TWI543774B - 蠶絲蛋白於製備促進膠原蛋白生成之組成物之用途 - Google Patents

Description

蠶絲蛋白於製備促進膠原蛋白生成之組成物之用途

本發明係有關於一種蠶絲蛋白於製備促進膠原蛋白生成之組成物之用途，尤其係指蠶絲蛋白具有清除自由基、抑制脂質過氧化以及減緩皮膚細胞受紫外線傷害的能力，藉此，蠶絲蛋白可進一步作為抗氧化或抗老化之化妝材料組成物或醫藥組成物，以達到保養肌膚之效果。

近年來，如何有效保養皮膚以減緩皮膚老化速度，已成為消費者追求之方向，對於美妝保養品廠商而言，亦是重點研發之方向。傳統具有抗氧化作用之成分如vitamin C或麴酸，雖可有效抑制氧化反應及清除自由基達到抗氧化或抗老化之效果，但各有其使用上之限制例如維生素C在陽光下或接觸空氣易被氧化，並且不耐熱，當濃度超過5%以上會對皮膚產生刺激性及紅腫；麴酸非常的不穩定，容易被氧化而變色及引起皮膚過敏，且長期過量使用麴酸產品會導致細胞毒性且發生病變。

蠶絲蛋白(silk protein)富含多種胺基酸組成，具有生物相容性、透氣性及無毒性，目前已廣泛應用在外科及人工皮膚等醫學領域(Kanokpanont et al.,2012)，藉以促進傷口癒合。蠶絲蛋白具有多種用途，例如中華民國專利公告第I418073號一種『電子裝置用 蠶絲溶液、使用其製備之具蠶絲蛋白介電層之有機薄膜電晶體裝置及其製作方法』以及第I433616號一種『電路板及其製備方法』，即揭示蠶絲蛋白可做為電路板結構之介電層材料；中華民國專利公告第M394101號一種『吸收性護片結構』揭示蠶絲蛋白具有抑制有害細菌之特性、及良好的吸水及保濕性；中華民國專利公告第M422970號一種『含薑黃素之奈米纖維膜敷料』揭示將蠶絲蛋白進行靜電紡絲製程，以製備成蠶絲蛋白奈米纖維膜，以使其蠶絲蛋白奈米纖維膜具備生物安全性、透氣、保濕、抗發炎及抗菌功能之敷料；國外的文獻中，亦證實蠶絲蛋白具有快速和持續的保濕效果(Padamwar et al.,2005)。然，上述有關於蠶絲蛋白之相關專利，其內容多應用於組合物，或是開發生物或介電材料的製作，尚無具體的研究指出蠶絲蛋白於抗氧化或抗老化之確切功效為何，因此，蠶絲蛋白於化粧品之相關應用，應具有研究與發展的潛力。

今，發明人即是鑑於上述現有之抗氧化或抗老化產品於實際實施使用時仍具有多處缺失，藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，而加以改善，並據此研創出本發明。

本發明主要目的為提供一種蠶絲蛋白於製備促進膠原蛋白生成之組成物之用途，其係指蠶絲蛋白具有清除自由基、抑制脂質過氧化以及減緩皮膚細胞受紫外線傷害的能力，藉此，蠶絲蛋白可進一步作為抗氧化或抗老化之化妝材料組成物或醫藥組成物，以達到保養肌膚之效果。

為了達到上述實施目的，本發明一種蠶絲蛋白於製備促進膠原蛋白生成之組成物之用途，其係將一有效劑量之蠶絲蛋白投予至一所需個體，以清除DPPH自由基及ABTS自由基、抑制脂質過氧化及預防質體DNA受紫外線傷害。

於本發明之一實施例中，蠶絲蛋白之有效劑量可例如為1%~20%，較佳為5%~20%。

於本發明之一實施例中，蠶絲蛋白係進一步抑制基質金屬蛋白酶MMP-2與MMP-9，且促進膠原蛋白生成。

於本發明之一實施例中，蠶絲蛋白可作為抗氧化或抗老化之化妝材料組成物或醫藥組成物。

第一圖：蠶絲蛋白之細胞存活度測試。

第二圖：蠶絲蛋白之ABTS自由基清除能力測試。

第三圖：蠶絲蛋白之DPPH自由基清除能力測試。

第四圖：蠶絲蛋白之還原能力測試。

第五圖：蠶絲蛋白之抑制脂質過氧化能力測試。

第六圖：蠶絲蛋白之抗紫外線及氧化性傷害效能分析。

第七圖：蠶絲蛋白之促進膠原蛋白生成能力測試。

第八圖：蠶絲蛋白之抑制基質金屬蛋白酶活性測試。

本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。

本發明一種蠶絲蛋白於製備促進膠原蛋白生成之組成物之用途，其將一有效劑量(較佳為1%~20%，更佳為5%~20%)之蠶絲蛋白投予至一所需個體，以清除DPPH自由基及ABTS自由基、抑制脂質過氧化及預防質體DNA受紫外線傷害。

再者蠶絲蛋白亦具有抑制基質金屬蛋白酶MMP-2與MMP-9的能力，並促進膠原蛋白生成；藉此，蠶絲蛋白可作為抗氧化或抗老化之化妝材料組成物或醫藥組成物，有效減緩皮膚老化 情形。

此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。

實驗一：測試蠶絲蛋白之細胞毒性

(1)蠶絲蛋白來源

蠶絲蛋白係購自一丸株式會社(日本)，將蠶絲蛋白配製成不同濃度以進行後續實驗。

(2)細胞存活度測試(MTT assay)

將1×10⁴/well人類皮膚角質化細胞株(HaCaT)培養在96孔盤(96-well multiplate)，並放置37℃及5% CO₂的培養箱中培養至少24小時。評估蠶絲蛋白對皮膚細胞是否具細胞毒性：加入1μL不同濃度(1%、5%、10%和20%)的蠶絲蛋白於細胞，於37℃作用24小時之後，移除舊的培養液，以PBS清洗一次，並換上新的培養液，每孔細胞加入10μL的MTT(3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)(5mg/ml)溶液反應，於37℃、5% CO₂反應4小時，之後移除上清液，加入100μL的二甲亞碸(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解MTT甲臢(MTT formazan；MTT四氮唑被還原後之產物)沉澱物，震盪10分鐘後，於波長570nm下測定吸光值(BioTek，Synergy^TM2，USA)以計算細胞存活度。

結果如第一圖，細胞經過1%、5%、10%和20%的蠶絲蛋白作用24小時後，細胞存活度皆大於90%，表示1%~20%的蠶絲蛋白對細胞不具毒性。

實驗二：清除自由基能力測試

(1)ABTS自由基清除能力測試

由於2,2’-次偶氮基-雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)(2,2’ -azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid，ABTS)在過氧化酶(peroxidase)的催化下，會產生ABTS‧⁺自由基，而呈現穩定的藍綠色，因此藉由加入抗氧化物參與反應，ABTS‧⁺得以還原成ABTS而抑制藍綠色生成，並藉由測定734nm吸光值的變化，可評估抗氧化物的抗氧化能力。將2.45mM K₂S₂O₈和7mM ABTS溶液混合後，避光靜置16~18小時後，反應產生自由基，接續取1.5μL不同濃度(1%、5%、10%和20%)的蠶絲蛋白混合3.5μL ddH₂O及145μL ABTS與K₂S₂O₈混合溶液，靜置20分鐘，以分光光度計檢測734nm之吸光值。當吸光值越低表示樣品清除ABTS自由基的能力越強。再以不同濃度(1%、5%、10%和20%)的維他命C清除ABTS．⁺陽離子自由基的能力作為標準曲線。以[1-(樣品於734nm之吸光值/未添加樣品之控制組於734nm之吸光值)]×100%得到清除效應百分率(scavenging effects%)。

結果請參閱第二圖，1%、5%、10%和20%的蠶絲蛋白清除陽離子自由基效能優越，清除率皆達90%以上，並且與對照組維他命C相當。

(2)DPPH自由基清除能力測試

1,1-二苯基-2-苦醯肼基(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH‧)自由基係一種穩定的自由基，在波長517nm有最大吸光值。藉由加入樣品乙醇溶液後測量其517nm吸光值變化，即可換算出濃度下之自由基抑制率；當顏色由藍紫轉為淡黃色，吸光值也隨之降低，因此可藉由517nm下吸光值的變化，來評估抗氧化物清除自由基的能力。將配製成不同濃度(1%、5%、10%和20%)的蠶絲蛋白或維他命C，依序加入90mL新鮮配置的100μM DPPH乙醇溶液，以分光光度計檢測517nm之吸光值，其中，維他命C係作為標準品。當吸光值越低表示樣品清除DPPH自由基的能力越 強，以[1-(樣品於517nm之吸光值/未添加樣品之控制組於517nm之吸光值)]×100%得到清除效應百分率(scavenging effects%)。

結果請參閱第三圖，隨著提高蠶絲蛋白的濃度，清除DPPH自由基的效能越來越好，並且呈現濃度依存性。

實驗三：還原能力測試

原理是將赤血鹽(potassium ferrocyanide；K₃Fe(CN)₆)提供的三價鐵離子(Fe³⁺)，還原成二價鐵離子(Fe²⁺)之黃血鹽(K₄Fe(CN)₆)，黃血鹽再與三氯化鐵(FeCl₃)提供的Fe³⁺反應形成普魯士藍[Fe₄(Fe(CN)₆)₃]，藉由700nm處吸光值偵測普魯士藍的含量，以得知其還原力大小，因此吸光值越高表示樣品的還原力越強。本實驗係各取20μL之不同濃度(1%、5%、10%和20%)的蠶絲蛋白或維他命C，分別加入50μL之0.2M磷酸緩衝溶液(phosphate buffer，pH 6.6，含1%赤血鹽[K₃Fe(CN)₆]，於50℃之水浴中反應20分鐘後，再加入50μL之10%三氯醋酸(trichloroacetic acid；TCA)溶液，經離心(轉速為10,000rpm，10分鐘)後，取25μL之上清液加入65.9μL之二次去離子水及9.1μL之0.1%三氯化鐵(FeCl₃)溶液反應後，以分光光度計檢測其於700nm之吸光值，吸光值越高代表還原能力越佳；其中，維他命C係作為標準品。

結果請參閱第四圖，隨著蠶絲蛋白的濃度增加，還原能力越高，並且呈現濃度依存性。

實驗四：抑制脂質過氧化能力測試

50μL肝組織液和1μL的不同濃度(5%和10%)的蠶絲蛋白或0.1%水溶性維生素E(trolox)分別混合均勻後，依序加入10μL、20μM的FeSO₄和10μL、0.2mM的抗壞血酸(ascorbic acid)。在37℃培養箱裡靜置一個小時後，加入40μL的70% TCA和76μL 1%的TBA，經過80℃的水浴20分鐘，14,000轉離心10分鐘後，於532nm測其吸 光值。

結果請參閱第五圖，5%和10%蠶絲蛋白抑制脂質過氧化能力之效能分別為44.4%和94.4%，且10%蠶絲蛋白之效能與對照組水溶性維生素E相當，具有良好抑制脂質過氧化能力。

實驗五：皮膚細胞抗紫外線及氧化性傷害效能分析

pUC119 DNA質體(plasmid)原是一個超螺旋結構(supercoiled form,S-form)，經過UV或是氧化傷害後，超螺旋結構會被打開行成線狀結構(linear form,L-form)或是開放結構(open form,O-form)，因此可藉由此試驗評估蠶絲蛋白是否具有保護DNA質體的能力。將pUC119 DNA質體以1：8比例用PBS稀釋。各別取2μL的pUC119 DNA質體於微量離心管後，探討蠶絲蛋白是否具保護皮膚細胞抗紫外線效能；取2μL不同濃度(5%、10%和20%)的蠶絲蛋白與紫外線和氧化劑(UVB+ H₂O₂ +FeSO₄)於37℃作用1小時，加入loading dye混合後，利用0.8%洋菜膠(agarose)進行電泳，30分鐘後以電泳膠片影像擷取系統分析，分析超螺旋結構DNA和線狀結構DNA之百分比例。

結果請參閱第六圖，單純處理紫外線和氧化劑(UVB+ H₂O₂ +FeSO₄)組別，大多質體被破壞而呈線狀結構；反觀加入不同濃度(5%、10%和20%)之蠶絲蛋白的組別，經紫外線及氧化劑作用後，質體大都仍維持環狀超螺旋結構的位置，僅些許紫外線和氧化劑被破壞而呈線狀結構，表示蠶絲蛋白具保護質體免於紫外線及氧化劑傷害的能力。

實驗六：蠶絲蛋白促進膠原蛋白生成能力測試

將1.5×10⁵cell/mL的3T3L1細胞量培養在3公分培養盤中24小時後，移除上清液再加入含有不同濃度(5%、10%和20%)蠶絲蛋白之無血清培養液培養48小時，PBS清洗後，刮除細胞，離 心1,200rpm 5分鐘，再去除上清液。本試驗是利用Sircol soluble collagen assay kit進行膠原蛋白測定。首先將100μL細胞液混合1mL sircol染劑(sircol dye reagent)，接著在室溫下均勻搖晃30分鐘，再離心12,000rpm 10分鐘，直接倒掉上清液，再加入750μL的冰酸鹽洗滌試劑(ice-cold acid-salt wash reagent)，再離心12,000rpm 10分鐘，將染劑(dye reagent)完全去除乾淨。之後加入250μL鹼性試劑(alkali reagent)混合均勻，取100μL至96-well盤，在555nm測吸光值。

結果請參閱第七圖，與控制組相較下，5%、10%和20%之蠶絲蛋白促進膠原蛋白生成量分別為6.0%、28.2%及34.8%，表示蠶絲蛋白具促進膠原蛋白生成的能力。

實驗七：蠶絲蛋白抑制基質金屬蛋白酶活性測試

基質金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)係可分解細胞外基質(extracellular matrix,ECM)蛋白的酵素，主要可分為五類，其中兩類與分解膠原蛋白相關，分別是(一)膠原蛋白脢(collagenase)：包括interstitial collagenase(MMP-1)、neutrophil collagenase(MMP-8)、Collagenase 3(MMP-13)；以及(二)明膠脢(gelatinases)：包括gelatinase A(MMP-2)、gelatinase B(MMP-9)；在此本實驗係利用蛋白質電泳分析MMP-2及MMP-9之表現，探討蠶絲蛋對於MMP-2及MMP-9之影響。

首先，收集有處理或無處理(控制組)不同濃度(5%和10%)蠶絲蛋白之纖維母細胞的胞外培養基，於10%的Tris-Glycine gels(含0.1%膠原蛋白)進行非變性(non-denaturing)的蛋白質電泳分析，電泳完成後，於室溫、緩和搖擺振盪的情形下，電泳膠片以2.5%的Triton X-100處理30分鐘以恢復蛋白質的活性，電泳膠片再與developing buffer(Bio-Rad)於室溫下先反應30分鐘，然後於 37℃下再反應至少24小時，反應完成後，電泳膠片以0.25%的Coomassie blue(溶於9.2%醋酸與45.4%甲醇)於室溫下染色4小時，然後以9.2%醋酸與45.4%甲醇清洗30分鐘，重複2次，最後以10%醋酸與10%甲醇清洗至基質金屬蛋白酶的蛋白質bands出現，即完成活性分析步驟。

結果請參閱第八圖，本發明進一步證實加入5%和10%之蠶絲蛋白具有抑制基質金屬蛋白酶MMP-2及MMP-9活性的能力。

綜上所述，本發明於細胞毒性測試發現蠶絲蛋白對細胞不具有細胞毒性，且在清除自由基功效評估當中可以證實蠶絲蛋白具有ABTS自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、抑制脂質過氧化能力與抗紫外線之作用、且可調控細胞中基質金屬蛋白酶表現，具有促進膠原蛋白生成之能力；藉此，蠶絲蛋白適合進一步作為抗老化或抗氧化之化妝材料組成物、保養品或醫藥組成物，並且此醫藥組成物可與一皮膚外用劑合併使用；上述“皮膚外用劑”意指一通常在化妝品或醫藥品中被使用的外用成份，包括，但不限於：其他的美白劑、保濕劑、抗氧化劑、紫外線吸收劑、介面活性劑、增稠劑、色料以及皮膚營養劑等等，可例如為濃縮精華液之成分或添加於面膜中，提供使用者以一適當量施予皮膚，進而達到保護皮膚免於紫外線傷害、抗氧化以及抗老化之功效。

由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點：

1.本發明經研究證實蠶絲蛋白具有清除自由基、抑制脂質過氧化、保護細胞免於紫外線傷害、調控基質金屬蛋白酶表現，及促進膠原蛋白生成之效能，若進一步運用於作為塗抹皮膚之化妝材料組成物、保養品或醫藥組成物，將可有效減緩皮膚老化。

2.本發明亦針對蠶絲蛋白進行安全濃度測試(細胞存活度測 試)，證實經由不同濃度蠶絲蛋白處理過之細胞，存活率皆大於九成以上；因此，蠶絲蛋白不會傷害細胞，於使用上可減輕是否安全之虞慮。

綜上所述，本發明之蠶絲蛋白於製備促進膠原蛋白生成之組成物之用途，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。

惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。

Claims (4)

1. 一種蠶絲蛋白於製備促進膠原蛋白生成之組成物之用途，係以一有效劑量之蠶絲蛋白抑制基質金屬蛋白酶MMP-2與MMP9。
2. 如申請專利範圍第1項所述之蠶絲蛋白於製備促進膠原蛋白生成之組成物之用途，其中該有效劑量係為1%~20%。
3. 如申請專利範圍第2項所述之蠶絲蛋白於製備促進膠原蛋白生成之組成物之用途，其中該有效劑量係為5%~20%。
4. 如申請專利範圍第1項所述之蠶絲蛋白於製備促進膠原蛋白生成之組成物之用途，其中該蠶絲蛋白係作為抗老化之化妝材料組成物或醫藥組成物。