TWI552757B

TWI552757B - 抗流感病毒ｈ１ｎ１複方藥材之萃取物及其口服劑型與製備方法

Info

Publication number: TWI552757B
Application number: TW103143518A
Authority: TW
Inventors: 謝登恩
Original assignee: 大仁科技大學
Priority date: 2014-12-12
Filing date: 2014-12-12
Publication date: 2016-10-11
Also published as: TW201620538A

Description

抗流感病毒H1N1複方藥材之萃取物及其口服劑型與製備方法

本發明是有關於一種抗病毒感染的組合物，且特別是有關於一種抗流感病毒感染組合物的口服劑型。

根據世界衛生組織最新發佈的通報顯示，目前全球各地報告的流感病例中，有近76%是新型H1N1流感的病例，其餘為普通季節性流感以及其他流感病例。依據文獻記載(Murray PR,Rosenthal KS,Pfaller MA(2005)Medical Microbiology.5th ed.P609-617)，流行性感冒年年流行，每十年一次大流行。美國人口數為世界人口數的1/20，流感大流行時，估計美國死亡人數為8.8萬至22.7萬人(Meltzer MI,Cox NJ,Fukuda K(1999)The economic impact of pandemic influenza in USA：implications for setting priorities for interventions.Emerg.Infect.Dis.5：659-671)。

對於流感病毒，目前雖有四種臨床用藥， amantadine、rimantadine、oseltamivir(Tamiflu)和zanamivir。但是，amantadine和rimantadine很容易產生抗藥性而失效(Hayden,F.G.,and A.J.Hay.(1992)Emergence and transmission of influenza A viruses resistant to amantadine and rimantadine.Curr.Top Microbiol.Immunol.176：119)，而近年才核准的oseltamivir(Tamiflu)和zanamivir在台灣也已經出現抗藥性(Gubareva,L.V.,M.N.Matrosovich,M.K.Brenner,R.C.Bethell,and R.G.Webster.(1998)Evidence for zanamivir resistance in an immunocompromised child infected with influenza B virus.J.Infect.Dis.178：1257)。藥廠宣稱Tamiflu能治禽流感，但是2006年5月越南公布用Tamiflu治療四十多例禽流感的結果卻是無效！

感染H1N1流感病毒的患者，大多會出現發燒、頭痛、流鼻涕、喉嚨腫痛、咳嗽或全身痠痛等症狀。這些症狀在中醫「傷寒雜病」、「溫熱病」或「瘟疫」記載中，皆留下有效的對治方藥。例如桂枝湯、葛根湯或銀翹散等著名複方及金銀花、連翹、桔梗、牛蒡子、薄荷、生甘草、桑葉、杭菊花、竹葉、蘆根等常用的單味藥材。

以出自中醫醫聖張仲景「傷寒雜病論」的桂枝湯來說，其具有鎮痛、發汗、抗菌、祛痰、止吐、抗病毒和利尿等作用，主要用於治療呼吸道疾病(感冒、流行性感冒、流鼻血)、皮膚疾病(溼疹、蕁麻疹、皮膚搔癢、冬季皮膚炎、凍瘡、多形紅斑、蛇皮癬)、運動器官病(關節炎、風濕、神經痛)等症狀(林俊清臨床生藥學(上篇)，勵波出版社，p.304-306，1986；林俊清臨床生藥學(上篇)，勵波出版社，p.304-306，1986)。近代研究顯示桂枝湯的生物活性有抗脂質過氧化(Yokozawa T,Dong E,Liu ZW,Oura H(1997)Antiperoxidation activity of traditional Chihese prescriptions and their main crude drug in vitro.Nat.Med.51：92-97)、清除自由基(Yokozawa T,Chen CP,Liu ZW(1998)Effects of traditional Chinese prescriptions and their main crude drugs on 1,1 diphenyl2picrylhydrazyl radical.Phytother.Res.12：94-97)、發汗(Fu HY,He YZ,(1991)Studies on the hidropoiesis of the decoction of guizhitang in mice and rats.Chung His I Chieh Ho Tsa Chih 11：34-36)、鎮定、降血壓、增加心臟輸出血量(Xu FH,Uebaba K(1999)Effects of kampo formulations on circulatory parameters.Acupunc.Electro.Ther.Res.24：1128)、抑制免疫(Lu XF(1989)Experimental study on the immunosuppressive effects of guizhi tang.Chung His I Chieh Ho Tsa Chih 9：283-285)、增加超氧化物歧化酶(superoxide dismutase；SOD)和治療缺血性慢性胰炎(Motoo Y,Su SB,Xie MJ,Taga H,Sawabu N(2001)Effect of herbal medicine keishjto(TJ45)And its components on rat pancreatic acinar cell injuries in vivo and in vitro.Pancreatol.1：102-109)等功效。

而亦出自張仲景「傷寒雜病論」的葛根湯更是常用的傳統中藥方，是由葛根(Pueraria lobata Ohwi)、麻黃 (Ephedra sinica Stapf)、桂枝(Cinnamomum cassia Blume)、生薑(Zingiber officinale Roscoee)、甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch et DC.)、白芍(Paeonia lactiflora Pall)及大棗(Zizyphusjujuba var.inermis Rehd)等七種藥物所組成。葛根湯用於治療呼吸道疾病，像感冒、流行性感冒、鼻炎、扁桃腺炎、支氣管炎、肺炎和鼻蓄膿等。最近國外的研究報告指出葛根湯能經由誘生白細胞介素(interleukin 12)而抑制流行性感冒病毒的感染(Kurokawa,M.,M.Tsurita,J.Brown,Y.Fukuda,and K.Shiraki.(2002)Effect of interleukin12 level augmented by Kakkonto,a herbal medicine,on the early stage of influenza infection in mice.Antiviral.Res.56：183)。另外葛根湯也曾報導因為誘導遲發型過敏反應(delay type hypersensitirity,DTH)而抑制第一型泡疹病毒感染(Nagasaka,K.,M.Kurokawa,M.Imakita,K.Terasawa,and K.Shiraki.(1995)Efficacy of kakkonto,a traditional herb medicine,in herpes simplex virus type 1 infection in mice.J.Med.Virol.46：28)。

至於出自清‧汪訒庵所著湯頭歌之銀翹散，其所用藥材包括金銀花一兩、淨連翹一兩、竹葉四錢、荊芥四錢、牛蒡子六錢、淡豆豉五錢、薄荷四錢、滑石六錢、蘆根五錢、生甘草四錢、桔梗六錢。銀翹散主要是應用在治療溫熱疾病中，只發熱，但不惡寒、口渴、喉嚨發炎及咽喉腫痛者。且具有清涼性、緩和性、解熱消炎、清表化痰藥品之特性。故凡一切熱性病、傳染病之不惡寒但發熱及有汗熱不解者，服之均有效。用於治傷寒、流行性感冒、耳下腺炎、扁桃腺炎、咽喉炎、麻疹等之發熱頭痛、胸悶喉痛、牙痛、小便短赤、口渴欲嘔、欬痰赤目等症，具有很好的經驗功效。

因此，本發明之一方面是在提供一種抗流感病毒H1N1複方藥材之萃取物，其中該複方藥材基本上由1-3重量份之金銀花、絞股藍、山豆根、魚腥草、牛蒡子、薄荷及山楂，1-2重量份之紫蘇及胖大海，以及0.5-1.5重量份之桔梗、藿香、甘草及薑所組成。

依據本發明一些實施例，該複方藥材的萃取方法為加入藥材總重量10-15倍的熱水進行萃取。

另一方面，本發明是在提供一種含有有效劑量之上述萃取物的口服劑型。

依據本發明一些實施例，該口服劑型為粉末、茶飲、茶包、丸劑或糖果甜食。

依據本發明又一些實施例，其中該糖果甜食為硬糖、軟糖或棗泥。

依據本發明又一些實施例，其中該糖果甜食為牛軋糖。該牛軋糖還包括90-200重量份之水、800-1000重量份之麥芽、500-700重量份之棗泥、150-250重量份之黑糖、80-200重量份之玉米粉、50-150重量份的奶油、500-700重量份之堅果、150-250重量份之糖及50-150重量份之蛋白。

依據本發明再一些實施例，上述之牛軋糖的製備方法。首先，加熱一混合物，該混合物基本上由90-200重量份之水、800-1000重量份之麥芽、500-700重量份之棗泥、150-250重量份之黑糖、80-200重量份之玉米粉、50-150重量份的奶油、500-700重量份之堅果及150-250重量份之糖所組成。再加入50-150重量份之蛋白至該混合物中，進行打發與沖漿的步驟。進行壓模、整形、冷卻及切條/切塊的步驟。最後，將成品進行單顆包裝，完成含有上述複方藥材牛軋糖的製備。

上述之抗流感病毒H1N1複方藥材之萃取物確實能有效地抑制病毒，且做成各種口服劑型之後，可以方便攜帶與食用。尤其是各種糖果甜食劑型，讓抗流感病毒複方藥材萃取物的口服劑型更容易下口。

上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施方面。

C‧‧‧空白組

V‧‧‧病毒對照組

S1‧‧‧樣品濃度10μg/ml組

S2‧‧‧樣品濃度30μg/ml組

S3‧‧‧樣品濃度100μg/ml組

S4‧‧‧樣品濃度300μg/ml組

為讓本發明之下述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附附圖之說明如下：

第1圖為金銀花複方藥材萃取物抗流感病毒活性之溶斑減少分析結果。圖上所標的符號C為空白組，V為病毒對照組，S1為樣品濃度10μg/ml組，S2為樣品濃度30μg/ml組，S3為樣品濃度100μg/ml組，S4為樣品濃度300μg/ml組。

第2圖為金銀花萃取物抗流感病毒活性之溶斑減少分析結果。圖上所標的符號C為空白組，V為病毒對照組，S1為樣品濃度10μg/ml組，S2為樣品濃度30μg/ml組，S3為樣品濃度100μg/ml組，S4為樣品濃度300μg/ml組。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對本發明的實施方面與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

依據上述，提供一種抗流感病毒H1N1的複方藥材萃取物及其口服劑型與製備方法。為了容易瞭解所述實施例之故，下面將會提供不少技術細節。當然，並不是所有的實施例皆需要這些技術細節。同時，一些廣為人知之結構或元件，僅會以示意的方式在附圖中繪出，以適當地簡化附圖內容。

抗H1N1流感病毒的金銀花複方藥材組成

用來製備上述抗H1N1流感病毒的金銀花複方藥材組成有金銀花、絞股藍、山豆根、魚腥草、牛蒡子、薄荷、山楂、紫蘇、胖大海、桔梗、藿香、甘草及生薑。

其中金銀花、絞股藍、山豆根、魚腥草、牛蒡子、薄荷及山楂的重量份皆為1-3，依據一些實施例，金銀花、絞股藍、山豆根、魚腥草、牛蒡子、薄荷及山楂的重量份例如可為1.5-2.5或1.8-2.2。舉例來說，金銀花、絞股藍、山豆根、魚腥草、牛蒡子、薄荷及山楂的重量份可為1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8或3。

紫蘇及胖大海的重量份皆為1-2，依據一些實施例，紫蘇及胖大海的重量份可為1.3-1.7或1.4-1.6。舉例來說，紫蘇及胖大海的重量份可為1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2。

桔梗、藿香、甘草及薑的重量份皆為0.5-1.5，依據一些實施例，桔梗、藿香、甘草及薑的重量份可為0.7-1.3或0.9-1.1。舉例來說，桔梗、藿香、甘草及薑的重量份可為0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5。接著，說明各藥材的療效如下。

金銀花的基源為忍冬科植物Lonicera japonica Thunb.之乾燥花蕾。根據本草綱目載紀錄，金銀花性味甘、寒，主一切風濕氣，及諸腫毒、癰疔、疥癬、楊梅諸惡瘡，具有清熱解毒功能；主治發熱、斑疹、咽痛、血痢、腫毒、痔漏、肺結核併發之呼吸道感染。其成分包括黃酮類、皂苷、鞣質等活性成分。上述之黃酮類如木犀草素(Luteolin)、亦含肌醇(Inositol)、綠原酸(Chlorogenic acid)、異綠原酸(Isochlorogenic acid)。金銀花的藥理作用包括抗菌作用、抑制病毒作用、抑制皮膚真菌作用、抗炎症作用及解熱作用。上述之抗菌作用包括可抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎雙球菌、腦膜炎雙球菌。上述之抑制病毒作用包括可抑制流行性感冒病毒、疱疹病毒(Atiqur Rahman,Sun Chul Kang.(2009)In vitro control of food-borne and Food spoilage bacteria by essential oil and ethanol extracts of Lonicera japonica Thunb.Food Chemistry 116：670-675)。

絞股藍的基源為Gynostema pentaphyllum(Thunb.)Markino。全世界Gynostema屬植物有13種，有11種分布於中國大陸，台灣則自日本引進栽培。絞股藍的成分包括絞股藍皂苷(Gynosaponin)、氨基酸、微量元素及各種糖類。上述之絞股藍皂苷含有80多種皂苷，上述之氨基酸包含天門冬氨酸、蘇氨酸、丙氨酸等，而上述之微量元素包含Fe、Zn、Cu、Mn等等13種人體必須微量元素。絞股藍的藥理作用包括抗氧化作用、提高體內超氧化物歧化酶(SOD)活性、提高白血球數、增強免疫作用、抗缺氧作用抗潰瘍作用及保肝作用。絞股藍近年來常被認為具消炎、解毒及能止咳化痰，可用於慢性支氣管炎、慢性肝炎、胃腸炎、癌症放療及化療的輔佐劑。

山豆根的基源為Leguminosae豆科植物廣豆根 Sophora subprostarta chun et T.Chen之乾燥根。山豆根的成分包括Alkaloid-Matrine、Oxymatrine、Anagyrine、Methycytisine、Flavonoid-Sophoradin、Soporadochromene、Sophoranone(Xue-Hong Shuai,Ting-Jun Hu,Hong-Li Liu,Zi-Jie Su,Yun Zeng,Yue-Hua Li.(2009)Immunomodulatory effect of a Sophora subprosrate polysaccharide in mice.International Journal of Biological Macromolecules,In Press,Accepted Manuscript,Available online 5 November)。山豆根的藥理作用包括有抗腫瘤作用、抑制白血病細胞、抗菌作用、平喘作用。山豆根功能主治為治咽喉腫痛，其他還包括治療扁桃腺炎、瘡瘍、腦腫瘍及腎炎病人容易引起之扁桃腺炎。

魚腥草的基源為Saururaceae三白草科植物Houttuynia cordata Thunberg在開花時期之地上部分。魚腥草的成分包括精油及特殊魚腥草臭成分。精油成分包括Capraldehyde、Myrcene、Caprinic acid，而特殊魚腥草臭成分包括Lauraldehyde、n-Decanoyl-acetaldehyde、Quercitrin、K⁺(鉀離子)。魚腥草的藥理作用包括抗菌作用-抑制白癬菌、葡萄球菌、淋球菌、抗病毒作用、利尿作用、鎮痛作用、促進組織再生能力、鎮咳作用-抑制咳嗽反應、促進免疫反應-可提高巨噬細胞之吞噬功能(Do-Ik Kim,Jong-Dae Park,Seon-Gon Kim,Hyun Kuk,Mi-Soon Jang,Sang-Soo Kim.,(2005)Screening of Some Crude Plant Extracts for Their Acaricidal and Insecticidal Efficacies J.of Asia-Pacific Entomol.8：93-100)。

牛蒡子的基源為菊科Compositae植物牛蒡Arctium lappa L.之果實。牛蒡子的成分包括牛蒡苷(Arctiin)、苷元、異牛蒡酚(Iso-arctigenin)、脂肪油、硫胺素、維他命B1(Thiamine)，上述之苷元為L-牛蒡酚(L-Arctigenin)。典籍記載牛蒡子性涼、辛苦，入肺、胃二經，能疏風散熱，宣肺解毒透疹，利咽散腫。主治外感風熱、咽喉腫痛、發熱咳嗽證、麻疹初期、疹出不暢、風熱疹癢症及熱毒瘡腫咽痛等證。牛蒡子的藥理作用包括抗菌作用及降血糖作用(Bor-Sen Wang,Gow-Chin Yen,Lee-Wen Chang,Wen-Jye Yen,Pin-Der Duh.(2007)Protective effects of burdock(Arctium lappa Linne)on oxidation of low-density lipoprotein and oxidative stress in RAW 264.7 macrophages.Food Chemistry,101：729-738)。

薄荷的基源為Labiatae唇形科植物薄荷Mentha arvensis L.var.piperascens Malinv.及其變種之葉。薄荷的成分包括精油(主成分為-Menthol，尚含其他Menthone、pinene蒎烯、Limonene、Camphene、Menthofuran、Menthol之ester)等。典籍記載薄荷味辛、性涼及入肝、肺經。薄荷的功能包括疏散風熱、清利頭目、利咽透疹、疏解肝鬱及辟穢氣，主治外感風熱證，風熱上攻之頭痛、目赤證，風熱壅盛之咽喉腫痛，麻疹透發不暢證，肝氣鬱滯之胸悶及脇肋脹痛證等。本草綱目云：薄荷辛能發散，涼能清利，專於消風散熱。故頭痛、頭風、眼目、咽喉、口齒諸病，皆為要藥。薄荷的藥理作用：對病原生物之作用(包括抗病毒之作用、抗菌作用)、驅蟲作用、發汗解熱、對呼吸系統的作用、對消化系統之作用(M.Gulluce,F.Sahin,M.Sokmen,H.Ozer,D.Daferera,A.Sokmen,M.Polissiou,A.Adiguzel,H.Ozkan.(2007)Antimicrobial and antioxidant activities of the essential oil and methanol extract from Mentha longifolia ssp.Longifolia.Food Chemistry,103：1449-1456)。

山楂的基源為薔薇科野山楂(C.cuneata Sieb.et Zucc.)及其他同屬植物之成熟果實。山楂的主要成分包括槲皮素(Quercetin)、綠原酸(Chlorogenic acid)、咖啡酸(Caffeic acid)、齊墩果酸(Oleanolic acid)及維他命C。典籍記載山楂味酸、性甘、微溫，歸脾、胃、肝經，具有消食化積，行氣散瘀功效。山楂的藥理作用包括強心、降血脂、抗菌、鎮靜、降血壓及子宮收縮作用。

紫蘇的基源為唇形科(Labiatae)一年生草本植物皺紫蘇Perilla frutescens(L.)Britt.Var crispa(Thunb.)Hand.-Mazz.及白蘇Perilla frutescens(L.)Britton的全草。紫蘇的成分包括精油類(Essential oils)、紫蘇醛(Perillaldehye)、檸檬醛(Citral)、菜油固醇(Campesterol)、豆固醇(Stigmasterol)、麥胚固醇(Sitosterol)、迷迭香酸(Rosmarinic acid)。皺紫蘇之精油類成分包含紫蘇苷(Shisonin)。典籍記載紫蘇味辛、性溫，入肺、脾經。紫蘇的功能包括發表散寒，行氣寬中，安胎，解魚蟹毒。紫蘇主治外感風寒證、脾胃氣滯證、胎動不安證及魚蟹毒引起之腹痛吐瀉證。本草綱目云：紫蘇，味辛入氣分，色紫入血分。同橘皮、砂仁則行氣安胎，同藿香、烏藥則溫中止痛，同香附、麻黃則發汗解肌，同芎藭、當歸則和血、散血，同木瓜、厚朴則濕熱解暑，治霍亂、腳氣，同桔梗、根殼則和膈寬腸，同杏仁、萊菔子則消痰定喘。紫蘇的藥理作用：解熱作用、抗菌作用、對血糖之影響、能減少支氣管黏液分泌、促進消化液的分泌(Min-Kyung Kim,Huyn-Sun Lee,Eun-Jin Kim,Nam-Hee Won,Young-Min Chi,Byoung-Chul Kim,Kwang-Won Lee.,(2007)Protective effects of aqueous extract of Perilla frutescens on tert-butyl hydroperoxide-induced oxidative hepatotoxicity in rat.Food and Chemical Toxicol.45：1738-1744)。

胖大海的基源為梧桐科植物胖大海Sterculia scaphigera Wall.的乾燥種子。胖大海種子外層的成分包括西黃耆膠黏素(Bossorin)，果皮含半乳糖(Galactose)、戊糖(Pentose)、阿拉伯糖(Arabinose)及戊酸(Valeric acid)等。典籍記載：胖大海味甘，性寒。歸肺、大腸經。能清熱、潤肺、潤腸通便。胖大海的藥理作用包括瀉下作用、降血壓作用、消炎作用、利尿及鎮痛作用(Ru-Feng Wang,Xiu-Wei Yang,Chao-Mei Ma,Ming-Ying Shang,Ji-Ye Liang,Xuan Wang,Shao-Qing Cai,Yukihiro Shoyama.(2003)Alkaloids from the seeds of Sterculia lychnophora(Pangdahai).Phytochemistry,63：475-478)。

桔梗的基源為桔梗科植物Platycodon grandiflorum(Jacquin)A.DC.的乾燥根。桔梗的成分包括桔梗皂苷(platycodin A,C,D)、桔梗皂苷元(platycodigenin)、遠志酸(polygalain)、葡萄糖(glucose)、α-菠菜固醇(α-spinasterol)、α-菠菜固醇-β-D-葡萄糖苷(α-spinasteryl-β-D-glucoside)、△⁷-豆固醇(△⁷-stigmasterol)、白樺脂醇(brtulin)、菊糖(inulin)、桔梗聚糖(platycodonin)、桔梗酸(platycigenic acid A,B,C)等。典籍記載桔梗性味苦辛平，歸肺經。能宣肺袪痰、排膿、開提肺氣。桔梗的藥理作用包括袪痰與鎮咳作用、降血糖作用、抑制胃液分泌、抗胃潰瘍作用、抗炎作用、鎮靜、鎮痛、解熱、抗水腫，及利尿作用(Chang-Ho Jeong,Gwi Nam Choi,Ji Hye Kim,Ji Hyun Kwak,Dae Ok Kim,Young Jun Kim,Ho Jin Heo.,(2010)Antioxidant activities from the aerial parts of Platycodon grandiflorum.,Food Chemistry,118：278-282)。

藿香的基源為唇形科Labiatae多年生草本植物廣藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth.之全草或葉乾燥者，或藿香Agastache rugosa(Fisch.et Mey.)O.Kuntze之地上部分。廣藿香的成分包括廣藿香油(patchouli oil)，廣藿香油的成分包括廣藿香醇(patchoulic alcohol)、環賽車烯(cycloseychellene)、pogostol、苯甲醛(benzaldehyde)、丁香醇(eugenol)。藿香的成分包括甲基胡椒酚(methyl chavicol)、異大茴香腦(isoanethole)、茴香醛 (anisaldehyde)、茴香腦(anethole)、檸檬烯(limonene)。典籍記載藿香辛、微溫，入脾、胃、肺三經。功能升清、降濁、化濕、解表、袪暑、避穢解嘔、醒脾和胃。藿香主治濕阻中焦、暑溼證、濕溫證及嘔吐等。藿香的藥理作用包括抗菌作用，且藿香的揮發油有促進胃液分泌、增強消化力、有制嘔、止瀉、健胃、解熱、毛細血管擴張等作用(Fabienne Deguerry,Laurence Pastore,Shuiqin Wu,Anthony Clark,Joseph Chappell,Michel Schalk.(2006)The diverse sesquiterpenes profile of patchouli,Pogostemon cablin,is correlated with a limited number of sesquiterpene synthase,Archives of Biochemistry and Biophysics,454：123-136)。

在甘草的基源中，常用者為豆科多年生草本植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch et DC.的根及根莖。甘草的主要成分包括甘草甜素(glycyrrhizin)、甘草酸(glycyrrhinic acid)、甘草次酸(glycyrrhetic acid，glycyrrhetinic acid)、甘草黃甙(甘草甙，liquiritin)及甘草素(liquiritigenin)等。典籍記載甘草味甘、性平、歸心、肺、脾、胃經。甘草具有益氣補中、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛及調和藥性作用。在甘草的藥理作用中，生用主治咽喉腫痛、痛疽瘡瘍、胃腸道潰瘍以及解藥毒等；而蜜炙主治脾胃功能減退、大便溏薄、乏力發熱以及咳嗽、心悸等。

生薑的基源為薑科草本植物薑(Zingiber officinale Rosc.)的根莖。在生薑的成分中，辛味的主要成分為薑酮((6-)Gingerone)、生薑酚((6-)Shogaol)；精油的主要成分為薑醇(Zingiberol)、薑烯(Zingiberene)、莰烯(Camphene)及硫脲(Citrol)；此外尚含有粘液質等。典籍記載薑味辛、性溫、歸肺、脾、胃經。薑具有發汗解表、溫中止嘔及溫肺止咳作用。薑的藥理作用包括能促進消化液分泌而有增進飲食作用、鎮吐、鎮痛、抗發炎及消腫等作用。

在中藥領域中，由於一種藥材往往含有多種的組成份，故會呈現出多重的療效，而相同症狀又常常可以使用具有類似療效的數種藥材來加以替換治療，再加上需考慮不同藥材間之相乘或相剋的複雜交互作用關係，因此使得中藥複方的處方原則十分複雜，配藥方式也往往因人而異。所以，針對治療H1N1病人來說，不同人所配之複方藥材的組成是很難相同或相似的。而所配出來的複方藥材之療效可能相同或相似，但是也可能天差地別。因此，下面約略說明上述金銀花複方藥材在處方過程中所考慮的因素。

上述金銀花複方藥材組成的基礎是由銀翹散的藥材處方變化而來。如前所述，銀翹散的藥材處方為金銀花一兩、淨連翹一兩、竹葉四錢、荊芥四錢、牛蒡子六錢、淡豆豉五錢、薄荷四錢、滑石六錢、蘆根五錢、生甘草四錢、桔梗六錢。雖然銀翹散之主治功效確與流行性感冒病毒所引起之症狀，有多方面之類似。但礙於下述因素必須加以調整變化。

首先是感染H1N1流感病毒的患者，大多會出現發燒、頭痛、流鼻涕、喉嚨腫痛、咳嗽、食慾不振或全身酸痛等症狀。故於處方設計時進行調整並加入適於此症之天然物。所以在銀翹散處方的基礎中加了絞股藍、山豆根、魚腥草、山楂、紫蘇、胖大海、藿香及生薑。此外，配合健康食品管理法中規定可供食用中藥材之限制，刪除只能做為藥用而不能做為食用之淨連翹、竹葉、荊芥、滑石、蘆根等藥材，進而得到上述的複方藥材組成。

複方藥材萃取法

將上述之藥材組成以研磨機將樣品粗碎後，加入藥材總重量10-15倍的熱水進行萃取。依照一些實施例，用熱水萃取的方法可為在煮沸後，再加熱萃取至少1小時。例如可為在煮沸後，再加熱萃取1-3小時，如可加熱萃取1、1.5、2、2.5或3小時。然後將水層先行減壓濃縮，再取水層萃取物進行乾燥，乾燥的方法例如可為冷凍乾燥或噴霧乾燥。最後將所得萃取物置放於4℃冷藏櫃保存，以備後需之用。

細胞培養法

然後進行細胞培養。在細胞培養中，細胞株MDCK係由高雄醫學大學微生物學科蔣連財教授所提供。

實驗時以DMEM培養基添加10%胎牛血清和1%三合一抗生素，用於培養測試抗病毒活性時的細胞。

在進行抗病毒活性測試或繁殖病毒時，培養基中的胎牛血清降為2%。

在細胞進行繼代培養(subculture)時，每次以5ml PBS潤洗細胞兩次，然後加入1ml的1×胰蛋白酶(trypsin)-EDTA。在充分的浸潤細胞表面後，吸掉胰蛋白酶-EDTA。將細胞培養瓶置於37℃的培養箱約5分鐘。之後，輕拍細胞培養瓶四周，以便拍散細胞。將MDCK細胞做1：10倍之稀釋(split ratio 1：10)，置於37℃，5% CO₂的細胞培養箱培養，每三至五天做一次繼代培養。

病毒培養法

接著，進行病毒培養。病毒株Influenza A(H1N1)，係由高雄醫學大學微生物學科蔣連財教授所提供

在病毒培養中，是將2×10⁵個MDCK細胞加入細胞培養瓶中，然後再加入10ml的細胞培養基。將細胞培養瓶放置於37℃，5% CO₂的細胞培養箱培養約三天(約9分滿)。在吸掉細胞培養基後，加入0.2ml的H1N1及10ml的病毒培養基。將細胞培養瓶口緊閉，於培養箱培養，並觀察細胞病變(cytopathic effect,CPE)的程度(Murray PR,Rosenthal KS,Pfaller MA(2005)Medical Microbiology.5th ed.P609-617；Meltzer MI,Cox NJ,Fukuda K(1999)The economic impact of pandemic influenza in USA：implications for setting priorities for interventions.Emerg.Infect.Dis.5：659-671)。當CPE到達3“+”(約75%的細胞呈現CPE症狀)時，將細胞刮下，然後再將病毒分裝成小量，置於-80℃下保存。

細胞毒性的測定法

細胞毒性之測定是取MDCK細胞(1×10⁵cells/ml)0.1ml，加入96洞培養盤中培養24小時。然後，加入連續稀釋後之各種不同濃度的待測藥品、陰性對照藥(DMSO)或抗病毒陽性對照藥(amantadin)(Sidwell,R.W.,J.H.Huffman,G.P.Khare,L.B.Allen,J.T.Witkowski,and R.K.Robins.(1972)Broadspectrum antiviral activity of Virazole：1β-Dribofuranosyl 1,2,4-triazolecarboxamide.Science 177：705)。培養3天後加入XTT試劑，3小時後測OD₄₉₂的吸光值，將所得OD₄₉₂的吸光值減去OD₆₉₀的吸光值，並計算10%、50%及90%細胞毒殺濃度(CC₁₀、CC₅₀、CC₉₀)。所有資料用單向變異數分析(one-way analysis of variance；one-way ANOVA)和多重比較(multiple comparison)來進行統計分析。

實驗結果列在下面的表一中。由表一的結果可知，此天然物複方及其各組成份的CC₅₀值介於3388.9±56.1~5873.5±154.7μg/ml間；而CC₉₀值則介於6157.9±167.4~11586.6±263.8μg/ml間。這結果證實此天然物複方及其各組成，對MDCK細胞呈現較安全且極低的毒性作用。

抗病毒活性測定法

抗病毒活性的測定方法(.Chiang,L.C.,W.Chiang,M.Y.Chang,L.T.Ng,and C.C.Lin.(2002)Antiviral activity of Plantago maior extracts and related compounds in vitro.Antiviral Res.55：53；Kodama,E.,S.Shigeta,T.Suzuki,and E.De Clercq.(1996)Application of a gastric cancer cell line(MKN28)for antiadenovirus screening using the MTT method.Antiviral Res.31：159)敘述如下。

取0.1ml之MDCK細胞(105cells/ml)，加入96洞培養盤中培養1天。吸掉培養基後加入適當量的測試H1N1病毒感染1小時，接著加入不同濃度的待測藥品或對照藥品。培養三天後，加入XTT試劑，3小時後測OD₄₉₂的吸光值，將所得OD₄₉₂的吸光值減去OD₆₉₀的吸光值，並計算抑制病毒的百分比。然後求得保護細胞10%、50%及90%免被病毒感染致死的有效濃度(EC₁₀、EC₅₀、EC₉₀)。接著，還可利用CC₅₀及EC₅₀來計算選擇指數(Selectivity index,SI)。所有資料用單向變異數分析(one-way analysis of variance；one-way ANOVA)和多重比較(multiple comparison)來進行統計分析。

結果列在下面的表二中。由下面表二的數據可知，組成此天然物複方中的金銀花、絞股藍、甘草、紫蘇、胖大海、桔梗及薄荷等七種單味成份，經XTT實驗分析後發現，皆具有抗H1N1病毒的活性。其中，EC₅₀值介於35.9±1.2(甘草)~256.5±7.2(桔梗)μg/ml間，而EC₉₀值則介於57.3±5.4(甘草)~422.4±11.6(桔梗)μg/ml間。

在表二中所測試的各種萃取物中，選擇指數值則介於13.2(桔梗)~139.2(甘草)。尤其複方萃取物(300μg/ml)抗H1N1病毒作用的選擇指數為78.5，遠高於抗病毒陽性對照藥金剛烷胺(amantadine)的51.7。此結果被證實此天然物複方可以更具有選擇性的用來降低H1N1病毒的感染。

病毒定量法

再繼續進行病毒之定量，病毒定量的方法係採用溶斑分析法(Plaque Assay)。

首先在24孔培養盤的每一孔中分別繼代培養1×10⁵個MDCK細胞，然後將其置於5% CO₂，37℃的培養箱中培養48小時。48小時後，將每一孔之培養基吸掉，然後在每一孔加入200μl的H1N1。經過1小時(5% CO₂，37℃培養箱中)的培養後，分別在每一孔加入800μl的覆蓋培養基(overlay medium)，然後將其置於5% CO₂，37℃的培養箱中繼續培養48小時。

48小時之後，先吸掉覆蓋培養基，然後在每一孔中分別加入約500μl的10%福馬林。在室溫下放置30分鐘後，將福馬林吸掉，然後在每一孔加入一滴1%的結晶紫溶液(crystal violet working solution)。30分鐘後，將結晶紫溶液沖洗掉，並將24孔培養盤洗淨擦乾，之後記錄其病毒溶斑(plaque)的數目(Reed LJ.,Muench H.(1938)A simple method of estimating fifty per cent endpoints.Am.J. Hyg.27：493；.Rovozzo GC.,Burke CN.A Manual of Basic Virological Techniques.PrenticeHall,Inc,New Jersey,USA,pp.7693)。依據所得的病毒溶斑數目來計算其溶斑形成單位(plaque forming units；PFU)。PFU的計算公式如下：

PFU=病毒溶斑數×病毒稀釋倍數/病毒接種量

病毒溶斑減少分析法

病毒溶斑減少分析法(De Logu,A.,G.Loy,M.L.Pellerano,L.Bonsignore,and M.L.Schivo.(2000)Inactivation of HSV1 and HSV2 and prevention of celltocell virus spread by Santolina insularis essential oil.Antiviral Res.48：177)，是先在24孔培養盤的每一孔中分別繼代培養1×10⁵個MDCK細胞，然後將培養盤置於5% CO₂及37℃的培養箱中培養48小時。48小時後，先將每一孔之培養基吸掉，然後分別在每一孔加入22μl不同濃度的測試檢品(另外也同時進行不含測試檢品的對照組)和100 PFU的H1N1。再經過1小時的培養後，於每一孔中分別再加入78μl不同濃度的測試檢品和700μl的覆蓋培養基。之後，將培養盤置於5% CO₂，37℃的培養箱中培養48小時。

48小時後，將覆蓋培養基吸掉，然後在每一孔中加入約500μl的10%福馬林。於室溫下放置30分鐘後，將福馬林吸掉，緊接著在每一孔中加入一滴1%的結晶紫溶液。30分鐘後，將結晶紫溶液沖洗掉並擦乾，然後記錄其病毒溶斑(plaque)的數目。根據病毒溶斑的數目，計算其抑制率，並進一步求其IC50(抑制50%病毒生長的樣品濃度)。抑制率的計算公式如下：

抑制率=(1-實驗組的病毒溶斑數/對照組的病毒溶斑數)×100%

所得分析結果顯示在第1-2圖及下面的表三中。第1圖為金銀花萃取物抗流感病毒活性之溶斑減少分析結果，第2圖為金銀花複方萃取物抗流感病毒活性之溶斑減少分析結果。第1-2圖中記號C為空白組，V為病毒對照組，S1~S4分別代表樣品濃度為10、30、100及300μg/ml。表三則是複方藥材及複方組成中各單方藥材萃取物對H1N1病毒的抑制率。

請同時參考第1圖、表二及表三，由這些數據可以確證單味金銀花(300μg/ml)及此天然物複方(300μg/ml)皆具有很強的病毒抑制作用，其抑制率分別為80.4%及90.9%。依此實驗結果確證了上述複方萃取物具有很好的抗H1N1病毒功效。

**沒有抗H1N1病毒活性

依據上述可知，可利用現有任何製程將上述複方藥材萃取物製備成任何的口服劑型。口服劑型例如可為，但不限於，粉末、茶飲(例如，無菌的水溶液或分散體)、茶包、丸劑(pellet)、糖果甜食以及類似之物。

糖果甜食劑型的製備方法

上述之糖果甜食劑型例如可為不同口味之硬糖或軟糖，甚至可以製成棗泥及其他種種不同甜食。如此，可以改變良藥苦口的傳統觀念，並利於產品之行銷。下面以糖果劑型中之牛軋糖為例，說明含有上述複方藥材牛軋糖的製備方法。

首先，先製備牛軋糖。在製備時，依水(90-200重量份)、麥芽(800-1000重量份)、棗泥(500-700重量份)、黑糖(150-250重量份)、玉米粉(80-200重量份)、奶油(50-150重量份)及堅果(500-700重量份)之重量，將原料秤重後下料，再加糖(150-250重量份)一起煮。然後，加入蛋白(50-150重量份)後，進行打發與沖漿的步驟。接著，加入有效劑量之上述複方藥材的萃取物進行混和攪拌，然後進行壓模、整形、冷卻及切割(切條/切塊)的步驟。最後，將成品進行單顆包裝，完成含有上述複方藥材牛軋糖的製備。

由上述可知，本說明書揭露一種可以抗H1N1流感病毒的複方藥材萃取物及其口服劑型與製備方法。將此抗流感病毒複方藥材萃取物製備成任何口服劑型後，可以方便攜帶與食用。尤其是糖果劑型，可以讓抗流感病毒複方藥材萃取物搭配不同的糖果調味添加物，製成各種不同口味的糖果甜食，不僅方便攜帶與食用，也讓抗流感病毒複方藥材萃取物的口服劑型更容易下口。

雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims

一種抗流感病毒H1N1複方藥材之萃取物，該複方藥材基本上由下述藥材所組成：1-3重量份之金銀花、絞股藍、山豆根、魚腥草、牛蒡子、薄荷及山楂；1-2重量份之紫蘇及胖大海；以及0.5-1.5重量份之桔梗、藿香、甘草及薑。
如請求項1所述之萃取物，其中該複方藥材的萃取方法為加入藥材總重量10-15倍的熱水進行萃取。
一種抗流感病毒H1N1複方藥材之口服劑型，該口服劑型包括有效劑量之如請求項1所述之萃取物。
如請求項3所述之口服劑型，其中該口服劑型為粉末、茶飲、茶包、丸劑或糖果甜食。
如請求項4所述之口服劑型，其中該糖果甜食為硬糖、軟糖或棗泥。
如請求項5所述之口服劑型，其中該軟糖包括牛軋糖。
如請求項6所述之口服劑型，其中該牛軋糖還包括90-200重量份之水、800-1000重量份之麥芽、500-700重量份之棗泥、150-250重量份之黑糖、80-200重量份之玉米粉、50-150重量份的奶油、500-700重量份之堅果、150-250重量份之糖及50-150重量份之蛋白。
一種含有抗流感病毒H1N1複方藥材萃取物之牛軋糖的製備方法，包括：加熱一混合物，該混合物基本上由90-200重量份之水、800-1000重量份之麥芽、500-700重量份之棗泥、150-250重量份之黑糖、80-200重量份之玉米粉、50-150重量份的奶油、500-700重量份之堅果及150-250重量份之糖所組成；加入50-150重量份之蛋白至該混合物中；進行打發與沖漿的步驟；加入有效劑量之如請求項1所述之複方藥材的萃取物至打發與沖漿後之該混合物中，並進行混合攪拌的步驟；以及依序進行壓模、整形、冷卻、切割及包裝的步驟。