後之碳水化合物定量結果、厭氧處理前後之油脂含有率、油脂組成之定性評價示於表3。
由上述結果得知，若將缺氮培養時間設為48小時(樣品1-1)，則碳水化合物之含量變得良好。
因此，可判斷若考慮碳水化合物之儲存，則缺氮培養時間較佳為48小時以內(明亮期24小時以內)。
另一方面，樣品1-1，其厭氧後之碳水化合物含有率與厭氧前相比會大幅度下降。此情況符合綠蟲藻所含之大部分碳水化合物為綠蟲藻糖、且綠蟲藻糖係藉由厭氧處理而被分解之見解。
又，另一方面，於油脂組成中，如圖2之蠟酯之波峰所示，於樣品1-1中亦可見良好之結果。
再者，若缺氮培養時間延長，則蠟酯之峰值減小。
認為其原因在於，因缺氮壓力而難以於綠蟲藻細胞內生物合成新的胺基酸，編碼與厭氧醱酵相關之酵素的基因表現或蛋白質之轉譯量減少，或酵素活性下降。
若考慮該等見解，則認為即便將缺氮時間設為48小時以上亦無較大之效果，將缺氮培養時間設為48小時以下進行比較實驗。
(實施例1) <氮源添加之研究> (1)預培養、缺氮培養、厭氧處理
由比較例1之結果得知，就儲存碳水化合物之觀點而言，缺氮培養時間為48小時以內較為充分。
另一方面，油脂組成之定性評價為C，認為尚有改善之餘地。
因此，以比較例1之樣品1-1作為基準，進行於厭氧處理之數小時前將氮源添加至培養液之實驗。
預培養及缺氮培養、厭氧處理之條件係設為與比較例1相同。
(2)添加氮源
於本例中，於厭氧處理前添加氮源。
於樣品2-1中，於厭氧處理1小時前、即缺氮培養第47小時，每1 L 培養液添加磷酸氫二銨((NH4)2HPO4)0.1643g(相當於10mg/L)作為氮源。
同樣地，於樣品2-2中，於厭氧處理12小時前、即缺氮培養第36小時，每1L培養液添加磷酸氫二銨((NH4)2HPO4)0.1643g(相當於10mg/L)作為氮源。
(3)碳水化合物定量、油脂之萃取、定量、GPC分析
該等分析係於與比較例1相同之條件下進行。
將厭氧處理前後之油脂含有率示於表4。
又，將GPC分析之結果示於圖3。
於厭氧處理12小時前添加磷酸氫二銨時，油脂含有率為30%，油脂組成定性評價為C，與樣品1-1相比油脂含有率較低，且無效果(參照表4之樣品2-2)。
另一方面，於厭氧處理1小時前添加磷酸氫二銨時，油脂含有率為36%，油脂組成定性評價為B，與樣品1-1相比油脂含有率稍下降，但有油脂組成之改善效果(參照表4之樣品2-1)。
認為其原因在於：若缺氮培養時間延長，則編碼與厭氧醱酵相關之酵素的基因表現或蛋白質之轉譯量減少，但藉由於厭氧處理前添加氮源，會促進編碼與厭氧醱酵相關之酵素的基因表現及轉譯，而使厭氧醱酵能力恢復。
(實施例2)
<碳源添加之研究>
(1)預培養、缺氮培養、厭氧處理
由比較例1之結果得知，就儲存碳水化合物之觀點而言，缺氮培養時間為48小時較為充分。
又，由實施例1之結果得知，藉由於厭氧前添加氮源，會使綠蟲藻細胞之厭氧醱酵能力恢復。
於本例中，為了查明藉由添加碳源而非氮源，是否亦會使厭氧醱酵能力恢復，而進行添加葡萄糖之實驗。
預培養及缺氮培養、厭氧處理之條件係設為與比較例1相同。
(2)添加碳源
於本例中，於厭氧處理前添加碳源。
樣品3-1係於厭氧處理1小時前、即缺氮培養第47小時，每1L培養液添加葡萄糖1g作為碳源。
(3)碳水化合物定量、油脂之萃取、定量、GPC分析該等分析係於與比較例1相同之條件下進行。
將厭氧處理前後之油脂含有率示於表5。
又，將GPC分析之結果示於圖4。
於厭氧處理1小時前添加葡萄糖時，油脂含有率為52%，油脂組成定性評價為B，與樣品1-1相比油脂含有率大幅度提高，亦有油脂組成之改善效果。
認為其原因在於：藉由添加碳源，亦會使厭氧醱酵能力恢復。
(實施例3) <添加氮源及碳源之研究> (1)預培養、缺氮培養、厭氧處理
由上述比較例1之結果得知，就儲存碳水化合物之觀點而言，缺氮培養時間為48小時較為充分。
又，由上述實施例1及實施例2之結果得知，藉由於厭氧前添加氮源或碳源，會使綠蟲藻細胞之厭氧醱酵能力恢復。
進而，於本例中，為了查明藉由同時添加氮源及碳源，對油脂含有率及油脂組成有何種影響，而進行以下之實驗作為實施例3。
預培養及缺氮培養、厭氧處理之條件係設為與比較例1相同。
(2)添加氮源及碳源
樣品4-1係於厭氧處理0小時前、即缺氮培養第48小時，每1 L培養液添加葡萄糖1 g作為碳源，每1 L培養液添加磷酸氫二銨((NH4)2HPO4)0.1643 g(相當於10 mg/L)作為氮源。
樣品4-2係於厭氧處理0.5小時前、即缺氮培養第47.5小時，每1 L培養液添加葡萄糖1 g作為碳源，每1 L培養液添加磷酸氫二銨((NH4)2HPO4)0.1643 g(相當於10 mg/L)作為氮源。
樣品4-3係於厭氧處理1小時前、即缺氮培養第47小時，每1 L培養液添加葡萄糖1 g作為碳源，每1 L培養液添加磷酸氫二銨((NH4)2HPO4)0.1643 g(相當於10 mg/L)作為氮源。樣品4-4係於厭氧處理12小時前、即缺氮培養第36小時，每1 L培養液添加葡萄糖1 g作為碳源，每1 L培養液添加磷酸氫二銨((NH4)2HPO4)0.1643 g(相當於10 mg/L)作為氮源。
(3)碳水化合物定量、油脂之萃取、定量、GPC分析
該等分析係於與比較例1相同之條件下進行。
將厭氧處理前後之油脂含有率示於表6。
又，將GPC分析之結果示於圖5。
於厭氧處理0~1小時前添加葡萄糖及磷酸氫二銨時，與樣品1-1相比油脂含有率均提高，且均有油脂組成之改善效果(參照表6、樣品4-1~4-3)。
於樣品4-3中油脂含有率為58%，油脂組成定性評價為A，與僅添加葡萄糖及添加磷酸氫二銨相比，油脂含有率大幅度提高，油脂組成亦大為改善。
另一方面，於厭氧處理12小時前添加葡萄糖及磷酸氫二銨時，與樣品1-1相同程度，且無油脂含有率及油脂組成之改善效果(參照表6、樣品4-4)。
認為藉由除氮源以外亦添加碳源，而於油脂含有率之提高及油脂組成之改善方面有協同效果。
如上所述，於本發明中，對當長時間處於氮饑餓狀態則蠟酯生產量下降之課題反覆進行努力研究，結果證實若於厭氧醱酵前添加營養素，則醱酵效率恢復，蠟酯生產量獲得改善。
得知作為所添加之營養素，較佳為氮源，亦可為碳源。
進而，證實若同時添加氮源與碳源，則與分別單獨添加之情形時相比，油脂組成獲得提高。
由於若添加營養素，則缺氮狀態會被消除，故而會促進所儲存之綠蟲藻糖之分解。
因此，若添加營養素之時間點過早，則會於培養中消耗添加之營養素，而回到缺氮狀態。
因此，進行上述驗證，證明添加營養素之時間點為厭氧醱酵之3小時前，更佳為於厭氧醱酵前1小時以內。
除上述條件以外，所添加之營養素之量亦重要。
其原因在於：若添加量過多，則綠蟲藻糖之儲存量減少，若添加量過少，則不會產生厭氧醱酵效率之改善。
因此，於本發明中，以銨離子濃度成為10mg/L左右之方式添加磷酸氫二銨。
由於在綠蟲藻度為0.3g/L左右時，氨之消耗速度約為1.5g．L-1．h-1，因此10mg/L為6~7小時所消耗之量。
藉由上述方式提高生產量之蠟酯係有效地用作生物燃料者。
綠蟲藻如可用於健康食品等般，係可簡便地獲取之微生物，並且可大量培養。
根據本發明，藉由自上述微生物即綠蟲藻大量回收優質之蠟酯，可穩定地供給潔淨之能源。

Claims (6)

  1. 一種蠟酯含量高之綠蟲藻之生產方法，其至少進行於缺氮條件下好氧培養微型藻綠蟲藻之第1步驟、及將細胞保持於厭氧狀態之第2步驟，並且在進行上述第2步驟前之比0小時長且在1小時以內的時間內，將營養源添加至經過上述第1步驟之培養液。
  2. 如申請專利範圍第1項之蠟酯含量高之綠蟲藻之生產方法，其中，添加上述營養源之時機係以上述第2步驟中之厭氧狀態即上述培養液的溶氧濃度下降至0.03mg/L以下之時間點作為基準，於時間上為該時間點之前。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之蠟酯含量高之綠蟲藻之生產方法，其中，上述營養源為作為氮源之銨化合物。
  4. 如申請專利範圍第1或2項之蠟酯含量高之綠蟲藻之生產方法，其中，上述營養源為碳源。
  5. 如申請專利範圍第3項之蠟酯含量高之綠蟲藻之生產方法，其中，將碳源與上述銨化合物一起添加。
  6. 如申請專利範圍第1項之蠟酯含量高之綠蟲藻之生產方法，其中，在48小時以內之期間進行上述第1步驟。
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6063362B2 (ja) * 2013-09-10 2017-01-18 株式会社日立製作所 光合成微生物の分離システム及びその分離方法
JP2016002004A (ja) * 2014-06-13 2016-01-12 株式会社デンソー 微細藻類の培養方法、微細藻類、及び油脂の製造方法
US20180112175A1 (en) * 2015-05-08 2018-04-26 Riken Method for producing an organic acid using euglena
KR20170024307A (ko) * 2015-08-25 2017-03-07 삼성전자주식회사 내장형 리프레쉬 콘트롤러 및 이를 포함하는 메모리 장치
JP6625370B2 (ja) * 2015-08-24 2019-12-25 岡山県 藻類の培養密度を向上させるための組成物およびその利用
JP2017070239A (ja) * 2015-10-07 2017-04-13 株式会社神鋼環境ソリューション ユーグレナの培養方法
JP6740590B2 (ja) * 2015-10-23 2020-08-19 株式会社デンソー 光合成微生物の培養装置及び培養方法
JP2017184698A (ja) * 2016-04-08 2017-10-12 株式会社ユーグレナ 油脂高含有ユーグレナ
JP7149137B2 (ja) * 2018-09-03 2022-10-06 株式会社ユーグレナ ユーグレナ及びワックスエステルの製造方法
WO2020162502A1 (ja) * 2019-02-07 2020-08-13 学校法人近畿大学 ユーグレナによるバイオ燃料の製造方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61254193A (ja) * 1985-05-07 1986-11-11 Harima Chem Inc 不飽和ワツクスエステルの製造方法
WO2012011421A1 (ja) * 2010-07-20 2012-01-26 株式会社ユーグレナ ワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法及びワックスエステル製造方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63119409A (ja) * 1986-11-08 1988-05-24 Harima Chem Inc 皮膚化粧料
JPH0889260A (ja) * 1994-09-22 1996-04-09 Iwase Cosfa Kk スクアレン類の製法
JP5513748B2 (ja) * 2009-01-13 2014-06-04 花王株式会社 凹凸補正用油性化粧料

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61254193A (ja) * 1985-05-07 1986-11-11 Harima Chem Inc 不飽和ワツクスエステルの製造方法
WO2012011421A1 (ja) * 2010-07-20 2012-01-26 株式会社ユーグレナ ワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法及びワックスエステル製造方法

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