TWI558811B - A planar patch clamp device, an electrode portion for the device, and a cell ion channel current measurement method - Google Patents

A planar patch clamp device, an electrode portion for the device, and a cell ion channel current measurement method Download PDF

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Hidetaka Uno
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Description

平面膜片鉗裝置、該裝置用電極部和細胞離子通道電流測量方法
本發明係關於平面膜片鉗裝置、該裝置用電極部和細胞離子通道電流測量方法。
進一步詳細而言，本發明係關於平面膜片鉗裝置、用於安裝於該裝置中的平面膜片鉗裝置用電極部、與使用該平面膜片鉗裝置進行的細胞離子通道電流測量方法，前述平面膜片鉗裝置為可以多點測量的平面基板型，具有細胞培養功能，可進行離子通道電流測量時的雜訊電流的有效抑制與細胞的穩定定位。
構成生命體的細胞的表面配置有各種膜蛋白，對於細胞表面的特定位元點，化學物質(配體等信號傳遞物質)的結合、或者電或光的刺激(閘極觸發)使得作為膜蛋白開口部的通道發生開閉，從而控制離子、化學物質在細胞膜的外側和內側之間的輸送。進行該控制的離子通道是與生物體系統的信號傳導相關的重要膜蛋白，其功能測量或與功能相關的藥品的開發中，需要測量通道蛋白質的電變化，即，測量離子通道電流。
對應於該要求，迄今為止開發了吸管膜片鉗、平面膜片鉗等技術。吸管膜片鉗具有無法應用於利用多點測量的高通量篩選中的弱點。與此相對，平面膜片鉗是在矽晶片之類的固體基板上構成多個膜片鉗裝置，使得多點測量成 為可能，各膜片鉗裝置的細胞配置部位分別設置有用於測量離子通道電流的微細貫通孔。
例如下述專利文獻1中，對用於以多個膜片鉗細胞實施膜片鉗記錄的由多個電極構成的平面的膜片鉗電極陣列進行了記載。另外，下述專利文獻2中，公開了在矽基板的上下表面設置電極，並貫通用於使兩個電極間電連通的孔，測定置於貫通孔的入口處的細胞的電變化的平面型膜片鉗裝置。
現有技術文獻 專利文獻
專利文獻1：日本特表2003-511668號公報
專利文獻2：日本特表2005-536751號公報
專利文獻3：日本特開2009-204407號公報
非專利文獻
非專利文獻1：Tsuneo Urisu et al, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 391 (2008) 2703-2709
然而，以往的平面膜片鉗裝置由於不具有細胞培養的功能，因而具有無法適用於神經細胞之類需要培養的細胞的問題。即，由於作為測定對象的細胞的壽命在非培養條件下為1小時或30分鐘以下的短時間，因而只能進行創新藥物篩選等有限的應用，難以在利用吸管膜片鉗的細胞 的功能解析等中應用。進而，還難以將細胞良好地運輸並捕獲至設置於基板的微細貫通孔的部位。
宇理須和宇野在上述專利文獻3(申請號：日本特願2008-046145)和非專利文獻1中，提出了解決以上問題的平面膜片鉗裝置。該裝置的特徵性構成在於下述方面：使具有細胞固定力的細胞外基質形成物質(膠原、纖連蛋白等)附著在設置於基板的微細貫通孔的細胞固定用開口部的周邊，並且，在基板中貫通孔的兩側的表面部設置可對電極通電的貯液部，在該貯液部中填充導電性液體(例如細胞培養液)。根據該平面膜片鉗裝置，可以通過細胞外基質形成物質容易地將細胞捕獲至微細貫通孔的位置，而且，可在細胞的培養條件下用充分的時間進行離子通道活性的測定。
但是，進一步進行研究的結果表明，上述提出的平面膜片鉗裝置具有如以下1)、2)那樣的問題。
1)測量離子通道電流的微細貫通孔的周邊附著有細胞外基質形成物質，因而在捕獲的細胞的細胞膜與微細貫通孔周邊的基板表面之間產生輕微的間隙，即所謂的密封電阻降低。流過該間隙的電流相對於離子通道電流而作為漏電流加入，其變動時，則會作為噪音起作用。所以，在密封電阻降低的狀態中，即使是相對於輕微的施加膜電位的變動，噪音電流也會變大，離子通道電流的準確測量變得困難。
對於該問題，若單純地放棄細胞外基質形成物質的使 用，則會抹殺容易將細胞捕獲至微細貫通孔的位置的優點。另一方面，作為上述噪音電流對策，除了增大密封電阻之外，抑制電極側的施加膜電位的變動也是有效的。另外，在密封電阻原本就不低時，為了實現離子通道電流的更準確的測量，有效的是實施基於抑制施加膜電位變動的噪音電流對策。
2)被捕獲至微細貫通孔的位置的細胞在培養狀態下會不斷移動至偏離微細貫通孔的位置。由於這樣的細胞移動，導致無法測量離子通道電流。
因此，本發明應解決的第1課題在於，抑制平面膜片鉗裝置中的施加膜電位的變動，使噪音電流降低，從而使離子通道電流的準確測量成為可能。
進而，本發明應解決的第2課題在於，開發一種將捕獲至微細貫通孔的位置的培養狀態的細胞以不從該位置發生移動的方式固定的技術。
(第1發明的構成)
用於解決上述課題的第1發明的構成是平面膜片鉗裝置，其中，(1)電絕緣性基板設置有1個以上使其兩側的表面連通的、可使細胞不通過但使液體通過的內徑的微細貫通孔，(2)前述貫通孔的第一表面側與第二表面側分別設置有用於保持導電性液體的貯液部、與可對該貯液部的導電性液體通電地配置的電極部，(3)第一表面側 的貯液部作為細胞配置用的貯液部，進而(4)前述第一表面側和第二表面側的電極部具備以下(a)~(c)的要素。
(a)前述貯液部中導入導電性液體時與該導電性液體接觸的容器壁的至少一部分由無機多孔材料構成的電極容器。
(b)收納於上述電極容器內的、貴金屬(表示為“Nm”)的表層部形成有該貴金屬的氯化物NmCl層的電極。
(c)填充於上述電極容器內的、以飽和濃度溶解有前述貴金屬的氯化物NmCl和鹼金屬氯化物的電極溶液。
(第2發明的構成)
用於解決上述課題的第2發明的構成是平面膜片鉗裝置，其為前述第1發明前述的平面膜片鉗裝置，其中，第一表面側的貯液部包括由光不透射性的材料構成的用於配置細胞的主貯液池、配置有第一表面側的電極部的副貯液池、與使上述主貯液池和副貯液池連通的狹窄液體通路。
(第3發明的構成)
用於解決上述課題的第3發明的構成是平面膜片鉗裝置，其為前述第1發明或第2發明前述的平面膜片鉗裝置，其中，第二表面側的貯液部與用於導入和排出導電性液體的液體通路連通，並且，該液體通路配置有第二表面 側的電極部。
(第4發明的構成)
用於解決上述課題的第4發明的構成是平面膜片鉗裝置，其為前述第1發明~第3發明中任一項前述的平面膜片鉗裝置，其中，第一表面側設置有多個貯液部，這些貯液部中形成有凹部，該凹部具有比神經細胞的細胞體大的寬度和可以阻止培養狀態的細胞體的移動的深度。
(第5發明的構成)
用於解決上述課題的第5發明的構成是平面膜片鉗裝置，其中，前述第1發明~第4發明中任一項前述的平面膜片鉗裝置具備以下(A)和/或(B)的構成。
(A)第二表面側的貯液部與液體抽吸設備連接，可以通過該液體抽吸設備對第二表面側的貯液部負荷負壓。
(B)在基板的貫通孔的第一表面側的開口部周邊，附著有具有細胞固定力的細胞外基質形成物質。
(第6發明的構成)
用於解決上述課題的第6發明的構成是具備以下(a’)~(c’)的要素的平面膜片鉗裝置用電極部。
(a’)容器壁的至少一部分由無機多孔材料構成的電極容器。
(b’)收納於上述電極容器內的、貴金屬Nm的表層 部形成有該貴金屬的氯化物NmCl層的電極。
(c’)填充於上述電極容器的、以飽和濃度溶解有前述貴金屬的氯化物NmCl和鹼金屬氯化物的電極溶液。
(第7發明的構成)
用於解決上述課題的第7發明的構成是平面膜片鉗裝置用電極部，其為前述第6發明前述的平面膜片鉗裝置用電極部，其中，構成容器壁的至少一部分的無機多孔材料是多孔玻璃或多孔陶瓷。
(第8發明的構成)
用於解決上述課題的第8發明的構成是平面膜片鉗裝置用電極部，其為前述第6發明或第7發明前述的平面膜片鉗裝置用電極部，其中，貴金屬Nm為銀Ag或鉑Pt，鹼金屬氯化物為氯化鉀KCl。
(第9發明的構成)
用於解決上述課題的第9發明的構成是平面膜片鉗裝置用電極部，其為前述第6發明~第8發明中任一項前述的平面膜片鉗裝置用電極部，其中，電極為以下(C)或(D)。
(C)在電極容器內部突出的棒狀電極，其中，在由貴金屬Nm構成的芯材的表層部形成有貴金屬氯化物NmCl層。
(D)在電極容器的壁部的內周面形成的筒狀電極，其中，容器壁部側的底層為貴金屬Nm的蒸鍍層，與電極溶液接觸的表面層為貴金屬氯化物NmCl的蒸鍍層。
(第10發明的構成)
用於解決上述課題的第10發明的構成是細胞離子通道電流測量方法，其中，向前述第1發明~第5發明中任一項前述的平面膜片鉗裝置的第二表面側的貯液部導入導電性液體的同時，向第一表面側的貯液部中導入分散有作為測定對象的細胞的導電性液體，並使第一表面側的貯液部與第二表面側的貯液部導電性地連通，將前述細胞配置於第一表面側的貯液部的規定位置，在此基礎上對第一表面側和第二表面側的電極部的電極間施加電壓，測量作為測定物件的細胞的離子通道電流。
(第11發明的構成)
用於解決上述課題的第11發明的構成是細胞離子通道電流測量方法，其為前述第10發明前述的細胞離子通道電流測量方法，其中，平面膜片鉗裝置的基板的第一表面側設置有第4發明前述的構成的多個貯液部，作為測定對象的細胞為神經細胞，導電性液體為前述神經細胞的細胞培養液。
(第12發明的構成)
用於解決上述課題的第12發明的構成是細胞離子通道電流測量方法，其為前述第11發明前述的細胞離子通道電流測量方法，其中，神經細胞中預先導入有用於Ca成像的Ca探針，至少通過包括觀察細胞活動電位的發生時或活動電位的傳輸時產生的螢光的Ca成像的方式來測定該細胞離子通道電流。
(第13發明的構成)
用於解決上述課題的第13發明的構成是細胞離子通道電流測量方法，其是前述第12發明前述的細胞離子通道電流測量方法，其中，將導入有Ca探針的神經細胞多個或大量配置於前述平面膜片鉗裝置的第一表面側的同時，形成這些神經細胞的突觸相互連接而成的神經細胞網路，對它們中的單一的神經細胞注入電流或施加電壓，由此通過前述多個或大量神經細胞的前述Ca成像進行測定。
根據第1發明，除了可以通過平面膜片鉗裝置中通常的多點測量進行高通量篩選這一點之外，還可以抑制平面膜片鉗裝置中的施加膜電位的變動，使噪音電流降低，因而可進行離子通道電流的準確測量。
在實現細胞的離子通道電流的準確測量方面，平面膜片鉗裝置的密封電阻低的情形自不必說，在密封電阻不低 的情形也實施噪音電流對策是有效且重要的。作為噪音電流對策，除了增大密封電阻之外，抑制電極側的施加膜電位的變動也是有效的。
作為平面膜片鉗裝置的電極，使用貴金屬Nm(例如銀Ag)的表層部形成有該貴金屬的氯化物NmCl層(例如AgCl層)的電極時，如上前述的施加膜電位的變動主要是由AgCl/Ag電極的表面與包圍其的溶液之間的界面電位的變動、或液-液界面電位的變動造成的。
因此，如第1發明前述，在電極部的電極容器內中，將AgCl/Ag電極浸漬於作為AgCl和鹼金屬氯化物(例如KCl)的飽和溶液的電極溶液中，使其通過由無機多孔材料構成的容器壁與細胞培養液之類的導電性液體(KCl濃度為數毫莫耳左右)接觸時，電極容器的內部與外部成為電導通的狀態。但是，由於液體本身基本無法通過無機多孔材料的細孔，因而電極容器內部的電極溶液與電極容器外部的導電性液體的混合為可忽視程度的小。結果，電極容器的內部與外部的KCl的大的濃度差被保持恆定，AgCl/Ag電極的界面電位、或液-液界面電位變得恆定，從而不會引起施加膜電位的變動。
根據第2發明，在使用表達了以光打開通道的離子通道的細胞、利用光來控制通道電流的情形中，即使對第一表面側的貯液部中用於配置細胞的主貯液池照射光，照射光也基本不會到達通過狹窄液體通路與主貯液池連通的副貯液池，因而可防止照射光照射第一表面側的電極部所致 的不良情況。除該點之外，由電極部的電極容器稍微漏出的電極溶液，由於狹窄液體通路成為障礙，因而基本不會到達配置於主貯液池中的細胞的周圍。因此，關於第1發明，上述施加膜電位的變動得到更加徹底的防止。考慮該點時，連通主貯液池與副貯液池的液體通路特別優異為例如1mm以下的內徑。
根據第3發明，不僅可以容易且確實地對第二表面側的貯液部進行導電性液體的導入和排出，而且在使用表達了以光打開通道的離子通道的細胞、利用光來控制通道電流的情形中，即使對第一表面側的主貯液池照射光，第二表面側的電極部由於配置於與第二表面側的貯液部隔離的液體通路，因而可防止照射光照射第二表面側的電極部所致的不良情況。
根據第4發明，由於形成有作為細胞體設置區域的凹部，該凹部具有比神經細胞的細胞體大的寬度與可阻止培養狀態的細胞體的移動的深度，因而神經細胞一旦被配置於該凹部，則在培養狀態下也無法由該位置移動。
應予說明，第4發明中，進一步地，也可以將多個凹部用比細胞體小的寬度的溝相互連接。此時，培養狀態的多個神經細胞可以沿著寬度小的溝相互形成二維網路。結果，可以以高的時空解析度測定形成了二維網路的各神經細胞的離子通道電流。進一步較佳者可以同時多點地進行該測定。
第5發明的具備(A)的構成的平面膜片鉗裝置中， 使用液體抽吸設備對第二表面側的貯液部負荷負壓，由此可以通過基板的微細貫通孔，由第一表面側的貯液部抽吸導電性液體。因此，除了可以使分散於該導電性液體中的細胞固定於貫通孔的開口部這點之外，還使細胞膜與細胞外基質18塗佈表面的密合性提高，密封電阻提高。另外，第5發明的具有(B)的構成的平面膜片鉗裝置中，通過細胞外基質形成物質，可以使分散於第一表面側的導電性液體中的細胞固定於貫通孔的開口部。此時，在將細胞捕獲至平面膜片鉗裝置的規定位置的步驟中，不會增加可影響細胞的離子通道活性的應力。
第5發明的平面膜片鉗裝置中，可以具備(A)的構成，也可以具備(B)的構成，還可以同時具備(A)的構成與(B)的構成。
根據第6發明，提供用於安裝在第1發明~第5發明前述的平面膜片鉗裝置中的新型且有用的平面膜片鉗裝置用電極部。其效果如關於第1發明前述。
根據第7發明，提高構成平面膜片鉗裝置用電極部的電極容器壁的至少一部分的無機多孔材料的較佳實施方式。
根據第8發明，對於平面膜片鉗裝置用電極部的電極中使用的貴金屬，提供較佳的實施方式。
根據第9發明，關於平面膜片鉗裝置用電極部的電極的形狀和結構，提供較佳的實施方式。
根據第10發明，提供使用了第1發明~第5發明中 任一項前述的平面膜片鉗裝置的新型的細胞離子通道電流測量方法。該方法的效果如關於第1發明~第5發明前述，簡言之，最大效果在於下述方面，抑制平面膜片鉗裝置中的施加膜電位的變動，使噪音電流降低，從而使離子通道電流的準確測量成為可能。
根據第11發明，在第10發明前述的細胞離子通道電流測量方法中，提供使用神經細胞時的優異的離子通道電流測量方法，特別地，可以以高的時空解析度測定形成了二維網路的各神經細胞的離子通道電流，進而可以同時多點進行該測定。
根據第12發明，除了如第10發明、第11發明的離子通道電流的準確測量之外，還可獲得下述重大優點：可利用平面膜片鉗裝置的基板上方的空間，進行對於神經細胞或其網路的功能解析重要的Ca成像。
根據第13發明，通過對存在於平面膜片鉗裝置的基板的微細貫通孔上的單一神經細胞(第1神經細胞)注入電流或施加電壓進行刺激，可以使活動電位發生，同時可以通過Ca成像來測量該活動電位通過神經細胞網路而傳輸至相鄰的周圍的神經細胞(第2神經細胞)，進而由第2神經細胞傳輸至與之相鄰的第3神經細胞的情況。作為現有技術，有例如電極刺激法，但該方法的情形中難以選擇性地刺激單一的神經細胞，解析變得複雜。另外，作為其它現有技術的利用微吸管電極進行刺激，雖然可以選擇性地刺激單一的神經細胞，但高通量篩選所需的多通道化 困難，而根據第13發明，可將測量部非常小型化，因而多通道化容易。
接著，對包含其最佳方式的本發明的實施方式進行說明。本發明的技術的範圍並不受這些實施方式的限定。
〔平面膜片鉗裝置〕
本發明前述的平面膜片鉗裝置中，設置有連通作為其電絕緣性基板的兩側的表面的第一表面側(配置細胞的表面側)與第二表面側的微細貫通孔。應予說明的是，實施例中例示了使基板取向為水平方向的橫置型的平面膜片鉗裝置，但使基板取向為其它方向的平面膜片鉗裝置，例如，將基板設置於垂直方向的垂直放置型的平面膜片鉗裝置也包含於本發明中。
作為電絕緣性的基板，可以較佳地使用玻璃製、陶瓷製、塑膠製等的基板。作為一例，在使用矽基板的情形中，較佳為具有第一表面側的矽層、中間的氧化矽層、與第二表面側的矽層依次層疊的結構的矽基板(SOI基板)。這種層疊結構的矽基板中，絕緣性極高的中間層存在於兩矽層之間，因而在測定物件細胞的離子通道關閉時可確保高電阻狀態，可降低背景的噪音。
設置於基板的貫通孔的個數沒有限定，可以是1個，特別較佳為多個~大量(例如，2個~數十個，或其以 上)。微細貫通孔的內徑較佳為使液體通過但使細胞不通過程度的內徑(例如為1~3μm左右)，但並不限定於這些內徑。
另外，本發明前述的平面膜片鉗裝置中，前述貫通孔的第一表面側與第二表面側中，分別設置有用於保持導電性液體的貯液部、與可對該貯液部的導電性液體通電地配置的電極部。
貯液部的構成只要滿足“可以配置為保持導電性液體，並且可使電極部對導電性液體通電”的要求，則對構成沒有限定，例如，可以如實施例所示，在基板的第一表面側與第二表面側分別重疊間隔體構件、板構件，在間隔體構件中在對應於基板的貫通孔的位置設置切槽部，由此來形成。
雖然不必限定，但第一表面側的間隔體構件和板構件較佳由光不透射性的材料構成，第二表面側的間隔體構件和板構件較佳者係由光透射性的材料構成。
貯液部在其自身液密性地構成的同時，還具備用於導入或排出導電性液體(或分散有細胞的導電性液體)的液體通路或可開閉的開口部。平面膜片鉗裝置為使基板取向於水平方向的橫置型時，基板的第一表面側的貯液部也可以將該貯液部的上部用蓋玻璃之類的蓋用構件塞上，並根據需要拆去蓋用構件而使貯液部開口。
本發明前述的平面膜片鉗裝置中，第一表面側和第二表面側具備新的構成的電極部，這一點在之後“平面膜片 鉗裝置用電極部”一項中進行敘述。
進而，本發明前述的平面膜片鉗裝置中，還較佳為形成下述構成，其中，前述第一表面側的貯液部包括由光不透射性的材料構成的用於配置細胞的主貯液池、配置有第一表面側的電極部的副貯液池、與使上述貯液池連通的狹窄液體通路。另外，還更佳為為下述構成，其中，前述第二表面側的貯液部與用於導入和排出導電性液體的液體通路連通，並且，該液體通路配置有第二表面側的電極部。特別優異的是，在前述第一表面側設置多個貯液部，這些貯液部中可形成凹部，該凹部具有比神經細胞的細胞體大的寬度與可阻止培養狀態的細胞體的移動的深度。進而，還可以將這些多個凹部用寬度比細胞體小的溝相互連接。另外，還較佳為使平面膜片鉗裝置具備以下(A)和/或(B)的構成。
(A)第二表面側的貯液部與液體抽吸設備連接，可以通過該液體抽吸設備對第二表面側的貯液部負荷負壓。
(B)在基板的貫通孔中的第一表面側的開口部周邊，附著有具有細胞固定力的細胞外基質形成物質。
作為上述細胞外基質形成物質的構成材料，例示有聚賴氨酸、膠原(I型、II型、IV型)、蛋白多糖、纖連蛋白、層黏連蛋白、膠原、蛋白多糖(多能蛋白多糖、核心蛋白多糖等)、蛋白多糖(聚集素)、連接蛋白、巢蛋白、腱生蛋白、蛋白多糖〔硫酸軟骨素蛋白多糖、硫酸乙醯肝素蛋白多醣(串珠素等)、硫酸角質素蛋白多糖、硫 酸皮膚素蛋白多糖〕、透明質酸(糖胺聚醣的一種)、彈性蛋白、纖維蛋白等。
〔平面膜片鉗裝置用電極部〕
進而，本發明前述的平面膜片鉗裝置用電極部具備以下(a’)~(c’)的要素，並設置於第一表面側和第二表面側。
(a’)容器壁的至少一部分由無機多孔材料構成的電極容器。
(b’)收納於上述電極容器內的、貴金屬Nm的表層部形成有該貴金屬的氯化物NmCl層的電極。
(c’)填充於上述電極容器的、以飽和濃度溶解有前述貴金屬的氯化物NmCl和鹼金屬氯化物的電極溶液。
上述的貴金屬Nm的種類沒有限定，較佳為銀Ag和鉑Pt，特別優異為銀Ag。因此，作為貴金屬的氯化物NmCl，較佳為銀的氯化物AgCl和鉑的氯化物AgCl，特別優異為銀的氯化物AgCl。另外，作為鹼金屬氯化物，沒有限定，較佳為氯化鉀KCl。構成容器壁的至少一部分的無機多孔材料較佳為多孔玻璃或多孔陶瓷。
進而，還更佳為前述電極部中的電極為以下(C)或(D)。
(C)在電極容器內部突出的棒狀電極，其中，在由貴金屬Nm構成的芯材的表層部形成有貴金屬氯化物NmCl層。
(D)在電極容器的壁部的內周面形成的筒狀電極，其中，容器壁部側的底層為貴金屬Nm的蒸鍍層，與電極溶液接觸的表面層為貴金屬氯化物NmCl的蒸鍍層。
〔細胞離子通道電流測量方法〕
本發明前述的細胞離子通道電流測量方法是下述方法，其中，使用上述記載的各種方式前述的平面膜片鉗裝置，向其第二表面側的貯液部導入導電性液體的同時，向第一表面側的貯液部中導入分散有作為測定對象的細胞的導電性液體，並使第一表面側的貯液部與第二表面側的貯液部導電性地連通，將前述細胞配置於第一表面側的貯液部的規定位置，在此基礎上對第一表面側和第二表面側的電極部的電極間施加電壓，測量作為測定物件的細胞的離子通道電流。
此時，在平面膜片鉗裝置的基板的第一表面側設置多個貯液部，作為測定對象的細胞為神經細胞，導電性液體為前述神經細胞的細胞培養液的情形，是特別特徵性的實施方式。
(Ca成像)
測量細胞的離子通道電流的方式或系統沒有特別限定，例如，可以進行通常的電流測量，作為進一步較佳的方式，可舉出Ca成像(鈣成像)。Ca成像特別是在多個至大量神經細胞網路的解析中有效。
Ca成像如周知那樣，是指將與Ca離子結合而發出螢光的色素(被稱為“Ca螢光指示劑”或“Ca探針”)導入細胞內，將在神經細胞中發生活動電位時Ca離子流入細胞體的現象以螢光的方式進行捕捉的方法。
細胞，特別是神經細胞的離子通道電流的測量中，對於Ca成像有效的原因，如前述“發明效果”一項中關於第12發明和第13發明前述。
實施例
以下對本發明的實施例進行說明。本發明技術範圍並不受以下的實施例限定。
〔第1實施例〕
本實施例係關於的平面膜片鉗裝置示於圖1。該裝置是作為離子通道生物感測器發揮功能的培養型的平面膜片鉗裝置。
作為平面膜片鉗裝置中的電絕緣性的基板1，使用矽基板(非專利文獻1)。圖1中，在基板1構成了單一的平面膜片鉗裝置，但也可以使用更大面積的基板1，構成多個平面膜片鉗裝置。
基板1中，設置有使其第一表面側(圖的上側)與第二表面側(圖的下側)連通的、直徑1~3μm的微細貫通孔19。圖1中，貫通孔19是在基板1的中央設置1個，但也可以使用更大的基板設置多個貫通孔19，相對於這些 各貫通孔19，各自可以如下前述構成。貫通孔19的第一表面側的開口部上配置有細胞12。
對於基板1，將其第一表面側與第二表面側用1對間隔體2、3夾持。間隔體2、3的構成材料沒有限定。但是，對於第一表面側的間隔體2，較佳為具有彈性的光不透射性的材料，例如，可以使用矽橡膠或PDMS(polydimethylesiloxane，聚二甲基矽氧烷)等。另一方面，對於第二表面側的間隔體3，可較佳地使用光透射性的材料。
間隔體2中的上述細胞12的配置部分中，設置有例如圓形的切槽部，將細胞12配置於該切槽部。間隔體3中，在與間隔體2對應的部分設置有例如圓形的切槽部，貫通孔19的第二表面側的開口部開口於該切槽部。
而且，上述基板1和1對間隔體2、3的整體形成被1對結實的板4、5所緊固的結構。作為板4、5的材料，只要是能耐受120℃左右的高壓釜滅菌的材料，則沒有特別限定。但是，對於第一表面側的板4，可較佳地使用光不透射性的材料。另一方面，對於第二表面側的板5，可較佳地使用光透射性的材料。
以上的構成中，在第一表面側的板4的中央部，對應於第一表面側的間隔體2的上述切槽部，在同樣的位置設置有同樣大小的例如圓形的切槽部。在設置於板4的中央部的切槽部的周邊，可以形成板的厚度的薄的凹部狀的階梯部，在該階梯部設置蓋玻璃之類的蓋用構件(圖示省 略)，由此使上述間隔體2中的切槽部的開口構成為可以開閉。這樣，在第一表面側構成主貯液池6。
另一方面，將第二表面側的間隔體3中的切槽部的開口利用板5塞上，由此形成第二表面側的貯液部9。設置於第一表面側的主貯液池6、與第二表面側的貯液部9通過貫通孔19連通。
主貯液池6構成第一表面側的貯液部的第1區域，相對於該主貯液池6，將通過設置於間隔體2的狹窄液體通路8連通的空間作為構成第一表面側的貯液部的第2區域的副貯液池7。副貯液池7是由共通地設置於間隔體2和板4的孔形成的。副貯液池7中配置有後述的第一表面側的電極部。
通過主貯液池6、液體通路8和副貯液池7構成的第一表面側的貯液部中，導入．保持有導電性液體。該導電性液體中可以分散有作為測定物件的細胞。作為導入的導電性液體，可以使用140mM NaCl，3mM KCl，10mM 4-(2-羥乙基)-1-呱嗪乙磺酸(HEPES)，2.5mM CaCl2，1.25mM MgCl2和10mM葡萄糖(用HCl調節pH 7.4)等緩衝液、或添加了10%(v/v)FBS、1%(v/v)GlutamaxTM(Gibco)的Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM：Sigma)的培養細胞的培養基等。這些導電性液體的組成可根據細胞的種類適宜改變。
第二表面側的貯液部9中，導入40mM CsCl，80mM CsCH3SO4，1mM MgCl2，10mM HEPES，2.5mM MgATP， 0.2mM Na2EGTA，(pH7.4)等被稱為吹打溶液的緩衝液、或培養細胞的培養基等。相對於貯液部9的導電性液體的導入通過管狀的導入用液體通路10來進行，其排出通過排出用液體通路11來進行。本實施例中，作為導入用液體通路10和排出用液體通路11，使用了外徑1mm、內徑0.5mm的PEEK製的管，但對於這些液體通路的構成材料，只要是可耐受120℃左右下的高壓釜滅菌的材料，則也可以使用其它材料。
排出用液體通路11中，設置有與第一表面側的電極部相同地構成的第二表面側的電極部。通常，第一表面側的電極部的電極被接地，第二表面側的電極部的電極被施加膜電壓。
在將分散有細胞12的導電性液體導入主貯液池6中時，為了將細胞12配置於圖1所示的貫通孔19的開口位置，例如，如第2實施例中前述，若通過與第二表面側的貯液部9連接的液體抽吸設備抽吸貯液部9的導電性液體，則也會通過貫通孔19抽吸主貯液池6的導電性液體，因而將細胞12配置於上述位置。進一步地，此時可通過抽吸壓力在與貫通孔19相接的部分的細胞12的細胞膜形成微細的孔。在細胞膜形成這樣的孔時，另外還存在將溶解有制真菌素、兩性黴素B等細胞膜穿孔性抗生素的溶液從導入用液體通路10導入第二表面側的貯液部9的方法。在細胞膜形成這樣的孔時，第二表面側的貯液部9成為與細胞內電導通的狀態(非專利文獻1)。
另一方面，培養型的平面膜片鉗裝置的情形中，作為將細胞12配置於圖1所示的貫通孔19的開口位置的方式，還可以使具有細胞固定力的細胞外基質形成物質18附著於基板1的貫通孔19中的第一表面側的開口部周邊。
以上的構成中，細胞12中表達有規定的離子通道，將打開該離子通道的刺激物質加入第一表面側的貯液部時，離子通道打開，在第一表面側的電極部與第二表面側的電極部間，產生對應於施加電壓的通道電流。此時，細胞12的細胞膜與基板1之間存在間隙時，密封電阻降低，漏電流會重疊於通道電流中。
由於實際施加於電極間的電壓重疊有空間中存在的電磁波造成的誘導電壓、電極金屬表面與包圍其的緩衝液之間的界面電位、或液/液界面電位，因而膜電位會分別對應於誘導雜訊或界面電位的變動造成的漏電流而發生變動。因此，相對於離子通道電流，表現為稱作基線變動的雜訊。將這些基線變動雜訊電流、和離子通道電流，作為密封電阻與膜電位的變動電壓△Vm的函數示於圖2。
如由圖2明確可知，在可容易地獲得千兆歐姆以上的密封電阻的吸管膜片鉗中，即使膜電位的變動△Vm較大，基線變動雜訊的影響也為可忽視程度地小，但在密封電阻較小的(~10MΩ)培養型平面膜片鉗中，則需要將該膜電位的變動△Vm減小。本發明開發膜電位的變動小而穩定的電極，大幅減小△Vm，提供即使密封電阻小也可 將雜訊電流抑制小地進行測量的平面膜片鉗技術。
第一表面側和第二表面側的電極部的具體結構示於圖3。內徑1mm的由Pyrex(註册商標)玻璃構成的筒狀的電極容器13的內部填滿以飽和濃度溶解有KCl和AgCl的電極溶液14。添加的KCl濃度為3.3M/L，AgCl為約1.1mM/L。應予說明的是，KCl的情形，飽和濃度在常溫為約3.3M/L。收納於電極容器13內的AgCl/Ag電極15中，在銀線的表面塗佈有AgCl。這樣的AgCl/Ag電極15可以將AgCl粉末塗佈於銀線的表面來形成，或將銀線浸漬於含次氯酸鈉的漂白劑等中來製作。另外，還可以通過KCl溶液中的電鍍來製作。
電極容器13的前端部用多孔玻璃、多孔陶瓷等無機多孔材料16塞上。作為無機多孔材料16，實際上使用了維克玻璃(康寧公司製造)。這樣，構成電極容器13的容器壁的一部分的無機多孔材料16的前端浸漬於導電性液體(細胞培養液或緩衝液)中。導電性液體中的KCl濃度為數毫莫耳，但由於該無機多孔材料16的效果，電極容器13的容器內與容器外為電導通的狀態，同時電極溶液14與容器外的導電性液體的混合為可以忽視程度的小，因而容器內與容器外的大的KCl濃度差被保持恆定，由此AgCl/Ag電極15的界面電位、液/液界面電位被保持恆定。電極容器13的基端部被密封材料20所密封，電極針17從此處突出。
實際製作的電極部的照片示於圖4。圖4的上側的照 片是第二表面側的電極部，是安裝了用於連接圖1所示的排出用液體通路11的管接頭的狀態，其中，無機多孔材料16在管接頭的管路內露出。圖4的下側的照片是第一表面側的電極部，如圖1所示設置有副貯液池7。
在使用表達了以光打開通道的離子通道的細胞，控制通道電流的情形中，只要如上前述配置第一表面側和第二表面側的電極部，則由於第一表面側的貯液部通過光不透射性的間隔體2、板4形成，因而照射至主貯液池6的照射光不會照射到第一表面側和第二表面側的電極部的AgCl/Ag電極。另外，主貯液池6中設置有細胞，細胞的外部的導電性液體的鉀離子濃度為數mM程度的小，因而可以說是微量，理想的是可抑制由電極部漏出的KCl的影響，因而對於第一表面側的貯液部，除了主貯液池6之外還設置副貯液池7，將上述主貯液池6和副貯液池7用寬1mm以下的狹窄液體通路8連結。
為了調查本發明前述的平面膜片鉗裝置用電極部的效果，對使用了以往通常的AgCl/Ag電極的情形，和使用本發明的電極部的情形中的施加電壓0mV下的電流變動進行了比較，結果示於圖5。將貫通孔19的直徑為約2μm的矽基板固定於圖1的平面膜片鉗裝置，在不設置細胞12的狀態下，以施加電壓0mV測量電流變動。貫通孔19的電阻為約2MΩ，因而對以往的AgCl/Ag電極來說，存在約0.5mV的緩慢的界面電位變動，這使得基線大幅變動，而對於本發明的電極部來說，界面電位變動為可忽視程度 地小。測定通過Axopatch200B(Molecular Devices公司)來進行。圖5的括弧內表示測量時的Axopatch 200 B的低通濾波器的頻率。如圖所示，本發明的電極的穩定化效果極大。
〔第2實施例〕
第2實施例前述的平面膜片鉗裝置的主要部分示於圖6(a)。裝置的構成基本與圖1相同，只是基板1的微細貫通孔19的附近結構不同。即，基板1的貫通孔19中的第一表面側的開口部中，形成有凹部24作為細胞體配置區域，該凹部24具有比細胞體大的寬度與可阻止培養狀態的細胞體的移動的深度。
培養型的平面型膜片鉗裝置中，即使將細胞設置於貫通孔之上，細胞也會在培養中不斷發生移動，密封電阻發生變動，或者細胞由孔偏離，感測器操作本身有時會不再工作。本實施例中則是將比細胞的尺寸稍大的凹部24形成於貫通孔19的開口部，並形成下述結構，以使一旦將細胞設置於該凹部24，則在培養中細胞無法移動。通常的細胞大小的長徑為10~30μm左右，因而作為凹部24的尺寸，雖根據細胞的種類而不同，但與細胞的長徑相比，對直徑來說，可以為10~30μm左右的稍大的圓形或矩形的平面形狀。凹部的深度也取決於細胞的大小，但通常只要為5~12μm左右，則可充分實現目的。凹部24的底部還較佳地塗佈具有細胞固定力的細胞外基質形成物質18。
作為細胞外基質形成物質18，對於神經細胞或PC12細胞，適宜的是聚L-賴氨酸或聚D-賴氨酸、層黏連蛋白等，另外，對於HEK293細胞，適宜的是膠原IV或纖連蛋白。
形成上述那樣的凹部24的圖案時，在基板1為Si或玻璃、陶瓷的情形中，可以用旋塗器塗佈相當於凹部24的深度的厚度的光致抗蝕劑，使用規定的光掩膜進行曝光成像，由此容易地形成。另外，基板1為塑膠的情形中，可容易地通過熱擠壓加工或注射成型來形成。
在作為測定對象的細胞12為神經細胞的情形中，除了圓形或矩形的凹部24之外，特別優異為以從凹部24延伸的狀態形成軸突、樹突可延伸那樣的細溝(例如，以凹部24為中心，放射狀地延伸設置多條細溝)。進一步地，以神經細胞為測定物件時，有時特別優異為的是在基板1設置多個凹部24的同時，用上述的細溝將這些多個凹部24間相互連接，由此在培養中形成神經細胞的網路。
本實施例中具有下述結構：將細胞設置於凹部24時，通過與第二表面側的貯液部9連通的抽吸管21，利用抽吸泵23進行抽吸，可以對第二表面側的貯液部9負荷負壓。抽吸管21的規定的部分設置有用於測量該負壓的負壓測定壓力計22。該抽吸管21還可以兼作第1實施例中前述的排出用液體通路11。雖然並不是必須設置這樣的抽吸裝置，但設置抽吸裝置時，考慮到細胞的種類，適於 抽吸的負壓通常設定為0.01氣壓~0.5氣壓左右。
包括上述細溝，形成了凹部24的例子示於圖6(b)。此時，在細溝的交點，利用具有直徑30~50μm的圓形圖案的格子狀圖案的鎳模具，通過熱壓花形成了凹部24與細溝。
實際上，用抽吸泵23抽吸，以使HEK293細胞來到貫通孔19的部位，對第二表面側的貯液部9負荷-0.2氣壓~-0.5氣壓的負壓的同時，接種細胞。此時，在凹部24之外的部位也接種有細胞，這從細胞培養的觀點出發，反而較佳。這樣，根據形成有凹部24的本實施例，可以測量非常穩定的離子通道電流。應予說明，凹部24由於是為了防止細胞的移動，因而作為其形狀，並不限於如圖6(a)所示的底面與側壁部成直角的矩形的剖面形狀，剖面也可以是半圓形或半橢圓形的(例如碗狀)剖面形狀。
應予說明，在細胞接種時之外，也具有設置抽吸泵23的效果。即，在通道電流測量時進行抽吸，對第二表面側的貯液部9施加負壓，由此細胞通過微細貫通孔19，被抽向貯液部9，結果細胞膜與細胞外基質18塗佈表面的密合性提高，密封電阻提高。即，具有可以降低離子通道電流的測量中的雜訊的效果。該效果的提高程度取決於細胞的大小或貫通孔19的位置與細胞位置的相對關係而有各種不同，大概的負壓的適當值為0.01~0.5氣壓，由此可實現2倍至10倍的密封電阻的提高。
〔第3實施例〕
如上前述使用具備凹部24的基板1，使用在基板1的第二表面側的貯液部9具備與之連通的液體負壓施加用的抽吸機構、其它方面為圖1所示的構成的培養型平面膜片鉗裝置，測量細胞的離子通道電流。作為基板1，使用與圖5所示的用於測量的相同的矽基板。作為細胞，使用(a)表達了通道視紫質2(ChR2)的C2C12細胞、與(b)表達了通道視紫質寬受體(ChR-WR)的HEK293細胞。已知這些離子通道是通過藍色的光打開通道(ChR2：Philipp Schoenenberger et al,Brain Cell Biology 36(2008)119,ChR-WR：Hongxia Wang,et al,J.Biol.Chem.,284(2009)5685)。
作為刺激用的光源，使用波長473nm的鐳射。施加膜電位對於(a)、(b)從低至高均為：-60、-30、-20、-10、20、30、50和70mV。照射鐳射功率為約2mW，鐳射集束為直徑約50μm。測量結果如圖7所示，(a)、(b)的任一情形中，通過本發明前述的電極部的效果，儘管密封電阻低、為10MΩ，也以良好的S/N比成功實現通道電流的測量。
〔第4實施例〕
基於圖8對本發明的第4實施例進行說明。圖8(a)為平面膜片鉗裝置的正面剖面圖，在將剖面示於圖的中央的基板上，圖示有左側的第1神經細胞12a與右側的第2 神經細胞12b。這些神經細胞12a、12b實際上配置於前述凹部24中，凹部24間通過細溝連接，為了方便圖示，省略了凹部24、細溝的圖示。而且，通過圖示省略的細溝，第1神經細胞12a與第2神經細胞12b利用軸突與突觸連接。
從作為本發明的AgCl/Ag穩定電極的下部電極(第2表面側的電極)施加電壓，向設置於微細貫通孔上的第1神經細胞12a注入電流，由此使神經細胞12a發生活動電位。該活動電位沿軸突傳輸，誘發突觸中的神經傳導物質的釋放，進而誘發突觸後膜表面的受體蛋白對神經傳導物質的接受引起的離子的流入，以及由此引起的相鄰的第2神經細胞12b中的活動電位發生。由此，觀察到Ca離子向相鄰的第2神經細胞12b中的流入，預先導入至神經細胞中的Ca探針的螢光的脈衝狀發光的一系列過程。
即是下述系統構成的應用的實施例，其中，使用本發明的裝置，在第1神經細胞12a發生活動電位，經由軸突與突觸，在相鄰的第2神經細胞12b接受該活動電位的傳輸。
作為平面膜片鉗裝置的基板，使用了表面具有直徑2微米的微細貫通孔的聚甲基丙烯酸酯(PMMA)基板。將基板表面預先以作為細胞外基質的聚L賴氨酸塗佈，在該表面以3×102至6×103/mm2的密度接種由大鼠大腦皮質採集的神經細胞，形成神經細胞網路。直到網路形成，基板的上部和下部的貯液池用神經細胞的培養基填滿，在將Ca 探針導入神經細胞、由微細貫通孔進行電流注入的時刻，將上部下部分別替換成細胞外液、細胞內液的緩衝液。
本實施例中，如圖8(a)所示，需要將任意一個神經細胞12a配置於微細貫通孔之上。其它的例如圖示的神經細胞12b等不需要配置於微細貫通孔上，但只要不進行電流注入或電壓施加，則也可以配置於微細貫通孔上。作為可容易地由本發明的基本構成類推的情況，在神經細胞12b也配置於微細貫通孔上的構成中，這裡，只要將本發明的穩定電極以與神經細胞12a側的貯液部為電絕緣的形態，配置於神經細胞12b附近的基板的上部(第一表面側)與下部(第二表面側)，由於到達神經細胞12b的活動電位的影響，離子通道電流在此處發生，因此將該電流不僅通過Ca成像進行測量，同時還容易實現以神經細胞12b的離子通道電流的形式進行測量。
該神經細胞網路設定為可以通過螢光顯微鏡進行觀測，進而還設定為可通過CCD相機觀測由顯微鏡觀察到的圖像。該設定中，對下部側的電極施加脈衝寬度短的電流脈衝或電壓脈衝。
本實施例中，將脈衝寬度1豪秒、700pA的電流由下部電極注入微細貫通孔上的神經細胞12a中時，活動電位在該神經細胞12a中發生。神經細胞12a和12b中預先導入有Ca成像用的Ca探針。本實施例中，將被稱作OregonGreen Bapta-1的Ca探針用的色素溶液以規定的步驟導入細胞內。只要是Ca成像用的色素，其它色素也可 以獲得相同的效果。
由於活動電位在微細貫通孔上的神經細胞12a發生，Ca離子流入該細胞體，因此圖8(b)的上側的標記為“細胞1”的圖中所示的脈衝狀的信號輸出可作為CCD輸出的形式得到。進而，該活動電位沿神經細胞12a的軸突傳輸，經由突觸傳輸至相鄰的神經細胞12b，誘發Ca離子對該細胞的流入。結果，該神經細胞12b的Ca探針的螢光強度暫態增大，可得到與標記為“細胞1”的上側的圖的信號同時發生的神經細胞12b的信號(標記為“細胞2”的下側的圖)。
本實施例顯示本發明可以應用於神經細胞網路的高通量篩選裝置。經由軸突的神經細胞間的信號傳輸是神經細胞網路的基本特性，因而可通過本實施例的系統實現與該基本特性的變差或恢復等相關的藥劑的性能評價。進而，由於本發明的裝置自身與吸管膜片鉗相比為非常小型，因此高通量裝置構成所需的多通道化容易。
產業實用性
根據本發明，提供抑制施加膜電位的變動，使噪音電流降低，以使細胞離子通道電流的準確測量成為可能的平面膜片鉗裝置。
更具體地，培養型平面膜片鉗裝置適於要求培養的神經細胞的高通量篩選。近年來，神經細胞網路的功能解析、高通量篩選的必要性、特別是利用通道電流測量的裝 置的必要性在國際上也不斷增高，但尚未報導成功例(Jonathan Erickson et al.,Journal of Neuroscience Methods,175,(2008)1-16等)。本發明的電極部在用於使用神經細胞網路的功能解析用平面膜片鉗裝置、神經細胞的測量離子通道電流的方式的高通量篩選裝置的電流測量用的電極中時，可以實現迄今為止難以實現的上述裝置。
1‧‧‧基板
2、3‧‧‧間隔體
4、5‧‧‧板
6‧‧‧主貯液池
7‧‧‧副貯液池
8‧‧‧液體通路
9‧‧‧貯液部
10‧‧‧導入用液體通路
11‧‧‧排出用液體通路
12‧‧‧細胞
12a‧‧‧第1神經細胞
12b‧‧‧第2神經細胞
13‧‧‧電極容器
14‧‧‧電極溶液
15‧‧‧AgCl/Ag電極
16‧‧‧無機多孔材料
17‧‧‧電極針
18‧‧‧細胞外基質形成物質
19‧‧‧貫通孔
20‧‧‧密封材料
21‧‧‧抽吸管
22‧‧‧負壓測定壓力計
23‧‧‧抽吸泵
24‧‧‧凹部
[圖1]表示第1實施例前述的平面膜片鉗裝置的剖面圖。
[圖2]將雜訊電流與離子通道電流作為密封電阻與膜電位的變動電壓△Vm的函數表示。
[圖3]將第1實施例前述的電極部的具體結構用剖面圖表示。
[圖4]表示第1實施例中實際製作的電極部的照片。
[圖5]表示使用以往的AgCl/Ag電極(表示為“普通AgCl/Ag電極”)的情形與使用本發明的電極部(表示為“穩定AgCl/Ag電極”)的情形的施加電壓0mV下的電流變動的測量結果。
[圖6]圖6(a)表示第2實施例前述的平面膜片鉗裝置的主要部分剖面圖，圖6(b)表示多個圓形的凹部24、與將它們相互連接的細溝的平面圖。
[圖7]表示第3實施例中的離子通道電流的測量結 果。
[圖8]圖示關於神經細胞網路的Ca成像的第4實施例。
1‧‧‧基板
2、3‧‧‧間隔體
4、5‧‧‧板
6‧‧‧主貯液池
7‧‧‧副貯液池
8‧‧‧液體通路
9‧‧‧貯液部
10‧‧‧導入用液體通路
11‧‧‧排出用液體通路
12‧‧‧細胞
13‧‧‧電極容器
14‧‧‧電極溶液
15‧‧‧AgCl/Ag電極
16‧‧‧無機多孔材料
17‧‧‧電極針
18‧‧‧細胞外基質形成物質
19‧‧‧貫通孔

Claims (9)

  1. 一種形成神經細胞網路之神經細胞用的培養型平面膜片鉗裝置，其特徵為：(1)電絕緣性基板設置有1個以上使其兩側的表面連通的、可使細胞不通過但使液體通過的微細貫通孔，(2)前述貫通孔的第一表面側與第二表面側分別設置有用於保持導電性液體的貯液部、與可對該貯液部的導電性液體通電地配置的電極部，(3)第一表面側的貯液部作為細胞配置用的貯液部，(4)前述第一表面側和第二表面側的電極部具備以下(a)~(c)的要素：(a)前述貯液部中導入導電性液體時與該導電性液體接觸的容器壁的至少一部分係由電極容器內部的電極溶液與電極容器外部的導電性液體的混合為可忽視程度的小之無機多孔材料所構成的電極容器，(b)收納於上述電極容器內的、貴金屬Nm的表層部形成有該貴金屬的氯化物NmCl層的電極，(c)填充於上述電極容器內的、以飽和濃度溶解有前述貴金屬的氯化物NmCl和鹼金屬氯化物的電極溶液；進而(5)於前述電絕緣性基板的貫通孔之第一表面側的開口部周緣被附著細胞外基質形成物質，在把細胞設置於貫通孔之上的狀態下，具有未滿10MΩ之密封電阻。
  2. 如申請專利範圍第1項之平面膜片鉗裝置，其中前述第一表面側的貯液部包括由光不透射性的材料構成的 用於配置細胞的第1貯液池、配置有第一表面側的電極部的第2貯液池、與使上述主貯液池和副貯液池連通的狹窄液體通路。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之平面膜片鉗裝置，其中前述第二表面側的貯液部與用於導入和排出導電性液體的液體通路連通，並且，該液體通路配置有第二表面側的電極部。
  4. 如申請專利範圍第1或2項之平面膜片鉗裝置，其中前述第一表面側設置有多個貯液部，這些貯液部中形成有凹部，該凹部具有比神經細胞的細胞體大的寬度與可以阻止培養狀態的細胞體的移動的深度。
  5. 如申請專利範圍第1或2項之平面膜片鉗裝置，其中前述平面膜片鉗裝置具備以下(A)和/或(B)的構成：(A)第二表面側的貯液部與液體抽吸設備連接，可以通過該液體抽吸設備對第二表面側的貯液部負荷負壓，(B)在基板的貫通孔中的第一表面側的開口部周邊，附著有具有細胞固定力的細胞外基質形成物質。
  6. 一種細胞離子通道電流測量方法，其特徵在於，向申請專利範圍第1~5項之任一項前述的平面膜片鉗裝置的第二表面側的貯液部導入導電性液體的同時，向第一表面側的貯液部導入分散有作為測定對象的細胞的導電性液體，並使第一表面側的貯液部與第二表面側的貯液部導電性地連通，將前述細胞配置於第一表面側的貯液部的規 定位置的狀態下，在此基礎上對第一表面側和第二表面側的電極部的電極間施加電壓，測量作為測定物件的細胞的離子通道電流。
  7. 如申請專利範圍第6項之細胞離子通道電流測量方法，其中前述平面膜片鉗裝置的基板的第一表面側設置有多個貯液部，於這些貯液部形成具有比神經細胞的細胞體更大的寬幅與可阻止培養狀態的細胞體移動的深度之凹部，作為測定對象的細胞是神經細胞，導電性液體是前述神經細胞的細胞培養液。
  8. 如申請專利範圍第7項之細胞離子通道電流測量方法，其中前述神經細胞中預先導入有用於Ca成像的Ca探針，至少通過包括觀察細胞活動電位的發生時或活動電位的傳輸時產生的螢光的Ca成像的方式來測定該細胞離子通道電流。
  9. 如申請專利範圍第8項之細胞離子通道電流測量方法，其中將導入有前述Ca探針的神經細胞多個或大量配置於前述平面膜片鉗裝置的第一表面側的同時，形成這些神經細胞的突觸相互連接而成的神經細胞網路，對它們中的單一的神經細胞注入電流或施加電壓，由此通過前述多個或大量神經細胞的前述Ca成像來進行測定。
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104419642B (zh) * 2013-08-22 2016-12-28 中国科学院沈阳自动化研究所 一种细胞生理信息检测系统及其检测方法
JP6377063B2 (ja) * 2013-08-30 2018-08-22 国立研究開発法人科学技術振興機構 プレーナーパッチクランプ装置及びプレーナーパッチクランプシステム
CN106103690B (zh) * 2014-01-22 2019-06-18 分子装置有限公司 用于电生理学的可更换的接地电极、电极再生设备以及相关方法和系统
JP6624933B2 (ja) * 2014-01-24 2019-12-25 国立研究開発法人科学技術振興機構 細胞播種培養装置
EP3101421A4 (en) * 2014-01-30 2017-08-30 Namiki Seimitsu Houseki kabushikikaisha Cell membrane observation and analysis device and cell membrane observation and analysis method
CN105527462B (zh) * 2016-01-21 2018-01-02 长春理工大学 一种原子力显微镜测量单个活心肌细胞动作电位及搏动力的方法
CN105738458A (zh) * 2016-02-22 2016-07-06 中山大学中山眼科中心 一种生物工程视网膜神经支架细胞电位的测量方法
US11215606B2 (en) * 2016-12-02 2022-01-04 Sophion Bioscience A/S Seal enhancer
WO2018199334A1 (ja) * 2017-04-28 2018-11-01 株式会社 Ｉｏｎ Ｃｈａｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 細胞の膜電位／膜電流の測定方法
JP2019062869A (ja) * 2017-10-05 2019-04-25 ソニーセミコンダクタソリューションズ株式会社 細胞電位検出装置、細胞電位検出装置の製造方法、及び、情報処理システム
US20210355418A1 (en) * 2018-10-29 2021-11-18 Ion Chat Research Corporate Electrode having nano structure at tip
CN109290283A (zh) * 2018-11-19 2019-02-01 冯世庆 一种用于膜片钳电极清洗的超声清洗仪器及应用
JP7107528B2 (ja) * 2018-12-20 2022-07-27 株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス 細胞培養容器
CN111122525B (zh) * 2019-12-11 2021-01-15 浙江大学 一种荧光—膜片钳—微吸管检测装置
CN113406316B (zh) * 2021-06-17 2023-08-08 重庆医科大学附属儿童医院 一种电生理膜片钳灌流装置

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2060896A (en) * 1979-09-28 1981-05-07 Radiometer As Silver/silver halide electrode
US20020063067A1 (en) * 2000-10-02 2002-05-30 Morten Bech System for electrophysiological measurements
US20080286750A1 (en) * 2002-05-04 2008-11-20 Aviva Biosciences Corporation Apparatus including ion transport detecting structures and methods of use

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001004581A (ja) * 1999-06-24 2001-01-12 Sentan Kagaku Gijutsu Incubation Center:Kk 微小参照電極
CN1204404C (zh) 1999-10-01 2005-06-01 索菲昂生物科学有限公司 电生理学性质的测定组件及其构照方法
DK1322955T3 (da) * 2000-10-02 2012-09-10 Sophion Bioscience As System til elektrofysiologiske målinger
US7390650B2 (en) 2002-08-21 2008-06-24 Cellectricon Ab System and method for obtaining and maintaining high-resistance seals in patch clamp recordings
DE60311973T2 (de) * 2002-04-17 2007-10-31 Sophion Bioscience A/S Substrat und verfahren zum messen elektrophysiologischer eigenschaften von zellmembranen
FR2844052B1 (fr) * 2002-08-28 2005-07-01 Commissariat Energie Atomique Dispositif de mesure de l'activite electrique d'elements biologiques et ses applications
JP4394916B2 (ja) * 2003-09-19 2010-01-06 独立行政法人科学技術振興機構 人工脂質二重膜の形成装置および人工脂質二重膜の形成方法、並びにその利用
WO2006015306A2 (en) * 2004-07-29 2006-02-09 Predicant Biosciences, Inc. Methods, compositions and devices, including microfluidic devices, comprising coated hydrophobic surfaces
JP4425891B2 (ja) * 2006-08-08 2010-03-03 パナソニック株式会社 細胞電気生理センサおよびその製造方法
WO2008004476A1 (fr) * 2006-07-06 2008-01-10 Panasonic Corporation Dispositif pour capteur cellulaire électrophysiologique, capteur cellulaire électrophysiologique utilisant le dispositif, et procédé de fabrication du dispositif pour capteur cellulaire électrophysiologique
JP2008046145A (ja) 2006-08-10 2008-02-28 Ricoh Printing Systems Ltd 画像形成装置
JP2009195107A (ja) * 2008-02-19 2009-09-03 Panasonic Corp 細胞電気生理センサ
JP2009204407A (ja) * 2008-02-27 2009-09-10 National Institutes Of Natural Sciences パッチクランプ素子用基板、平面基板型パッチクランプ素子及び細胞イオンチャンネル活性測定方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2060896A (en) * 1979-09-28 1981-05-07 Radiometer As Silver/silver halide electrode
US20020063067A1 (en) * 2000-10-02 2002-05-30 Morten Bech System for electrophysiological measurements
US20080286750A1 (en) * 2002-05-04 2008-11-20 Aviva Biosciences Corporation Apparatus including ion transport detecting structures and methods of use

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Publication number Publication date
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